JP2004502946A - 改変された免疫原性を有するタンパク質ライブラリーを設計するためのタンパク質設計オートメーション - Google Patents
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Abstract
本発明は、宿主生物中で免疫反応を誘起する可能性が高いアミノ酸配列を同定し、そして改変することにより、タンパク質の免疫原性を調節するための、様々なコンピューター処理方法の使用に関するものである。特に、タンパク質を、MHC結合配列、T細胞エピトープおよびB細胞エピトープについてスクリーニングする。
Description
【0001】
本願は2000年7月10日に出願されたU.S.S.N.60/217,661の優先日の利益を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、宿主生物中で免疫反応を誘起する可能性が高いアミノ酸配列を同定し、そして改変することにより、タンパク質の免疫原性を調節するための、様々なコンピューター処理方法の使用に関するものである。特に、タンパク質を、MHC、T細胞受容体およびB細胞受容体結合配列についてスクリーニングする。
【0003】
発明の背景
外来のものと「自己」のものとの間の区別は、免疫監視の中で主要な重要点である。ウイルスや細菌などの外来性病原体由来タンパク質の同定は、獲得免疫において重大な段階である。同様の認識過程は、移植臓器拒絶中に、自己免疫疾患において生じ、そしてヒトにおいて外因性タンパク質または他の高分子を繰返しまたは継続して全身的に使用するときにも起こり得る。
【0004】
獲得免疫には2つの主要な武器がある:体液性免疫と細胞性免疫である。免疫グロブリンは、体液性免疫反応の最重要物である。Bリンパ球上の細胞表面受容体として、免疫グロブリンは、活性化、分化およびプログラムされた細胞死など多岐にわたる細胞反応の誘発を担う。抗体として分泌されると、免疫グロブリンは、外来抗原に結合し、それを直接中和するか、または補体もしくは単球性食細胞による抗体依存性細胞溶解などのエフェクター系を武装させ、徴集するのに必要な段階を開始させられる(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 3, pp 37−74)。
【0005】
T細胞は細胞性免疫を担う。T細胞は、標的細胞を直接的に殺すこと、そのようなキラーに補助を与えること、他の免疫系の細胞(即ち、マクロファージ)を活性化すること、B細胞が抗体反応を起こすのを補助すること、各種免疫系細胞の活性を下方調節すること、そしてサイトカイン、ケモカイン、および他の調整因子を分泌することが知られている。これらの活性は、性質の異なるタイプのTサイトカイン、ケモカイン、および他の調整因子によってしばしば媒介される。これらの活性は、α:βT細胞、1型および2型ヘルパー細胞などの性質の異なるタイプのT細胞によって、しばしば媒介される。T細胞の活性化は、その表面に並ぶ受容体(即ち、T細胞受容体またはTCR)を介して、T細胞が特定の抗原を認識するときに起こる。α:βT細胞(即ち、CD8+かつCD4+T細胞)は、主要組織適合性複合体(MHC)内にコードされる分子の1つと共同してのみ、そしてそれが適切な対立遺伝子変異体である場合にのみ、抗原を認識する。この現象はMHC拘束と呼ばれる(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 11, pp 367−409)。
【0006】
主要組織適合性複合体(MHC)分子は、外来タンパク質由来のポリペプチド断片(抗原)に結合し、これらのペプチドをT細胞表面の受容体に提示して免疫反応に至ることによって、認識過程において中心的な役割を演じる。MHC分子は、2種の別個の分子機能を満たすことにより、免疫反応におけるその主要な役割を達成する:ペプチドの結合、および通常α:βT細胞受容体(TCR)を介するT細胞との相互作用である。MHC IまたはMHC II分子によるペプチドの結合は、MHC分子を発現している細胞(抗原提示細胞、APC)が、それ自身のタンパク質(MCH I)または付近の細胞外環境から摂取したタンパク質(MCH II)のいずれかのサンプルになることを可能にする選択的事象である(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 8, pp 263−285)。
【0007】
ある細胞上のTCRと別の細胞上の相補的ペプチド−MHC複合体との間の相互作用は、T細胞および抗原提示細胞の個性によって決まる細胞内シグナルのカスケードを引き起こす。最終的に、TCR−ペプチド−MHC認識は、移植片および腫瘍拒絶、抗ウイルス細胞溶解、および抗体産生B細胞などの他の免疫細胞の徴集と制御を含む、免疫反応を調節する(Madden, D.R., (1995) Annu. Rev. Immunol., 13:587−622)。
【0008】
MHC分子は高度に多形であり、種々のヒトの集団中で対立遺伝子変異を示す(Buus、前出)。何百ものMHCクラスIおよびII対立遺伝子が既知であり、各々が特定の抗原ペプチド配列に対して異なる結合親和性を示す。この対立遺伝子依存性ペプチド選択性のための構造的偏重は、MHCペプチド結合ポケット内のアミノ酸残基における差異に集中している(Buus、前出)。特定の抗原ペプチドに結合したMHCクラスIおよびII分子のX線結晶構造は、NおよびC末端(即ち、アンカー位置)のペプチド残基がMHCクラスI結合ポケットと間近な物理的接触にあり、一方クラスIIに結合するペプチドは、MHCクラスIIポケットとの接触を形成している付加的ペプチド残基によりさらに延長されていること、を明らかにしている(Buus、前出)。
【0009】
MHC分子から抽出されるペプチドの詳細な配列分析により、いくつかの対立遺伝子特異的アミノ酸選択性が解明された(Buus、前出)。MHC分子に結合すると知られている何千ものペプチド配列からなるデータベースが編集され(Rammensee, H., et al. (1999) Immunogenetics, 50:213−219)、そして全長タンパク質配列を分析し、可能性のある抗原配列の存在を予測するためのいくつかの技法が開発された(Hiemstra, H.S. et al. (2000) Curr. Op. Immunol., 12:80−84; Malios, R.R., (1999) Bioinformatics, 15:432−439; Sturniolo, T., et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, 14:121−130; Mallios, R.R., (1998) J. Comp. Biol., 5:703−711; Savoie, C.J. et al. (1999) Pac Symp Biocomput, 182−9; Altuvia, Y., et al. (1997) Human Immunology, 58:1−11; Shastri, N. (1996) Curr. Op. Immunol., 8:271−277; Hammer, J. (1995) Curr. Op. Immunol., 7:263−269; Meister, G.E., et al. (1995) Vaccine, 13:581−591; Udaka, K., et al. (1995) J. Exp. Med., 181:20972108; Hammer, J. et al. (1994) Behring. Inst. Mitt. 94:124−132; Hammer, J., et al. (1994) J. Exp. Med., 180: 2353−2358; および Rudenshky, A. Y., et al. (1991) Nature, 353:622−627)。包括的なペプチド結合親和性は配列およびMHC対立遺伝子特異的であるが、各ペプチド残基の寄与は隣接残基の個性から独立しており、そして個々に総計され得る(Altuvia, et al., 前出)。アンカー残基の存在およびMHCクラスI結合ペプチドの長さは、MHCクラスII分子よりもMHCクラスI分子に対して良好な予測モデルを導く(Abrams and Schlom, (2000) Curr. Op. Immunol., 12:85−91)。
【0010】
抗原ペプチドのいずれの残基がTCRにより結合されるのかは、あまり明確ではないが、側鎖置換実験により、数々のペプチド−MHC複合体上のTCR結合部位の概略がマッピングされてきた。典型的に、異なるTCRは異なるが重複するMHCおよびペプチド側鎖のサブセットと接触することが見出された。TCR「足跡」は、結合したペプチドの中心に置かれ、ペプチド結合溝を形成する両αヘリックスの最上部にあるMHC側鎖を含む。ペプチド表面の大部分が埋没しているにも関わらず、結合したペプチドは、明らかに、顕著にTCR認識に寄与する。より最近の結果は、ペプチド配列中の各アミノ酸が独立してMHC−ペプチド−TCR複合体の親和性に寄与することを示唆している (Hemmer, B., et al., (1998), J. Immunol., 160:3631−3636)。
【0011】
体液性免疫の重要な構成要素は、Bリンパ球が産生する広範なレパートリーの抗体(即ち、免疫グロブリン)である。特異的B細胞との抗原接触は、B細胞抗原受容体(BCR)の膜貫通シグナル伝達機能を引き起こす。これが、今度は、MHCクラスII分子発現の増加および抗体分泌細胞の形成を含む、B細胞活性化における初期事象を誘導する。
【0012】
ポリペプチドの免疫原性の減少は、合理的(rational)部位特異的突然変異導入(Meyer, et al., (2001) Protein Science 10:491−503)、網羅的(exhaustive)部位特異的突然変異導入(Laroche, et al., (2000) Blood, 96:1425−1432; WO00/34317;WO98/52976)およびポリエチレングリコール誘導体の直接的化学カップリング(Tsutsumi, et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8548−8553)により達成されてきた。しかしながら、これらの方法は、特に多数の変異を同時に考慮すると、極度に時間を消費する。表面残基の合理的選択により免疫原性の減少を導けるが、いくつかの残基の置換は、不安定化し、折畳みを不十分にし得る。加えて、溶媒に露出する荷電残基の除去は、エネルギー的に不都合であり得る。
【0013】
これらの問題を克服する方法の1つは、コンピューター処理方法を使用して、標的タンパク質と比べて免疫原性が高いか、または低いが、適切な折畳みと活性を確保するための構造的特性を保持している配列を設計することである。
【0014】
従って、可能性のあるMHC、TCR、またはBCR結合ペプチドをスクリーニングするためのコンピューター処理方法の使用が、本発明の目的である。配列の生成および評価のための、幅広い各種の方法が既知である。これらには、配列プロファイリング (Bowie and Eisenberg, Science 253(5016): 164−70, (1991))、回転異性体ライブラリー選択法(Dahiyat and Mayo, Protein Sci 5(5): 895−903 (1996); Dahiyat and Mayo, Science 278(5335): 82−7 (1997); Desjarlais and Handel, Protein Science 4: 2006−2018 (1995); Harbury et al, PNAS USA 92(18): 8408−8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19: 244−255 (1994); Hellinga and Richards, PNAS USA 91: 5803−5807 (1994));および残基対ポテンシャル (Jones, Protein Science 3: 567−574, (1994))が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0015】
特に、U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926およびPCT US98/07254は、配列安定性を評価するための数々のスコア付け関数を利用する「タンパク質設計オートメーション」またはPDAと称する方法を記載している。
【0016】
さらに、免疫原性の改変のために作成および評価できるタンパク質配列の小型ライブラリーを選択するために、配列ライブラリーのスクリーニング用のコンピューター処理方法を提供することが、本発明の目的である。
【0017】
発明の概要
上記概説した目的に従って、本発明は、標的タンパク質の免疫原性の調節方法を提供する。その方法は、可変残基位置と共にタンパク質主鎖構造をコンピューターに入力する段階、コンピューター処理で一次変異配列のセットを生成させる段階、そしてコンピューター処理の免疫原性フィルターを一次変異配列のセットに対して適用し、少なくとも1つの候補変異タンパク質を同定する段階を含む。次いで候補タンパク質を作成し、標的タンパク質と比較して候補タンパク質の免疫原性が改変されたか否かを判定するために試験する。
【0018】
本方法は、各可変残基位置を、コア、表面または境界残基のいずれかに分類することをさらに含む。コンピューター処理で生成させる段階は、行き止まり排除法(Dead−End−Elimination:DEE)コンピューター計算またはモンテカルロ検索を含み得る。一般に、一次変異配列は、ファンデルワールスポテンシャルスコア付け関数、水素結合ポテンシャルスコア付け関数、原子溶媒和スコア付け関数、二次構造傾向スコア付け関数および静電気スコア付け関数からなる群から選択される少なくとも1種のスコア付け関数に最適化される。
【0019】
さらなる態様では、標的タンパク質は非ヒト種由来であり、候補変異タンパク質は、ヒトにおいてより低い免疫原性または非免疫原性を付与される。
【0020】
さらなる態様では、本発明は標的タンパク質の免疫原性の調節方法を提供する。その方法は、可変残基位置と共にタンパク質主鎖をコンピューターに入力する段階、コンピューター処理の免疫原性フィルターを適用し、少なくとも1つの変異タンパク質を同定する段階、適正な折畳みおよび安定性について該変異タンパク質をコンピューター処理で分析し、一次変異アミノ酸配列のセットを生成させる段階を含む。
【0021】
図面の簡単な説明
図1は、全長遺伝子の合成およびPCRによる可能な全変異導入を描く。全長遺伝子(黒い棒線、段階1)に対応する重複オリゴヌクレオチドを合成し、加熱し、アニーリングする。アニーリングしたオリゴヌクレオチドにPfu DNAポリメラーゼを添加することにより、DNAの5’→3’合成に至り(段階2)、さらに長いDNA断片を産生する(段階3)。加熱、アニーリングの反復周期(段階4)により、いくつかの全長分子を含む、さらに長いDNAが産生される結果となる。これらは、全長遺伝子の末端に対応するプライマー(矢印)を用いて第2ラウンドのPCRにより選択できる(段階5)。
【0022】
図2は、本発明のライブラリーを合成するための、好ましいスキームを示す。野生型遺伝子、または大域的極小(global minimum)遺伝子のための遺伝子などの、いかなる出発遺伝子も使用できる。様々な変異部位で様々なアミノ酸を含むオリゴヌクレオチドを、標準的なプライマーを使用するPCRにおいて使用できる。これは、一般的に、要するオリゴヌクレオチドはより少なく、そして結果としてエラーがより少なくなる。
【0023】
図3は、重複伸張法を示す。図3の最上段は、変異させる領域(黒色のボックス)の場所と、関連するプライマー(矢印)の結合部位を示した鋳型DNAである。プライマーR1とR2は、プライマーのプールを表し、各々が異なる変異を含む;ここで記載したように、これは、所望により様々な比率のプライマーを使用して行い得る。変異部位は、ハイブリダイゼーションを行うのに十分な相同性がある領域に隣接する。この例では、3つの別個のPCR反応が段階1で行われる。第1の反応は、鋳型に加えてオリゴF1とR1を含む。第2の反応は、鋳型に加えてF2とR2を含み、第3の反応は、鋳型に加えてF3とR3を含む。反応生成物を示す。段階2では、段階1のチューブ1と、段階1のチューブ2の生成物を用いる。精製してプライマーを除いた後、これらをF1とR4と共に、新しいPCR反応に添加する。PCRの変性段階の間に、重複領域がアニーリングし、第2鎖が合成される。次いで、生成物を外側のプライマーにより増幅する。段階3では、精製した段階2の生成物を、段階1のチューブ3の生成物およびプライマーF1とR3と共に、第3のPCR反応に用いる。最終生成物は、全長遺伝子に相当し、求める変異を含む。
【0024】
図4は、本発明のライブラリーを合成するための、PCR反応生成物のライゲーションを示す。この技法では、プライマーは、平滑末端、5’オーバーハング末端、または3’オーバーハング末端のいずれかのエンドヌクレアーゼ制限部位(RE)も含む。我々は、段階1に、3つの別個のPCR反応をセットアップした。第1の反応は、鋳型に加えてオリゴF1とR1を含む。第2の反応は、鋳型に加えてF2とR2を含み、第3の反応は、鋳型に加えてF3とR3を含む。反応生成物を示す。段階2では、段階1の生成物を精製し、次に適切な制限エンドヌクレアーゼで切断する。段階2のチューブ1および段階2のチューブ2由来の切断生成物を共にDNAリガーゼでライゲーションする。次いで、段階4では、プライマーF1とR4を用いて生成物を増幅する。増幅された生成物を切断し、それらを段階2のチューブ3の切断生成物にライゲーションし、そして最終生成物をプライマーF1とR3で増幅することにより、全プロセスを繰り返す。2つの制限酵素部位(RETとRE2)が異なれば、段階1の3つの全PCR産物を、1反応でライゲーションすることも可能である。
【0025】
図5は、PCR産物の平滑末端ライゲーションを描く。この技法では、F1とR1のようなプライマーは重複しないが隣接する。再び3つの別個のPCR反応を実施する。チューブ1とチューブ2の生成物をライゲーションし、外側のプライマーF1とR4で増幅する。次いで、この生成物を、段階1のチューブ3の生成物とライゲーションする。次いで、最終生成物をプライマーF1とR3で増幅する。
【0026】
発明の詳細な説明
本発明は、改変された免疫原性を有するタンパク質配列の小型ライブラリー(1013以下の構成員を含み得る)を選択するための、タンパク質配列ライブラリー(1080以下またはそれ以上の構成員を含み得る)のコンピューター処理スクリーニングの使用方法を対象としている。例えば、免疫原性が減少したタンパク質を所望するならば、免疫反応を誘起すると知られている残基を同定し、タンパク質の天然の折畳みと安定性を維持する補償の残基と置換するために、コンピューター処理のフィルターを使用でき、その結果、非免疫原性であるか、または開始タンパク質よりも低免疫原性であるタンパク質が生じる。
【0027】
あるいは、免疫原性が増加したタンパク質を設計することが所望であり得る。この場合、残基を変更して抗原モチーフを導入し、生じるタンパク質の適正な折畳みと安定性を確保するために、コンピューター処理のフィルターを適用できる。
【0028】
一般に、このことは2つの一般的方法のうちの1つで成し得る。第1の実施態様では、コンピューター処理による加工を、安定性などの特性が改変された変異タンパク質のリストを生成させるために使用する。次いで、コンピューター処理のフィルターを、免疫原性が改変された傾向が強い変異体を選択するために適用する。
【0029】
あるいは、免疫原性を改変された傾向のある変異体のリストを生成させるためにコンピューター処理のフィルターを最初に適用し、次いで折畳まれているか、または安定であると考えられる変異体を選択するために、コンピューター処理による加工を行う。
【0030】
特に、MHCクラスIおよびクラスII分子、T細胞およびB細胞に結合する可能性のあるペプチド断片またはアミノ酸残基をスクリーニングするために、コンピューター処理のフィルターを使用する。例えば、MHCリガンドとペプチドモチーフのデータベースを検索し、可能性のあるMHCクラスIまたはクラスII結合配列を同定するために、使用できる(Rammensee, H., et al. (1999) Immunogenetics, 50:213−219)。次いで、MHC分子への結合に関連するアミノ酸残基を、構造的、化学的に補償するために、コンピューター処理方法を使用する。例えば、標的タンパク質よりも免疫原性が低い変異タンパク質が望ましいならば、免疫反応を誘起すると予測されるペプチド配列またはアミノ酸残基を同定し、これらの残基を非免疫原性と予測される残基で置換し、次いで生じた配列から、適正に折畳まれ、かつ安定である配列をスクリーニングするために、コンピューター処理方法を使用できる。
【0031】
抗体結合表面残基の適切な置換を判定するための法則が明らかになっている (Meyer, D.L., et al. (2001) Protein Science, 10:491−503; Laroche, Y., (2000) Blood, 96:1425−1432; and Schwartz, H.L., (1999) J. Mol. Biol., 287:983−999 参照)。例えば、芳香族の表面残基は、抗原抗体結合に関与する。チロシンなどの芳香族の表面残基を、セリン、アラニンまたはグリシンなどの小型残基で置換することができる。同様に、荷電側鎖の大型パッチを、セリンまたはアラニンなどの小型親水性残基で置換できる。次いで、天然の折畳みおよび安定性の維持を補償する配列変化を決定するために、コンピューター処理方法を適用できる。
【0032】
標的タンパク質の免疫原性を増加させることが望ましい状況もある。例えば、特定のエピトープに対するT細胞集団の活性化は、ウイルス性病原体または腫瘍形成を制御または排除するのに密接な関係を有する。この場合、固定度が低く、構造的な制限が少ない標的タンパク質のループ領域にT細胞エピトープを導入するために、コンピューター処理方法を使用できる。その際、エピトープ挿入に隣接する残基を変更するために、コンピューター処理方法を使用し、天然のタンパク質と移植したエピトープとの間のエネルギー的適合性を確保する。
【0033】
従って、本発明は、標的タンパク質の免疫原性の調節方法を提供する。本明細書における「調節」は、標的タンパク質に対する免疫反応が改変されることを意味する。つまり、標的タンパク質が所定の種で免疫反応を誘引するならば、免疫反応が減少するか、または増強されるように、標的タンパク質のアミノ酸配列を変化させる。本明細書における「減少」は、野生型タンパク質と比較して少なくとも1つの免疫学的反応が低減することを意味する。本明細書における「増強」は、野生型タンパク質と比較して少なくとも1つの免疫学的反応が増加することを意味する。当業者に認識されるように、反応を誘引する能力がある全同定配列を改変する必要があるわけではない。例えば、一般に免疫反応は、免疫グロブリンおよび他の血清タンパク質などの、自己由来循環タンパク質に対しては起こらない。従って、反応を誘起する能力のある配列の少なくとも5%を改変する。好ましくは少なくとも10%の配列を改変し、少なくとも15%の配列を改変するのがより好ましく、少なくとも20%の配列を改変するのがさらにより好ましく、少なくとも30%の配列を改変するのがさらにより好ましく、少なくとも40%の配列を改変するのがさらにより好ましく、少なくとも50%の配列を改変するのがより好ましく、100%の配列を改変するのが最も好ましい。
【0034】
改変された免疫原性は、特定の宿主生物内で定義されることに留意すべきである。つまり、好ましい実施態様では、標的タンパク質(下記定義の通り)は、改変された免疫原性をヒト内で示すために改変される。これに代る宿主生物には、げっ歯類(ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど)、霊長類、家畜動物(ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなど)、および家内動物(ネコ、イヌ、ウサギなど)が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【0035】
本明細書における「免疫原性」は、免疫反応を誘起するタンパク質の能力を表す。免疫反応を誘起するタンパク質の能力は、タンパク質内のアミノ酸配列または配列類に依存する。免疫反応を誘起する能力があるアミノ酸配列は、本明細書で「免疫原性配列」と表す。好ましくは、免疫原性配列は、下記概説のように「MHC結合部位」、「T細胞エピトープ」および「B細胞エピトープ」を含む。
【0036】
本明細書で定義するように、免疫原性の定義は、用語「抗原性」を包含するに十分なほど広範である。「抗原性」は、非自己分子と認識されるとタンパク質が単独で抗体反応を誘起する能力を表す。
【0037】
免疫原性配列を有するタンパク質によって誘起された反応には、免疫系の両構成要素が含まれる:体液性免疫と細胞性免疫である。従って、本発明の文脈における「免疫反応」は、体液性または細胞性免疫反応のいかなる構成要素をも含む。概説すると、免疫原性配列を有するタンパク質をヒトに投与すると、そのタンパク質は免疫系の体液性と細胞性の両武器の監視下におかれる。タンパク質が外来性と認識され、かつ免疫系がまだそのタンパク質内の免疫原性配列に対して寛容でない場合、免疫系はそのタンパク質に対して反応する。体液性免疫反応では、表面に免疫グロブリン(Ig)を表示している未成熟B細胞は、個々の免疫グロブリンに適合する親和性があり、かつIgがB細胞エピトープに接近できるようにB細胞エピトープが露出している場合、タンパク質内の1つまたはそれ以上の配列(B細胞エピトープ)に結合できる。タンパク質へのIg結合の過程は、好適なサイトカインの存在下で、B細胞が分化分裂するように刺激して、タンパク質と複合体を形成できる可溶性形態の原型Igを提供し、個体からのタンパク質の除去を促進できる。
【0038】
効果的なB細胞反応は、可溶性抗体を生じるのに必要なサイトカインおよび他のシグナルを与えるために、平行してT細胞反応も含む。効果的なT細胞反応には、抗原提示細胞(APC)によるタンパク質またはその断片の取込みが必要である;APCには、B細胞、またはマクロファージ、樹状細胞および他の単球などの他の細胞が含まれる。次いでAPCはMHCクラスII分子と複合体を形成したタンパク質を細胞表面に提示する。そのようなペプチド−MHC II複合体は、T細胞受容体を介してヘルパーT細胞によって認識されることができ、そしてこのことは、抗体産生細胞への分化においてB細胞に補助を与える、T細胞刺激およびサイトカインの分泌に至る。上記議論から分かるように、免疫原性タンパク質に対する効果的な一次免疫反応には、一般に、BおよびT細胞特異的配列またはエピトープに対するBおよびT細胞反応の組合せが必要である。
【0039】
あるいは、免疫原性配列がMHCクラスI分子に特異的である場合、MHC I抗原加工/提示経路が関わる。MHCクラスI分子は、感染病原体由来タンパク質または「自己」分子の断片を集め、次いでAPCの表面にこれらの断片を表示する。結合したペプチドは細胞傷害性Tリンパ球のTCRに認識され、細胞性免疫反応の一次抗原決定基である。従って、免疫原性の調節には、T細胞反応を刺激するペプチド、即ちT細胞エピトープを同定すること、そのタンパク質への細胞性反応が減少または増強されるようにそれらのペプチドの配列を変化させること、が含まれる。加えて、免疫原性の調節には、B細胞反応を刺激するペプチド、即ち「B細胞エピトープ」または「BCR」を同定すること、そのタンパク質への体液性の反応が改変されるようにこれらのペプチドの配列を変化させること、も含まれる。当業者に理解されるように、単一のタンパク質はTおよびB細胞エピトープの両方を含有し得るので、両方の調節により、免疫系の体液性と細胞性の両武器を改変し得る。
【0040】
好ましい実施態様では、MHC I反応を改変するように標的タンパク質を改変する。MHCクラスI分子は、感染しているウイルス、細胞内寄生生物、または正常に発現しているか、腫瘍形成により制御を逸脱した自己タンパク質に由来するタンパク質断片を集め、これらの分子の断片を細胞表面に表示する。細胞表面では、APC上に露出している、細胞に結合したMHC I−ペプチド複合体がT細胞に対して表示される。MHC I分子の第2の特徴は、特定のMHC−ペプチド複合体を有するAPCが適切なTCRと噛合うようにする、TCRとの相互作用能力である。このことは、標的としてのAPCの細胞溶解を導く細胞性のプログラム、および/またはT細胞によるリンホカインの分泌の活性化における第1段階である。TCRとの相互作用はペプチドとMHC分子の両方に依存する。MHCクラスI分子は、CD8+細胞に対する選択的制限を示す。MHCクラスI分子のさらなる機能は、ナチュラルキラー細胞へのシグナル伝達の要素として作用することである(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 8, pp 263−285)。
【0041】
好ましい実施態様では、MHC II反応を改変するように標的タンパク質を改変する。MHCクラスI分子と同様の分子メカニズムを活用して、MHCクラスII分子は、MHC IIを発現しているAPCにより摂取されたタンパク質の分解に由来するペプチドに結合し、特異的T細胞に認識されるようにそれらを細胞表面に表示する。MHC II抗原提示経路は、MHC IIαβヘテロダイマーの、二重機能分子、即ち、不変鎖(Ii)との最初の会合をベースとする。Iiは、αβヘテロダイマーが抗原ペプチドと出会うエンドソームの酸性のタンパク質加工場所へ、αβヘテロダイマーを導くシャペロンとして作用する。抗原ペプチドをMHC II分子にロードする(load)過程により、MHC IIペプチド複合体の細胞表面提示が導かれる。MHC IIを認識しているT細胞は、次いでリンホカインを分泌し、増殖するように誘導され得る。MHCクラスII分子は、CD4+細胞に選択的制限を示す(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 8, pp 263−285)。
【0042】
好ましい実施態様では、TCR反応を改変するように標的タンパク質を改変する。TCRは、2つの別個のヘテロダイマー、αβまたはγδとして生じ、これらの両者は非多型CD3ポリペプチドγ、δ、ε、ζと共に発現する。CD3ポリペプチド、特にζおよびその変異体は、細胞内シグナル伝達に非常に重要である。αβTCRヘテロダイマー発現細胞は、ほとんどのリンパ球区画で支配的であり、古典的なヘルパーまたは細胞傷害性T細胞反応を担う。ほとんどの場合、αβTCRリガンドは、クラスIまたはクラスII MHC分子に結合したペプチド抗原である(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 10, pp 341−367)。
【0043】
好ましい実施態様では、BCR反応を改変するように標的タンパク質を改変する。特異的B細胞との抗原の接触は、B細胞抗原受容体(BCR)の膜貫通シグナル伝達機能を引き起こす。BCR分子は、抗原結合後迅速に内在化し、抗原取込みおよびエンドソームまたはリソソームにおける分解を導く。タンパク質抗原の場合、抗原由来ペプチドは、クラスII MHC分子の溝の中で結合する。結合すると、この複合体は細胞表面に送達され、そこで特異的ヘルパーT細胞の刺激物質として作用する。ヘルパーT細胞による抗原認識は、ヘルパーT細胞が緊密かつ長期継続であるB細胞との相互作用を形成し、B細胞増殖および分化因子を合成するように誘導する。このようにして活性化されたB細胞は、増殖し、ついには抗体分泌細胞(プラズマ細胞とも呼ばれる)に分化する(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapters 6−7, pp 183−261)。
【0044】
従って、本発明は標的タンパク質の免疫原性の調節方法を対象としている。本明細書において「標的タンパク質」とは、共有結合した少なくとも2つのアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。該タンパク質は、天然産生のアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造、即ち、ペプトイド(peptoid)などの「類似体」(Simon et al., Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 89 (20):9367−71 (1992)参照)からなってもよく、一般に合成法に依存する。従って本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、天然産生のアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明のためのアミノ酸と考えられる。また「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基が含まれる。加えて、本発明の変異タンパク質の構成要素を表すいかなるアミノ酸も、同じアミノ酸であるが反対のキラリティーのもので置換できる。従って、L配置で天然に産生するいかなるアミノ酸(これらは化学物質の構造によって、RまたはSとも呼ばれる)も、同じ化学構造であるが反対のキラリティーのアミノ酸で置換できる。これは一般にDアミノ酸と呼ばれるが、その組成および化学配置によってさらにRまたはSと呼ばれる。そのような誘導体は、安定性が大幅に増加する特性を有し、従って経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、局所、直腸、眼内または他の経路で投与するときに、インビボでのハーフライフがより長い化合物の形成に有利である。
【0045】
好ましい実施態様では、該アミノ酸は(S)またはL配置である。非天然産生側鎖を用いる場合は、例えばインビボ分解の防止または遅延のために非アミノ酸置換基を用いてもよい。非天然産生アミノ酸を含むタンパク質は、合成してもよく、組換え的に作成する場合もある;van Hest et al., FEBS Lett 428:(1−2) 68−70 May 22 1998 and Tang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S218:U138−U138 Part 2 August 22, 1999 を参照のこと。両者を出典明示により本明細書の一部とする。
【0046】
芳香族アミノ酸は、D−またはL−ナフィル(naphyl)アラニン、D−またはL−フェニルグリシン、D−またはL−2−チエニルアラニン、D−またはL−1−,2−,3−または4−ピレニルアラニン、D−またはL−3−チエニルアラニン、D−またはL−(2−ピリジニル)−アラニン、D−またはL−(3−ピリジニル)−アラニン、D−またはL−(2−ピラジニル)−アラニン、D−またはL−(4−イソプロピル)−フェニルグリシン、D−(トリフルオロメチル)−フェニルグリシン、D−(トリフルオロメチル)−フェニルアラニン、D−p−フルオロフェニルアラニン、D−またはL−p−ビフェニルフェニルアラニン、D−またはL−p−メトキシビフェニルフェニルアラニン、D−またはL−2−インドール(アルキル)アラニン、およびD−またはL−アルキルアイニン(ainine)(ただしアルキルは置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、sec−イソチル(isotyl)、イソ−ペンチル、C1−C20の非酸性アミノ酸である)で置換してもよい。
【0047】
酸性アミノ酸は、非限定的な例として(ホスホノ)アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、または セリン;または硫酸化 (例えば、−SO3H) スレオニン、セリン、またはチロシンなどの、負電荷を維持している非カルボン酸アミノ酸およびそれらの誘導体または類似体で置換できる。
【0048】
他の置換には、任意の天然アミノ酸と「アルキル」を組合せて作成し得る非天然水酸化アミノ酸が含まれ得る。本明細書で使用する用語「アルキル」は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラシシルなどの、1ないし24個の炭素原子の分枝または非分枝飽和炭化水素基を意味する。アルキルには、窒素、酸素および硫黄原子を有するヘテロアルキルが含まれる。本発明で好ましいアルキル基は、1ないし12個の炭素原子を含有する。塩基性アミノ酸は、天然産生アミノ酸のリシン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、または(グアニジノ)−酢酸、または他の(グアニジノ)アルキル−酢酸(但し、「アルキル」は上記定義の通りである)の任意の位置でアルキル基で置換し得る。ニトリル誘導体(例えば、COOHの代りにCN部分を含有する)も、アスパラギンまたはグルタミンを置換し得、そしてメチオニンスルフォキシドはメチオニンを置換し得る。そのようなペプチド誘導体の調製方法は、当業者に周知である。
【0049】
加えて、任意の変異ポリペプチド中の任意のアミド結合を、ケトメチレン部分で置換することができる。そのような誘導体は、酵素による分解に対する安定性が増加している特性を有し、従って経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、局所、直腸、眼内または他の経路で投与するときに、インビボでのハーフライフがより長い化合物の形成に有利であると期待される。
【0050】
本発明の変異ポリペプチドのアミノ酸のさらなるアミノ酸修飾には、以下のものが含まれ得る:システイニル残基を2−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのアルファ−ハロ酢酸塩(および相応するアミン)と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−(5−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、p−クロロ水銀安息香酸塩、2−クロロ水銀−4−ニトロフェノール、またはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールなどの化合物との反応によっても誘導体化し得る。
【0051】
ヒスチジル残基は、ジエチルプロ炭酸塩(例えばpH5.5−7.0で、なぜならこの物質はヒスチジル側鎖に比較的特異的であるので)などの化合物との反応により誘導体化し得、パラ−ブロモフェナシル(bromophenacyl)臭化物も使用し得る;例えば、その場合、好ましくはpH6.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム中で反応を実施する。
【0052】
リシニルおよびアミノ末端残基は、スクシン酸または他のカルボン酸無水物と反応させ得る。これらの試薬による誘導は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有すると期待される。
【0053】
アルファ−アミノ含有残基を誘導するのに適する他の試薬には、イミドエステル/例えばメチルピコリンイミダート;ピリドキサルリン酸塩;ピリドキサール;クロロボロヒドリド;トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;2,4ペンタンジオンなどの化合物;およびグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、1または複数の従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応により、既知方法の段階に従って修飾し得る。アルギニン残基の誘導には、グアニジン官能基のpKaが高いために、反応をアルカリ性条件で実施することが必要である。さらに、これらの試薬は、アルギニンのイプシロン−アミノ基と同様に、リシンの基と反応させ得る。芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりスペクトル標識をチロシル残基に導入するためなどの、チロシル残基自体の特異的修飾は周知である。
【0054】
N−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、各々O−アセチルチロシル種および3−ニトロ誘導体を形成するために使用し得る。カルボキシル側鎖基(アスパルチルまたはグルタミル)は、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R’−N−C−N−R’)との反応により、選択的に修飾し得る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換し得る。
【0055】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に相応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は穏かな酸性条件下で脱アミド化し得る。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内にある。
【0056】
標的タンパク質は、3次元構造が既知であるかまたは生成できる、即ちタンパク質の各原子について3次元座標が存在する任意のタンパク質であり得る。一般的に、これは、X線結晶技法、NMR技法、新規モデリング、相同性モデリングなどを用いて測定できる。一般に、X線構造を使用する場合、2Å解像能またはそれより高解像能での構造が好ましいが、必ずしも必要なわけではない。
【0057】
本発明の標的タンパク質は、細菌(古細菌のような好極限性細菌を含む)、真菌、昆虫、魚類および哺乳動物などの原核生物および真核生物に由来し得る。適する哺乳動物には、げっ歯類(ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど)、霊長類、家畜動物(ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む)が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、最も好ましい実施態様では、ヒト由来である。
【0058】
即ち、本明細書では「標的タンパク質」は、好ましくは免疫原性が改変された変異体のライブラリーが望まれるタンパク質を意味する。当業者に理解されるように、いかなる数の標的タンパク質も本発明では有用である。具体的には、酵素ドメイン、結合ドメインなどの機能的ドメイン、およびターン、ループなどの小型フラグメントを含む、既知タンパク質のフラグメントおよびドメインは、「タンパク質」の定義内に含まれる。即ち、タンパク質の一部も同様に使用され得る。さらに、本明細書で使用する「タンパク質」は、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。さらに、タンパク質変異体、即ち非天然産生タンパク質類似体構造も使用され得る。
【0059】
適するタンパク質には、リガンド、細胞表面受容体、抗原、抗体、サイトカイン、ホルモン、転写因子、シグナルモジュール、細胞骨格タンパク質および酵素を含む、産業用、医薬用および農業用タンパク質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。適する種類の酵素には、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼなどの加水分解酵素、ラセマーゼ、エピメラーゼ、タウトメラーゼ、またはムターゼなどのイソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、オキシドリダクターゼおよびホスファターゼがあるが、これらに限定されるわけではない。適する酵素はスイス−プロット酵素データベースに列挙されている。適するタンパク質主鎖には、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB, 前身は the Brookhaven National Lab)により編集および提供されたタンパク質データベースに見出されるもの全てが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0060】
特に、好ましい医薬用標的タンパク質には、サイトカイン類(IL−1ra(+受容体複合体)、IL−1(受容体単独)、IL−1a、IL−1b(変異体および/または受容体複合体を含む)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−10、IFN−β、INF−γ、IFN−α−2a;IFN−α−2B、TNF−α;CD40リガンド(chk)、ヒト肥満タンパク質レプチン、顆粒球コロニー刺激因子、骨形態形成タンパク質−7、毛様体神経栄養因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、単球化学誘導タンパク質1、マクロファージ遊走阻止因子、ヒトグリコシル化阻害因子、ヒトランテス、ヒトマクロファージ炎症タンパク質1ベータ、ヒト成長ホルモン、白血病阻害因子、ヒト黒色腫増殖刺激活性、好中球活性化ペプチド−2、Cc−ケモカインMcp−3、血小板因子M2、好中球活性化ペプチド2、エオタキシン(Eotaxin)、間質細胞由来因子−1、インシュリン、インシュリン様増殖因子I、インシュリン様成長因子II、トランスフォーミング増殖因子B1、トランスフォーミング増殖因子B2、トランスフォーミング増殖因子B3、トランスフォーミング増殖因子A、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、神経発育因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、神経膠細胞由来神経栄養因子(およびPDB1/12/99における55のサイトカイン類));ウロキナーゼ;エリトロポイエチン;ヘッジホッグ(hedgehog)・ソニック、ヘッジホッグ・デザート、ヘッジホッグ・インディアン、hCGを含むがこれらに限定されるわけではない、他の細胞外シグナル伝達部分;TPAおよび因子VIIaを含むがこれらに限定されるわけではない、凝固因子;p53、p53四量体化ドメイン、Znフィンガー(そのうち12個以上が構造を有する)、ホメオドメイン(そのうち8個が構造を有する)、ロイシンジッパー(そのうち4個が構造を有する)を含むがこれらに限定されるわけではない、転写因子;cFvを含むがこれらに限定されるわけではない、抗体;血球凝集素四量体化ドメインおよびhiv Gp41エクトドメイン(融合ドメイン)を含むがこれらに限定されるわけではない、ウイルスタンパク質;SH2ドメイン(そのうち8構造は既知である)、SH3ドメイン(そのうち11個は構造を有する)、およびプレクスチン相同性ドメインを含むがこれらに限定されるわけではない、細胞内シグナルモジュール;Gp130のヒト組織因子サイトカイン結合性領域の細胞外領域、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、TNF受容体、IL−1受容体、IL−1受容体/IL1ra複合体、IL−4受容体、INF−γ受容体アルファ鎖、MHCクラスI、MHCクラスII、T細胞受容体、インシュリン受容体、インシュリン受容体、インシュリン受容体チロシンキナーゼおよびヒト成長ホルモン受容体を含むがこれらに限定されるわけではない、受容体を含む、既知構造を有するもの(変異体を含む)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0061】
特に、好ましい産業用標的タンパク質には、プロテアーゼ(パパイン、サブチリシンを含むが、これらに限定されるわけではない)セルラーゼ(エンドグルカナーゼI、IIおよびIII、エキソグルカナーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、IIおよびIIIを含むが、これらに限定されるわけではない)、カルボヒドラーゼ(グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコースイソメラーゼを含むが、これらに限定されるわけではない)およびリパーゼを含む、既知構造を有するもの(変異体を含む)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0062】
特に、好ましい農業用標的タンパク質には、キシロースイソメラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ルビスコ、ADPグルコースフロホスホルリアーゼ、並びに油生合成、ステロール生合成、炭水化物生合成および二次代謝物の合成に関わる酵素を含む、既知構造を有するもの(変異体を含む)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0063】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、標的タンパク質で開始すること、および一次配列のセットを生成させるためにコンピューター処理分析を使用することを包含する。関連するタンパク質の配列アラインメント、構造アラインメント、構造予測モデル、データベース、または(好ましくは)タンパク質設計オートメーションのコンピューター処理分析を含む、使用できる多様なコンピューター処理方法がある。同様に、(分子力学計算、モンテカルロ分析などの任意の数の技法を使用して)出発構造を乱してタンパク質を変化させること(主鎖および側鎖のねじれ角の変化を含む)によって創出した骨格構造のセットを使用する配列スクリーニングを介して、一次変異配列ライブラリーを生成できる。各出発構造(または、上位配列のいくつかのセット)について最適配列を選択し、一次変異配列ライブラリーを作成する。
【0064】
これらの技術のいくつかにより、一次ライブラリー中の配列リストがある特定の基準をベースとして「スコア付け」または「ランク付け」される結果となる。いくつかの実施態様では、ランク付け無しで生成される配列リストに、その後下記に概説する技術を使用してランク付けすることができる。
【0065】
一般的に、一次変異配列ライブラリーの生成に使用できる様々なコンピューター処理方法がある。好ましい実施態様では、配列をベースとする方法が使用される。あるいは、下記に詳述するPDAのような、構造をベースとする方法を使用する。高精度で配列の相対エネルギーを評価するための他のモデルには、出典明示により本明細書の一部とする Warshel, Computer Modeling of Chemical Reactions in Enzymes and Solutions, Wiley & Sons, New York, (1991) が含まれる。
【0066】
同様に、変異配列スコアを個々に計算し、ランク順リストを編集することにより配列をコンピューター処理でスクリーニングするために、分子力学計算を使用できる。
【0067】
好ましい実施態様では、コンピューター処理のスクリーニング中に配列をスコア付けするために、残基対ポテンシャルを使用できる(Miyazawa et al. Macromolecules 18(3):534−552 (1985) 、出典明示により本明細書の一部とする)。
【0068】
好ましい実施態様では、配列をスコア付けするために、配列プロフィール評価(Bowie et al. Science 253 (5016): 164−70 (1991) 出典明示により本明細書の一部とする)および/または平均力のポテンシャル(Hendlich et al. J.Mol.Biol. 216(1): 167−180 (1990) これも出典明示により本明細書の一部とする)も計算できる。これらの方法は、配列と3Dタンパク質構造との間の調和を評価するため、タンパク質構造に対する忠実度についてスクリーニングすべく機能できる。配列を評価するために様々なスコア付け関数を使用することにより、配列空間の様々な領域がコンピューター処理スクリーニングでサンプリングできる。
【0069】
さらに、タンパク質に金属または補因子結合部位を創出する配列についてスクリーニングするために、スコア付け関数を使用できる(Hellinga et al. Fold Des.3(1):R1−8(1998) 、出典明示により本明細書の一部とする)。同様に、タンパク質にジスルフィド結合を創出する配列についてスクリーニングするために、スコア付け関数を使用できる。新規構造モチーフを導入すべくタンパク質構造を特異的に変更するために、これらの可能性を試す。
【0070】
好ましい実施態様では、一次ライブラリーを生成させるために、配列および/または構造アラインメント・プログラムを使用できる。当業界で既知のように、数々の配列をベースとしたアラインメント・プログラムがある;例えば、Smith−Waterman サーチ、Needleman−Wunsch、Double Affine Smith−Waterman、フレームサーチ、Griskov/GCG プロフィールサーチ、Griskov/GCG プロフィールスキャン、プロフィールフレームサーチ、Bucher 一般化プロフィール、Hidden Markov モデル、Hframe、Double Frame、Blast、Psi−blast、Clustal、および GeneWise を含む。
【0071】
配列の情報源は幅広く変化でき、かつ、SCOP (Hubbard et al. Nucleic Acids Res 27(1):254−256. (1999));PFAM (Bateman et al. Nucleic Acids Res 27(1):260−262. (1999));VAST (Gibrat et al. Curr Opin Struct Biol 6(3):377−385. (1996));CATH (Orengo et al. Structure 5(8):1093−1108. (1997));PhD Predictor (http://www.embl−heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html);Prosite (Hofmann et al. Nucleic Acids Res 27(1):215−219. (1999));PIR (http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/protseqdb/);GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/);PDB (www.rcsb.org) および BIND (Bader et al. Nucleic Acids Res 29(1):242−245. (2001))を含むがこれらに限定されない、1つまたはそれ以上の既知データベースから配列を得ることを含む。
【0072】
さらに、これらのデータベース由来の配列は、連続分析または遺伝子予測にかけ得る;Wheeler et al. Nucleic Acids Res 28(1):10−14. (2000) と、Burge and Karlin, J Mol Biol 268(1):78−94. (1997) を参照のこと。
【0073】
当業界で既知のように、使用できる数々の配列アラインメント体系がある。例えば、アラインメント法に基づく配列の相同性は、標的構造に関するタンパク質の配列アラインメントを創出するために使用できる(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215(3):403 (1990)、出典明示により本明細書の一部とする)。これらの配列アラインメントを調べ、観測された配列の変動を決定する。これらの配列の変動は、一次ライブラリーを定義するために表にする。加えて、さらに以下に概説するように、二次ライブラリーを生成させるためにもこれらの方法を使用できる。
【0074】
配列をベースとしたアラインメントは、様々な方法で使用できる。例えば、関連するタンパク質のいくつかを、当業界で既知のようにアラインメントでき、そして「可変」および「保存された」残基を定義する;即ち、そのファミリーの構成員の間で、変化した残基または同一のままの残基を定義できる。これらの結果は、以下に概説した確率表を生成させるのに使用できる。同様に、これらの配列の変動を表にでき、そしてこれらから、以下で定義するように二次ライブラリーを定義する。あるいは、コンピューター処理スクリーニングにおいて各位置で考えられるアミノ酸を定義するために、許容される配列変動を使用できる。別の変動は、配列アラインメントで生じるアミノ酸のスコアに偏りをかけ、それによってそれらのアミノ酸がコンピューター処理スクリーニングにおいて見出される見込みが増加するが、なお他のアミノ酸を考慮することも許容される。この偏りは、結果として焦点をあてた一次ライブラリーが得られるが、アラインメントに見出されないアミノ酸を考慮から除外しない。加えて、数々の他のタイプの偏りを導入してもよい。例えば、多様化を強いてもよい;即ち「保存された」残基を選び、タンパク質に多様化を強いるように改変し、かくして配列空間のより大きな部分をサンプリングする。あるいは、ファミリーの構成員間で可変性が高い (即ち保存性が低い) 位置を、アミノ酸の全てまたはサブセットのいずれかを使用して、ランダム化することができる。同様に、異常残基は位置異常または側鎖異常のいずれも排除してもよい。
【0075】
同様に、配列アラインメントを生成させるために、構造的に関連したタンパク質の構造アラインメントを行える。そのような既知の広く様々な構造アラインメント・プログラムがある。例えば、NCBI による VAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/Structure/VAST/vast.shtml) ;SSAP (Orengo and Taylor, Methods Enzymol 266(617−635 (1996)) SARF2 (Alexandrov, Protein Eng 9(9):727−732. (1996)) CE (Shindyalov and Bourne, Protein Eng 11(9):739−747. (1998));(Orengo et al. Structure 5(8):1093−108 (1997);Dali (Holm et al. Nucleic Acid Res. 26(1):316−9 (1998)(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)を参照のこと。観測された配列の変動を決定するために、これらの構造的に生成させた配列アラインメントを調査できる。
【0076】
一次変異配列ライブラリーは、配列から二次構造を予測し、次いで予測された二次構造と矛盾しない配列を選択することによって生成できる。スレッディング(threading) (Bryant and Altschul, Curr Opin Struct Biol 5(2):236−244. (1995));Profile 3D (Bowie et al. Methods Enzymol 266(598−616 (1996);MONSSTER (Skolnick et al. J Mol Biol 265(2):217−241. (1997);Rosetta (Simons et al. Proteins 37(S3):171−176 (1999);PSI−BLAST (Altschul and Koonin, Trends Biochem Sci 23(11):444−447. (1998));Impala(Schaffer et al. Bioinformatics 15(12):1000−1011. (1999));HMMER (McClure et al. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol 4(155−164 (1996));Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/);BLAST (Altschul et al. J Mol Biol 215(3):403−410. (1990));ヘリックス−コイル転移理論 (Munoz and Serrano, Biopolymers 41:495, 1997)、ニューラルネットワーク、局所構造アラインメント、およびその他(例えば、Selbig et al. Bioinformatics 15:1039, 1999 参照)を含むが、これらに制限されるものではない、数々の二次構造予測法がある。
【0077】
同様に、上記概説した通り、他のコンピューター処理方法も知られており、例えば配列プロファイリング(Bowie and Eisenberg、Science253(5016):164−70(1991))、回転異性体ライブラリー選択法(Dahiyat and Mayo、Protein Sci5(5):895−903(1996)、Dahiyat and Mayo、Science278(5335):82−7(1997);Desjarlais and Handel、Protein Science 4:2006−2018(1995)、Harburyet al. PNAS USA92(18):8408−8412(1995);Konoet al. Proteins:Structure,Function and Genetics 19:244−255(1994);Hellinga and Richards、PNAS USA 91:5803−5807(1994)) および残基対ポテンシャル(Jones、Protein Science 3:567−574(1994))、PROSA (Heindlich et al. J. Mol. Biol. 216 : 167−180 (1990) ;THREADER (Jones et al. Nature 358 : 86−89 (1992)、および Simons et al. (Proteins, 34 : 535−543, 1999), Levitt and Gerstein (PNAS USA, 95 : 59135920, 1998), Godzik et al. PNAS, V89, PP 12098−102 ; Godzik and Skolnick (PNAS USA, 89 : 12098102, 1992), Godzik et al. (J. Mol. Biol. 227 : 227−38, 1992) に記載されているもののような他の逆折畳み方法、および2−プロファイル方法 (Gribskov et al. PNAS 84 : 4355−4358 (1987) および、Fischer and Eisenberg, Protein Sci. 5 : 947−955 (1996), Rice and Eisenberg J. Mol. Biol. 267 : 1026−1038 (1997)) が含まれるが、これらに限定されるわけではなく、これらは全て出典明示により本明細書の一部とする。さらに、Koehl and Levitt (J. Mol. Biol. 293 : 1161−1181 (1999) ; J. Mol. Biol. 293 : 1183−1193 (1999) ; 出典明示により本明細書の一部とする)に記載されているもののような他のコンピューター処理方法を使用してタンパク質配列ライブラリーを創出でき、場合により、それを改良された特性および機能についての実験的スクリーニングにおいて使用するための、より小さい二次ライブラリーを生成させるのに使用できる。
【0078】
加えて、SCMF と同様に用い得る、SCMF などの力場の計算に基づくコンピューター処理方法がある。Delarue et al. Pac. Symp. Biocomput. 109−21 (1997), Koehl et al. J. Mol. Biol. 239:249 (1994);Koehl et al. Nat. Struc. Biol. 2:163 (1995);Koehl et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 6:222 (1996);Koehl et al. J. Mol. Bio. 293:1183 (1999);Koehl et al. J. Mol. Biol. 293:1161 (1999);Lee, J. Mol. Biol. 236:918 (1994);Vasquez Biopolymers 36:53−70 (1995);(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)を参照のこと。コンピューター処理方法の範囲内で配列のコンホメーション(立体配座)を最適化するため、またはここで概説したような新規の最適化された配列を新しく生成させるために使用できる他の力場計算には、OPLS−AA (Jorgensen et al. J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225−11236;Jorgensen, W.L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT (1999));OPLS (Jorgensen et al. J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff;Jorgensen et al. J Am. Chem. Soc. (1990), v 112, pp 4768ff);UNRES (United Residue Forcefield;Liwo et al. Protein Science (1993), v 2, pp1697−1714;Liwo et al. Protein Science (1993), v 2, pp1715−1731;Liwo et al. J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp849−873;Liwo et al. J. Comp. Chem. (1997),v 18, pp874−884;Liwo et al. J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp259−276;Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp5482−5485);ECEPP/3(Liwo et al. J Protein Chem 1994 May;13(4):375−80);AMBER 1.1 力場 (Weiner et al. J. Am. Chem. Soc. v 106, pp765−784);AMBER 3.0 力場 (U.C. Singh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:755−759);CHARMM および CHARMM22 (Brooks et al. J. Comp. Chem. v 4, pp 187−217);cvff3.0 (Dauber−Osguthorpe et al. (1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v4, pp31−47);cff91 (Maple et al. J. Comp. Chem. v15, 162−182) を含み、これらに限定されない;また、DISCOVER (cvff および cff91) および AMBER 力場は、INSIGHT 分子モデリング・パッケージ (Biosym/MSI, San Diego California) で使用され、そして HARMM は、QUANTA 分子モデリング・パッケージ (Biosym/MSI, San Diego California)で使用される(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)。事実、下記で概説したように、直接二次ライブラリーを生成させるために、これらの力場の方法を使用できる;即ち、一次ライブラリーを生成させない;むしろ、これらの方法は、確率表を作成するために使用でき、それを元に、例えばSCMF計算の間にこれらの力場を使用することによって、二次ライブラリーを直接生成させる。
【0079】
好ましい実施態様では、一次ライブラリー生成に使用するコンピューター処理方法は、U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926、09/782,004およびPCT US98/07254(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている、タンパク質設計オートメーション(登録商標)(PDA(登録商標))技法である。簡単に述べると、PDAは次のように説明できる。既知タンパク質構造を出発点として使用する。次いで、最適化される残基を同定するが、それは全配列またはそのサブセット(複数も可)であり得る。次いで、変化させる任意の位置の側鎖を除去する。得られたタンパク質主鎖および残りの側鎖から成る構造を鋳型と呼ぶ。次いで、好ましくは、各可変残基位置を、コア残基、表面残基または境界残基として分類する。各分類は、その位置に可能なアミノ酸残基のサブセットを定義する(例えば、コア残基は一般に疎水性残基のセットから選択され、表面残基は一般に親水性残基から選択され、そして境界残基はどちらでもあり得る)。各アミノ酸は、回転異性体と呼ばれる、独立したセットの許容される各側鎖の全コンフォマーにより代理され得る。即ち、主鎖に最適な配列に到達するため、回転異性体の可能性のある全配列をスクリーニングしなければならず、その場合各主鎖位置は、その可能な全回転異性体状態である各アミノ酸、またはアミノ酸のサブセット、従って回転異性体のサブセットにより占められ得る。
【0080】
次いで、2セットの相互作用を各回転異性体について全位置で計算する。即ち、回転異性体側鎖と主鎖の全部または一部との相互作用(「シングルス」エネルギー、回転異性体/鋳型または回転異性体/主鎖エネルギーとも呼ばれる)、および回転異性体側鎖と、他の全ての位置または他の位置のサブセットにおける他の可能な全回転異性体との相互作用(「ダブルス」エネルギー、回転異性体/回転異性体エネルギーとも呼ばれる)。これらの相互作用の各々のエネルギーは、様々なスコア付け関数の使用を通して計算され、それにはファンデルワールス力のエネルギー、水素結合のエネルギー、二次構造傾向のエネルギー、表面領域溶媒和のエネルギーおよび静電気が含まれる。ゆえに、主鎖および他の回転異性体の両方と各回転異性体の相互作用の総エネルギーが計算され、マトリックス形態で記憶される。
【0081】
回転異性体のセットの明確な性質は、試験する回転異性体配列の数の単純計算を可能にする。各位置につきm個の可能な回転異性体をもつ長さnの主鎖の場合、mn個の可能な回転異性体配列があり、その数は配列長と共に指数関数的に増大し、リアルタイムで計算するのは非実際的または不可能である。従って、この組合せ検索問題を解決するため、「行き止まり排除法」(DEE)計算を実施する。DEE計算は、第1回転異性体の最悪の総相互作用が第2回転異性体の最良の総相互作用よりもなお良好な場合、第2回転異性体は大域的最適解答(global optimum solution)の一部にはなり得ないという事実に基づいている。全回転異性体のエネルギーは既に計算されているので、DEE方法では、回転異性体を試験し排除するためには配列長全体に及ぶ合計があればよく、計算はかなり速くなる。DEEは、回転異性体の対または回転異性体の組合せを比較しながら再実行でき、結局、大域的最適エネルギーを表す単一の配列が決定される。
【0082】
一旦大域的解答を見出したら、DEE解答の近隣における配列のランク順リストを生成させるためにモンテカルロ検索を行い得る。DEE解答から出発し、ランダム位置を他の回転異性体に変更し、新規配列エネルギーを計算する。新規配列が許容基準に合う場合、それを別のジャンプ用の出発点として使用する。予め定めた数のジャンプの後、配列のランク順リストを生成させる。
【0083】
モンテカルロ検索は、大域的極小値周辺の配列空間を調査するための、または配列空間中の新しい局所的極小距離を見出すためのサンプリング技法である。下記にさらに概説するように、ボルツマンサンプリング、遺伝的アルゴリズム技法および模擬アニーリング(simulated annealing)を含む、使用できる他のサンプリング技法がある。さらに、全ての標本技術に関して、許容されるジャンプの種類を変更できる(例えば、ランダムな残基へのランダムなジャンプ、偏りのあるジャンプ(例えば、野生型へ、または野生型から)、偏りのある残基へのジャンプ(例えば、類似の残基へ、または残基から)など)。同様に、全てのサンプリング技法に関して、サンプリングのジャンプが許容されるか否かの許容基準を変更できる。
【0084】
U.S.S.N.09/127926で概説されているように、タンパク質主鎖(α−炭素からβ−炭素へのベクトルの方向に沿って、窒素、カルボニル炭素、α−炭素およびカルボニル酸素を含む(天然タンパク質の場合))を、超二次構造パラメーターと呼ばれるパラメーターのセットを変えることにより、コンピューター処理分析に先立ち改変し得る。
【0085】
一旦タンパク質構造主鎖を生成させ(上記概説の通り、改変を伴う)、コンピューターに入力したら、明らかな水素が構造内に含まれていないならば、それを付加する(例えば、構造がX線結晶学により生成された場合、水素を付加しなければならない)。水素付加後、構造エネルギーの最小化を実行し、水素並びに他の原子、結合角および結合長を緩和する。好ましい実施態様では、これは、いくつかの段階から成る原子座標位置のコンジュゲート勾配最小化(Mayoet al. J. Phys.Chem.94: 8897 (1990))を実行することにより行なわれ、静電気を全く伴わずに Dreiding の力場が最小限にされる。一般的に、約10ないし約250の段階が好ましく、約50が最も好ましい。
【0086】
タンパク質主鎖構造は、少なくとも1つの可変残基位置を含む。当業界で既知のように、タンパク質の残基またはアミノ酸は、一般にタンパク質のN−末端から出発して連続的に番号付けされる。従って、そのN末端にメチオニンを有するタンパク質は、残基またはアミノ酸の1位にメチオニンを有し、次の残基は2、3、4位などとされている。各位置において、野生型(即ち天然産生)タンパク質は、少なくとも20個のアミノ酸のうちの1つを任意の数の回転異性体で有し得る。本明細書における「可変残基位置」とは、設計方法において特定の残基または回転異性体、一般的には野生型残基または回転異性体として固定されていない、設計されるタンパク質のアミノ酸位置を意味する。
【0087】
好ましい実施態様において、タンパク質の残基位置全てが可変である。即ち、どのアミノ酸側鎖も本発明方法では改変され得る。これは、小型タンパク質の場合特に望ましいが、本発明は大型タンパク質の設計も同様に可能にする。この方法で設計され得るタンパク質の長さに理論的制限は無く、実際的なコンピューター処理上の制限がある。
【0088】
別の好ましい実施態様では、タンパク質の残基位置のいくつかのみが可変であり、残りは「固定」されている、即ち、それらは設定されたコンホメーションであるものとして3次元構造中で同定される。いくつかの実施態様では、固定位置はその本来の立体配座のままである(使用されている回転異性体ライブラリーの特異的回転異性体と相関関係を示しても示さなくてもよい)。あるいは、残基は非野生型残基として固定され得る。例えば、既知の部位指定変異導入技法により、特定残基が望ましい(例えば、タンパク質加水分解部位の排除または酵素の基質特異性の改変のために)と示されたとき、残基は特定アミノ酸として固定され得る。
【0089】
あるいは、下記で検討されている通り、新たに変異を評価するために本発明の方法を使用できる。別の好ましい実施態様では、固定位置は「浮動」させ得る;その位置のアミノ酸は固定されるが、そのアミノ酸の別の回転異性体が試験される。この実施態様において、可変残基は、少なくとも1個、または概して残基総数の0.1%ないし99.9%であり得る。従って、例えば、少数のみ(または1個)の残基または残基の大部分(両者の間にあらゆる可能性がある)を変えることが可能である。
【0090】
好ましい実施態様において、固定できる残基には、構造的または生物学的機能性残基が含まれるが、これらに限定されるわけではない;あるいは、生物学的機能性残基は、特異的に固定されていなくてもよい。例えば、生物活性にとって重要であることが知られている残基、例えば酵素の活性部位、酵素の基質結合部位、結合パートナー(リガンド/受容体、抗原/抗体など)への結合部位、生物学的機能にとっては決定的なリン酸化またはグリコシル化部位を形成する残基、または構造的に重要な残基、例えばジスルフィド架橋、金属結合部位、重大な水素結合性残基、プロリンまたはグリシンなどの主鎖立体配座にとって重大な残基、相互作用パッキングにとって重大な残基などは全て、一立体配座に、または単一回転異性体として固定してもよく、または「浮動」してもよい。
【0091】
同様に、可変残基として選択し得る残基は、望ましくない生物学的特性、例えばタンパク質加水分解に対する感受性、二量体化または凝集部位、免疫応答を誘導し得るグリコシル化部位、望ましくない結合活性、望ましくないアロステリー、結合は保存されているが望ましくない酵素活性などを付与するものであり得る。
【0092】
好ましい実施態様において、各可変位置は、コア、表面または境界残基位置として分類されるが、場合によっては、下記説明の通り、主鎖を最小化するために可変位置をグリシンに設定し得る。さらに、本明細書で概説するように、残基が分類されている必要はなく、可変なものとして選択でき、いかなるアミノ酸のセットも使用し得る。コア、表面および境界位置のいずれの組合せも利用できる。即ち、コア、表面および境界残基;コアおよび表面残基;コアおよび境界残基、および表面および境界残基、並びにコア残基単独、表面残基単独または境界残基単独。
【0093】
コア、表面または境界としての残基位置の分類は、当業者に明らかな通り、いくつかの方法で行い得る。好ましい実施態様において、分類は、側鎖を含む本来のタンパク質主鎖構造の走査画像により行い、タンパク質モデリングの当業者の主観的評価に基づいて分類を指定する。あるいは、好ましい態様は、U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926およびPCT US98/07254で概説されている通り、鋳型Cα原子のみを用いて計算した、溶媒が近づき易い表面に関してCα−Cβベクトル配向評価を利用する。あるいは、表面積計算を行える。
【0094】
一旦各可変位置をコア、表面または境界として分類したら、アミノ酸側鎖のセット、即ち回転異性体のセットが各位置に割り当てられる。即ち、プログラムにより特定位置での考慮の対象として認められた可能なアミノ酸側鎖のセットが選択される。それに続いて、一旦可能なアミノ酸側鎖を選択すると、特定位置で評価される回転異性体のセットを決定し得る。従って、コア残基は、一般にアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンから成る疎水性残基の群から選択され(いくつかの実施態様では、下記ファンデルワールススコア付け関数のαスケーリング因子が低いとき、メチオニンがセットから除去される)、各コア位置のための回転異性体のセットは、潜在的にこれらの8アミノ酸側鎖の回転異性体を包含する(主鎖非依存的ライブラリーを使用する場合は全回転異性体、そして回転異性体依存的主鎖を使用する場合はサブセット)。
【0095】
同様に、表面位置は、一般にアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンから成る親水性残基の群から選択される。従って、各表面位置のための回転異性体のセットは、これらの10残基の回転異性体を包含する。最後に、境界位置は、一般にアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンから選択する。従って、各境界位置のための回転異性体のセットは、これらの17残基の全回転異性体を包含する(システイン、グリシンおよびプロリンが使用されないことを仮定するが、それらは使用できる)。さらに、いくつかの好ましい実施態様では、18個の天然産生アミノ酸(特に破壊的であることが知られているシステインおよびプロリンを除く全て)を使用する。
【0096】
従って、当業者に理解されるように、計算回数が減らせるため、残基位置を分類することにはコンピューター処理上の利点がある。また、コア、境界および表面残基のセットが上記のものから改変される状況があり得ることに注目すべきである。例えば、ある状況では、1個またはそれ以上のアミノ酸が付加されるかまたは許容されるアミノ酸のセットから控除される。例えば、二量体化または多量体化するか、またはリガンド結合部位を有するいくつかのタンパク質は、疎水性表面残基などを含み得る。さらに、らせん「キャッピング」またはαらせん双極子との有利な相互作用を行わせない残基は、許容される残基のセットから控除し得る。このアミノ酸のグループの変更は、残基ごとに行い得る。
【0097】
好ましい態様において、プロリン、システインおよびグリシンは可能なアミノ酸側鎖のリストには含まれず、従ってこれらの側鎖の回転異性体は使用されない。しかしながら、好ましい実施態様では、可変残基位置が0°より大きいφ角度(即ち、1)先行アミノ酸のカルボニル炭素、2)現残基の窒素原子、3)現残基のα炭素、および4)現残基のカルボニル炭素、により定義される二面角)を有するとき、該位置をグリシンに設定して主鎖のひずみを最小化する。
【0098】
一旦可能な回転異性体の群を各可変残基位置に割り当てたら、U.S.S.N.09/127,926およびPCT US98/07254で概説されているように加工が進められる。この加工段階は、最適タンパク質配列を生成させるために、回転異性体間の相互作用および回転異性体とタンパク質主鎖との相互作用の分析を必要とする。極度に単純化すると、加工は、まずいくつかのスコア付け関数を用いることにより、主鎖自体または他の回転異性体に対する、回転異性体の相互作用エネルギーを計算することを含む。好ましいPDA(登録商標)技法スコア付け関数には、ファンデルワールスポテンシャルスコア付け関数、水素結合ポテンシャルスコア付け関数、原子溶媒和スコア付け関数、二次構造傾向スコア付け関数および静電気スコア付け関数があるが、これらに限定はされない。さらに下記で報告されているように、各位置をスコア付けするために少なくとも1つのスコア付け関数を使用するが、スコア付け関数は、位置分類、またはαらせん双極子との有利な相互作用などの他の考慮すべき点により異なり得る。下記で概説されている通り、計算で使用される総エネルギーは、一般に等式1で示されるように、特定位置で使用される各スコア付け関数のエネルギーの合計である:
等式1 Etotal=nEvdw+nEas+nEh−結合+nEas+nEelec
【0099】
等式1において、総エネルギーは、ファンデルワールスポテンシャルエネルギー(Evdw)、原子溶媒和エネルギー(Eas)、水素結合エネルギー(Eh−結合)、二次構造エネルギー(Ess)および静電気相互作用エネルギー(Eelec)の合計である。nの語は、この語を特定残基位置に関して考慮すべきか否かによって、0または1である。
【0100】
U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926およびPCT US98/07254で概説されているように、単独でか、または組合せて、これらのスコア付け関数の組合せはどれでも使用し得る。一旦使用するスコア付け関数を各可変位置について同定したら、コンピューター処理分析における好ましい第1段階には、可能な各回転異性体とタンパク質の残り全部または一部との相互作用の測定が含まれる。即ち、スコア付け関数の1つまたはそれ以上により測定される、各可変残基位置における可能な各回転異性体と主鎖または他の回転異性体との相互作用のエネルギーが計算される。好ましい実施態様では、各回転異性体とタンパク質の残り全部、即ち鋳型全体および他の全回転異性体の両方との相互作用が行なわれる。しかしながら、上記で概説されている通り、タンパク質の一部分、例えば大型タンパク質のドメインのみをモデルにすることが可能であり、従って、場合によってはタンパク質の必ずしも全部を考慮する必要はない。本明細書で使用される「部分」という用語は、あるタンパク質に関してそのタンパク質の断片を表す。この断片は、10アミノ酸残基から、全アミノ酸配列マイナス1アミノ酸までのサイズの範囲であり得る。従って、本明細書で使用される「部分」の用語は、ある核酸に関してその核酸の断片を表す。この断片は、10ヌクレオチドから、全核酸配列マイナス1ヌクレオチドまでのサイズの範囲であり得る。
【0101】
好ましい実施態様において、コンピューター処理加工の第1段階は、全ての位置における各回転異性体に関して2セットの相互作用を計算することにより行なう。即ち、その位置を変更しようと浮動させようと、回転異性体側鎖と鋳型または主鎖との相互作用(「シングルス」エネルギー)、および回転異性体側鎖と全ての他の位置における全ての他の可能な回転異性体との相互作用(「ダブルス」エネルギー)である。この場合の主鎖はタンパク質構造主鎖の原子および固定残基があればその原子の両方を含み、この場合固定残基はあるアミノ酸の特定立体配座として定義されることを理解すべきである。
【0102】
即ち、「シングルス」(回転異性体/鋳型)エネルギーは、スコア付け関数のいくつかまたは全部を使用して、全ての可変残基位置における全ての可能な回転異性体と主鎖との相互作用について計算される。従って、水素結合スコア付け関数の場合、回転異性体の全水素結合原子および主鎖の全水素結合原子が評価され、EHBが全可変位置における可能な各回転異性体について計算される。同様に、ファンデルワールススコア付け関数の場合、回転異性体の全原子を鋳型の全原子と比較し(一般的にそれ自体の残基の主鎖原子を除外する)、そして全可変残基位置における可能な各回転異性体についてEvdWを計算する。さらに、原子が3つまたはそれ未満の結合により結合されている場合、一般的に、ファンデルワールスエネルギーは計算されない。原子溶媒和スコア付け関数の場合、回転異性体の表面は鋳型表面に対して測定され、全ての可変残基位置における可能な各回転異性体についてEasが計算される。また二次構造傾向スコア付け関数も、シングルスエネルギーとして考えられるため、総シングルスエネルギーはEss項を含み得る。当業者に明らかなように、回転異性体および鋳型位置間の物理的距離に依存して、これらのエネルギー項の多くはゼロに近づく;即ち、2つの部分が離れれば離れるほど、エネルギーは低くなる。
【0103】
「ダブルス」エネルギー(回転異性体/回転異性体)の計算の場合、可能な各回転異性体の相互作用エネルギーを全ての他の可変残基位置における全ての可能な回転異性体と比較する。従って、「ダブルス」エネルギーは、スコア付け関数のいくつかまたは全部を使用して、全ての可変残基位置における全ての可能な回転異性体と全ての他の可変残基位置における全ての可能な回転異性体との相互作用について計算される。従って、水素結合スコア付け関数の場合、第1回転異性体の全水素結合原子および全ての可能な第2回転異性体の全水素結合原子が評価され、EHBが任意の2可変位置における可能な各回転異性体対について計算される。同様に、ファンデルワールススコア付け関数の場合、第1回転異性体の全原子を全ての可能な第2回転異性体の全原子と比較し、そして全ての2可変残基位置における可能な各回転異性体対についてEvdWを計算する。原子溶媒和スコア付け関数の場合、第1回転異性体の表面は全ての可能な第2回転異性体の表面に対して測定され、そして全ての2可変残基位置における可能な各回転異性体対についてEasが計算される。二次構造傾向スコア付け関数は、「シングルス」エネルギーの構成要素として見なされることから、「ダブルス」エネルギーとして実施する必要は無い。当業者に認識されるように、第1回転異性体および第2回転異性体間の物理的距離に依存して、これらのダブルスエネルギー項の多くはゼロに近づく。即ち、即ち、2つの部分が離れれば離れるほど、エネルギーは低くなる。
【0104】
加えて、当業者に認識されるように、PDA(登録商標)技法計算で種々の力場を使用でき、Dreifing I および Dreiding II (Mayo et al, J. Phys. Chem. 948897 (1997))、AMBER (Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc. 106:765 (1984) および Weiner et al., J. Comp. Chem. 106:230 (1986))、MM2 (Allinger J. Chem. Soc. 99:8127 (1977), Liljefors et al., J. Com. Chem. 8:1051 (1987)); MMP2 (Sprague et al., J. Comp. Chem. 8:581 (1987)); CHARMM (Brooks et al., J. Comp. Chem. 106:187 (1983)); GROMOS; および MM3 (Allinger et al., J. Amer. Chem. Soc. 111:8551 (1989))、OPLS−AA (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225−11236; Jorgensen, W. L.; BOSS, Version 4.1; Yale University:New Haven, CT (1999)); OPLS (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff; Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1990), v112, pp 4768ff); UNRES (United Residue Forcefield; Liwo, et al., Protein Science (1993), v2, pp 1697−1714; Liwo et al.,Protein science (1993), v2, pp1715−1731; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp849−873; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (197), v18, pp874−884; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp259−276; Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp5482−5485); ECEPP/3 (Liwo et al., J Protein Chem 1994 May; 13 (4):375−80); AMBER 1.1 力場 (Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. v106, pp765−784); AMBER 3.0 力場 (U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:755−759); CHARMM および CHARMM22 (Brooks, et al., J. Comp. Chem. v4, pp 187−217); cvff3.0 (Dauber−Osguthorpe, et al., (1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v4, pp31−47); cff91 (Maple, et al., J. Comp. Chem. v15, 162−182) を含むがこれらに限定されるわけではない;また DISCOVER (cvff および cff91) および AMBER 力場は、INSIGHT 分子モデリングパッケージ (Biosym/MSI, San Diego California) に使用し、HARMM は QUANTA 分子モデリングパッケージ (Biosym/MSI, San Diego California) に使用し、これらの全ては出典明示により本明細書の一部とする。
【0105】
一旦シングルスおよびダブルスエネルギーが計算され記憶されると、コンピューター処理加工の第2段階が行われ得る。U.S.S.N.09/127926およびPCT US98/07254で概説されているように、好ましい実施態様は、行き止まり排除法(DEE)段階、および好ましくはモンテカルロ段階を利用する。
【0106】
概観すると、PDA(登録商標)技法は、アウトプット(例えば、一次ライブラリー)を改変するために変化させ得る3つの要素を有する:加工に使用するスコア付け関数;フィルタリング技法、およびサンプリング技法。
【0107】
好ましい実施態様では、スコア付け関数を改変し得る。好ましい実施態様では、上記概説のスコア付け関数は、種々の方法において偏らされ、または加重され得る。例えば、参照配列または参照配列のファミリーに向かうかまたはそこから離れる偏りを行うことができる;例えば、野生型または相同残基に向かう偏りを使用し得る。同様に、全タンパク質またはそのフラグメントを偏らせ得る;例えば、活性部位を野生型残基に向けて偏らせ得、または特定の望ましい物理的特性に向けたドメイン残基を行える。更に、増加したエネルギーに向かうまたは対する偏りを創出し得る。更なるスコア付け関数偏重には、静電ポテンシャル勾配または疎水性勾配の適用、計算への基板または結合パートナーの添加、または所望の電荷または阻止性に向けた偏りが含まれるが、これらに限定されない。
【0108】
加えて、別の実施態様において、使用し得る更なる種々のスコア付け関数が存在する。更なるスコア付け関数には、ねじれポテンシャル、または残基対ポテンシャルまたは残基エントロピーポテンシャルが含まれるが、これらに限定されない。このような更なるスコア付け関数は、単独で、またはライブラリーを最初にスコア付けした後のライブラリー加工用の関数として使用できる。
【0109】
好ましい実施態様において、DEEおよびその関連カウンターパートを含むが、これらに限定されない、種々の加工フィルタリング技法を行える。更なるフィルタリング技法は、最適配列の発見のためのブランチ−アンド−バウンド技法 (Cordon and Majo, Structure Fold. Des. 7:1089−98, 1999) および配列の徹底的な列挙を含むが、これらに限定されない。しかし、ある技法は、フィルタリング技法なしでも行ない得ることは注意すべきである;例えば、サンプリング技法は、フィルタリング無しで良好な配列の発見に使用できる。
【0110】
当業者に認識されるように、一旦最適配列または配列のセットが生成されたら、(あるいはまた、これらは最適化または順序だてる必要はない)種々の配列空間サンプリング法を、好ましいモンテカルロ法に加えて、またはモンテカルロ検索の代わりに行なうことができる。即ち、一旦配列または配列のセットが生成されたら、好ましい方法は、試験のための更なる、関連配列の生成を可能にするサンプリング技法を利用する。
【0111】
これらのサンプリング法には、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失、または1つもしくはそれ以上の配列の組換えの使用が含まれる。本明細書で略述するように、好ましい実施態様はモンテカルロ検索を利用するが、これは一連の偏らせたか、系統的か、またはランダムなジャンプである。しかしながら、この他にも使用可能なサンプリング技法があり、ボルツマンサンプリング、遺伝的アルゴリズム技法、および模擬アニーリングが含まれる。加えて、全てのサンプリング技法に関して、許容されるジャンプの種類を改変することができる (例えば、ランダムな残基へのランダムなジャンプ、偏らせたジャンプ (例えば、野生型に向かうか、または離れて) 、偏らせた残基へのジャンプ (類似の残基に向かうか、または離れて、等) 。複数の残基の位置を一緒にしたジャンプ (2個の残基が常に共に変化する、または決して共に変化しない) 、残基の全セットが他の配列に変化するジャンプ (例、組換え) 。同様に、全てのサンプリング技法について、サンプリングジャンプが許容されるか否かの許容基準を改変することもでき、また高温での広い検索および低温での局所的最適値近傍で狭い検索を可能にする。出展明示により本明細書の一部とする Metropolis et al., J. Chem. Phys v21, pp1087, 1953 参照。
【0112】
加えて、本発明の好ましい方法は配列のランク順リストに至ることに留意すべきである;即ち、配列は一定の客観的基準に基づいてランク付けされる。しかしながら、本明細書で概説するように、例えば配列をランク付けせずに、リストする確率表を直接に生成させること (例えば、SCMF分析または配列アラインメント技法を使用して)により、ランク付けをしない配列のセットを創出することが可能である。本明細書に略述するサンプリング技法はどちらの状況でも使用できる。
【0113】
好ましい実施態様では、ボルツマンサンプリングを行う。当業者に認識されるように、ボルツマンサンプリングの温度基準を改変することにより、高温で広い検索を行うことも低温で局所的な最適値の近傍で狭い検索を行うこともできる (例えば、Metropolis et al., J. Chem. Phys. 21: 1087, 1953 参照) 。
【0114】
好ましい実施態様では、サンプリング技法は、例えば、Holland (Adaptation in Natural and Artificial Systems, 1975, Ann Arbor, U. Michigan Press) により記載されたような遺伝的アルゴリズムを利用する。一般的に、遺伝的アルゴリズムは、生成させた配列を取り、これらを核酸の組換え事象と同様にして「遺伝子混合」と同様なやりかたでコンピューター処理で組換える。かくして、遺伝的アルゴリズム分析の「ジャンプ」は一般的に複数位置のジャンプである。加えて、以下に略述するように、相関的多重ジャンプも行い得る。このようなジャンプは、様々なクロスオーバー位置で、一度に1回以上の組換えを行うことができ、そして2個またはそれ以上の配列の組換えを伴うことができる。さらに、欠失または挿入 (ランダムまたは偏らせた) を行うことができる。加えて、以下に略述するように、遺伝的アルゴリズム分析は二次ライブラリー生成後に使用してもよい。
【0115】
好ましい実施態様では、サンプリング技法は、例えば、Kirkpatrick et al. (Science, 220: 671−680, 1983) に記載されているようなシミュレートしたアニーリングを使用する。シミュレートしたアニーリングは温度を改変することにより良いジャンプまたは悪いジャンプのカットオフを改変する。即ち、温度を変えることによってカットオフの厳しさの度合いを変化させる。これにより、新しい配列空間領域への高温での広範な検索を行って、低温での狭いサーチによる領域の詳細な探索に切り替えることが可能になる。
【0116】
加えて、以下に略述するように、これらのサンプリング方法を、更なる二次ライブラリー (時々、本明細書では三次ライブラリーと呼ぶ) を生成させるための更なるプロセスに使用できる。
【0117】
従って、一次ライブラリーは、PDA(登録商標)のような構造ベースの方法、または配列ベースの方法、または本明細書に概説のような組合せを含む、コンピューター処理の種々の方法において生成できる。
【0118】
コンピューター処理加工により、最適化候補変異配列のセットが生じる。最適化候補変異タンパク質配列は、一般に、MHC、TCRまたはBCR結合に非常に重要な領域において標的タンパク質配列と異なっている。好ましくは、各最適化候補変異配列は、開始または標的配列から少なくとも約1個の変異アミノ酸を含み、3−5個が好ましい。好ましくは、変異残基は非連続の領域に位置する。
【0119】
従って、好ましい実施態様では、本発明は、標的タンパク質またはその断片をコンピューター処理により加工し、候補変異タンパク質または候補変異タンパク質配列のセットを産生する方法を対象としている。
【0120】
ゆえに、好ましい実施態様では、本発明の候補変異タンパク質は、少なくとも1つのMHC、TCRまたはBCR結合部位において、標的タンパク質と異なるアミノ酸配列を有する。好ましくは、免疫原性の低いタンパク質が望ましいならば、候補変異タンパク質は、少なくとも1つのMHC、TCRまたはBCR結合部位を排除することにより標的タンパク質と異なっている。あるいは、より免疫原性のあるタンパク質が望ましいならば、候補変異タンパク質は、少なくとも1つのMHC、TCRまたはBCR結合部位の付加を介して標的タンパク質と異なっている。
【0121】
従って、コンピューター処理加工により、一次変異配列のセットが生じ、ある種のランク付けまたはスコア付け関数を使用する場合、それは最適化タンパク質配列であり得る。これらの最適化タンパク質配列は、一般に(常にではないが)、主鎖を採用した標的配列と顕著に異なっている。つまり、各最適化タンパク質配列は、好ましくは開始標的または野生型配列から少なくとも約5−10%の変異アミノ酸を含み、少なくとも約15−20%の変化が好ましく、そして少なくとも約30%の変化が特に好ましい。
【0122】
好ましい実施態様では、コンピューター処理の免疫原性フィルターを、一次ライブラリー配列のセットに適用する。本明細書における「コンピューター処理の免疫原性フィルター」は、MHC分子、またはT細胞エピトープまたはB細胞エピトープへのペプチドの結合に関するデータから派生した、数々のスコア付け関数のいずれかを意味する。これらのスコア付け関数は、免疫原性の可能性がある配列を排除するため、または非免疫原性の配列を排除するために、一次ライブラリー配列のセットを再スコア付けするために使用される。次いで、免疫原性を調節するために除去または付加された任意の残基(表面残基を含む)を、構造的および化学的に補償するために、PDAを使用する。
【0123】
好ましい実施態様では、MHCクラスIおよびII分子により表示され、TCRに認識される線状エピトープをコードするアミノ酸残基の除去または付加のいずれかを、構造的および化学的に補償するために、PDA(登録商標)技法を使用する。
【0124】
好ましい実施態様では、ナイーブB細胞上の膜結合抗体に感知される立体構造エピトープをコードするアミノ酸残基の除去または付加のいずれかを、構造的および化学的に補償するために、PDA(登録商標)技法を使用する。
【0125】
他の実施態様では、一次配列のセットをコンピューター処理で生成させる前または最中に、コンピューター処理の免疫原性フィルターを適用する。このアプローチを使用して、潜在的に免疫原性配列を欠くか、または含む、一次配列のセットを生成させる。次いで、これらの配列にPDA(登録商標)技法を実行して、天然の折畳みを維持し、かつ少なくとも開始標的タンパク質と同程度に安定な配列を同定する。
【0126】
MHC分子によるペプチド選択の法則についての現在の知見は、ペプチドおよびMHCタンパク質から抽出した天然のペプチドライブラリーの配列解読、MHC分子へのペプチド結合およびT細胞反応に対する、未知CTLエピトープ配列への変異導入の効果の分析、並びに決定されたMHCペプチド複合体の結晶構造分析および分子力場研究に由来するものである (Meister, G.E., et al. (1995) Vaccine, 13:581−591; Malios, R.R., (1999) Bioinformatics Savoie, C.J. et al. (1999) Pac Symp Biocomput., 182−9; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, Mallios, R.R., (1998) J. Comp. Biol., 5:703−711; Altuvia, Y., et al. (1997) Human Immunology, 58:1−11; Udaka, et al., (1995) J. Exp. Med., 181:2097−2108; Hammer, J. et al. (1994) Behring. Inst. Mitt. 94:124−132)。
【0127】
さらに、MHC分子に結合すると知られている数千のペプチド配列からなるデータベースが編集され(Buus, 前出)、そしてタンパク質全長の配列を分析し、可能性のある免疫原性配列の存在を予測するためのいくつかの技法が開発されてきた (Hiemstra, H.S. et al. (2000) Curr. Op. Immunol., 12:80−84; Malios, R.R., (1999) Bioinformatics, 15:432−439; Sturniolo, T., et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, 14:121−130; Mallios, R.R., (1998) J. Comp. Biol., 5:703−711; Shastri, N. (1996) Curr. Op. Immunol., 8:271−277; Hammer, J. (1995) Curr. Op. Immunol., 7:263−269; Meister, G.E., et al. (1995) Vaccine, 13:581−591; Udaka, K., et al. (1995) J. Exp. Med., 181:20972108; Hammer, J. et al. (1994) Behring. Inst. Mitt. 94:124−132; Hammer, J., et al. (1994) J. Exp. Med., 180: 2353−2358; および、Rudenshky, A. Y., et al. (1991) Nature, 353:622−627; これらの全てを出典明示により本明細書の一部とする)。
【0128】
好ましい実施態様では、潜在的にMHCクラスI分子に結合する能力のあるペプチド断片について、一次変異配列をスクリーニングする。MHC Iリガンドは、ほとんどオクタ−またはノナペプチドであり、天然の隔離集団を集団的に配列解読して決定された、MHC対立遺伝子特異的配列モチーフを示す。結晶構造分析により、2本のαヘリックスと1本のβプリーツ・シートで縁取られたペプチド結合開裂(cleft)、即ち溝、が同定された。開裂は、非共有結合で会合したβ2ミクログロブリンにより、下から安定化されている。結合溝中の特異的ポケットが、ペプチドのアンカー残基を収容する。ペプチドの向きは、NH2−およびCOOH−末端の電荷を補償している、MHC Iタンパク質の保存された側鎖により決定される。
【0129】
所定のMHCクラスIペプチド結合溝は、少数の側鎖位置でのみ同一または相同である、何百または何千もの異なるペプチドに結合できる。多数のクラスIペプチド−MHC複合体の構造比較により、この柔軟性は、各ペプチドの残基の小さいサブセットが構造的に同等に結合することによって達成されると解明された。なかでも、ペプチド主鎖の荷電または極性原子は、本質的な側鎖非依存的ペプチド−MHC相互作用をもたらす。この水素結合およびファンデルワールス接触の集合は、要求される主鎖コンホメーションをとる能力のある任意のペプチドの結合を安定化するのを補助する。少数のペプチド側鎖とのさらなる相互作用は、主鎖結合エネルギーを補い、特定のMHC分子に結合するペプチドにいくらかの配列選択性を持たせる(Madden, D.R. (1995) Annu. Rev. Immunol., 13:587−622)。MHC I結合部位同定の法則は、出典明示により本明細書の一部とする Altuvia, Y., et al (1997) Human Immunology, 58:1−11; および Meister, GE., et al (1995) Vaccine: 6:581−591 に記載されている。
【0130】
好ましい実施態様では、可能性のあるMHCクラスI結合部位は、MHCクラスI分子へのペプチド結合を減少または排除するために除去されたアンカー残基を構造的および化学的に補償するアミノ酸残基で置換される。好ましくは、可能性のあるMHC I結合モチーフは、SYFPEITHIなどの公開されたモチーフのデータベースに適合させて同定する(Rammensee, H., et al., (1999) Immunogenetics, 50:213−219; http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.html)); http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep/)。
【0131】
さらなる実施態様では、非アンカー残基を排除する。
【0132】
好ましい実施態様では、MHCクラスII分子に結合すると予測されるペプチド断片について、一次変異配列をスクリーニングする。クラスIIリガンドは、12ないし25アミノ酸からなり、そのうちの9個が結合溝を占める;2個ないし4個がポケットにアンカーされる。クラスIリガンドにおいてと同様に、非アンカーアミノ酸は、二次的な、しかし依然として重要な役割を果たす (Rammensee, H., et al., (1999) Immunogenetics, 50:213−219)。MHC II結合部位同定の法則は、出典明示により全体を本明細書の一部とする Hammer, J. et al., (1994) Behring. Inst. Mitt., 94: 124−132; Hammer, J. et al., (1995) J. Exp. Med., 180:2353−2358; Mallios, R.R. (1998) J. Com. Biol., 5:703−711; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, 14:121−130; Mallios, R.R. (1999) Bioinformatics, 15:432−439 に記載されている。
【0133】
好ましい実施態様では、可能性のあるMHCクラスII結合部位は、MHCクラスI結合部位を排除するために除去されたアンカー残基を構造的および化学的に補償するアミノ酸残基で置換される。好ましくは、可能性のあるMHC I結合部位は、SYFPEITHIなどの公開されたモチーフのデータベースに適合させて同定する(Rammensee, H., et al., (1999) Immunogenetics, 50:213−219; http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.html) または http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep/)。あるいは、クラスII分子への結合予測は、Sturniolo, T, et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561 に記載されているように、仮想マトリックスの方法を使用する。
【0134】
さらなる実施態様では、非アンカー残基を排除する。
好ましい実施態様では、本明細書に記載のコンピューター処理方法により改変された配列のみを考慮する。
他の実施態様では、自己由来タンパク質に存在するペプチド配列 (即ち、免疫グロブリン、アルブミンなどの循環するヒトタンパク質)は無視される。
【0135】
好ましい実施態様では、一次変異配列を、T細胞エピトープとして機能すると予測されるペプチド断片についてスクリーニングする。好ましい実施態様では、可能性のあるT細胞エピトープは、T細胞エピトープを排除するために除去された残基を構造的および化学的に補償するアミノ酸残基で置換される。好ましくは、可能性のあるT細胞エピトープは、公開されたモチーフのデータベースに適合させて同定する (Walden, P., (1996) Curr. Op. Immunol., 8:68−74)。本発明で有用な他のT細胞エピトープ同定方法には、全て出典明示により全体を本明細書の一部とする、Hemmer, B., et al. (1998) J. Immunol., 160:3631−3636; Walden, P., et al. (1995) Biochemical Society Transactions, 23; Anderton, S.M., et al., (1999) Eur. J. Immunol., 29:1850−1857; Correia−Neves, M., et al., (1999) J. Immunol., 163:5471−5477; Shastri, N., (1995) Curr. Op. Immunol., 7:258−262; Hiemstra, H.S., (2000) Curr. Op. Immunol., 12:80−84; および Meister, G.E., et al., (1995) Vaccine, 13:581−591 に記載されたものが含まれる。
【0136】
他の実施態様では、標的タンパク質の天然の折畳みと安定性に影響しない領域で、T細胞エピトープを一次配列ライブラリーに導入する。T細胞エピトープは、上記のような既知のMHC I結合ペプチド、MHC II結合ペプチドおよびT細胞エピトープのデータベースから選択される。
【0137】
好ましい実施態様では、一次変異配列は、抗体に結合すると予測されるペプチド断片についてスクリーニングする。好ましい実施態様では、Meyer らによって記載されたように(Meyer, D.L., et al. (2001), Protein Sci., 10:491−503; Schwartz, HL., et al. (1999) J. Mol Biol. 287:983−999; および Laroche, Y., et al., (2000) Blood, 96:1425−1432 も参照)、可能性のあるB細胞エピトープをより小さい中性残基で置換し、配列の免疫原性を減少させる。
【0138】
他の実施態様では、標的タンパク質の天然の折畳みと安定性に影響しない領域で、B細胞エピトープを一次配列ライブラリーに導入する。特に、標的タンパク質表面に荷電、芳香族、または大型疎水性残基を付加する。
【0139】
好ましい実施態様では、MHCクラスIまたはクラスII分子、TCRまたはBCRと相互作用する能力のある少なくとも1つの配列が改変された、少なくとも1つの候補変異タンパク質を同定する。可能性があるか、または実際のMHC、TCRまたはBCR配列を同定するいかなる方法も、本発明で使用し得る。許容し得る方法には、コンピューター処理的または物理的方法が含まれる。許容し得るコンピューター処理方法には、OptiMer と EpiMer (Meister, GE., et al. (1995) Vaccine, 6:581−591); 相互作用段階的判別手段分析金属アルゴリズム(iterative stepwise discriminant analysis metal algorithm)(Mallios, RR., (1999) Bioinformatics, 15:432−439);および構造ベースのもの (Altuvia, Y., (1997) Human Immunology 58:1−11)および進化的アルゴリズムと人工神経ネットワークを組合せた予測方法(Brusic, V., et al. (1998) Bioinformatics, 14:121−130)、仮想的マトリックス (Sturniolo, T., et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561) および BONSAI 決定ツリー (Savoie, CJ., et al (1999) Pac Symp Biocomput., 182−9)などのアルゴリズムの使用が含まれる。
【0140】
許容し得る物理的方法には、高親和性結合アッセイ(Hammer, J., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4456−4460; Sarobe, P. et al. (1998) J. Clin. Invest., 102:1239−1248)、T細胞増殖およびCTLアッセイ (Hemmer, B., et al., (1998) J. Immunol., 160:3631−3636)が含まれる。
【0141】
可能性のあるMHC、TCRまたはBCR配列を同定したら、次いで下記のように1個またはそれ以上のアミノ酸の置換によりこれらの配列を変更する。一旦候補変異タンパク質を変更したら、その後該タンパク質を試験して、その活性が標的タンパク質と同様か否かを判定する。変異体は、十分な活性を保持しているか、十分な割合の活性を有用に保持し得る。
【0142】
本発明の変異タンパク質および核酸は、天然産生の標的タンパク質と区別できる。本明細書における「天然産生」または「野生型」または文法的均等物は、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子変化を含む;つまり、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、通常は意図的に変更されていない。従って、本明細書における「非天然産生」または「合成」または「組換え」またはそれらの文法的均等物は、天然に見出されないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する;つまり、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、通常は意図的に変更されている。一旦組換え核酸が作成され、宿主細胞または生物に再導入されると、それは非組換え的に、即ち、インビトロの操作よりもむしろインビボで宿主細胞の細胞機構を使用して、複製されるが、一旦組換え的に産生された核酸は、以後は非組換え的に複製されても、本発明のためにはなお組換え体と考えられることが理解される。従って、本発明の変異タンパク質および核酸は、非天然産生である;つまり、これらは天然には存在しない。
【0143】
従って、好ましい実施態様では、変異タンパク質は、少なくとも残基の1−5%まで標的配列と異なるアミノ酸配列を有する。つまり、本発明の変異タンパク質は標的アミノ酸配列と約97−99%以下同一である。従って、タンパク質は、標的配列に対するタンパク質配列の包括的相同性が好ましくは約99%以下、より好ましくは約98%以下、さらにより好ましくは約97%以下、そしてより好ましくは約95%以下であるならば、「候補変異タンパク質」である。いくつかの実施態様では、相同性は約75−80%程も低い。
【0144】
この文脈における相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。当業界で既知のように、タンパク質(または以下に考察するように核酸)が既知配列と配列同一性または類似性を有しているか否かを同定するために多数の異なるプログラムを使用できる。配列同一性および/または類似性は技術上周知の標準的技法を使用して測定され、それには、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981) の局所配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970) の配列同一性アラインメント、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444 (1988) の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI、中の GAP、BESTFIT、FASTA および TFASTA)、Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12: 387−395 (1984) に記載の Best Fit 配列プログラムを含むがこれらに限定されるわけではなく、好ましくはデフォルト設定を使用し、または検定により使用する。好ましくは、FstDB により以下のパラメータに基づいてパーセント同一性を計算する:mismatch penalty 1; gap penalty 1; gap size penalty 0.33; joining penalty 30、”Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127−149 (1988), Alan R. Liss, Inc. である。全参照文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
【0145】
有用なアルゴリズムの一例は PILEUP である。PILEUP は、漸進的対アラインメントを用いて関連配列群から多重配列アラインメントを創出する。それはまた、アラインメント創出に使用される、クラスタリングの関係を示すツリーを描くことができる。PILEUP は、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351−360 (1987)の漸進的アラインメント法を簡略化したものを用いる;この方法は Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151−153 (1989) 記載の方法と類似している。有用な PILEUP パラメータは、a default gap weight 3.00, a default gap length weight 0.10, weighted end gaps を含む。
【0146】
有用なアルゴリズムのもう1つの例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403−410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389−3402 (1997);および Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873−5787 (1993) に記載の BLAST アルゴリズムである。特に有用な BLAST プログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460−480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html] から得られる WU−BLAST−2 プログラムである。WU−BLAST−2 はいくつかの検索パラメータを使用するがその殆どはデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは以下の値で設定する:overlap span =1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11である。HSP S および HSP S2 パラメータは動的数値であり、特定の配列の組成および興味の対象である配列を検索する特定のデータベースの組成に依存してプログラム自身により確立されるが、値は感度を上げるように調節し得る。
【0147】
これに加えて有用なアルゴリズムは、Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25: 3389−3402 に報告されている gapped BLAST である。gapped BLAST は BLOSUM−62 代替スコアを使用する;ここで閾値Tパラメータは9に設定し;2−ヒット法によりギャップのない伸長を引き起こし;ギャップ長kにコスト10+kを課し;Xuを16に設定し;Xgをデータベース検索段階では40に、そしてアルゴリズムのアウトプット段階では67に設定する。ギャップドアラインメントは約22ビットまでに相当するスコアで開始される。
【0148】
パーセントアミノ酸配列同一性の値は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より長い」配列の総残基数で割って決定される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有するものである(アラインメントスコアを最大化するために WU−Blast−2 により導入されたギャップを無視する)。
【0149】
同様にして、本発明で同定されるポリペプチドのコード配列に関する「パーセント(%)核酸配列同一性」を、標的タンパク質のコード配列のヌクレオチド残基と同一な、候補配列中のヌクレオチド残基の割合として定義する。好ましい方法は、WU−BLAST−2 の BLASTN モジュールをデフォルトパラメータに設定し、重複スパンおよび重複フラクションをそれぞれ1および0.125に設定して利用する。
【0150】
アラインメントは、アラインメントを行う配列中へのギャップ導入を含んでもよい。加えて、標的タンパク質より多いかまたは少ないアミノ酸を含有する配列については、ある実施態様では、配列同一性の割合は、アミノ酸総数に関する同一アミノ酸数に基づいて決定されると理解される。パーセント同一性の計算においては、相対的重みは、挿入、欠失、置換その他のような種々の配列変化の表出には割り当てられない。
【0151】
ある実施態様では、同一性のみがプラスのスコアを与えられ(+1)、ギャップを含むあらゆる形態の配列変化に「0」の値が割り当てられる。これにより、配列類似性計算について後述するような、重みをつけた目盛りまたはパラメータの必要性がなくなる。例えば、パーセントアミノ酸配列同一性は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より短い」配列の総残基数で割り、100を掛けて算出される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有するものである。
【0152】
従って、本発明の変異タンパク質は、標的タンパク質よりも、短くても長くてもよい。標的配列の部分または断片が、変異タンパク質の定義に包含される。変異タンパク質の断片は、a)少なくとも1つの抗原エピトープを共有する;b)少なくとも指示された相同性を有する;c)そして好ましくは標的タンパク質の生物学的活性を示す場合、変異αタンパク質とみなされる。
【0153】
下記でより詳細に概説するように、好ましい実施態様では、候補変異タンパク質は、標的タンパク質と比較して、本明細書に概説するものよりもさらにアミノ酸変化を含む。加えて、本明細書に概説するように、さらなる新規変異タンパク質を形成するために、本明細書に描写する任意の変化をいかなる方法で組合せてもよい。
【0154】
加えて、例えば出典明示により本明細書の一部とするU.S.S.N. 09/798,789に記載のように、精製タグ、融合配列などの他の配列を付加することにより、標的タンパク質よりも長い候補変異タンパク質を作成できる。例えば、本発明の変異タンパク質を、他の治療的タンパク質または薬物動体学的な目的でFcもしくは血清アルブミンなどの他のタンパク質と融合させてもよい。例えば、両方とも出典明示により本明細書の一部とする米国特許番号第5,766,883号および第5,876,969号を参照されたい。
【0155】
コア、表面、および境界残基に可変残基を含む変異タンパク質も、発明の内に含まれる。
【0156】
好ましい実施態様では、本発明の変異タンパク質は、ヒトのコンフォマー(conformer)である。本明細書における「コンフォマー」は、事実上同一の主鎖3D構造を有するが、アミノ酸側鎖に顕著な差異を有するタンパク質を意味する。つまり、本発明の変異タンパク質は、セットの全タンパク質が主鎖構造を共有し、なお少なくとも1−3−5%まで異なる配列を有する、コンフォマーのセットを定義する。変異タンパク質の3次元主鎖構造は、従ってヒト標的タンパク質の3次元主鎖構造と実質的に相応する。
【0157】
この文脈における「主鎖」は、非側鎖原子、即ち窒素、カルボニル基の炭素および酸素、およびα炭素、並びに窒素およびα炭素に結合した水素を意味する。コンフォマーを考慮すると、タンパク質はヒト標的タンパク質構造から2Åを超えない主鎖原子を持たねばならず、1.5Åを超えないのが好ましく、1Åを超えないのが特に好ましい。一般に、これらの距離は2つの方法で決定される。ある実施態様では、可能性のある各コンフォマーを結晶化し、その3次元構造を決定する。あるいは、前者は技術的に難しいので、各可能性のあるコンフォマーの配列をPDAプログラムで実行し、それがコンフォマーであるか否かを判定する。
【0158】
候補変異核酸にコードされるものとして、候補変異タンパク質を同定してもよい。核酸の場合、核酸配列の包括的な相同性はアミノ酸相同性と同一基準であるが、遺伝コードの縮重と様々な生物のコドン偏重を考慮に入れる。従って、核酸配列相同性は、タンパク質配列のものよりも低くても高くてもよく、低い相同性が好ましい。
【0159】
好ましい実施態様では、候補変異核酸は、候補変異タンパク質をコードする。当業者に理解されるように、遺伝暗号の縮重のために、すべて本発明の変異タンパク質をコードする、極めて多数の核酸を作成し得る。ゆえに、特定のアミノ酸配列を同定すれば、当業者は、変異タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で、単純に1つまたはそれ以上のコドンの配列を変更することにより、異なる核酸をいくつでも作成し得る。
【0160】
ある実施態様では、核酸相同性はハイブリダイゼーション研究により決定される。ハイストリンジェンシー条件は、当分野で既知である;例えば、出典明示により本明細書の一部とする Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989 および Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al. を参照のこと。ハイストリンジェント条件は配列依存的であり、環境が違えば異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−−Hybridization with Nucleic Acid Probes, ”Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993) に見出される。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびpHにおいて、特異的配列の熱融解点(Tm)より約5−10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が、平衡状態で標的配列に(規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度で)ハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するので、Tmでは、50%のプローブが平衡状態で占有される)。ストリンジェント条件は、そこでは塩濃度が約1.0Mナトリウムイオンより低く、典型的には約0.01ないし1.0Mのナトリウムイオン(または他の塩)濃度、pH7.0ないし8.3、温度が、短いプローブ(例えば、10ないし50のヌクレオチド)には低くても約30℃、長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド以上)には低くても約60℃であるもの、である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化させる物質の添加により達成されてもよい。
【0161】
他の実施態様では、より低いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件を使用する;例えば、当分野で既知のように、モデレートまたはローストリンジェンシー条件を使用してもよい;Maniatis and Ausubel(前出)および Tijssen(前出)を参照のこと。
【0162】
本発明の候補変異タンパク質と核酸は、組換え体である。本明細書で使用される「核酸」は、DNAもしくはRNA、またはデオキシ−およびリボヌクレオチドの両者を含有する分子を表わし得る。核酸は、ゲノムDNA、cDNAおよびオリゴヌクレオチドを含み、センスおよびアンチセンス核酸を含む。このような核酸はまた、生理的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、リボース−リン酸バックボーンに変更を含んでいてもよい。
【0163】
核酸は2本鎖、1本鎖であってよく、または2本鎖もしくは1本鎖の配列の両方の部分を含有してもよい。当業者に認識されるように、1本鎖(「ワトソン」)を描けばもう1つの鎖(「クリック」)の配列が規定され、ゆえに図6に示す配列は、該配列の相補鎖もまた含む。本明細書における「組換え核酸」の用語は、一般的に、核酸をエンドヌクレアーゼによって操作して、天然には通常見出されない形状で、当初はインビトロで形成した核酸を意味する。ゆえに、線状形状で単離された候補変異核酸や、通常は結合していないDNA分子をライゲーションすることによりインビトロで形成した発現ベクターは、両者とも本発明のためには組換え体と考えられる。一旦組換え核酸が作成され宿主細胞または生物に再導入されたら、それは非組換え的に、即ち、インビトロの操作ではなく宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して複製すると理解される;しかしながら、そのような核酸は一旦組換え的に産生されれば、以後は非組換え的に複製しても、本発明のためにはなお組換え体と考えられる。
【0164】
同様に、「組換えタンパク質」は組換え技法を使用して、即ち上述のように組換え核酸の発現を通して作成されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも1つまたはそれ以上の特性によって、天然産生のタンパク質と区別される。例えば、このタンパク質は、野生型宿主中で通常会合しているタンパク質または化合物の一部または全てから単離または精製され、従って実質的に純粋であり得る。例えば、単離されたタンパク質は、天然状態では通常会合している物質の少なくとも一部を伴わないで、所定の試料中の総タンパク質重量の好ましくは少なくとも約0.5%、より好ましくは少なくとも5%を構成している。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質重量の少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、そして特に好ましくは少なくとも約90%を含む。この定義には、ある生物由来の候補変異タンパク質を異なる生物または宿主細胞中で生産することが含まれる。あるいは、タンパク質がより増加した濃度レベルで作成されるように、誘導可能プロモーターまたは高発現プロモーターを使用することにより、タンパク質を通常見られるよりも有意に高濃度で作成し得る。さらに、以下に考察するように、本明細書で概説する全ての変異タンパク質は、アミノ酸置換、挿入および欠失、好ましくは置換、を含むので、天然に通常は見出されない形態である。
【0165】
本明細書で概説する候補変異配列のアミノ酸配列変異体も、本発明の候補変異タンパク質の定義に包含される。つまり、候補変異タンパク質は、標的タンパク質と比較して、さらなる可変位置を含有し得る。これらの変異体は、置換、挿入または欠失変異体の3分類の1つまたはそれ以上に相当する。これらの変異体は通常、カセット式またはPCR式変異導入または当分野で周知の他の技法を使用して、候補変異タンパク質をコードするDNA中のヌクレオチドの部位特異的変異導入により、変異体をコードするDNAを産生し、その後上記概説したようにDNAを組換え培養細胞中で発現させることにより調製する。しかしながら、約100〜150残基までを有する候補変異タンパク質断片を、確立された技法を使用してインビトロ合成で調製し得る。アミノ酸配列変異体は変化が予め決定されているという性質によって特徴付けられ、この特徴によって、これらの変異体は、候補変異タンパク質のアミノ酸配列の天然産生の対立遺伝子変異体または種間変異体から区別される。変異体は典型的に、天然産生の類似体と同じ定性的な生物学的活性を発揮するが、以下にさらに詳しく略述するように、変更された特徴を有する変異体を選択することもできる。
【0166】
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は予め決定されるが、変異自体は予め決定しておく必要はない。例えば、所定の部位における変異の実施を最適化するために、標的コドンまたは領域でランダム変異誘発を起こし、発現した変異タンパク質をスクリーニングして所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。既知配列を有するDNA中の予め定められた部位に置換変異を作成する技法は周知であり、例えば、M13プライマーによる変異導入およびPCRによる変異導入がある。
【0167】
アミノ酸置換は典型的には単一の残基である;かなり大きな挿入も許容され得るが、挿入は通常、約1〜20アミノ酸の単位で行われる。欠失は、より大きな場合もあるが、約1から約20残基の範囲である。
【0168】
最終誘導体に到達するために、置換、欠失、挿入またはそれらのいかなる組合せを用いてもよい。一般的に、これらの変化は、分子の改変を最小限にするために少数のアミノ酸について行われる。しかしながら、より大きな変化も一定の状況では許容され得る。変異タンパク質の特徴について小さな改変が望まれる場合は、置換は一般的に次のチャートに従って作成される。
【表1】
【0169】
機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、チャートIに示したものより保存性の低い置換を選択することによって作成される。例えば、より大きく影響する置換を作成できる:それらは、改変する区域のポリペプチド主鎖構造、例えばアルファ−ヘリックス構造またはベータ−シート構造;標的部位での分子の電荷または疎水性;または側鎖の大きさである。一般的にポリペプチドの特性に最も大きな変化を生じると期待される置換は(a)親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルに置換する(またはその逆)、(b)システインまたはプロリンを他のいずれかの残基に置換する(またはその逆)、(c)正電荷を持つ側鎖、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルを、負電荷を持つ側鎖、例えばグルタミル、アスパルチルに置換する(またはその逆)、または(d)大きい側鎖を持つ残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を持たない残基、例えばグリシンに置換する(またはその逆)、ものである。
【0170】
典型的には、変異体は定性的に同じ生物学的活性を発揮するが、必要に応じて免疫応答は元来の候補変異タンパク質のものから改変されていてもよい。あるいは、変異体を候補変異タンパク質の生物学的活性が改変されるように設計することができる。例えば、グリコシル化部位を改変または除去し得る。同様に、生物学的機能も改変し得る。
【0171】
加えて、いくつかの実施態様では、標的タンパク質よりも安定である、免疫原性が改変された候補変異タンパク質を得るのが望ましい。好ましくは、酸化安定性、アルカリ安定性、熱安定性を示すタンパク質を得るのが望ましい。
【0172】
酸化安定性の変化は、様々な酸化条件にさらされたときに、変異タンパク質の活性が、野生型タンパク質のものと比較して少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約50%増加することにより明示される。酸化安定性は、既知方法により測定される。
【0173】
アルカリ安定性の変化は、上昇または低下するpH条件にさらされたときに、変異タンパク質活性の半減期が、野生型タンパク質のものと比較して、少なくとも約5%またはそれ以上増加または減少(好ましくは増加)することにより明示される。一般に、アルカリ安定性は、既知方法により測定される。
【0174】
熱安定性の変化は、比較的高い温度と中性pHにさらされたときに、変異タンパク質活性の半減期が、野生型タンパク質のものと比較して少なくとも約5%またはそれ以上増加または減少(好ましくは増加)することにより明示される。一般に、熱安定性は、既知方法により測定される。
【0175】
本発明の候補変異タンパク質および核酸は、数々の方法で作成できる。個々の核酸およびタンパク質は、当分野で既知のように、また以下に概説するように作成できる。あるいは、候補変異タンパク質のライブラリーを試験用に作成できる。
【0176】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質ライブラリーは確率分布表から生成される。本明細書に概説するように、PDA(登録商標)技法、配列アラインメント、自己無撞着性平均力場(self−consistent mean field; SCMF)計算などの力場計算などを含む、確率分布表を生成させる様々な方法がある。加えて、ライブラリーで観察される変異頻度の測定として各位置についてエントロピースコアの情報を生成させるために、確率分布を使用できる。
【0177】
この実施態様では、リスト中の各可変位置における各アミノ酸残基の頻度を同定する。各頻度は、カットオフより低い変異頻度を全てゼロとセットした場合の閾値であり得る。このカットオフは、好ましくは、約1%、2%、5%、10%または20%であり、特に好ましいのは約10%である。これらの頻度は、次いで候補変異タンパク質ライブラリー中に組込む。即ち、上記のように、これらの可変位置を集め、そしてあらゆる可能性のある組合せを生成させるが、候補変異タンパク質ライブラリーを「満たす」アミノ酸残基は頻度ベースで利用する。従って、ある頻度ベースでない候補変異タンパク質ライブラリー中では、5つの可能性のある残基を有する1つの可変位置が、可能性がある第1残基を有するその可変位置を含むタンパク質を約20%、第2のそれを20%、以下同、を有するであろう。しかしながら、頻度ベースの候補変異タンパク質ライブラリーでは、それぞれ約10%、15%、25%、30%および20%の頻度で、5つの可能性のある残基を有する1つの可変位置は、可能性がある第1残基を有するその可変位置を含むタンパク質を10%、第2残基を有するタンパク質を15%、第3のそれを25%、以下同、を有するであろう。当業者には明らかなように、実際の頻度は実際にタンパク質生成に使用した方法によって変り得る;例えば、正確な頻度はタンパク質を合成した時に可能であり得る。しかしながら、以下に概説する頻度ベースのプライマー系を使用する場合は、各位置における実際の頻度は後述のように変化する。
【0178】
当業者に認識されるように、そして本明細書で概説するように、確率分布表は種々の方法で生成させることができる。本明細書で概説した方法に加えて、確率表の直接的生成において、自己無撞着性平均力場(SCMF)法を使用できる。SCMFは、回転異性体相互作用の平均力場の記載を使用してエネルギーを計算する決定論的コンピュータ処理方法である。この方法で形成された確率表は、本明細書に記載のような候補変異タンパク質ライブラリーを創出するのに使用できる。SCMFは3通りに使用できる:アミノ酸および各アミノ酸の回転異性体の頻度を各位置についてリストする;確率をSCMFから直接決定する(出典明示により本明細書の一部とする Delarue et la. Pac. Symp. Biocomput. 109−21 (1997) を参照のこと)。加えて、高度可変位置および非可変位置を同定できる。
【0179】
あるいは、配列空間探索中にどの配列にジャンプするかを決定するために、別の方法が使用される;SCMFはその配列について正確なエネルギーを得るために用いられる;このエネルギーは次いでそれをランク付けし、(モンテカルロ配列リストに類似の)配列のランク順リストを創出するのに使用される。次いで各位置におけるアミノ酸の頻度を示す確率表がこのリストから計算される(Koehl et al., J. Mol. Biol. 239: 249 (1994); Koehl et al., Nat. Struc. Biol. 2: 163 (1995); Koehl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 222 (1996); Koehl et al., J. Mol. Bio. 293: 1183 (1999); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293: 1161 (1999); Lee J. Mol. Biol. 236: 918 (1994); and Vasquez Biopolymers 36: 53−70 (1995);いずれも、特に出典明示により本明細書の一部とする)。
【0180】
類似の方法としては、OPLS−AA (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225−11236; Jorgensen, W.L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT (1999)); OPLS (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff; Jorgensen, et al., J Am. Chem. Soc. (1990), v 112, pp 4768ff);UNRES (United Residue Forcefield; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp 1697−1714; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp1715−1731; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp 849−873; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp 874−884; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp 259−276); Forcefield for Protein Structure Prediction(Liwo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp 5482−5485);ECEPP/3(Liwo et al., J Protein Chem 1994 May;13(4): 375−80); AMBER 1.1 力場 (Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. v 106, pp 765−784);AMBER 3.0 力場 (U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 755−759);CHARMM および CHARMM22 (Brooks, et al., J. Comp. Chem. v4, pp 187−217);cvff3.0(Dauber−Osguthorpe, et al.,(1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v 4,pp 31−47); CFF91(Maple, et al., J. Comp. Chem. v 15, 162−182)が含まれるが、これらに限定されるわけではない;また、DISCOVER(cvffおよびcff91)および AMBER 力場は INSIGHT 分子モデリングパッケージ(Biosym/MSI, San Diego California)で使用され、そして HARM は QUANTA 分子モデリングパッケージ(Biosym/MSI, San Diego California)で使用される。
【0181】
加えて、本明細書で概説するように、確率分布表生成の好ましい方法は配列アラインメントプログラムの使用を介するものである。加えて、確率表は配列アラインメントおよびコンピューター処理によるアプローチの組合せで得られる。例えば、相同配列のアラインメントで見出されたアミノ酸をコンピューター処理の結果に付加できる。好ましくは、確立表に一致する野生型アミノ酸を、もしそれがコンピューター処理で見出されない場合に付加できる。
【0182】
明らかとなるであろうが、可変位置および/または可変位置における残基を組換えて創出した候補変異タンパク質ライブラリーは、ランク順になっていない。いくつかの実施態様では、全リストを作成し、試験するだけでよい。あるいは、好ましい実施態様では、この二次ライブラリーもランク順リスト形態にある。これは、二次ライブラリーの大きさが実験的に生成させるにはまだ大きすぎること、または予測上の目的を含む、いくつかの理由で行い得る。これは数種の方法で実施できる。ある実施態様では、ライブラリー構成員をランク付けするPDAのスコア付け機能を使用して、二次ライブラリーをランク付けする。あるいは、統計的手法を使用できる。例えば、この二次ライブラリーは、頻度スコアによってランク付けし得る;即ち、高頻度残基の大部分を含有するタンパク質を高くランク付けすること、等が可能であろう。これは、数値的スコアを生成させるために、各可変位置において頻度を加算するかまたは乗ずることによっても行い得る。同様にして、二次ライブラリーの様々な位置に重みを付け、次いでタンパク質をスコア付けできる;例えば、ある残基を含有するものを任意にランク付けできる。
【0183】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリーの異なるタンパク質構成員を化学的に合成できる。これは、設計したタンパク質が短い場合、好ましくは150アミノ酸長以下、より好ましくは100アミノ酸長以下、特に好ましくは50アミノ酸長以下である場合に特に有用であるが、当業界で既知のように、より長いタンパク質でも、化学的または酵素的に調製し得る。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Wilken et al, Curr. Opin. Biotevhnol. 9: 412−26 (1998) 参照。
【0184】
好ましい実施態様では、特により長いタンパク質または大型サンプルが望まれるタンパク質について、候補変異配列を、構成員配列をコードしており、そして宿主細胞中にクローン化し、所望により発現および分析できるDNAのような核酸を生成させるために使用する。従って、各構成員タンパク質配列をコードする核酸および特にDNAを作成できる。これは周知の方法を使用して行う。コドン、適する発現ベクター、および適する宿主細胞の選択は、数々の要因によって変化し、また必要に応じて容易に最適化できる。
【0185】
好ましい実施態様では、図1に一般的に示すように、プールしたオリゴヌクレオチドを用いる複数のPCR反応を実施する。この実施態様では、全長遺伝子に対応する重なり合ったオリゴヌクレオチドを合成する。また、これらのオリゴヌクレオチドは、各変異位置またはサブセットにおいて異なるアミノ酸の全てを表し得る。
【0186】
好ましい実施態様では、これらのオリゴヌクレオチドを等しい割合でプールし、複数のPCR反応を実施して、二次ライブラリーで定義された変異の組合せを含有する全長配列を創出する。加えて、このことは、誤りがちなPCR(error−prone PCR)の方法を使用して行い得る。
【0187】
好ましい実施態様では、様々なオリゴヌクレオチドを、確率分布表に対応する相対量で加える。従って、複数のPCR反応は、所望の変異の組合せを所望の割合で有する全長配列をもたらす。
【0188】
必要なオリゴヌクレオチドの総数は、変異させる位置の数およびそれらの位置で考慮される変異の数の関数である。
(不変位置に対するオリゴ数)+M1+M2+M3+・・・Mn=(必要オリゴの総数)、但し、Mnはその配列の位置nにおいて考慮される変異の数である。
【0189】
好ましい実施態様では、各重複オリゴヌクレオチドは、変異させようとする位置を1つだけ含む;別の実施態様では、変異位置が互いに近接しすぎてこのことを不可能にし、各オリゴヌクレオチド当たり複数の変異を使用して可能性のある全ての組換えを完成させる。即ち、各オリゴは、変異させようとする単一位置か、または変異させようとする1以上の位置のコドンを含有できる。変異させようとする複数位置は、オリゴの長さが非実用的になるのを防ぐために、配列内で近接していなければならない。
【0190】
あるオリゴヌクレオチド上の複数の変異位置に対して、特定の変異の組合せをコードしているオリゴヌクレオチドを包含または排除することにより、該組合せをそのライブラリー中で包含または排除できる。例えば、本明細書で考察するように、可変位置間に相関関係があり得る;即ち、位置Xがある特定の残基の場合には、位置Yはある特定の残基でなければならない(または、あってはならない)。可変位置のこれらのセットは、本明細書においては時々「クラスター」と呼称される。クラスターが互いに近接した残基を含み、従って1個のヌクレオチドプライマー上に存在できるときには、クラスターは「良好な」相関に設定し、ライブラリーの有効性を減少させ得る悪い組合せを除去できる。しかしながら、クラスターの残基が配列中で離れていて、従って合成のための別のオリゴヌクレオチド上に存在するであろう場合には、残基を「良好な」相関に設定するか、または可変残基として完全に排除するのが望ましいであろう。
【0191】
別の実施態様では、クラスター変異がもっぱら一緒に現れるように、ライブラリーをいくつかの段階で創出する。この方法、即ち、変異クラスターを同定し、それを同じオリゴヌクレオチド上に置くか、またはライブラリーから除去するか、またはクラスターを保存しながらいくつかの段階でライブラリーを生成させることにより、実験的ライブラリーが、適正に折畳まれたタンパク質にかなり富むようにできる。クラスターの同定は、例えば、既知のパターン認識法の使用、変異発生頻度の比較、または実験的に生成させる配列のエネルギー解析(例えば、もし相互作用エネルギーが高ければ、位置は相関している)の使用などの多数の方法で実行することができる。これらの相関は、位置相関(例えば、位置1および2が常に一緒に変化するか、または決して一緒に変化しない)でも、配列相関(例えば、位置1に残基Aがあれば、常に位置2に残基Bがある)でもよい。
【0192】
Pattern discovery in Biomolecular Data: Tools, Techniques, and Applications; edited by Jason T.L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shasha. New York: Oxford University, 1999; Andrews, Harry C. Introduction to mathematical techniques in pattern recognition; New York, Wiley−lnterscience [1972]; Applications of Pattern Recognition; Editor, K.S. Fu. Boca Raton, Fla. CRC Press, 1982; Genetic Algorithms for Pattern Recognition; edited by Sankar K. Pal, Paul P. Wang. Boca Raton: CRC Press, c1996; Pandya, Abhijit S., Pattern recognition with neural networks in C++ / Abhijit S. Pandya, Robert B. Macy. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1996; Handbook of pattern recognition & computer vision / edited by C.H. Chen, L.F. Pau, P.S.P. Wang. 2nd ed. Singapore; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999; Friedman, Introduction to Pattern Recognition: Statistical, Structural, Neural, and Fuzy Logic Approaches; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999, Series title: Series in machine perception and artificial intelligence; vol. 32、これらは全て出典明示により本明細書の一部とする、を参照のこと。加えて、共通モチーフの探索に使用するプログラムも同様に使用できる。
【0193】
加えて、相関および混合は、オリゴヌクレオチドの設計を改変することにより、即ち、オリゴヌクレオチド(プライマー)をどこで開始および停止するか(例えばどこで配列を「切断」するか)を定めることにより、固定または最適化することができる。オリゴの開始および停止部位は、単一のオリゴヌクレオチド中に現れるクラスターの数を最大にするように設定でき、それにより、ライブラリーをより高いスコアの配列に富ませる。様々なオリゴヌクレオチドの開始および停止部位のオプションをコンピューター処理でモデル化し、単一のオリゴ上に表されるクラスターの数に従って、または予測された配列ライブラリーに合致する、生じた配列の割合に従ってランク付けを行うことができる。
【0194】
必要となるオリゴヌクレオチドの総数は、複数の変異可能位置が単一のオリゴヌクレオチドによりコードされるとき、増加する。アニールリングした領域は一定のままのもの、即ち、参考配列の配列を有するものである。
【0195】
長さが異なるタンパク質を発現するライブラリーを創出するために、コドンを挿入または欠失したオリゴヌクレオチドを使用できる。特に、挿入または欠失のためのコンピューター処理配列スクリーニングにより、長さが異なるタンパク質を定義する二次ライブラリーを得ることができ、それらのタンパク質は、プールした様々な長さのオリゴヌクレオチドのライブラリーにより発現させ得る。
【0196】
好ましい実施態様では、二次ライブラリーは、ファミリー(例えば、変異体のセット)の混合により実施される;つまり、(ランク順リストを使用する場合、)誤りがちなPCRを用いるか、または用いずに、いくつかの上位配列のセットを混合できる。この文脈での「混合」は、一般にランダムに行われる、関連配列の組換えを意味する。それには、米国特許番号第5,830,721号;第5,811,238号;第5,605,793号;第5,837,458号およびPCT US/19256(すべて、これらの全部分を出典明示により本明細書の一部とする)に定義および例示されているような「混合」が包含される。この配列のセットは、人工のセットも可能である;例えば、確率表(例えばSCMFを使用して生成されるもの)やモンテカルロのセットに由来する。同様に、「ファミリー」は、上位の10配列と下位の10配列、上位100配列、などであり得る。また、このことは誤りがちなPCRによっても行い得る。
【0197】
従って、好ましい実施態様では、本明細書に記載のコンピューター処理方法を使用して、インシリコ(in silico)混合を行う。つまり、2つのライブラリーまたは2つの配列のどちらかで開始し、ランダムな配列の組換えを生成させ、評価することができる。
【0198】
好ましい実施態様では、誤りがちなPCRを行って二次ライブラリーを生成させる。米国特許番号第5,605,793号、第5,811,238号、および第5,830,721号参照(これらの全部を出典明示により本明細書の一部とする)。これは、最適配列またはライブラリーの上位構成員、または他の人工セットもしくはファミリー上で行える。この実施態様では、一次ライブラリーのコンピューター処理スクリーニングで見出した最適配列に対する遺伝子を合成できる。次いで、誤りがちなPCRを、二次ライブラリーの変異位置で変異をコードしているオリゴヌクレオチド(偏りのある(bias)オリゴヌクレオチド)の存在下で、最適配列遺伝子上で実施する。オリゴヌクレオチドの添加により、二次ライブラリー中に変異の導入に有利となる偏りが創出される。あるいは、ライブラリーを偏らせるのに、ある一定の変異のためのオリゴヌクレオチド群のみを使用し得る。
【0199】
好ましい実施態様では、偏りのあるオリゴヌクレオチドの存在下に、誤りがちなPCRによる遺伝子の混合を最適配列の遺伝子上で実施し、二次ライブラリー中に見出される各変異の割合を反映しているDNA配列ライブラリーを創出できる。偏りのあるオリゴヌクレオチドの選択は、各種の方法で行える;それらは、それらの頻度に基づいて選択できる、即ち、変異頻度の高い位置をコードしているオリゴヌクレオチドを使用でき;あるいは、多様性が増加するように、最も変異しやすい位置を含有するオリゴヌクレオチドを使用でき;もし二次ライブラリーがランク付けされるなら、上位スコアの位置のいくつかを、偏りのあるオリゴヌクレオチドの生成に使用でき;ランダムな位置を選択することもでき;上位スコアのものを少数と低スコアのものを少数選択し得る;等である。重要なことは、好ましい変異位置および配列に基づいて新規配列を生成させることである。
【0200】
好ましい実施態様では、図1に概略を描写するように、野生型遺伝子または標的遺伝子を用いるPCRを使用できる。この実施態様では、開始遺伝子を使用する;要件ではないが、一般にその遺伝子は野生型遺伝子である。それは大域的最適配列またはリストにある任意の他の配列をコードする遺伝子である場合がある。この実施態様では、変異位置に対応し、二次ライブラリーの様々なアミノ酸を含有するオリゴヌクレオチドを使用する。当分野で周知のように、PCRは末端でPCRプライマーを用いて行う。これには2点の利点がある;第1にオリゴヌクレオチドが少なくて済み、誤りを少なくできる。加えて、野生型遺伝子を使用する場合、合成する必要がないという実験上の利点がある。
【0201】
加えて、図2−5に例示するように、使用できる他のいくつかの技法がある。好ましい実施態様では、PCR産物のライゲーションを行う。
【0202】
好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の候補変異二次ライブラリーに対して、様々な付加的な段階を行える;例えば、さらなるコンピューター処理を施すことができ、候補変異二次ライブラリーを再び組合せることができ、あるいは異なる候補変異二次ライブラリーからのカットオフを組合せることができる。好ましい実施態様では、候補変異二次ライブラリーをコンピューター処理により再操作してさらなる二次ライブラリー(本明細書で「三次ライブラリー」と呼ぶときがある)を形成し得る。例えば、任意の候補変異二次ライブラリー配列を、第1二次ライブラリー中の変化位置の一部または全てを凍結または固定することにより、PDAの第2ラウンド用に選択できる。あるいは、最後の確率分布表中にみられる変化のみを許容する。あるいは、確率表のストリンジェンシーを、含めるカットオフを増加させるかまたは減少させるかのいずれかにより変更し得る。同様にして、候補変異二次ライブラリーを第1ラウンド後に実験的に組換え得る;例えば、第1スクリーニング由来の最良遺伝子/遺伝子群を取り、遺伝子組み立てを再び行う(以下に概説する技術、複数PCR、誤りがちなPCR、混合、等を使用して)。あるいは、いくつかの位置における確率を変えるための、1つまたはそれ以上の良好遺伝子(群)由来の断片。これは、第1ラウンドのコンピューター処理的および実験的スクリーニングにおいて見出された配列空間の区域の探索を偏らせる。
【0203】
好ましい実施態様では、候補変異二次ライブラリーを組合せることから三次ライブラリーを生成できる。例えば、本明細書で概説するようにコンピューター処理的または実験的に、候補変異二次ライブラリーから確率分布表を生成させて組換える。PDA(登録商標)技法の候補変異二次ライブラリーを配列アラインメントライブラリーと組合せてもよく、(再度、コンピューター処理的または実験的に)組換えるか、単に各々からのカットオフを合わせるかして、新しい三次ライブラリーを作成してもよい。数個のライブラリーからの上位配列を再び組合せることができる。一次および二次ライブラリーを、同様に組合せることができる。あるライブラリーの上位からの配列を、そのライブラリーの下位からの配列と組合せてより広い配列空間をサンプリングすることができ、あるいはライブラリーの上位から離れた配列のみを組合せることができる。タンパク質の様々な部分を分析した候補変異二次ライブラリーを組合せて、タンパク質の組合された部分を取扱う三次ライブラリーにすることができる。
【0204】
好ましい実施態様では、候補変異二次ライブラリーにおける相関を使用して、三次ライブラリーを生成できる。つまり、第1可変位置の残基を第2可変位置の残基に相関させる(または同様にさらなる位置の残基に相関させる)ことができる。例えば、第1の残基がXなら第2の塩基はYでなければならないというように、2つの可変位置は立体配置的または静電気的に相互作用し得る。これは正または負の相関のどちらでもよい。
【0205】
候補変異体ライブラリー構成員をコードする本発明の核酸を使用して、様々な発現ベクターを作成する。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクター、または宿主のゲノムに組込まれるベクターのどちらでもよい。一般に、これらの発現ベクターは、ライブラリータンパク質をコードする核酸に機能し得るように結合した、転写および翻訳調節核酸を含む。「制御配列」の用語は、特定の宿主生物中で機能し得るように結合したコード配列の発現に必要なDNA配列を表す。原核生物に適する調節配列には、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、そしてリボソーム結合部位が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【0206】
核酸が別の核酸配列と機能的関係にある状況に置かれたとき、核酸は「機能し得るように結合」されている。例えば、前駆配列または分泌リーダーに関するDNAは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのDNAに機能し得るように結合されている;プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響するならば、コード配列に機能し得るように結合されている;またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するような位置にあるならば、コード配列に機能し得るように結合されている。一般的に、「機能し得るように結合」するとは、結合されるDNA配列が隣接していることを、そして、分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディング・フェーズ(reading phase)にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接する必要はない。結合は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、常法に従い使用する。転写および翻訳調節核酸は、一般に、当業者に認識されるように、ライブラリータンパク質の発現に使用される宿主細胞に適切である;例えば、Bacillus 由来の転写および翻訳調節核酸配列は、好ましくは Bacillus でのライブラリータンパク質の発現に使用される。多様な型の適当な発現ベクター、および適当な調節配列が、様々な宿主細胞に関して当技術分野で知られている。
【0207】
一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定はされない。好ましい実施態様では、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。
【0208】
プロモーター配列は、構成的または誘導可能プロモーター配列を含む。プロモーターは、天然産生プロモーター、ハイブリッドまたは合成プロモーターであり得る。1つ以上のプロモーターのエレメントをあわせもつハイブリッドプロモーターも、当業界で知られており、本発明で有用である。
【0209】
さらに、発現ベクターはさらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは2つの複製系を有してもよく、2生物、例えば発現用の哺乳動物または昆虫細胞およびクローニングおよび増幅用の原核生物宿主において維持され得る。さらに、組込み発現ベクターの場合、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同的な少なくとも1つの配列、そして好ましくは発現コンストラクトの両端に接する2つの相同配列を含む。組込みベクターは、ベクターに含める適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞中の特定座に導かれ得る。組込みベクター用コンストラクトおよび適切な選択およびスクリーニングプロトコールは当業界ではよく知られ、例えば、Mansouret all, Cell, 51:503 (1988) and Murray, Gene Transfer and Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 7 (Clifton: Humana Press, 1991)に記載されている。
【0210】
さらに、好ましい実施態様では、発現ベクターは、発現ベクターを含有する、形質転換した宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子を含有し、そして、特に哺乳動物細胞の場合、ベクターを含有しない細胞が一般的に死滅するため、ベクターの安定性が確保される。選択遺伝子は当業界ではよく知られており、使用する宿主細胞により異なる。本明細書における「選択遺伝子」は、選択剤に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする任意の遺伝子を意味する。適当な選択剤には、ネオマイシン(またはその類似体G418)、ブラスチシジンS、ヒスチニドールD、ベレオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシンBおよび他の薬物が含まれるが、それらに限定するものではない。
【0211】
好ましい実施態様では、発現ベクターは、遺伝子発現レベルを上昇させるために、発現される遺伝子の上流または下流にRNAスプライシング配列を含有する(Barret et al., Nucleic Acids Res. 1991; Groos et al., Mol. Cell. Biol. 1987; and Budiman et al., Mol. Cell. Biol. 1988 を参照されたい)。
【0212】
好ましい発現ベクター系は、 Mann et al., Cell, 33:153−9 (1993); Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(18):8392−6 (1993); Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:9146−50 (1995);Kinsella et al., Human Gene Therapy, 7:1405−13; Hofmann et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:5185−90; Choate et al., Human Gene Therapy, 7:2247 (1996); PCT/US97/01019 および PCT/US97/01048、並びにこれらで引用された参照文献に一般的に記載されるようなレトロウイルスベクター系であって、すべて出典明示により本明細書の一部とする。
【0213】
本発明の候補変異体ライブラリータンパク質は、核酸、好ましくはライブラリータンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ライブラリータンパク質の発現を誘導するか、または引き起こすための適切な条件下で、培養して産生する。候補変異体ライブラリータンパク質の発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変動し、日常的な実験を通じて当業者により容易に確認される。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターを使用するには、宿主細胞の成長および増殖の最適化が必要とされ、一方誘導可能プロモーターを使用するには、誘導に適した成長条件が必要とされる。さらに、いくつかの実施態様では、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルス系は溶菌ウイルスであり、そのため回収時期の選択が生成物の収率にとって重大である。
【0214】
当業者に明らかなように、本発明において使用する細胞型は広範囲に変動する。基本的には、酵母、細菌、古細菌、真菌および昆虫および哺乳動物細胞を含む動物細胞を含む、広く様々な適切な宿主細胞を使用できる。特に有利なのは、Drosophila melangaster 細胞、Saccharomyses cerevisiae および他の酵母、E. coli、Bacillus subtilis、SF9細胞、C129細胞、293細胞、ニューロスポラ(Neurospora)、BHK、CHO、COSおよびHeLa細胞、線維芽細胞、神経鞘腫細胞系、不死化哺乳動物骨髄様およびリンパ様細胞系、ジャーカット(Jurkat)細胞、マスト細胞および他の内分泌性細胞および外分泌性細胞、並びにニューロン細胞である。出典明示により本明細書の一部とするATCC細胞株カタログを参照されたい。さらに、当業界で周知のようなファージディスプレイ系における二次ライブラリーの発現は、特に二次ライブラリーがランダムペプチドを含む場合に、特に好ましい。ある実施態様では、細胞は遺伝子操作し得る、つまり、外因核酸を含有するように、例えば標的分子を含有するようにし得る。
【0215】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質を、哺乳動物細胞中で発現させる。いずれの哺乳動物細胞を使用してもよく、マウス、ラット、霊長類、ヒトの細胞は特に好ましい。当業者に理解されるように、偽型による系の変更により、全ての真核細胞、好ましくは高等真核生物の使用を可能にする。以下により詳しく記載するように、スクリーニングは、ランダムライブラリー構成員の存在下で選択可能な表現型を示すように設定する。さらに以下に詳述するように、細胞内にライブラリー構成員が存在する結果として、改変された表現型を示す細胞の選択を可能とするように、適当なスクリーンが設計され得る限り、幅広く様々な疾病症状のに関連する細胞型は、特に有用である。
【0216】
従って、適当な哺乳動物細胞型は、限定されるものではないが、全ての種類の腫瘍細胞(特に、黒色腫様、骨髄性白血病、肺癌腫、胸癌腫、卵巣癌腫、大腸癌腫、腎臓癌腫、前立腺癌腫、膵臓癌腫および精巣癌腫)、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球(T細胞およびB細胞)、マスト細胞、好酸球、血脈管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を含む白血球、造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋幹細胞などの幹細胞(分化および脱分化因子のスクリーニングで使用する)、破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝臓細胞、腎臓細胞および含脂肪細胞を包含する。また、適当な細胞は、ジャーカットT細胞、NIH3T3細胞、CHO、Cosなどを含むが、これらに限定されるものではない、既知の研究用細胞を含む。出典明示により本明細書の一部とするATCC細胞株カタログを参照のこと。
【0217】
哺乳動物発現系もまた当分野では既知であり、レトロウイルス系を含む。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物RNAポリメラーゼに結合し、ライブラリータンパク質をコードする配列のmRNAへの下流(3’)転写を開始させる能力のある任意のDNA配列である。プロモーターは、通常コード配列の5’末端近傍に位置する転写開始領域、および転写開始部位上流に位置する25−30塩基対を使用するTATAボックスを有する。TATAボックスは、RNAポリメラーゼIIに指令し、正確な部位でのRNA合成を開始させると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、典型的にはTATAボックスの上流100ないし200塩基対内に位置する、上流プロモーターエレメント(エンハンサーエレメント)を含有する。上流プロモーターエレメントは、転写開始速度を決定し、いずれかの向きで作用できる。ウイルス遺伝子は高度に発現されることが多く広い宿主範囲を有するため、哺乳動物プロモーターとして特に有用なのは哺乳動物ウイルス遺伝子由来プロモーターである。例としては、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびCMVプロモーターが含まれる。
【0218】
典型的には、哺乳動物細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの3’に位置する調節領域であり、そのためプロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟mRNAの3’末端は、部位特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、SV40由来のものがある。
【0219】
外因核酸を哺乳動物宿主ならびに他の宿主に導入する方法は、当業界ではよく知られており、使用される宿主細胞により変化する。技法には、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、ウイルス感染、リポソームにおけるポリヌクレオチド(複数も可)封入、および核へのDNAの直接マイクロインジェクションがある。
【0220】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質は、細菌系で発現する。細菌発現系は、当業者には周知である。
【0221】
適当な細菌プロモーターとは、細菌RNAポリメラーゼに結合し、ライブラリータンパク質をコードする配列のmRNAへの下流(3’)転写を開始させる能力のある任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、通常コード配列の5’末端近傍に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は典型的にはRNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースなどの糖代謝性酵素由来のプロモーター配列、およびトリプトファンなどの生合成酵素由来の配列がある。バクテリオファージからのプロモーターもまた使用され得、当業者には公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である;例えば、tac プロモーターは、trp および lac プロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼと結合し、転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然産生プロモーターを包含できる。
【0222】
機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位が望ましい。大腸菌の場合、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ(SD)配列と呼ばれ、開始コドンおよび開始コドン上流3−11ヌクレオチドに位置する3−9ヌクレオチド長の配列を含む。
【0223】
発現ベクターはまた、細菌中でライブラリータンパク質の分泌をもたらすシグナルペプチド配列も含み得る。シグナル配列は、典型的に、当業者に周知のように、細胞からのタンパク質分泌を指令する、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、成長培地(グラム陽性菌)または細胞の内膜と外膜との間にある周辺腔(グラム陰性菌)のいずれかに分泌される。
【0224】
細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子も含み得る。適当な選択遺伝子には、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を細菌に付与する遺伝子が含まれる。選択可能マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路にあるもののような生合成遺伝子を含む。
【0225】
これらの成分は発現ベクターに組立てる。細菌用の発現ベクターは当分野ではよく知られており、Bacillus subtilis、E. coli、Streptococcus cremoris およびStreptococcus lividans などのためのベクターが含まれる。
【0226】
細菌発現ベクターは、当業界で周知の技術、例えば塩化カルシウム処理、エレクトロポーレーションなどを使用して細菌宿主細胞に形質転換される。
【0227】
ある実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質は昆虫細胞で産生される。昆虫細胞形質転換用の発現ベクターおよび特にバキュロウイルスベースの発現ベクターは、当業界でも周知であり、例えば O’Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual(New York: Oxford University Press, 1994 に記載されている。
【0228】
好ましい態様において、候補変異体ライブラリータンパク質は酵母細胞で産生される。酵母発現系は当業界では周知であり、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans および C. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis および K. lactis、Pichia guillerimondii および P. pastoris、Schizosaccharomyces pombe および Yarrowia lipolytica 用の発現ベクターが含まれる。酵母における発現に好ましいプロモーター配列には、誘導可能GAL1,10プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼおよび酸性ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターが含まれる。酵母の選択可能マーカーには、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1およびツニカマイシンに対する耐性を与えるALG7、G418に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および銅イオンの存在下で酵母を成長させるCUP1遺伝子が含まれる。
【0229】
本発明の候補変異体ライブラリータンパク質は、当分野で周知の技法を使用して、融合タンパク質としても作成し得る。従って、例えば、モノクローナル抗体の創出のために、所望のエピトープが小さいならば、ライブラリータンパク質を担体タンパク質と融合させて免疫原を形成し得る。あるいは、ライブラリータンパク質は、発現を増加させるため、または他の理由のために融合タンパク質として作成し得る。例えば、ライブラリータンパク質がライブラリーペプチドである場合には、ペプチドをコードする核酸は発現目的のために他の核酸と結合させてもよい。同様に、細胞の細胞内または細胞外区画へのライブラリー構成員の局在化を可能にする標的配列、ライブラリータンパク質またはそれらをコードする核酸のいずれかの精製または単離を可能にするレスキュー配列または精製タグ;ライブラリータンパク質またはライブラリータンパク質をコードする核酸に安定性または分解からの保護(例えばタンパク質加水分解への耐性)を与える安定配列、またはこれらの組合せ、並びに必要であればリンカー配列などの他の融合パートナーも使用できる。
【0230】
このように、適当な標的配列には、限定されるものではないが、発現産物の生物学的活性を保持しながら、発現産物を予じめ決定した分子または分子クラスと結合させる能力のある結合配列(例えば、酵素阻害剤または基質配列を使用して関連する酵素クラスを標的化する);それ自体またはともに結合しているタンパク質の選択的分解のシグナルを与える配列;および、候補発現産物を、a)ゴルジ体、小胞体、核、仁、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム、および細胞膜などの細胞内位置、および、b)分泌シグナルを介する細胞外の位置を含む、予め決定された細胞の位置へ構成的に局在化させる能力のあるシグナル配列が挙げられる。細胞内への局在化または分泌を介する細胞外への局在化のいずれかが特に好ましい。
【0231】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリー構成員はレスキュー配列を含む。レスキュー配列は、候補物質またはそれをコードする核酸のいずれかを精製または単離するために使用し得る配列である。従って、例えば、ペプチドレスキュー配列には、例えば、Ni親和性カラムと共に使用するためのHis6タグ、および検出、免疫沈降またはFACS(蛍光活性化細胞分別)のためのエピトープタグなどの精製配列が含まれる。適当なエピトープタグには、myc(市販の9E10抗体と共に使用する)、細菌酵素BirAのBSPビオチン化標的配列、fluタグ、lacZおよびGSTが含まれる。
【0232】
あるいは、レスキュー配列は、PCR、関連技法またはハイブリダイゼーションを介してレトロウイルスコンストラクトの迅速かつ容易な単離を可能にするプローブ標的部位として作用する独特のオリゴヌクレオチド配列であってもよい。
【0233】
好ましい実施態様では、融合パートナーは、ライブラリー構成員またはそれをコードする核酸に安定性を付与する安定配列である。従って、例えば、Varahavsky のN−末端則に従い、ユビキチン化されるペプチドを保護するために、開始メチオニンの後にグリシンを組み込むこと(MGまたはMGG0)によりペプチドを安定化し、このようにして細胞質中での長い半減期を付与し得る。同様に、C末端の2個のプロリンは、カルボキシペプチダーゼの作用に対して十分に耐性のあるペプチドをもたらす。プロリンの前に2個のグリシンが存在することは、可変性と防護構造の両方を付与し、ジ−プロリン中の事象を候補ペプチド構造中伝播させる。従って、好ましい安定配列は次の通りである:MG(X)nGGPP、但し、Xは任意のアミノ酸であり、nは少なくとも4の整数である。
【0234】
ある実施態様では、本発明の候補変異体ライブラリー核酸、タンパク質および抗体を標識化する。本明細書において「標識化」とは、本発明の核酸、タンパク質および抗体が、本発明の核酸、タンパク質および抗体の検出を可能にするために取付けられた少なくとも1つの成分、同位元素または化学的化合物を有することを意味する。一般に、標識は3分類、即ちa)放射性または重同位元素であり得る同位元素標識;b)抗体または抗原であり得る免疫標識;およびc)着色または蛍光染料、に分類される。標識は任意の位置で化合物に組込まれ得る。
【0235】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質を、発現後に精製または単離する。ライブラリータンパク質は、サンプル中にどのような他の成分が存在するかによって、当業者には公知の様々な方法で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、電気泳動、分子、免疫学的方法並びにイオン交換、疎水性、アフィニティー並びに逆相HPLCクロマトグラフィーを含むクロマログラフィー技法およびクロマトフォーカシング(chromatofocusing)が含まれる。例えば、ライブラリータンパク質は、標準的な抗ライブラリー抗体カラムを使用して精製し得る。タンパク質濃度との関連で限外濾過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。適当な精製技法の一般的ガイダンスについては、Scopes,R., Protein Purification, Springer−Verlag, NY(1982)を参照のこと。必要な精製度は、ライブラリータンパク質の用途により異なる。精製が必要ではない場合もある。
【0236】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質を、発現後に精製または単離する。変異タンパク質は、サンプル中にどのような他の成分が存在するかによって、当業者には公知の様々な方法で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、電気泳動、分子、免疫学的方法並びにイオン交換、疎水性、アフィニティー並びに逆相HPLCクロマトグラフィーを含むクロマログラフィー技法およびクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、変異タンパク質は、標準的な抗ライブラリー抗体カラムを使用して精製し得る。タンパク質濃度との関連で限外濾過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。適当な精製技法の一般的ガイダンスについては、Scopes,R., Protein Purification, Springer−Verlag, NY(1982)を参照のこと。必要な精製度は、変異タンパク質の用途により異なる。精製が必要ではない場合もある。
【0237】
一旦発現させ、必要であれば精製した候補変異体ライブラリータンパク質および核酸は、免疫原性の改変について試験できる。適切な方法には、MHCペプチド複合体のTCRへの結合の測定、MHC/ペプチド相互作用の測定(Sidney, J., et al., In Current Protocols in Immunology (1998) 18.3.1−18.3.19)、ヒトMHC分子を発現するトランスジェニックマウスにおける、可能性のあるT細胞エピトープの試験、内在性細胞の代りにヒト抗原提示細胞およびT細胞で再構成されたマウスにおける、可能性のあるT細胞エピトープの試験(WO 98/52976; WO 00/34317)、T細胞増殖およびCTLアッセイ(Hemmer, B., (1998) J. Immunol., 160:3631−3636)および「i−mune アッセイ」(Genecor; The Scientist, 15:14, (2001))が含まれる。
【0238】
一旦作成したら、本発明の候補変異タンパク質および核酸は、数々の応用に有用である。好ましい実施態様では、標的タンパク質よりも低免疫原性の候補変異タンパク質を、治療用タンパク質として使用する。例えば、臨床および前臨床治療研究により、外因性タンパク質は、放射性各種を捕獲するための人工受容体として、毒物として、またはプロドラッグ活性化のための触媒として、インビボで効果的であり得ることが示された(Meyer, DL., et al. (2001) Protein Science, 10:491−503)。免疫原性が減少した治療用タンパク質の他の用途には、急性心筋梗塞の血栓溶解治療が含まれる(Laroche, Y., et al., (2000) Blood, 96:1425−1432)。
【0239】
好ましい実施態様では、標的タンパク質よりも高免疫原性である候補変異タンパク質を、ワクチン並びに自己免疫疾患および癌に対する免疫治療剤の開発において使用する。例えば、MHCクラスIまたはクラスII分子に対する親和性が増加した線状アミノ酸配列エピトープの挿入により、免疫反応の誘導においてより効果的であるワクチンを作成できる(例えば、Sarobe, P., et al. (1998) J. Clin. Invest., 102:1239−1248; Thimme, R., et al. (2001) J. Virology, 75:3984−3987; Roberts, C., et al., (1996) Aids Research and Human Retroviruses, 12:593−610 を参照のこと)。他の実施態様では、ナイーブB細胞上の膜結合抗体と相互作用する構造的3次元エピトープをコードする配列の挿入により、免疫反応の誘導においてより効果的であるワクチンを作成する。
【0240】
好ましくは、ライム病、B型肝炎、C型肝炎、ポリオウイルスおよびHIVに対してワクチンを作成する。他の実施態様では、候補変異タンパク質は、癌細胞に対してより免疫原性である。
【0241】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質の治療的有効量を、処置を必要としている患者に投与する。本明細書における「治療的有効量」は、投与の目的である効果を生じる用量を意味する。正確な用量は処置目的により異なり、公知技法を使用して当業者は確認し得る。好ましい実施態様では、約5μg/kgの用量を使用し、静脈内、腹膜内または皮下に投与する。当分野で既知の通り、候補変異タンパク質分解、全身対局所送達、および新規プロテアーゼ合成速度、並びに年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤相互作用および病状の重篤度による調節が必要であり、当業者は常用の実験法で確認し得る。
【0242】
本発明のための「患者」は、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物、および生物を包含する。従って、本発明の方法は、ヒトの治療および獣医学的応用の両方に適用可能である。好ましい実施態様では、患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施態様では、患者はヒトである。
【0243】
本発明における用語「処置」は、治療処置並びに疾患または異常の予防または抑制手段を含む意味である。従って、例えば、疾患の発病に先立って候補変異タンパク質を成功裡に投与することは、疾患の「処置」に至る。他の例として、疾患の症状と闘うために、疾患の臨床的顕示の後に変異タンパク質を成功裡に投与することは、疾患の「処置」を含む。また、「処置」は、疾患を撲滅するために疾患の出現の後に変異タンパク質を投与することも包含する。あり得る臨床症状の減少とおそらく疾患の改善を伴って、発病後および臨床症状の進行の後に物質を成功裡に投与することは、疾患の「処置」を含む。
【0244】
「処置を必要としている」者には、既に疾患または異常を有する哺乳動物、並びに疾患または異常を有する傾向のある者が含まれ、その者において疾患または異常が防止されるべき者が含まれる。
【0245】
好ましくは滅菌水性溶液形態における、本発明の候補変異タンパク質の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内または眼内投与を含むがこれらに限定されない、様々な方法で行える。場合によっては、例えば、損傷や炎症などの処置において、候補変異タンパク質を溶液またはスプレーとして直接適用し得る。導入方法に応じて、医薬組成物を様々な方法で製剤化し得る。製剤中の治療的に活性な候補変異タンパク質の濃度は、約0.1ないし100重量%で変化し得る。別の好ましい実施態様では、候補変異タンパク質の濃度は0.003ないし1.0モル濃度の範囲内であり、体重キログラム当り0.03、0.05、0.1、0.2、および0.3ミリモルの用量が好ましい。
【0246】
本発明の医薬組成物は、患者への投与に適する形態の候補変異タンパク質を含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、酸および塩基の両付加塩類を包含することを意図している、医薬的に許容し得る塩として存在するような、水溶性形態である。「医薬的に許容し得る酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学上またはその他の点で不都合でないものであり、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸と形成する。「医薬的に許容し得る塩基付加塩」は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩類などから誘導されたものを含む。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩などである。医薬的に許容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩には、第1級、第2級および第3級アミン類、置換アミン類、例えば、天然産生の置換アミン類、環状アミン類および塩基性イオン交換樹脂、例えば、イロプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンの塩が含まれる。
【0247】
医薬組成物はまた、次の物質;即ち、血清アルブミンなどの担体タンパク質;NaOAcなどの緩衝液;微晶性セルロース、ラクトース、トウモロコシおよび他の澱粉類などの充填剤;結合剤;甘味料および他の着香剤;着色剤;およびポリエチレングリコールのうちの1種またはそれ以上を含み得る。添加物は当業界で周知であり、様々な製剤で使用される。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Goodman and Gilman を参照されたい。
【0248】
さらなる実施態様では、ミセル製剤に候補変異タンパク質を添加する;出典明示により全体を本明細書の一部とする米国特許番号第5,833,948号参照。 医薬組成物の組合せを投与し得る。さらに、組成物を他の治療剤と組合せて投与してもよい。
【0249】
本発明で提供されるある実施態様では、当分野で既知の方法を使用して、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を含むがこれらに限定されない、変異タンパク質に対する抗体を生成させる(出典明示により本明細書の一部とする、Soren, M., et al (1997) EP 0 752 886 を参照されたい)。好ましい実施態様では、これらの抗変異体抗体を、免疫治療に使用する。従って、免疫治療の方法が提供される。「免疫治療」は、自己タンパク質の産生を伴う自己免疫疾患の処置を意味する。特に、自己ワクチンを作成するために、自己タンパク質をT細胞エピトープに結合する。本発明での用途の自己タンパク質には、癌の処置用のTNFαおよびγ−インターフェロン、アレルギーの処置用のIGE、慢性炎症性疾患の処置用のTNFα、TNFβおよびインターロイキン1が含まれる。
【0250】
本発明で使用されるように、免疫治療は、受動的または能動的であり得る。本明細書で定義するように、受動的免疫治療は、抗体を受容者(患者)に受動的に輸送することである。能動的免疫化は、抗体および/またはT細胞反応を受容者(患者)の中で誘導することである。免疫反応の誘導は、T細胞エピトープおよび自己タンパク質を含む変異タンパク質抗原(これに対して抗体を生成させる)を受容者に与える結果であり得る。当業者に理解されるように、変異タンパク質抗原は、抗体を生成させることが望まれる変異ポリペプチドを受容者に注射するか、または変異TNFαタンパク質抗原を発現するための条件下で、変異タンパク質抗原を発現する能力のある、変異タンパク質をコードする核酸を、受容者に接触させるかして与えられる。
【0251】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質を治療剤として投与し、上記概説のように製剤できる。同様に、候補変異遺伝子(全長配列、部分配列の両方、または変異体コード領域の調節配列を含む)を、当分野で既知のように遺伝子治療応用において投与できる。当業者に理解されるように、これらの変異体遺伝子は、遺伝子治療(即ち、ゲノムへの組込み用)としてか、またはアンチセンス組成物としての、アンチセンス応用を含む。
【0252】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質をコードしている核酸も、遺伝子治療で使用し得る。遺伝治療への応用では、例えば欠陥遺伝子置換のために、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成させるために、遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子治療」には、単回の処置により持続的効果を達成させる従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNAまたはmRNAの単回または反復した投与を含む、遺伝子治療剤の投与との両方が含まれる。アンチセンスRNAおよびDNAを、インビボである種の遺伝子の発現を阻止する治療剤として使用できる。細胞膜による取り込みが制限されることにより細胞内濃度が低いにもかかわらず、短いアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に導入され、そこで阻害物質として作用することが既に示されている(Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143−4146 [1986])。例えば、取込みを増強するために、負荷電のホスホジエステル基を非荷電基で置換することにより、オリゴヌクレオチドを変更できる。
【0253】
生存細胞内に核酸を導入するには様々なの技法が利用できる。技法は、核酸がインビトロで培養細胞内に移入されるのか、またはインビボで意図する宿主の細胞内に移入されるのかによって変わる。インビトロで哺乳動物細胞内に核酸を移入するのに適する技法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、等の使用が含まれる。現今好適とされているインビボ遺伝子移入技法には、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターを用いるトランスフェクション、およびウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介トランスフェクションが含まれる(Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205−210 [1993])。ある状況では、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体や標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどの標的細胞を標的とする物質を有する核酸ソースを供給するのが望ましい。リポソームを採用した場合は、エンドサイトーシスに伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を標的化および/または取込み促進のために使用し得る。例えば特定の細胞型に親和性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリング中に内在化を経るタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的化し、細胞内半減期を強化するタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技法は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262,4429−2232 (1987): および Wagnernet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410−3414(1990) に記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールを概観するには、Andersen et al., Science 256, 808−813 (1992)を参照されたい。
【0254】
好ましい実施態様では、候補変異遺伝子を、DNAワクチンとして投与する。単一の遺伝子または候補変異遺伝子の組合せのどちらかである。むき出しのDNAワクチンは、当分野で一般的に知られている;Brower, Nature Biotechnology 16:1304−1305 (1998)。DNAワクチンとして遺伝子を使用する方法は、当業者に周知であり、候補変異遺伝子または変異遺伝子の部分を、処置を必要としている患者中での発現用のプロモーターの制御下に置くことを含む。DNAワクチンに使われる変異遺伝子は、変異タンパク質全長をコードできるが、より好ましくは、変異タンパク質から生じたペプチドを含む、変異タンパク質の部分をコードする。好ましい実施態様では、患者は、変異遺伝子から生じた多数のヌクレオチド配列を含むDNAワクチンで免疫される。同様に、本明細書で定義するように、多数の変異遺伝子またはその部分で、患者を免疫することが可能である。理論によって制限を受けないが、DNAワクチンにコードされるポリペプチドの発現に続いて、TNFαタンパク質を発現している細胞を認識し破壊または除去する細胞障害性T細胞、ヘルパーT細胞および抗体が誘導される。
【0255】
好ましい実施態様では、DNAワクチンは、DNAワクチンと共にアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。そのようなアジュバント分子には、DNAワクチンにコードされる変異ポリペプチドへの免疫反応を上昇させるサイトカインが含まれる。追加または代用のアジュバントは、当業者に周知であり、本発明で有用である。
【0256】
本明細書で引用した全参照文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図1】全長遺伝子の合成およびPCRによる可能な全変異導入を描く。
【図2】本発明のライブラリーを合成するための、好ましいスキームを示す。
【図3】重複伸張法を示す。
【図4】本発明のライブラリーを合成するための、PCR反応生成物のライゲーションを示す。
【図5】PCR産物の平滑末端ライゲーションを描く。
本願は2000年7月10日に出願されたU.S.S.N.60/217,661の優先日の利益を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、宿主生物中で免疫反応を誘起する可能性が高いアミノ酸配列を同定し、そして改変することにより、タンパク質の免疫原性を調節するための、様々なコンピューター処理方法の使用に関するものである。特に、タンパク質を、MHC、T細胞受容体およびB細胞受容体結合配列についてスクリーニングする。
【0003】
発明の背景
外来のものと「自己」のものとの間の区別は、免疫監視の中で主要な重要点である。ウイルスや細菌などの外来性病原体由来タンパク質の同定は、獲得免疫において重大な段階である。同様の認識過程は、移植臓器拒絶中に、自己免疫疾患において生じ、そしてヒトにおいて外因性タンパク質または他の高分子を繰返しまたは継続して全身的に使用するときにも起こり得る。
【0004】
獲得免疫には2つの主要な武器がある:体液性免疫と細胞性免疫である。免疫グロブリンは、体液性免疫反応の最重要物である。Bリンパ球上の細胞表面受容体として、免疫グロブリンは、活性化、分化およびプログラムされた細胞死など多岐にわたる細胞反応の誘発を担う。抗体として分泌されると、免疫グロブリンは、外来抗原に結合し、それを直接中和するか、または補体もしくは単球性食細胞による抗体依存性細胞溶解などのエフェクター系を武装させ、徴集するのに必要な段階を開始させられる(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 3, pp 37−74)。
【0005】
T細胞は細胞性免疫を担う。T細胞は、標的細胞を直接的に殺すこと、そのようなキラーに補助を与えること、他の免疫系の細胞(即ち、マクロファージ)を活性化すること、B細胞が抗体反応を起こすのを補助すること、各種免疫系細胞の活性を下方調節すること、そしてサイトカイン、ケモカイン、および他の調整因子を分泌することが知られている。これらの活性は、性質の異なるタイプのTサイトカイン、ケモカイン、および他の調整因子によってしばしば媒介される。これらの活性は、α:βT細胞、1型および2型ヘルパー細胞などの性質の異なるタイプのT細胞によって、しばしば媒介される。T細胞の活性化は、その表面に並ぶ受容体(即ち、T細胞受容体またはTCR)を介して、T細胞が特定の抗原を認識するときに起こる。α:βT細胞(即ち、CD8+かつCD4+T細胞)は、主要組織適合性複合体(MHC)内にコードされる分子の1つと共同してのみ、そしてそれが適切な対立遺伝子変異体である場合にのみ、抗原を認識する。この現象はMHC拘束と呼ばれる(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 11, pp 367−409)。
【0006】
主要組織適合性複合体(MHC)分子は、外来タンパク質由来のポリペプチド断片(抗原)に結合し、これらのペプチドをT細胞表面の受容体に提示して免疫反応に至ることによって、認識過程において中心的な役割を演じる。MHC分子は、2種の別個の分子機能を満たすことにより、免疫反応におけるその主要な役割を達成する:ペプチドの結合、および通常α:βT細胞受容体(TCR)を介するT細胞との相互作用である。MHC IまたはMHC II分子によるペプチドの結合は、MHC分子を発現している細胞(抗原提示細胞、APC)が、それ自身のタンパク質(MCH I)または付近の細胞外環境から摂取したタンパク質(MCH II)のいずれかのサンプルになることを可能にする選択的事象である(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 8, pp 263−285)。
【0007】
ある細胞上のTCRと別の細胞上の相補的ペプチド−MHC複合体との間の相互作用は、T細胞および抗原提示細胞の個性によって決まる細胞内シグナルのカスケードを引き起こす。最終的に、TCR−ペプチド−MHC認識は、移植片および腫瘍拒絶、抗ウイルス細胞溶解、および抗体産生B細胞などの他の免疫細胞の徴集と制御を含む、免疫反応を調節する(Madden, D.R., (1995) Annu. Rev. Immunol., 13:587−622)。
【0008】
MHC分子は高度に多形であり、種々のヒトの集団中で対立遺伝子変異を示す(Buus、前出)。何百ものMHCクラスIおよびII対立遺伝子が既知であり、各々が特定の抗原ペプチド配列に対して異なる結合親和性を示す。この対立遺伝子依存性ペプチド選択性のための構造的偏重は、MHCペプチド結合ポケット内のアミノ酸残基における差異に集中している(Buus、前出)。特定の抗原ペプチドに結合したMHCクラスIおよびII分子のX線結晶構造は、NおよびC末端(即ち、アンカー位置)のペプチド残基がMHCクラスI結合ポケットと間近な物理的接触にあり、一方クラスIIに結合するペプチドは、MHCクラスIIポケットとの接触を形成している付加的ペプチド残基によりさらに延長されていること、を明らかにしている(Buus、前出)。
【0009】
MHC分子から抽出されるペプチドの詳細な配列分析により、いくつかの対立遺伝子特異的アミノ酸選択性が解明された(Buus、前出)。MHC分子に結合すると知られている何千ものペプチド配列からなるデータベースが編集され(Rammensee, H., et al. (1999) Immunogenetics, 50:213−219)、そして全長タンパク質配列を分析し、可能性のある抗原配列の存在を予測するためのいくつかの技法が開発された(Hiemstra, H.S. et al. (2000) Curr. Op. Immunol., 12:80−84; Malios, R.R., (1999) Bioinformatics, 15:432−439; Sturniolo, T., et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, 14:121−130; Mallios, R.R., (1998) J. Comp. Biol., 5:703−711; Savoie, C.J. et al. (1999) Pac Symp Biocomput, 182−9; Altuvia, Y., et al. (1997) Human Immunology, 58:1−11; Shastri, N. (1996) Curr. Op. Immunol., 8:271−277; Hammer, J. (1995) Curr. Op. Immunol., 7:263−269; Meister, G.E., et al. (1995) Vaccine, 13:581−591; Udaka, K., et al. (1995) J. Exp. Med., 181:20972108; Hammer, J. et al. (1994) Behring. Inst. Mitt. 94:124−132; Hammer, J., et al. (1994) J. Exp. Med., 180: 2353−2358; および Rudenshky, A. Y., et al. (1991) Nature, 353:622−627)。包括的なペプチド結合親和性は配列およびMHC対立遺伝子特異的であるが、各ペプチド残基の寄与は隣接残基の個性から独立しており、そして個々に総計され得る(Altuvia, et al., 前出)。アンカー残基の存在およびMHCクラスI結合ペプチドの長さは、MHCクラスII分子よりもMHCクラスI分子に対して良好な予測モデルを導く(Abrams and Schlom, (2000) Curr. Op. Immunol., 12:85−91)。
【0010】
抗原ペプチドのいずれの残基がTCRにより結合されるのかは、あまり明確ではないが、側鎖置換実験により、数々のペプチド−MHC複合体上のTCR結合部位の概略がマッピングされてきた。典型的に、異なるTCRは異なるが重複するMHCおよびペプチド側鎖のサブセットと接触することが見出された。TCR「足跡」は、結合したペプチドの中心に置かれ、ペプチド結合溝を形成する両αヘリックスの最上部にあるMHC側鎖を含む。ペプチド表面の大部分が埋没しているにも関わらず、結合したペプチドは、明らかに、顕著にTCR認識に寄与する。より最近の結果は、ペプチド配列中の各アミノ酸が独立してMHC−ペプチド−TCR複合体の親和性に寄与することを示唆している (Hemmer, B., et al., (1998), J. Immunol., 160:3631−3636)。
【0011】
体液性免疫の重要な構成要素は、Bリンパ球が産生する広範なレパートリーの抗体(即ち、免疫グロブリン)である。特異的B細胞との抗原接触は、B細胞抗原受容体(BCR)の膜貫通シグナル伝達機能を引き起こす。これが、今度は、MHCクラスII分子発現の増加および抗体分泌細胞の形成を含む、B細胞活性化における初期事象を誘導する。
【0012】
ポリペプチドの免疫原性の減少は、合理的(rational)部位特異的突然変異導入(Meyer, et al., (2001) Protein Science 10:491−503)、網羅的(exhaustive)部位特異的突然変異導入(Laroche, et al., (2000) Blood, 96:1425−1432; WO00/34317;WO98/52976)およびポリエチレングリコール誘導体の直接的化学カップリング(Tsutsumi, et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8548−8553)により達成されてきた。しかしながら、これらの方法は、特に多数の変異を同時に考慮すると、極度に時間を消費する。表面残基の合理的選択により免疫原性の減少を導けるが、いくつかの残基の置換は、不安定化し、折畳みを不十分にし得る。加えて、溶媒に露出する荷電残基の除去は、エネルギー的に不都合であり得る。
【0013】
これらの問題を克服する方法の1つは、コンピューター処理方法を使用して、標的タンパク質と比べて免疫原性が高いか、または低いが、適切な折畳みと活性を確保するための構造的特性を保持している配列を設計することである。
【0014】
従って、可能性のあるMHC、TCR、またはBCR結合ペプチドをスクリーニングするためのコンピューター処理方法の使用が、本発明の目的である。配列の生成および評価のための、幅広い各種の方法が既知である。これらには、配列プロファイリング (Bowie and Eisenberg, Science 253(5016): 164−70, (1991))、回転異性体ライブラリー選択法(Dahiyat and Mayo, Protein Sci 5(5): 895−903 (1996); Dahiyat and Mayo, Science 278(5335): 82−7 (1997); Desjarlais and Handel, Protein Science 4: 2006−2018 (1995); Harbury et al, PNAS USA 92(18): 8408−8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19: 244−255 (1994); Hellinga and Richards, PNAS USA 91: 5803−5807 (1994));および残基対ポテンシャル (Jones, Protein Science 3: 567−574, (1994))が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0015】
特に、U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926およびPCT US98/07254は、配列安定性を評価するための数々のスコア付け関数を利用する「タンパク質設計オートメーション」またはPDAと称する方法を記載している。
【0016】
さらに、免疫原性の改変のために作成および評価できるタンパク質配列の小型ライブラリーを選択するために、配列ライブラリーのスクリーニング用のコンピューター処理方法を提供することが、本発明の目的である。
【0017】
発明の概要
上記概説した目的に従って、本発明は、標的タンパク質の免疫原性の調節方法を提供する。その方法は、可変残基位置と共にタンパク質主鎖構造をコンピューターに入力する段階、コンピューター処理で一次変異配列のセットを生成させる段階、そしてコンピューター処理の免疫原性フィルターを一次変異配列のセットに対して適用し、少なくとも1つの候補変異タンパク質を同定する段階を含む。次いで候補タンパク質を作成し、標的タンパク質と比較して候補タンパク質の免疫原性が改変されたか否かを判定するために試験する。
【0018】
本方法は、各可変残基位置を、コア、表面または境界残基のいずれかに分類することをさらに含む。コンピューター処理で生成させる段階は、行き止まり排除法(Dead−End−Elimination:DEE)コンピューター計算またはモンテカルロ検索を含み得る。一般に、一次変異配列は、ファンデルワールスポテンシャルスコア付け関数、水素結合ポテンシャルスコア付け関数、原子溶媒和スコア付け関数、二次構造傾向スコア付け関数および静電気スコア付け関数からなる群から選択される少なくとも1種のスコア付け関数に最適化される。
【0019】
さらなる態様では、標的タンパク質は非ヒト種由来であり、候補変異タンパク質は、ヒトにおいてより低い免疫原性または非免疫原性を付与される。
【0020】
さらなる態様では、本発明は標的タンパク質の免疫原性の調節方法を提供する。その方法は、可変残基位置と共にタンパク質主鎖をコンピューターに入力する段階、コンピューター処理の免疫原性フィルターを適用し、少なくとも1つの変異タンパク質を同定する段階、適正な折畳みおよび安定性について該変異タンパク質をコンピューター処理で分析し、一次変異アミノ酸配列のセットを生成させる段階を含む。
【0021】
図面の簡単な説明
図1は、全長遺伝子の合成およびPCRによる可能な全変異導入を描く。全長遺伝子(黒い棒線、段階1)に対応する重複オリゴヌクレオチドを合成し、加熱し、アニーリングする。アニーリングしたオリゴヌクレオチドにPfu DNAポリメラーゼを添加することにより、DNAの5’→3’合成に至り(段階2)、さらに長いDNA断片を産生する(段階3)。加熱、アニーリングの反復周期(段階4)により、いくつかの全長分子を含む、さらに長いDNAが産生される結果となる。これらは、全長遺伝子の末端に対応するプライマー(矢印)を用いて第2ラウンドのPCRにより選択できる(段階5)。
【0022】
図2は、本発明のライブラリーを合成するための、好ましいスキームを示す。野生型遺伝子、または大域的極小(global minimum)遺伝子のための遺伝子などの、いかなる出発遺伝子も使用できる。様々な変異部位で様々なアミノ酸を含むオリゴヌクレオチドを、標準的なプライマーを使用するPCRにおいて使用できる。これは、一般的に、要するオリゴヌクレオチドはより少なく、そして結果としてエラーがより少なくなる。
【0023】
図3は、重複伸張法を示す。図3の最上段は、変異させる領域(黒色のボックス)の場所と、関連するプライマー(矢印)の結合部位を示した鋳型DNAである。プライマーR1とR2は、プライマーのプールを表し、各々が異なる変異を含む;ここで記載したように、これは、所望により様々な比率のプライマーを使用して行い得る。変異部位は、ハイブリダイゼーションを行うのに十分な相同性がある領域に隣接する。この例では、3つの別個のPCR反応が段階1で行われる。第1の反応は、鋳型に加えてオリゴF1とR1を含む。第2の反応は、鋳型に加えてF2とR2を含み、第3の反応は、鋳型に加えてF3とR3を含む。反応生成物を示す。段階2では、段階1のチューブ1と、段階1のチューブ2の生成物を用いる。精製してプライマーを除いた後、これらをF1とR4と共に、新しいPCR反応に添加する。PCRの変性段階の間に、重複領域がアニーリングし、第2鎖が合成される。次いで、生成物を外側のプライマーにより増幅する。段階3では、精製した段階2の生成物を、段階1のチューブ3の生成物およびプライマーF1とR3と共に、第3のPCR反応に用いる。最終生成物は、全長遺伝子に相当し、求める変異を含む。
【0024】
図4は、本発明のライブラリーを合成するための、PCR反応生成物のライゲーションを示す。この技法では、プライマーは、平滑末端、5’オーバーハング末端、または3’オーバーハング末端のいずれかのエンドヌクレアーゼ制限部位(RE)も含む。我々は、段階1に、3つの別個のPCR反応をセットアップした。第1の反応は、鋳型に加えてオリゴF1とR1を含む。第2の反応は、鋳型に加えてF2とR2を含み、第3の反応は、鋳型に加えてF3とR3を含む。反応生成物を示す。段階2では、段階1の生成物を精製し、次に適切な制限エンドヌクレアーゼで切断する。段階2のチューブ1および段階2のチューブ2由来の切断生成物を共にDNAリガーゼでライゲーションする。次いで、段階4では、プライマーF1とR4を用いて生成物を増幅する。増幅された生成物を切断し、それらを段階2のチューブ3の切断生成物にライゲーションし、そして最終生成物をプライマーF1とR3で増幅することにより、全プロセスを繰り返す。2つの制限酵素部位(RETとRE2)が異なれば、段階1の3つの全PCR産物を、1反応でライゲーションすることも可能である。
【0025】
図5は、PCR産物の平滑末端ライゲーションを描く。この技法では、F1とR1のようなプライマーは重複しないが隣接する。再び3つの別個のPCR反応を実施する。チューブ1とチューブ2の生成物をライゲーションし、外側のプライマーF1とR4で増幅する。次いで、この生成物を、段階1のチューブ3の生成物とライゲーションする。次いで、最終生成物をプライマーF1とR3で増幅する。
【0026】
発明の詳細な説明
本発明は、改変された免疫原性を有するタンパク質配列の小型ライブラリー(1013以下の構成員を含み得る)を選択するための、タンパク質配列ライブラリー(1080以下またはそれ以上の構成員を含み得る)のコンピューター処理スクリーニングの使用方法を対象としている。例えば、免疫原性が減少したタンパク質を所望するならば、免疫反応を誘起すると知られている残基を同定し、タンパク質の天然の折畳みと安定性を維持する補償の残基と置換するために、コンピューター処理のフィルターを使用でき、その結果、非免疫原性であるか、または開始タンパク質よりも低免疫原性であるタンパク質が生じる。
【0027】
あるいは、免疫原性が増加したタンパク質を設計することが所望であり得る。この場合、残基を変更して抗原モチーフを導入し、生じるタンパク質の適正な折畳みと安定性を確保するために、コンピューター処理のフィルターを適用できる。
【0028】
一般に、このことは2つの一般的方法のうちの1つで成し得る。第1の実施態様では、コンピューター処理による加工を、安定性などの特性が改変された変異タンパク質のリストを生成させるために使用する。次いで、コンピューター処理のフィルターを、免疫原性が改変された傾向が強い変異体を選択するために適用する。
【0029】
あるいは、免疫原性を改変された傾向のある変異体のリストを生成させるためにコンピューター処理のフィルターを最初に適用し、次いで折畳まれているか、または安定であると考えられる変異体を選択するために、コンピューター処理による加工を行う。
【0030】
特に、MHCクラスIおよびクラスII分子、T細胞およびB細胞に結合する可能性のあるペプチド断片またはアミノ酸残基をスクリーニングするために、コンピューター処理のフィルターを使用する。例えば、MHCリガンドとペプチドモチーフのデータベースを検索し、可能性のあるMHCクラスIまたはクラスII結合配列を同定するために、使用できる(Rammensee, H., et al. (1999) Immunogenetics, 50:213−219)。次いで、MHC分子への結合に関連するアミノ酸残基を、構造的、化学的に補償するために、コンピューター処理方法を使用する。例えば、標的タンパク質よりも免疫原性が低い変異タンパク質が望ましいならば、免疫反応を誘起すると予測されるペプチド配列またはアミノ酸残基を同定し、これらの残基を非免疫原性と予測される残基で置換し、次いで生じた配列から、適正に折畳まれ、かつ安定である配列をスクリーニングするために、コンピューター処理方法を使用できる。
【0031】
抗体結合表面残基の適切な置換を判定するための法則が明らかになっている (Meyer, D.L., et al. (2001) Protein Science, 10:491−503; Laroche, Y., (2000) Blood, 96:1425−1432; and Schwartz, H.L., (1999) J. Mol. Biol., 287:983−999 参照)。例えば、芳香族の表面残基は、抗原抗体結合に関与する。チロシンなどの芳香族の表面残基を、セリン、アラニンまたはグリシンなどの小型残基で置換することができる。同様に、荷電側鎖の大型パッチを、セリンまたはアラニンなどの小型親水性残基で置換できる。次いで、天然の折畳みおよび安定性の維持を補償する配列変化を決定するために、コンピューター処理方法を適用できる。
【0032】
標的タンパク質の免疫原性を増加させることが望ましい状況もある。例えば、特定のエピトープに対するT細胞集団の活性化は、ウイルス性病原体または腫瘍形成を制御または排除するのに密接な関係を有する。この場合、固定度が低く、構造的な制限が少ない標的タンパク質のループ領域にT細胞エピトープを導入するために、コンピューター処理方法を使用できる。その際、エピトープ挿入に隣接する残基を変更するために、コンピューター処理方法を使用し、天然のタンパク質と移植したエピトープとの間のエネルギー的適合性を確保する。
【0033】
従って、本発明は、標的タンパク質の免疫原性の調節方法を提供する。本明細書における「調節」は、標的タンパク質に対する免疫反応が改変されることを意味する。つまり、標的タンパク質が所定の種で免疫反応を誘引するならば、免疫反応が減少するか、または増強されるように、標的タンパク質のアミノ酸配列を変化させる。本明細書における「減少」は、野生型タンパク質と比較して少なくとも1つの免疫学的反応が低減することを意味する。本明細書における「増強」は、野生型タンパク質と比較して少なくとも1つの免疫学的反応が増加することを意味する。当業者に認識されるように、反応を誘引する能力がある全同定配列を改変する必要があるわけではない。例えば、一般に免疫反応は、免疫グロブリンおよび他の血清タンパク質などの、自己由来循環タンパク質に対しては起こらない。従って、反応を誘起する能力のある配列の少なくとも5%を改変する。好ましくは少なくとも10%の配列を改変し、少なくとも15%の配列を改変するのがより好ましく、少なくとも20%の配列を改変するのがさらにより好ましく、少なくとも30%の配列を改変するのがさらにより好ましく、少なくとも40%の配列を改変するのがさらにより好ましく、少なくとも50%の配列を改変するのがより好ましく、100%の配列を改変するのが最も好ましい。
【0034】
改変された免疫原性は、特定の宿主生物内で定義されることに留意すべきである。つまり、好ましい実施態様では、標的タンパク質(下記定義の通り)は、改変された免疫原性をヒト内で示すために改変される。これに代る宿主生物には、げっ歯類(ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど)、霊長類、家畜動物(ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなど)、および家内動物(ネコ、イヌ、ウサギなど)が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【0035】
本明細書における「免疫原性」は、免疫反応を誘起するタンパク質の能力を表す。免疫反応を誘起するタンパク質の能力は、タンパク質内のアミノ酸配列または配列類に依存する。免疫反応を誘起する能力があるアミノ酸配列は、本明細書で「免疫原性配列」と表す。好ましくは、免疫原性配列は、下記概説のように「MHC結合部位」、「T細胞エピトープ」および「B細胞エピトープ」を含む。
【0036】
本明細書で定義するように、免疫原性の定義は、用語「抗原性」を包含するに十分なほど広範である。「抗原性」は、非自己分子と認識されるとタンパク質が単独で抗体反応を誘起する能力を表す。
【0037】
免疫原性配列を有するタンパク質によって誘起された反応には、免疫系の両構成要素が含まれる:体液性免疫と細胞性免疫である。従って、本発明の文脈における「免疫反応」は、体液性または細胞性免疫反応のいかなる構成要素をも含む。概説すると、免疫原性配列を有するタンパク質をヒトに投与すると、そのタンパク質は免疫系の体液性と細胞性の両武器の監視下におかれる。タンパク質が外来性と認識され、かつ免疫系がまだそのタンパク質内の免疫原性配列に対して寛容でない場合、免疫系はそのタンパク質に対して反応する。体液性免疫反応では、表面に免疫グロブリン(Ig)を表示している未成熟B細胞は、個々の免疫グロブリンに適合する親和性があり、かつIgがB細胞エピトープに接近できるようにB細胞エピトープが露出している場合、タンパク質内の1つまたはそれ以上の配列(B細胞エピトープ)に結合できる。タンパク質へのIg結合の過程は、好適なサイトカインの存在下で、B細胞が分化分裂するように刺激して、タンパク質と複合体を形成できる可溶性形態の原型Igを提供し、個体からのタンパク質の除去を促進できる。
【0038】
効果的なB細胞反応は、可溶性抗体を生じるのに必要なサイトカインおよび他のシグナルを与えるために、平行してT細胞反応も含む。効果的なT細胞反応には、抗原提示細胞(APC)によるタンパク質またはその断片の取込みが必要である;APCには、B細胞、またはマクロファージ、樹状細胞および他の単球などの他の細胞が含まれる。次いでAPCはMHCクラスII分子と複合体を形成したタンパク質を細胞表面に提示する。そのようなペプチド−MHC II複合体は、T細胞受容体を介してヘルパーT細胞によって認識されることができ、そしてこのことは、抗体産生細胞への分化においてB細胞に補助を与える、T細胞刺激およびサイトカインの分泌に至る。上記議論から分かるように、免疫原性タンパク質に対する効果的な一次免疫反応には、一般に、BおよびT細胞特異的配列またはエピトープに対するBおよびT細胞反応の組合せが必要である。
【0039】
あるいは、免疫原性配列がMHCクラスI分子に特異的である場合、MHC I抗原加工/提示経路が関わる。MHCクラスI分子は、感染病原体由来タンパク質または「自己」分子の断片を集め、次いでAPCの表面にこれらの断片を表示する。結合したペプチドは細胞傷害性Tリンパ球のTCRに認識され、細胞性免疫反応の一次抗原決定基である。従って、免疫原性の調節には、T細胞反応を刺激するペプチド、即ちT細胞エピトープを同定すること、そのタンパク質への細胞性反応が減少または増強されるようにそれらのペプチドの配列を変化させること、が含まれる。加えて、免疫原性の調節には、B細胞反応を刺激するペプチド、即ち「B細胞エピトープ」または「BCR」を同定すること、そのタンパク質への体液性の反応が改変されるようにこれらのペプチドの配列を変化させること、も含まれる。当業者に理解されるように、単一のタンパク質はTおよびB細胞エピトープの両方を含有し得るので、両方の調節により、免疫系の体液性と細胞性の両武器を改変し得る。
【0040】
好ましい実施態様では、MHC I反応を改変するように標的タンパク質を改変する。MHCクラスI分子は、感染しているウイルス、細胞内寄生生物、または正常に発現しているか、腫瘍形成により制御を逸脱した自己タンパク質に由来するタンパク質断片を集め、これらの分子の断片を細胞表面に表示する。細胞表面では、APC上に露出している、細胞に結合したMHC I−ペプチド複合体がT細胞に対して表示される。MHC I分子の第2の特徴は、特定のMHC−ペプチド複合体を有するAPCが適切なTCRと噛合うようにする、TCRとの相互作用能力である。このことは、標的としてのAPCの細胞溶解を導く細胞性のプログラム、および/またはT細胞によるリンホカインの分泌の活性化における第1段階である。TCRとの相互作用はペプチドとMHC分子の両方に依存する。MHCクラスI分子は、CD8+細胞に対する選択的制限を示す。MHCクラスI分子のさらなる機能は、ナチュラルキラー細胞へのシグナル伝達の要素として作用することである(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 8, pp 263−285)。
【0041】
好ましい実施態様では、MHC II反応を改変するように標的タンパク質を改変する。MHCクラスI分子と同様の分子メカニズムを活用して、MHCクラスII分子は、MHC IIを発現しているAPCにより摂取されたタンパク質の分解に由来するペプチドに結合し、特異的T細胞に認識されるようにそれらを細胞表面に表示する。MHC II抗原提示経路は、MHC IIαβヘテロダイマーの、二重機能分子、即ち、不変鎖(Ii)との最初の会合をベースとする。Iiは、αβヘテロダイマーが抗原ペプチドと出会うエンドソームの酸性のタンパク質加工場所へ、αβヘテロダイマーを導くシャペロンとして作用する。抗原ペプチドをMHC II分子にロードする(load)過程により、MHC IIペプチド複合体の細胞表面提示が導かれる。MHC IIを認識しているT細胞は、次いでリンホカインを分泌し、増殖するように誘導され得る。MHCクラスII分子は、CD4+細胞に選択的制限を示す(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 8, pp 263−285)。
【0042】
好ましい実施態様では、TCR反応を改変するように標的タンパク質を改変する。TCRは、2つの別個のヘテロダイマー、αβまたはγδとして生じ、これらの両者は非多型CD3ポリペプチドγ、δ、ε、ζと共に発現する。CD3ポリペプチド、特にζおよびその変異体は、細胞内シグナル伝達に非常に重要である。αβTCRヘテロダイマー発現細胞は、ほとんどのリンパ球区画で支配的であり、古典的なヘルパーまたは細胞傷害性T細胞反応を担う。ほとんどの場合、αβTCRリガンドは、クラスIまたはクラスII MHC分子に結合したペプチド抗原である(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapter 10, pp 341−367)。
【0043】
好ましい実施態様では、BCR反応を改変するように標的タンパク質を改変する。特異的B細胞との抗原の接触は、B細胞抗原受容体(BCR)の膜貫通シグナル伝達機能を引き起こす。BCR分子は、抗原結合後迅速に内在化し、抗原取込みおよびエンドソームまたはリソソームにおける分解を導く。タンパク質抗原の場合、抗原由来ペプチドは、クラスII MHC分子の溝の中で結合する。結合すると、この複合体は細胞表面に送達され、そこで特異的ヘルパーT細胞の刺激物質として作用する。ヘルパーT細胞による抗原認識は、ヘルパーT細胞が緊密かつ長期継続であるB細胞との相互作用を形成し、B細胞増殖および分化因子を合成するように誘導する。このようにして活性化されたB細胞は、増殖し、ついには抗体分泌細胞(プラズマ細胞とも呼ばれる)に分化する(Fundamental Immunology, fourth edition, W. E. Paul, ed., Lippincott−Raven Publishers, 1999, Chapters 6−7, pp 183−261)。
【0044】
従って、本発明は標的タンパク質の免疫原性の調節方法を対象としている。本明細書において「標的タンパク質」とは、共有結合した少なくとも2つのアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。該タンパク質は、天然産生のアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造、即ち、ペプトイド(peptoid)などの「類似体」(Simon et al., Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 89 (20):9367−71 (1992)参照)からなってもよく、一般に合成法に依存する。従って本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、天然産生のアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明のためのアミノ酸と考えられる。また「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基が含まれる。加えて、本発明の変異タンパク質の構成要素を表すいかなるアミノ酸も、同じアミノ酸であるが反対のキラリティーのもので置換できる。従って、L配置で天然に産生するいかなるアミノ酸(これらは化学物質の構造によって、RまたはSとも呼ばれる)も、同じ化学構造であるが反対のキラリティーのアミノ酸で置換できる。これは一般にDアミノ酸と呼ばれるが、その組成および化学配置によってさらにRまたはSと呼ばれる。そのような誘導体は、安定性が大幅に増加する特性を有し、従って経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、局所、直腸、眼内または他の経路で投与するときに、インビボでのハーフライフがより長い化合物の形成に有利である。
【0045】
好ましい実施態様では、該アミノ酸は(S)またはL配置である。非天然産生側鎖を用いる場合は、例えばインビボ分解の防止または遅延のために非アミノ酸置換基を用いてもよい。非天然産生アミノ酸を含むタンパク質は、合成してもよく、組換え的に作成する場合もある;van Hest et al., FEBS Lett 428:(1−2) 68−70 May 22 1998 and Tang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S218:U138−U138 Part 2 August 22, 1999 を参照のこと。両者を出典明示により本明細書の一部とする。
【0046】
芳香族アミノ酸は、D−またはL−ナフィル(naphyl)アラニン、D−またはL−フェニルグリシン、D−またはL−2−チエニルアラニン、D−またはL−1−,2−,3−または4−ピレニルアラニン、D−またはL−3−チエニルアラニン、D−またはL−(2−ピリジニル)−アラニン、D−またはL−(3−ピリジニル)−アラニン、D−またはL−(2−ピラジニル)−アラニン、D−またはL−(4−イソプロピル)−フェニルグリシン、D−(トリフルオロメチル)−フェニルグリシン、D−(トリフルオロメチル)−フェニルアラニン、D−p−フルオロフェニルアラニン、D−またはL−p−ビフェニルフェニルアラニン、D−またはL−p−メトキシビフェニルフェニルアラニン、D−またはL−2−インドール(アルキル)アラニン、およびD−またはL−アルキルアイニン(ainine)(ただしアルキルは置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、sec−イソチル(isotyl)、イソ−ペンチル、C1−C20の非酸性アミノ酸である)で置換してもよい。
【0047】
酸性アミノ酸は、非限定的な例として(ホスホノ)アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、または セリン;または硫酸化 (例えば、−SO3H) スレオニン、セリン、またはチロシンなどの、負電荷を維持している非カルボン酸アミノ酸およびそれらの誘導体または類似体で置換できる。
【0048】
他の置換には、任意の天然アミノ酸と「アルキル」を組合せて作成し得る非天然水酸化アミノ酸が含まれ得る。本明細書で使用する用語「アルキル」は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラシシルなどの、1ないし24個の炭素原子の分枝または非分枝飽和炭化水素基を意味する。アルキルには、窒素、酸素および硫黄原子を有するヘテロアルキルが含まれる。本発明で好ましいアルキル基は、1ないし12個の炭素原子を含有する。塩基性アミノ酸は、天然産生アミノ酸のリシン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、または(グアニジノ)−酢酸、または他の(グアニジノ)アルキル−酢酸(但し、「アルキル」は上記定義の通りである)の任意の位置でアルキル基で置換し得る。ニトリル誘導体(例えば、COOHの代りにCN部分を含有する)も、アスパラギンまたはグルタミンを置換し得、そしてメチオニンスルフォキシドはメチオニンを置換し得る。そのようなペプチド誘導体の調製方法は、当業者に周知である。
【0049】
加えて、任意の変異ポリペプチド中の任意のアミド結合を、ケトメチレン部分で置換することができる。そのような誘導体は、酵素による分解に対する安定性が増加している特性を有し、従って経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、局所、直腸、眼内または他の経路で投与するときに、インビボでのハーフライフがより長い化合物の形成に有利であると期待される。
【0050】
本発明の変異ポリペプチドのアミノ酸のさらなるアミノ酸修飾には、以下のものが含まれ得る:システイニル残基を2−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのアルファ−ハロ酢酸塩(および相応するアミン)と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−(5−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、p−クロロ水銀安息香酸塩、2−クロロ水銀−4−ニトロフェノール、またはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールなどの化合物との反応によっても誘導体化し得る。
【0051】
ヒスチジル残基は、ジエチルプロ炭酸塩(例えばpH5.5−7.0で、なぜならこの物質はヒスチジル側鎖に比較的特異的であるので)などの化合物との反応により誘導体化し得、パラ−ブロモフェナシル(bromophenacyl)臭化物も使用し得る;例えば、その場合、好ましくはpH6.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム中で反応を実施する。
【0052】
リシニルおよびアミノ末端残基は、スクシン酸または他のカルボン酸無水物と反応させ得る。これらの試薬による誘導は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有すると期待される。
【0053】
アルファ−アミノ含有残基を誘導するのに適する他の試薬には、イミドエステル/例えばメチルピコリンイミダート;ピリドキサルリン酸塩;ピリドキサール;クロロボロヒドリド;トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;2,4ペンタンジオンなどの化合物;およびグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、1または複数の従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応により、既知方法の段階に従って修飾し得る。アルギニン残基の誘導には、グアニジン官能基のpKaが高いために、反応をアルカリ性条件で実施することが必要である。さらに、これらの試薬は、アルギニンのイプシロン−アミノ基と同様に、リシンの基と反応させ得る。芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりスペクトル標識をチロシル残基に導入するためなどの、チロシル残基自体の特異的修飾は周知である。
【0054】
N−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、各々O−アセチルチロシル種および3−ニトロ誘導体を形成するために使用し得る。カルボキシル側鎖基(アスパルチルまたはグルタミル)は、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R’−N−C−N−R’)との反応により、選択的に修飾し得る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換し得る。
【0055】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に相応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は穏かな酸性条件下で脱アミド化し得る。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内にある。
【0056】
標的タンパク質は、3次元構造が既知であるかまたは生成できる、即ちタンパク質の各原子について3次元座標が存在する任意のタンパク質であり得る。一般的に、これは、X線結晶技法、NMR技法、新規モデリング、相同性モデリングなどを用いて測定できる。一般に、X線構造を使用する場合、2Å解像能またはそれより高解像能での構造が好ましいが、必ずしも必要なわけではない。
【0057】
本発明の標的タンパク質は、細菌(古細菌のような好極限性細菌を含む)、真菌、昆虫、魚類および哺乳動物などの原核生物および真核生物に由来し得る。適する哺乳動物には、げっ歯類(ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど)、霊長類、家畜動物(ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む)が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、最も好ましい実施態様では、ヒト由来である。
【0058】
即ち、本明細書では「標的タンパク質」は、好ましくは免疫原性が改変された変異体のライブラリーが望まれるタンパク質を意味する。当業者に理解されるように、いかなる数の標的タンパク質も本発明では有用である。具体的には、酵素ドメイン、結合ドメインなどの機能的ドメイン、およびターン、ループなどの小型フラグメントを含む、既知タンパク質のフラグメントおよびドメインは、「タンパク質」の定義内に含まれる。即ち、タンパク質の一部も同様に使用され得る。さらに、本明細書で使用する「タンパク質」は、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。さらに、タンパク質変異体、即ち非天然産生タンパク質類似体構造も使用され得る。
【0059】
適するタンパク質には、リガンド、細胞表面受容体、抗原、抗体、サイトカイン、ホルモン、転写因子、シグナルモジュール、細胞骨格タンパク質および酵素を含む、産業用、医薬用および農業用タンパク質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。適する種類の酵素には、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼなどの加水分解酵素、ラセマーゼ、エピメラーゼ、タウトメラーゼ、またはムターゼなどのイソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、オキシドリダクターゼおよびホスファターゼがあるが、これらに限定されるわけではない。適する酵素はスイス−プロット酵素データベースに列挙されている。適するタンパク質主鎖には、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB, 前身は the Brookhaven National Lab)により編集および提供されたタンパク質データベースに見出されるもの全てが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0060】
特に、好ましい医薬用標的タンパク質には、サイトカイン類(IL−1ra(+受容体複合体)、IL−1(受容体単独)、IL−1a、IL−1b(変異体および/または受容体複合体を含む)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−10、IFN−β、INF−γ、IFN−α−2a;IFN−α−2B、TNF−α;CD40リガンド(chk)、ヒト肥満タンパク質レプチン、顆粒球コロニー刺激因子、骨形態形成タンパク質−7、毛様体神経栄養因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、単球化学誘導タンパク質1、マクロファージ遊走阻止因子、ヒトグリコシル化阻害因子、ヒトランテス、ヒトマクロファージ炎症タンパク質1ベータ、ヒト成長ホルモン、白血病阻害因子、ヒト黒色腫増殖刺激活性、好中球活性化ペプチド−2、Cc−ケモカインMcp−3、血小板因子M2、好中球活性化ペプチド2、エオタキシン(Eotaxin)、間質細胞由来因子−1、インシュリン、インシュリン様増殖因子I、インシュリン様成長因子II、トランスフォーミング増殖因子B1、トランスフォーミング増殖因子B2、トランスフォーミング増殖因子B3、トランスフォーミング増殖因子A、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、神経発育因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、神経膠細胞由来神経栄養因子(およびPDB1/12/99における55のサイトカイン類));ウロキナーゼ;エリトロポイエチン;ヘッジホッグ(hedgehog)・ソニック、ヘッジホッグ・デザート、ヘッジホッグ・インディアン、hCGを含むがこれらに限定されるわけではない、他の細胞外シグナル伝達部分;TPAおよび因子VIIaを含むがこれらに限定されるわけではない、凝固因子;p53、p53四量体化ドメイン、Znフィンガー(そのうち12個以上が構造を有する)、ホメオドメイン(そのうち8個が構造を有する)、ロイシンジッパー(そのうち4個が構造を有する)を含むがこれらに限定されるわけではない、転写因子;cFvを含むがこれらに限定されるわけではない、抗体;血球凝集素四量体化ドメインおよびhiv Gp41エクトドメイン(融合ドメイン)を含むがこれらに限定されるわけではない、ウイルスタンパク質;SH2ドメイン(そのうち8構造は既知である)、SH3ドメイン(そのうち11個は構造を有する)、およびプレクスチン相同性ドメインを含むがこれらに限定されるわけではない、細胞内シグナルモジュール;Gp130のヒト組織因子サイトカイン結合性領域の細胞外領域、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、TNF受容体、IL−1受容体、IL−1受容体/IL1ra複合体、IL−4受容体、INF−γ受容体アルファ鎖、MHCクラスI、MHCクラスII、T細胞受容体、インシュリン受容体、インシュリン受容体、インシュリン受容体チロシンキナーゼおよびヒト成長ホルモン受容体を含むがこれらに限定されるわけではない、受容体を含む、既知構造を有するもの(変異体を含む)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0061】
特に、好ましい産業用標的タンパク質には、プロテアーゼ(パパイン、サブチリシンを含むが、これらに限定されるわけではない)セルラーゼ(エンドグルカナーゼI、IIおよびIII、エキソグルカナーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、IIおよびIIIを含むが、これらに限定されるわけではない)、カルボヒドラーゼ(グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコースイソメラーゼを含むが、これらに限定されるわけではない)およびリパーゼを含む、既知構造を有するもの(変異体を含む)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0062】
特に、好ましい農業用標的タンパク質には、キシロースイソメラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ルビスコ、ADPグルコースフロホスホルリアーゼ、並びに油生合成、ステロール生合成、炭水化物生合成および二次代謝物の合成に関わる酵素を含む、既知構造を有するもの(変異体を含む)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0063】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、標的タンパク質で開始すること、および一次配列のセットを生成させるためにコンピューター処理分析を使用することを包含する。関連するタンパク質の配列アラインメント、構造アラインメント、構造予測モデル、データベース、または(好ましくは)タンパク質設計オートメーションのコンピューター処理分析を含む、使用できる多様なコンピューター処理方法がある。同様に、(分子力学計算、モンテカルロ分析などの任意の数の技法を使用して)出発構造を乱してタンパク質を変化させること(主鎖および側鎖のねじれ角の変化を含む)によって創出した骨格構造のセットを使用する配列スクリーニングを介して、一次変異配列ライブラリーを生成できる。各出発構造(または、上位配列のいくつかのセット)について最適配列を選択し、一次変異配列ライブラリーを作成する。
【0064】
これらの技術のいくつかにより、一次ライブラリー中の配列リストがある特定の基準をベースとして「スコア付け」または「ランク付け」される結果となる。いくつかの実施態様では、ランク付け無しで生成される配列リストに、その後下記に概説する技術を使用してランク付けすることができる。
【0065】
一般的に、一次変異配列ライブラリーの生成に使用できる様々なコンピューター処理方法がある。好ましい実施態様では、配列をベースとする方法が使用される。あるいは、下記に詳述するPDAのような、構造をベースとする方法を使用する。高精度で配列の相対エネルギーを評価するための他のモデルには、出典明示により本明細書の一部とする Warshel, Computer Modeling of Chemical Reactions in Enzymes and Solutions, Wiley & Sons, New York, (1991) が含まれる。
【0066】
同様に、変異配列スコアを個々に計算し、ランク順リストを編集することにより配列をコンピューター処理でスクリーニングするために、分子力学計算を使用できる。
【0067】
好ましい実施態様では、コンピューター処理のスクリーニング中に配列をスコア付けするために、残基対ポテンシャルを使用できる(Miyazawa et al. Macromolecules 18(3):534−552 (1985) 、出典明示により本明細書の一部とする)。
【0068】
好ましい実施態様では、配列をスコア付けするために、配列プロフィール評価(Bowie et al. Science 253 (5016): 164−70 (1991) 出典明示により本明細書の一部とする)および/または平均力のポテンシャル(Hendlich et al. J.Mol.Biol. 216(1): 167−180 (1990) これも出典明示により本明細書の一部とする)も計算できる。これらの方法は、配列と3Dタンパク質構造との間の調和を評価するため、タンパク質構造に対する忠実度についてスクリーニングすべく機能できる。配列を評価するために様々なスコア付け関数を使用することにより、配列空間の様々な領域がコンピューター処理スクリーニングでサンプリングできる。
【0069】
さらに、タンパク質に金属または補因子結合部位を創出する配列についてスクリーニングするために、スコア付け関数を使用できる(Hellinga et al. Fold Des.3(1):R1−8(1998) 、出典明示により本明細書の一部とする)。同様に、タンパク質にジスルフィド結合を創出する配列についてスクリーニングするために、スコア付け関数を使用できる。新規構造モチーフを導入すべくタンパク質構造を特異的に変更するために、これらの可能性を試す。
【0070】
好ましい実施態様では、一次ライブラリーを生成させるために、配列および/または構造アラインメント・プログラムを使用できる。当業界で既知のように、数々の配列をベースとしたアラインメント・プログラムがある;例えば、Smith−Waterman サーチ、Needleman−Wunsch、Double Affine Smith−Waterman、フレームサーチ、Griskov/GCG プロフィールサーチ、Griskov/GCG プロフィールスキャン、プロフィールフレームサーチ、Bucher 一般化プロフィール、Hidden Markov モデル、Hframe、Double Frame、Blast、Psi−blast、Clustal、および GeneWise を含む。
【0071】
配列の情報源は幅広く変化でき、かつ、SCOP (Hubbard et al. Nucleic Acids Res 27(1):254−256. (1999));PFAM (Bateman et al. Nucleic Acids Res 27(1):260−262. (1999));VAST (Gibrat et al. Curr Opin Struct Biol 6(3):377−385. (1996));CATH (Orengo et al. Structure 5(8):1093−1108. (1997));PhD Predictor (http://www.embl−heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html);Prosite (Hofmann et al. Nucleic Acids Res 27(1):215−219. (1999));PIR (http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/protseqdb/);GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/);PDB (www.rcsb.org) および BIND (Bader et al. Nucleic Acids Res 29(1):242−245. (2001))を含むがこれらに限定されない、1つまたはそれ以上の既知データベースから配列を得ることを含む。
【0072】
さらに、これらのデータベース由来の配列は、連続分析または遺伝子予測にかけ得る;Wheeler et al. Nucleic Acids Res 28(1):10−14. (2000) と、Burge and Karlin, J Mol Biol 268(1):78−94. (1997) を参照のこと。
【0073】
当業界で既知のように、使用できる数々の配列アラインメント体系がある。例えば、アラインメント法に基づく配列の相同性は、標的構造に関するタンパク質の配列アラインメントを創出するために使用できる(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215(3):403 (1990)、出典明示により本明細書の一部とする)。これらの配列アラインメントを調べ、観測された配列の変動を決定する。これらの配列の変動は、一次ライブラリーを定義するために表にする。加えて、さらに以下に概説するように、二次ライブラリーを生成させるためにもこれらの方法を使用できる。
【0074】
配列をベースとしたアラインメントは、様々な方法で使用できる。例えば、関連するタンパク質のいくつかを、当業界で既知のようにアラインメントでき、そして「可変」および「保存された」残基を定義する;即ち、そのファミリーの構成員の間で、変化した残基または同一のままの残基を定義できる。これらの結果は、以下に概説した確率表を生成させるのに使用できる。同様に、これらの配列の変動を表にでき、そしてこれらから、以下で定義するように二次ライブラリーを定義する。あるいは、コンピューター処理スクリーニングにおいて各位置で考えられるアミノ酸を定義するために、許容される配列変動を使用できる。別の変動は、配列アラインメントで生じるアミノ酸のスコアに偏りをかけ、それによってそれらのアミノ酸がコンピューター処理スクリーニングにおいて見出される見込みが増加するが、なお他のアミノ酸を考慮することも許容される。この偏りは、結果として焦点をあてた一次ライブラリーが得られるが、アラインメントに見出されないアミノ酸を考慮から除外しない。加えて、数々の他のタイプの偏りを導入してもよい。例えば、多様化を強いてもよい;即ち「保存された」残基を選び、タンパク質に多様化を強いるように改変し、かくして配列空間のより大きな部分をサンプリングする。あるいは、ファミリーの構成員間で可変性が高い (即ち保存性が低い) 位置を、アミノ酸の全てまたはサブセットのいずれかを使用して、ランダム化することができる。同様に、異常残基は位置異常または側鎖異常のいずれも排除してもよい。
【0075】
同様に、配列アラインメントを生成させるために、構造的に関連したタンパク質の構造アラインメントを行える。そのような既知の広く様々な構造アラインメント・プログラムがある。例えば、NCBI による VAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/Structure/VAST/vast.shtml) ;SSAP (Orengo and Taylor, Methods Enzymol 266(617−635 (1996)) SARF2 (Alexandrov, Protein Eng 9(9):727−732. (1996)) CE (Shindyalov and Bourne, Protein Eng 11(9):739−747. (1998));(Orengo et al. Structure 5(8):1093−108 (1997);Dali (Holm et al. Nucleic Acid Res. 26(1):316−9 (1998)(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)を参照のこと。観測された配列の変動を決定するために、これらの構造的に生成させた配列アラインメントを調査できる。
【0076】
一次変異配列ライブラリーは、配列から二次構造を予測し、次いで予測された二次構造と矛盾しない配列を選択することによって生成できる。スレッディング(threading) (Bryant and Altschul, Curr Opin Struct Biol 5(2):236−244. (1995));Profile 3D (Bowie et al. Methods Enzymol 266(598−616 (1996);MONSSTER (Skolnick et al. J Mol Biol 265(2):217−241. (1997);Rosetta (Simons et al. Proteins 37(S3):171−176 (1999);PSI−BLAST (Altschul and Koonin, Trends Biochem Sci 23(11):444−447. (1998));Impala(Schaffer et al. Bioinformatics 15(12):1000−1011. (1999));HMMER (McClure et al. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol 4(155−164 (1996));Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/);BLAST (Altschul et al. J Mol Biol 215(3):403−410. (1990));ヘリックス−コイル転移理論 (Munoz and Serrano, Biopolymers 41:495, 1997)、ニューラルネットワーク、局所構造アラインメント、およびその他(例えば、Selbig et al. Bioinformatics 15:1039, 1999 参照)を含むが、これらに制限されるものではない、数々の二次構造予測法がある。
【0077】
同様に、上記概説した通り、他のコンピューター処理方法も知られており、例えば配列プロファイリング(Bowie and Eisenberg、Science253(5016):164−70(1991))、回転異性体ライブラリー選択法(Dahiyat and Mayo、Protein Sci5(5):895−903(1996)、Dahiyat and Mayo、Science278(5335):82−7(1997);Desjarlais and Handel、Protein Science 4:2006−2018(1995)、Harburyet al. PNAS USA92(18):8408−8412(1995);Konoet al. Proteins:Structure,Function and Genetics 19:244−255(1994);Hellinga and Richards、PNAS USA 91:5803−5807(1994)) および残基対ポテンシャル(Jones、Protein Science 3:567−574(1994))、PROSA (Heindlich et al. J. Mol. Biol. 216 : 167−180 (1990) ;THREADER (Jones et al. Nature 358 : 86−89 (1992)、および Simons et al. (Proteins, 34 : 535−543, 1999), Levitt and Gerstein (PNAS USA, 95 : 59135920, 1998), Godzik et al. PNAS, V89, PP 12098−102 ; Godzik and Skolnick (PNAS USA, 89 : 12098102, 1992), Godzik et al. (J. Mol. Biol. 227 : 227−38, 1992) に記載されているもののような他の逆折畳み方法、および2−プロファイル方法 (Gribskov et al. PNAS 84 : 4355−4358 (1987) および、Fischer and Eisenberg, Protein Sci. 5 : 947−955 (1996), Rice and Eisenberg J. Mol. Biol. 267 : 1026−1038 (1997)) が含まれるが、これらに限定されるわけではなく、これらは全て出典明示により本明細書の一部とする。さらに、Koehl and Levitt (J. Mol. Biol. 293 : 1161−1181 (1999) ; J. Mol. Biol. 293 : 1183−1193 (1999) ; 出典明示により本明細書の一部とする)に記載されているもののような他のコンピューター処理方法を使用してタンパク質配列ライブラリーを創出でき、場合により、それを改良された特性および機能についての実験的スクリーニングにおいて使用するための、より小さい二次ライブラリーを生成させるのに使用できる。
【0078】
加えて、SCMF と同様に用い得る、SCMF などの力場の計算に基づくコンピューター処理方法がある。Delarue et al. Pac. Symp. Biocomput. 109−21 (1997), Koehl et al. J. Mol. Biol. 239:249 (1994);Koehl et al. Nat. Struc. Biol. 2:163 (1995);Koehl et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 6:222 (1996);Koehl et al. J. Mol. Bio. 293:1183 (1999);Koehl et al. J. Mol. Biol. 293:1161 (1999);Lee, J. Mol. Biol. 236:918 (1994);Vasquez Biopolymers 36:53−70 (1995);(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)を参照のこと。コンピューター処理方法の範囲内で配列のコンホメーション(立体配座)を最適化するため、またはここで概説したような新規の最適化された配列を新しく生成させるために使用できる他の力場計算には、OPLS−AA (Jorgensen et al. J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225−11236;Jorgensen, W.L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT (1999));OPLS (Jorgensen et al. J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff;Jorgensen et al. J Am. Chem. Soc. (1990), v 112, pp 4768ff);UNRES (United Residue Forcefield;Liwo et al. Protein Science (1993), v 2, pp1697−1714;Liwo et al. Protein Science (1993), v 2, pp1715−1731;Liwo et al. J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp849−873;Liwo et al. J. Comp. Chem. (1997),v 18, pp874−884;Liwo et al. J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp259−276;Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp5482−5485);ECEPP/3(Liwo et al. J Protein Chem 1994 May;13(4):375−80);AMBER 1.1 力場 (Weiner et al. J. Am. Chem. Soc. v 106, pp765−784);AMBER 3.0 力場 (U.C. Singh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:755−759);CHARMM および CHARMM22 (Brooks et al. J. Comp. Chem. v 4, pp 187−217);cvff3.0 (Dauber−Osguthorpe et al. (1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v4, pp31−47);cff91 (Maple et al. J. Comp. Chem. v15, 162−182) を含み、これらに限定されない;また、DISCOVER (cvff および cff91) および AMBER 力場は、INSIGHT 分子モデリング・パッケージ (Biosym/MSI, San Diego California) で使用され、そして HARMM は、QUANTA 分子モデリング・パッケージ (Biosym/MSI, San Diego California)で使用される(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)。事実、下記で概説したように、直接二次ライブラリーを生成させるために、これらの力場の方法を使用できる;即ち、一次ライブラリーを生成させない;むしろ、これらの方法は、確率表を作成するために使用でき、それを元に、例えばSCMF計算の間にこれらの力場を使用することによって、二次ライブラリーを直接生成させる。
【0079】
好ましい実施態様では、一次ライブラリー生成に使用するコンピューター処理方法は、U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926、09/782,004およびPCT US98/07254(これらは全て出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている、タンパク質設計オートメーション(登録商標)(PDA(登録商標))技法である。簡単に述べると、PDAは次のように説明できる。既知タンパク質構造を出発点として使用する。次いで、最適化される残基を同定するが、それは全配列またはそのサブセット(複数も可)であり得る。次いで、変化させる任意の位置の側鎖を除去する。得られたタンパク質主鎖および残りの側鎖から成る構造を鋳型と呼ぶ。次いで、好ましくは、各可変残基位置を、コア残基、表面残基または境界残基として分類する。各分類は、その位置に可能なアミノ酸残基のサブセットを定義する(例えば、コア残基は一般に疎水性残基のセットから選択され、表面残基は一般に親水性残基から選択され、そして境界残基はどちらでもあり得る)。各アミノ酸は、回転異性体と呼ばれる、独立したセットの許容される各側鎖の全コンフォマーにより代理され得る。即ち、主鎖に最適な配列に到達するため、回転異性体の可能性のある全配列をスクリーニングしなければならず、その場合各主鎖位置は、その可能な全回転異性体状態である各アミノ酸、またはアミノ酸のサブセット、従って回転異性体のサブセットにより占められ得る。
【0080】
次いで、2セットの相互作用を各回転異性体について全位置で計算する。即ち、回転異性体側鎖と主鎖の全部または一部との相互作用(「シングルス」エネルギー、回転異性体/鋳型または回転異性体/主鎖エネルギーとも呼ばれる)、および回転異性体側鎖と、他の全ての位置または他の位置のサブセットにおける他の可能な全回転異性体との相互作用(「ダブルス」エネルギー、回転異性体/回転異性体エネルギーとも呼ばれる)。これらの相互作用の各々のエネルギーは、様々なスコア付け関数の使用を通して計算され、それにはファンデルワールス力のエネルギー、水素結合のエネルギー、二次構造傾向のエネルギー、表面領域溶媒和のエネルギーおよび静電気が含まれる。ゆえに、主鎖および他の回転異性体の両方と各回転異性体の相互作用の総エネルギーが計算され、マトリックス形態で記憶される。
【0081】
回転異性体のセットの明確な性質は、試験する回転異性体配列の数の単純計算を可能にする。各位置につきm個の可能な回転異性体をもつ長さnの主鎖の場合、mn個の可能な回転異性体配列があり、その数は配列長と共に指数関数的に増大し、リアルタイムで計算するのは非実際的または不可能である。従って、この組合せ検索問題を解決するため、「行き止まり排除法」(DEE)計算を実施する。DEE計算は、第1回転異性体の最悪の総相互作用が第2回転異性体の最良の総相互作用よりもなお良好な場合、第2回転異性体は大域的最適解答(global optimum solution)の一部にはなり得ないという事実に基づいている。全回転異性体のエネルギーは既に計算されているので、DEE方法では、回転異性体を試験し排除するためには配列長全体に及ぶ合計があればよく、計算はかなり速くなる。DEEは、回転異性体の対または回転異性体の組合せを比較しながら再実行でき、結局、大域的最適エネルギーを表す単一の配列が決定される。
【0082】
一旦大域的解答を見出したら、DEE解答の近隣における配列のランク順リストを生成させるためにモンテカルロ検索を行い得る。DEE解答から出発し、ランダム位置を他の回転異性体に変更し、新規配列エネルギーを計算する。新規配列が許容基準に合う場合、それを別のジャンプ用の出発点として使用する。予め定めた数のジャンプの後、配列のランク順リストを生成させる。
【0083】
モンテカルロ検索は、大域的極小値周辺の配列空間を調査するための、または配列空間中の新しい局所的極小距離を見出すためのサンプリング技法である。下記にさらに概説するように、ボルツマンサンプリング、遺伝的アルゴリズム技法および模擬アニーリング(simulated annealing)を含む、使用できる他のサンプリング技法がある。さらに、全ての標本技術に関して、許容されるジャンプの種類を変更できる(例えば、ランダムな残基へのランダムなジャンプ、偏りのあるジャンプ(例えば、野生型へ、または野生型から)、偏りのある残基へのジャンプ(例えば、類似の残基へ、または残基から)など)。同様に、全てのサンプリング技法に関して、サンプリングのジャンプが許容されるか否かの許容基準を変更できる。
【0084】
U.S.S.N.09/127926で概説されているように、タンパク質主鎖(α−炭素からβ−炭素へのベクトルの方向に沿って、窒素、カルボニル炭素、α−炭素およびカルボニル酸素を含む(天然タンパク質の場合))を、超二次構造パラメーターと呼ばれるパラメーターのセットを変えることにより、コンピューター処理分析に先立ち改変し得る。
【0085】
一旦タンパク質構造主鎖を生成させ(上記概説の通り、改変を伴う)、コンピューターに入力したら、明らかな水素が構造内に含まれていないならば、それを付加する(例えば、構造がX線結晶学により生成された場合、水素を付加しなければならない)。水素付加後、構造エネルギーの最小化を実行し、水素並びに他の原子、結合角および結合長を緩和する。好ましい実施態様では、これは、いくつかの段階から成る原子座標位置のコンジュゲート勾配最小化(Mayoet al. J. Phys.Chem.94: 8897 (1990))を実行することにより行なわれ、静電気を全く伴わずに Dreiding の力場が最小限にされる。一般的に、約10ないし約250の段階が好ましく、約50が最も好ましい。
【0086】
タンパク質主鎖構造は、少なくとも1つの可変残基位置を含む。当業界で既知のように、タンパク質の残基またはアミノ酸は、一般にタンパク質のN−末端から出発して連続的に番号付けされる。従って、そのN末端にメチオニンを有するタンパク質は、残基またはアミノ酸の1位にメチオニンを有し、次の残基は2、3、4位などとされている。各位置において、野生型(即ち天然産生)タンパク質は、少なくとも20個のアミノ酸のうちの1つを任意の数の回転異性体で有し得る。本明細書における「可変残基位置」とは、設計方法において特定の残基または回転異性体、一般的には野生型残基または回転異性体として固定されていない、設計されるタンパク質のアミノ酸位置を意味する。
【0087】
好ましい実施態様において、タンパク質の残基位置全てが可変である。即ち、どのアミノ酸側鎖も本発明方法では改変され得る。これは、小型タンパク質の場合特に望ましいが、本発明は大型タンパク質の設計も同様に可能にする。この方法で設計され得るタンパク質の長さに理論的制限は無く、実際的なコンピューター処理上の制限がある。
【0088】
別の好ましい実施態様では、タンパク質の残基位置のいくつかのみが可変であり、残りは「固定」されている、即ち、それらは設定されたコンホメーションであるものとして3次元構造中で同定される。いくつかの実施態様では、固定位置はその本来の立体配座のままである(使用されている回転異性体ライブラリーの特異的回転異性体と相関関係を示しても示さなくてもよい)。あるいは、残基は非野生型残基として固定され得る。例えば、既知の部位指定変異導入技法により、特定残基が望ましい(例えば、タンパク質加水分解部位の排除または酵素の基質特異性の改変のために)と示されたとき、残基は特定アミノ酸として固定され得る。
【0089】
あるいは、下記で検討されている通り、新たに変異を評価するために本発明の方法を使用できる。別の好ましい実施態様では、固定位置は「浮動」させ得る;その位置のアミノ酸は固定されるが、そのアミノ酸の別の回転異性体が試験される。この実施態様において、可変残基は、少なくとも1個、または概して残基総数の0.1%ないし99.9%であり得る。従って、例えば、少数のみ(または1個)の残基または残基の大部分(両者の間にあらゆる可能性がある)を変えることが可能である。
【0090】
好ましい実施態様において、固定できる残基には、構造的または生物学的機能性残基が含まれるが、これらに限定されるわけではない;あるいは、生物学的機能性残基は、特異的に固定されていなくてもよい。例えば、生物活性にとって重要であることが知られている残基、例えば酵素の活性部位、酵素の基質結合部位、結合パートナー(リガンド/受容体、抗原/抗体など)への結合部位、生物学的機能にとっては決定的なリン酸化またはグリコシル化部位を形成する残基、または構造的に重要な残基、例えばジスルフィド架橋、金属結合部位、重大な水素結合性残基、プロリンまたはグリシンなどの主鎖立体配座にとって重大な残基、相互作用パッキングにとって重大な残基などは全て、一立体配座に、または単一回転異性体として固定してもよく、または「浮動」してもよい。
【0091】
同様に、可変残基として選択し得る残基は、望ましくない生物学的特性、例えばタンパク質加水分解に対する感受性、二量体化または凝集部位、免疫応答を誘導し得るグリコシル化部位、望ましくない結合活性、望ましくないアロステリー、結合は保存されているが望ましくない酵素活性などを付与するものであり得る。
【0092】
好ましい実施態様において、各可変位置は、コア、表面または境界残基位置として分類されるが、場合によっては、下記説明の通り、主鎖を最小化するために可変位置をグリシンに設定し得る。さらに、本明細書で概説するように、残基が分類されている必要はなく、可変なものとして選択でき、いかなるアミノ酸のセットも使用し得る。コア、表面および境界位置のいずれの組合せも利用できる。即ち、コア、表面および境界残基;コアおよび表面残基;コアおよび境界残基、および表面および境界残基、並びにコア残基単独、表面残基単独または境界残基単独。
【0093】
コア、表面または境界としての残基位置の分類は、当業者に明らかな通り、いくつかの方法で行い得る。好ましい実施態様において、分類は、側鎖を含む本来のタンパク質主鎖構造の走査画像により行い、タンパク質モデリングの当業者の主観的評価に基づいて分類を指定する。あるいは、好ましい態様は、U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926およびPCT US98/07254で概説されている通り、鋳型Cα原子のみを用いて計算した、溶媒が近づき易い表面に関してCα−Cβベクトル配向評価を利用する。あるいは、表面積計算を行える。
【0094】
一旦各可変位置をコア、表面または境界として分類したら、アミノ酸側鎖のセット、即ち回転異性体のセットが各位置に割り当てられる。即ち、プログラムにより特定位置での考慮の対象として認められた可能なアミノ酸側鎖のセットが選択される。それに続いて、一旦可能なアミノ酸側鎖を選択すると、特定位置で評価される回転異性体のセットを決定し得る。従って、コア残基は、一般にアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンから成る疎水性残基の群から選択され(いくつかの実施態様では、下記ファンデルワールススコア付け関数のαスケーリング因子が低いとき、メチオニンがセットから除去される)、各コア位置のための回転異性体のセットは、潜在的にこれらの8アミノ酸側鎖の回転異性体を包含する(主鎖非依存的ライブラリーを使用する場合は全回転異性体、そして回転異性体依存的主鎖を使用する場合はサブセット)。
【0095】
同様に、表面位置は、一般にアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンから成る親水性残基の群から選択される。従って、各表面位置のための回転異性体のセットは、これらの10残基の回転異性体を包含する。最後に、境界位置は、一般にアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンから選択する。従って、各境界位置のための回転異性体のセットは、これらの17残基の全回転異性体を包含する(システイン、グリシンおよびプロリンが使用されないことを仮定するが、それらは使用できる)。さらに、いくつかの好ましい実施態様では、18個の天然産生アミノ酸(特に破壊的であることが知られているシステインおよびプロリンを除く全て)を使用する。
【0096】
従って、当業者に理解されるように、計算回数が減らせるため、残基位置を分類することにはコンピューター処理上の利点がある。また、コア、境界および表面残基のセットが上記のものから改変される状況があり得ることに注目すべきである。例えば、ある状況では、1個またはそれ以上のアミノ酸が付加されるかまたは許容されるアミノ酸のセットから控除される。例えば、二量体化または多量体化するか、またはリガンド結合部位を有するいくつかのタンパク質は、疎水性表面残基などを含み得る。さらに、らせん「キャッピング」またはαらせん双極子との有利な相互作用を行わせない残基は、許容される残基のセットから控除し得る。このアミノ酸のグループの変更は、残基ごとに行い得る。
【0097】
好ましい態様において、プロリン、システインおよびグリシンは可能なアミノ酸側鎖のリストには含まれず、従ってこれらの側鎖の回転異性体は使用されない。しかしながら、好ましい実施態様では、可変残基位置が0°より大きいφ角度(即ち、1)先行アミノ酸のカルボニル炭素、2)現残基の窒素原子、3)現残基のα炭素、および4)現残基のカルボニル炭素、により定義される二面角)を有するとき、該位置をグリシンに設定して主鎖のひずみを最小化する。
【0098】
一旦可能な回転異性体の群を各可変残基位置に割り当てたら、U.S.S.N.09/127,926およびPCT US98/07254で概説されているように加工が進められる。この加工段階は、最適タンパク質配列を生成させるために、回転異性体間の相互作用および回転異性体とタンパク質主鎖との相互作用の分析を必要とする。極度に単純化すると、加工は、まずいくつかのスコア付け関数を用いることにより、主鎖自体または他の回転異性体に対する、回転異性体の相互作用エネルギーを計算することを含む。好ましいPDA(登録商標)技法スコア付け関数には、ファンデルワールスポテンシャルスコア付け関数、水素結合ポテンシャルスコア付け関数、原子溶媒和スコア付け関数、二次構造傾向スコア付け関数および静電気スコア付け関数があるが、これらに限定はされない。さらに下記で報告されているように、各位置をスコア付けするために少なくとも1つのスコア付け関数を使用するが、スコア付け関数は、位置分類、またはαらせん双極子との有利な相互作用などの他の考慮すべき点により異なり得る。下記で概説されている通り、計算で使用される総エネルギーは、一般に等式1で示されるように、特定位置で使用される各スコア付け関数のエネルギーの合計である:
等式1 Etotal=nEvdw+nEas+nEh−結合+nEas+nEelec
【0099】
等式1において、総エネルギーは、ファンデルワールスポテンシャルエネルギー(Evdw)、原子溶媒和エネルギー(Eas)、水素結合エネルギー(Eh−結合)、二次構造エネルギー(Ess)および静電気相互作用エネルギー(Eelec)の合計である。nの語は、この語を特定残基位置に関して考慮すべきか否かによって、0または1である。
【0100】
U.S.S.N.60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926およびPCT US98/07254で概説されているように、単独でか、または組合せて、これらのスコア付け関数の組合せはどれでも使用し得る。一旦使用するスコア付け関数を各可変位置について同定したら、コンピューター処理分析における好ましい第1段階には、可能な各回転異性体とタンパク質の残り全部または一部との相互作用の測定が含まれる。即ち、スコア付け関数の1つまたはそれ以上により測定される、各可変残基位置における可能な各回転異性体と主鎖または他の回転異性体との相互作用のエネルギーが計算される。好ましい実施態様では、各回転異性体とタンパク質の残り全部、即ち鋳型全体および他の全回転異性体の両方との相互作用が行なわれる。しかしながら、上記で概説されている通り、タンパク質の一部分、例えば大型タンパク質のドメインのみをモデルにすることが可能であり、従って、場合によってはタンパク質の必ずしも全部を考慮する必要はない。本明細書で使用される「部分」という用語は、あるタンパク質に関してそのタンパク質の断片を表す。この断片は、10アミノ酸残基から、全アミノ酸配列マイナス1アミノ酸までのサイズの範囲であり得る。従って、本明細書で使用される「部分」の用語は、ある核酸に関してその核酸の断片を表す。この断片は、10ヌクレオチドから、全核酸配列マイナス1ヌクレオチドまでのサイズの範囲であり得る。
【0101】
好ましい実施態様において、コンピューター処理加工の第1段階は、全ての位置における各回転異性体に関して2セットの相互作用を計算することにより行なう。即ち、その位置を変更しようと浮動させようと、回転異性体側鎖と鋳型または主鎖との相互作用(「シングルス」エネルギー)、および回転異性体側鎖と全ての他の位置における全ての他の可能な回転異性体との相互作用(「ダブルス」エネルギー)である。この場合の主鎖はタンパク質構造主鎖の原子および固定残基があればその原子の両方を含み、この場合固定残基はあるアミノ酸の特定立体配座として定義されることを理解すべきである。
【0102】
即ち、「シングルス」(回転異性体/鋳型)エネルギーは、スコア付け関数のいくつかまたは全部を使用して、全ての可変残基位置における全ての可能な回転異性体と主鎖との相互作用について計算される。従って、水素結合スコア付け関数の場合、回転異性体の全水素結合原子および主鎖の全水素結合原子が評価され、EHBが全可変位置における可能な各回転異性体について計算される。同様に、ファンデルワールススコア付け関数の場合、回転異性体の全原子を鋳型の全原子と比較し(一般的にそれ自体の残基の主鎖原子を除外する)、そして全可変残基位置における可能な各回転異性体についてEvdWを計算する。さらに、原子が3つまたはそれ未満の結合により結合されている場合、一般的に、ファンデルワールスエネルギーは計算されない。原子溶媒和スコア付け関数の場合、回転異性体の表面は鋳型表面に対して測定され、全ての可変残基位置における可能な各回転異性体についてEasが計算される。また二次構造傾向スコア付け関数も、シングルスエネルギーとして考えられるため、総シングルスエネルギーはEss項を含み得る。当業者に明らかなように、回転異性体および鋳型位置間の物理的距離に依存して、これらのエネルギー項の多くはゼロに近づく;即ち、2つの部分が離れれば離れるほど、エネルギーは低くなる。
【0103】
「ダブルス」エネルギー(回転異性体/回転異性体)の計算の場合、可能な各回転異性体の相互作用エネルギーを全ての他の可変残基位置における全ての可能な回転異性体と比較する。従って、「ダブルス」エネルギーは、スコア付け関数のいくつかまたは全部を使用して、全ての可変残基位置における全ての可能な回転異性体と全ての他の可変残基位置における全ての可能な回転異性体との相互作用について計算される。従って、水素結合スコア付け関数の場合、第1回転異性体の全水素結合原子および全ての可能な第2回転異性体の全水素結合原子が評価され、EHBが任意の2可変位置における可能な各回転異性体対について計算される。同様に、ファンデルワールススコア付け関数の場合、第1回転異性体の全原子を全ての可能な第2回転異性体の全原子と比較し、そして全ての2可変残基位置における可能な各回転異性体対についてEvdWを計算する。原子溶媒和スコア付け関数の場合、第1回転異性体の表面は全ての可能な第2回転異性体の表面に対して測定され、そして全ての2可変残基位置における可能な各回転異性体対についてEasが計算される。二次構造傾向スコア付け関数は、「シングルス」エネルギーの構成要素として見なされることから、「ダブルス」エネルギーとして実施する必要は無い。当業者に認識されるように、第1回転異性体および第2回転異性体間の物理的距離に依存して、これらのダブルスエネルギー項の多くはゼロに近づく。即ち、即ち、2つの部分が離れれば離れるほど、エネルギーは低くなる。
【0104】
加えて、当業者に認識されるように、PDA(登録商標)技法計算で種々の力場を使用でき、Dreifing I および Dreiding II (Mayo et al, J. Phys. Chem. 948897 (1997))、AMBER (Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc. 106:765 (1984) および Weiner et al., J. Comp. Chem. 106:230 (1986))、MM2 (Allinger J. Chem. Soc. 99:8127 (1977), Liljefors et al., J. Com. Chem. 8:1051 (1987)); MMP2 (Sprague et al., J. Comp. Chem. 8:581 (1987)); CHARMM (Brooks et al., J. Comp. Chem. 106:187 (1983)); GROMOS; および MM3 (Allinger et al., J. Amer. Chem. Soc. 111:8551 (1989))、OPLS−AA (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225−11236; Jorgensen, W. L.; BOSS, Version 4.1; Yale University:New Haven, CT (1999)); OPLS (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff; Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1990), v112, pp 4768ff); UNRES (United Residue Forcefield; Liwo, et al., Protein Science (1993), v2, pp 1697−1714; Liwo et al.,Protein science (1993), v2, pp1715−1731; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp849−873; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (197), v18, pp874−884; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp259−276; Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp5482−5485); ECEPP/3 (Liwo et al., J Protein Chem 1994 May; 13 (4):375−80); AMBER 1.1 力場 (Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. v106, pp765−784); AMBER 3.0 力場 (U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:755−759); CHARMM および CHARMM22 (Brooks, et al., J. Comp. Chem. v4, pp 187−217); cvff3.0 (Dauber−Osguthorpe, et al., (1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v4, pp31−47); cff91 (Maple, et al., J. Comp. Chem. v15, 162−182) を含むがこれらに限定されるわけではない;また DISCOVER (cvff および cff91) および AMBER 力場は、INSIGHT 分子モデリングパッケージ (Biosym/MSI, San Diego California) に使用し、HARMM は QUANTA 分子モデリングパッケージ (Biosym/MSI, San Diego California) に使用し、これらの全ては出典明示により本明細書の一部とする。
【0105】
一旦シングルスおよびダブルスエネルギーが計算され記憶されると、コンピューター処理加工の第2段階が行われ得る。U.S.S.N.09/127926およびPCT US98/07254で概説されているように、好ましい実施態様は、行き止まり排除法(DEE)段階、および好ましくはモンテカルロ段階を利用する。
【0106】
概観すると、PDA(登録商標)技法は、アウトプット(例えば、一次ライブラリー)を改変するために変化させ得る3つの要素を有する:加工に使用するスコア付け関数;フィルタリング技法、およびサンプリング技法。
【0107】
好ましい実施態様では、スコア付け関数を改変し得る。好ましい実施態様では、上記概説のスコア付け関数は、種々の方法において偏らされ、または加重され得る。例えば、参照配列または参照配列のファミリーに向かうかまたはそこから離れる偏りを行うことができる;例えば、野生型または相同残基に向かう偏りを使用し得る。同様に、全タンパク質またはそのフラグメントを偏らせ得る;例えば、活性部位を野生型残基に向けて偏らせ得、または特定の望ましい物理的特性に向けたドメイン残基を行える。更に、増加したエネルギーに向かうまたは対する偏りを創出し得る。更なるスコア付け関数偏重には、静電ポテンシャル勾配または疎水性勾配の適用、計算への基板または結合パートナーの添加、または所望の電荷または阻止性に向けた偏りが含まれるが、これらに限定されない。
【0108】
加えて、別の実施態様において、使用し得る更なる種々のスコア付け関数が存在する。更なるスコア付け関数には、ねじれポテンシャル、または残基対ポテンシャルまたは残基エントロピーポテンシャルが含まれるが、これらに限定されない。このような更なるスコア付け関数は、単独で、またはライブラリーを最初にスコア付けした後のライブラリー加工用の関数として使用できる。
【0109】
好ましい実施態様において、DEEおよびその関連カウンターパートを含むが、これらに限定されない、種々の加工フィルタリング技法を行える。更なるフィルタリング技法は、最適配列の発見のためのブランチ−アンド−バウンド技法 (Cordon and Majo, Structure Fold. Des. 7:1089−98, 1999) および配列の徹底的な列挙を含むが、これらに限定されない。しかし、ある技法は、フィルタリング技法なしでも行ない得ることは注意すべきである;例えば、サンプリング技法は、フィルタリング無しで良好な配列の発見に使用できる。
【0110】
当業者に認識されるように、一旦最適配列または配列のセットが生成されたら、(あるいはまた、これらは最適化または順序だてる必要はない)種々の配列空間サンプリング法を、好ましいモンテカルロ法に加えて、またはモンテカルロ検索の代わりに行なうことができる。即ち、一旦配列または配列のセットが生成されたら、好ましい方法は、試験のための更なる、関連配列の生成を可能にするサンプリング技法を利用する。
【0111】
これらのサンプリング法には、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失、または1つもしくはそれ以上の配列の組換えの使用が含まれる。本明細書で略述するように、好ましい実施態様はモンテカルロ検索を利用するが、これは一連の偏らせたか、系統的か、またはランダムなジャンプである。しかしながら、この他にも使用可能なサンプリング技法があり、ボルツマンサンプリング、遺伝的アルゴリズム技法、および模擬アニーリングが含まれる。加えて、全てのサンプリング技法に関して、許容されるジャンプの種類を改変することができる (例えば、ランダムな残基へのランダムなジャンプ、偏らせたジャンプ (例えば、野生型に向かうか、または離れて) 、偏らせた残基へのジャンプ (類似の残基に向かうか、または離れて、等) 。複数の残基の位置を一緒にしたジャンプ (2個の残基が常に共に変化する、または決して共に変化しない) 、残基の全セットが他の配列に変化するジャンプ (例、組換え) 。同様に、全てのサンプリング技法について、サンプリングジャンプが許容されるか否かの許容基準を改変することもでき、また高温での広い検索および低温での局所的最適値近傍で狭い検索を可能にする。出展明示により本明細書の一部とする Metropolis et al., J. Chem. Phys v21, pp1087, 1953 参照。
【0112】
加えて、本発明の好ましい方法は配列のランク順リストに至ることに留意すべきである;即ち、配列は一定の客観的基準に基づいてランク付けされる。しかしながら、本明細書で概説するように、例えば配列をランク付けせずに、リストする確率表を直接に生成させること (例えば、SCMF分析または配列アラインメント技法を使用して)により、ランク付けをしない配列のセットを創出することが可能である。本明細書に略述するサンプリング技法はどちらの状況でも使用できる。
【0113】
好ましい実施態様では、ボルツマンサンプリングを行う。当業者に認識されるように、ボルツマンサンプリングの温度基準を改変することにより、高温で広い検索を行うことも低温で局所的な最適値の近傍で狭い検索を行うこともできる (例えば、Metropolis et al., J. Chem. Phys. 21: 1087, 1953 参照) 。
【0114】
好ましい実施態様では、サンプリング技法は、例えば、Holland (Adaptation in Natural and Artificial Systems, 1975, Ann Arbor, U. Michigan Press) により記載されたような遺伝的アルゴリズムを利用する。一般的に、遺伝的アルゴリズムは、生成させた配列を取り、これらを核酸の組換え事象と同様にして「遺伝子混合」と同様なやりかたでコンピューター処理で組換える。かくして、遺伝的アルゴリズム分析の「ジャンプ」は一般的に複数位置のジャンプである。加えて、以下に略述するように、相関的多重ジャンプも行い得る。このようなジャンプは、様々なクロスオーバー位置で、一度に1回以上の組換えを行うことができ、そして2個またはそれ以上の配列の組換えを伴うことができる。さらに、欠失または挿入 (ランダムまたは偏らせた) を行うことができる。加えて、以下に略述するように、遺伝的アルゴリズム分析は二次ライブラリー生成後に使用してもよい。
【0115】
好ましい実施態様では、サンプリング技法は、例えば、Kirkpatrick et al. (Science, 220: 671−680, 1983) に記載されているようなシミュレートしたアニーリングを使用する。シミュレートしたアニーリングは温度を改変することにより良いジャンプまたは悪いジャンプのカットオフを改変する。即ち、温度を変えることによってカットオフの厳しさの度合いを変化させる。これにより、新しい配列空間領域への高温での広範な検索を行って、低温での狭いサーチによる領域の詳細な探索に切り替えることが可能になる。
【0116】
加えて、以下に略述するように、これらのサンプリング方法を、更なる二次ライブラリー (時々、本明細書では三次ライブラリーと呼ぶ) を生成させるための更なるプロセスに使用できる。
【0117】
従って、一次ライブラリーは、PDA(登録商標)のような構造ベースの方法、または配列ベースの方法、または本明細書に概説のような組合せを含む、コンピューター処理の種々の方法において生成できる。
【0118】
コンピューター処理加工により、最適化候補変異配列のセットが生じる。最適化候補変異タンパク質配列は、一般に、MHC、TCRまたはBCR結合に非常に重要な領域において標的タンパク質配列と異なっている。好ましくは、各最適化候補変異配列は、開始または標的配列から少なくとも約1個の変異アミノ酸を含み、3−5個が好ましい。好ましくは、変異残基は非連続の領域に位置する。
【0119】
従って、好ましい実施態様では、本発明は、標的タンパク質またはその断片をコンピューター処理により加工し、候補変異タンパク質または候補変異タンパク質配列のセットを産生する方法を対象としている。
【0120】
ゆえに、好ましい実施態様では、本発明の候補変異タンパク質は、少なくとも1つのMHC、TCRまたはBCR結合部位において、標的タンパク質と異なるアミノ酸配列を有する。好ましくは、免疫原性の低いタンパク質が望ましいならば、候補変異タンパク質は、少なくとも1つのMHC、TCRまたはBCR結合部位を排除することにより標的タンパク質と異なっている。あるいは、より免疫原性のあるタンパク質が望ましいならば、候補変異タンパク質は、少なくとも1つのMHC、TCRまたはBCR結合部位の付加を介して標的タンパク質と異なっている。
【0121】
従って、コンピューター処理加工により、一次変異配列のセットが生じ、ある種のランク付けまたはスコア付け関数を使用する場合、それは最適化タンパク質配列であり得る。これらの最適化タンパク質配列は、一般に(常にではないが)、主鎖を採用した標的配列と顕著に異なっている。つまり、各最適化タンパク質配列は、好ましくは開始標的または野生型配列から少なくとも約5−10%の変異アミノ酸を含み、少なくとも約15−20%の変化が好ましく、そして少なくとも約30%の変化が特に好ましい。
【0122】
好ましい実施態様では、コンピューター処理の免疫原性フィルターを、一次ライブラリー配列のセットに適用する。本明細書における「コンピューター処理の免疫原性フィルター」は、MHC分子、またはT細胞エピトープまたはB細胞エピトープへのペプチドの結合に関するデータから派生した、数々のスコア付け関数のいずれかを意味する。これらのスコア付け関数は、免疫原性の可能性がある配列を排除するため、または非免疫原性の配列を排除するために、一次ライブラリー配列のセットを再スコア付けするために使用される。次いで、免疫原性を調節するために除去または付加された任意の残基(表面残基を含む)を、構造的および化学的に補償するために、PDAを使用する。
【0123】
好ましい実施態様では、MHCクラスIおよびII分子により表示され、TCRに認識される線状エピトープをコードするアミノ酸残基の除去または付加のいずれかを、構造的および化学的に補償するために、PDA(登録商標)技法を使用する。
【0124】
好ましい実施態様では、ナイーブB細胞上の膜結合抗体に感知される立体構造エピトープをコードするアミノ酸残基の除去または付加のいずれかを、構造的および化学的に補償するために、PDA(登録商標)技法を使用する。
【0125】
他の実施態様では、一次配列のセットをコンピューター処理で生成させる前または最中に、コンピューター処理の免疫原性フィルターを適用する。このアプローチを使用して、潜在的に免疫原性配列を欠くか、または含む、一次配列のセットを生成させる。次いで、これらの配列にPDA(登録商標)技法を実行して、天然の折畳みを維持し、かつ少なくとも開始標的タンパク質と同程度に安定な配列を同定する。
【0126】
MHC分子によるペプチド選択の法則についての現在の知見は、ペプチドおよびMHCタンパク質から抽出した天然のペプチドライブラリーの配列解読、MHC分子へのペプチド結合およびT細胞反応に対する、未知CTLエピトープ配列への変異導入の効果の分析、並びに決定されたMHCペプチド複合体の結晶構造分析および分子力場研究に由来するものである (Meister, G.E., et al. (1995) Vaccine, 13:581−591; Malios, R.R., (1999) Bioinformatics Savoie, C.J. et al. (1999) Pac Symp Biocomput., 182−9; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, Mallios, R.R., (1998) J. Comp. Biol., 5:703−711; Altuvia, Y., et al. (1997) Human Immunology, 58:1−11; Udaka, et al., (1995) J. Exp. Med., 181:2097−2108; Hammer, J. et al. (1994) Behring. Inst. Mitt. 94:124−132)。
【0127】
さらに、MHC分子に結合すると知られている数千のペプチド配列からなるデータベースが編集され(Buus, 前出)、そしてタンパク質全長の配列を分析し、可能性のある免疫原性配列の存在を予測するためのいくつかの技法が開発されてきた (Hiemstra, H.S. et al. (2000) Curr. Op. Immunol., 12:80−84; Malios, R.R., (1999) Bioinformatics, 15:432−439; Sturniolo, T., et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, 14:121−130; Mallios, R.R., (1998) J. Comp. Biol., 5:703−711; Shastri, N. (1996) Curr. Op. Immunol., 8:271−277; Hammer, J. (1995) Curr. Op. Immunol., 7:263−269; Meister, G.E., et al. (1995) Vaccine, 13:581−591; Udaka, K., et al. (1995) J. Exp. Med., 181:20972108; Hammer, J. et al. (1994) Behring. Inst. Mitt. 94:124−132; Hammer, J., et al. (1994) J. Exp. Med., 180: 2353−2358; および、Rudenshky, A. Y., et al. (1991) Nature, 353:622−627; これらの全てを出典明示により本明細書の一部とする)。
【0128】
好ましい実施態様では、潜在的にMHCクラスI分子に結合する能力のあるペプチド断片について、一次変異配列をスクリーニングする。MHC Iリガンドは、ほとんどオクタ−またはノナペプチドであり、天然の隔離集団を集団的に配列解読して決定された、MHC対立遺伝子特異的配列モチーフを示す。結晶構造分析により、2本のαヘリックスと1本のβプリーツ・シートで縁取られたペプチド結合開裂(cleft)、即ち溝、が同定された。開裂は、非共有結合で会合したβ2ミクログロブリンにより、下から安定化されている。結合溝中の特異的ポケットが、ペプチドのアンカー残基を収容する。ペプチドの向きは、NH2−およびCOOH−末端の電荷を補償している、MHC Iタンパク質の保存された側鎖により決定される。
【0129】
所定のMHCクラスIペプチド結合溝は、少数の側鎖位置でのみ同一または相同である、何百または何千もの異なるペプチドに結合できる。多数のクラスIペプチド−MHC複合体の構造比較により、この柔軟性は、各ペプチドの残基の小さいサブセットが構造的に同等に結合することによって達成されると解明された。なかでも、ペプチド主鎖の荷電または極性原子は、本質的な側鎖非依存的ペプチド−MHC相互作用をもたらす。この水素結合およびファンデルワールス接触の集合は、要求される主鎖コンホメーションをとる能力のある任意のペプチドの結合を安定化するのを補助する。少数のペプチド側鎖とのさらなる相互作用は、主鎖結合エネルギーを補い、特定のMHC分子に結合するペプチドにいくらかの配列選択性を持たせる(Madden, D.R. (1995) Annu. Rev. Immunol., 13:587−622)。MHC I結合部位同定の法則は、出典明示により本明細書の一部とする Altuvia, Y., et al (1997) Human Immunology, 58:1−11; および Meister, GE., et al (1995) Vaccine: 6:581−591 に記載されている。
【0130】
好ましい実施態様では、可能性のあるMHCクラスI結合部位は、MHCクラスI分子へのペプチド結合を減少または排除するために除去されたアンカー残基を構造的および化学的に補償するアミノ酸残基で置換される。好ましくは、可能性のあるMHC I結合モチーフは、SYFPEITHIなどの公開されたモチーフのデータベースに適合させて同定する(Rammensee, H., et al., (1999) Immunogenetics, 50:213−219; http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.html)); http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep/)。
【0131】
さらなる実施態様では、非アンカー残基を排除する。
【0132】
好ましい実施態様では、MHCクラスII分子に結合すると予測されるペプチド断片について、一次変異配列をスクリーニングする。クラスIIリガンドは、12ないし25アミノ酸からなり、そのうちの9個が結合溝を占める;2個ないし4個がポケットにアンカーされる。クラスIリガンドにおいてと同様に、非アンカーアミノ酸は、二次的な、しかし依然として重要な役割を果たす (Rammensee, H., et al., (1999) Immunogenetics, 50:213−219)。MHC II結合部位同定の法則は、出典明示により全体を本明細書の一部とする Hammer, J. et al., (1994) Behring. Inst. Mitt., 94: 124−132; Hammer, J. et al., (1995) J. Exp. Med., 180:2353−2358; Mallios, R.R. (1998) J. Com. Biol., 5:703−711; Brusic, V., et al., (1998) Bioinformatics, 14:121−130; Mallios, R.R. (1999) Bioinformatics, 15:432−439 に記載されている。
【0133】
好ましい実施態様では、可能性のあるMHCクラスII結合部位は、MHCクラスI結合部位を排除するために除去されたアンカー残基を構造的および化学的に補償するアミノ酸残基で置換される。好ましくは、可能性のあるMHC I結合部位は、SYFPEITHIなどの公開されたモチーフのデータベースに適合させて同定する(Rammensee, H., et al., (1999) Immunogenetics, 50:213−219; http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.html) または http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep/)。あるいは、クラスII分子への結合予測は、Sturniolo, T, et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561 に記載されているように、仮想マトリックスの方法を使用する。
【0134】
さらなる実施態様では、非アンカー残基を排除する。
好ましい実施態様では、本明細書に記載のコンピューター処理方法により改変された配列のみを考慮する。
他の実施態様では、自己由来タンパク質に存在するペプチド配列 (即ち、免疫グロブリン、アルブミンなどの循環するヒトタンパク質)は無視される。
【0135】
好ましい実施態様では、一次変異配列を、T細胞エピトープとして機能すると予測されるペプチド断片についてスクリーニングする。好ましい実施態様では、可能性のあるT細胞エピトープは、T細胞エピトープを排除するために除去された残基を構造的および化学的に補償するアミノ酸残基で置換される。好ましくは、可能性のあるT細胞エピトープは、公開されたモチーフのデータベースに適合させて同定する (Walden, P., (1996) Curr. Op. Immunol., 8:68−74)。本発明で有用な他のT細胞エピトープ同定方法には、全て出典明示により全体を本明細書の一部とする、Hemmer, B., et al. (1998) J. Immunol., 160:3631−3636; Walden, P., et al. (1995) Biochemical Society Transactions, 23; Anderton, S.M., et al., (1999) Eur. J. Immunol., 29:1850−1857; Correia−Neves, M., et al., (1999) J. Immunol., 163:5471−5477; Shastri, N., (1995) Curr. Op. Immunol., 7:258−262; Hiemstra, H.S., (2000) Curr. Op. Immunol., 12:80−84; および Meister, G.E., et al., (1995) Vaccine, 13:581−591 に記載されたものが含まれる。
【0136】
他の実施態様では、標的タンパク質の天然の折畳みと安定性に影響しない領域で、T細胞エピトープを一次配列ライブラリーに導入する。T細胞エピトープは、上記のような既知のMHC I結合ペプチド、MHC II結合ペプチドおよびT細胞エピトープのデータベースから選択される。
【0137】
好ましい実施態様では、一次変異配列は、抗体に結合すると予測されるペプチド断片についてスクリーニングする。好ましい実施態様では、Meyer らによって記載されたように(Meyer, D.L., et al. (2001), Protein Sci., 10:491−503; Schwartz, HL., et al. (1999) J. Mol Biol. 287:983−999; および Laroche, Y., et al., (2000) Blood, 96:1425−1432 も参照)、可能性のあるB細胞エピトープをより小さい中性残基で置換し、配列の免疫原性を減少させる。
【0138】
他の実施態様では、標的タンパク質の天然の折畳みと安定性に影響しない領域で、B細胞エピトープを一次配列ライブラリーに導入する。特に、標的タンパク質表面に荷電、芳香族、または大型疎水性残基を付加する。
【0139】
好ましい実施態様では、MHCクラスIまたはクラスII分子、TCRまたはBCRと相互作用する能力のある少なくとも1つの配列が改変された、少なくとも1つの候補変異タンパク質を同定する。可能性があるか、または実際のMHC、TCRまたはBCR配列を同定するいかなる方法も、本発明で使用し得る。許容し得る方法には、コンピューター処理的または物理的方法が含まれる。許容し得るコンピューター処理方法には、OptiMer と EpiMer (Meister, GE., et al. (1995) Vaccine, 6:581−591); 相互作用段階的判別手段分析金属アルゴリズム(iterative stepwise discriminant analysis metal algorithm)(Mallios, RR., (1999) Bioinformatics, 15:432−439);および構造ベースのもの (Altuvia, Y., (1997) Human Immunology 58:1−11)および進化的アルゴリズムと人工神経ネットワークを組合せた予測方法(Brusic, V., et al. (1998) Bioinformatics, 14:121−130)、仮想的マトリックス (Sturniolo, T., et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:555−561) および BONSAI 決定ツリー (Savoie, CJ., et al (1999) Pac Symp Biocomput., 182−9)などのアルゴリズムの使用が含まれる。
【0140】
許容し得る物理的方法には、高親和性結合アッセイ(Hammer, J., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4456−4460; Sarobe, P. et al. (1998) J. Clin. Invest., 102:1239−1248)、T細胞増殖およびCTLアッセイ (Hemmer, B., et al., (1998) J. Immunol., 160:3631−3636)が含まれる。
【0141】
可能性のあるMHC、TCRまたはBCR配列を同定したら、次いで下記のように1個またはそれ以上のアミノ酸の置換によりこれらの配列を変更する。一旦候補変異タンパク質を変更したら、その後該タンパク質を試験して、その活性が標的タンパク質と同様か否かを判定する。変異体は、十分な活性を保持しているか、十分な割合の活性を有用に保持し得る。
【0142】
本発明の変異タンパク質および核酸は、天然産生の標的タンパク質と区別できる。本明細書における「天然産生」または「野生型」または文法的均等物は、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子変化を含む;つまり、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、通常は意図的に変更されていない。従って、本明細書における「非天然産生」または「合成」または「組換え」またはそれらの文法的均等物は、天然に見出されないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する;つまり、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、通常は意図的に変更されている。一旦組換え核酸が作成され、宿主細胞または生物に再導入されると、それは非組換え的に、即ち、インビトロの操作よりもむしろインビボで宿主細胞の細胞機構を使用して、複製されるが、一旦組換え的に産生された核酸は、以後は非組換え的に複製されても、本発明のためにはなお組換え体と考えられることが理解される。従って、本発明の変異タンパク質および核酸は、非天然産生である;つまり、これらは天然には存在しない。
【0143】
従って、好ましい実施態様では、変異タンパク質は、少なくとも残基の1−5%まで標的配列と異なるアミノ酸配列を有する。つまり、本発明の変異タンパク質は標的アミノ酸配列と約97−99%以下同一である。従って、タンパク質は、標的配列に対するタンパク質配列の包括的相同性が好ましくは約99%以下、より好ましくは約98%以下、さらにより好ましくは約97%以下、そしてより好ましくは約95%以下であるならば、「候補変異タンパク質」である。いくつかの実施態様では、相同性は約75−80%程も低い。
【0144】
この文脈における相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。当業界で既知のように、タンパク質(または以下に考察するように核酸)が既知配列と配列同一性または類似性を有しているか否かを同定するために多数の異なるプログラムを使用できる。配列同一性および/または類似性は技術上周知の標準的技法を使用して測定され、それには、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981) の局所配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970) の配列同一性アラインメント、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444 (1988) の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI、中の GAP、BESTFIT、FASTA および TFASTA)、Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12: 387−395 (1984) に記載の Best Fit 配列プログラムを含むがこれらに限定されるわけではなく、好ましくはデフォルト設定を使用し、または検定により使用する。好ましくは、FstDB により以下のパラメータに基づいてパーセント同一性を計算する:mismatch penalty 1; gap penalty 1; gap size penalty 0.33; joining penalty 30、”Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127−149 (1988), Alan R. Liss, Inc. である。全参照文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
【0145】
有用なアルゴリズムの一例は PILEUP である。PILEUP は、漸進的対アラインメントを用いて関連配列群から多重配列アラインメントを創出する。それはまた、アラインメント創出に使用される、クラスタリングの関係を示すツリーを描くことができる。PILEUP は、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351−360 (1987)の漸進的アラインメント法を簡略化したものを用いる;この方法は Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151−153 (1989) 記載の方法と類似している。有用な PILEUP パラメータは、a default gap weight 3.00, a default gap length weight 0.10, weighted end gaps を含む。
【0146】
有用なアルゴリズムのもう1つの例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403−410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389−3402 (1997);および Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873−5787 (1993) に記載の BLAST アルゴリズムである。特に有用な BLAST プログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460−480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html] から得られる WU−BLAST−2 プログラムである。WU−BLAST−2 はいくつかの検索パラメータを使用するがその殆どはデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは以下の値で設定する:overlap span =1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11である。HSP S および HSP S2 パラメータは動的数値であり、特定の配列の組成および興味の対象である配列を検索する特定のデータベースの組成に依存してプログラム自身により確立されるが、値は感度を上げるように調節し得る。
【0147】
これに加えて有用なアルゴリズムは、Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25: 3389−3402 に報告されている gapped BLAST である。gapped BLAST は BLOSUM−62 代替スコアを使用する;ここで閾値Tパラメータは9に設定し;2−ヒット法によりギャップのない伸長を引き起こし;ギャップ長kにコスト10+kを課し;Xuを16に設定し;Xgをデータベース検索段階では40に、そしてアルゴリズムのアウトプット段階では67に設定する。ギャップドアラインメントは約22ビットまでに相当するスコアで開始される。
【0148】
パーセントアミノ酸配列同一性の値は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より長い」配列の総残基数で割って決定される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有するものである(アラインメントスコアを最大化するために WU−Blast−2 により導入されたギャップを無視する)。
【0149】
同様にして、本発明で同定されるポリペプチドのコード配列に関する「パーセント(%)核酸配列同一性」を、標的タンパク質のコード配列のヌクレオチド残基と同一な、候補配列中のヌクレオチド残基の割合として定義する。好ましい方法は、WU−BLAST−2 の BLASTN モジュールをデフォルトパラメータに設定し、重複スパンおよび重複フラクションをそれぞれ1および0.125に設定して利用する。
【0150】
アラインメントは、アラインメントを行う配列中へのギャップ導入を含んでもよい。加えて、標的タンパク質より多いかまたは少ないアミノ酸を含有する配列については、ある実施態様では、配列同一性の割合は、アミノ酸総数に関する同一アミノ酸数に基づいて決定されると理解される。パーセント同一性の計算においては、相対的重みは、挿入、欠失、置換その他のような種々の配列変化の表出には割り当てられない。
【0151】
ある実施態様では、同一性のみがプラスのスコアを与えられ(+1)、ギャップを含むあらゆる形態の配列変化に「0」の値が割り当てられる。これにより、配列類似性計算について後述するような、重みをつけた目盛りまたはパラメータの必要性がなくなる。例えば、パーセントアミノ酸配列同一性は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より短い」配列の総残基数で割り、100を掛けて算出される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有するものである。
【0152】
従って、本発明の変異タンパク質は、標的タンパク質よりも、短くても長くてもよい。標的配列の部分または断片が、変異タンパク質の定義に包含される。変異タンパク質の断片は、a)少なくとも1つの抗原エピトープを共有する;b)少なくとも指示された相同性を有する;c)そして好ましくは標的タンパク質の生物学的活性を示す場合、変異αタンパク質とみなされる。
【0153】
下記でより詳細に概説するように、好ましい実施態様では、候補変異タンパク質は、標的タンパク質と比較して、本明細書に概説するものよりもさらにアミノ酸変化を含む。加えて、本明細書に概説するように、さらなる新規変異タンパク質を形成するために、本明細書に描写する任意の変化をいかなる方法で組合せてもよい。
【0154】
加えて、例えば出典明示により本明細書の一部とするU.S.S.N. 09/798,789に記載のように、精製タグ、融合配列などの他の配列を付加することにより、標的タンパク質よりも長い候補変異タンパク質を作成できる。例えば、本発明の変異タンパク質を、他の治療的タンパク質または薬物動体学的な目的でFcもしくは血清アルブミンなどの他のタンパク質と融合させてもよい。例えば、両方とも出典明示により本明細書の一部とする米国特許番号第5,766,883号および第5,876,969号を参照されたい。
【0155】
コア、表面、および境界残基に可変残基を含む変異タンパク質も、発明の内に含まれる。
【0156】
好ましい実施態様では、本発明の変異タンパク質は、ヒトのコンフォマー(conformer)である。本明細書における「コンフォマー」は、事実上同一の主鎖3D構造を有するが、アミノ酸側鎖に顕著な差異を有するタンパク質を意味する。つまり、本発明の変異タンパク質は、セットの全タンパク質が主鎖構造を共有し、なお少なくとも1−3−5%まで異なる配列を有する、コンフォマーのセットを定義する。変異タンパク質の3次元主鎖構造は、従ってヒト標的タンパク質の3次元主鎖構造と実質的に相応する。
【0157】
この文脈における「主鎖」は、非側鎖原子、即ち窒素、カルボニル基の炭素および酸素、およびα炭素、並びに窒素およびα炭素に結合した水素を意味する。コンフォマーを考慮すると、タンパク質はヒト標的タンパク質構造から2Åを超えない主鎖原子を持たねばならず、1.5Åを超えないのが好ましく、1Åを超えないのが特に好ましい。一般に、これらの距離は2つの方法で決定される。ある実施態様では、可能性のある各コンフォマーを結晶化し、その3次元構造を決定する。あるいは、前者は技術的に難しいので、各可能性のあるコンフォマーの配列をPDAプログラムで実行し、それがコンフォマーであるか否かを判定する。
【0158】
候補変異核酸にコードされるものとして、候補変異タンパク質を同定してもよい。核酸の場合、核酸配列の包括的な相同性はアミノ酸相同性と同一基準であるが、遺伝コードの縮重と様々な生物のコドン偏重を考慮に入れる。従って、核酸配列相同性は、タンパク質配列のものよりも低くても高くてもよく、低い相同性が好ましい。
【0159】
好ましい実施態様では、候補変異核酸は、候補変異タンパク質をコードする。当業者に理解されるように、遺伝暗号の縮重のために、すべて本発明の変異タンパク質をコードする、極めて多数の核酸を作成し得る。ゆえに、特定のアミノ酸配列を同定すれば、当業者は、変異タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で、単純に1つまたはそれ以上のコドンの配列を変更することにより、異なる核酸をいくつでも作成し得る。
【0160】
ある実施態様では、核酸相同性はハイブリダイゼーション研究により決定される。ハイストリンジェンシー条件は、当分野で既知である;例えば、出典明示により本明細書の一部とする Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989 および Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al. を参照のこと。ハイストリンジェント条件は配列依存的であり、環境が違えば異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−−Hybridization with Nucleic Acid Probes, ”Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993) に見出される。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびpHにおいて、特異的配列の熱融解点(Tm)より約5−10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が、平衡状態で標的配列に(規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度で)ハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するので、Tmでは、50%のプローブが平衡状態で占有される)。ストリンジェント条件は、そこでは塩濃度が約1.0Mナトリウムイオンより低く、典型的には約0.01ないし1.0Mのナトリウムイオン(または他の塩)濃度、pH7.0ないし8.3、温度が、短いプローブ(例えば、10ないし50のヌクレオチド)には低くても約30℃、長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド以上)には低くても約60℃であるもの、である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化させる物質の添加により達成されてもよい。
【0161】
他の実施態様では、より低いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件を使用する;例えば、当分野で既知のように、モデレートまたはローストリンジェンシー条件を使用してもよい;Maniatis and Ausubel(前出)および Tijssen(前出)を参照のこと。
【0162】
本発明の候補変異タンパク質と核酸は、組換え体である。本明細書で使用される「核酸」は、DNAもしくはRNA、またはデオキシ−およびリボヌクレオチドの両者を含有する分子を表わし得る。核酸は、ゲノムDNA、cDNAおよびオリゴヌクレオチドを含み、センスおよびアンチセンス核酸を含む。このような核酸はまた、生理的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、リボース−リン酸バックボーンに変更を含んでいてもよい。
【0163】
核酸は2本鎖、1本鎖であってよく、または2本鎖もしくは1本鎖の配列の両方の部分を含有してもよい。当業者に認識されるように、1本鎖(「ワトソン」)を描けばもう1つの鎖(「クリック」)の配列が規定され、ゆえに図6に示す配列は、該配列の相補鎖もまた含む。本明細書における「組換え核酸」の用語は、一般的に、核酸をエンドヌクレアーゼによって操作して、天然には通常見出されない形状で、当初はインビトロで形成した核酸を意味する。ゆえに、線状形状で単離された候補変異核酸や、通常は結合していないDNA分子をライゲーションすることによりインビトロで形成した発現ベクターは、両者とも本発明のためには組換え体と考えられる。一旦組換え核酸が作成され宿主細胞または生物に再導入されたら、それは非組換え的に、即ち、インビトロの操作ではなく宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して複製すると理解される;しかしながら、そのような核酸は一旦組換え的に産生されれば、以後は非組換え的に複製しても、本発明のためにはなお組換え体と考えられる。
【0164】
同様に、「組換えタンパク質」は組換え技法を使用して、即ち上述のように組換え核酸の発現を通して作成されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも1つまたはそれ以上の特性によって、天然産生のタンパク質と区別される。例えば、このタンパク質は、野生型宿主中で通常会合しているタンパク質または化合物の一部または全てから単離または精製され、従って実質的に純粋であり得る。例えば、単離されたタンパク質は、天然状態では通常会合している物質の少なくとも一部を伴わないで、所定の試料中の総タンパク質重量の好ましくは少なくとも約0.5%、より好ましくは少なくとも5%を構成している。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質重量の少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、そして特に好ましくは少なくとも約90%を含む。この定義には、ある生物由来の候補変異タンパク質を異なる生物または宿主細胞中で生産することが含まれる。あるいは、タンパク質がより増加した濃度レベルで作成されるように、誘導可能プロモーターまたは高発現プロモーターを使用することにより、タンパク質を通常見られるよりも有意に高濃度で作成し得る。さらに、以下に考察するように、本明細書で概説する全ての変異タンパク質は、アミノ酸置換、挿入および欠失、好ましくは置換、を含むので、天然に通常は見出されない形態である。
【0165】
本明細書で概説する候補変異配列のアミノ酸配列変異体も、本発明の候補変異タンパク質の定義に包含される。つまり、候補変異タンパク質は、標的タンパク質と比較して、さらなる可変位置を含有し得る。これらの変異体は、置換、挿入または欠失変異体の3分類の1つまたはそれ以上に相当する。これらの変異体は通常、カセット式またはPCR式変異導入または当分野で周知の他の技法を使用して、候補変異タンパク質をコードするDNA中のヌクレオチドの部位特異的変異導入により、変異体をコードするDNAを産生し、その後上記概説したようにDNAを組換え培養細胞中で発現させることにより調製する。しかしながら、約100〜150残基までを有する候補変異タンパク質断片を、確立された技法を使用してインビトロ合成で調製し得る。アミノ酸配列変異体は変化が予め決定されているという性質によって特徴付けられ、この特徴によって、これらの変異体は、候補変異タンパク質のアミノ酸配列の天然産生の対立遺伝子変異体または種間変異体から区別される。変異体は典型的に、天然産生の類似体と同じ定性的な生物学的活性を発揮するが、以下にさらに詳しく略述するように、変更された特徴を有する変異体を選択することもできる。
【0166】
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は予め決定されるが、変異自体は予め決定しておく必要はない。例えば、所定の部位における変異の実施を最適化するために、標的コドンまたは領域でランダム変異誘発を起こし、発現した変異タンパク質をスクリーニングして所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。既知配列を有するDNA中の予め定められた部位に置換変異を作成する技法は周知であり、例えば、M13プライマーによる変異導入およびPCRによる変異導入がある。
【0167】
アミノ酸置換は典型的には単一の残基である;かなり大きな挿入も許容され得るが、挿入は通常、約1〜20アミノ酸の単位で行われる。欠失は、より大きな場合もあるが、約1から約20残基の範囲である。
【0168】
最終誘導体に到達するために、置換、欠失、挿入またはそれらのいかなる組合せを用いてもよい。一般的に、これらの変化は、分子の改変を最小限にするために少数のアミノ酸について行われる。しかしながら、より大きな変化も一定の状況では許容され得る。変異タンパク質の特徴について小さな改変が望まれる場合は、置換は一般的に次のチャートに従って作成される。
【表1】
【0169】
機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、チャートIに示したものより保存性の低い置換を選択することによって作成される。例えば、より大きく影響する置換を作成できる:それらは、改変する区域のポリペプチド主鎖構造、例えばアルファ−ヘリックス構造またはベータ−シート構造;標的部位での分子の電荷または疎水性;または側鎖の大きさである。一般的にポリペプチドの特性に最も大きな変化を生じると期待される置換は(a)親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルに置換する(またはその逆)、(b)システインまたはプロリンを他のいずれかの残基に置換する(またはその逆)、(c)正電荷を持つ側鎖、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルを、負電荷を持つ側鎖、例えばグルタミル、アスパルチルに置換する(またはその逆)、または(d)大きい側鎖を持つ残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を持たない残基、例えばグリシンに置換する(またはその逆)、ものである。
【0170】
典型的には、変異体は定性的に同じ生物学的活性を発揮するが、必要に応じて免疫応答は元来の候補変異タンパク質のものから改変されていてもよい。あるいは、変異体を候補変異タンパク質の生物学的活性が改変されるように設計することができる。例えば、グリコシル化部位を改変または除去し得る。同様に、生物学的機能も改変し得る。
【0171】
加えて、いくつかの実施態様では、標的タンパク質よりも安定である、免疫原性が改変された候補変異タンパク質を得るのが望ましい。好ましくは、酸化安定性、アルカリ安定性、熱安定性を示すタンパク質を得るのが望ましい。
【0172】
酸化安定性の変化は、様々な酸化条件にさらされたときに、変異タンパク質の活性が、野生型タンパク質のものと比較して少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約50%増加することにより明示される。酸化安定性は、既知方法により測定される。
【0173】
アルカリ安定性の変化は、上昇または低下するpH条件にさらされたときに、変異タンパク質活性の半減期が、野生型タンパク質のものと比較して、少なくとも約5%またはそれ以上増加または減少(好ましくは増加)することにより明示される。一般に、アルカリ安定性は、既知方法により測定される。
【0174】
熱安定性の変化は、比較的高い温度と中性pHにさらされたときに、変異タンパク質活性の半減期が、野生型タンパク質のものと比較して少なくとも約5%またはそれ以上増加または減少(好ましくは増加)することにより明示される。一般に、熱安定性は、既知方法により測定される。
【0175】
本発明の候補変異タンパク質および核酸は、数々の方法で作成できる。個々の核酸およびタンパク質は、当分野で既知のように、また以下に概説するように作成できる。あるいは、候補変異タンパク質のライブラリーを試験用に作成できる。
【0176】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質ライブラリーは確率分布表から生成される。本明細書に概説するように、PDA(登録商標)技法、配列アラインメント、自己無撞着性平均力場(self−consistent mean field; SCMF)計算などの力場計算などを含む、確率分布表を生成させる様々な方法がある。加えて、ライブラリーで観察される変異頻度の測定として各位置についてエントロピースコアの情報を生成させるために、確率分布を使用できる。
【0177】
この実施態様では、リスト中の各可変位置における各アミノ酸残基の頻度を同定する。各頻度は、カットオフより低い変異頻度を全てゼロとセットした場合の閾値であり得る。このカットオフは、好ましくは、約1%、2%、5%、10%または20%であり、特に好ましいのは約10%である。これらの頻度は、次いで候補変異タンパク質ライブラリー中に組込む。即ち、上記のように、これらの可変位置を集め、そしてあらゆる可能性のある組合せを生成させるが、候補変異タンパク質ライブラリーを「満たす」アミノ酸残基は頻度ベースで利用する。従って、ある頻度ベースでない候補変異タンパク質ライブラリー中では、5つの可能性のある残基を有する1つの可変位置が、可能性がある第1残基を有するその可変位置を含むタンパク質を約20%、第2のそれを20%、以下同、を有するであろう。しかしながら、頻度ベースの候補変異タンパク質ライブラリーでは、それぞれ約10%、15%、25%、30%および20%の頻度で、5つの可能性のある残基を有する1つの可変位置は、可能性がある第1残基を有するその可変位置を含むタンパク質を10%、第2残基を有するタンパク質を15%、第3のそれを25%、以下同、を有するであろう。当業者には明らかなように、実際の頻度は実際にタンパク質生成に使用した方法によって変り得る;例えば、正確な頻度はタンパク質を合成した時に可能であり得る。しかしながら、以下に概説する頻度ベースのプライマー系を使用する場合は、各位置における実際の頻度は後述のように変化する。
【0178】
当業者に認識されるように、そして本明細書で概説するように、確率分布表は種々の方法で生成させることができる。本明細書で概説した方法に加えて、確率表の直接的生成において、自己無撞着性平均力場(SCMF)法を使用できる。SCMFは、回転異性体相互作用の平均力場の記載を使用してエネルギーを計算する決定論的コンピュータ処理方法である。この方法で形成された確率表は、本明細書に記載のような候補変異タンパク質ライブラリーを創出するのに使用できる。SCMFは3通りに使用できる:アミノ酸および各アミノ酸の回転異性体の頻度を各位置についてリストする;確率をSCMFから直接決定する(出典明示により本明細書の一部とする Delarue et la. Pac. Symp. Biocomput. 109−21 (1997) を参照のこと)。加えて、高度可変位置および非可変位置を同定できる。
【0179】
あるいは、配列空間探索中にどの配列にジャンプするかを決定するために、別の方法が使用される;SCMFはその配列について正確なエネルギーを得るために用いられる;このエネルギーは次いでそれをランク付けし、(モンテカルロ配列リストに類似の)配列のランク順リストを創出するのに使用される。次いで各位置におけるアミノ酸の頻度を示す確率表がこのリストから計算される(Koehl et al., J. Mol. Biol. 239: 249 (1994); Koehl et al., Nat. Struc. Biol. 2: 163 (1995); Koehl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 222 (1996); Koehl et al., J. Mol. Bio. 293: 1183 (1999); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293: 1161 (1999); Lee J. Mol. Biol. 236: 918 (1994); and Vasquez Biopolymers 36: 53−70 (1995);いずれも、特に出典明示により本明細書の一部とする)。
【0180】
類似の方法としては、OPLS−AA (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225−11236; Jorgensen, W.L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT (1999)); OPLS (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff; Jorgensen, et al., J Am. Chem. Soc. (1990), v 112, pp 4768ff);UNRES (United Residue Forcefield; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp 1697−1714; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp1715−1731; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp 849−873; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp 874−884; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp 259−276); Forcefield for Protein Structure Prediction(Liwo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp 5482−5485);ECEPP/3(Liwo et al., J Protein Chem 1994 May;13(4): 375−80); AMBER 1.1 力場 (Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. v 106, pp 765−784);AMBER 3.0 力場 (U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 755−759);CHARMM および CHARMM22 (Brooks, et al., J. Comp. Chem. v4, pp 187−217);cvff3.0(Dauber−Osguthorpe, et al.,(1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v 4,pp 31−47); CFF91(Maple, et al., J. Comp. Chem. v 15, 162−182)が含まれるが、これらに限定されるわけではない;また、DISCOVER(cvffおよびcff91)および AMBER 力場は INSIGHT 分子モデリングパッケージ(Biosym/MSI, San Diego California)で使用され、そして HARM は QUANTA 分子モデリングパッケージ(Biosym/MSI, San Diego California)で使用される。
【0181】
加えて、本明細書で概説するように、確率分布表生成の好ましい方法は配列アラインメントプログラムの使用を介するものである。加えて、確率表は配列アラインメントおよびコンピューター処理によるアプローチの組合せで得られる。例えば、相同配列のアラインメントで見出されたアミノ酸をコンピューター処理の結果に付加できる。好ましくは、確立表に一致する野生型アミノ酸を、もしそれがコンピューター処理で見出されない場合に付加できる。
【0182】
明らかとなるであろうが、可変位置および/または可変位置における残基を組換えて創出した候補変異タンパク質ライブラリーは、ランク順になっていない。いくつかの実施態様では、全リストを作成し、試験するだけでよい。あるいは、好ましい実施態様では、この二次ライブラリーもランク順リスト形態にある。これは、二次ライブラリーの大きさが実験的に生成させるにはまだ大きすぎること、または予測上の目的を含む、いくつかの理由で行い得る。これは数種の方法で実施できる。ある実施態様では、ライブラリー構成員をランク付けするPDAのスコア付け機能を使用して、二次ライブラリーをランク付けする。あるいは、統計的手法を使用できる。例えば、この二次ライブラリーは、頻度スコアによってランク付けし得る;即ち、高頻度残基の大部分を含有するタンパク質を高くランク付けすること、等が可能であろう。これは、数値的スコアを生成させるために、各可変位置において頻度を加算するかまたは乗ずることによっても行い得る。同様にして、二次ライブラリーの様々な位置に重みを付け、次いでタンパク質をスコア付けできる;例えば、ある残基を含有するものを任意にランク付けできる。
【0183】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリーの異なるタンパク質構成員を化学的に合成できる。これは、設計したタンパク質が短い場合、好ましくは150アミノ酸長以下、より好ましくは100アミノ酸長以下、特に好ましくは50アミノ酸長以下である場合に特に有用であるが、当業界で既知のように、より長いタンパク質でも、化学的または酵素的に調製し得る。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Wilken et al, Curr. Opin. Biotevhnol. 9: 412−26 (1998) 参照。
【0184】
好ましい実施態様では、特により長いタンパク質または大型サンプルが望まれるタンパク質について、候補変異配列を、構成員配列をコードしており、そして宿主細胞中にクローン化し、所望により発現および分析できるDNAのような核酸を生成させるために使用する。従って、各構成員タンパク質配列をコードする核酸および特にDNAを作成できる。これは周知の方法を使用して行う。コドン、適する発現ベクター、および適する宿主細胞の選択は、数々の要因によって変化し、また必要に応じて容易に最適化できる。
【0185】
好ましい実施態様では、図1に一般的に示すように、プールしたオリゴヌクレオチドを用いる複数のPCR反応を実施する。この実施態様では、全長遺伝子に対応する重なり合ったオリゴヌクレオチドを合成する。また、これらのオリゴヌクレオチドは、各変異位置またはサブセットにおいて異なるアミノ酸の全てを表し得る。
【0186】
好ましい実施態様では、これらのオリゴヌクレオチドを等しい割合でプールし、複数のPCR反応を実施して、二次ライブラリーで定義された変異の組合せを含有する全長配列を創出する。加えて、このことは、誤りがちなPCR(error−prone PCR)の方法を使用して行い得る。
【0187】
好ましい実施態様では、様々なオリゴヌクレオチドを、確率分布表に対応する相対量で加える。従って、複数のPCR反応は、所望の変異の組合せを所望の割合で有する全長配列をもたらす。
【0188】
必要なオリゴヌクレオチドの総数は、変異させる位置の数およびそれらの位置で考慮される変異の数の関数である。
(不変位置に対するオリゴ数)+M1+M2+M3+・・・Mn=(必要オリゴの総数)、但し、Mnはその配列の位置nにおいて考慮される変異の数である。
【0189】
好ましい実施態様では、各重複オリゴヌクレオチドは、変異させようとする位置を1つだけ含む;別の実施態様では、変異位置が互いに近接しすぎてこのことを不可能にし、各オリゴヌクレオチド当たり複数の変異を使用して可能性のある全ての組換えを完成させる。即ち、各オリゴは、変異させようとする単一位置か、または変異させようとする1以上の位置のコドンを含有できる。変異させようとする複数位置は、オリゴの長さが非実用的になるのを防ぐために、配列内で近接していなければならない。
【0190】
あるオリゴヌクレオチド上の複数の変異位置に対して、特定の変異の組合せをコードしているオリゴヌクレオチドを包含または排除することにより、該組合せをそのライブラリー中で包含または排除できる。例えば、本明細書で考察するように、可変位置間に相関関係があり得る;即ち、位置Xがある特定の残基の場合には、位置Yはある特定の残基でなければならない(または、あってはならない)。可変位置のこれらのセットは、本明細書においては時々「クラスター」と呼称される。クラスターが互いに近接した残基を含み、従って1個のヌクレオチドプライマー上に存在できるときには、クラスターは「良好な」相関に設定し、ライブラリーの有効性を減少させ得る悪い組合せを除去できる。しかしながら、クラスターの残基が配列中で離れていて、従って合成のための別のオリゴヌクレオチド上に存在するであろう場合には、残基を「良好な」相関に設定するか、または可変残基として完全に排除するのが望ましいであろう。
【0191】
別の実施態様では、クラスター変異がもっぱら一緒に現れるように、ライブラリーをいくつかの段階で創出する。この方法、即ち、変異クラスターを同定し、それを同じオリゴヌクレオチド上に置くか、またはライブラリーから除去するか、またはクラスターを保存しながらいくつかの段階でライブラリーを生成させることにより、実験的ライブラリーが、適正に折畳まれたタンパク質にかなり富むようにできる。クラスターの同定は、例えば、既知のパターン認識法の使用、変異発生頻度の比較、または実験的に生成させる配列のエネルギー解析(例えば、もし相互作用エネルギーが高ければ、位置は相関している)の使用などの多数の方法で実行することができる。これらの相関は、位置相関(例えば、位置1および2が常に一緒に変化するか、または決して一緒に変化しない)でも、配列相関(例えば、位置1に残基Aがあれば、常に位置2に残基Bがある)でもよい。
【0192】
Pattern discovery in Biomolecular Data: Tools, Techniques, and Applications; edited by Jason T.L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shasha. New York: Oxford University, 1999; Andrews, Harry C. Introduction to mathematical techniques in pattern recognition; New York, Wiley−lnterscience [1972]; Applications of Pattern Recognition; Editor, K.S. Fu. Boca Raton, Fla. CRC Press, 1982; Genetic Algorithms for Pattern Recognition; edited by Sankar K. Pal, Paul P. Wang. Boca Raton: CRC Press, c1996; Pandya, Abhijit S., Pattern recognition with neural networks in C++ / Abhijit S. Pandya, Robert B. Macy. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1996; Handbook of pattern recognition & computer vision / edited by C.H. Chen, L.F. Pau, P.S.P. Wang. 2nd ed. Singapore; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999; Friedman, Introduction to Pattern Recognition: Statistical, Structural, Neural, and Fuzy Logic Approaches; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999, Series title: Series in machine perception and artificial intelligence; vol. 32、これらは全て出典明示により本明細書の一部とする、を参照のこと。加えて、共通モチーフの探索に使用するプログラムも同様に使用できる。
【0193】
加えて、相関および混合は、オリゴヌクレオチドの設計を改変することにより、即ち、オリゴヌクレオチド(プライマー)をどこで開始および停止するか(例えばどこで配列を「切断」するか)を定めることにより、固定または最適化することができる。オリゴの開始および停止部位は、単一のオリゴヌクレオチド中に現れるクラスターの数を最大にするように設定でき、それにより、ライブラリーをより高いスコアの配列に富ませる。様々なオリゴヌクレオチドの開始および停止部位のオプションをコンピューター処理でモデル化し、単一のオリゴ上に表されるクラスターの数に従って、または予測された配列ライブラリーに合致する、生じた配列の割合に従ってランク付けを行うことができる。
【0194】
必要となるオリゴヌクレオチドの総数は、複数の変異可能位置が単一のオリゴヌクレオチドによりコードされるとき、増加する。アニールリングした領域は一定のままのもの、即ち、参考配列の配列を有するものである。
【0195】
長さが異なるタンパク質を発現するライブラリーを創出するために、コドンを挿入または欠失したオリゴヌクレオチドを使用できる。特に、挿入または欠失のためのコンピューター処理配列スクリーニングにより、長さが異なるタンパク質を定義する二次ライブラリーを得ることができ、それらのタンパク質は、プールした様々な長さのオリゴヌクレオチドのライブラリーにより発現させ得る。
【0196】
好ましい実施態様では、二次ライブラリーは、ファミリー(例えば、変異体のセット)の混合により実施される;つまり、(ランク順リストを使用する場合、)誤りがちなPCRを用いるか、または用いずに、いくつかの上位配列のセットを混合できる。この文脈での「混合」は、一般にランダムに行われる、関連配列の組換えを意味する。それには、米国特許番号第5,830,721号;第5,811,238号;第5,605,793号;第5,837,458号およびPCT US/19256(すべて、これらの全部分を出典明示により本明細書の一部とする)に定義および例示されているような「混合」が包含される。この配列のセットは、人工のセットも可能である;例えば、確率表(例えばSCMFを使用して生成されるもの)やモンテカルロのセットに由来する。同様に、「ファミリー」は、上位の10配列と下位の10配列、上位100配列、などであり得る。また、このことは誤りがちなPCRによっても行い得る。
【0197】
従って、好ましい実施態様では、本明細書に記載のコンピューター処理方法を使用して、インシリコ(in silico)混合を行う。つまり、2つのライブラリーまたは2つの配列のどちらかで開始し、ランダムな配列の組換えを生成させ、評価することができる。
【0198】
好ましい実施態様では、誤りがちなPCRを行って二次ライブラリーを生成させる。米国特許番号第5,605,793号、第5,811,238号、および第5,830,721号参照(これらの全部を出典明示により本明細書の一部とする)。これは、最適配列またはライブラリーの上位構成員、または他の人工セットもしくはファミリー上で行える。この実施態様では、一次ライブラリーのコンピューター処理スクリーニングで見出した最適配列に対する遺伝子を合成できる。次いで、誤りがちなPCRを、二次ライブラリーの変異位置で変異をコードしているオリゴヌクレオチド(偏りのある(bias)オリゴヌクレオチド)の存在下で、最適配列遺伝子上で実施する。オリゴヌクレオチドの添加により、二次ライブラリー中に変異の導入に有利となる偏りが創出される。あるいは、ライブラリーを偏らせるのに、ある一定の変異のためのオリゴヌクレオチド群のみを使用し得る。
【0199】
好ましい実施態様では、偏りのあるオリゴヌクレオチドの存在下に、誤りがちなPCRによる遺伝子の混合を最適配列の遺伝子上で実施し、二次ライブラリー中に見出される各変異の割合を反映しているDNA配列ライブラリーを創出できる。偏りのあるオリゴヌクレオチドの選択は、各種の方法で行える;それらは、それらの頻度に基づいて選択できる、即ち、変異頻度の高い位置をコードしているオリゴヌクレオチドを使用でき;あるいは、多様性が増加するように、最も変異しやすい位置を含有するオリゴヌクレオチドを使用でき;もし二次ライブラリーがランク付けされるなら、上位スコアの位置のいくつかを、偏りのあるオリゴヌクレオチドの生成に使用でき;ランダムな位置を選択することもでき;上位スコアのものを少数と低スコアのものを少数選択し得る;等である。重要なことは、好ましい変異位置および配列に基づいて新規配列を生成させることである。
【0200】
好ましい実施態様では、図1に概略を描写するように、野生型遺伝子または標的遺伝子を用いるPCRを使用できる。この実施態様では、開始遺伝子を使用する;要件ではないが、一般にその遺伝子は野生型遺伝子である。それは大域的最適配列またはリストにある任意の他の配列をコードする遺伝子である場合がある。この実施態様では、変異位置に対応し、二次ライブラリーの様々なアミノ酸を含有するオリゴヌクレオチドを使用する。当分野で周知のように、PCRは末端でPCRプライマーを用いて行う。これには2点の利点がある;第1にオリゴヌクレオチドが少なくて済み、誤りを少なくできる。加えて、野生型遺伝子を使用する場合、合成する必要がないという実験上の利点がある。
【0201】
加えて、図2−5に例示するように、使用できる他のいくつかの技法がある。好ましい実施態様では、PCR産物のライゲーションを行う。
【0202】
好ましい実施態様では、1つまたはそれ以上の候補変異二次ライブラリーに対して、様々な付加的な段階を行える;例えば、さらなるコンピューター処理を施すことができ、候補変異二次ライブラリーを再び組合せることができ、あるいは異なる候補変異二次ライブラリーからのカットオフを組合せることができる。好ましい実施態様では、候補変異二次ライブラリーをコンピューター処理により再操作してさらなる二次ライブラリー(本明細書で「三次ライブラリー」と呼ぶときがある)を形成し得る。例えば、任意の候補変異二次ライブラリー配列を、第1二次ライブラリー中の変化位置の一部または全てを凍結または固定することにより、PDAの第2ラウンド用に選択できる。あるいは、最後の確率分布表中にみられる変化のみを許容する。あるいは、確率表のストリンジェンシーを、含めるカットオフを増加させるかまたは減少させるかのいずれかにより変更し得る。同様にして、候補変異二次ライブラリーを第1ラウンド後に実験的に組換え得る;例えば、第1スクリーニング由来の最良遺伝子/遺伝子群を取り、遺伝子組み立てを再び行う(以下に概説する技術、複数PCR、誤りがちなPCR、混合、等を使用して)。あるいは、いくつかの位置における確率を変えるための、1つまたはそれ以上の良好遺伝子(群)由来の断片。これは、第1ラウンドのコンピューター処理的および実験的スクリーニングにおいて見出された配列空間の区域の探索を偏らせる。
【0203】
好ましい実施態様では、候補変異二次ライブラリーを組合せることから三次ライブラリーを生成できる。例えば、本明細書で概説するようにコンピューター処理的または実験的に、候補変異二次ライブラリーから確率分布表を生成させて組換える。PDA(登録商標)技法の候補変異二次ライブラリーを配列アラインメントライブラリーと組合せてもよく、(再度、コンピューター処理的または実験的に)組換えるか、単に各々からのカットオフを合わせるかして、新しい三次ライブラリーを作成してもよい。数個のライブラリーからの上位配列を再び組合せることができる。一次および二次ライブラリーを、同様に組合せることができる。あるライブラリーの上位からの配列を、そのライブラリーの下位からの配列と組合せてより広い配列空間をサンプリングすることができ、あるいはライブラリーの上位から離れた配列のみを組合せることができる。タンパク質の様々な部分を分析した候補変異二次ライブラリーを組合せて、タンパク質の組合された部分を取扱う三次ライブラリーにすることができる。
【0204】
好ましい実施態様では、候補変異二次ライブラリーにおける相関を使用して、三次ライブラリーを生成できる。つまり、第1可変位置の残基を第2可変位置の残基に相関させる(または同様にさらなる位置の残基に相関させる)ことができる。例えば、第1の残基がXなら第2の塩基はYでなければならないというように、2つの可変位置は立体配置的または静電気的に相互作用し得る。これは正または負の相関のどちらでもよい。
【0205】
候補変異体ライブラリー構成員をコードする本発明の核酸を使用して、様々な発現ベクターを作成する。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクター、または宿主のゲノムに組込まれるベクターのどちらでもよい。一般に、これらの発現ベクターは、ライブラリータンパク質をコードする核酸に機能し得るように結合した、転写および翻訳調節核酸を含む。「制御配列」の用語は、特定の宿主生物中で機能し得るように結合したコード配列の発現に必要なDNA配列を表す。原核生物に適する調節配列には、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、そしてリボソーム結合部位が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【0206】
核酸が別の核酸配列と機能的関係にある状況に置かれたとき、核酸は「機能し得るように結合」されている。例えば、前駆配列または分泌リーダーに関するDNAは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのDNAに機能し得るように結合されている;プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響するならば、コード配列に機能し得るように結合されている;またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するような位置にあるならば、コード配列に機能し得るように結合されている。一般的に、「機能し得るように結合」するとは、結合されるDNA配列が隣接していることを、そして、分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディング・フェーズ(reading phase)にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接する必要はない。結合は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、常法に従い使用する。転写および翻訳調節核酸は、一般に、当業者に認識されるように、ライブラリータンパク質の発現に使用される宿主細胞に適切である;例えば、Bacillus 由来の転写および翻訳調節核酸配列は、好ましくは Bacillus でのライブラリータンパク質の発現に使用される。多様な型の適当な発現ベクター、および適当な調節配列が、様々な宿主細胞に関して当技術分野で知られている。
【0207】
一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定はされない。好ましい実施態様では、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。
【0208】
プロモーター配列は、構成的または誘導可能プロモーター配列を含む。プロモーターは、天然産生プロモーター、ハイブリッドまたは合成プロモーターであり得る。1つ以上のプロモーターのエレメントをあわせもつハイブリッドプロモーターも、当業界で知られており、本発明で有用である。
【0209】
さらに、発現ベクターはさらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは2つの複製系を有してもよく、2生物、例えば発現用の哺乳動物または昆虫細胞およびクローニングおよび増幅用の原核生物宿主において維持され得る。さらに、組込み発現ベクターの場合、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同的な少なくとも1つの配列、そして好ましくは発現コンストラクトの両端に接する2つの相同配列を含む。組込みベクターは、ベクターに含める適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞中の特定座に導かれ得る。組込みベクター用コンストラクトおよび適切な選択およびスクリーニングプロトコールは当業界ではよく知られ、例えば、Mansouret all, Cell, 51:503 (1988) and Murray, Gene Transfer and Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 7 (Clifton: Humana Press, 1991)に記載されている。
【0210】
さらに、好ましい実施態様では、発現ベクターは、発現ベクターを含有する、形質転換した宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子を含有し、そして、特に哺乳動物細胞の場合、ベクターを含有しない細胞が一般的に死滅するため、ベクターの安定性が確保される。選択遺伝子は当業界ではよく知られており、使用する宿主細胞により異なる。本明細書における「選択遺伝子」は、選択剤に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする任意の遺伝子を意味する。適当な選択剤には、ネオマイシン(またはその類似体G418)、ブラスチシジンS、ヒスチニドールD、ベレオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシンBおよび他の薬物が含まれるが、それらに限定するものではない。
【0211】
好ましい実施態様では、発現ベクターは、遺伝子発現レベルを上昇させるために、発現される遺伝子の上流または下流にRNAスプライシング配列を含有する(Barret et al., Nucleic Acids Res. 1991; Groos et al., Mol. Cell. Biol. 1987; and Budiman et al., Mol. Cell. Biol. 1988 を参照されたい)。
【0212】
好ましい発現ベクター系は、 Mann et al., Cell, 33:153−9 (1993); Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(18):8392−6 (1993); Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:9146−50 (1995);Kinsella et al., Human Gene Therapy, 7:1405−13; Hofmann et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:5185−90; Choate et al., Human Gene Therapy, 7:2247 (1996); PCT/US97/01019 および PCT/US97/01048、並びにこれらで引用された参照文献に一般的に記載されるようなレトロウイルスベクター系であって、すべて出典明示により本明細書の一部とする。
【0213】
本発明の候補変異体ライブラリータンパク質は、核酸、好ましくはライブラリータンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ライブラリータンパク質の発現を誘導するか、または引き起こすための適切な条件下で、培養して産生する。候補変異体ライブラリータンパク質の発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変動し、日常的な実験を通じて当業者により容易に確認される。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターを使用するには、宿主細胞の成長および増殖の最適化が必要とされ、一方誘導可能プロモーターを使用するには、誘導に適した成長条件が必要とされる。さらに、いくつかの実施態様では、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルス系は溶菌ウイルスであり、そのため回収時期の選択が生成物の収率にとって重大である。
【0214】
当業者に明らかなように、本発明において使用する細胞型は広範囲に変動する。基本的には、酵母、細菌、古細菌、真菌および昆虫および哺乳動物細胞を含む動物細胞を含む、広く様々な適切な宿主細胞を使用できる。特に有利なのは、Drosophila melangaster 細胞、Saccharomyses cerevisiae および他の酵母、E. coli、Bacillus subtilis、SF9細胞、C129細胞、293細胞、ニューロスポラ(Neurospora)、BHK、CHO、COSおよびHeLa細胞、線維芽細胞、神経鞘腫細胞系、不死化哺乳動物骨髄様およびリンパ様細胞系、ジャーカット(Jurkat)細胞、マスト細胞および他の内分泌性細胞および外分泌性細胞、並びにニューロン細胞である。出典明示により本明細書の一部とするATCC細胞株カタログを参照されたい。さらに、当業界で周知のようなファージディスプレイ系における二次ライブラリーの発現は、特に二次ライブラリーがランダムペプチドを含む場合に、特に好ましい。ある実施態様では、細胞は遺伝子操作し得る、つまり、外因核酸を含有するように、例えば標的分子を含有するようにし得る。
【0215】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質を、哺乳動物細胞中で発現させる。いずれの哺乳動物細胞を使用してもよく、マウス、ラット、霊長類、ヒトの細胞は特に好ましい。当業者に理解されるように、偽型による系の変更により、全ての真核細胞、好ましくは高等真核生物の使用を可能にする。以下により詳しく記載するように、スクリーニングは、ランダムライブラリー構成員の存在下で選択可能な表現型を示すように設定する。さらに以下に詳述するように、細胞内にライブラリー構成員が存在する結果として、改変された表現型を示す細胞の選択を可能とするように、適当なスクリーンが設計され得る限り、幅広く様々な疾病症状のに関連する細胞型は、特に有用である。
【0216】
従って、適当な哺乳動物細胞型は、限定されるものではないが、全ての種類の腫瘍細胞(特に、黒色腫様、骨髄性白血病、肺癌腫、胸癌腫、卵巣癌腫、大腸癌腫、腎臓癌腫、前立腺癌腫、膵臓癌腫および精巣癌腫)、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球(T細胞およびB細胞)、マスト細胞、好酸球、血脈管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を含む白血球、造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋幹細胞などの幹細胞(分化および脱分化因子のスクリーニングで使用する)、破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝臓細胞、腎臓細胞および含脂肪細胞を包含する。また、適当な細胞は、ジャーカットT細胞、NIH3T3細胞、CHO、Cosなどを含むが、これらに限定されるものではない、既知の研究用細胞を含む。出典明示により本明細書の一部とするATCC細胞株カタログを参照のこと。
【0217】
哺乳動物発現系もまた当分野では既知であり、レトロウイルス系を含む。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物RNAポリメラーゼに結合し、ライブラリータンパク質をコードする配列のmRNAへの下流(3’)転写を開始させる能力のある任意のDNA配列である。プロモーターは、通常コード配列の5’末端近傍に位置する転写開始領域、および転写開始部位上流に位置する25−30塩基対を使用するTATAボックスを有する。TATAボックスは、RNAポリメラーゼIIに指令し、正確な部位でのRNA合成を開始させると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、典型的にはTATAボックスの上流100ないし200塩基対内に位置する、上流プロモーターエレメント(エンハンサーエレメント)を含有する。上流プロモーターエレメントは、転写開始速度を決定し、いずれかの向きで作用できる。ウイルス遺伝子は高度に発現されることが多く広い宿主範囲を有するため、哺乳動物プロモーターとして特に有用なのは哺乳動物ウイルス遺伝子由来プロモーターである。例としては、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびCMVプロモーターが含まれる。
【0218】
典型的には、哺乳動物細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの3’に位置する調節領域であり、そのためプロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟mRNAの3’末端は、部位特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、SV40由来のものがある。
【0219】
外因核酸を哺乳動物宿主ならびに他の宿主に導入する方法は、当業界ではよく知られており、使用される宿主細胞により変化する。技法には、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、ウイルス感染、リポソームにおけるポリヌクレオチド(複数も可)封入、および核へのDNAの直接マイクロインジェクションがある。
【0220】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質は、細菌系で発現する。細菌発現系は、当業者には周知である。
【0221】
適当な細菌プロモーターとは、細菌RNAポリメラーゼに結合し、ライブラリータンパク質をコードする配列のmRNAへの下流(3’)転写を開始させる能力のある任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、通常コード配列の5’末端近傍に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は典型的にはRNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースなどの糖代謝性酵素由来のプロモーター配列、およびトリプトファンなどの生合成酵素由来の配列がある。バクテリオファージからのプロモーターもまた使用され得、当業者には公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である;例えば、tac プロモーターは、trp および lac プロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼと結合し、転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然産生プロモーターを包含できる。
【0222】
機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位が望ましい。大腸菌の場合、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ(SD)配列と呼ばれ、開始コドンおよび開始コドン上流3−11ヌクレオチドに位置する3−9ヌクレオチド長の配列を含む。
【0223】
発現ベクターはまた、細菌中でライブラリータンパク質の分泌をもたらすシグナルペプチド配列も含み得る。シグナル配列は、典型的に、当業者に周知のように、細胞からのタンパク質分泌を指令する、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、成長培地(グラム陽性菌)または細胞の内膜と外膜との間にある周辺腔(グラム陰性菌)のいずれかに分泌される。
【0224】
細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子も含み得る。適当な選択遺伝子には、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を細菌に付与する遺伝子が含まれる。選択可能マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路にあるもののような生合成遺伝子を含む。
【0225】
これらの成分は発現ベクターに組立てる。細菌用の発現ベクターは当分野ではよく知られており、Bacillus subtilis、E. coli、Streptococcus cremoris およびStreptococcus lividans などのためのベクターが含まれる。
【0226】
細菌発現ベクターは、当業界で周知の技術、例えば塩化カルシウム処理、エレクトロポーレーションなどを使用して細菌宿主細胞に形質転換される。
【0227】
ある実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質は昆虫細胞で産生される。昆虫細胞形質転換用の発現ベクターおよび特にバキュロウイルスベースの発現ベクターは、当業界でも周知であり、例えば O’Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual(New York: Oxford University Press, 1994 に記載されている。
【0228】
好ましい態様において、候補変異体ライブラリータンパク質は酵母細胞で産生される。酵母発現系は当業界では周知であり、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans および C. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis および K. lactis、Pichia guillerimondii および P. pastoris、Schizosaccharomyces pombe および Yarrowia lipolytica 用の発現ベクターが含まれる。酵母における発現に好ましいプロモーター配列には、誘導可能GAL1,10プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼおよび酸性ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターが含まれる。酵母の選択可能マーカーには、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1およびツニカマイシンに対する耐性を与えるALG7、G418に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および銅イオンの存在下で酵母を成長させるCUP1遺伝子が含まれる。
【0229】
本発明の候補変異体ライブラリータンパク質は、当分野で周知の技法を使用して、融合タンパク質としても作成し得る。従って、例えば、モノクローナル抗体の創出のために、所望のエピトープが小さいならば、ライブラリータンパク質を担体タンパク質と融合させて免疫原を形成し得る。あるいは、ライブラリータンパク質は、発現を増加させるため、または他の理由のために融合タンパク質として作成し得る。例えば、ライブラリータンパク質がライブラリーペプチドである場合には、ペプチドをコードする核酸は発現目的のために他の核酸と結合させてもよい。同様に、細胞の細胞内または細胞外区画へのライブラリー構成員の局在化を可能にする標的配列、ライブラリータンパク質またはそれらをコードする核酸のいずれかの精製または単離を可能にするレスキュー配列または精製タグ;ライブラリータンパク質またはライブラリータンパク質をコードする核酸に安定性または分解からの保護(例えばタンパク質加水分解への耐性)を与える安定配列、またはこれらの組合せ、並びに必要であればリンカー配列などの他の融合パートナーも使用できる。
【0230】
このように、適当な標的配列には、限定されるものではないが、発現産物の生物学的活性を保持しながら、発現産物を予じめ決定した分子または分子クラスと結合させる能力のある結合配列(例えば、酵素阻害剤または基質配列を使用して関連する酵素クラスを標的化する);それ自体またはともに結合しているタンパク質の選択的分解のシグナルを与える配列;および、候補発現産物を、a)ゴルジ体、小胞体、核、仁、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム、および細胞膜などの細胞内位置、および、b)分泌シグナルを介する細胞外の位置を含む、予め決定された細胞の位置へ構成的に局在化させる能力のあるシグナル配列が挙げられる。細胞内への局在化または分泌を介する細胞外への局在化のいずれかが特に好ましい。
【0231】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリー構成員はレスキュー配列を含む。レスキュー配列は、候補物質またはそれをコードする核酸のいずれかを精製または単離するために使用し得る配列である。従って、例えば、ペプチドレスキュー配列には、例えば、Ni親和性カラムと共に使用するためのHis6タグ、および検出、免疫沈降またはFACS(蛍光活性化細胞分別)のためのエピトープタグなどの精製配列が含まれる。適当なエピトープタグには、myc(市販の9E10抗体と共に使用する)、細菌酵素BirAのBSPビオチン化標的配列、fluタグ、lacZおよびGSTが含まれる。
【0232】
あるいは、レスキュー配列は、PCR、関連技法またはハイブリダイゼーションを介してレトロウイルスコンストラクトの迅速かつ容易な単離を可能にするプローブ標的部位として作用する独特のオリゴヌクレオチド配列であってもよい。
【0233】
好ましい実施態様では、融合パートナーは、ライブラリー構成員またはそれをコードする核酸に安定性を付与する安定配列である。従って、例えば、Varahavsky のN−末端則に従い、ユビキチン化されるペプチドを保護するために、開始メチオニンの後にグリシンを組み込むこと(MGまたはMGG0)によりペプチドを安定化し、このようにして細胞質中での長い半減期を付与し得る。同様に、C末端の2個のプロリンは、カルボキシペプチダーゼの作用に対して十分に耐性のあるペプチドをもたらす。プロリンの前に2個のグリシンが存在することは、可変性と防護構造の両方を付与し、ジ−プロリン中の事象を候補ペプチド構造中伝播させる。従って、好ましい安定配列は次の通りである:MG(X)nGGPP、但し、Xは任意のアミノ酸であり、nは少なくとも4の整数である。
【0234】
ある実施態様では、本発明の候補変異体ライブラリー核酸、タンパク質および抗体を標識化する。本明細書において「標識化」とは、本発明の核酸、タンパク質および抗体が、本発明の核酸、タンパク質および抗体の検出を可能にするために取付けられた少なくとも1つの成分、同位元素または化学的化合物を有することを意味する。一般に、標識は3分類、即ちa)放射性または重同位元素であり得る同位元素標識;b)抗体または抗原であり得る免疫標識;およびc)着色または蛍光染料、に分類される。標識は任意の位置で化合物に組込まれ得る。
【0235】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質を、発現後に精製または単離する。ライブラリータンパク質は、サンプル中にどのような他の成分が存在するかによって、当業者には公知の様々な方法で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、電気泳動、分子、免疫学的方法並びにイオン交換、疎水性、アフィニティー並びに逆相HPLCクロマトグラフィーを含むクロマログラフィー技法およびクロマトフォーカシング(chromatofocusing)が含まれる。例えば、ライブラリータンパク質は、標準的な抗ライブラリー抗体カラムを使用して精製し得る。タンパク質濃度との関連で限外濾過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。適当な精製技法の一般的ガイダンスについては、Scopes,R., Protein Purification, Springer−Verlag, NY(1982)を参照のこと。必要な精製度は、ライブラリータンパク質の用途により異なる。精製が必要ではない場合もある。
【0236】
好ましい実施態様では、候補変異体ライブラリータンパク質を、発現後に精製または単離する。変異タンパク質は、サンプル中にどのような他の成分が存在するかによって、当業者には公知の様々な方法で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、電気泳動、分子、免疫学的方法並びにイオン交換、疎水性、アフィニティー並びに逆相HPLCクロマトグラフィーを含むクロマログラフィー技法およびクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、変異タンパク質は、標準的な抗ライブラリー抗体カラムを使用して精製し得る。タンパク質濃度との関連で限外濾過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。適当な精製技法の一般的ガイダンスについては、Scopes,R., Protein Purification, Springer−Verlag, NY(1982)を参照のこと。必要な精製度は、変異タンパク質の用途により異なる。精製が必要ではない場合もある。
【0237】
一旦発現させ、必要であれば精製した候補変異体ライブラリータンパク質および核酸は、免疫原性の改変について試験できる。適切な方法には、MHCペプチド複合体のTCRへの結合の測定、MHC/ペプチド相互作用の測定(Sidney, J., et al., In Current Protocols in Immunology (1998) 18.3.1−18.3.19)、ヒトMHC分子を発現するトランスジェニックマウスにおける、可能性のあるT細胞エピトープの試験、内在性細胞の代りにヒト抗原提示細胞およびT細胞で再構成されたマウスにおける、可能性のあるT細胞エピトープの試験(WO 98/52976; WO 00/34317)、T細胞増殖およびCTLアッセイ(Hemmer, B., (1998) J. Immunol., 160:3631−3636)および「i−mune アッセイ」(Genecor; The Scientist, 15:14, (2001))が含まれる。
【0238】
一旦作成したら、本発明の候補変異タンパク質および核酸は、数々の応用に有用である。好ましい実施態様では、標的タンパク質よりも低免疫原性の候補変異タンパク質を、治療用タンパク質として使用する。例えば、臨床および前臨床治療研究により、外因性タンパク質は、放射性各種を捕獲するための人工受容体として、毒物として、またはプロドラッグ活性化のための触媒として、インビボで効果的であり得ることが示された(Meyer, DL., et al. (2001) Protein Science, 10:491−503)。免疫原性が減少した治療用タンパク質の他の用途には、急性心筋梗塞の血栓溶解治療が含まれる(Laroche, Y., et al., (2000) Blood, 96:1425−1432)。
【0239】
好ましい実施態様では、標的タンパク質よりも高免疫原性である候補変異タンパク質を、ワクチン並びに自己免疫疾患および癌に対する免疫治療剤の開発において使用する。例えば、MHCクラスIまたはクラスII分子に対する親和性が増加した線状アミノ酸配列エピトープの挿入により、免疫反応の誘導においてより効果的であるワクチンを作成できる(例えば、Sarobe, P., et al. (1998) J. Clin. Invest., 102:1239−1248; Thimme, R., et al. (2001) J. Virology, 75:3984−3987; Roberts, C., et al., (1996) Aids Research and Human Retroviruses, 12:593−610 を参照のこと)。他の実施態様では、ナイーブB細胞上の膜結合抗体と相互作用する構造的3次元エピトープをコードする配列の挿入により、免疫反応の誘導においてより効果的であるワクチンを作成する。
【0240】
好ましくは、ライム病、B型肝炎、C型肝炎、ポリオウイルスおよびHIVに対してワクチンを作成する。他の実施態様では、候補変異タンパク質は、癌細胞に対してより免疫原性である。
【0241】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質の治療的有効量を、処置を必要としている患者に投与する。本明細書における「治療的有効量」は、投与の目的である効果を生じる用量を意味する。正確な用量は処置目的により異なり、公知技法を使用して当業者は確認し得る。好ましい実施態様では、約5μg/kgの用量を使用し、静脈内、腹膜内または皮下に投与する。当分野で既知の通り、候補変異タンパク質分解、全身対局所送達、および新規プロテアーゼ合成速度、並びに年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤相互作用および病状の重篤度による調節が必要であり、当業者は常用の実験法で確認し得る。
【0242】
本発明のための「患者」は、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物、および生物を包含する。従って、本発明の方法は、ヒトの治療および獣医学的応用の両方に適用可能である。好ましい実施態様では、患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施態様では、患者はヒトである。
【0243】
本発明における用語「処置」は、治療処置並びに疾患または異常の予防または抑制手段を含む意味である。従って、例えば、疾患の発病に先立って候補変異タンパク質を成功裡に投与することは、疾患の「処置」に至る。他の例として、疾患の症状と闘うために、疾患の臨床的顕示の後に変異タンパク質を成功裡に投与することは、疾患の「処置」を含む。また、「処置」は、疾患を撲滅するために疾患の出現の後に変異タンパク質を投与することも包含する。あり得る臨床症状の減少とおそらく疾患の改善を伴って、発病後および臨床症状の進行の後に物質を成功裡に投与することは、疾患の「処置」を含む。
【0244】
「処置を必要としている」者には、既に疾患または異常を有する哺乳動物、並びに疾患または異常を有する傾向のある者が含まれ、その者において疾患または異常が防止されるべき者が含まれる。
【0245】
好ましくは滅菌水性溶液形態における、本発明の候補変異タンパク質の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内または眼内投与を含むがこれらに限定されない、様々な方法で行える。場合によっては、例えば、損傷や炎症などの処置において、候補変異タンパク質を溶液またはスプレーとして直接適用し得る。導入方法に応じて、医薬組成物を様々な方法で製剤化し得る。製剤中の治療的に活性な候補変異タンパク質の濃度は、約0.1ないし100重量%で変化し得る。別の好ましい実施態様では、候補変異タンパク質の濃度は0.003ないし1.0モル濃度の範囲内であり、体重キログラム当り0.03、0.05、0.1、0.2、および0.3ミリモルの用量が好ましい。
【0246】
本発明の医薬組成物は、患者への投与に適する形態の候補変異タンパク質を含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、酸および塩基の両付加塩類を包含することを意図している、医薬的に許容し得る塩として存在するような、水溶性形態である。「医薬的に許容し得る酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学上またはその他の点で不都合でないものであり、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸と形成する。「医薬的に許容し得る塩基付加塩」は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩類などから誘導されたものを含む。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩などである。医薬的に許容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩には、第1級、第2級および第3級アミン類、置換アミン類、例えば、天然産生の置換アミン類、環状アミン類および塩基性イオン交換樹脂、例えば、イロプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンの塩が含まれる。
【0247】
医薬組成物はまた、次の物質;即ち、血清アルブミンなどの担体タンパク質;NaOAcなどの緩衝液;微晶性セルロース、ラクトース、トウモロコシおよび他の澱粉類などの充填剤;結合剤;甘味料および他の着香剤;着色剤;およびポリエチレングリコールのうちの1種またはそれ以上を含み得る。添加物は当業界で周知であり、様々な製剤で使用される。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Goodman and Gilman を参照されたい。
【0248】
さらなる実施態様では、ミセル製剤に候補変異タンパク質を添加する;出典明示により全体を本明細書の一部とする米国特許番号第5,833,948号参照。 医薬組成物の組合せを投与し得る。さらに、組成物を他の治療剤と組合せて投与してもよい。
【0249】
本発明で提供されるある実施態様では、当分野で既知の方法を使用して、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を含むがこれらに限定されない、変異タンパク質に対する抗体を生成させる(出典明示により本明細書の一部とする、Soren, M., et al (1997) EP 0 752 886 を参照されたい)。好ましい実施態様では、これらの抗変異体抗体を、免疫治療に使用する。従って、免疫治療の方法が提供される。「免疫治療」は、自己タンパク質の産生を伴う自己免疫疾患の処置を意味する。特に、自己ワクチンを作成するために、自己タンパク質をT細胞エピトープに結合する。本発明での用途の自己タンパク質には、癌の処置用のTNFαおよびγ−インターフェロン、アレルギーの処置用のIGE、慢性炎症性疾患の処置用のTNFα、TNFβおよびインターロイキン1が含まれる。
【0250】
本発明で使用されるように、免疫治療は、受動的または能動的であり得る。本明細書で定義するように、受動的免疫治療は、抗体を受容者(患者)に受動的に輸送することである。能動的免疫化は、抗体および/またはT細胞反応を受容者(患者)の中で誘導することである。免疫反応の誘導は、T細胞エピトープおよび自己タンパク質を含む変異タンパク質抗原(これに対して抗体を生成させる)を受容者に与える結果であり得る。当業者に理解されるように、変異タンパク質抗原は、抗体を生成させることが望まれる変異ポリペプチドを受容者に注射するか、または変異TNFαタンパク質抗原を発現するための条件下で、変異タンパク質抗原を発現する能力のある、変異タンパク質をコードする核酸を、受容者に接触させるかして与えられる。
【0251】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質を治療剤として投与し、上記概説のように製剤できる。同様に、候補変異遺伝子(全長配列、部分配列の両方、または変異体コード領域の調節配列を含む)を、当分野で既知のように遺伝子治療応用において投与できる。当業者に理解されるように、これらの変異体遺伝子は、遺伝子治療(即ち、ゲノムへの組込み用)としてか、またはアンチセンス組成物としての、アンチセンス応用を含む。
【0252】
好ましい実施態様では、候補変異タンパク質をコードしている核酸も、遺伝子治療で使用し得る。遺伝治療への応用では、例えば欠陥遺伝子置換のために、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成させるために、遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子治療」には、単回の処置により持続的効果を達成させる従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNAまたはmRNAの単回または反復した投与を含む、遺伝子治療剤の投与との両方が含まれる。アンチセンスRNAおよびDNAを、インビボである種の遺伝子の発現を阻止する治療剤として使用できる。細胞膜による取り込みが制限されることにより細胞内濃度が低いにもかかわらず、短いアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に導入され、そこで阻害物質として作用することが既に示されている(Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143−4146 [1986])。例えば、取込みを増強するために、負荷電のホスホジエステル基を非荷電基で置換することにより、オリゴヌクレオチドを変更できる。
【0253】
生存細胞内に核酸を導入するには様々なの技法が利用できる。技法は、核酸がインビトロで培養細胞内に移入されるのか、またはインビボで意図する宿主の細胞内に移入されるのかによって変わる。インビトロで哺乳動物細胞内に核酸を移入するのに適する技法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、等の使用が含まれる。現今好適とされているインビボ遺伝子移入技法には、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターを用いるトランスフェクション、およびウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介トランスフェクションが含まれる(Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205−210 [1993])。ある状況では、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体や標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどの標的細胞を標的とする物質を有する核酸ソースを供給するのが望ましい。リポソームを採用した場合は、エンドサイトーシスに伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を標的化および/または取込み促進のために使用し得る。例えば特定の細胞型に親和性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリング中に内在化を経るタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的化し、細胞内半減期を強化するタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技法は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262,4429−2232 (1987): および Wagnernet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410−3414(1990) に記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールを概観するには、Andersen et al., Science 256, 808−813 (1992)を参照されたい。
【0254】
好ましい実施態様では、候補変異遺伝子を、DNAワクチンとして投与する。単一の遺伝子または候補変異遺伝子の組合せのどちらかである。むき出しのDNAワクチンは、当分野で一般的に知られている;Brower, Nature Biotechnology 16:1304−1305 (1998)。DNAワクチンとして遺伝子を使用する方法は、当業者に周知であり、候補変異遺伝子または変異遺伝子の部分を、処置を必要としている患者中での発現用のプロモーターの制御下に置くことを含む。DNAワクチンに使われる変異遺伝子は、変異タンパク質全長をコードできるが、より好ましくは、変異タンパク質から生じたペプチドを含む、変異タンパク質の部分をコードする。好ましい実施態様では、患者は、変異遺伝子から生じた多数のヌクレオチド配列を含むDNAワクチンで免疫される。同様に、本明細書で定義するように、多数の変異遺伝子またはその部分で、患者を免疫することが可能である。理論によって制限を受けないが、DNAワクチンにコードされるポリペプチドの発現に続いて、TNFαタンパク質を発現している細胞を認識し破壊または除去する細胞障害性T細胞、ヘルパーT細胞および抗体が誘導される。
【0255】
好ましい実施態様では、DNAワクチンは、DNAワクチンと共にアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。そのようなアジュバント分子には、DNAワクチンにコードされる変異ポリペプチドへの免疫反応を上昇させるサイトカインが含まれる。追加または代用のアジュバントは、当業者に周知であり、本発明で有用である。
【0256】
本明細書で引用した全参照文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図1】全長遺伝子の合成およびPCRによる可能な全変異導入を描く。
【図2】本発明のライブラリーを合成するための、好ましいスキームを示す。
【図3】重複伸張法を示す。
【図4】本発明のライブラリーを合成するための、PCR反応生成物のライゲーションを示す。
【図5】PCR産物の平滑末端ライゲーションを描く。
Claims (18)
- 標的タンパク質の免疫原性の調節方法であって、
a)標的タンパク質の可変残基位置と共に、タンパク質主鎖構造をコンピューターに入力すること
b)コンピューター処理で一次変異アミノ酸配列のセットを生成させること;および
c)該セットに対してコンピューター処理の免疫原性フィルターを適用し、少なくとも1つの候補変異タンパク質を同定すること
を含む方法。 - 該標的タンパク質と比較して免疫原性が改変されたか否かを判定するために、該候変異タンパク質を試験することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 各可変残基位置を、コア、表面または境界残基のいずれかに分類することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 該コンピューター処理で生成させる段階が、DEEコンピューター計算をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 該DEEコンピューター計算が、オリジナルDEEおよびゴールドステイン(Goldstein)DEEからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 該一次変異アミノ酸配列のセットが、少なくとも1つのスコア付け関数に最適化されている、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのスコア付け関数に最適化されている該一次変異アミノ酸配列のセットが、大域的最適タンパク質配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 該スコア付け関数が、ファンデルワールスポテンシャルスコア付け関数、水素結合ポテンシャルスコア付け関数、原子溶媒和スコア付け関数、静電気スコア付け関数および二次構造傾向スコア付け関数からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 該コンピューター処理で生成させる段階がモンテカルロ検索の使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 該標的タンパク質が非ヒト種由来であり、かつ該候補変異タンパク質がヒトにおいて減少した免疫原性を示す、請求項1に記載の方法。
- 該候補変異タンパク質の免疫原性が、該標的タンパク質と比較して減少している、請求項1に記載の方法。
- 該候補変異タンパク質が非免疫原性である、請求項1に記載の方法。
- 該候補変異タンパク質が該標的タンパク質よりも安定である、請求項11または請求項12に記載の方法。
- 該標的タンパク質の免疫原性を調節することが、MHC分子に結合するアミノ酸配列を変更することを含む、請求項1に記載の方法。
- 該MHC分子がMHCクラスIに属するものである、請求項14に記載の方法。
- 該MHC分子がMHCクラスIIに属するものである、請求項14に記載の方法。
- 該標的タンパク質の免疫原性を調節することが、T細胞エピトープをコードするアミノ酸配列を変更することを含む、請求項1に記載の方法。
- 標的タンパク質の免疫原性の調節方法であって、
a)標的タンパク質の可変残基位置と共に、タンパク質主鎖構造をコンピューターに入力すること
b)該セットに対してコンピューター処理の免疫原性フィルターを適用し、少なくとも1つの候補変異タンパク質を同定すること
c)天然の折畳みおよび安定性について、該変異タンパク質をコンピューター処理で分析すること;および
d)一次変異アミノ酸配列のセットを生成させること
を含む方法。
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