ES2537202T3 - Variantes de Fc con unión alterada a FcRn - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende una variante de Fc de un Fc de IgG humana, en el que dicha variante de Fc comprende una isoleucina en la posición 259 y una fenilalanina en la posición 308, en el que dicha variante de Fc muestra una unión incrementada a FcRn humano comparada con dicha Fc de IgG humana, y en el que la numeración es según el índice EU en Kabat et al.

Description

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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe la generación de nuevas variantes de dominios Fc, incluyendo las encontradas en anticuerpos, fusiones de Fc, e inmuno-adhesiones, que tienen una unión incrementada al receptor FcRn. Como se indica en la presente memoria, la unión a FcRn resulta en una retención en suero más larga in vivo.
Con el fin de incrementar la retención de las proteínas Fc in vivo, el incremento en la afinidad de unión debe ser a alrededor de pH 6 mientras se mantiene una afinidad más baja a alrededor de pH 7,4. Aunque todavía se está examinando, se cree que las regiones Fc tienen vidas medias más largas in vivo, porque la unión a FcRn a pH 6 en un endosoma secuestra el Fc (Ghetie y Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598). El compartimento endosomal recicla entonces el Fc a la superficie celular. Una vez se abre el compartimento al espacio extracelular, el mayor pH, ~7,4, induce la liberación de Fc de nuevo a la sangre. En ratones, Dall' Acqua et al. mostraron que los mutantes Fc con unión incrementada a FcRn a pH 6 y pH 7,4 tenían realmente concentraciones séricas reducidas y la misma vida media que el Fc de tipo salvaje (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180). La afinidad incrementada de Fc para FcRn a pH 7,4 se piensa que impide la liberación del Fc de nuevo a la sangre. Por lo tanto, las mutaciones en Fc que incrementarán la vida media de Fc in vivo incrementarán idealmente la unión a FcRn al pH menor mientras todavía permite la liberación de Fc a pH mayor. El aminoácido histidina cambia su estado de carga en el intervalo de pH de 6,0 a 7,4. Por lo tanto, no es sorprendente encontrar residuos de His en posiciones importantes en el complejo Fc/FcRn (Figura 6.)
Un aspecto adicional de la invención es el incremento en la unión a FcRn sobre el tipo salvaje específicamente a pH menor, aproximadamente pH 6,0, para facilitar la unión Fc/FcRn en el endosoma. También se describen variantes de Fc con unión alterada a FcRn y unión alterada a otra clase de receptores de Fc, los FcγR (algunas veces escritos FcgammaR) ya que se ha mostrado que la unión diferencial a FcγR, particularmente unión incrementada a FcγRIIIb y unión disminuida a FcγRIIb, resulta en una eficacia incrementada.
Definiciones
Con el fin de que la solicitud pueda entenderse más completamente, se muestran a continuación varias definiciones. Se pretende que dichas definiciones engloben equivalentes gramaticales.
Por "ADCC" o "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcγR reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana.
Por "ADCP" o "fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcγR reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la fagocitosis de la célula diana.
Por "modificación" en la presente memoria se quiere decir una sustitución, inserción, y/o deleción de aminoácidos en una secuencia polipeptídica o una alteración en un resto químicamente unido a una proteína. Por ejemplo, una modificación puede ser un carbohidrato alterado o estructura PEG unida a una proteína. Por "modificación de aminoácidos" en la presente memoria se quiere decir una sustitución, inserción, y/o deleción de aminoácidos en una secuencia polipeptídica.
Por "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" en la presente memoria se quiere decir el reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica parental con otro aminoácido. Por ejemplo, la sustitución E272Y se refiere a un polipéptido variante, en este caso una variante de Fc, en la que el ácido glutámico en la posición 272 se reemplaza con tirosina.
Por "inserción de aminoácidos" o "inserción" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir la adición de una secuencia de aminoácidos en una posición particular en una secuencia polipeptídica parental. Por ejemplo, -233E o ^233E designa una inserción de ácido glutámico después de la posición 233 y antes de la posición 234. Además, -233ADE o ^233ADE designa una inserción de AlaAspGlu después de la posición 233 y antes de la posición 234.
Por "deleción de aminoácidos" o "deleción" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir la eliminación de una secuencia de aminoácidos en una posición particular en una secuencia polipeptídica parental. Por ejemplo, E233-o E233# designa una deleción de ácido glutámico en la posición 233. Además, EDA233-o EDA233# designa una deleción de la secuencia GluAspAla que empieza en la posición 233.
Por "proteína variante" o "variante de proteína", o "variante" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una proteína que se diferencia de una proteína parental en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Variante de proteína puede referirse a la proteína en sí misma, a una composición que comprende la proteína, o a la secuencia de aminoácidos que la codifica. Preferiblemente, la variante de proteína tiene al menos una modificación de aminoácidos comparada con la proteína parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez modificaciones de aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente una a
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Por "función efectora" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir en evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor o ligando Fc. Las funciones efectoras incluyen pero no están limitadas a ADCC, ADCP, y CDC.
Por "célula efectora" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una célula del sistema inmune que expresa uno o más receptores Fc y media una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen pero no están limitadas a monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (NK), y células γδT, y pueden ser de cualquier organismo incluyendo pero no limitado a seres humanos, ratones, ratas, conejos, y monos.
Por "ligando de Fc de IgG" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una molécula, preferiblemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo IgG para formar un complejo Fc / ligando de Fc. Los ligandos de Fc incluyen pero no están limitados a FcγR, FcγR, FcγR, FcRn, C1q, C3, lectina de unión a manano, receptor de manosa, proteína A staphylococcal , proteína G streptococcal, y FcγR viral. Los ligandos de Fc también incluyen homólogos del receptor Fc (FcRH), que son una familia de receptores Fc que son homólogos a los FcγR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Los ligandos de Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc. Los ligandos particulares de Fc de IgG son FcRn y receptores gamma Fc. Por "ligando de Fc" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una molécula, preferiblemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo Fc / ligando de Fc.
Por "receptor gamma de Fc", "FcγR" o "FcgammaR" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir cualquier miembro de la familia de proteínas que se unen a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificada por un gen FcγR. En los seres humanos, esta familia incluye pero no está limitada a FcγRI (CD64), incluyendo las isoformas FcγRIa, FcγRIb, y FcγRIc; FcγRII (CD32), incluyendo las isoformas FcγRIIa (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcγRIIb (incluyendo FcγRIIb-1 y FcγRIIb-2), y FcγRIIc; y FcγRIII (CD16), incluyendo las isoformas FcγRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcγRIIIb (incluyendo los alotipos FcγRIIIb-NA1 y FcγRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), así como cualquier FcγR humano no descubierto o isoformas o alotipos de FcγR. Un FcγR puede ser de cualquier organismo, incluyendo pero no limitado a seres humanos, ratones, ratas, conejos, y monos. Los FcγR de ratón incluyen pero no están limitados a FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), y FcγRIII-2 (CD16-2), así como cualquier FcγR de ratón no descubierto o isoformas o alotipos de FcγR.
Por "FcRn" o "receptor neonatal de Fc" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una proteína que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificada al menos en parte por un gen FcRn. El FcRn puede ser de cualquier organismo, incluyendo pero no limitado a seres humanos, ratones, ratas, conejos, y monos. Como se conoce en la técnica, la proteína FcRn funcional comprende dos polipéptidos, referidos frecuentemente como la cadena pesada y la cadena ligera. La cadena ligera es beta-2-microglobulina y la cadena pesada está codificada por el gen FcRn. A no ser que se indique otra cosa en la presente memoria, FcRn o una proteína FcRn se refiere al complejo de la cadena pesada de FcRn con beta-2-microglobulina. Las secuencias de interés particular de FcRn se muestran en las Figuras, particularmente las especies humanas.
Por "polipéptido parental" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir un polipéptido no modificado que posteriormente se modifica para generar una variante. El polipéptido parental puede ser un polipéptido natural, o una variante o versión obtenida por ingeniería de un polipéptido natural. Polipéptido parental puede referirse al polipéptido en sí mismo, a composiciones que comprenden el polipéptido parental, o a la secuencia de aminoácidos que lo codifica. De acuerdo con esto, por "inmunoglobulina parental" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir un polipéptido de inmunoglobulina no modificado que se modifica para generar una variante, y por "anticuerpo parental" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir un anticuerpo no modificado que se modifica para generar un anticuerpo variante. Debe indicarse que "anticuerpo parental" incluye anticuerpos producidos recombinantemente comerciales conocidos como se resalta más adelante.
Por "posición" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una localización en la secuencia de una proteína. Las posiciones pueden numerarse secuencialmente, o según un formato establecido, por ejemplo el índice EU como en Kabat. Por ejemplo, la posición 297 es una posición en el anticuerpo IgG1 humano.
Por "antígeno diana" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir la molécula que se une específicamente por la región variable de un anticuerpo dado. Un antígeno diana puede ser una proteína, carbohidrato, lípido. u otro compuesto químico.
Por "célula diana" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una célula que expresa un antígeno diana.
Por "región variable" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir la región de una inmunoglobulina que comprende uno o más dominios Ig codificados sustancialmente por cualquiera de los genes Vκ, Vλ, y/o VH que componen los loci genéticos de la cadena kappa, lambda, y pesada, respectivamente, de una inmunoglobulina.
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Por "de tipo salvaje o WT" en la presente memoria se quiere decir una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, incluyendo variaciones alélicas. Una proteína WT tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que no se ha modificado intencionadamente.
La presente invención está dirigida a anticuerpos que presentan unión moduladora a FcRn (incluyendo la modulación unión incrementada así como disminuida). Por ejemplo, en algunos casos, la unión incrementada resulta en reciclado celular del anticuerpo y por lo tanto vida media incrementada, por ejemplo para anticuerpos terapéuticos. Alternativamente, una unión a FcRn disminuida es deseable, por ejemplo, para anticuerpos de diagnóstico o anticuerpos terapéuticos que contienen radiomarcadores. Además, los anticuerpos que presentan unión incrementada a FcRn y unión alterada a otros receptores Fc, por ejemplo FcγR encuentran uso en la presente invención. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona anticuerpos.
Anticuerpos
La presente solicitud está dirigida a anticuerpos que incluyen modificaciones de aminoácidos que modulan la unión a FcRn. Son particularmente interesantes los anticuerpos que comprenden mínimamente una región Fc, o variante funcional de ésta, que presenta afinidad de unión incrementada para FcRn a pH disminuido, y que no presentan unión sustancialmente alterada a pH mayor.
Las unidades estructurales de anticuerpos tradicionales comprenden típicamente un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto típicamente por dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, teniendo cada pareja una cadena "ligera" (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero no limitado a IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. IgM tiene subclases, incluyendo, pero no limitado a, IgM1 e IgM2. Así, "isotipo" tal y como se usa en la presente memoria quiere decir cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definida por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Los isotipos conocidos de inmunoglobulina humana son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD, e IgE.
La parte amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable del reconocimiento del antígeno. En la región variable, se agrupan tres bucles para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y cadena ligera para formar un sitio de unión a antígeno. Cada uno de los bucles se refiere como una región determinante de la complementariedad (de aquí en adelante referido como una "CDR"), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es muy significativa.
La parte carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Kabat et al. recogieron numerosas secuencias primarias de las regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras. Tomando como base el grado de conservación de las secuencias, clasificaron secuencias primarias individuales en la CDR y el marco e hicieron una lista de éstas (véase SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5a edición, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al.).
En la subclase IgG de inmunoglobulinas, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)" en la presente memoria se quiere decir una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria clara. Son de interés en la presente invención los dominios de cadena pesada, incluyendo, los dominios constantes pesados (CH) y los dominios bisagra. En el contexto de los anticuerpos IgG, los isotipos IgG tienen cada uno tres regiones CH. De acuerdo con esto, los dominios "CH" en el contexto de IgG son como sigue: "CH1" se refiere a las posiciones 118-220 según el índice EU como en Kabat. "CH2" se refiere a las posiciones 237-340 según el índice EU como en Kabat, y "CH3" se refiere a las posiciones 341-447 según el índice EU como en Kabat.
Otro tipo de dominio Ig de la cadena pesada es el dominio bisagra. Por "bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra de anticuerpo" o "región bisagra de inmunoglobulina" en la presente memoria se quiere decir el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y segundo dominios constantes de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de IgG termina en la posición EU 220, y el dominio CH2 de IgG empieza en el residuo EU posición
237. Así, para IgG la bisagra del anticuerpo se define en la presente memoria para incluir las posiciones 221 (D221 en IgG1) a 236 (G236 en IgG1), en el que la numeración es según el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, por ejemplo en el contexto de una región Fc, se incluye la bisagra menor, con la "bisagra menor" refiriéndose generalmente a las posiciones 226 ó 230.
De interés particular en la presente invención son las regiones Fc. Por "Fc" o "región Fc", tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante y, en algunos casos, parte de la bisagra. Así, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD, e IgG, y los tres últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y la bisagra flexible N-terminal respecto a estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, como se ilustra en la Figura 1, Fc comprende dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cg2 y Cg3) y la región bisagra menor entre Cgamma1 (Cg1) y Cgamma2
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(Cg2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define habitualmente para incluir los residuos C226 o P230 en su extremo carboxilo, en el que la numeración es según el índice EU como en Kabat. Fc puede referirse a esta región aisladamente, o esta región en el contexto de un polipéptido Fc, como se describe más adelante. Por "polipéptido Fc" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir un polipéptido que comprende toda o parte de una región Fc. Los polipéptidos Fc incluyen anticuerpos, fusiones Fc, Fc aislados, y fragmentos de Fc.
En algunas realizaciones, los anticuerpos son de longitud completa. Por "anticuerpo de longitud completa" en la presente memoria se quiere decir la estructura que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, incluyendo las regiones variable y constante, incluyendo una o más modificaciones como se resalta en la presente memoria.
Alternativamente, los anticuerpos pueden tener una variedad de estructuras, incluyendo, pero no limitado a, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces referidos en la presente memoria como "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (algunas veces referidas como "conjugados de anticuerpos"), y fragmentos de cada uno, respectivamente.
Fragmentos de Anticuerpo
En una realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. De particular interés son los anticuerpos que comprenden regiones Fc, fusiones Fc, y la región constante de la cadena pesada (CH1-bisagra-CH2-CH3), de nuevo incluyendo también fusiones de región pesada constante.
Los fragmentos de anticuerpo específicos incluyen, pero no están limitados a, (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al., 1989, Nature 341:544546) que consiste en una única variable, (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv de cadena única(scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL se unen por un conector peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883), (viii) Fv de cadena única biespecífico (WO 03/11161) y (ix) "fragmentos divalentes" o "fragmentos trivalentes", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448). Los fragmentos de anticuerpo pueden estar modificados. Por ejemplo, las moléculas pueden estabilizarse por la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:12391245).
Anticuerpos Quiméricos y Humanizados
En algunas realizaciones, los componentes de soporte pueden ser una mezcla de diferentes especies. Como tal, si la proteína es un anticuerpo, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto los "anticuerpos quiméricos" como los "anticuerpos humanizados" se refieren a los anticuerpos que combinan regiones de más de una especie. Por ejemplo, los "anticuerpos quiméricos" comprenden tradicionalmente región o regiones variables de un ratón (o rata, en algunos casos) y la región o regiones constantes de un ser humano. Los "anticuerpos humanizados" se refieren generalmente a anticuerpos no humanos en los que se han cambiado las regiones marco de dominio variable por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. Generalmente, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto las CDR, está codificado por un polinucleótido de origen humano o es idéntico a dicho anticuerpo excepto en sus CDR. Las CDR, algunas de las cuales están codificadas por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en el marco de lámina beta de una región variable de anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad es determinada por las CDR injertadas. La creación de dichos anticuerpos se describe, por ejemplo, en WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536. La "retromutación" de residuos marco aceptores seleccionados a residuos donantes correspondientes se requiere frecuentemente para volver a adquirir la afinidad que se pierde en la construcción injertada inicial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213). El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana, y así comprenderá típicamente una región Fc humana. Los anticuerpos humanizados también pueden generarse usando ratones con un sistema inmune modificado por ingeniería genéticamente. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. En la técnica se conoce una variedad de técnicas y métodos para humanizar y remodelar anticuerpos no humanos (Véase Tsurushita y Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), y las referencias citadas en ésta). Los métodos de humanización incluyen pero no están limitados a los métodos descritos en Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res.57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8. La humanización u otros métodos para reducir la inmunogenicidad de regiones variables de anticuerpos no humanos pueden incluir métodos de
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Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril o treonil, metilación de los grupos α-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, p. 79-86 ), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Glicosilación
Otro tipo de modificación covalente es glicosilación. En otra realización, las variantes de IgG descritas en la presente memoria pueden modificarse para incluir una o más glicoformas preparadas por ingeniería. Por "glicoforma preparada por ingeniería" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir una composición de carbohidrato que está unida covalentemente a una IgG, en la que dicha composición de carbohidrato se diferencia químicamente de la de una IgG parental. Las glicoformas preparadas por ingeniería pueden ser útiles para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitado a aumentar o reducir la función efectora. Las glicoformas preparadas por ingeniería pueden generarse por una variedad de métodos conocidos en la técnica (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6.602.684; USSN 10/277.370; USSN 10/113.929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1; (tecnología Potelligent® [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb® tecnología de glicosilación por ingeniería [Glycart Biotechnology AG, Zurich, Suiza]). Muchas de estas técnicas se basan en controlar el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisectados que están unidos covalentemente a la región Fc, por ejemplo expresando una IgG en varios organismos o líneas celulares, preparada por ingeniería o de otra forma (por ejemplo, células CHO Lec-13 o células de hibridoma YB2/0 de rata), regulando las enzimas implicadas en la ruta de glicosilación (por ejemplo, FUT8 [α1,6-fucosiltranserasa] y/o β1-4-N-acetilglucosaminiltransferasa III [GnTIII]), o modificando carbohidrato(s) después de que se ha expresado la IgG. La glicoforma preparada por ingeniería se refiere típicamente al diferente carbohidrato u oligosacárido; así, una variante de IgG, por ejemplo un anticuerpo o fusión de Fc, puede incluir una glicoforma preparada por ingeniería. Alternativamente, la glicoforma preparada por ingeniería puede referirse a la variante de IgG que comprende el diferente carbohidrato u oligosacárido. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particulares, discutido más adelante), como de la célula u organismo huésped en el que se produce la proteína. Los sistemas de expresión particulares se discuten más adelante.
La glicosilación de polipéptidos está típicamente ligada a N o ligada a O. Ligado a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tri-péptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tri-péptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina ó 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos que contiene una o más de las secuencias de tri-péptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también puede hacerse por la adición de, o sustitución con, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para sitios de glicosilación ligados a O). Para facilitarlo, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se altera preferiblemente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido diana en bases preseleccionadas de manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio para incrementar el número de restos de carbohidrato en el anticuerpo es por acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula diana que tiene capacidades de glicosilación para glicosilación ligada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO 87/05330 y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., p. 259-306.
La eliminación de restos de carbohidrato presentes en el anticuerpo de partida puede conseguirse químicamente o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de la mayor parte o de todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras se deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química está descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.
259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse por el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en sitios de glicosilación potenciales puede evitarse por el uso del compuesto tunicamicina como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de uniones proteína-N-glicósido.
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Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a varios polímeros no proteináceos, incluyendo, pero no limitado a, varios polioles tales como polietilen glicol, polipropilen glicol o polioxialquilenos, de la manera mostrada, por ejemplo, en 2005-2006 Catálogo PEG de Nektar Therapeutics (disponible en el sitio de internet de Nektar) Patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó
4.179.337. Además, como se conoce en la técnica, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos en varias posiciones en el anticuerpo para facilitar la adición de polímeros tales como PEG. Véase, por ejemplo, la Publicación
U.S. No. 2005/0114037A1.
Anticuerpos Marcados
En algunas realizaciones, la modificación covalente de los anticuerpos de la invención comprende la adición de uno
o más marcadores. En algunos casos, éstos se consideran fusiones de anticuerpo. El término "grupo marcador" significa cualquier marcador detectable. En algunas realizaciones, el grupo marcador está acoplado al anticuerpo mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. En la técnica se conocen varios métodos para marcar proteínas y pueden usarse para llevar a cabo la presente invención.
En general, los marcadores se encuentran en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el que se van a detectar: a) marcadores isotópicos que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas); c) restos activos redox; d) marcadores ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo, etc.). En algunas realizaciones, el grupo marcador está acoplado al anticuerpo mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. En la técnica se conocen varios métodos para marcar proteínas y pueden usarse para llevar a cabo la presente invención.
Los marcadores específicos incluyen marcadores ópticos, incluyendo, pero no limitado a, cromóforos, sustancias luminiscentes y fluoróforos, siendo los últimos específicos en muchos casos. Los fluoróforos pueden ser bien sustancias fluorescentes de "molécula pequeña", o sustancias fluorescentes proteináceas.
Por "marcador fluorescente" se quiere decir cualquier molécula que puede detectarse a través de sus propiedades fluorescentes inherentes. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no están limitados a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil-coumarinas, pireno, Malaquita verde, estilbeno, Lucifer Amarillo, Cascade BlueJ, Texas Rojo, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon verde, los agentes de tinción Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina, y Texas Rojo (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Los agentes de tinción ópticos adecuados, incluyendo fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland.
Los marcadores fluorescentes proteináceos adecuados también incluyen, pero no están limitados a, proteína verde fluorescente, incluyendo una especie de Renilla, Ptilosarcus, o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Número de Registro Genbank U55762), proteína azul fluorescente (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína amarilla fluorescente aumentada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:54085417), β galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (WO92/15673, WO95/07463,WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes U.S. Nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).
Variantes de IgG
En una realización, la invención proporciona proteínas IgG variantes. Como mínimo, las variantes de IgG comprenden un fragmento de anticuerpo que comprende la región CH2-CH3 de la cadena pesada. Además, las variantes de IgG adecuadas comprenden dominios Fc (por ejemplo, incluyendo la región bisagra menor), así como siendo también útiles en la presente invención las variantes de IgG que comprenden la región constante de la cadena pesada (CH1-bisagra-CH2-CH3), todas las cuales pueden fusionarse con parejas de fusión.
Una variante de IgG incluye una o más modificaciones de aminoácidos respecto a un polipéptido IgG parental, en algunos casos respecto a la IgG de tipo salvaje. La variante de IgG puede tener una o más propiedades optimizadas. Una variante de IgG se diferencia en la secuencia de aminoácidos de su IgG parental en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Así, las variantes de IgG tienen al menos una modificación de aminoácidos comparadas con la parental. Alternativamente, las variantes de IgG pueden tener más de una modificación de aminoácidos comparadas con la parental, por ejemplo de aproximadamente una a cincuenta modificaciones de aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente una a diez modificaciones de aminoácidos, y lo más preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco modificaciones de aminoácidos comparadas con la parental.
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Así, las secuencias de las variantes de IgG y aquellas del polipéptido Fc parental son sustancialmente homólogas. Por ejemplo, las secuencias variantes de la IgG variante en la presente memoria poseerán aproximadamente 80% de homología con la secuencia variante de IgG parental, preferiblemente al menos aproximadamente 90% de homología, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de homología. Las modificaciones pueden hacerse genéticamente usando biología molecular, o pueden hacerse enzimáticamente o químicamente.
Antígenos Diana para Anticuerpos
Virtualmente, cualquier antígeno puede ser diana de las variantes de IgG, incluyendo pero no limitado a proteínas, subunidades, dominios, restos, y/o epítopos que pertenecen a la lista siguiente de antígenos diana, que incluye tanto factores solubles tales como citoquinas como factores unidos a membrana, incluyendo receptores transmembrana: 17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, Receptor de Adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, Activina, Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C, Activina RIA, Activina RIA ALK-2, Activina RIB ALK-4, Activina RIIA, Activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Adresinas, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, antagonista alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artemina, anti-Id, ASPÁRTICO, factor natriurético atrial, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, Estimulador de linfocitos B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, BOK, Bombesina, Factor neurotrófico derivado de hueso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, factor de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, Calcitonina, AMPc, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado a carcinoma, Catepsina A, Catepsina B, Catepsina C/DPPI, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina H, Catepsina L, Catepsina O, Catepsina S, Catepsina V, Catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, GMPc, CINC, Toxina de Clostridium botulinum, Toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno asociado a tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Factor acelerador de la degradación, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, ADNasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, Enquefalinasa, eNOS, Eot, eotaxina1, EpCAM, Efrina B2/ EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, Factor IIa, Factor VII, Factor VIIIc, Factor IX, proteína de activación de fibroblastos (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, Ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, Fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, Hormona estimuladora del folículo, Fractalquina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (Miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, Glucagón, Glut 4, glicoproteína IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, Factor liberador de la hormona del crecimiento, Hapteno (NP-cap o NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína de cubierta de HCMV gB, HCMV) glicoproteína de cubierta gH, HCMV UL, Factor de crecimiento hematopoyético (HGF), Hep B gp120, heparanasa, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína del virus del herpes simple (HSV) gB, glicoproteína de HSV gD, HGFA, Antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardiaca humana, citomegalovirus humano (HCMV), hormona de crecimiento humana (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteínas de unión a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferón (INF)-alfa, INF-beta, INF-gamma, Inhibina, iNOS, Cadena A de insulina, Cadena B de insulina, factor de crecimiento semejante a insulina 1, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfaV), integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferón gamma, IP-10, I-TAC, JE, Calicreína 2, Calicreína 5, Calicreína 6, Calicreína 11, Calicreína 12, Calicreína 14, Calicreína 15, Calicreína L1, Calicreína L2, Calicreína L3, Calicreína L4, KC, KDR, Factor de Crecimiento de Queratinocitos (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 Latente, TGF-1 bp1 Latente, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, Antígeno Y de Lewis, Antígeno relacionado con Y de Lewis, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LIX, LKN, Lptn, L-Selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, Tensioactivo pulmonar, Hormona luteinizante, Receptor beta de Linfotoxina, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASAS, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18, Sustancia inhibidora mulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-Cadherina, NCA 90, NCAM, NCAM, Neprilisina, Neurotrofina-3,-4, ó -6, Neurturina, Factor de crecimiento neuronal (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN,
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CBL, un anticuerpo anti-CD147 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-IL8 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-MA1, un anticuerpo anti-MUC18 que está siendo desarrollado por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1), un anti-MUC1 en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUC1 que está siendo desarrollado por Antisoma, AngioMab (AS1405), que está siendo desarrollado por Antisoma, HuBC-1, que está siendo desarrollado por Antisoma, Thioplatin (AS1407) que está siendo desarrollado por Antisoma, Antegren® (natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y alfa-4-beta-7 que está siendo desarrollado por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo anti-VLA-1 integrina que está siendo desarrollado por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo anti-receptor de linfotoxina beta (LTBR) que está siendo desarrollado por Biogen, CAT152, un anticuerpo anti-TGF-β2 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, J695, un anticuerpo anti-IL-12 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGFβ1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Genzyme, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxina1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B™ un anticuerpo anti-Blys que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, un anticuerpo anti-TRAIL-R1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences, Inc., Avastin™ (bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF que está siendo desarrollado por Genentech, un anticuerpo anti-familia de receptores HER que está siendo desarrollado por Genentech, Anti-Factor Tisular (ATF), un anticuerpo anti-Factor Tisular que está siendo desarrollado por Genentech, Xolair™ (Omalizumab), un anticuerpo anti-IgE que está siendo desarrollado por Genentech, Raptiva™ (Efalizumab), un anticuerpo anti-CD11a que está siendo desarrollado por Genentech y Xoma, Anticuerpo MLN-02 (antiguamente LDP-02), que está siendo desarrollado por Genentech y Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que está siendo desarrollado por Genmab y Amgen, HuMax-Inflam, que está siendo desarrollado por Genmab y Medarex, HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I que está siendo desarrollado por Genmab y Medarex y Oxford GcoSciences, HuMax-Lymphoma, que está siendo desarrollado por Genmab y Amgen, HuMax-TAC, que está siendo desarrollado por Genmab, IDEC-131, y anticuerpo anti-CD40L que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, un anticuerpo anti-CD23 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos anti-factor de migración de macrófagos (MIF) que están siendo desarrollados por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotípico que está siendo desarrollado por Imclone, IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR que está siendo desarrollado por Imclone, DC101, un anticuerpo anti-flk-1 que está siendo desarrollado por Imclone, anticuerpos anti-VE cadherina que están siendo desarrollados por Imclone, CEA-Cide™ (labetuzumab), un anticuerpo anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) que está siendo desarrollado por Immunomedics, LymphoCide™ (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 que está siendo desarrollado por Immunomedics, AFP-Cide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MyelomaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, LkoCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, ProstaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-070 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-018 que está siendo desarrollado por Medarex, Osidem™ (IDM-1), y anticuerpo anti-Her2 que está siendo desarrollado por Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax™-CD4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por Medarex y Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que está siendo desarrollado por Medarex y Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFα que está siendo desarrollado por Medarex y Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citoquina que está siendo desarrollado por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos anti-molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1)(CD54) que están siendo desarrollados por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 3 (FGFR-3) que está siendo desarrollado por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, HuZAF™, un anticuerpo anti-interferón gamma que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, Anti-Integrina α5β1, que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, anti-IL-12, que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM que está siendo desarrollado por Xoma, y MLN01, un anticuerpo anti-Integrina Beta2 que está siendo desarrollado por Xoma.
Los polipéptidos Fc de la presente invención pueden incorporarse en los candidatos y productos clínicos mencionados anteriormente, o en anticuerpos y fusiones Fc que son sustancialmente iguales a ellos. Los polipéptidos Fc de la presente invención pueden incorporarse en versiones de los candidatos y productos clínicos mencionados anteriormente que son humanizados, madurados por afinidad, preparados por ingeniería, o modificados de alguna otra manera.
En una realización los polipéptidos Fc de la presente invención se usan para el tratamiento de indicaciones autoinmunes, inflamatorias, o de trasplante. Los antígenos diana y productos y candidatos clínicos que son relevantes para dichas enfermedades incluyen pero no están limitados a anticuerpos anti-integrina α4β7 tales como LDP-02, anticuerpos anti-integrina beta2, tales como LDP-01, anticuerpos anti-complemento (C5) tales como 5G1.1, anticuerpos anti-CD2 tales como BTI-322, MEDI-507, anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3, SMART anti-CD3, anticuerpos anti-CD4 tales como IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A, anticuerpos anti-CD11a, anticuerpos anti-CD14 tales como IC14, anticuerpos anti-CD18, anticuerpos anti-CD23 tales como IDEC 152, anticuerpos anti-CD25 tales como Zenapax, anticuerpos anti-CD40L tales como 5c8, Antova, IDEC-131, anticuerpos anti-CD64 tales como MDX33, anticuerpos anti-CD80 tales como IDEC-114, anticuerpos anti-CD147 tales como ABX-CBL, anticuerpos anti-Eselectina tales como CDP850, anticuerpos anti-gpIIb/IIIa tales como ReoPro/Abcixima, anticuerpos anti-ICAM-3 tales
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opcional más, las variantes de IgG se optimizan para poseer una afinidad reducida para el receptor inhibidor humano FcγRIIb. Esto es, realizaciones particulares abarcan el uso de anticuerpos que muestran una unión incrementada a FcRn, y unión incrementada a FcγRIIIa. Otras realizaciones utilizan el uso de anticuerpos que muestran unión incrementada para FcRn, y unión incrementada a FcγRIIIa. Estas realizaciones se anticipan para proporcionar polipéptidos IgG con propiedades terapéuticas aumentadas en seres humanos, por ejemplo función efectora aumentada y mayor potencia anti-cancerosa. En una realización alternativa, las variantes de IgG se optimizan para tener una afinidad incrementada o reducida para FcRn y afinidad incrementada o disminuida para un FcγR humano, incluyendo pero no limitado a FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, y FcγRIIIb incluyendo sus variaciones alélicas. Estas realizaciones se anticipan para proporcionar polipéptidos IgG con propiedades terapéuticas aumentadas en seres humanos, por ejemplo vida media sérica incrementada y función efectora reducida. En otras realizaciones, las variantes de IgG proporcionan afinidad aumentada para FcRn y afinidad aumentada para uno o más FcγR, con afinidad reducida para uno o más FcγR adicionales. Por ejemplo, una variante de IgG puede tener unión aumentada para FcRn y FcγRIIIa, con unión reducida para FcγRIIb. Alternativamente, una variante de IgG puede tener unión reducida para FcRn y para FcγR. En otra realización, una variante de IgG puede tener afinidad reducida para FcRn y afinidad aumentada para FcγRIIb, con afinidad reducida para uno o más FcγR activadores. En otra realización más, una variante de IgG puede tener vida media sérica incrementada y funciones efectoras reducidas.
Las realizaciones preferidas comprenden la optimización de la unión a un FcRn y FcγR humano, sin embargo en realizaciones alternativas las variantes de IgG poseen afinidad aumentada o reducida para FcRn y FcγR de organismos no humanos, incluyendo pero no limitado a roedores y primates no humanos. Las variantes de IgG que se optimizan para unión a un FcRn no humano pueden encontrar uso en experimentación. Por ejemplo, los modelos de ratón están disponibles para una variedad de enfermedades que permiten el ensayo de propiedades tales como eficacia, toxicidad, y farmacocinética para un candidato a fármaco dado. Como se conoce en la técnica, las células cancerosas pueden injertarse o inyectarse en ratones para mimetizar un cáncer humano, un proceso referido como xenoinjerto. El ensayo de las variantes de IgG que comprenden variantes de IgG que se optimizan para FcRn puede proporcionar información valiosa respecto a las características de aclaramiento de la proteína, su mecanismo de aclaramiento, y semejantes. Las variantes de IgG también pueden optimizarse para funcionalidad incrementada y/o propiedades de disolución en forma aglicosilada. Los ligandos Fc incluyen pero no están limitados a FcRn, FcγR, C1q, y proteínas A y G, y pueden ser de cualquier fuente incluyendo pero no limitado a ser humano, ratón, rata, conejo, o mono, preferiblemente ser humano. En una realización preferida alternativa, las variantes de IgG se optimizan para ser más estables y/o más solubles que la forma aglicosilada de la variante de IgG parental.
Las variantes de IgG pueden incluir modificaciones que modulan la interacción con ligandos Fc distintos de FcRn y FcγR, incluyendo pero no limitado a proteínas de complemento, y homólogos del receptor de Fc (FcRH). Los FcRH incluyen pero no están limitados a FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5, y FcRH6 (Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136).
Preferiblemente, la especificidad de ligando Fc de la variante de IgG determinará su utilidad terapéutica. La utilidad de una variante de IgG dada para propósitos terapéuticos dependerá del epítopo o forma del antígeno diana y la enfermedad o indicación que se va a tratar. Para la mayor parte de las dianas e indicaciones, puede ser preferible una unión aumentada a FcRn ya que la unión aumentada a FcRn puede resultar en un incremento de la vida media sérica. Las vidas medias séricas mayores permiten una dosificación menos frecuente o dosificación menor del terapéutico. Esto es particularmente preferible cuando el agente terapéutico se proporciona en respuesta a una indicación que requiere administración repetida. Para algunas dianas e indicaciones, puede ser preferible una afinidad disminuida para FcRn. Esto puede ser particularmente preferible cuando se desea una variante de Fc con aclaramiento incrementado o vida media sérica disminuida, por ejemplo en polipéptidos Fc usados como agentes formadores de imágenes o radio-terapéuticos.
Pueden usarse variantes de IgG que comprenden variantes de IgG que proporcionan afinidad aumentada para FcRn con afinidad aumentada para FcγR activadores y/o reducida para FcγR inhibidores. Para algunas dianas e indicaciones, puede ser además beneficioso utilizar variantes de IgG que proporcionen selectividad diferencial para diferentes FcγR activadores; por ejemplo, en algunos casos puede desearse una unión aumentada a FcγRIIa y FcγRIIIa, pro no FcγRI, mientras en otros casos, puede preferirse unión aumentada sólo a FcγRIIa. Para determinadas dianas e indicaciones, puede ser preferible utilizar variantes de IgG que alteran la unión a FcRn y aumentan las funciones efectoras tanto mediadas por FcγR como mediadas por complemento, mientras para otros casos puede ser ventajoso utilizar variantes de IgG que aumentan la unión a FcRn, o vida media sérica, y bien las funciones efectoras mediadas por FcγR o mediadas por complemento. Para algunas dianas o indicaciones de cáncer, puede ser ventajoso reducir o suprimir una o más funciones efectoras, por ejemplo, desactivando la unión a C1q, uno o más FcγR, FcRn, o uno o más ligandos de Fc. Para otras dianas e indicaciones, puede ser preferible utilizar variantes de IgG que proporcionan unión aumentada al FcγRIIb inhibidor, con nivel WT, reducido, o unión suprimida a FcγRs activadores. Esto puede ser particularmente útil, por ejemplo, cuando el objetivo de una variante de IgG es inhibir la inflamación o enfermedad auto-inmune, o modular el sistema inmune de alguna manera. Como las enfermedades auto-inmunes son generalmente duraderas y el tratamiento se proporciona en dosificación repetida, se prefiere particularmente su tratamiento con variantes de Fc con vida media incrementada de FcRn incrementado.
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posiciones 229-239, 266-273, 294-299, y 324-331 son localizaciones preferidas de bucle para inserciones o deleciones (numeración del índice EU de Kabat et al., PDB código 1 E4K.pdb Sondermann et al. Nature. 2000 406:267). Los bucles son regiones del polipéptido no implicadas en la estructura de hélice alfa o lámina beta. Las posiciones de bucle son posiciones que no están ni en estructura hélice alga ni lámina beta (van Holde, Johnson y Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, Nueva Jersey 1998, Capítulo 1 p2-67). Las posiciones de bucle se prefieren porque los átomos del núcleo son típicamente más flexibles y están menos probablemente implicados en enlaces de hidrógeno comparado con los átomos de núcleo de hélices alfa y láminas beta. Por lo tanto, el alargamiento o acortamiento de un bucle debido a una inserción o deleción de uno o más aminoácidos es menos probable que de lugar a cambios grandes, disruptivos en el polipéptido Fc, incluyendo estabilidad, expresión u otros problemas.
Pueden usarse inserciones y deleciones para alterar la longitud del polipéptido. Por ejemplo, en las regiones de bucle, la alteración de la longitud del bucle resulta en una flexibilidad y entropía conformacional alteradas del bucle. Las inserciones en el bucle incrementarán generalmente la entropía conformacional del bucle, que puede definirse como la constante de Boltzman multiplicada por el logaritmo natural del número de posibles conformaciones (van Holde, Johnson y Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, Nueva Jersey 1998, pp78). Mediante la inserción de al menos un aminoácidos en un polipéptido, se incrementa el número total de conformaciones disponibles en el polipéptido. Estas conformaciones adicionales pueden ser beneficiosas para formar interacciones Fc/pareja de unión de Fc favorables porque el polipéptido Fc puede usar una de las conformaciones adicionales en la unión a la proteína de unión a Fc. En este caso, la inserción puede dar lugar a interacciones Fc/pareja de unión de Fc más fuertes. Si las conformaciones adicionales no se usan en la interfase de unión, la inserción puede dar lugar a interacciones Fc/pareja de unión de Fc más débiles, porque las conformaciones adicionales competirían con la conformación competente para la unión. De manera similar, la deleción de un segmento de polipéptido también puede dar lugar a interacciones Fc/pareja de unión de Fc más fuertes o más débiles. Si la deleción de un segmento, que reduce el número posible de conformaciones de núcleo, elimina la conformación competente para la unión, la deleción puede dar lugar a interacciones Fc/pareja de unión de Fc más débiles. Si la deleción no elimina la conformación competente para la unión, la deleción puede dar lugar a interacciones Fc/pareja de unión de Fc más fuertes porque la deleción puede eliminar conformaciones que compiten con la conformación competente para la unión.
Pueden usarse inserciones y deleciones para alterar las posiciones y orientaciones de los aminoácidos en el polipéptido Fc. Como las inserciones y deleciones causan un cambio en la estructura covalente del núcleo, causan necesariamente un cambio en las posiciones de los átomos del núcleo. La Figura 7 compara las posiciones en el núcleo en algunos segmentos de bucle, marcadas L1 a L4, en tres núcleos diferentes. La estructura de núcleo de referencia contiene cuatro segmentos de bucle, mientas el núcleo de deleción carece del segmento L1 y el segmento de inserción comprende un segmento adicional antes, es decir, N-terminal respecto a, el segmento L1. Las deleciones e inserciones causan el cambio mayor en la estructura del núcleo cerca del sitio de la inserción o deleción. Mediante la deleción de un segmento cerca del extremo N-terminal del bucle, por ejemplo, segmento L1, el bucle se acorta y los segmentos remanentes cambian su posición más cerca del extremo N del bucle. Esto tiene el efecto de mover el segmento L2 hacia la localización anterior del segmento L1 y hacia el extremo N del bucle. Este cambio de posición del segmento L2 hacia el segmento L1 puede reforzar la unión del complejo Fc/pareja de unión de Fc y se prefiere cuando hay una información anterior que sugiere que el aminoácido o aminoácidos localizados en L2 establecen interacciones favorables con la pareja de unión de Fc, cuando están localizados en L1. Por ejemplo, si L2 contiene alanina y tirosina y la sustitución de dos aminoácidos en L1 para alanina y tirosina da lugar previamente a una variante de Fc con unión incrementada, la deleción de L1 puede crear una variante de Fc con afinidad incrementada para la pareja de unión de Fc.
De manera similar, una inserción de un segmento de polipéptido en un polipéptido Fc en el lado N-terminal de un bucle causa que las posiciones de los segmentos del bucle cambien hacia el lado C-terminal del bucle. En la Figura 7, una inserción de uno o más aminoácidos antes, es decir, N-terminal respecto a, el segmento L1 altera la conformación del bucle incluyendo un desplazamiento del segmento L1 hacia el extremo C-terminal del bucle. Este tipo de inserción se prefiere cuando se sabe que los aminoácidos localizados en el segmento L1 establecen interacciones favorables cuando están localizados en las posiciones L2, ya que la inserción puede dar lugar a interacciones Fc/pareja de unión de Fc más fuertes. Si se desean interacciones Fc/pareja de unión de Fc más débiles, la inserción puede usarse para cambiar aminoácidos no favorables a una nueva posición. Los segmentos insertados, delecionados y de referencia (L1 a L4 en la Figura 7) pueden ser uno o más de un aminoácido en el polipéptido Fc.
Alternativamente, pueden usarse inserciones o deleciones en el extremo C-terminal de bucles de una manera análoga a las inserciones o deleciones en el extremo N-terminal de bucles. Las inserciones en el extremo C del bucle pueden dar lugar a un movimiento de las posiciones N-terminales de la inserción hacia el extremo N del bucle. Las deleciones en el extremo C del bucle pueden dar lugar a un movimiento de las posiciones N-terminales de la deleción hacia el extremo C del bucle. La elección de usar una inserción o deleción en el extremo N-terminal o Cterminal del bucle se basa en los aminoácidos localizados en el bucle, el deseo de afinidad incrementada o disminuida de Fc/pareja de unión de Fc, y el cambio posicional deseado.
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Pueden usarse inserciones o deleciones en cualquier región de un polipéptido Fc, incluyendo los bucles, las regiones de hélice alfa, y lámina beta. Las localizaciones preferidas para inserciones y deleciones incluyen las regiones de bucle, que son aquellas que no son regiones en hélice alfa o lámina beta. Se prefieren los bucles porque aceptan generalmente alteraciones en el núcleo mejor que las hélices alfa o láminas beta. Las localizaciones particularmente preferidas para inserciones o deleciones que resultan en interacciones proteína/proteína más fuertes son en los extremos N-terminal o C-terminal de un bucle. Si las cadenas laterales del bucle están implicadas en las interacciones Fc/pareja de unión de Fc, las inserciones o deleción en los extremos dan lugar menos probablemente a cambios muy perjudiciales en las interacciones de unión. Las deleciones en el centro exacto del bucle eliminan más probablemente residuos importantes en la interfase Fc/pareja de unión de Fc y las inserciones en el centro exacto del bucle crean más probablemente interacciones desfavorables en la interfase Fc/pareja de unión de Fc. El número de residuos delecionado o insertado puede determinarse por el tamaño del cambio en el núcleo deseado prefiriéndose inserciones o deleciones de 15 o menos residuos, prefiriéndose más inserciones o deleciones de 10 o menos residuos, y siendo lo más preferido inserciones o deleciones de 5 o menos residuos.
Una vez se diseña la posición y tamaño de una variante de deleción de Fc, la secuencia completa de polipéptido se determina completamente y el polipéptido puede construirse por métodos conocidos en la técnica.
Las variantes de inserción de Fc, sin embargo, tienen la etapa adicional de diseñar la secuencia de al menos un aminoácido que se va a insertar. Las inserciones de residuos polares, incluyendo Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Gly, His, se prefieren en posiciones que se espera que van a estar expuestas en el polipéptido Fc. Los aminoácidos más pequeños, incluyendo Ser, Thr, y Ala, se prefieren particularmente ya que el tamaño pequeño interferirá estéricamente menos probablemente con las interacciones Fc/pareja de unión de Fc. Ser y Thr también tienen la capacidad de enlace de hidrogeno con átomos en la pareja de unión de Fc.
Las inserciones también tienen la flexibilidad añadida de que el polipéptido insertado puede diseñarse para establecer interacciones favorables con la pareja de unión de Fc como se desearía cuando se desea una unión Fc/pareja de unión de Fc más fuerte. La longitud de la inserción del núcleo puede determinarse modelando el núcleo variante con una secuencia genérica simple que se va a insertar. Por ejemplo, pueden construirse y modelarse inserciones de poliserina, poliglicina o polialanina de diferentes longitudes. El modelado puede hacerse por una variedad de métodos, incluyendo modelado de homología basado en estructuras tridimensionales conocidas de homólogos que comprenden la inserción, y por modelado informático incluyendo MODELLER (M.A. Marti-Renom et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 291-325, 2000) y ROSETTA (Kuhlman et al. (2003). Science 302, 13648). Típicamente, se generan inicialmente varias conformaciones de núcleo y la estructura final de núcleo puede determinarse después de establecer las identidades de la cadena lateral. Las cadenas laterales pueden diseñarse por algoritmos PDA® (US 6.188.965; 6.269.312; 6.403.312; 6.801.861; 6.804.611; 6.792.356. 6.950.754, y USSN 09/782.004; 09/927.790; 10/101.499; 10/666.307; 10/666311; 10/218.102).
Las inserciones y deleciones pueden hacerse para alterar la unión de polipéptidos Fc a FcgammaR de una manera análoga al método descrito para alterar las propiedades de unión de FcRn. Los dominios Fc se unen a FcgammaR en la posición indicada en la Figura 1. Las estructuras del complejo Fc/FcgammaR, incluyendo PDB códigos 1T89 y 1IIS (Radaev S et al. J. Biol. Chem. v276, p.16469-16477), demuestran los residuos que interaccionan y los bucles entre las dos estructuras. Los resultados de mutagénesis tales como los encontrados en US11/124620 y US6737056) tienen todos utilidad para determinar los cambios apropiados del posicionamiento del núcleo.
Pueden diseñarse inserciones y deleciones en cualquier polipéptido además de los polipéptidos Fc por los métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, pueden diseñarse inserciones o deleciones en el miembro de la superfamilia TNF, APRIL, con la ayuda de su estructura tri-dimensional (PDB código 1XU1.pdb, Hymowitz, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:7218). Pueden diseñarse inserciones o deleciones para incrementar la unión de APRIL a su receptor, TACI. Los residuos de bucle preferidos como sitios de inserción o deleción son los residuos Ser118-Val124, Asp164-Phe167, Pro192-Ala198, Pro221-Lys226. Estos bucles interaccionan con TACI en el complejo APRIL/TACI y median la unión.
Polipéptidos que incorporan variantes
Las variantes de IgG pueden basarse en secuencias de IgG humana, y así se usan secuencias de IgG humana como las secuencias "base" frente a las que se comparan otras secuencias, incluyendo pero no limitado a secuencias de otros organismos, por ejemplo secuencias de roedor y primate. Las variantes de IgG también pueden comprender secuencias de otras clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgE, IgD, IgM, y semejantes. Se contempla que, aunque las variantes de IgG se preparan por ingeniería en el contexto de una IgG parental, las variantes pueden prepararse por ingeniería en o "transferirse" en el contexto de otra, segunda IgG parental. Esto se hace determinando los residuos "equivalentes" o "correspondientes" y sustituciones entre la primera y segunda IgG, típicamente basado en homología de secuencia o estructural entre las secuencias de las IgG. Con el fin de establecer homología, la secuencia de aminoácidos de una primera IgG mostrada en la presente memoria se compara directamente con la secuencia de una segunda IgG. Después de alinear las secuencias, usando uno o más de los programas de alineamiento para homología conocidos en la técnica (por ejemplo, usando residuos conservados como entre especies), permitiendo inserciones y deleciones necesarias con el fin de mantener el alineamiento (es decir, evitando la eliminación de residuos conservados mediante deleción e inserción arbitraria), se
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preferidas de la presente invención incluyen las encontradas en la Figura 8. Alternativamente, las variantes preferidas de la presente invención incluyen las encontradas en la Figura 9. Además, alternativamente, las variantes preferidas de la presente invención incluyen las encontradas en la Figura 10. Estas variantes han mostrado una unión incrementada al receptor de Fc, FcRn, como se ilustra en los ejemplos.
Preparación de Variantes de IgG
Las variantes de IgG pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica. En una realización, las secuencias de variantes de IgG se usan para crear ácidos nucleicos que codifican las secuencias miembro, y pueden clonarse, expresarse y ensayarse en células huésped, si se desea. Estas prácticas se llevan a cabo usando procedimientos muy conocidos, y una variedad de métodos que pueden encontrar uso se describen en Molecular Cloning -A Laboratory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001), y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Los ácidos nucleicos que codifican las variantes de IgG pueden incorporarse en un vector de expresión con el fin de expresar la proteína. Los vectores de expresión incluyen típicamente una proteína unida de manera operativa, esto es, posicionada en una relación funcional, con secuencias de control o reguladoras, marcadores seleccionables, cualesquiera parejas de fusión, y/o elementos adicionales. Las variantes de IgG pueden producirse cultivando una célula huésped transformada con ácido nucleico, preferiblemente un vector de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica las variantes de IgG, bajo las condiciones apropiadas para inducir o causar la expresión de la proteína. Puede usarse una amplia variedad de células huésped apropiadas, incluyendo pero no limitado a células de mamífero, bacterias, células de insecto, y levaduras. Por ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden encontrar uso se describen en el catálogo de líneas celulares de ATCC, disponible en la American Type Culture Collection. Los métodos para introducir ácido nucleico exógeno en células huésped son muy conocidos en la técnica, y variarán con la célula huésped usada.
En una realización preferida, las variantes de IgG se purifican o aíslan después de la expresión. Los anticuerpos pueden aislarse o purificarse de varias formas conocidas para los expertos en la técnica. Los métodos estándar de purificación incluyen técnicas cromatográficas, electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, diálisis, concentración, y técnicas de cromatoenfoque. Como es muy conocido en la técnica, una variedad de proteínas naturales se unen a anticuerpos, por ejemplo las proteínas bacterianas A, G, y L, y estas proteínas pueden encontrar uso en la purificación. Frecuentemente, la purificación puede permitirse por una pareja de fusión particular. Por ejemplo, las proteínas pueden purificarse usando resina de glutatión si se emplea una fusión con GST, cromatografía de afinidad de Ni+2 si se emplea una etiqueta His, o anticuerpo anti-flag inmovilizado si se usa una etiqueta flag. Para las directrices generales sobre técnicas de purificación adecuadas, véase Antibody Purification: Principles and Practice, 3a Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994,.
Cribado de Variantes de IgG
Las variantes de Fc pueden cribarse usando una variedad de métodos, incluyendo pero no limitado a aquellos que usan ensayos in vitro, in vivo y ensayos basados en células, y tecnologías de selección. Pueden utilizarse tecnologías de cribado automatizadas y de alto rendimiento en los procedimientos de cribado. El cribado puede emplear el uso de una pareja de fusión o marcador, por ejemplo un marcador inmune, marcador isotópico, o marcador que es una molécula pequeña tal como un agente fluorescente o colorimétrico.
En una realización preferida, las propiedades funcionales y/o biofísicas de las variantes de Fc se criban en un ensayo in vitro. En una realización preferida, la proteína se criba para funcionalidad, por ejemplo su capacidad de catalizar una reacción o su afinidad de unión a su diana.
Como se conoce en la técnica, los subconjuntos de métodos de cribado son aquellos que seleccionan miembros favorables de una biblioteca. Los métodos se refieren en la presente memoria como "métodos de selección", y estos métodos encuentran uso en la presente invención para cribar variantes de Fc. Cuando se criban bibliotecas de proteínas usando un método de selección, sólo aquellos miembros de una biblioteca que son favorables, esto es que cumplen algunos criterios de selección, se propagan, aíslan, y/o observan. En la técnica se conoce una variedad de métodos de selección que pueden encontrar uso en la presente invención para el cribado de bibliotecas de proteínas. Otros métodos de selección que pueden encontrar uso en la presente invención incluyen métodos que no se basan en la exposición, tales como métodos in vivo. Un subconjunto de métodos de selección referidos como métodos de "evolución dirigida" son aquellos que incluyen el acoplamiento o reproducción de secuencias favorables durante la selección, algunas veces con la incorporación de nuevas mutaciones.
En una realización preferida, las variantes de Fc se criban usando uno o más ensayos basados en células o in vivo. Para dichos ensayos, las proteínas purificadas o no purificadas se añaden típicamente exógenamente de manera que las células se exponen a variantes individuales o conjuntos de variantes que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos se basan típicamente, pero no siempre, en la función del polipéptido Fc; esto es, la capacidad del polipéptido Fc de unirse a su diana y mediar algún evento bioquímico, por ejemplo función efectora, inhibición de la unión ligando/receptor, apoptosis, y semejantes. Dichos ensayos implican frecuentemente monitorizar la respuesta de células a la IgG, por ejemplo supervivencia celular, muerte celular, cambio en la morfología celular, o activación transcripcional tal como expresión celular de un gen natural o un gen informador. Por ejemplo, dichos ensayos pueden medir la capacidad de variantes de Fc para incitar ADCC, ADCP, o CDC. Para algunos ensayos, puede ser
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Se hizo mutagénesis dirigida a sitio usando el método Quikchange™ (Stratagene). Los plásmidos que contenían las sustituciones, inserciones, y deleciones deseadas se propagaron en células de E. coli One Shot TOP10 (Invitrogen) y se purificaron usando el Hi-Speed Plasmid Maxi Kit (Qiagen). El ADN se secuenció para confirmar la fidelidad de las secuencias.
Los plásmidos que contenían el gen de la cadena pesada (VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3) (tipo salvaje o variantes) se cotransfectaron con plásmido que contenía el gen de la cadena ligera (VL-Cκ) en células 293T. Se recogieron los medos 5 días después de la transfección, y los anticuerpos se purificaron del sobrenadante usando cromatografía de afinidad con proteína A (Pierce). Las características de unión a la proteína A de algunos Fc modificados se muestran en la Figura 26. Las concentraciones de anticuerpo se determinaron por el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce).
EJEMPLO 2: Medidas de la afinidad de unión
La unión de los polipéptidos Fc a ligandos Fc se ensayó con medidas de resonancia de plasmón superficial. Las medidas de resonancia de plasmón superficial (SPR) se llevaron a cabo usando un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore AB). El anticuerpo de tipo salvaje o variante se capturó usando proteína L inmovilizada (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), y se midió la unión al analito receptor. La proteína L se acopló covalentemente a un chip sensor CM5 a una concentración de 1 uM en 10 mM acetato de sodio, pH 4,5 en un chip sensor CM5 usando N-hidroxisuccinimida/N-etil-N'-(-3-dimetilamino-propil) carbodiimida (NHS/EDC) a una velocidad de flujo de 5 ul/min. La celda de flujo 1 de cada chip sensor se utilizó como simulación con NHS/EDC como un control negativo de unión. El tampón de corrida fue 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v Tensioactivo P20 (HBS-EP, Biacore, Uppsala, Suecia), y el tampón de regeneración del chip fue 10 mM glicina-HCl pH 1,5. Se unió 125 nM anticuerpo anti-HER2 de tipo salvaje o variante al chip CM5 de proteína L en HBS-EP a 1 ul/min durante 5 minutos. Se inyectaron el analito FcRn-His-GST, un FcRn fusionado con una etiqueta His y glutatión S transferasa, en diluciones seriadas entre 1 y 250 nM, durante 20 minutos asociación, 10 minutos disociación, en HBS-EP a 10 ul/min. La respuesta, medida en unidades de resonancia (RU), se adquirió a 1.200 segundos después de la inyección del receptor, reflejando la unión cerca del estado estacionario. Un ciclo con anticuerpo y tampón sólo proporcionó respuesta de línea base. Se generaron representaciones de RU frente a 1 / log concentración y se ajustaron a una respuesta a la dosis sigmoidal usando regresión no lineal con GraphPad Prism.
La unión de los polipéptidos Fc a ligandos Fc también se hizo con AlphaScreen™ (Ensayo Homógeneo de Proximidad Luminiscente Amplificada). AlphaScreen™ es un ensayo de proximidad luminiscente no radiactivo basado en lechos. La excitación con láser de un lecho donante excita al oxígeno, que si está lo suficientemente cerca del lecho aceptor generará una cascada de eventos quimioluminiscentes, dando lugar finalmente a emisión de fluorescencia a 520-620 nm. La ventaja principal del AlphaScreen™ es su sensibilidad. Debido a que un lecho donante emite hasta 60.000 moléculas de oxígeno excitado por segundo, la amplificación de la señal es extremadamente alta, permitiendo la detección tan abajo como niveles de attomolar (10-18). El anticuerpo de tipo salvaje se biotiniló por métodos estándar para la unión a lechos donantes de estreptavidina, y el ligando Fc etiquetado, por ejemplo FcRn, FcgammaR o Proteína A, se unió a lechos aceptores quelado con glutatión. El AlphaScreen™ se aplicó como un ensayo de unión directa en el que las interacciones Fc/ligando Fc juntan los lechos donantes y aceptores para crear la señal medida. Además, el AlphaScreen™ se aplicó como un ensayo de competición para cribar polipéptidos Fc diseñados. En ausencia de polipéptidos Fc competidores, el anticuerpo de tipo salvaje y FcRn interaccionan y producen una señal a 520-620 nm. Los dominios de Fc no etiquetados compiten con la interacción Fc de tipo salvaje/FcRn, reduciendo la fluorescencia cuantitativamente para permitir la determinación de afinidades de unión relativas.
EJEMPLO 3: Propiedades de unión a FcRn de variantes de Fc.
La afinidad de unión de Fc de IgG1 a FcRn se midió con anticuerpos variantes usando AlphaScreen™. Los polipéptidos Fc eran parte de Alemtuzumab o Trastuzumab. Alemtuzumab (Campath®, Ilex) es un anticuerpo monoclonal humanizado aprobado actualmente para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de células B (Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35:118-127,). Trastuzumab (Herceptin®, Genentech) es un anticuerpo anti-HER2/neu para el tratamiento de cáncer de mama metastásico.
Los datos de AlphaScreen™ competitivo se recogieron para medir la unión relativa de las variantes de Fc comparada con el anticuerpo de tipo salvaje en 0,1 M fosfato de sodio pH6,0 con 25mM cloruro de sodio. Los ejemplos de la señal de AlphaScreen™ como una función de anticuerpo competidor se muestran en la Figura 12. Las 12 curvas de las variantes mostradas, aquellas de P257L, P257N, V279E, V279Q, V279Y, ^281S, E283F, V284E, L306Y, T307V, V308F, y Q311V, demuestran afinidad incrementada ya que cada curva de variante se desplaza a la izquierda del tipo salvaje en su caja. Los datos de AphaScreen™ de competición para las variantes de Fc de la presente invención se resumen en las Figuras 13 y 14. Los datos de AlphaScreen™ de competición adicionales en 0,1M fosfato de sodio pH 6,0 con 125mM cloruro de sodio se resumen en la Figura 21. Se lista la unión relativa a FcRn de la variante comparada con el tipo salvaje. Los valores mayores se uno demuestran unión mejorada de la variante de Fc a FcRn comparada con el tipo salvaje. Por ejemplo, la variante E283L y V284E tienen una unión 9,5 veces y 26 veces más fuerte que el tipo salvaje, respectivamente. Las medidas de resonancia de
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