KR20100090266A

KR20100090266A - ＦｃＲｎ에 대한 변경된 결합성을 갖는 Ｆｃ 변이체

Info

Publication number: KR20100090266A
Application number: KR1020107010782A
Authority: KR
Inventors: 아론 챔버라인; 바실 다히야트; 존 루돌프 데스자르라이스; 셰어 바하두르 카르키
Original assignee: 젠코어 인코포레이티드
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-09-22
Publication date: 2010-08-13
Also published as: ES2537282T3; IL205050A0; WO2009058492A2; US20150152183A1; CA2703385A1; CN114891093A; WO2009058492A3; US20090041770A1; EP2937361A2; RU2010121898A; IL231423A0; IL231423A; JP2014193168A; US8802820B2; EP2212354B1; AU2008319144A1; EP2444423A1; JP5927231B2; JP2011502126A; CN101970492B

Abstract

본 출원은 최적화된 IgG 면역글로불린 변이체, 이들의 생산을 위한 조작 방법, 그리고 특히, 치료 목적을 위한 이들의 적용에 관한 것이다.

Description

ＦｃＲｎ에 대한 변경된 결합성을 갖는 Ｆｃ 변이체{Fc VARIANTS WITH ALTERED BINDING TO FcRn}

본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에, 2007년 10월 31일 제출된 USSN 11/932,151에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명의 기술분야

본 발명의 배경기술

항체는 특정 항원에 결합하는 면역 단백질이다. 인간 및 생쥐를 비롯한 대부분의 동물에서, 항체는 쌍을 이루고 있는 중쇄 및 경쇄의 폴리펩티드 사슬로부터 작제된다. 각 사슬은 개별적 면역글로불린(Ig) 도메인으로 구성되고, 따라서 이들 단백질에 대하여 일반 용어 면역글로불린이 이용된다. 각 사슬은 가변 및 불변 영역으로 지칭되는 2개의 구별되는 영역으로 구성된다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 항체 간에 있어 상당한 서열 다양성을 나타내고, 표적 항원에 결합을 담당한다. 불변 영역은 서열 다양성이 덜하고, 중요한 생화학적 반응을 유도하는 다수의 천연 단백질에 결합을 담당한다. 인간에서, IgA(IgA1 및 IgA2 하위부류 포함), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위부류 포함), 그리고 IgM를 비롯한 다섯 가지 상이한 부류의 항체가 존재한다. 이들 항체 부류간의 차별적인 특징은, 비록 V 영역에서 더욱 미세한 차이가 존재할 수도 있긴 하지만, 이들의 불변 영역이다. 도 1에서는 IgG1 항체를 도시하는데, 이는 본 명세서에서 면역글로불린의 일반적 구조 특징을 기술하기 위한 실례로서 이용된다. IgG 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 사합체(tetrameric) 단백질이다. IgG 중쇄는 각각, 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 도메인 1, 중쇄 불변 도메인 2 및 중쇄 불변 도메인 3을 나타내는 VH-CH1-CH2-CH3(또한, 각각 중쇄 가변 도메인, 불변 감마 1 도메인, 불변 감마 2 도메인 및 불변 감마 3 도메인을 나타내는 VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3으로 지칭됨)의 순서로 N- 말단에서 C 말단으로 연결된 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된다. IgG 경쇄는 각각, 경쇄 가변도메인 및 경쇄 불변 도메인을 나타내는 VL-CL의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 연결된 2개의 면역글로불린 도메인으로 구성된다.

항체의 가변 영역은 분자의 항원 결정 부위(antigen binding determinant)를 포함하고, 따라서 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 가변 영역은 동일한 부류 내에 다른 항체와 서열에서 가장 많은 차이가 나기 때문에, 이러한 이름으로 명명된다. 대부분의 서열 가변성(sequence variability)은 상보성 결정부위(complementarity determining region, CDR)에서 발생한다. 중쇄와 경쇄에 대해 각각 3개씩 총 6개의 CDR이 존재하고, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3으로 불린다. CDR 외부의 가변 영역은 골격 영역(framework region, FR)으로 불린다. 골격 영역은 CDR 만큼 다양하진 않지만, 상이한 항체 간에 서열 가변성이 발생한다. 전반적으로, 항체의 이러한 특징적인 구조는 광범위한 항원에 대한 특이성을 획득하기 위하여 면역계에 의해 상당한 항원 결합 다양성(CDR)이 탐구될 수 있는 안정적인 골격(FR 영역)을 제공한다. 상이한 생물체로부터 다양한 가변 영역 단편에 대한 다수의 고해상도 구조가 가용한데, 일부는 항원과 결합하지 않고, 다른 일부는 항원과 복합된다. 항체 가변 영역의 서열 및 구조 특징은 충분히 특성화되고(Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨), 항체의 이러한 보존된 특징은 많은 항체 조작 기술의 개발을 가능하게 하였다(Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 가령, 하나의 항체, 예를 들면, 뮤린 항체로부터 CDR을 다른 항체, 예를 들면, 인간 항체의 골격 영역 내로 이식(graft)하는 것이 가능하다. 이러한 과정은 당분야에서 "인간화(humanization)"로 지칭되고, 비인간 항체로부터 면역원성이 덜한 항체 치료제의 생성을 가능하게 한다. 가변 영역을 포함하는 단편은 항체의 다른 영역의 부재에서 존재할 수 있는데, 여기에는 예로써 VH-Cγ1 및 VH-CL를 포함하는 항원 결합 단편(Fab), VH 및 VL을 포함하는 가변 단편(Fv), 동일한 사슬에서 함께 연결된 VH 및 VL를 포함하는 단쇄 가변 영역(scFv), 그리고 다양한 다른 가변 영역 단편이 포함된다(Little et al., 2000, Immunol Today 21 :364-370, 이는 본 발명에 전체적으로 참조로서 포함됨).

항체의 Fc 영역은 다수의 Fc 수용체 및 리간드와 상호작용하여, 효과기 기능(effector function)으로 지칭되는 다양한 중요한 기능적 능력을 부여한다. IgG의 경우에, Fc 영역은 도 1 및 2에 도시된 바와 같이, Ig 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 그리고 Cγ2로 이어지는 N-말단 힌지(hinge)를 포함한다. IgG 부류에 대한 중요한 Fc 수용체 계통은 Fc 감마 수용체이다(FcγR). 이들 수용체는 항체 및 면역계의 세포성 암(cellular arm) 간에 소통을 매개한다(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, 둘 모두 순전히 참조로서 편입됨). 인간에서, 이러한 단백질 계통에는 동종형(isoform) FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 비롯한 FcγRI(CD64); 동종형 FcγRIIa(알로타입(allotype) H131 및 R131 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함), 그리고 FcγRllc를 비롯한 FcγRII(CD32); 그리고 동종형 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2 포함)을 비롯한 FcγRIII(CD16)(Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)가 포함된다. 이들 수용체는 전형적으로, Fc에 결합을 매개하는 세포외 도메인, 막통과 영역, 그리고 세포내에서 일부 신호전달 현상을 매개할 수 있는 세포내 도메인을 갖는다. 이러한 수용체는 단핵구, 대식세포, 중성구, 수지상세포, 호산구, 비만세포, 혈소판, B 세포, 큰 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포, 그리고 γγT 세포를 비롯한 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체의 형성은 이들 효과기 세포를 항원이 결합된 부위로 동원하여, 전형적으로 세포내에서 신호전달 현상 및 중요한 후속 면역반응, 예를 들면, 염증 매개인자의 방출, B 세포 활성화, 세포내이입, 식세포작용 및 세포독성 공격을 유도한다. 세포독성 및 식세포성 효과기 기능을 매개하는 능력은 항체가 표적화 세포를 파괴하는 잠재적 기전이다. FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고, 이후 표적 세포의 용혈(lysis)를 유도하는 세포-매개된 반응은 항체 의존성 세포-매개된 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)으로 지칭된다(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고, 이후 표적 세포의 식세포작용을 유도하는 세포-매개성 반응은 항체 의존성 세포-매개된 식세포작용(antibody dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP)로 지칭된다. FcγRIIa(pdb 수납 코드 1H9V, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)(Sondermann et al., 2001, J MoI Biol 309:737-749, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)(pdb 수납 코드 1FCG, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)(Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨), FcγRIIb(pdb 수납 코드 2FCB, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)(Sondermann et at, 1999, Embo J 18:1095-1103, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨); 그리고 FcγRIIIb(pdb 수납 코드 1E4J, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)(Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)를 비롯한 인간 FcγR의 세포외 도메인의 다수의 구조가 밝혀졌다. 모든 FcγR은 도 1에 도시된 바와 같이, Cγ2 도메인의 N-말단 및 선행하는 힌지에서, Fc 상의 동일한 부분에 결합한다. 이러한 상호작용은 구조적으로 충분히 특성화되고(Sondermann et al., 2001, J MoI Biol 309:737-749, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨), 인간 FcγRIIIb의 세포외 도메인에 결합된 인간 Fc의 여러 구조가 밝혀졌고(pdb 수납 코드 1E4K, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)(Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)(pdb 수납 코드 1IIS 및 1IIX, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)(Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨) 인간 IgE Fc/FcεRlα 복합체의 구조를 갖는다(pdb 수납 코드 1F6A, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)(Garman et al., 2000, Nature 406:259-266, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 이러한 효과기 기능 반응은 Fc 영역에서 이형에 의해 변형될 수도 있다(Lazar et al. 2006 Proc. Nat. Acad. Sci USA. 103(111):4005-4010, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

상이한 IgG 하위부류는 FcγR에 대한 상이한 친화성을 갖는데, IgG1 및 IgG3이 전형적으로, IgG2 및 IgG4와 비교하여 이들 수용체에 실질적으로 더욱 우수하게 결합한다(Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 모든 FcγR은 친화성이 상이하긴 하지만, IgG Fc 상에서 동일한 영역에 결합한다: 높은 친화성 결합체 FcγRI은 IgG1에 대한 10^-8M^-1의 Kd를 갖는 반면, 낮은 친화성 수용체 FcγRII 및 FcγRIII은 일반적으로, 각각 10^-6 및 10^-5로 결합한다. FcγRIIIa 및 FcγRIIIb의 세포외 도메인은 96% 동일하다; 하지만, FcγRIIIb는 세포내 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 더 나아가, FcγRI, FcγRIIa/c 및 FcγRIIIa는 면역 복합체-촉발된 활성화의 양성 조절인자로서, 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티브(tyrosine-based activation motif, ITAM)를 갖는 세포내 도메인을 보유하는 것으로 특성화되는 반면, FcγRIIb는 면역수용체 티로신-기초된 저해 모티브(tyrosine-based inhibition motif, ITIM)를 갖고, 따라서 저해성이다. 따라서 전자는 활성화 수용체로 지칭되고, FcγRIIb는 저해 수용체로 지칭된다. 이들 수용체는 또한, 상이한 면역세포에서 발현 양상 및 수준에서 차이가 난다. 또 다른 수준의 복잡한 문제는 인간 프로테옴 내에서 다수의 FcγR 다형성(polymorphism)의 존재이다. 임상적 중요성을 갖는 특히 유관한 다형성은 V158/F158 FcγRIIIa이다. 인간 IgG1은 F158 알로타입보다 V158 알로타입에 더욱 큰 친화성으로 결합한다. 친화성, 그리고 아마도, ADCC 및/또는 ADCP에 대한 이의 영향에서 차이는 항-CD20 항체 리툭시맙(Rituxan®, Biogenldec) 효능의 중요한 결정인자인 것으로 밝혀졌다. V158 알로타입을 갖는 환자는 리툭시맙 치료에 긍정적으로 반응한다; 하지만, 더욱 낮은 친화성 F158 알로타입을 갖는 환자의 경우는 불량하게 반응한다(Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 대략 10-20%의 인간은 V158/V158 동종접합성(homozygous)이고, 45%의 인간은 V158/F158 이종접합성(heterozygous)이고, 35-45%의 인간은 F158/F158 동종접합성이다(Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 따라서 80-90%의 사람은 치료 반응이 불량하다, 다시 말하면, 이들은 F158 FcγRIIIa의 적어도 하나의 대립유전자를 갖는다.

도 1에 도시된 바와 같이, Fc 상에서 중첩되지만 별개의 부위는 보체 단백질(complement protein) C1q에 대한 인터페이스로 기능한다. Fc/FcγR 결합이 ADCC를 매개하는 것과 동일한 방식으로, Fc/C1q 결합은 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 매개한다. C1q는 세린 프로테아제 C1r 및 C1s와 복합체를 구성하여 C1 복합체를 형성한다. C1q는 6개의 항체에 결합할 수 있지만, 보체 캐스케이드(complement cascade)를 활성화시키는데 2개의 IgG에 결합으로도 충분하다. Fc와 FcγR의 상호작용과 유사하게, 상이한 IgG 하위부류는 C1q에 대한 상이한 친화성을 갖는데, IgG1 및 IgG3은 전형적으로, IgG2 및 IgG4 보다 실질적으로 더욱 우수하게 FcγR에 결합한다(Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

IgG에서, Fc 상에서 Cγ2 및 Cγ3 도메인 간에 부위(도 1)는 신생아 수용체(neonatal receptor) FcRn과의 상호작용을 매개하는데, 이러한 결합으로 세포내이입 항체는 엔도좀(endosome)에서 혈류로 역으로 재순환된다(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 이러한 과정은 전장 분자의 큰 크기로 인한 신장 여과의 배제와 결부되면, 1주 내지 3주 범위의 긍정적인 항체의 반감기를 발생시킨다. FcRn에 Fc의 결합은 또한, 항체 운반에서 중요한 역할을 수행한다. Fc 상에서 FcRn에 대한 결합 부위는 또한, 세균 단백질인 A 및 G가 결합하는 부위이다. 이들 단백질에 의한 단단한 결합은 단백질 정제 동안 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 이용함으로써 항체의 정제 수단으로 이용된다. 따라서 Fc 상에서 이러한 영역의 충실성(fidelity)은 항체의 임상적 특성 및 이들의 정제 모두에 중요하다. 쥐 Fc/FcRn 복합체의 가용한 구조(Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨) 및 Fc와 단백질 A 및 G의 복합체의 가용한 구조(Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al., 1995, Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)는 Fc와 이들 단백질의 상호작용에 관한 통찰력을 제공한다. FcRn 수용체는 또한, IgG의 신생아 내장 및 성인에서 장 상피의 내강(lumen)으로의 전달을 담당한다(Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol., 2000, 18:739-766; Yoshida et al., Immunity, 2004, 20(6):769-783, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

쥐 및 인간 Fc 도메인에 관한 연구에서, FcRn의 결합에 일부 Fc 잔기의 중요성이 증명되었다. 쥐 및 인간 서열은 Fc 영역에서 약 64% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다(Kabat 등의 번호 매김에서 잔기 237-443). Fc, FcRn 중쇄, 그리고 FcRn 경쇄(베타-2-마이크로글로불린)의 쥐/인간 정렬에 대하여 도 3, 4 및 5를 참조한다. 인간 Fc/FcRn 복합체 모델이 쥐 Fc/FcRn 복합체의 기존 구조로부터 구축되었다(Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 이들 쥐 및 인간 서열은 FcRn 결합에 중요한 일부 잔기, 예를 들면, H310 및 H435를 공유한다(Medesan et al., 1997 J. Immunol. 158(5):221-7; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 하지만, 다수 위치에서, 이들 인간 및 쥐 단백질은 상이한 아미노산을 보유하고, 쥐 서열에서보다 인간 서열에서 잔기에 상이한 환경, 그리고 아마도 상이한 개성을 제공한다. 이러한 변이성은 한 동족체(homolog)로부터 다른 동족체로 특징을 전달하는 능력을 제한한다.

뮤린 Fc에서, T252, T254 및 T256 부위에서 무작위 돌연변이(random mutation) 및 파지 디스플레이 선별(phage display selection)은 FcRn 친화성이 3.5-배 증가되고 혈청 반감기가 1.5-배 증가된 삼중 돌연변이 T252L/T254S/T256F를 산출한다(Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15(7): 637-640, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 또한, 253, 310 및 435 위치에서 돌연변이에 의한 Fc/FcRn 상호작용의 파괴는 감소된 생체내 반감기로 이어진다(Medesan et al J. Immunol. 1997 158(5):2211-7, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

쥐 Fc/FcRn 복합체의 결정 구조로, FcRn 결합에 중요한 Fc 잔기가 밝혀졌다(Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994); Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001), 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 최초 Fc/FcRn 복합체 구조는 1994년에 6Å의 해상도로 규명되었다(표 2a, Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994), 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 2001년 Marin 등에 의해 규명된 더욱 고해상도 구조에서는 측쇄 위치를 보다 상세하게 보여주었다(Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001), 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 쥐 FcRn에 결합된 쥐 Fc의 이러한 결정 구조는 FcRn 결합을 방해하는 T252G/I253G/T254G/H310E/H433E/H435E 돌연변이를 보유하는 하나의 단량체, 그리고 야생형 Fc 단량체를 보유하는 하나의 단량체를 포함하는 Fc 이합체를 이용하여 규명되었다.

FcRn의 결합에 중요한 일부 잔기에 대하여 인간 Fcγ에서 돌연변이 연구를 수행하였는데, 이들은 증가된 혈청 반감기를 증명하였다. 인간 Fcγ1에서, Hinton 등은 3개의 잔기를 개별적으로 19개의 통상적인 다른 아미노산으로 돌연변이시켰다. Hinton 등은 일부 점 돌연변이체 중에서 이중 돌연변이체가 증가된 FcRn 결합 친화성을 갖는다는 것을 발견하였다(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216; Hinton et al. Journal of Immunology 2006, 176:346-356, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 2개의 돌연변이는 원숭이에서 반감기를 증가시켰다. Shields 등은 잔기를 거의 전적으로 Ala으로 돌연변이시키고, FcRn 및 FcγR에 이들의 결합을 조사하였다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

Dall'Acqua 등은 파지 디스플레이를 이용하여, 증가된 친화성으로 FcRn에 결합하는 Fc 돌연변이를 선별하였다(Dall'Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 선별된 DNA 서열은 주로 이중 및 삼중 돌연변이체이었다. 상기 문헌에서는 많은 선별된 서열에 의해 인코딩되는 단백질을 발현시키고, 일부 단백질이 야생형 Fc보다 FcRn에 더욱 강하게 결합한다는 것을 발견하였다.

치료제로서 항체 및 Fc 융합 단백질의 투여는 단백질의 제거 및 반감기의 특성을 고려하여, 규정된 빈도로 주사를 필요로 한다. 생체내에서 더욱 긴 반감기는 더욱 낮은 빈도의 주사 또는 더욱 적은 투여량을 가능하게 하는데, 이는 명백한 장점으로 작용한다. Fc 도메인에서 이전의 돌연변이가 증가된 FcRn 결합 친화성 및 생체내 반감기를 갖는 일부 단백질을 산출하긴 했지만, 이들 돌연변이는 최적화된 돌연변이가 아니고, 생체내 반감기를 향상시키지 못하였다.

Fc 영역의 한 가지 특징은 도 1에서 도시된, N297에서 발생하는 보존된 N-연결 글리코실화(glycosylation)이다. 이러한 탄수화물, 또는 종종 언급되는 올리고사카라이드는 항체의 중요한 구조적 및 기능적 역할을 수행하고, 항체가 포유류 발현 시스템을 이용하여 생산되어야만 하는 주요한 이유 중의 하나이다(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477; 그리고 Krapp et al., 2003, J MoI Biol 325:979-989, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

항체는 치료 용도로 개발되고 있다. 이런 치료제에 관련된 대표적인 문헌은 Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410, McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833; 그리고 Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639-2648을 포함하고, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 현재, 항암 치료의 경우에, 사망률에서 사소한 향상도 성공으로 간주된다. 본 발명에 개시된 특정 IgG 변이체는 표적화 암 세포의 추가적인 성장을 제한하거나, 또는 이들을 적어도 부분적으로 파괴하는 항체의 능력을 향상시킨다.

항체의 항-종양 효능은 ADCC, ADCP 및 CDC와 같은 세포독성 효과기 기능을 매개하는 이들의 능력 향상을 통하여 달성된다. 실례에는 Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446; 그리고 Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758이 포함되는데, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함된다.

인간 IgG1은 치료용으로 가장 보편적으로 이용되는 항체이고, 대부분의 조작 연구가 이러한 배경에서 수행되었다. 하지만, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 IgG 부류에 속하는 상이한 동종형은 특징적인 물리적, 생물학적, 그리고 임상적 특성을 갖는다. 향상된 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 변이체의 설계가 당분야에서 요구된다. 더 나아가, 고유 IgG 폴리펩티드와 비교하여, FcRn에 결합을 향상시키고 및/또는 생체내 반감기를 증가시키는 이런 변이체의 설계가 요구된다. 부가적으로, 향상된 약물동역학적 특성을 갖는 변이체와 변경된 FcgammaR 결합을 통하여 효능을 향상시키는 변형을 포함하는 변이체의 합병이 요구된다. 본 발명은 이와 같은 요구를 충족시킨다.

본 발명의 요약

본 출원은 모 폴리펩티드(parent polypeptide)의 Fc 영역 내에서 적어도 하나의 변형을 포함하는 모 폴리펩티드의 Fc 변이체에 관계한다. 다양한 구체예에서, 상기 변이형 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교하여 FcRn에 대한 변경된 결합성을 나타낸다. 특정 이형에서, 상기 변형은 246H, 246S, 247D, 247T, 248H, 248P, 248Q, 248R, 248Y, 249T, 249W, 250E, 250I, 250Q, 250V, 251D, 251E, 251H, 251I, 251K, 251M, 251N, 251T, 251V, 251Y, 252Q, 252Y, 253L, 253T, 253V, 254H, 254L, 254N, 254T, 254V, ^254N, 255E, 255F, 255H, 255K, 255S, 255V, 256E, 256V, 257A, 257C, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257Q, 257R, 257S, 257T, 257V, 257W, 257Y, 258R, 258V, 259I, 279A, 279D, 279C, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280H, ^281A, ^281D, ^281S, ^281T, 282D, 282F, 282H, 282I, 282T, 283F, 283I, 283L, 283Y, 284H, 284K, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284Y, 285S, 285V, 286D, 286#, 286L, 287H, 287S, 287V, 287Y, 288H, 288Q, 288S, 305H, 305T, 306F, 306H, 306I, 306N, 306T, 306V, 306Y, 307D, 307P, 307Q, 307S, 307V, 307Y, 308C, 308D, 308E, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308Q, 308P, 308R, 308S, 308W, 308Y, 309F, 309H, 309N, 309Q, 309V, 309Y, 310K, 310N, 310T, 311A, 311L, 311P, 311T, 311V, 311W, 312H, 313Y, 315E, 315G, 315H, 315Q, 315S, 315T, 317H, 317S, 319F, 319F, 319L, 339P, 340P, 341S, 374H, 374S, 376H, 376L, 378H, 378N, 380A, 380T, 380Y, 382H, 383H, 383K, 383Q, 384E, 384G, 384H, 385A, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385S, 385T, 385V, 385W, 385Y, 386E, 386K, 387#, 387A, 387H, 387K, 387Q, 389E, 389H, 426E, 426H, 426L, 426N, 426R, 426V, 426Y, 427I, 428F, 428L, 429D, 429F, 429K, 429N, 429Q, 429S, 429T, 429Y, 430D, 430H, 430K, 430L, 430Q, 430Y, 431G, 431H, 431I, 431P, 431P, 431S, 432F, 432H, 432N, 432S, 432V, 433E, 433P, 433S, 434A, 434F, 434H, 434L, 434M, 434Q, 434S, 434Y, 435N, 436E, 436F, 436L, 436V, 436W, 437E, 437V, 438H, 그리고 438K로 구성된 군에서 선택될 수 있고,

여기서 번호 매김(numbering)은 Kabat 등의 EU 인덱스에 따르고, ^는 지정된 위치 뒤의 삽입(insertion)을 나타내고 #는 지정된 위치의 결실(deletion)을 나타낸다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 250Q/252Y, 250Q/256E, 250Q/286D, 250Q/308F, 250Q/308Y, 250Q/311A, 250Q/311V, 250Q/380A, 250Q/428L, 250Q/428F, 250Q/434H, 250Q/434F, 250Q/434Y, 250Q/434A, 250Q/434M, 그리고 250Q/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 250E/252Y, 250E/256E, 250E/286D, 250E/308F, 250E/308Y, 250E/311A, 250E/311V, 250E/380A, 250E/428L, 250E/428F, 250E/434H, 250E/434F, 250E/434Y, 250E/434A, 250E/434M, 그리고 250E/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 252Y/250Q, 252Y/250E, 252Y/256E, 252Y/286D, 252Y/308F, 252Y/308Y, 252Y/311A, 252Y/311V, 252Y/380A, 252Y/428L, 252Y/428F, 252Y/434H, 252Y/434F, 252Y/434Y, 252Y/434A, 252Y/434M, 그리고 252Y/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 256E/250Q, 256E/250E, 256E/252Y, 256E/286D, 256E/308F, 256E/308Y, 256E/311A, 256E/311V, 256E/380A, 256E/428L, 256E/428F, 256E/434H, 256E/434F, 256E/434Y, 256E/434A, 256E/434M, 그리고 256E/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 286D/250Q, 286D/250E, 286D/252Y, 286D/256E, 286D/308F, 286D/308Y, 286D/311A, 286D/311V, 286D/380A, 286D/428L, 286D/428F, 286D/434H, 286D/434F, 286D/434Y, 286D/434A, 286D/434M, 그리고 286D/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 308F/250Q, 308F/250E, 308F/252Y, 308F/256E, 308F/286D, 308F/311A, 308F/311V, 308F/380A, 308F/428L, 308F/428F, 308F/434H, 308F/434F, 308F/434Y, 308F/434A, 308F/434M, 그리고 308F/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 308Y/250Q, 308Y/250E, 308Y/252Y, 308Y/256E, 308Y/286D, 308Y/311A, 308Y/311V, 308Y/380A, 308Y/428L, 308Y/428F, 308Y/434H, 308Y/434F, 308Y/434Y, 308Y/434A, 308Y/434M, 그리고 308Y/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 311A/250Q, 311A/250E, 311A/252Y, 311A/256E, 311A/286D, 311A/308F, 311A/308Y, 311A/380A, 311A/428L, 311A/428F, 311A/434H, 311A/434F, 311A/434Y, 311A/434A, 311A/434M, 그리고 311A/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 311V/250Q, 311V/250E, 311V/252Y, 311V/256E, 311V/286D, 311V/308F, 311V/308Y, 311V/380A, 311V/428L, 311V/428F, 311V/434H, 311V/434F, 311V/434Y, 311V/434A, 311V/434M, 그리고 311V/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 380A/250Q, 380A/250E, 380A/252Y, 380A/256E, 380A/286D, 380A/308F, 380A/308Y, 380A/311A, 380A/311V, 380A/428L, 380A/428F, 380A/434H, 380A/434F, 380A/434Y, 380A/434A, 380A/434M, 그리고 380A/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 428L/250Q, 428L/250E, 428L/252Y, 428L/256E, 428L/286D, 428L/308F, 428L/308Y, 428L/311A, 428L/311V, 428L/380A, 428L/434H, 428L/434F, 428L/434Y, 428L/434A, 428L/434M, 그리고 428L/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 428F/250Q, 428F/250E, 428F/252Y, 428F/256E, 428F/286D, 428F/308F, 428F/308Y, 428F/311A, 428F/311V, 428F/380A, 428F/434H, 428F/434F, 428F/434Y, 428F/434A, 428F/434M, 그리고 428F/434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 434H/250Q, 434H/250E, 434H/252Y, 434H/256E, 434H/286D, 434H/308F, 434H/308Y, 434H/311A, 434H/311V, 434H/380A, 434H/428L, 그리고 434H/428F로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 434F/250Q, 434F/250E, 434F/252Y, 434F/256E, 434F/286D, 434F/308F, 434F/308Y, 434F/311A, 434F/311V, 434F/380A, 434F/428L, 그리고 434F/428F로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 434Y/250Q, 434Y/250E, 434Y/252Y, 434Y/256E, 434Y/286D, 434Y/308F, 434Y/308Y, 434Y/311A, 434Y/311V, 434Y/380A, 434Y/428L, 그리고 434Y/428F로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 434A/250Q, 434A/250E, 434A/252Y, 434A/256E, 434A/286D, 434A/308F, 434A/308Y, 434A/311A, 434A/311V, 434A/380A, 434A/428L, 그리고 434A/428F로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 434M/250Q, 434M/250E, 434M/252Y, 434M/256E, 434M/286D, 434M/308F, 434M/308Y, 434M/311A, 434M/311V, 434M/380A, 434M/428L, 그리고 434M/428F로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 434S/250Q, 434S/250E, 434S/252Y, 434S/256E, 434S/286D, 434S/308F, 434S/308Y, 434S/311A, 434S/311V, 434S/380A, 434S/428L, 그리고 434S/428F로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, M252Y/S254T/T256E/N434S, M252Y/S254T/T256E/V308F, M252Y/S254T/T256E/M428L, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L, 그리고 T250Q/V308F/M428L로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L, 그리고 T250Q/V308F/M428L로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 250I, 250V, 252Q, 252Y, 254T, 256V, 259I, 307P, 307Q, 307S, 308F, 309N, 309Y, 311P, 319F, 319L, 428L, 그리고 434S로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, Fc 변이체는 250V/308F, 250I/308F, 254T/308F, 256V/308F, 259I/308F, 307P/208F, 307Q/308F, 307S/308F, 308F/309Y, 308F/309Y, V308F/311P, 308F/319L, 308F/319F, 308F/428L, 252Q/308F, M252Y/S254T/T256E, 259I/434S, 428L/434S, 308F/434S, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S, 308F/319L/434S, 259I/308F/428L, 259I/307Q/308F, 250I/259I/308F, 259I/308F/319L, 307Q/308F/309Y, 307Q/308F/319L, 그리고 250Q/308F/428L로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형을 포함한다.

다른 이형에서, 본 발명에는 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 본 발명에 개시된 Fc 변이체의 효과량을 투여하는 단계를 포함한다.

다른 이형에서, 본 발명에는 항체 또는 면역접합체(immunoadhesin)의 반감기를 증가시키는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 본 발명에 개시된 변형에 따라서 Fc를 변형하는 단계를 포함한다.

본 발명은 FcRn 수용체에 증가된 결합력을 갖는, 항체, Fc 융합체(fusion) 및 면역접합체에서 발견되는 것들을 비롯한 Fc 도메인의 신규한 변이체의 산출을 개시한다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, FcRn에의 결합은 생체 내에서 더욱 긴 혈청 체류(serum retention)를 유도한다.

생체 내에서 Fc 단백질의 체류를 증가시키기 위해서는, 대략 pH 7.4에서 더욱 낮은 친화성을 유지하는 한편, 결합 친화성의 증가가 pH 6 부근에서 일어나야 한다. 여전히 조사 중에 있긴 하지만, 엔도좀에서 pH 6에서 FcRn에의 결합은 Fc를 격리시키기 때문에, Fc 영역은 생체 내에서 더욱 긴 반감기를 갖는 것으로 생각된다(Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 엔도좀 구획은 이후, Fc를 세포 표면으로 재순환시킨다. 일단 엔도좀 구획이 세포외 공간에 개방되면, ~7.4의 높은 pH가 Fc의 혈액으로의 역행 방출을 유도한다. Dall'Acqua 등은 pH 6 및 pH 7.4에서 증가된 FcRn 결합을 갖는 Fc 돌연변이체가 실제로 감소된 혈청 농도 및 야생형 Fc와 동일한 반감기를 갖는 것으로 밝혔다(Dall'Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). pH 7.4에서 FcRn에 대한 Fc의 증가된 친화성은 Fc의 혈액으로의 역행 방출을 차단하는 것으로 생각된다. 이런 이유로, 생체 내에서 Fc의 반감기를 증가시키는 Fc 돌연변이는 이상적으로, 낮은 pH에서 FcRn 결합을 증가시키면서 높은 pH에서 Fc의 방출을 여전히 가능하게 한다. 아미노산 히스티딘은 6.0 내지 7.4의 pH 범위에서 이의 전하 상태(charge state)를 변화시킨다. 이런 이유로, Fc/FcRn 복합체에서 중요한 위치에서 His를 발견하는 것은 놀라운 일이 아니다(도 6).

본 발명의 다른 관점은 엔도좀에서의 Fc/FcRn 결합을 촉진하는 특히 낮은 pH, 대략 pH 6.0에서 야생형과 비교하여 FcRn 결합에서의 증가이다. FcγR에 차별적 결합, 특히 FcγRIIIb에 증가된 결합 및 FcγRIIb에 감소된 결합이 증가된 효능을 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명에서는 변경된 FcRn 결합 및 다른 부류의 Fc 수용체, FcγR(때때로, FcgammaR)에 변경된 결합력을 갖는 Fc 변이체가 또한 개시된다.

정의

본 발명을 더욱 완전하게 이해하기 위하여, 하기에 몇몇 정의가 열거된다. 이런 정의는 문법적 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서, "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포- 매개된 세포독성( antibody dependent cell - mediated cytotoxicity )"은 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고, 이후 상기 표적 세포를 용혈시키는 세포-매개된 반응을 의미한다.

본 명세서에서, "ADCP" 또는 "항체 의존성 세포- 매개된 식세포작용( antibody dependent cell - mediated phagocytosis )"은 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고, 이후 상기 표적 세포의 식세포작용을 유도하는 세포-매개된 반응을 의미한다.

본 명세서에서, "변형"은 폴리펩티드 서열에서 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 또는 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티에 변화를 의미한다. 가령, 변형은 변화된 탄수화물 또는 단백질에 부착된 PEG 구조일 수 있다. 본 명세서에서, "아미노산 변형"은 폴리펩티드 서열에서 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다.

본 명세서에서, "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체를 의미한다. 가령, 치환 E272Y는 272 위치에서 글루타민산이 티로신으로 대체된 변이형 폴리펩티드, 본 발명의 경우에 Fc 변이체를 지칭한다.

본 명세서에서, "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열의 추가를 의미한다. 가령, -233E 또는 ^233E는 233 위치 뒤에 및 234 위치 앞에 글루타민산의 삽입을 나타낸다. 부가적으로, -233ADE 또는 ^233ADE는 233 위치 뒤에 및 234 위치 앞에 AlaAspGlu의 삽입을 나타낸다.

본 명세서에서, "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열의 제거를 의미한다. 가령, E233- 또는 E233#는 233 위치에서 글루타민산의 결실을 나타낸다. 부가적으로, EDA233- 또는 EDA233#는 233 위치에서 시작하는 GluAspAla 서열의 결실을 나타낸다.

본 명세서에서, "변이형 단백질" 또는 "단백질 변이체" 또는 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 변형으로 인하여, 모 단백질과 상이한 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 그 자체, 상기 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 적절하게는, 단백질 변이체는 모 단백질과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들면, 약 1개 내지 약 10개 아미노산 변형, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 본 명세서의 단백질 변이체 서열은 바람직하게는, 모 단백질 서열과 적어도 약 80% 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 상동성을 가질 것이다. 변이형 단백질은 변이형 단백질 그 자체, 상기 단백질 변이체를 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 DNA 서열을 언급할 수 있다. 따라서 본 명세서에서, "항체 변이체" 또는 "변이형 항체"는 하나 이상의 아미노산 변형으로 인하여 부모 항체와 상이한 항체를 의미한다. 본 명세서에서, "IgG 변이체" 또는 "변이형 IgG"는 하나 이상의 아미노산 변형으로 인하여 부모 IgG와 상이한 항체를 의미하고, 본 명세서에서, "면역글로불린 변이체" 또는 "변이형 면역글로불린"은 하나 이상의 아미노산 변형으로 인하여 모 면역글로불린 서열과 상이한 면역글로불린 서열을 의미한다. 본 명세서에서, "Fc 변이체" 또는 "변이형 Fc"는 Fc 도메인에 변형을 포함하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 Fc 변이체는 이들을 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 가령, I332E는 모 Fc 폴리펩티드와 비교하여 치환 I332E를 갖는 Fc 변이체이다. 유사하게, S239D/I332E/G236A는 모 Fc 폴리펩티드와 비교하여 치환 S239D, I332E 및 G236A를 갖는 Fc 변이체를 정의한다. WT 아미노산의 실체가 특정되지 않을 수도 있는데, 이러한 경우에 상기한 변이체는 239D/332E/236A로 지칭된다. 치환이 제공되는 순서는 임의적이다, 다시 말하면, 예로써, S239D/I332E/G236A는 G236A/S239D/I332E 등과 동일한 Fc 변이체이다. 본 발명에서 논의된 모든 위치와 관련하여, 번호 매김(numbering)은 EU 인덱스 또는 EU 번호 매김 설계(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)에 따른다. 상기 EU 인덱스 또는 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스 또는 EU 번호 매김 설계는 EU 항체의 번호 매김을 지칭한다(Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 변형은 부가, 결실, 또는 치환일 수 있다. 변이체는 비-자연 아미노산을 포함할 수 있다. 실례에는 US 6,586,207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10이 포함되고, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함된다.

본 명세서에서, "단백질"은 적어도 2개의 공유 부착된 아미노산을 의미하는데, 여기에는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드가 포함된다. 펩티딜 기는 자연적으로 발생하는 아미노산 및 펩티드 결합, 또는 합성 펩티드모방체 구조, 다시 말하면, 펩토이드(peptoid)와 같은 "유사체(analog)"를 포함할 수 있다(Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992) 참조, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 이들 아미노산은 당업자가 인지하는 바와 같이, 자연 발생하거나, 또는 비-자연 발생할 수 있다. 가령, 호모-페닐알라닌, 시트룰린 및 노르루이신이 본 발명의 목적에 고려되는 아미노산이고, D- 및 L-(R 또는 S) 형태 아미노산이 모두 이용될 수 있다. 본 발명의 변이체는 예로써, 본 발명에 전체가 참조로서 포함되는 Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3; 그리고 Chin et al., 2003, Science 301 (5635):964-7 등에 기술된 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 Schultz 및 동료에 의해 개발된 기술을 이용하여, 통합되는 비자연 아미노산의 이용을 포함하는 변형을 포함할 수 있다. 부가적으로, 폴리펩티드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, 페길화, 원형 순열교환(circular permutation), 고리화, 다른 분자에 연결, 단백질 또는 단백질 도메인에 융합 및 펩티드 태그 또는 표지의 추가를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, "잔기"는 단백질에서 위치 및 이의 연관된 아미노산 실체를 의미한다. 가령, 아스파라긴 297(또는 Asn297 또는 N297로 지칭됨)은 인간 항체 IgG1에서 잔기이다.

본 명세서에서, "Fab" 또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fab는 상기 영역 단독, 또는 전장 항체, 항체 단편 또는 Fab 융합 단백질의 맥락에서 상기 영역을 지칭할 수 있다.

본 명세서에서, "IgG 하위부류 변형"은 한 IgG 동종형에서 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 동종형에서 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 가령, EU 296 위치에서 IgG1이 티로신을 포함하고 IgG2가 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2에서 F296Y 치환은 IgG 하위부류 변형으로 간주된다.

본 명세서에서, "비-자연 발생 변형"은 동종형이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 가령, IgG 중에서 어느 것도 332 위치에서 글루타민산을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 치환 I332E는 비-자연 발생 변형으로 간주된다.

본 명세서에서, "아미노산" 및 "아미노산 실체( identity )"는 특정의 규정된 위치에 존재할 수 있는 20개의 자연 발생 아미노산 중에서 하나 또는 임의의 비-자연 유사체를 의미한다.

본 명세서에서, "효과기 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 유래되는 생화학적 현상을 의미한다. 효과기 기능에는 ADCC, ADCP 및 CDC가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 명세서에서, "효과기 세포"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 면역계의 세포를 의미한다. 효과기 세포에는 단핵세포, 대식세포, 중성구, 수지상세포, 호산구, 비만세포, 혈소판, B 세포, 큰 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 γδT 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 생물체로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에서, "IgG Fc 리간드"는 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 생물체로부터 유래된 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드에는 FcγR, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 레시틴, 만노스 수용체, 스타필로코커스 단백질 A, 스트렙토코커스 단백질 G 및 바이러스 FcγR이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. Fc 리간드는 또한, FcγR에 상동한 Fc 수용체 계통인 Fc 수용체 동족체(FcRH)를 포함한다(Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). Fc 리간드는 Fc에 결합하는 아직 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다. 특히, IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본 명세서에서, "Fc 리간드"는 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 생물체로부터 유래된 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다.

본 명세서에서, "Fc 감마 수용체", "Fc γR" 또는 "FcgammaR"은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질 계통의 임의의 구성원을 의미하고, FcγR 유전자에 의해 인코딩된다. 인간의 경우에, 이러한 계통에는 동종형 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc을 비롯한 FcγRI(CD64); 동종형 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함) 및 FcγRIIc를 비롯한 FcγRII(CD32); 그리고 동종형 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2 포함)을 비롯한 FcγRIII(CD16)(Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨), 그리고 임의의 발견되지 않은 인간 FcγR 또는 FcγR 동종형 또는 알로타입이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. FcγR은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 생물체로부터 유래될 수 있다. 생쥐 FcγR에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2)과 임의의 발견되지 않은 생쥐 FcγR 또는 FcγR 동종형 또는 알로타입이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 명세서에서, "FcRn" 또는 "신생아 Fc 수용체"는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질을 의미하고, 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 상기 FcRn은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 생물체로부터 유래될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 기능적 FcRn 단백질은 종종, 경쇄 및 중쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않으면, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 지칭한다. 특히 인간 서열에서 주목되는 FcRn 서열이 도면에 도시된다.

본 명세서에서, "모 폴리펩티드"는 차후에 변형되어 변이체를 생성하는 비변형 폴리펩티드를 의미한다. 모 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드, 또는 자연 발생 폴리펩티드의 변이체 또는 조작된 이형일 수 있다. 모 폴리펩티드는 폴리펩티드 그 자체, 상기 모 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 따라서 본 명세서에서, "모 면역글로불린"은 변형되어 변이체를 생성하는 비변형 면역글로불린 폴리펩티드를 의미하고, 본 명세서에서, "모 항체"는 변형되어 변이형 항체를 생성하는 비변형 항체를 의미한다. "모 항체"에는 하기에 기술된 바와 같은 공지의 상업적인 재조합적으로 생산된 항체가 포함된다는 점에 주의해야 한다.

본 명세서에서, "위치"는 단백질 서열에서 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 양식, 예를 들면, Kabat 등에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따라서 번호 매김 된다. 가령, 297 위치는 인간 항체 IgG1에서 위치이다.

본 명세서에서, "표적 항원"은 소정의 항체의 가변 영역에 특이적으로 결합된 분자를 의미한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 기타 화학적 화합물일 수 있다.

본 명세서에서, "표적 세포"는 표적 항원을 발현하는 세포를 의미한다.

본 명세서서, "가변 영역"은 실질적으로, 각각 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 유전자 좌위를 구성하는 Vκ, Vλ 및/또는 VH 유전자 중에서 임의의 하나에 의해 인코딩되는 하나 이상의 Ig 영역을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다.

본 명세서에서, "야생형 또는 WT"는 대립유전자성 변이를 비롯하여, 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

본 발명은 FcRn에 조정된 결합을 나타내는 항체에 관계한다(조정은 증가된 결합 및 감소된 결합을 포함한다). 가령, 일부 경우에, 증가된 결합은 항체의 세포 재순환을 유도하고, 따라서 예로써, 치료 항체의 반감기를 증가시킨다. 대안으로, 예로써 방사능 표지를 포함하는 치료 항체 또는 진단 항체의 경우에는 감소된 FcRn 결합이 바람직하다. 이에 더하여, FcRn에 증가된 결합을 나타내는 항체 및 다른 Fc 수용체, 예를 들면 FcγR에 변화된 결합을 나타내는 항체가 본 발명에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 항체를 제시한다.

항체

본 발명은 FcRn에 결합을 조정하는 아미노산 변형을 포함하는 항체에 관계한다. 특히, 낮은 pH에서 FcRn에 대한 증가된 결합 친화성을 나타내고, 높은 pH에서 실질적으로 변화된 결합을 나타내지 않은 Fc 영역, 또는 그 기능적 변이체를 최소한 포함하는 항체가 주목된다.

전통적인 항체의 구조적 단위체는 전형적으로, 사합체이다. 각 사합체는 전형적으로, 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(전형적으로, 약 25kDa의 분자량) 및 하나의 "중쇄"(전형적으로, 약 50-70kDa의 분자량)로 구성된다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 동종형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 규정한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 여러 하위부류를 포함한다. IgM은 IgM1 및 IgM2가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하위부류를 포함한다. 따라서 본 명세서에서, "동종형(isotype)"은 불변 영역의 화학적 특성 및 항원적 특성에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 하위부류를 의미한다. 공지된 인간의 면역글로불린 동종형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD 및 IgE이다.

각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 구성된 가변 영역을 포함한다. 상기 가변 영역에서, 중쇄 및 경쇄의 각 V 영역에 대하여 3개의 루프(loop)가 모여 항원 결합 부위(antigen-binding site)를 형성한다. 루프 각각은 상보성 결정 영역(complementarity-determining region; 이하 "CDR")으로 지칭되는데, 여기에서 아미노산 서열의 변이가 가장 현저하다.

각 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. Kabat 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 다수의 일차 서열을 수집하였다. 이들 서열의 보존도에 기초하여, 개별적 일차 서열을 CDR 및 골격으로 분류하고, 이의 목록을 만들었다(참조: SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al., 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

면역글로불린의 IgG 하위부류에서, 중쇄 내에 여러 면역글로불린 도메인이 존재한다. 본 명세서에서, "면역글로불린( Ig ) 도메인"은 특징적인 3차 구조를 갖는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 본 발명에서, 불변 중세(CH) 도메인 및 힌지 도메인을 포함하는 중쇄 도메인이 특히 주목된다. IgG 항체의 배경에서, IgG 동종형은 각각 3개의 CH 영역을 갖는다. 따라서 IgG의 배경에서 "CH" 도메인은 아래와 같다: "CH1"은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른 118-220 위치를 지칭한다; "CH2"는 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른 237-340 위치를 지칭한다; "CH3"은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른 341-447 위치를 지칭한다.

중쇄 Ig 도메인의 다른 유형은 힌지 영역(hinge region)이다. 본 명세서에서, "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "면역글로불린 힌지 영역"은 항체의 첫 번째 및 두 번째 불변 도메인 간에 아미노산을 포함하는 유연성 폴리펩티드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 220 위치에서 종결되고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 237 위치에서 시작된다. 따라서 IgG의 경우에, 항체 힌지는 여기에서 221 위치(IgG1에서 D221) 내지 236 위치(IgG1에서 G236)를 포함하는 것으로 정의되는데, 여기에서 번호 매김은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다. 일부 구체예에서, 예로써 Fc 영역의 배경에서, 하부 힌지가 포함되는데, 상기 "하부 힌지"는 일반적으로, 226 또는 230 위치를 지칭한다.

본 발명에서, Fc 도메인이 특히 주목된다. 본 명세서에서, "Fc" 또는 "Fc 영역"은 첫 번째 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 일부 경우에, 힌지의 부분을 배제하고 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 이들 도메인의 N-말단에서 유연성 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우에, Fc는 J 사슬을 포함한다. IgG의 경우에, 도 1에 도시된 바와 같이, Fc는 면역글로불린 도메인 Cgamma2 및 Cgamma3(Cγ2 및 Cγ3) 및 Cgamma1(Cγ1) 및 Cgamma2(Cγ2) 간에 하부 힌지 영역을 포함한다. 비록 Fc 영역의 경계가 변할 수 있긴 하지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로, 이의 카르복시 말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되는데, 여기에서 번호 매김은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다. Fc는 이러한 영역 단독, 또는 하기에 기술된 바와 같은 Fc 폴리펩티드의 배경에서 상기 영역을 지칭할 수 있다. 본 명세서에서, "Fc 폴리펩티드"는 Fc 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 폴리펩티드는 항체, Fc 융합체, 분리된 Fc 및 Fc 단편을 포함한다.

일부 구체예에서, 항체는 전장이다. 본 명세서에서, "전장 항체"는 하기에 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형을 포함하는, 가변 및 불변 부위를 비롯한 항체의 자연적 생물학적 형태를 구성하는 구조를 의미한다.

대안으로, 항체는 항체 단편, 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 합성 항체(종종, "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합체(종종, "항체 접합체(conjugate)"로 언급됨) 및 각각의 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 구조를 취할 수 있다.

항체 단편

한 구체예에서, 항체는 항체 단편이다. 불변 중쇄 영역 융합을 포함하고, Fc 영역, Fc 융합체 및 중쇄의 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3)을 포함하는 항체가 특히 주목된다.

특이적 항체 단편에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (iv) 단일 가변 부위로 구성되는 dAb 단편(Ward et al., 1989, Nature 341 :544-546, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨); (v) 분리된 CDR 영역, (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가성 단편인 F(ab')2 단편, (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결되고, 상기 펩티드 링커가 이들 두 도메인을 연합시켜 항원 결합 부위를 형성하도록 하는 단쇄 Fv 분자(scFv)(Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨), (viii) 이중특이적 단쇄 Fv(WO 03/11161, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 작제된 "디아바디(diabody)" 또는 "트리아바디(triabody)", 다가성 또는 다중특이적 단편(Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항체 단편은 변형될 수 있다. 가령, 이들 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 결합의 통합에 의해 안정화될 수 있다(Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

키메라 및 인간화 항체

일부 구체예에서, 골격 성분은 상이한 종으로부터 유래된 혼합물일 수 있다. 따라서 만약 단백질이 항체라면, 이런 항체는 키메라 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있다. 일반적으로, "키메라 항체" 및 "인간화 항체"는 둘 모두 한 가지 이상의 종으로부터 유래된 영역을 합병하는 항체를 지칭한다. 가령, "키메라 항체"는 전통적으로, 생쥐(또는 일부 경우에, 쥐)로부터 가변 영역 및 인간으로부터 불변 영역을 포함한다. "인간화 항체"는 일반적으로, 인간 항체에서 관찰되는 서열로 대체된 가변-도메인 골격 영역을 포함하는 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체에서, CDR을 제외한 전체 항체는 인간 유래의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되거나, 또는 CDR 내부를 제외하고 이런 항체에 동일하다. 전부 또는 일부가 비-인간 생물체에서 기원하는 핵산에 의해 인코딩되는 CDR은 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 골격으로 이식되어 항체를 형성하고, 상기 항체의 특이성은 이식된 CDR에 의해 결정된다. 이들 항체의 산출은 예로써, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321 :522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536에 기술되는데, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 선별된 수용자 골격 잔기의 상응하는 공여자 잔기로의 "복귀돌연변이(backmutation)"는 최초 이식된 구조체에서 상실된 친화성을 회복하기 위하여 종종 필요하다(US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 최적으로는, 인간화 항체는 전형적으로, 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하고, 따라서 전형적으로, 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한, 유전적으로 조작된 면역계를 갖는 생쥐를 이용하여 산출될 수 있다(Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 비-인간 항체를 인간화하고 재구축하는 다양한 기술 및 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다(참조: Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) 및 여기에 인용된 참고문헌, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 인간화 방법에는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res.57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11 :321-8에 기술된 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 비인간 항체 가변 영역의 인간화 또는 면역원성을 감소시키는 다른 방법에는 예로써, 본 발명에 전체가 참조로서 포함되는 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969-973에 기술된 바와 같은 재표면화(resurfacting) 방법이 포함될 수 있다. 한 구체예에서, 부모 항체는 당분야에 공지된 바와 같이, 친화성 성숙된다. 구조 기초된 방법, 예를 들면, USSN 11/004,590에 기술된 바와 같은 방법이 인간화 및/또는 친화성 성숙에 이용될 수 있다. 본 발명에 전체가 참조로서 포함되는 Wu et al., 1999, J. MoI. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 (37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759에 기술된 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 선별 기초된 방법이 항체 가변 영역을 인간화 및/또는 친화성 성숙시키는데 이용될 수 있다. 본 발명에 전체가 참조로서 포함되는 USSN 09/810,502; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084에 기술된 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 인간화 방법은 CDR 부위 만의 이식을 필요로 한다.

이중특이적 항체

한 구체예에서, 본 발명의 항체는 다중특이적 항체, 특히 종종 "디아바디(diabody)"로 지칭되는 이중특이적 항체이다. 이들은 2개(또는 그 이상)의 상이한 항원에 결합하는 항체이다. 디아바디는 당분야에 공지된 다양한 방법(Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)으로, 예를 들면, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있다.

미니바디

한 구체예에서, 본 발명의 항체는 미니바디이다. 미니바디는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 최소화된 항체-유사 단백질이다(Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 일부 경우에, scFv는 Fc 영역에 연결될 수 있고, 힌지 영역의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.

인간 항체

한 구체예에서, 본 발명의 항체는 본 발명에 개시된 바와 같은 하나 이상의 변형을 갖는 완전 인간 항체이다. "완전 인간 항체" 또는 "완벽 인간 항체"는 본 발명에 개시된 변형을 갖는 인간 염색체로부터 유래된 항체의 유전자 서열을 갖는 인간 항체를 지칭한다.

항체 융합체

한 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체 융합 단백질(종종 "항체 접합체"로 지칭됨)이다. 한 유형의 항체 융합체는 Fc 영역을 접합체 짝과 연결하는 Fc 융합체를 포함한다. 본 명세서에서, "Fc 융합체"는 하나 이상의 폴리펩티드가 Fc 영역에 작동가능하게 연결된 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 Fc 융합체는 선행 기술(Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨)에 이용된 바와 같은 용어 "면역접합체", "Ig 융합체", "Ig 키메라" 및 "수용체 글로불린"(종종 대시(dash)와 함께)과 동의어이다. Fc 융합체는 면역글로불린의 Fc 영역을 일반적으로 단백질 또는 소분자(small molecule)일 수 있는 융합 짝과 합병한다. 실질적으로 임의의 단백질 또는 소분자가 Fc에 연결되어 Fc 융합체를 생성할 수 있다. 단백질 융합 짝에는 임의의 항체의 가변 영역, 수용체의 표적 결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨, 케모킨, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 소분자 융합 짝은 Fc 융합체를 치료 표적으로 지향시키는 임의의 치료제를 포함할 수 있다. 이런 표적은 질환에 연관되는 임의의 분자, 바람직하게는, 세포외 수용체일 수 있다. 따라서 IgG 변이체는 하나 이상의 융합 짝에 연결될 수 있다. 대안적 구체예에서, IgG 변이체는 다른 치료 화합물에 접합되거나, 또는 작동가능하게 연결된다. 치료 화합물은 세포독성제, 화학치료제, 독소, 방사성동위원소, 사이토킨, 또는 기타 치료 활성 물질일 수 있다. IgG는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체와 같은 다양한 비단백질성 중합체 중의 하나에 연결될 수 있다.

Fc 융합체 이외에, 항체 융합체는 중쇄의 불변 영역과 하나 이상의 융합 짝(임의의 항체의 가변 영역 포함)의 융합을 포함하고, 반면 다른 항체 융합체는 융합 짝을 포함하는 실질적으로 또는 완전히 전장 항체이다. 한 구체예에서, 융합 짝의 역할은 표적 결합을 매개하는 것이고, 따라서 항체의 가변 영역에 기능적으로 유사하다(그리고 실제로, 항체의 가변 영역일 수 있다). 실질적으로 임의의 단백질 또는 소분자가 Fc에 연결되어 Fc 융합체(또는 항체 융합체)를 생성할 수 있다. 단백질 융합 짝에는 수용체의 표적 결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨, 케모킨, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 소분자 융합 짝은 Fc 융합체를 치료 표적으로 지향시키는 임의의 치료제를 포함할 수 있다. 이런 표적은 질환에 연관되는 임의의 분자, 바람직하게는 세포외 수용체일 수 있다.

접합체 짝은 단백질 또는 비-단백질일 수 있다; 후자는 일반적으로, 항체 또는 접합체 짝 상에서 작용기를 이용하여 생성된다. 가령, 링커는 당분야에 공지되어 있다; 가령, 호모- 또는 헤테로-이중기능성 링커가 공지되어 있다(참조: 1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200, 이는 본 발명에 참조로서 포함됨).

적절한 접합체에는 하기에 기술된 표지, 약물, 그리고 세포독성 약물(가령, 화학치료제) 또는 독소 또는 이런 독소의 활성 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포독성제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적합한 독소 및 이들의 상응하는 단편에는 디프테리아 A 사슬, 엑소톡신 A 사슬, 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 큐린(curcin), 크로틴(crotin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 등이 포함된다. 세포독성제에는 또한, 방사성동위원소를 항체에 접합하거나, 또는 방사성핵종을 항체에 공유 부착된 킬레이트제(chelating agent)에 결합시킴으로써 만들어진 방사성화학물질이 포함된다. 부가적인 구체예는 칼리케아마이신(calicheamicin), 아우리스타틴(auristatin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메이탄신(maytansine), 그리고 듀오카르마이신(duocarmycin) 및 유사체를 이용한다; 후자의 경우에, U.S. 2003/0050331A1을 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

항체의 공유 변형

항체의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되고, 항상 그런 것은 아니지만, 일반적으로 번역 이후에 수행된다. 가령, 항체의 여러 유형의 공유 변형은 항체의 특정 아미노산 잔기를 선별된 측쇄 또는 N-또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자내로 도입된다.

시스테이닐(cysteinyl) 잔기는 일반적으로, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 σ-할로아세테이트(및 상응하는 아민)와 반응하여, 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 생성한다. 시스테이닐 잔기는 또한, 브로모트리플로오르아세톤, σ-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬 말레이미드, 3-니트로-2-피리딜디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니크로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸 등과의 반응에 의해 유도체화 될 수 있다.

히스티딜(histidyl) 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸피로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화될 수 있는데, 그 이유는 상기 작용제가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라-브로모페나실 브롬화물 역시 유용하다; 이러한 반응은 바람직하게는, pH 6.0에서 0.1 M 나트륨 카코딜레이트에서 수행된다.

리시닐(lysinyl) 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응된다. 이들 작용제를 이용한 유도체화는 리시닐 잔기의 전하를 역진시키는 효과를 갖는다. 알파-아미노 함유 잔기를 유도체화하는데 적합한 다른 시제에는 이미도에스테르, 예를 들면, 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드리드; 트리니트로벤젠설폰산; 0-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 그리고 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매된 반응이 포함된다.

아르기닐(arginyl) 잔기는 하나 또는 수개의 통상적인 시제와의 반응으로 변형되는데, 이들 시제에는 페닐글리옥살, 2-3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린이 포함된다. 아르기닌 잔기의 유도체화 반응은 구아니딘 작용기의 높은 pKa로 인하여 알칼리성 조건에서 수행되어야 한다. 더 나아가, 이들 시제는 아르기닌 엡실론-아미노기뿐만 아니라 리신 기와 반응할 수 있다.

티로실(tyrosyl) 잔기의 특이적 변형이 만들어지는데, 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응으로 스펙트럼 표지의 티로실 잔기 내로 도입이 특히 주목된다. 일반적으로, 0-아세틸 티로실 화학종 및 3-니트로 유도체를 형성하는데 N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄이 각각 이용된다. 티로실 잔기는 방사성면역분석에 이용을 위한 표지된 단백질을 만들기 위하여 125I 또는 131I를 이용하여 요오드화되는데, 앞서 기술된 클로라민 T 방법이 적합하다.

카르복실 측쇄기(아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드(R'- N=C=N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형되는데, 여기서 R 및 R'는 선택적으로 상이한 알킬기, 예를 들면, 1-시클로헥실-3-(2-모르포리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드이다. 더 나아가, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과 반응으로 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

이중기능성 작용제를 이용한 유도체화는 하기에 기술된 방법 이외에, 다양한 방법에 이용을 위하여 항체를 물-불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 가교 연결하는데 유용하다. 통상적으로 이용되는 가교 연결제에는 예로써, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들면, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티올비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 비롯한 호모이중기능성 이미도에스테르, 그리고 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이중기능성 말레이미드가 포함된다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 광의 존재에서 가교를 형성할 수 있는 광활성 중간체를 산출한다. 대안으로, 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 그리고 4,330,440에 기술된 반응성 기질 및 반응성 물-불용성 매트릭스, 예를 들면, 시아노겐 브롬화물-활성화 탄수화물이 단백질 고정화에 이용된다.

글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 탈아미노화(deamidation)된다. 대안으로, 이들 잔기는 약한 산성 조건에서 탈아미노화된다. 이들 잔기는 어떤 형태이든지 본 발명의 범위에 속한다. 다른 변형에는 프롤린 및 리신의 수소화(hydroxylation), 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화(phosphorylation), 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 σ-아미노기의 메틸화(methylation)(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983], 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨), N-말단 아민의 아세틸화(acetylation) 및 C-말단 카르복실기의 아미드화(amidation)가 포함된다.

글리코실화

다른 유형의 공유 변형은 글리코실화(glycosylation)이다. 다른 구체예에서, 본 발명에 개시된 IgG 변이체는 하나 이상의 조작된 단백당형(glycoform)을 포함하도록 변형될 수 있다. 본 명세서에서, "조작된 단백당형"은 IgG에 공유 부착된 탄수화물 조성물을 의미하는데, 여기서 상기 탄수화물 조성물은 모 IgG의 것과 화학적으로 상이하다. 조작된 단백당형은 효과기 기능 향상 또는 감소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 목적에 이용될 수 있다. 조작된 단백당형은 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨; (Potelligent™ technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb® glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zurich, Switzerland]). 이들 기술 중에서 상당수는 예로써, 조작된 다양한 생물체 또는 세포주(가령, Lec-13 CHO 세포 또는 쥐 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 IgG를 발현하거나, 글리코실화 경로에 연관된 효소(가령, FUT8[σ1,6-푸코실트랜스퍼라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III[GnTIII])를 조절하거나, 또는 IgG가 발현된 이후에 탄수화물을 변형함으로써, Fc 영역에 공유 부착된 푸코실화 및/또는 이등분 올리고사카라이드의 수준을 조절하는데 기초된다. 조작된 단백당형은 전형적으로, 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드를 지칭한다; 따라서 IgG 변이체, 예를 들면, 항체 또는 Fc 융합체는 조작된 단백당형을 포함할 수 있다. 대안으로, 조작된 단백당형은 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드를 포함하는 IgG 변이체를 지칭할 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 글리코실화 패턴은 단백질의 서열(가령, 하기에 기술된 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생산되는 숙주 세포 또는 생물체에 좌우될 수 있다. 특정 발현 시스템은 하기에 기술된다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로, N-연결되거나, 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리-펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서 폴리펩티드 내에서 이들 트리-펩티드 서열의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 발생시킨다. O-연결 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로오스 중에서 하나의 부착을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신 역시 이용될 수 있다.

항체에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 하나 이상의 앞서 기술된 트리-펩티드 서열을 포함하도록 상기 아미노산 서열을 변형함으로써 손쉽게 달성된다(N-연결된 글리코실화 부위의 경우에). 이러한 변화는 개시 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해서 달성될 수도 있다(O-연결 글리코실화 부위의 경우에). 편의를 위하여, 항체 아미노산 서열은 바람직하게는, 특히 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 산출되도록 미리 선별된 염기에서 표적 펩티드를 인코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써, DNA 수준에서 변화를 통하여 변형된다.

항체 상에서 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 단백질에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 커플링(coupling)시키는 것이다. 이들 절차는 N- 및 O-연결 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 단백질의 생산을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용되는 커플링 방식에 따라서, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 자유 카르복실기, (c) 시스테인에 있는 것과 같은 자유 설피드릴 기, (d) 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린에 있는 것과 같은 자유 하이드록실 기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판에 있는 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 WO 87/05330; Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 기술되는데, 이들은 본 발명에 전체가 참조로서 포함된다.

출발 항체 상에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화(deglycosylation)는 화합물 트리플루오르메탄설폰산 또는 동등한 화합물에 단백질의 노출을 필요로 한다. 이러한 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 유도하지만, 폴리펩티드는 본래대로 남겨진다. 화학적 탈글리코실화는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52; Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131에서 기술된다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350에 기술된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다아제의 이용으로 달성될 수 있다. 잠재적 글리코실화 부위에서 글리코실화는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105에 기술된 바와 같은 화합물 투니카마이신의 이용으로 예방될 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코시드 연결의 형성을 차단한다.

항체의 다른 유형의 공유 변형은 예로써, 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Nektar Therapeutics의 2005-2006 PEG Catalog(Nektar 웹사이트에서 입수가능); 그리고 US Patent 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기술된 방식으로, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌과 같은 다양한 폴리올이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 비단백질성 중합체에 항체의 연결을 포함한다. 부가적으로, 당분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 치환은 PEG와 같은 중합체의 부가를 용이하게 하기 위하여 항체 내에 다양한 위치에서 수행될 수 있다. 예로써, U.S. Publication No. 2005/0114037A1을 참조하는데, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

표지된 항체

일부 구체예에서, 본 발명의 항체의 공유 변형은 하나 이상의 표지의 부가를 포함한다. 일부 경우에, 이들은 항체 융합체로 간주된다. 용어 "표지 기(labeling group)"는 임의의 검출가능 표지를 의미한다. 일부 구체예에서, 표지 기는 잠재적 입체 방해(steric hindrance)를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이스 암(arm)을 통하여 항체에 커플링된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있고, 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있다.

일반적으로, 표지는 검출 분석법에 따라서, 다양한 부류로 구분된다: a) 방사성 또는 중(heavy) 동위원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 자성 표지(가령, 자석 입자; c) 산화환원반응 모이어티; d) 광학성 염료; 효소 기(가령, 양고추냉이 과산화효소, 베타-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제); e) 비오틴화 기; 그리고 f) 2차 리포터(가령, 루이신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프. 일부 구체예에서, 표지 기는 잠재적 입체 방해를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이스 암(arm)을 통하여 항체에 커플링된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있고, 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있다.

특이적 표지에는 발색단(chromophore), 인광물질(phosphor) 및 형광단(fluorophore)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 후자는 많은 경우에 특이적이다. 형광단은 "소분자" 형광물질, 또는 단백질성 형광물질일 수 있다.

본 명세서에서, "형광 표지"는 내재된 형광 특성을 통하여 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적합한 형광 표지에는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루 J, 텍사스 레드, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, 오레곤 그린, Alexa-Fluor 염료(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우 및 R-피코에리트린(PE)(Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, 로다민 및 텍사스 레드(Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7(Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 형광단을 비롯한 적절한 광학성 염료는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland에 기술된다.

적절한 단백질성 형광 표지에는 또한, GFP의 레닐라, 프틸로사르쿠스 또는 아에쿠오레아 화학종을 비롯한 그린 형광 단백질(Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP(Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), 청색 형광 단백질(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 향상된 황색 형광 단백질(EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), 루시페라아제(lchiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β 갈락토시다아제(Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) 및 레닐라(WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. Patent No. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 문단에서 앞서 언급된 모든 참고문헌은 본 발명에 전체가 참조로서 포함된다.

IgG 변이체

한 구체예에서, 본 발명은 변이형 IgG 단백질을 제시한다. 최소한, IgG 변이체는 중쇄의 CH2-CH3 영역을 포함하는 항체 단편을 포함한다. 부가적으로, 적절한 IgG 변이체는 Fc 도메인(가령, 하부 힌지 영역 포함)을 포함하고, 또한 중쇄의 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3)을 포함하는 IgG 변이체 또한 본 발명에 유용하며, 이들 모두 융합 짝에 융합될 수 있다.

IgG 변이체는 모 IgG 폴리펩티드, 일부 경우에 야생형 IgG와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 이러한 IgG 변이체는 하나 이상의 최적화된 특성을 가질 수 있다. IgG 변이체는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 IgG와 아미노산 서열에서 차이가 난다. 따라서 IgG 변이체는 모 IgG와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 대안으로, IgG 변이체는 모 IgG와 비교하여, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들면, 약 1개 내지 50개 아미노산 변형, 바람직하게는 약 1개 내지 약 10개 아미노산 변형, 가장 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형을 포함한다.

따라서 IgG 변이체의 서열 및 모 Fc 폴리펩티드의 서열은 실질적으로 상동하다. 가령, 본 발명의 IgG 변이체 서열은 모 IgG 변이체 서열과 약 80% 상동성, 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 가질 것이다. 변형은 분자생물학을 이용하여 유전적으로 수행되거나, 또는 효소적으로 또는 화학적으로 수행될 수 있다.

항체에 대한 표적 항원

하기의 표적 항원 목록에 속하는 단백질, 아단위, 도메인, 모티브 및/또는 에피토프가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 실질적으로 임의의 항원이 IgG 변이체에 의해 표적화될 수 있는데, 이러한 표적 항원에는 막통과 수용체를 비롯하여, 사이토킨과 같은 가용성 인자 및 막-결합 인자가 모두 포함된다: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Addressins, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 길항제, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항-Id, ASPARTIC, 심방나트륨이뇨인자, av/b3 인테그린, AxI, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, BcI, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2, BMP-2a, BMP-3 오스테오제닌, BMP-4, BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 골-유래된 향신경성 인자(bone-derived neurotrophic factor), BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암배아 항원(CEA), 암종 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 독소, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 시토케라틴 종양-연관 항원(cytokeratin tumor-associated antigen), DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 분해 가속화 인자, des(1-3)-IGF-1(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리나아제, eNOS, Eot, 에오탁신1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 인자 IIa, 인자 VII, 인자 VIIIc, 인자 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein)(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, Fractalkine, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파1, GFR-알파2, GFR-알파3, GITR, 글루카곤, Glut 4, 당단백질 IIb/IIIa(GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 자극 인자, 합텐(Np-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV, gb 외피 당단백질, HCMV) gH 외피 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2, Her2/neu(ErbB2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 포진 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종-연관 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV MIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRF, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로 바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 인슐린-유사 성장 인자1, 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파4/베타1, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파5(알파V), 인테그린 알파5/베타1, 인테그린 알파5/베타3, 인테그린 알파6, 인테그린 베타1, 인테그린 베타2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 각질세포 성장 인자(keratinocyte growth factor, KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠복 TGF-1, 잠복 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, Lewis-Y 항원, Lewis-Y 관련된 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 계면활성제, 황체형성 호르몬, 림포독소 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, 메탈로프로테아제, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 점액소(Muc1), MUC18, 뮐러 저해 물질(Muellerian-inhibitin substance), Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-카드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3,-4, 또는 -6, 뉴투린, 신경 성장 인자(neuronal growth factor, NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반형 알칼리성 포스파타아제(placental alkaline phosphatase, PLAP), PIGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로렐락신, 단백질 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 세포막 항원(prostate specific membrane antigen, PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 렐락신 A-사슬, 렐락신 B-사슬, 레닌, 호흡기 합포체 바이러스(RSV) F, RSV Fgp, Ret, 류머토이드 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양-연관된 당단백질-72), TARC, TCA-3, T-세포 수용체(가령, T-세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP-유사 알칼리성 포스파타아제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타 RI(ALK-5), TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone), Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파 베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴, DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 Lewis Y 관련된 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카드헤린, VE-카드헤린-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 본 빌레브란트(von Willebrand) 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, 그리고 호르몬 및 성장 인자에 대한 수용체.

당업자는 상기한 표적 목록이 특정 단백질 및 생물분자뿐만 아니라 이들을 포함하는 생화학적 경로(들)를 지칭한다는 것을 인지할 것이다. 가령, 표적 항원으로서, CTLA-4의 언급은 CTLA-4, B7-1, B7-2, CD28 및 이들 단백질에 결합하는 임의의 다른 발견되지 않은 리간드 또는 수용체를 비롯한, T 세포 보조-자극 경로를 구성하는 리간드 및 수용체 역시 표적이 된다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명에 이용되는 표적은 특정 생물분자뿐만 아니라 상기 표적 및 상기 표적이 속하는 생화학 경로의 구성원과 상호작용하는 일단의 단백질을 지칭한다. 당업자는 또한, 임의의 상기한 표적 항원, 이들에 결합하는 리간드 또는 수용체, 또는 이들의 상응하는 생화학 경로의 다른 구성원이 본 발명의 Fc 변이체에 작동가능하게 연결되어 Fc 융합체를 생성할 수 있다는 것을 더욱 인지할 것이다. 따라서 예로써, EFGR을 표적으로 하는 Fc 융합체는 Fc 변이체를 EGF, TGF-β, 또는 EGFR에 결합하는 발견되었거나 아직 발견되지 않은 임의의 다른 리간드에 작동가능하게 연결함으로써 작제될 수 있다. 따라서 본 발명의 Fc 변이체는 EGF, TGF-β, 또는 EGFR에 결합하는 발견되었거나 아직 발견되지 않은 임의의 다른 리간드에 결합하는 Fc 융합체를 생성하기 위하여 EGFR에 작동가능하게 연결될 수 있다. 따라서 리간드, 수용체, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인인지에 상관없이, 상기한 표적 및 이들의 상응하는 생화학 경로를 구성하는 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 실질적으로 임의의 폴리펩티드가 본 발명의 Fc 변이체에 작동가능하게 연결되어 Fc 융합체를 생성할 수 있다.

적절한 항원의 선택은 원하는 적용에 따라 달라진다. 항암 치료의 경우에, 발현이 암 세포로 국한된 표적을 확보하는 것이 바람직하다. 항체 치료에 특히 적합한 것으로 증명된 일부 표적은 신호전달 기능을 갖는 것들이다. 다른 치료 항체는 수용체 및 이의 동계(cognate) 리간드 간의 결합을 저해하여 수용체의 신호전달을 차단함으로써 효과를 발휘한다. 치료 항체의 다른 작용 기전은 수용체의 하향 조절하는 것이다. 다른 항체는 표적 항원을 통한 신호전달로 작용하지 않는다. 일부 경우에, 감염성 병원체에 대한 항체가 이용된다.

한 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 사이토킨에 대한 항체 내로 통합된다. 대안으로, 이들 Fc 변이체는 사이토킨에 융합 또는 접합된다. 본 명세서에서, "사이토킨"은 세포간 매개인자로서 다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 포괄적 용어이다. 가령, 본 발명에서 참조로서 편입되는 Penichet et al., 2001, J Immunol Methods 248:91-101에 기술된 바와 같이, 사이토킨은 항체에 융합하여 다양한 원하는 특성을 제공할 수 있다. 이런 사이토킨의 실례는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 이들 사이토킨에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들면, 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반성 락토젠; 종양 괴사 인자-알파 및 베타; 뮐러-저해 물질; 생쥐 생식샘 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 쓰롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF-베타; 혈소판 성장 인자; 전환 성장 인자(TGF), 예를 들면, TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성자인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들면, 인터페론-알파, 베타 및 감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들면, 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF) 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예를 들면, IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15; 종양 괴사 인자, 예를 들면, TNF-알파 또는 TNF-베타; C5a; 그리고 LIF 및 키트 리간드(KL)를 유도하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본 명세서에서, 사이토킨은 자연 공급원 또는 재조합 세포 배양액으로부터 유래된 단백질, 또는 고유 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.

사이토킨 및 가용성 표적, 예를 들면, TNF 대과 구성원이 본 발명의 변이체와 함께 이용에 바람직한 표적이다. 가령, 항-VEGF, 항-CTLA-4, 항-TNF 항체, 또는 이들의 단편이 FcRn 결합을 증가시키는 Fc 변이체의 이용에 특히 적합한 항체이다. 이들 표적에 대한 치료제는 종종 자가면역 질환의 치료에 연관되고 오랜 기간 동안 수회의 주사를 필요로 한다. 이런 이유로, 본 발명의 변이체에 의해 달성되는 더욱 긴 혈청 반감기 및 더욱 낮은 빈도의 치료가 특히 바람직하다.

치료에 승인된, 임상 중인, 또는 개발 중인 다수의 항체 및 Fc 융합체가 본 발명의 Fc 변이체로부터 이익을 얻을 수 있다. 이들 항체 및 Fc 융합체는 본 명세서에서 "임상 제품 및 후보물질"로 지칭된다. 따라서 바람직한 구체예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 임상 제품 및 후보물질로서 이용될 수 있다. 가령, CD20을 표적으로 하는 다수의 항체가 본 발명의 Fc 폴리펩티드로부터 이익을 얻을 수 있다. 가령, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 비-호지킨 림프종의 치료에 승인된 키메라 항-CD20 항체인 리툭시맙(Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche)(예로써, US 5,736,137 참조), Genmab에서 현재 개발 중인 항-CD20인 HuMax-CD20, US 5,500,362에 기술된 항-CD20 항체, AME-133(Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc.), HumaLYM(Intracel) 및 PRO70769(PCT/US2003/040426 "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof")에 실질적으로 유사한 항체에 이용될 수 있다. EGFR(ErbB-1), Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4)를 비롯한, 표피 성장 인자 수용체 계통의 구성원을 표적으로 하는 다수의 항체가 본 발명의 Fc 폴리펩티드로부터 이익을 얻을 수 있다. 가령, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 유방암의 치료에 승인된 인간화 항-Her2/neu 항체인 트라스투주맙(Herceptin®, Genentech)(예로써, US 5,677,171 참조); Genentech에서 현재 개발 중인 퍼투주맙(rhuMab-2C4, Omnitarg™); US 4,753,894에 기술된 항-Her2 항체; 다양한 암에 대한 임상 시험 중인 키메라 항-EGFR 항체인 세툭시맙(Erbitux®, Imclone)(US 4,943,533; PCT WO 96/40210); Abgenix-lmmunex-Amgen에서 현재 개발 중인 ABX-EGF(US 6,235,883); Genmab에서 현재 개발 중인 HuMax-EGFr(USSN 10/172,317); 425, EMD55900, EMD62000 및 EMD72000(Merck KGaA)(US 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, lnt J Cancer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centra de Immunologia Molecular, Cuba(US 5,891,996; US 6,506,883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806(Ludwig lnstitue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639-44); KSB-102(KS Biomedix); MR1-1(IVAX, National Cancer Institute)(PCT WO 0162931 A2); 그리고 SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138)에 기술된 것과 실질적으로 유사한 항체에 이용될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 현재 B-세포 만성 림프성 백혈병의 치료에 승인된 인간화 단일클론 항체인 알렘투주맙(Campath®,Millenium)에 이용될 수 있다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의해 개발된 항-CD3 항체인 뮤로모납-CD3(Orthoclone OKT3®), IDEC/Schering AG에 의해 개발된 항-CD20 항체인 이브리투모맙 티우세탄(Zevalin®), Celltech/Wyeth에 의해 개발된 항-CD33(p67 단백질) 항체인 겜투주맙 오조가마이신(Mylotarg®), Biogen에 의해 개발된 항-LFA-3 Fc 융합체인 알레파셉트(Amevive®), Centocor/Lilly에 의해 개발된 아브식시맙(ReoPro®), Novartis에 의해 개발된 바실릭시맙(Simulect®), Medlmmune에 의해 개발된 팔리비주맙(Synagis®), Centocor에 의해 개발된 항-TNF 알파 항체인 인플릭시맙(Remicade®), Abbott에서 개발한 항-TNF 알파 항체인 아달리무맙(Humira®), Celltech에 의해 개발된 항-TNF 알파 항체인 Humicade™, Immunex/Amgen에 의해 개발된 항-TNF 알파 Fc 융합체인 에타네르셉트(Enbrel®), Abgenix에서 개발 중인 항-CD147 항체인 ABX-CBL, Abgenix에서 개발 중인 항-IL8 항체인 ABX-IL8, Abgenix에서 개발 중인 항-MUC18 항체인 ABX-MA1, Antisoma에서 개발 중인 항-MUC1인 펨투모맙(R1549, 90Y-muHMFG1), Antisoma에서 개발 중인 항-MUC1 항체인 Therex(R1550), Antisoma에서 개발 중인 안지오맙(AS1405), Antisoma에서 개발 중인 HuBC-1, Antisoma에서 개발 중인 티오플라틴(AS1407), Biogen에서 개발 중인 항-알파-4-베타-1(VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체인 Antegren®(나탈리주맙), Biogen에서 개발 중인 항-VLA-1 인테그린 항체인 VLA-1 mAb, Biogen에서 개발 중인 항-림포톡신 베타 수용체(LTBR) 항체인 LTBR mAb, Cambridge Antibody Technology에서 개발 중인 항-TGF-β2 항체인 CAT-152, Cambridge Antibody Technology 및 Abbott에서 개발 중인 항-IL-12 항체인 J695, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에서 개발 중인 항-TGFβ1 항체인 CAT-192, Cambridge Antibody Technology에서 개발 중인 항-에오탁신 1 항체인 CAT-213, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에서 개발 중인 항-Blys 항체인 LymphoStat-B™, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences, Inc.에서 개발 중인 항-TRAIL-R1 항체인 TRAIL-R1mAb, Genentech에서 개발 중인 항-VEFG 항체인 Avastin™(bevacizumab, rhuMAb-VEGF), Genentech에서 개발중인 항-HER 수용체 계통 항체, Genentech에서 개발 중인 항-조직 인자 항체인 항-조직인자(ATF), Genentech에서 개발 중인 항-IgE 항체인 Xolair™(Omalizumab), Genentech 및 Xoma에서 개발 중인 항-CD11a 항체인 Raptiva™(Efalizumab), Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals에서 개발 중인 MLN-02 항체(이전에 LDP-02), Genmab에서 개발 중인 항-CD4 항체인 HuMax CD4, Genmab 및 Amgen에서 개발 중인 항-IL15-항체인 HuMax-IL15, Genmab 및 Medarex에서 개발 중인 HuMax-lnflam, Genmab 및 Medarex 및 Oxford GcoSciences에서 개발 중인 항-헤파라나제 I 항체인 Hu Max-Cancer, Genmab 및 Amgen에서 개발 중인 HuMax-Lymphoma, Genmab에서 개발 중인 HuMax-TAC, IDEC Pharmaceuticals에서 개발 중인 항-CD40L 항체인 IDEC-131, IDEC Pharmaceuticals에서 개발 중인 항-CD4 항체인 IDEC-151(Clenoliximab), IDEC Pharmaceuticals에서 개발 중인 항-CD80 항체인 IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에서 개발 중인 항-CD23 항체인 IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에서 개발 중인 항-대식세포 이동 인자(MIF) 항체, Imclone에서 개발 중인 항-이디오타입 항체인 BEC2, Imclone에서 개발 중인 항-KDR 항체인 IMC-1C11, Imclone에서 개발 중인 항-flk-1 항체인 DC101, Imclone에서 개발 중인 항-VE 카드헤린 항체, Immunomedics에서 개발 중인 항-암종배아 항원(CEA) 항체인 CEACide™(labetuzumab), Immunomedics에서 개발 중인 항-CD22 항체인 LymphoCide™(Epratuzumab), Immunomedics에서 개발 중인 AFP-Cide, Immunomedics에서 개발 중인 MyelomaCide, Immunomedics에서 개발 중인 LkoCide, Immunomedics에서 개발 중인 ProstaCide, Medarex에서 개발 중인 항-CTLA4 항체인 MDX-010, Medarex에서 개발 중인 항-CD30 항체인 MDX-060, Medarex에서 개발 중인 MDX-070, Medarex에서 개발 중인 MDX-018, Medarex 및 Immuno-Designed Molecules에서 개발 중인 항-Her2 항체인 Osidem™(IDM-1), Medarex and Genmab에서 개발 중인 항-CD4 항체인 HuMax™-CD4, Medarex 및 Genmab에서 개발 중인 항-IL15 항체인 HuMax-IL15, Medarex 및 Centocor/J&J에서 개발 중인 항-TNFσ 항체인 CNTO 148, Centocor/J&J에서 개발 중인 항-사이토킨 항체인 CNTO 1275, MorphoSys에서 개발 중인 항-세포간 부착 분자-1(ICAM-1)(CD54) 항체인 MOR101 및 MOR102, MorphoSys에서 개발 중인 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR) 항체인 MOR201, Protein Design Labs에서 개발 중인 항-CD3 항체인 Nuvion®(visilizumab), Protein Design Labs에서 개발 중인 항-감마 인터페론 항체인 HuZAF™, Protein Design Labs에서 개발 중인 항-σ5β1 인테그린, Protein Design Labs에서 개발 중인 항-IL-12, Xoma에서 개발 중인 항-Ep-CAM 항체인 ING-1, 그리고 Xoma에서 개발 중인 항-베타2 인테그린 항체인 MLN01이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 임상 제품 및 후보물질과 실질적으로 유사한 다양한 항체 또는 Fc 융합체에 이용될 수 있는데, 본 문단에 언급된 모든 참고문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

본 발명의 Fc 폴리펩티드는 상기한 임상 후보물질 및 제품 내로, 또는 이들과 실질적으로 유사한 항체 및 Fc 융합체 및 항체 내로 통합될 수 있다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 인간화된, 친화성 성숙된, 조작된, 또는 다른 방식으로 변형된 상기한 임상 후보물질 및 제품의 이형 내로 통합될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 자가면역, 염증, 또는 이식 증상의 치료에 이용된다. 이런 질환에 유관한 표적 항원 및 임상 제품 및 후보물질에는 LDP-02와 같은 항-σ4β7 인테그린 항체, LDP-01과 같은 항-베타2 인테그린 항체, 5G1.1과 같은 항-보체(C5) 항체, BTI-322와 같은 항-CD2 항체, MEDI-507, OKT3과 같은 항-CD3 항체, SMART 항-CD3, IDEC-151과 같은 항-CD4 항체, MDX-CD4, OKT4A, 항-CD11a 항체, IC14와 같은 항-CD14 항체, 항-CD18 항체, IDEC 152와 같은 항-CD23 항체, Zenapax와 같은 항-CD25 항체, 5c8과 같은 항-CD40L 항체, Antova, IDEC-131, MDX-33과 같은 항-CD64 항체, IDEC-114와 같은 항-CD80 항체, ABX-CBL과 같은 항-CD147 항체, CDP850과 같은 항-E-셀렉틴 항체, ReoPro/Abcixima과 같은 항-gpIIb/IIIa 항체, ICM3과 같은 항-ICAM-3 항체, VX-740과 같은 항-ICE 항체, MDX-33과 같은 항-FcR1 항체, rhuMab-E25와 같은 항-IgE 항체, SB-240683과 같은 항-IL-4 항체, SB-240563과 같은 항-IL-5 항체, SCH55700, ABX-IL8과 같은 항-IL-8 항체, 항-인터페론 감마 항체, 항-TNF(TNF, TNFa, TNFa, TNF-알파) 항체, 예를 들면, CDP571, CDP870, D2E7, 인플릭시맙, MAK-195F, 그리고 항-VLA-4 항체, 예를 들면, 안테그렌이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

FcRn에 증가된 결합을 갖는 것들과 같은 본 발명의 Fc 변이체는 향상된 특성을 제공하기 위해 TNF 저해물질 분자에 이용될 수 있다. 유용한 TNF 저해물질 분자에는 포유동물에서 TNF-알파의 작용을 저해하는 임의의 분자가 포함된다. 적절한 실례에는 Fc 융합체 Enbrel®(etanercept), 그리고 항체 Humira®(adalimumab) 및 Remicade®(infliximab)가 포함된다. FcFn 결합을 증가시키기 위하여 본 발명의 Fc 변이체를 이용하여 조작된 단일클론 항체(가령, Remicade 및 Humira)는 증가된 반감기를 통하여 더욱 우수한 효능을 제공할 수 있다.

일부 구체예에서, 감염성 질환에 대한 항체가 이용된다. 진핵세포에 대한 항체에는 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis) 및 클루이베로미세스 락티스(K. lactis), 피치아 귈레리몬디이(Pichia guillerimondii) 및 피치아 파스토리스(P. pastoris), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 그리고 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 효모 세포를 표적으로 하는 항체가 포함된다.

특히, 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 크루세이(C. krusei), 칸디다 루시타니에안(C. lusitaniaean), 칸디다 말토사(C. maltosa)를 비롯한 칸디다(Candida) 균주, 그리고 아스페르길루스(Aspergillus), 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 콕시디오이데스(Coccidioides), 블라스토미세스(Blastomyces) 및 페니실리움(Penicillium)의 종과 연관된 표적 항원을 비롯한 부가의 진균 세포에 대한 항체 역시 유용하다.

원생동물과 연관된 표적 항원에 대한 항체에는 트리파노소마(Trypanosoma), 레이쉬마니아 도노바니(Leishmania donovanii)를 비롯한 레이쉬마니아(Leishmania) 종, 플라스모디움(Plasmodium) 종, 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum), 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 그리고 시클로스포라 카에타네시스(Cyclospora cayetanensis)와 연관된 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)를 비롯한 바실루스(Bacillus); 비브리오(Vibrio), 예를 들면, 비브리오 콜레라(V. cholerae); 에스체리키아(Escherichia), 예를 들면, 장독성 대장균(E. coli); 시겔라(Shigela), 예를 들면, 시겔라 디센테리아(S. dysenteriae); 살모넬라(Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피(S. typhi); 마이코박테리움(Mycobacterium), 예를 들면, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 레프라에(M. leprae); 클로스트리디움(Clostridium), 예를 들면, 클로스트리디움 보툴리눔(C. botulinum), 클로스트리디움 테타니(C. tetani), 클로스트리디움 디피실레(C. difficile), 클로스트리디움 퍼프리젠스(C. perfringens); 코리네박테리움(Cornyebacterium), 예를 들면, 코리네박테리움 디프레리아(C. diphtheriae); 스트렙토코커스(Streptococcus), 스트렙토코커스 피오젠스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아(S. pneumoniae); 스타필로코커스(Staphylococcus), 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus); 헤모필루스(Haemophilus), 예를 들면, 헤모필루스 인플루엔자(H. influenzae); 나이세리아(Neisseria), 예를 들면, 수막염균(N. meningitidis), 임질균(N. gonorrhoeae); 에르시니아(Yersinia), 예를 들면, 에르시니아 람블리아(Y. lamblia), 에르시니아 페스티스(Y. pestis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들면, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(P. putida); 클라미디아(Chlamydia), 예를 들면, 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis); 보르데텔라(Bordetella), 예를 들면, 보르데텔라 퍼투시스(B. pertussis); 트레포네마(Treponema), 예를 들면, 트레포네마 팔라디움(T. palladium); 바실루스 안트라시스(B. anthracis), 에르시니아 페스티스(Y. pestis), 부르셀라 종(Brucella spp.), 프란시셀라 툴라렌시스(F. tularensis), 부르코홀데리아 말레이(B. mallei), 부르코홀데리아 슈도말레이(B. pseudomallei), 클로스트리디움 보툴리눔(C. botulinum), 살모넬라 종(Salmonella spp.), SEB 비브리오 콜레라(V. cholerae) 톡신 B, 대장균(E. coli) 0157:H17, 리스테리아 종(Listeria spp.), 트리코스포론 베이겔리이(Trichosporon beigelii), 로도토룰라 종(Rhodotorula species), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 엔테로박터 종(Enterobacter sp.), 클렙시엘라 종(Klebsiella sp.), 리스테리아 종(Listeria spp.), 마이코플라즈마 종(Mycoplasma spp.) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 병원성 및 비병원성 원핵생물과 같은 적절한 세균에 대한 항체를 비롯한, 원핵생물 항원에 대한 항체가 또한 유용하다.

일부 관점에서, 이들 항체는 바이러스 감염에 대한 항체이다; 이들 바이러스에는 오르토믹소바이러스(가령, 인플루엔자 바이러스), 파라믹소바이러스(가령, 호흡기 합포체 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스), 아데노바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, 레오바이러스, 토가바이러스(가령, 루벨라 바이러스), 파르보바이러스, 폭스바이러스(가령, 바리올라 바이러스, 우두 바이러스), 엔테로바이러스(가령, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스), 간염 바이러스(A, B 및 C형 포함), 포진바이러스(가령, 단순 포진 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스 엡스테인-바 바이러스), 로타바이러스, 놀웍 바이러스, 한타바이러스, 아레나바이러스, 라브도바이러스(가령, 라비스 바이러스), 레트로바이러스(HIV, HTLV-I 및 II 포함), 파포바바이러스(가령, 파필로마바이러스), 폴리오마바이러스 및 피코르나바이러스 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

최적화된 IgG 변이체 특성

본 발명은 또한, 치료 관련된 다양한 특성에 대하여 최적화된 IgG 변이체를 제공한다. 하나 이상의 최적화된 특성을 나타내도록 조작되거나 또는 예측되는 IgG 변이체는 본 명세서에서 "최적화된 IgG 변이체"로 지칭된다. 최적화될 수 있는 가장 바람직한 특징은 FcRn에 대한 증강된 또는 감소된 친화성 및 증가된 또는 감소된 생체내 반감기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절한 구체예에는 낮은 pH, 예를 들면, pH 6.0과 같은 엔도좀과 관련된 pH에서 FcRn에 대한 증가된 결합 친화성을 나타내지만, 높은 pH, 예를 들면, 7.4에서 감소된 친화성을 유지하여, 엔도좀 내로 흡수(uptake)가 증가하도록 하지만, 정상적인 방출 속도를 가능하게 하는 항체가 포함된다. 유사하게, 조정된 FcRn 결합을 갖는 이들 항체는 선택적으로 다른 바람직한 특징, 예를 들면, U.S.S.N. 11/174,287, 11/124,640, 10/822,231, 10/672,280, 10/379,392, 그리고 2005년 10월 21일 제출된 출원 11/256,060 "IgG immunoglobulin variants with optimized effector function"에 기술된 바와 같은 조정된 FcγR 결합을 가질 수 있다. 다시 말하면, 최적화된 특성에는 FcγR에 대한 증강된 또는 감소된 친화성이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 한 가지 선택적 구체예에서, IgG 변이체는 FcRn 결합 프로필 이외에, 인간 활성화 FcγR, 바람직하게는 FcγRIIIa에 대한 증가된 친화성을 갖도록 최적화된다. 다른 대안적 구체예에서, IgG 변이체는 인간 저해 수용체 FcγRIIb에 대한 감소된 친화성을 갖도록 최적화된다. 다시 말하면, 특정 구체예는 FcRn에 대한 증가된 결합 및 FcγRIIIa에 대한 증가된 결합력을 보이는 항체의 이용을 포함한다. 다른 구체예에서는 FcRn에 대한 증가된 결합 및 FcγRIIIa에 대한 증가된 결합을 보이는 항체의 용도를 포함한다. 이들 구체예는 인간에서 향상된 치료적 특성을 갖는 IgG 폴리펩티드, 예를 들면, 향상된 효과기 기능 및 더욱 큰 항암 효능을 갖는 IgG 폴리펩티드를 제공할 것으로 기대된다. 대안적 구체예에서, IgG 변이체는 FcRn에 대한 증가된 또는 감소된 친화성, 그리고 대립형질 변이체를 비롯한 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRllc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 인간 FcγR에 대한 증가된 또는 감소된 친화성을 갖도록 최적화된다. 이들 구체예는 인간에서 향상된 치료적 특성, 예를 들면, 증가된 혈청 반감기 및 감소된 효과기 기능을 갖는 IgG 폴리펩티드를 제공할 것으로 기대된다. 다른 구체예에서, IgG 변이체는 FcRn에 대한 향상된 친화성 및 하나 이상의 FcγR에 대한 향상된 친화성을 제공하면서, 하나 이상의 다른 FcγR에 대한 감소된 친화성을 제공한다. 가령, IgG 변이체는 FcRn 및 FcγRIIIa에 향상된 결합을 나타내면서, FcγRIIb에 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 대안으로, IgG 변이체는 FcRn 및 FcγR에 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 다른 구체예에서, IgG 변이체는 FcRn에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIb에 대한 향상된 친화성을 나타내면서, 하나 이상의 활성화 FcγR에 대한 감소된 친화성을 나타낼 수 있다. 다른 구체예에서, IgG 변이체는 증가된 혈청 반감기 및 감소된 효과기 기능을 가질 수 있다.

바람직한 구체예는 인간 FcRn 및 FcγR에 결합의 최적화를 포함하지만, 대안적 구체예에서, IgG 변이체는 설치류 및 비인간 영장류가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 비인간 생물체로부터 유래된 FcRn 및 FcγR에 대한 향상된 또는 감소된 친화성을 갖는다. 비인간 FcRn에 결합에 대하여 최적화된 IgG 변이체는 실험용으로 이용될 수 있다. 가령, 소정의 후보 약물에 대한 효능, 독성 및 약동학과 같은 특성의 시험을 가능하게 하는 다양한 질환에 대한 생쥐 모델이 가용하다. 당분야에 공지된 바와 같이, 암세포는 인간 암을 모방하기 위하여 생쥐로 이식 또는 주입될 수 있는데, 이러한 과정은 이종이식(xenografting)으로 지칭된다. FcRn에 대하여 최적화된 IgG 변이체를 포함하는 IgG 변이체의 검사는 단백질의 제거 특성, 제거 기전 등과 관련된 귀중한 정보를 제공할 수 있다. IgG 변이체는 또한, 무글리코실화(aglycosylation) 형태에서 향상된 기능성 및/또는 용액 특성에 대하여 최적화될 수 있다. Fc 리간드에는 FcRn, FcγRs, C1q, 그리고 단백질 A 및 G가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 인간, 생쥐, 쥐, 토끼, 또는 원숭이, 바람직하게는 인간이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 출처로부터 유래될 수 있다. 대안적으로 바람직한 구체예에서, IgG 변이체는 무글리코실화 형태의 부모 IgG 변이체보다 더욱 안정하고 및/또는 더욱 가용성이 되도록 최적화된다.

IgG 변이체는 보체 단백질 및 Fc 수용체 동족체(FcRH)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, FcRn 및 FcγR 이외의 Fc 리간드와의 상호작용을 조정하는 변형을 포함할 수 있다. FcRH에는 FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5 및 FcRH6이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨).

적절하게는, IgG 변이체의 Fc 리간드 특이성은 이의 치료적 유용성을 결정할 것이다. 치료 목적의 소정의 IgG 변이체의 유용성은 표적 항원의 에피토프 또는 형태 및 치료되는 질환 또는 증상에 좌우될 것이다. 대부분의 표적 및 증상의 경우에, 향상된 FcRn 결합은 향상된 FcRn 결합이 혈청 반감기의 증가를 유도할 수 있기 때문에 바람직하다. 더욱 긴 혈청 반감기는 치료제의 더욱 낮은 빈도의 투약 또는 더욱 적은 투여량을 가능하게 한다. 이는 반복 투여가 요구되는 증상에 대응하여 치료제가 투여되는 경우에 특히 바람직하다. 일부 표적 및 증상의 경우에, 감소된 FcRn 친화성이 바람직할 수 있다. 이는 증가된 제거율 또는 감소된 혈청 반감기를 갖는 변이형 Fc가 바람직한 경우, 예를 들면, Fc 폴리펩티드가 영상화제 또는 방사성 치료제로서 이용되는 경우에 특히 바람직하다.

향상된 활성화 FcγR로 FcRn에 대한 향상된 친화성 및/또는 저해 FcγR에 대한 감소된 친화성을 제공하는 IgG 변이체를 포함하는 IgG 변이체가 이용될 수 있다. 일부 표적 및 증상의 경우에, 상이한 활성화 FcγR에 대한 차별적 선별성을 제공하는 IgG 변이체를 이용하는 것이 유익할 수 있다; 가령, 일부 경우에, FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 향상된 결합이 바람직하지만 FcγRI에 대해서는 그렇지 않은 반면, 다른 경우에, FcγRIIa에 대해서만 향상된 결합이 바람직할 수 있다. 특정 표적 및 증상의 경우에, FcRn 결합을 변경하고, FcγR-매개된 효과기 기능과 보체-매개된 효과기 기능을 모두 향상시키는 IgG 변이체를 이용하는 것이 바람직한 반면, 다른 경우에, FcRn 결합 또는 혈청 반감기를 향상시키고, FcγR-매개된 효과기 기능 또는 보체-매개된 효과기 기능을 향상시키는 IgG 변이체를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 표적 또는 암 증상의 경우에, 예로써 C1q, 하나 이상의 FcγR, FcRn, 또는 하나 이상의 다른 Fc 리간드에 결합을 녹아웃(knockout)시킴으로써 하나 이상의 효과기 기능을 감소 또는 제거하는 것이 이로울 수 있다. 다른 표적 및 증상의 경우에, 저해 FcγRIIb에 향상된 결합을 제공하지만 활성화 FcγR에 WT 수준, 감소된, 또는 상실된 결합을 제공하는 IgG 변이체의 이용이 바람직할 수 있다. 이는 예로써, IgG 변이체의 목적이 감염 또는 자가면역 질환을 저해하거나, 또는 어떤 방식으로 면역계를 조정하는 것일 때, 특히 유용하다. 자가면역 질환이 일반적으로, 장기적이고 치료가 반복 투약으로 제공되기 때문에, 증가된 FcRn으로부터 증가된 반감기를 갖는 Fc 변이체를 이용한 이들 질환의 치료가 특히 바람직하다.

IgG 안정성, 용해성, 기능 또는 임상적 이용을 향상시키기 위하여 변형이 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, IgG 변이체는 인간에서 면역원성을 감소시키는 변형을 포함할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, IgG 변이체의 면역원성은 USSN 11/004,590에 기술된 방법을 이용하여 감소되고, 상기 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 대안적 구체예에서, IgG 변이체는 인간화된다(Clark, 2000, Immunol Today 21 :397-402, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

IgG 변이체는 면역원성을 감소시키는 변형을 포함할 수 있다. 면역원성을 감소시키는 변형은 부모 서열로부터 유래된 처리된 펩티드의 MHC에 결합을 감소시키는 변형을 포함할 수 있다. 가령, 아미노산 변형은 임의의 우성 MHC 대립유전자에 높은 친화성으로 결합할 것으로 예측되는 면역 에피토프가 없거나 그 숫자가 최소가 되도록 조작될 것이다. 단백질 서열에서 MHC-결합 에피토프를 확인하는 여러 방법이 당분야에 공지되어 있고, IgG 변이체에서 에피토프의 숫자를 측정하는데 이용될 수 있다. 예로써 WO 98/52976; WO 02/079232; WO 00/3317; USSN 09/903,378; USSN 10/039,170; USSN 60/222,697; USSN 10/754,296; PCT WO 01/21823; PCT WO 02/00165; Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942-948; Stumiolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561; WO 98/59244; WO 02/069232; WO 02/77187; Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154: 5927-5933; Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353-2358을 참조하는데, 이들 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 서열-기초된 정보를 이용하여 소정의 펩티드-MHC 상호작용에 대한 결합 스코어(binding scorew)를 측정할 수 있다(예로써, Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942-948; Sturniolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561을 참조하는데, 이들 모두 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

IgG 변이체 조작

본 발명의 변이체는 다양한 방법에 의해 설계될 수 있다. 본 발명에 개시된 변이체는 삽입, 결실, 치환, 기타 변형, 또는 이들 변화의 조합일 수 있다. 본 발명의 신규한 특정 구체예는 Fc 리간드에 Fc 폴리펩티드의 결합을 향상 또는 감소시키는 삽입 및 결실의 설계이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, FcRn에 대한 Fc 폴리펩티드의 친화성을 증가 또는 감소시키는 삽입 또는 결실이 수행될 수 있다. 삽입 및 결실은 논리적 접근법(rational approach)에 의해, 또는 무작위 성분, 예를 들면, 무작위 또는 반무작위 라이브러리 산출 또는 스크리닝의 이용을 수반하는 접근법에 의해 설계될 수 있다. 대안적 구체예에서, FcRn에 대한 Fc 폴리펩티드의 친화성을 증가 또는 감소시키는 치환이 개시된다.

골격 변형: 삽입 및 결실

변이형 Fc 폴리펩티드는 Fc 폴리펩티드 내에 한 위치에서 모 아미노산 대신에 변이형 아미노산으로 치환함으로서 생성될 수 있다. Fc 폴리펩티드 내에서 하나 이상의 아미노산을 변이형 아미노산으로 치환함으로써, 이들 위치에서 측쇄가 변경된다. 가장 유용한 치환은 Fc 측쇄를 변형함으로써 Fc 특성을 변경하는 것이다. 치환된 측쇄는 Fc 기능 또는 특성과 연관된 Fc 결합 짝과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용할 수 있다. 적어도 하나의 치환은 모 Fc 폴리펩티드의 하나 이상의 측쇄의 공유 구조를 변화시킨다.

대안으로, 모 Fc 폴리펩티드의 골격의 공유 구조를 변화시키는 변이형 Fc 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 단백질 내에서 골격 원자는 펩티드 질소, 알파 탄소, 카르보닐 또는 펩티드 탄소 및 카르보닐 산소이다. 골격의 공유 구조의 변화는 Fc 폴리펩티드의 특성을 변화시키는 추가의 방법을 제공한다. Fc 골격의 공유 구조는 예로써, 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의한 골격 내로 원자의 부가에 의해, 또는 예로써, 하나 이상의 아미노산의 결실에 의한 골격으로부터의 원자의 제거에 의해 변형될 수 있다. 골격의 공유 구조는 또한, 골격의 개별 원자를 다른 원자로 변화시킴으로써 변형될 수 있다(Deechongkit et al., J Am Chem Soc. 2004. 126(51):16762-71, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 당분야에 공지되고 본 명세서에서 예시된 바와 같이, Fc 폴리펩티드 내에서 아미노산의 삽입 및 결실은 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 내에서 상응하는 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실에 수행될 수 있다. 대안으로, 당분야에 공지된 바와 같이, 아미노산의 삽입 또는 결실은 Fc 폴리펩티드의 합성 동안 수행될 수 있다.

Fc 폴리펩티드의 하나 이상의 결합 짝(가령, FcgammaR, FcRn, C1q)과의 상호작용을 변화시키는 아미노산의 삽입 또는 결실의 설계는 Fc 폴리펩티드 및 이의 결합 짝의 복합체의 구조를 고려하여 수행될 수 있다. 덜 바람직한 구체예에서, 이러한 설계는 Fc 폴리펩티드의 구조 및 결합 짝에 결합에 관련된 Fc 영역에 관한 정보를 고려하여 수행될 수 있다. 이러한 정보는 돌연변이유발 실험, 파지 디스플레이 실험, 상동성 비교, 컴퓨터 모델링 또는 기타 수단에 의해 달성될 수 있다.

아미노산 서열 내에서, Fc 결합 상호작용에는 영향을 주지만 Fc 폴리펩티드의 전반적인 구조, 안정성, 발현 또는 이용에는 영향을 주지 않는 삽입 또는 결실에 바람직한 위치는 Fc/Fc-결합 짝 상호작용에 관련된 루프 내에 위치한다. Fc 폴리펩티드에 FcRn 결합을 변경하기 위하여, 244-257, 279-284, 307-317, 383-390 및 428-435 위치가 삽입 또는 결실에 바람직한 루프 위치이다(Kabat 등의 EU 인덱스로부터 번호 매김, Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001 , Mol Cell 7:867-877, 이들 모두 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). Fc 폴리펩티드에 Fcgamma 수용체의 결합을 변경하기 위하여, 229-239, 266-273, 294-299 및 324-331 위치가 삽입 또는 결실에 바람직한 루프 위치이다(Kabat 등의 EU 인덱스로부터 번호 매김, PDB 코드 1 E4K.pdb Sondermann et al. Nature. 2000 406:267, 이들 모두 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 루프는 알파 나선 또는 베타 시트 구조에 관여되지 않은 폴리펩티드의 영역이다. 루프의 위치는 알파 나선 또는 베타 시트 구조 내에 존재하지 않는 위치이다(van Holde, Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, Chapter 1 pp2-67, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 루프 위치가 선호되는데, 그 이유는 골격 원자가 전형적으로 더욱 유연하고, 알파 나선 및 베타 시트의 골격 원자와 비교하여 수소 결합에 연관될 가능성이 적기 때문이다. 이런 이유로, 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 결실로 인한 루프의 연장 또는 단축은 안정성, 발현 또는 기타 문제점을 비롯한 큰 파괴적 변화를 Fc 폴리펩티드에 유발할 가능성이 적다.

삽입 및 결실은 폴리펩티드의 길이를 변경하는데 이용될 수 있다. 가령, 루프 영역에서, 루프 길이의 변경은 루프의 유연성 및 형태 엔트로피(conformational entropy)를 변화시킨다. 루프 내에 삽입은 일반적으로, 루프의 형태 엔트로피를 증가시키는데, 상기 형태 엔트로피는 가능한 형태의 숫자의 자연 로그에 의해 곱해진 볼츠만 상수로 정의될 수 있다(van Holde, Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, pp78, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 적어도 하나의 아미노산을 폴리펩티드에 삽입하면, 폴리펩티드에 이용가능한 형태의 총수가 증가한다. 이들 추가적 형태는 우호적인 Fc/Fc-결합 짝 상호작용을 형성하는데 이로울 수 있는데, 그 이유는 Fc 폴리펩티드가 Fc-결합 단백질에 결합할 때 이들 추가적 형태 중에서 하나를 이용할 수 있기 때문이다. 이 경우에, 삽입은 더욱 강한 Fc/Fc-결합 짝 상호작용을 산출할 수 있다. 이들 추가적 형태가 결합 경계면에 이용되지 않으면, 삽입이 더욱 약한 Fc/Fc-결합 짝 상호작용을 유발할 수 있는데, 그 이유는 이들 추가적 형태가 결합-적격 형태와 경쟁할 것이기 때문이다. 이와 유사하게, 폴리펩티드 분절(segment)의 결실은 더욱 강한 또는 더욱 약한 Fc/Fc 결합-짝 상호작용으로 이어질 수 있다. 골격 형태의 가능 숫자를 감소시키는 분절의 결실이 결합-적격 형태를 제거하는 경우에, 이러한 결실은 더욱 약한 Fc/Fc-결합 짝 상호작용을 유발할 수 있다. 결실이 결합-적격 형태를 제거하지 않으면, 이러한 결실은 더욱 강한 Fc/Fc-결합 짝 상호작용을 산출할 수 있는데, 그 이유는 이러한 결실이 결합-적격 형태와 경쟁하는 형태를 제거할 수 있기 때문이다.

삽입 및 결실은 Fc 폴리펩티드 내에 아미노산의 위치 및 방향을 변경하는데 이용될 수 있다. 삽입 및 결실이 골격의 공유 구조를 변화시키기 때문에, 이들 삽입 및 결실은 반드시 골격 원자의 위치를 변화시키게 된다. 도 7에서는 3가지 상이한 골격 내에서 L1 내지 L4로 표시된 일부 루프 분절에서, 골격 위치를 비교한다. 참고 골격 구조는 4개의 루프 분절을 포함하는 반면, 결실 골격은 분절 L1이 없고, 삽입 분절은 분절 L1 이전에, 즉, 분절 L1의 N-말단에 추가적 분절을 포함한다. 결실 및 삽입은 이러한 삽입 또는 결실의 부위에 인접한 골격 구조에서 최대 변화를 유도한다. 루프의 N-말단에 인접한 분절, 예를 들면, 분절 L1을 결실시킴으로써, 루프가 단축되고 나머지 분절은 그들의 위치가 루프 N-말단에 더욱 근접하게 이동한다. 이는 L2 분절을 L1 분절의 이전 위치 및 루프 N-말단 방향으로 이동시키는 효과를 갖는다. L2 분절의 L1 분절 방향으로 이러한 위치 변화는 Fc/Fc-결합 짝 복합체의 결합력을 강화시킬 수 있고, L2 내에 위치한 아미노산(들)이 L1 내에 위치할 때 Fc-결합 짝과 우호적인 상호작용을 한다는 것을 암시하는 사전 정보가 있을 경우에 바람직하다. 가령, L2가 알라닌 및 티로신을 포함하고, 알라닌 및 티로신에 대한 2개 L1 아미노산의 치환이 증가된 결합력을 갖는 Fc 변이체를 산출하는 경우에, L1의 결실은 Fc-결합 짝에 대한 증가된 친화성을 갖는 Fc 변이체를 산출할 수 있다.

유사하게, 루프의 N-말단에서 폴리펩티드 분절의 Fc 폴리펩티드 내로 삽입은 루프 분절의 위치를 루프의 C-말단 방향으로 이동시킨다. 도 7에 도시된 바와 같이, 분절 L1 이전에, 즉, 분절 L1의 N-말단에 하나 이상의 아미노산의 삽입은 L1 분절의 루프 C-말단으로의 이동을 비롯한 골격 형태의 변화를 유도한다. 이러한 유형의 삽입은 분절 L1 내에 위치한 아미노산이 L2 위치 내에 위치할 때, 우호적인 상호작용을 하는 것으로 알려져 있을 경우에 바람직한데, 그 이유는 이러한 삽입이 더욱 강한 Fc/Fc-결합 짝 상호작용을 유도할 수 있기 때문이다. 더욱 약한 Fc/Fc-결합 짝 상호작용이 바람직한 경우에, 삽입은 비우호적인 아미노산을 새로운 위치로 이동시키는데 이용될 수 있다. 이들 삽입 분절, 결실 분절 및 참고 분절(도 7에서 L1 내지 L4)은 Fc 폴리펩티드 내에서 하나 또는 하나 이상의 아미노산일 수 있다.

대안으로, 루프 N-말단에서 삽입 또는 결실과 유사한 방식으로 루프 C-말단에서 삽입 또는 결실이 이용될 수 있다. 루프 C-말단에서 삽입은 삽입의 N-말단 위치를 루프 N-말단 방향으로 이동시킬 수 있다. 루프 C-말단에서 결실은 결실의 N-말단 위치를 루프 C-말단 방향으로 이동시킬 수 있다. 루프의 N-말단 또는 C-말단에서 삽입 또는 결실의 선택은 루프 내에 위치한 아미노산, 증가된 또는 감소된 Fc/Fc-결합 짝 친화성에 대한 요구 및 원하는 위치 이동에 의해 좌우된다.

삽입 또는 결실은 루프, 알파 나선 및 베타 시트 영역을 비롯한, Fc 폴리펩티드의 임의의 영역에 이용될 수 있다. 삽입 및 결실에 바람직한 위치에는 알파 나선 또는 베타 시트 영역이 아닌 루프 영역이 포함된다. 루프가 바람직한데, 그 이유는 루프가 일반적으로, 알파 나선 또는 베타 시트보다 양호하게 골격 변형을 수용하기 때문이다. 더욱 강한 단백질/단백질 상호작용을 유도하는 삽입 또는 결실에 특히 바람직한 위치는 루프의 N-말단 또는 C-말단 가장자리이다. 루프 측쇄가 Fc/Fc-결합 짝 상호작용과 관련되는 경우에, 이들 가장자리에서 삽입 또는 결실은 결합 상호작용에서 매우 불리한 변화를 유발할 가능성이 적다. 루프의 정중앙 내에서 결실은 Fc/Fc-결합 짝 경계면 내에서 중요 잔기를 제거할 가능성이 크고, 루프의 정중앙 내에서 삽입은 Fc/Fc-결합 짝 경계면 내에서 비우호적인 상호작용을 유발할 가능성이 크다. 결실되거나 삽입되는 잔기의 숫자는 원하는 골격 변화의 크기에 의해 결정되는데, 15개 이하 잔기의 삽입 또는 결실이 바람직하고, 10개 이하 잔기의 삽입 또는 결실이 더욱 바람직하고, 5개 이하 잔기의 삽입 또는 결실이 가장 바람직하다.

Fc 결실 변이체의 위치 및 크기가 설계되면, 전체 폴리펩티드 서열이 완전히 결정되고, 상기 폴리펩티드이 당분야에서 공지된 방법에 의해 작제될 수 있다.

하지만, Fc 삽입 변이체는 삽입되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 설계하는 추가 단계를 포함한다. Fc 폴리펩티드에 노출될 것으로 예상되는 위치에서, Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Gly, His를 비롯한 극성 잔기의 삽입이 바람직하다. 크기가 작을수록 Fc/Fc-결합 짝 상호작용을 입체적으로 간섭할 가능성이 더욱 적기 때문에, Ser, Thr 및 Ala을 비롯한 더욱 작은 아미노산이 특히 바람직하다. Ser 및 Thr은 또한, Fc-결합 짝 상에서 원자와 수소 결합하는 능력을 갖는다.

삽입은 또한, 더욱 강한 Fc/Fc-결합 짝 결합이 요구될 때처럼 삽입된 폴리펩티드가 Fc-결합 짝과 우호적인 상호작용을 나타내도록 설계될 수 있도록 하는 부가된 유연성을 갖는다. 골격 삽입의 길이는 삽입되는 간단하고 일반적인 서열로 변이체 골격을 모델링함으로써 결정될 수 있다. 가령, 상이한 길이의 폴리세린, 폴리글리신 또는 폴리알라닌 삽입이 작제되고 모델링될 수 있다. 모델링은 삽입을 포함하는 동족체의 공지된 3차원 구조에 기초된 상동성 모델링을 비롯한 다양한 방법에 의해, 그리고 MODELLER(MA Marti-Renom et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 291-325, 2000, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨) 및 ROSETTA(Kuhlman et al. (2003). Science 302, 1364-8, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)을 비롯한 컴퓨터 모델링에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 먼저 다양한 골격 형태가 생성되고, 측쇄의 실체가 확립된 이후에 최종 골격 구조가 결정될 수 있다. 측쇄는 PDA® 알고리즘에 의해 설계될 수 있다(US 6,188,965; 6,269,312; 6,403,312; 6,801,861; 6,804,611; 6,792,356; 6,950,754, 그리고 USSN 09/782,004; 09/927,790; 10/101,499; 10/666,307; 10/666311; 10/218,102, 이들 모두 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨).

FcRn-결합 특성을 변화시키는 앞서 기술된 방법과 유사한 방식으로, FcgammaR에 Fc 폴리펩티드의 결합을 변화시키는 삽입과 결실이 수행될 수 있다. Fc 도메인은 도 1에 지시된 위치에서 FcgammaR에 결합한다. PDB 코드 1T89와 1IIS(Radaev S et al. J. Biol. Chem. v276, p.16469-16477, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)를 비롯한 Fc/FcgammaR 복합체의 구조는 이들 두 구조 간에 상호작용 잔기와 루프를 증명한다. US11/124620 및 US6737056(이들 문헌은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입됨)에서 확인되는 것들과 같은 돌연변이유발 결과는 골격 위치(backbone positioning)의 적절한 이동을 결정하는데 유용하다.

본 발명에 개시된 방법에 의해, Fc 폴리펩티드 이외의 임의의 폴리펩티드에서 삽입 및 결실이 설계될 수 있다. 가령, TNF 대과 구성원, APRIL에서 삽입 또는 결실이 이의 3차원 구조의 보조로 설계될 수 있다(PDB 코드 1XU1.pdb, Hymowitz, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:7218, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 삽입 또는 결실은 수용체에 APRIL 결합을 증가시키도록 설계될 수 있다. 삽입 또는 결실 부위로서 바람직한 루프 잔기는 Ser118-Val124, Asp164-Phe167, Pro192-Ala198, Pro221-Lys226 잔기이다. 이들 루프는 APRIL/TACI 복합체 내에서 TACI와 상호작용하고 결합을 매개한다.

변이체를 통합하는 폴리펩티드

IgG 변이체는 인간 IgG 서열에 기초할 수 있고, 따라서 인간 IgG 서열은 다른 생물체로부터 유래된 서열, 예를 들면, 설치류 및 영장류 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 서열이 비교되는 "기초(base)" 서열로 이용된다. IgG 변이체는 또한, IgA, IgE, IgD, IgM 등과 같은 다른 면역글로불린 부류로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. IgG 변이체가 한 모 IgG의 배경(context)에서 조작되지만, 이들 변이체는 다른 두 번째 모 IgG의 배경으로 조작되거나 "이전"될 수 있을 것으로 예기된다. 이는 전형적으로 IgG 서열 간에 서열 또는 구조 상동성에 기초하여, 첫 번째 및 두 번째 IgG 간에 "동등한(equivalent)" 또는 "상응하는(corresponding)" 잔기 및 치환을 결정함으로써 달성된다. 상동성을 확립하기 위하여, 본 발명에 개시된 첫 번째 IgG의 아미노산 서열이 두 번째 IgG의 서열과 직접 비교된다. 당분야에 공지된 하나 이상의 상동성 정렬 프로그램을 이용하고(가령, 종 간 보존된 잔기를 이용하고), 정렬을 유지(즉, 임의의 결실 및 삽입을 통한 보존된 잔기의 소실을 회피)하는데 필요한 삽입 및 결실을 고려하여 이들 서열을 정렬한 이후에, 첫 번째 IgG 변이체의 일차 서열에서 특정 아미노산과 동등한 잔기가 정의된다. 보존된 잔기의 정렬은 바람직하게는, 이런 잔기의 100%를 보존해야 한다. 하지만, 75% 초과 또는 최소 50% 보존된 잔기의 정렬 역시 동등한 잔기를 정의하는데 적합하다. 또한, 구조가 결정된 IgG에 대한 3차 구조 수준에서 첫 번째 및 두 번째 IgG 간에 구조 상동성을 측정함으로써, 동등한 잔기가 정의될 수 있다. 이 경우에, 동등한 잔기는 정렬후, 부모(parent) 또는 전구체의 특정 아미노산 잔기의 주쇄 원자 중에서 2개 이상의 원자 배위(atomic coordinate)(N에서 N, CA에서 CA, C에서 C 및 O에서 O)가 0.13 nm 이내, 바람직하게는 0.1 nm 이내인 잔기로서 정의된다. 이들 단백질의 비-수소 단백질 원자의 원자 배위의 최대 겹침을 제공하기 위하여 최적 모델이 배향되고 위치된 이후에, 정렬이 달성된다. 동등한 또는 상응하는 잔기의 결정 방법에 상관없이, 그리고 IgG이 만들어지는 부모 IgG의 실체(identity)와 상관없이, 전달되도록 의도되는 것은 발견된 IgG 변이체가 이러한 IgG 변이체와 현저한 서열 또는 구조 상동성을 갖는 임의의 두 번째 모 IgG로 조작될 수 있다는 것이다. 따라서 예로써, 모 항체가 인간 IgG1인 변이형 항체가 생성되면, 상기한 방법 또는 동등한 잔기를 결정하기 위한 다른 방법을 이용하여, 변이형 항체는 상이한 항원, 인간 IgG2 모 항체, 인간 IgA 모 항체, 생쥐 IgG2a 또는 IgG2b 모 항체 등에 결합하는 다른 IgG1 모 항체에서 조작될 수 있다. 전술한 바와 같이, 모 IgG 변이체의 배경은 IgG 변이체를 다른 모 IgG로 이전하는 능력에 영향을 주지 않는다.

IgG 변이체를 조작, 생산 및 스크리닝하는 방법이 제공된다. 본 발명에 개시된 방법은 임의의 특정 적용 또는 작업 이론에 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명에 개시된 방법은 최적화된 효과기 기능을 갖는 IgG 변이체를 수득하기 위하여 하나 이상의 IgG 변이체가 조작되고, 생산되고, 그리고 실험적으로 스크리닝되는 과정을 전반적으로 예시하도록 의도된다. 항체 및 단백질 변이체를 설계, 생산 및 시험하기 위한 다양한 방법이 USSN 10/754,296 및 USSN 10/672,280에 기술되는데, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

최적화된 효과기 기능을 갖는 IgG 변이체를 설계하기 위하여, 다양한 단백질 조작 방법이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 구조-기초된 조작 방법이 이용될 수 있는데, 여기서 가용한 구조적 정보가 치환, 삽입 또는 결실을 유도하는데 이용되다. 바람직한 구체예에서, 컴퓨터 스크리닝 방법이 이용되는데, 여기서 치환은 컴퓨터 계산에 에너지 적응도(energetic fitness)에 기초하여 설계된다. 예로써, USSN 10/754,296 및 USSN 10/672,280을 참조하는데, 이들 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

확인된 위치에서 치환을 유도하는데 서열의 정렬이 이용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 서열 정보의 이용은 단백질 구조에 잠재적으로 해로운 치환의 도입을 억제할 수 있다. 서열의 출처는 광범위한데, 여기에는 Kabat 데이터베이스(Northwestern University); Johnson & Wu, 2001, Nucleic Acids Res. 29:205-206; Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res. 28:214-218), IMGT 데이터베이스(IMGT, the international ImMunoGeneTics information system® Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28:219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31 :307-310) 및 VBASE가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하나 이상의 공지된 데이터베이스가 포함되고, 이들 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 포유동물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 생물체로부터 생식계열(germline) 서열 또는 자연 발생 항체의 서열의 서열 정렬로부터, 항체 서열 정보가 수득, 수집 및/또는 산출될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 인간 또는 실질적으로 인간인 서열의 이용은 인간에 투여될 때 면역원성이 덜한 이점을 가질 수 있다. 더욱 포괄적인, 즉, 항체에 특정되지 않는 핵산 또는 단백질 데이터베이스인 다른 데이터베이스에는 SwissProt, GenBank Entrez 및 EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 정렬된 서열은 VH, VL, CH 및/또는 CL 서열을 포함할 수 있다. 당분야에 공지된 다수의 서열-기초된 정렬 프로그램 및 방법이 존재하는데, 이들 모두 서열 정렬의 산출에 이용될 수 있다.

대안으로, 원하는 위치에서 아미노산 변형을 발생시키는데 무작위 또는 반무작위(semi-random) 돌연변이유발(mutagenesis) 방법이 이용될 수 있다. 이 경우에, 위치가 무작위로 선택되거나, 또는 아미노산 변화가 단순한 법칙으로 진행된다. 가령, 모든 잔기는 알라닌으로 돌연변이될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝(alanine scanning)으로 지칭된다. 이들 방법은 더욱 높은 수준의 서열 다양성(sequence diversity)을 스크리닝하기 위한 선별 방법(selection method)을 이용하는 더욱 정교한 조작 접근법과 결합될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 예로써 하기에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이(phage display), 리보솜 디스플레이, 세포 표면 디스플레이 등과 같은 디스플레이 기술을 비롯한 다양한 선별 기술이 이런 접근법에 이용될 수 있다.

IgG 변이체의 생산 및 스크리닝 방법은 당분야에 공지되어 있다. 항체 분자생물학, 발현, 정제 및 스크리닝을 위한 전반적인 방법은 Antibody Engineering, Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76에 기술된다. 또한, USSN 10/754,296; USSN 10/672,280; USSN 10/822,231; 그리고 11/124,620에 기술된 방법을 참조하는데, 이들 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 본 발명의 바람직한 변이체에는 도 8에서 발견되는 것들이 포함된다. 대안으로, 본 발명의 바람직한 변이체에는 도 9에서 발견되는 것들이 포함된다. 부가적으로, 본 발명의 다른 바람직한 변이체에는 도 10에서 발견되는 것들이 포함된다. 이들 변이체는 실시예에 예시된 바와 같이, Fc 수용체, FcRn에 증가된 결합을 나타낸다.

IgG 변이체 제조

IgG 변이체는 당분야에서 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, IgG 변이체 서열은 구성원 서열을 인코딩하고, 이후 원하는 경우에, 숙주 세포 내로 클로닝되고, 발현되고 분석되는 핵산을 산출하는데 이용된다. 이들 과정은 공지된 절차를 이용하여 수행되고, 이용될 수 있는 다양한 방법은 Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001) 및 Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons)에 기술되는데, 이들 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. IgG 변이체를 인코딩하는 핵산은 단백질을 발현하기 위하여 발현 벡터 내로 통합될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로, 제어 또는 조절 서열, 선별가능 마커, 임의의 융합 짝 및/또는 부가적 요소에 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 상관관계로 배치된 단백질을 포함한다. IgG 변이체는 단백질 발현을 유도 또는 유발하는데 적합한 조건 하에, IgG 변이체를 인코딩하는 핵산, 바람직하게는 IgG 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 포유류 세포, 세균, 곤충 세포 및 효모가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 적절한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 가령, 이용될 수 있는 다양한 세포주는 American Type Culture Collection로부터 입수가능한 ATCC 세포주 카탈로그에 기술되는데, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 이용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.

바람직한 구체예에서, IgG 변이체는 발현 이후에 정제 또는 분리된다. 항체는 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 분리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제 방법에는 크로마토그래피 기술, 전기영동, 면역 침강, 투석, 여과, 농축 및 크로마토포커싱(chromatofocusing) 기술이 포함된다. 당분야에 공지된 바와 같이, 세균 단백질 A, G 및 L과 같은 다양한 자연 단백질이 항체와 결합하고, 이들 단백질은 정제에 이용될 수 있다. 종종, 특정 융합 짝에 의해 정제가 가능할 수 있다. 가령, GST 융합체가 이용되는 경우에 글루타티온 수지, His-태그가 이용되는 경우에 Ni⁺² 친화 크로마토그래피, 또는 플래그-태그(flag-tag)가 이용되는 경우에 고정된 항-플래그(flag) 항체를 이용하여 단백질이 정제될 수 있다. 적절한 정제 기술의 전반적인 보도를 위하여, Antibody Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994를 참조하는데, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

IgG 변이체 스크리닝( screening )

Fc 변이체는 시험관내 분석법, 생체내 및 세포-기초된 분석법 및 선별 기술을 이용하는 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 방법을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝 절차에 자동화 및 고효율 스크리닝 기술이 이용될 수 있다. 스크리닝은 융합 짝 또는 표지, 예를 들면, 면역 표지, 동위원소 표지, 또는 형광 또는 비색 염료와 같은 소분자 표지를 이용할 수 있다.

바람직한 구체예에서, Fc 변이체의 기능적 및/또는 생체물리학적 특성이 시험관내 분석법으로 스크리닝된다. 바람직한 구체예에서, 단백질은 기능성, 예를 들면, 반응을 촉매하는 능력 또는 표적에 대한 결합 친화성에 대하여 스크리닝된다.

당분야에 공지된 바와 같이, 스크리닝 방법 중에서 일부는 라이브러리의 유리한 구성원을 선별하는 방법이다. 이들 방법은 본 명세서에서 "선별 방법(selection method)"으로 지칭되고, 본 발명에서 Fc 변이체를 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 단백질 라이브러리가 선별 방법으로 스크리닝되는 경우에, 일부 선별 조건을 충족시키는 유리한 라이브러리의 구성원만 증식, 분리 및/또는 관찰된다. 본 발명에서 단백질 라이브러리의 스크리닝에 이용될 수 있는 다양한 선별 방법이 당분야에서 공지되어 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 다른 선별 방법에는 디스플레이(display)에 의존하지 않는 방법, 예를 들면, 생체내 방법이 포함된다. "지향된 진화(directed evolution)" 방법으로 지칭되는 일부 선별 방법은 때때로 새로운 돌연변이의 통합과 함께, 선별 동안 유리한 서열의 짝짓기(mating) 또는 번식(breeding)을 수반하는 방법이다.

바람직한 구체예에서, Fc 변이체는 한 가지 이상의 세포-기초된 또는 생체내 분석법을 이용하여 스크리닝된다. 이런 분석법의 경우에, 정제된 또는 비정제된 단백질이 외부로부터 추가되고, 따라서 세포가 라이브러리에 속하는 개별 변이체 또는 변이체 풀에 노출되게 된다. 이들 분석법은 항상은 아니지만 전형적으로, Fc 폴리펩티드의 기능; 다시 말하면, 표적에 결합하고 일부 생화학적 현상, 예를 들면, 효과기 기능, 리간드/수용체 결합 저해, 아폽토시스(apoptosis) 등을 매개하는 Fc 폴리펩티드의 능력에 기초한다. 이들 분석법은 종종, IgG에 대한 세포의 반응, 예를 들면, 세포 생존, 세포 사멸, 세포 형태에서 변화, 또는 자연 유전자 또는 리포터(reporter) 유전자의 세포 발현과 같은 전사 활성화를 모니터링하는 단계를 포함한다. 가령, 이들 분석법은 ADCC, ADCP, 또는 CDC를 유도하는 Fc 변이체의 능력을 측정할 수 있다. 일부 분석법의 경우에, 표적 세포 이외에, 예로써 혈청 보체, 또는 효과기 세포, 예를 들면, 말초 혈액 단핵구(PBMC), NK 세포, 대식세포 등과 같은 부가적 세포 또는 성분이 추가될 필요가 있다. 이들 부가적 세포는 임의의 생물체, 바람직하게는 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이로부터 유래될 수 있다. 항체는 표적을 발현하는 특정 세포주의 아폽토시스를 유도하거나, 또는 분석법에 추가된 면역 세포에 의한 표적 세포에 대한 공격을 매개할 수 있다. 세포 사멸 또는 생존력을 모니터링하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 염료, 면역화학적, 세포화학적 및 방사성 시제의 이용을 수반한다. 전사 활성화 역시 세포-기초된 분석법에서 기능을 분석하는 방법으로서의 역할을 할 수 있다. 대안으로, 변이체를 인코딩하는 핵산으로 형질전환된 또는 형질감염된 세포를 이용한 세포-기초된 스크리닝이 수행된다. 즉, Fc 변이체가 외부로부터 세포에 추가되지 않는다.

IgG 변이체의 생물학적 특성은 세포, 조직 및 전체 생물체 실험에서 특성화될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 질병 또는 질병 모델의 치료에 대한 약물의 효능을 측정하거나, 또는 약물의 약물동력학, 독성 및 기타 특성을 측정하기 위하여, 약물은 종종 생쥐, 쥐, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 동물에서 시험된다. 치료제는 종종 누드 생쥐, SCID 생쥐, 이종이식(xenograft) 생쥐 및 유전자도입(transgenic) 생쥐(녹인(knockin) 및 녹아웃(knockout) 포함)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 생쥐에서 시험된다. 이런 실험은 단백질이 치료제로서 이용될 수 있는 잠재력을 결정하는데 유의한 데이터를 제공한다. 임의의 생물체, 바람직하게는 포유동물이 시험에 이용될 수 있다. 가령, 인간과의 유전적 유사성으로 인하여, 원숭이가 적절한 치료 모델이 될 수 있고, 따라서 IgG의 효능, 독성, 약물동력학, 또는 기타 특성을 시험하는데 이용될 수 있다. 궁극적으로 약물로서 승인을 위하여 인간에서 시험이 요구되기 때문에, 이들 실험 역시 고려된다. 따라서 이들 IgG은 치료 효능, 독성, 면역원성, 약물동력학 및/또는 기타 임상적 특성을 결정하기 위하여 인간에서 시험될 수 있다.

IgG 변이체의 이용 방법

IgG 변이체는 다양한 제품에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, IgG 변이체는 치료제, 진단제, 또는 조사 시제, 바람직하게는, 치료제이다. IgG 변이체는 단일클론 또는 다중클론인 항체 조성물에 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, IgG 변이체는 표적 항원을 보유하는 표적 세포, 예를 들면, 암 세포를 사멸시키는데 이용된다. 다른 구체예에서, IgG 변이체는 예로써, 사이토킨 또는 사이토킨 수용체를 길항하기 위하여 표적 항원을 차단, 길항, 또는 항진하는데 이용된다. 다른 바람직한 구체예에서, IgG 변이체는 표적 항원을 차단, 길항 또는 항진하고, 표적 항원을 보유하는 표적 세포를 사멸시키는데 이용된다.

IgG 변이체는 다양한 치료적 목적으로 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, IgG 변이체를 포함하는 항체는 항체-관련 질환을 치료하기 위하여 환자에 투여된다. 이러한 목적을 위한 "환자"는 인간 및 다른 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 본 명세서에서, "항체 관련 질환" 또는 "항체 반응성 질환" 또는 "장애" 또는 "질병"은 IgG 변이체를 포함하는 제약학적 조성물의 투여에 의해 경감되는 질환을 의미한다. 항체 관련 질환에는 자가면역 질환, 면역 질환, 감염 질환, 염증 질환, 신경 질환 및 암을 비롯한 종양 및 신생물(neoplastic) 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서, "암" 및 "암성(cancerous)"은 전형적으로, 비조절된 세포 성장으로 특징되는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 실례에는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma)(지방육종(liposarcoma) 포함), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 선암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 그리고 백혈병(leukemia) 및 림프구 악성종양(lymphoid malignancy)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

한 구체예에서, IgG 변이체는 환자에 투여되는 유일한 치료적 활성제이다. 대안으로, IgG 변이체는 세포독성제, 화학치료제, 사이토킨, 성장 억제제, 항-호르몬제, 키나아제 저해물질, 항-혈관신생제, 심장보호제, 또는 기타 치료제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 한 가지 이상의 다른 치료제와 조합으로 투여된다. IgG 변이체는 한 가지 이상의 다른 치료 섭생(therapeutic regime)과 동시에 투여될 수 있다. 가령, IgG 변이체는 화학요법, 방사성요법, 또는 둘 모두와 함께, 환자에 투여될 수 있다. 한 구체예에서, IgG 변이체는 IgG 변이체이거나 IgG 변이체가 아닌 하나 이상의 항체와 공동으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에 따라서, IgG 변이체 및 하나 이상의 다른 항암 치료제가 생체외 암세포를 치료하는데 이용된다. 이런 생체외 치료는 골수 이식(bone marrow transplantation), 특히 자가 골수 이식에 유용할 것으로 예기된다. 물론, IgG 변이체는 수술과 같은 다른 치료 기술과도 병용될 수 있는 것으로 예기된다.

다양한 다른 치료제가 IgG 변이체와 함께 투여에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, IgG는 항-혈관신생제와 함께 투여된다. 본 명세서에서, "항-혈관신생제( anti - angiogenic agent )"는 혈관 발달을 상당히 차단 또는 방해하는 화합물을 의미한다. 가령, 항-혈관신생 인자는 혈관신생 촉진에 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 단백질, 예를 들면, 항체, Fc 융합체, 또는 사이토킨 등일 수 있다. 본 발명에서 바람직한 항-혈관신생 인자는 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 결합하는 항체이다. 대안적 구체예에서, IgG는 적합한 면역 반응을 유도 또는 향상시키는 치료제, 예를 들면, CTLA-4를 표적으로 하는 항체와 함께 투여된다. 대안적 구체예에서, IgG는 티로신 키나아제 저해물질과 함께 투여된다. 본 명세서에서, "티로신 키나아제 저해물질"은 티로신 키나아제의 티로신 키나아제 활성을 상당히 저해하는 분자를 의미한다. 대안적 구체예에서, IgG 변이체는 사이토킨과 함께 투여된다.

IgG 변이체 및 하나 이상의 치료 활성제가 제제화되는 제약학적 조성물이 예기된다. IgG 변이체 제제는 원하는 순도를 갖는 IgG을 임의의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써, 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 보관용으로 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 생체내 투여용으로 이용되는 제제는 바람직하게는 무균이다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과, 또는 다른 방법에 의해 용이하게 달성된다. 본 발명에 개시된 IgG 변이체 및 다른 치료적 활성제는 또한, 면역리포좀(immunoliposome)으로 제제화되거나, 또는 마이크로캡슐에 피포될 수 있다.

제제 내에서 치료 활성 IgG 변이체의 농도는 약 0.1 내지 100 중량% 범위에서 변할 수 있다. 바람직한 구체예에서, IgG 농도 범위는 0.003 내지 1.0 몰(molar)이다. 환자를 치료하기 위하여, IgG 변이체의 치료 효과량이 투여될 수 있다. 본 명세서에서, "치료 효과량"은 IgG 변이체가 투여되어 효과를 나타내는 용량이다. 정확한 용량은 치료 목적에 따라 달라질 수 있고, 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 확인될 것이다. 용량은 체중 ㎏당 0.01 내지 100 ㎎, 또는 그 이상이며, 예를 들면, 체중 ㎏당 0.01, 0.1, 1.0, 10, 또는 50 ㎎이고, 1 내지 10 ㎎/㎏이 바람직하다. 당분야에 공지된 바와 같이, 단백질 분해, 전신 대 국소 전달 및 새로운 프로테아제 합성의 속도뿐만 아니라, 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 상태의 중증도에 대한 조절이 필요하고, 이러한 조절은 당업자에 의해 통상적인 실험으로 확인될 것이다.

IgG 변이체를 가급적, 멸균 수용액 형태로 포함하는 제약학적 조성물의 투여는 경구, 피하, 정맥내, 비경구, 비내, 이내, 안구내, 직장, 질, 경피, 국소(가령, 겔, 연고, 로션, 크림 등), 복강내, 근육내, 폐내(가령, Aradigm로부터 상업적으로 입수가능한 AERx®흡입가능 기술, 또는 Nektar Therapeutics등으로부터 상업적으로 입수가능한 Inhance® 폐 전달 시스템)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명에 개시된 치료제는 다른 치료제와 동시에 투여될 수 있다, 다시 말하면, 본 발명에 개시된 치료제는 예로써, 소분자, 다른 생물학 제제, 방사성 요법, 수술 등을 비롯한 다른 치료법 또는 치료제와 병용될 수 있다.

도면의 간단한 설명
도 1. 항체의 구조 및 기능. pdb 수납 코드 1CE1(James et al., 1999, J MoI Biol 289:293-301, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)로부터 유래된 인간화 Fab 구조 및 pdb 수납 코드 1DN2(DeLano et al., 2000, Science 287:1279-1283, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)로부터 유래된 인간 IgG1 Fc 구조를 이용하여 모델링된, 전장 인간 IgG1 항체의 모델이 도시된다. Fab 및 Fc 영역을 연결하는 유연성 힌지는 도시되지 않는다. IgG1은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성되는, 이형이합체들의 동종이합체이다. 상기 항체를 구성하는 Ig 도메인은 표지되고, 경쇄의 경우에 VL 및 CL, 그리고 중쇄의 경우에 V_H, Cgamma1(Cγ1), Cgamma2(Cγ2) 및 Cgamma3(Cγ3)을 포함한다. Fc 영역은 표지된다. 가변 영역에서 항원 결합 부위를 비롯한, 관련 단백질에 대한 결합 부위, 그리고 Fc 영역에서 FcγR, FcRn, C1q 및 단백질 A와 G에 대한 결합 부위는 표지된다.
도 2. Kabat 등에서 제시된 바와 같이 EU 번호 매김된, 본 발명에 이용되는 인간 IgG 서열.
도 3. Kabat 등에서 제시된 바와 같이 EU 번호 매김된, 본 발명에 이용되는 인간 및 설치류의 IgG 서열의 실례.
도 4. 본 발명에 이용되는 인간 및 설치류의 FcRn 중쇄 서열의 실례.
도 5. 본 발명에 이용되는 인간 및 설치류의 베타-2-마이크로글로불린 서열의 실례.
도 6. 쥐 구조로부터 산출된 인간 Fc/FcRn 복합체 모델 (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 일부 히스티딘 잔기는 FcRn 사슬(연회색) 및 Fc 폴리펩티드(진회색) 상에 공간-채움(space-filling) 원자에서 도시된다.
도 7. 삽입 또는 결손을 포함하는 변이체 설계에 이용되는 일부 개념의 예시.
도 8. 본 발명의 변이체.
도 9. 본 발명의 변이체.
도 10. 본 발명의 변이체.
도 11. Fc 변이체의 작제에 이용될 수 있는, 벡터 pcDNA3.1 Zeo+의 도식.
도 12. 본 발명의 야생형 Fc 및 Fc 변이체의 경쟁적 FcRn 결합 데이터. 각 패널에서, 본 발명의 Fc 변이체는 왼편 곡선(적색 또는 진회색)으로서 도시되고, 야생형 항-HER2 항체는 오른편 곡선(청색 또는 연회색)으로서 도시된다.
도 13. Fc 변이체의 FcRn 결합 특성 요약. 왼쪽으로부터 오른쪽으로 각 칼럼은 FcRn 결합 변형, 이용된 면역글로불린, 기타 변형, 야생형과 비교하여 AlphaScreen™ 경쟁 분석법에 의한 상대적 FcRn 친화성(중앙값), 그리고 수행된 분석 횟수를 도시한다. 1.0보다 큰 상대적 FcRn 친화성 수치는 야생형과 비교하여 증가된 결합을 증명한다. 데이터는 pH 6.0(0.1M 인산나트륨, 25mM 염화나트륨)에서 수집되었다.
도 14. Fc 변이체의 FcRn 결합 데이터. Fc 변이체는 알렘투주맙 또는 항-HER2 항체에 존재한다. 야생형과 비교하여, 결합에서 배수적-증가가 도시된다, 다시 말하면, 1 초과의 수치는 FcRn에 더욱 단단한 결합을 지시하는 반면, 1 미만의 숫치는 FcRn에 감소된 결합을 지시한다.
도 15. FcRn에 대한 향상된 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체에 대한 표면 플라즈몬 공명 실험의 요약. 막대그래프는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 각 변이체의 FcRn 결합 친화성에서 배수적 증가를 보여준다.
도 16. 야생형 항체 및 본 발명의 변이체의 표면 플라즈몬 공명 실험. 도시된 증적(trace)은 pH 6.0에서 FcRn에 Fc 변이형 항체의 결합 및 해리를 보여준다.
도 17. FcRn에 본 발명의 Fc 변이체의 결합 분석. pH 6.0(a 및 b), 그리고 pH 7.0(c)에서 AlphaScreen™에 의해 측정된 직접 결합 분석을 보여준다.
도 18. FcRn에 본 발명의 Fc 변이체의 결합 분석. 표면-결합된 FcRn에 변이 Fc의 결합 이후에 산출된 표면 플라즈몬 공명 단위를 보여준다.
도 19. pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 본 발명의 Fc 변이체의 결합 친화성의 표면 플라즈몬 공명 측정.
도 20. 인간, 짧은꼬리원숭이와 생쥐 FcRn에 대한 본 발명의 Fc 변이체의 결합 친화성의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 측정의 요약. 1 보다 큰 숫자는 SPR 곡선을 1:1 Langmuir 결합 모델에 적합(fitting)시킴으로써 결정된, FcRn에 변이 Fc의 증가된 결합을 지시한다.
도 21. Fc 변이체의 FcRn 결합 특성의 요약. 왼쪽으로부터 오른쪽으로 각 칼럼은 FcRn 결합 변형, 이용된 면역글로불린, 기타 변형, 야생형과 비교하여 AlphaScreen™ 경쟁 분석법에 의한 상대적 FcRn 친화성(중앙값), 그리고 수행된 분석 횟수를 도시한다. 1.0보다 큰 상대적 FcRn 친화성 수치는 야생형과 비교하여 증가된 결합을 증명한다. 데이터는 pH 6.0(0.1M 인산나트륨, 125mM 염화나트륨)에서 수집되었다.
도 22. 항-HER2 항체 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열.
도 23. 본 발명에 이용되는 일부 IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1 내지 CH3)의 아미노산 서열.
도 24. 본 발명에 이용되는 일부 하이브리드 IgG1/2 중쇄의 불변 영역(CH1 내지 CH3)의 아미노산 서열.
도 25. AlphaScreen™ 경쟁 분석법으로 측정된, 인간 FcgammaRIIIA(V158 알로타입(allotype))에 결합하는 Fc 변이체
도 26. AlphaScreen™ 경쟁 분석법으로 측정된, 단백질에 A에 결합하는 Fc 변이체.
도 27. 인간 FcRn 녹인(knockin) 생쥐에서 WT 항체와 변이형 항체의 혈청 농도. 이용되는 항-VEGF 항체는 WT(열린 사각형), V308F(닫힌 사각형), P257L(닫힌 삼각형) 및 P257N(십자표)이었다.
도 28. 본 발명의 FcRn 결합 변이체의 실례. 항-VEGF 항체는 배양 배지의 부피와 정제된 단백질의 수율과 함께 표로 열거된다.
도 29. pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 본 발명의 변이체의 결합 친화성. 도시된 수치는 야생형 항체와 비교하여, 본 발명의 변이체의 결합 강도(binding strength)에서 배수적 증가이다. 가령, 변이 434S는 야생형 항체보다 4.4-배 강한 친밀도로 FcRn에 결합한다.
도 30. 293T 세포의 표면 상에서 FcRn에 WT와 변이형 항체의 결합.
도 31. 복수 치환을 포함하는 본 발명의 조합 변이체.
도 32. 434S, 표지된 Ser434, 그리고 인간 FcRn을 포함하는 변이 인간 CH3 도메인의 상호작용의 사진.

실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 하기에 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 특정 적용 또는 작업 이론으로 한정하도록 의도되지 않는다. 본 발명에서 논의된 모든 위치에서, 번호 매김은 Kabat에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다(Kabat et al., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 항체 분야에서 당업자는 이러한 합의가 면역글로불린 서열의 특정 영역에서 비-순차적 번호 매김으로 구성되고, 면역글로불린 집단에서 보존된 위치에 정규화된 참고(normalized reference)를 가능하게 한다는 것을 인지할 것이다. 따라서 EU 인덱스에 의해 정의된 바와 같은 소정의 면역글로불린의 위치는 순차적 서열에 반드시 일치할 필요가 없다.

실시예 1: Fc 변이체의 DNA 작제 , 발현 및 정제

Fc 변이체를 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®, Genentech)의 인간 IgG1 Fc 도메인 및 가변 도메인을 이용하여 작제하였다. 이들 Fc 폴리펩티드는 알렘투주맙(Alemtuzumab), 항-HER2 항체 또는 AC10의 일부이었다. 알렘투주맙(Campath®, Millenium의 등록 상표)은 현재 B-세포 만성 림프성 백혈병의 치료용으로 승인된 인간화 단일클론 항체이다(Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35:118-127, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함됨). 트라스투주맙(Herceptin®, Genentech의 등록 상표)은 전이 유방암 치료용 항-HER2/neu 항체이다. 항-HER2 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 도 22에 도시된다. AC10은 항-CD30 단일클론 항체이다. Herceptin 가변 영역은 반복 PCR을 이용하여 조립하였다. 상기 가변 영역은 이후, 인간 IgG1을 이용하여 도 11에 도시된 pcDNA3.1/Zeo(+) 벡터(Invitrogen)로 클로닝하였다. 플라스미드를 One Shot TOP10 대장균(E. coli) 세포(Invitrogen)에서 증폭시키고 고속 플라스미드 Maxi 키트(Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 플라스미드를 염기서열분석하여 클로닝된 삽입물의 존재를 확인하였다.

Quikchange™ 방법(Stratagene)을 이용하여 특정 부위 돌연변이유발을 수행하였다. 원하는 치환, 삽입 및 결실을 포함하는 플라스미드를 One Shot TOP10 대장균(E. coli) 세포(Invitrogen)에서 증폭시키고 고속 플라스미드 Maxi 키트(Qiagen)를 이용하여 정제하였다. DNA를 염기서열분석하여 서열의 신뢰도(fidelity)를 확인하였다.

중쇄 유전자(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)(야생형 또는 변이형)를 포함하는 플라스미드를 경쇄 유전자(VL-Cκ)를 포함하는 플라스미드와 함께 293T 세포로 공동-형질감염(co-transfection)시켰다. 배지를 형질감염후 5일 시점에 수거하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Pierce)를 이용하여 상층액으로부터 항체를 정제하였다. 일부 변형된 Fc의 단백질 A 결합 특성은 도 26에 도시된다. 비신코닌산(bicinchoninic acid, BCA) 분석법(Pierce)으로 항체 농도를 결정하였다.

실시예 2: 결합 친화성 측정

Fc 리간드에 Fc 폴리펩티드의 결합을 표면 플라즈몬 공명 측정을 이용하여 분석하였다. BIAcore 3000 기구(BIAcore AB)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR) 측정을 수행하였다. 고정화된 단백질 L(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)을 이용하여 야생형 또는 변이형 항체를 포획하고 수용체 분석물에 결합을 측정하였다. 단백질 L을 5 ㎕/min 유속에서 N-하이드록시숙신이미드/N-에틸-N'-(-3-디메틸아미노-프로필) 카르보디이미드(NHS/EDC)를 이용하여 CM5 센서 칩 상에서 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.5에서 1 μM 농도로 CM5 센서 칩에 공유 결합시켰다. 모든 센서 칩의 유동 세포 1을 결합의 음성 대조(negative control)로서, NHS/EDC로 모의하였다. 작업 완충액은 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20(HBS-EP, Biacore, Uppsala, Sweden)이고, 칩 재생 완충액은 10 mM 글리신-HCl pH 1.5이었다. 125 nM의 야생형 또는 변이형 항-HER2 항체를 5분 동안 1 ㎕/min으로 HBS-EP에서 단백질 L CM5 칩에 결합시켰다. FcRn-His-GST 분석물, 1 내지 250 nM로 연속 희석되고 His-태그(tag) 및 글루타티온 S 전이효소에 융합된 FcRn를 10 ㎕/min으로 HBS-EP에서 20분간 연관 및 10분간 해리를 위하여 주입하였다. 수용체 주입후 1200초 시점에서 공명 단위(RU)로 측정된 반응치를 획득하였는데, 이는 거의 항정 상태 결합을 반영하였다. 항체 및 완충액만으로 1회 사이클은 기준 반응(baseline response)을 제공하였다. RU 대 1/로그 농도 도면을 산출하고, GraphPad Prism으로 비선형 회귀(nonlinear regression)를 이용한 S자형 용량 반응(sigmoidal dose response)에 적합(fitting)시켰다.

Fc 리간드에 Fc 폴리펩티드의 결합은 또한, AlphaScreen™(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay, 증폭 발광 인접 균일 분석법)으로 수행하였다. AlphaScreen™은 비드 기반 비-방사선 발광 인접 분석법이다. 공여체 비드의 레이저 여기(excitation)는 산소를 흥분시키고, 이는 수용체 비드에 충분히 가까울 경우에, 일련의 화학발광 현상을 산출하고, 최종적으로 520-620 nm에서 형광 방출로 이어진다. AlphaScreen™의 주요 장점은 감도이다. 하나의 공여체 비드가 초당 최대 60,000개의 흥분된 산소 분자를 방출하기 때문에, 신호 증폭이 매우 높고, 아토몰(attomolar)(10^-18) 수준까지 검출을 가능하게 한다. 야생형 항체는 스트렙타비딘(streptavidin) 공여체 비드에 부착을 위하여 표준 방법으로 비오틴화되고, FcRn, FcgammaR 또는 단백질 A와 같은 태그부착된 Fc 리간드가 글루타티온 킬레이트 수용체 비드에 결합되었다. AlphaScreen™은 직접 결합 분석법으로서 적용되었는데, 여기서 Fc/Fc 리간드 상호결합이 공여체 및 수용체 비드를 모으고 측정된 신호를 산출한다. 부가적으로, AlphaScreen™은 고안된 Fc 폴리펩티드를 스크리닝(screening)하기 위한 경쟁 분석법으로서 적용되었다. 경쟁 Fc 폴리펩티드의 부재에서, 야생형 항체 및 FcRn은 상호작용하고 520-620 nm에서 신호를 산출한다. 태그부착되지 않은 Fc 도메인은 야생형 Fc/FcRn 상호작용과 경쟁하고 형광을 정량적으로 감소시켜, 상대적 결합 친화성의 측정을 가능하게 한다.

실시예 3: Fc 변이체의 FcRn -결합 특성

FcRn에 대한 IgG1 Fc의 결합 친화성을 AlphaScreen™을 이용하여, 변이형 항체로 측정하였다. Fc 폴리펩티드는 알렘투주맙 또는 트라스투주맙의 일부이었다. 알렘투주맙(Campath®, Ilex)은 현재 B-세포 만성 림프성 백혈병 치료용으로 승인된 인간화 단일클론 항체이다(Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35:118-127, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 트라스투주맙(Herceptin®, Genentech)은 전이 유방암 치료용 항-HER2/neu 항체이다.

25mM 염화나트륨을 포함하는 0.1M 인산나트륨 pH 6.0에서 야생형 항체와 비교하여 Fc 변이체의 상대적 결합을 측정하기 위하여, 경쟁적 AlphaScreen™ 데이터를 수집하였다. 경쟁자 항체의 함수로서 AlphaScreen™ 신호의 실례는 도 12에 도시된다. 12개의 변이체 P257L, P257N, V279E, V279Q, V279Y, ^281S, E283F, V284E, L306Y, T307V, V308F 및 Q311V에 대한 곡선은 각 변이체 곡선이 그들의 박스에서 야생형 곡선의 좌측으로 이동함에 따라서 증가된 친화성을 나타낸다. 본 발명의 Fc 변이체에 대한 경쟁 AphaScreen™ 데이터는 도 13 및 14에 요약된다. 125mM 염화나트륨을 포함하는 0.1M 인산나트륨 pH 6.0에서 부가적인 경쟁 AlphaScreen™ 데이터는 도 21에 요약된다. 야생형과 비교하여 변이체의 상대적 FcRn 결합이 표로 열거된다. 1 보다 큰 값은 야생형과 비교하여 FcRn에 Fc 변이체의 향상된 결합을 나타낸다. 가령, 변이체 E283L 및 V284E는 각각 야생형보다 9.5-배 및 26-배 강한 결합을 갖는다. 도 15 및 16에 도시된 바와 같이, 다수 변이체의 표면 플라즈몬 공명 측정 역시 FcRn에 대한 증가된 결합을 증명한다.

257 위치에서 이미노산, 프롤린을 제거하고 측쇄 공유 결합에 대한 N 골격이 없는 아미노산을 치환하는 모든 변이체는 골격에 더욱 유연성을 부여하고, 이러한 유연성은 Fc 도메인이 더욱 효과적으로 FcRn에 결합하도록 더욱 많은 자유를 가능하게 한다. 특히, 257 위치에서 L 및 N에 대한 변이체는 pH 6에서 강한 FcRn 결합을 갖는데, 이는 Fc 도메인이 생산적인, 다시 말하면, 강한 FcRn 상호작용을 발생시키는데 4개 원자 측쇄 및 이러한 측쇄의 감마 가지화(branching) 패턴이 도움이 된다는 것을 증명한다. 308 위치는 257 위치와 상호작용한다. 이들 양쪽 위치는 차례로, H310과 상호작용하는데, 상기 H310은 Fc/FcRn 상호작용에 직접적으로 관련된다(표 2, Burmeister et al (1994) Nature 372:379-383, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). Fc 변이체 V308F 및 V08Y는 야생형과 비교하여 2.9-배 및 4.3-배 증가된 FcRn 친화성을 가진다(도 13). 279 및 385 위치는 변이체 V279E, V279Q 및 V279Y, 그리고 G385H 및 G385N이 모두 더욱 강한 FcRn 상호작용을 나타내기 때문에, FcRn와 상호작용한다. 이들 변이체 모두 수소 결합할 수 있는 아미노산에 대한 것이다.

도 13에 도시된 바와 같이, Fc 변이체 N434Y는 pH 6.0에서 FcRn에 특히 강한 결합을 갖는다. 단일 변이체 N434Y는 16-배 증가된 결합을 갖는다. 이러한 변이체 및 다른 변형의 조합은 더욱 강한 결합으로 이어졌다. 가령, P257L/N434Y, ^281S/N434Y, 그리고 V308F/N434Y는 FcRn 결합에서 830-배, 180-배 및 350-배 증가를 보인다.

실시예 4: 삽입 및 결실을 포함하는 변이체

Fc/FcRn 상호작용의 강도를 변화시키는 삽입 및 결실을 작제하고, 다양한 Fc 리간드에 대한 이들의 결합 특성을 측정하였다. Kabat 등의 EU 번호 매김을 이용하여, 잔기 281 및 282 사이에 Ser 잔기가 삽입된 Fc 변이체는 Fc 도메인의 FcRn 결합 특성을 증가시키도록 고안되었다. 이 변이체는 ^281S로 지칭되는데, 여기서 "^" 표시는 정해진 위치 다음에 삽입을 의미한다. ^281S의 향상된 결합을 증명하는 AlphaScreen™ 데이터는 도 12b 및 21a에 도시된다. 하나 이상의 잔기일 수 있는 삽입된 서열은 위치 번호 다음에 제공된다. 이러한 Fc 변이체는 본 발명에 개시된 방법을 이용하여 카파, IgG1 항-HER2 항체 트라스투주맙(Herceptin®, Genetech)에서 작제되었다. 잔기 281 및 282 사이의 부위에 삽입은 잔기 281의 C-말단에서 Fc 루프 잔기를 상기 루프의 C-말단으로 이동시키고, 측쇄 위치를 변경시킨다. 282, 283 및 284 위치에서 치환을 포함하는 Fc 변이체는 상기 루프의 C-말단 이동이 유익하였음을 암시하였다(도 14 참조). 때때로 N286#으로 지칭되는 N286의 결실인 다른 변이체 역시 FcRn-결합 루프의 위치를 이동시키도록 작제되었다. 상기 변이체는 pH 6.0에서 FcRn에 증가된 결합을 보인다.

이러한 AlphaScreen™ 데이터는 ^281S 변이체 및 다른 변이체의 FcRn에 대한 결합을 증명한다. AlphaScreen™ 데이터는 직접 결합 분석법으로서 수집되었다. 높은 수준의 화학발광 신호는 강한 결합을 나타낸다. 상기 분석법에서 변이체 농도가 증가함에 따라, 더욱 강한 신호가 산출된다. pH 6.0에서 도 17a 및 17b의 데이터는 야생형 Fc와 비교하여 ^281S, P257L, P257L/^281S(복합 치환/삽입 변이체) 및 다른 변이체의 증가된 친화성을 증명한다. 또한, 원숭이에서 증가된 혈청 반감기를 갖는 것으로 이미 밝혀진 이중 치환, T250Q/M428L이 도시된다(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 삽입 변이체 ^281S는 단독으로 Fc/FcRn 결합력을 증가시킨다. 부가적으로, ~40nM 데이터 포인트에서 확인되는 바와 같이, 두 변형이 변이체 P257L/^281S에서 통합될 때, ^281S는 P257L의 결합을 더욱 증가시킨다. 도 17c의 데이터는 이들 변이체가 pH 7.0에서 증가된 FcRn 결합을 나타내지 않는다는 것을 증명한다. pH 7.0에서 감소된 친화성은 Fc 재순환에서 중요 단계인 FcRn으로부터 Fc 폴리펩티드의 세포외 공간으로의 방출을 가능하게 하기 때문에, 생체내 반감기를 증가시키는데 바람직하다.

표면 플라즈몬 공명 시험은 또한, FcRn에 ^281S의 향상된 결합을 증명한다. 도 18에서는 다양한 Fc 변이체가 칩 표면 상에서 FcRn에 결합할 때 산출된 반응 단위(response unit)를 도시한다. 변이체가 칩에 충분히 결합할 수 있도록 한 이후, 반응 단위를 기록하고 세로좌표에 나타낸다. 삽입 변이체 ^281S는 야생형과 비교하여 FcRn에 대한 증가된 친화성을 갖는 것으로 본 발명에서 밝혀진 다른 변이체에 필적하는 결합 특성을 보인다(예로써, 도 13, 14 및 15 참조).

N286의 결실을 포함하는 결실 변이체, N286# 역시 야생형과 비교하여 FcRn에 대한 증가된 친화성을 보인다. 도 13에 도시된 바와 같이, 상기 변이체는 2.0-배 증가된 FcRn 친화성을 갖는다. 상기 데이터는 또한, pH 6.0에서 경쟁 실험으로서 수집된 AlphaScreen™ 데이터이다. 이들 변이체는 공여체 비드에 연결된 야생형 Fc의 수용체 비드에 연결된 FcRn과의 결합을 저해하는데 이용된다. Fc/FcRn 복합체를 통하여 공여체/수용체 비드의 결합을 저해하기 위하여, 자유 야생형 Fc 보다 2-배 덜 자유로운 N286#이 필요하였다. 이는 야생형과 비교하여 N286#의 2-배 강한 결합을 증명한다.

삽입 또는 결실을 포함하는 다른 Fc 변이체는 FcRn에 대한 감소된 친화성을 갖는다. 삽입 변이체 ^254N은 상기 변이체의 성질 및 위치로부터 예측되는 바와 같이, 매우 감소된 FcRn 결합을 갖는다. 상기 변이체는 FcRn 결합 루프의 중간에 삽입, Asn을 배치한다. 이러한 삽입은 야생형의 결합 친화성의 단지 1.1% 결합만을 갖는다(도 13).

실시예 5: 변경된 FcRn 과 FcgammaR 특징을 갖는 조합 변이체.

항-HER2 항체에 대하여 도 13b에 도시된 바와 같이, Fc 변이체 P257L은 WT와 비교하여 FcRn에 대한 증가된 친화성을 갖는다. P257L은 25mM NaCl이 첨가된 인산염 완충액 pH 6.0에서, 인간 FcRn에 대한 FcRn 친화성에서 평균 2.6-배 증가를 제공하였다. P257L 변이체에 I332E 또는 S239D/I332E의 추가는 이중 및 삼중 변이체, P257L/I332E 및 S239D/P257L/I332E를 산출하였는데, 이들은 FcRn에 대한 증가된 친화성을 유지한다. 변이형 S239D/I332E는 도 14b에서 AlphaScreen™ 분석에서 확인되는 바와 같이 야생형과 비교하여 본질적으로 변경되지 않은 FcRn 결합을 갖는다. 이들 이중과 삼중 변이체는 5-배와 4-배 증가된 친화성을 갖는다. I332E 및 S239D/I332E 변이체는 FcgammaR, 특히 FcgammaRIIIa에 향상된 결합을 갖는다(참조: US11/124620, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 본 발명의 일부 변이체의 FcgammaR-결합 특성은 도 25에 도시된다. 본 발명의 일부 변이체의 단백질 A 결합 특성은 도 26에 도시된다. 단백질 A 결합은 Fc-보유 단백질의 정제 동안 빈번하게 이용된다. 치환 V308F 역시 pH 6.0에서 FcRn 결합을 향상시킨다(도 13e). V308F는 항-HER2 항체 트라스투주맙(Herceptin™, Genentech)에서 단일 치환체로서 3-배 증가된 친화성을 갖고, 또한 FcgammaR 결합을 증가시키는 치환, 예를 들면, I332E, S239D/I332E, 그리고 S298A/E333A/K334A와 합병될 때 증가된 친화성을 갖는다(Lazar et al. 2006 Proc. Nat. Acad. Sci USA. 103(111): 4005-4010, Shields et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 특히, 삼중-치환 변이형 S239D/I332E/G385H에서 FcgammaR 향상 치환과 합병될 때, G385H의 증가된 FcRn 결합 역시 유지된다.

FcRn에 증가된 결합을 갖는 변이체는 FcgammaR 및 보체 단백질(complement protein), C1q에 결합을 감소시키거나 녹아웃(knock-out)시키는 변이체와 합병될 수 있다. FcRn에 향상된 결합은 보호 수용체(protecting receptor)로부터 효과를 증가시키고 향상된 반감기를 가능하게 한다. Fc 보유 단백질은 또한, 세포 내로 흡수되고 FcgammaR 및 C1q 단백질과의 상호작용을 통하여 물질대사될 수도 있다. Fc/FcgammaR 및 Fc/C1q 단백질 상호작용이 항체 효능을 위하여 요구되지 않으면, 이들 상호작용은 결실될 수 있다. 이들 상호작용의 결실은 또한, 퇴화 수용체(degrading receptor)의 효과를 감소시키고, 따라서 향상된 반감기를 가능하게 할 수도 있다. 특히, 변이체 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325A, 325L, 그리고 328R(US11/396,495, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)이 증가된 FcRn 친화성 및 감소된 FcgammaR 또는 C1q 친화성을 갖는 변이체를 산출하기 위하여 FcRn-향상 변이체와 합병될 수 있다. 이들 변이체에는 235G/257C, 325A/385H, 325A/257L, 234G/308F, 234G/434Y, 그리고 269R/308F/311V가 포함된다. 이들 변이체는 비록 FcgammaR 또는 C1q와의 감소된 상호작용이 IgG2, IgG4, 또는 IgG3으로부터 Fc 도메인을 포함하는 단백질 내로 이들 돌연변이를 위치시킴으로써 달성될 수도 있긴 하지만, IgG1로부터 Fc 도메인에서 만들어진다. FcRn 변형, 예를 들면, 257N, 257L, 257M, 308F, 311V를 IgG2 내로 집어넣으면, FcgammaR 결합에서 감소 및 증가된 FcRn 상호작용이 가능해진다.

FcRn에 감소된 결합을 갖는 변이체는 증가된 FcgammaR 또는 C1q 결합을 갖는 변이체와 합병될 수 있다. 증가된 FcgammaR 결합과 합병된 감소된 FcRn 결합은 부정한 작동체 기능(effector function)에 가용한 Fc-보유 단백질의 양을 증가시키는데 유익할 수 있다. FcRn 결합의 감소는 FcRn에 의해 격리되는 Fc-보유 단백질의 양을 감소시키고, 따라서 생체이용효율(bioavailability)에 영향을 줄 수 있다. I253V, S254N, S254#(254의 결실), T255H, 그리고 H435N과 같은 변형은 Fc/FcRn 결합(도 13)을 감소시키고, 향상된 FcgammaR 결합을 갖는 변이체, 예를 들면, S239D, I332E, H268E, G236A와 합병될 수 있다. 결과의 Fc 도메인, 예를 들면, I253V/S239D/I332E, I332E/H435N, 또는 S254N/H268E을 포함하는 것들은 감소된 FcRn 결합 및 증가된 FcgammaR 결합을 갖는다.

FcRn에 감소된 결합을 갖는 변이체는 감소된 FcgammaR 결합을 갖는 변이체와 합병될 수 있다. 감소된 FcRn 및 FcgammaR 결합의 이러한 조합은 Fc-보유 단백질이 방사활성 또는 독성 추적자(tracer)로 표지되는 이미지화(imaging)와 같은 적용에서 유익하다. 이상적으로, 방사활성 추적자를 포함하는 단백질의 반감기는 방사성핵종(radionuclide) 자체의 반감기에 유사하다. 이는 방사성핵종의 붕괴(decay)와 동일한 시간에, 신체로부터 추적자의 제거를 가능하게 한다. 이러한 감소된 FcgammaR 상호작용은 또한, 표적에 대한 Fc-보유 단백질의 최적 이용도(optimal availability)를 가능하게 한다. 가령, Fc-보유 단백질이 항체이면, 이러한 감소된 FcgammaR 결합은 더욱 많은 항체가 항원에 접근할 수 있도록 한다. FcRn- 및 FcgammaR-영향 변이체의 조합, 예를 들면, 235G/254N, 236R/435N, 269R/I253V가 이러한 적용에 적합하다.

실시예 6: 인간 FcRn 에 결합하는 항체 OST577 에서 Fc 변이체.

OST577은 항-B형 간염 표면 항원 항체이다(Ehrlich et al. (1992) Hum. Antibodies Hybridomas 3:2-7, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). KADBID 000653(중쇄) 및 KADBID 007557(경쇄)로 Kabat 데이터베이스로부터 중쇄와 경쇄 서열을 획득하였다(Martin AC, Proteins. 1996 May;25(1):130-3, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). 이들 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 DNA는 Blue Heron Biolotechnology, Bothell, WA에 의해 합성되었다. 실시예 1에서 항-HER2(트라스투주맙) 변이체에서처럼, 야생형 및 변이형 OST577 항체를 발현하고 정제하였다. 칩 표면에 부착된 인간 FcRn/글루타티온 D 전이효소(GST) 융합 단백질로, 실시예 2에서처럼 Biacore™ 결합 분석을 수행하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 본 발명의 Fc 변이체는 인간 FcRn에 변경된 결합을 갖는다. 증가된 결합을 갖는 변이체는 표면 상에서 FcRn에 더욱 용이하게 부착하고 반응 단위(Response Unit, RU)에서 더욱 큰 상승을 유도한다. FcRn-결합 영역에서 변형을 갖는 것으로 밝혀진 변이체는 모두 야생형 단백질과 비교하여, FcRn에 대한 증가된 친화성을 갖는다. 이들 변이체에는 P257L, P257N, V308F, N434Y, P257L/N434Y 그리고 P257L/V308F가 포함된다. 975초에 세 번째로 많은 RU를 갖는 변이체, T250Q/M428L은 짧은꼬리원숭이에서 OST577 항체의 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Hinton et al. 2004 Journal of Biological Chemistry 279(8):6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다). 이러한 데이터 세트(data set)에는 치환 S239D/I332E를 보유하는 하이브리드 IgG1/IgG2 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체가 포함된다. 실시예 5에 기술된 바와 같이, 이들 치환은 FcgammaR에 대한 항체 친화성을 증가시킨다. 도 19에 도시된 바와 같이, 이들 치환은 FcRn-결합 특성을 변화시키지 않는데, 그 이유는 하이브리드 S239D/I332E Biacore™ 증적이 카파(kappa) 또는 람다(lambda) CL1 도메인을 포함하는 야생형 증적을 덮어쓰기 때문이다.

실시예 7: 인간, 원숭이 및 생쥐 FcRn 에 대한 Fc 변이체의 친화성

실시예 1에 기술된 바와 같이, 항-HER2 항체 트라스투주맙에서 Fc 변이체를 산출하였다. 인간, 짧은꼬리원숭이 또는 생쥐 FcRn이 칩 표면에 부착되는 점을 제외하고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR) 증적을 수집하였다. 상이한 양의 GST-FcRn이 표면에 부착된 각 Fc 변이체에 대하여 2개의 SPR 곡선을 수집하였다. 각 곡선을 1:1 Langmuir 결합 모델에 적합시키고, 2가지 결과 Kd 수치를 평균하여 각 변이체-수용체 쌍에 대한 대표 수치를 산출하였다. 이들 결과는 야생형 트라스투주맙과 비교하여, Kd에서 배수적 향상으로서 도 20에 제시된다. 가령, 변이형 V308F/Q311V는 야생형과 비교하여, 인간 FcRn에 3.4-배 강한 친밀도로 결합한다. V308F/Q311V는 또한, 원숭이와 생쥐 FcRn에 각각 3.7-배 및 5.1-배 강한 친밀도로 결합한다. 변이형 M428L은 항체 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀졌고(Hinton et al. 2004 Journal of Biological Chemistry 279(8):6213-6216, 이는 본 발명에 전체가 참조로서 포함된다), 인간, 원숭이 및 생쥐 FcRn에 각각 2.4-배, 2.0-배, 그리고 2.1-배 증가된 결합을 갖는다. P257L, P257N, N434Y, Q311V, V308F, V308F/N434Y, P257L/V308F, 그리고 P257L/N434Y를 비롯한 다른 변이체 역시 pH 6.0에서 증가된 결합을 보인다.

실시예 8: 다양한 Fc 도메인에서 FcRn 변이체

실시예 1에 기술된 것들을 비롯한 본 명세서에 기술된 분자생물학과 정제 기술을 이용하여, 본 발명의 변이체를 임의의 불변 도메인 내로 통합하였다. 도 2에 표로 열거된 바와 같은 IgG1, IgG2, IgG3, 그리고 IgG4 불변 도메인의 아미노산 서열이 이용될 수 있다. 이에 더하여, 2개 이상의 상이한 불변 도메인의 조합이 이용될 수도 있다. 가령, 도 24에서는 IgG1과 IgG2의 하이브리드 내로 통합되는, 본 발명에서 확인된 변형 중에서 일부를 표로 열거한다. 이러한 하이브리드는 IgG2 CH1 도메인, 그리고 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. IgG3은 인간에서, IgG1, IgG2, 그리고 IgG4에 비하여 낮은 반감기를 갖고(7일 대(對) ~21일, Janeway, Travers, Walport, Shlomchik. Immunology, 5^th ed. Garland Publishing c2001, 도 4-16, 이는 참조로서 포함됨), 따라서 특정 적용에 바람직하다.

실시예 9: 항- VEGF 항체에서 변이체의 산출

실시예 1을 비롯한 본 명세서에 기술된 방법을 이용하여, 변경된 결합을 갖는 항-VEGF 항체를 생산하였다. 야생형 항-VEGF 중쇄는 아래의 아미노산 서열을 포함한다:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELIgGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

야생형 항-VEGF 경쇄는 아래의 아미노산 서열을 포함한다:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

변경된 결합을 갖는 단일 변이체와 조합 변이체에는 도 28에 도시된 변이체가 포함되는데, 상기 도면에서는 생산된 변이체, 이용된 배양 배지의 부피, 그리고 이들 항체 변이체의 결과 수율을 도시한다. 이들 변이체에 대한 번호 매김은 Kabat 등에서 제시된 바와 같은 EU 인덱스를 따른다. 도 28에서 표로 열거된 변이체는 IgG1과 IgG2 둘 모두로부터 서열을 포함하는 IgG1 또는 하이브리드 VH에서 생산되었다. 이들 변이체는 항원 VEGF에 결합하는 가변 영역을 포함한다. 모든 단백질은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)와 SDS 겔 전기영동(gel electrophoresis)에 의해, >90% 순수한 것으로 평가되었다.

실시예 10: 항체 변이체의 생체내 반감기

야생형 및 변이형 항체의 약물동력학(pharmacokinetics)을 생쥐에서 조사하였다. 이용된 생쥐(B6-Fcgrt^Tm1Dcr 생쥐)는 Petkova et al. International Immunology 2006 Dec;18(12):1759-69에서 기술된 바와 같이, 생쥐 FcRn의 발현이 결함되고 인간 FcRn의 녹인(knock-in)(hFcRn Tg - 도입유전자(transgene))에 이종접합성(heterozygous)이었다. Petkova 등은 변이형 N434A가 이들 인간 FcRn 녹인 생쥐에서 증가된 반감기를 갖는다는 것을 증명하였는데, 이는 N434A 변이체가 원숭이에서 증가된 반감기를 갖는다는 것을 보여주는 이전의 결과(US Appl No. 11/208422, 공개 번호 US26067930A1)와 일치한다. 9-12 주령의 암컷 생쥐는 항체당 6마리 생쥐 군으로 2 ㎎/㎏ 항체를 정맥내 주입하였다. 1시간, 그리고 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 18일, 21일, 25일과 28일 시점에 안와 정맥총(orbital plexus)으로부터 혈액 시료를 수집하였다. 항-인간 Fc 항체 및 유러퓸(europium) 검출을 이용한 샌드위치 ELISA 분석법(sandwich ELISA assay)으로, 혈청 내에서 각 항체의 농도를 측정하였다.

본 연구의 결과는 도 27에 도시되는데, 이들은 2가지 독립된 연구의 대표 데이터이다. 4가지 시료에 대한 평균 및 이러한 평균의 표준 편차가 도시된다. 명백하게, V308F 변이체는 더욱 긴 반감기를 갖는데, 25일까지 측정가능 농도로 존재하였다. WT 및 P257L과 P257N 변이체는 더욱 빠르게 제거되는데, 각각 15일, 8일 및 4일까지만 측정가능 농도로 존재하였다. 시간의 함수로서 혈청 농도는 소프트웨어 패키지, WinNonLin(Pharsight Inc)을 이용하여 비-구획 모델(non-compartmental model)에 적합시켰다. V308F 변이체의 종말 반감기(terminal half-life)는 4.9일인 반면, WT 및 P257L과 P257N 변이체의 종말 반감기는 각각, 3.0일, 1.9일 및 0.9일이었다. V308F 변이체의 곡선 아래 면적(area under curve, AUC)은 129 day^*㎍/㎖인 반면, WT 및 P257L과 P257N 변이체의 곡선 아래 면적은 각각 70, 38 및 38 day^*㎍/㎖이었다.

실시예 11: pH 6.0에서 FcRn 결합 실험

본 발명의 항-VEGF 변이체는 실시예 2에 기술된 Biacore 분석법을 약간 변형하여, 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 능력을 시험하였다. 5 ㎕/min의 유속(flow rate)에서 N-하이드록시숙신이미드/N-에틸-N'-(-3-디메틸아미노-프로필) 카르보디이미드(NHS/EDC)를 이용하여, 인간 FcRn을 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.5에서 CM5 칩에 공유 부착시켰다. 이용된 인간 FcRn은 정제 및 다른 분석을 보조하기 위하여, GST 및 HIS 태그부착된 이형을 포함하였다. 대략 3300 RU의 FcRn이 칩에 부착되었다. 유동 세포(flow cell) 1은 결합의 음성 대조로서, NHS/EDC로 모의하였다. 작업 완충액은 25mM 인산염 완충액 pH 6.0, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.005%(v/v) 계면활성제 P20이었다. 동일한 완충액 pH 7.4로 FcRn 칩으로부터 항체를 씻어냈는데, 이는 시험된 모든 변이체를 신속하게 제거하였다. biacore 결합 및 해리 증적을 형태 교환 모델(conformational exchange model)에 적합시켜 겉보기 평형 결합 상수(apparent equilibrium binding constant, Kd)를 계산하였다.

이의 결과는 V308F 변이체 및 많은 다른 변이체가 FcRn에 향상된 결합을 갖는다는 것을 증명한다. 야생형 항-VEGF 항체는 18 nM의 Kd를 갖는데, 이는 분석법 설계(assay design)와 데이터 적합(data fitting)에서 차이로 인하여, Dall' Acqua et al(Dall' Acqua et al Journal of Immunology 2002, 169:5171-5180)에서 보고된 수치와 상당한 차이를 보인다. 본 실시예의 분석 양식(assay format)은 FcRn 칩이 산출 직후에 이용되면, 재현가능 결과를 제공하였다. 하지만, 이러한 FcRn 칩은 아마도, 표면으로부터 이들 2가지 FcRn 사슬 중에서 한쪽의 해리로 인하여, 사용 과정에서 저하되었다. 이들 결과는 야생형 항-VEGF와 비교하여 이들 변이체의 변경된 결합을 증명한다. 도 29에서는 야생형 대조와 비교하여 결합 강도에서 배수적 증가를 보여준다. 1 보다 큰 수치는 변이형 항체가 야생형 단백질보다 FcRn에 대한 더욱 높은 친화성을 갖는다는 것을 나타낸다. 예로써, 변이형 V308F는 야생형 항체보다 4.5-배 강한 친밀도로 FcRn에 결합한다. 변이형 V308F/M428L은 야생형 단백질보다 12.3-배 강한 친밀도로 FcRn에 결합하고, 변이형 T307P/V308F는 3.16-배 강한 친밀도로 FcRn에 결합한다. 도 29에 도시된 어떤 변이체도 야생형(수치가 1.0 미만일 것이다)과 비교하여, FcRn에 대한 감소된 친화성을 나타내지 않았다. 변이형 N434S는 WT보다 4.4-배 강한 FcRn 결합 친화성을 갖는데, 이는 V308F에 필적하다.

실시예 12: 막통과 FcRn 에 결합 실험.

FcRn 알파 사슬과 베타-2-마이크로글로불린 cDNA를 OriGene Technologies Inc(Rockville, MD)로부터 구입하고, 세포 표면 상에서 기능적 FcRn을 발현하기 위하여 293T 세포에 형질감염시켰다. 20 ㎍ Fcgrt 및 40 ㎍ 베타-2-마이크로글로불린 DNA를 리포펙타민(lipofectamine)(Invitrogen Inc.)으로 형질감염시키고, 이들 세포를 10% 초저(ultra low) IgG 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 3일 동안 성장시켰다. 이들 2개의 FcRn 사슬로 형질감염되지 않은 대조 세포 역시 성장시켰다. 다양한 양의 항-VEGF 항체(WT 및 변이체)를 25mM 인산염 완충액 pH 6.0, 150mM NaCl, 0.5% BSA에서 30분 동안 이들 세포에 결합시키고, 이후 25mM 인산염 완충액 pH 6.0, 150mM NaCl, 0.5% BSA + 0.003% 이게팔(igepal)에서 6-9회 세척하였다. 세척후, 항체를 1% PFA와의 결합으로 처리하여 표면에 고정시켰다. 결합된 항체는 이후, 인간 Fab 도메인에 대한 PE 태그부착된 Fab'₂를 이용하여 검출하고, BD FACS Canto II를 이용하여 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)를 측정하였다. 항체당 2가지 샘플의 평균은 도 30에 도시된다. 도 30에 도시된 데이터에 곡선 적합(curve fit)은 해석가능 EC50 수치를 제공하지 못하는데, 그 이유는 많은 곡선이 이들 세포를 포화시킴으로써 상한선(upper baseline)을 형성하지 못했기 때문이다. 하지만, 이들 항체는 MFI가 3000, EC(MFI=3000)에 상당하는 로그[변이체]를 보고함으로써, 그들의 결합 친화성의 순서로 정렬될 수 있다. 이러한 측정 규준(metric)을 이용하여, 이들 항체는 가장 강한 FcRn 친화성에서 가장 약한 FcRn 친화성의 순서로, 아래와 같이 열거될 수 있다: V308F/M428L, V259I/V308F, T250I/V308F, T250Q/M428L, N434S, T307Q/V308F, P257L, T307S/V308F, V308F, T256V/V308F, V308F/L309Y, 그리고 WT.

실시예 13: 변이체 , 434S의 특징.

변형 434S를 포함하는 항체는 이들 항체를 본 발명의 바람직한 변이체가 될 수 있도록 하는 특히 유익한 특성을 갖는다. 인간 IgG1에서, 434 위치에서 야생형 잔기는 아스파라긴, Asn이고, 따라서 이러한 변이체는 434 위치에서 Asn, N을 포함하는 IgG1 또는 다른 Fc 도메인의 배경에서 N434S로 지칭된다. 더욱 일반적으로, 상기 변이체는 간단하게, 434S로 지칭될 수도 있다. 본 발명에서, 434S 변이체는 항-HER2 항체 트라스투주맙과 항-VEGF 항체 둘 모두에서 성공적으로 생산되었다.

434 위치에서 Ser은 직접적으로 또는 간접적으로, 다시 말하면, 물 또는 용질 분자를 통하여 FcRn과 수소 결합(hydrogen bond)하는 능력을 갖는다. 434 위치에서 Ser의 감마 산소(gamma oxygen)는 도 32에 도시된 바와 같이, FcRn 분자 상에서 Gly131과 Pro134의 카르보닐 산소 원자(carbonyl oxygen atom)에 근접 위치한다. 도 32에서는 인간 FcRn과 복합된 인간 Fc 도메인의 모델을 도시한다. 이러한 모델에서 Fc 도메인은 434S 치환을 포함하고, 따라서 도 32에서 잔기 434는 Ser이다. 상기 모델은 PDA® 기술(Dahiyat and Mayo Protein Sci. 1996 May; 5(5):895-903), 쥐 FcRn에 결합된 쥐 Fc 도메인의 결정 구조(Martin et al. Mol Cell. 2001 Apr;7(4):867-77), 그리고 Pymol(Delano Scientific)로 산출된다. Ser은 크기가 작기 때문에, 이들 두 단백질 사이의 접촉면에 용이하게 수용된다.

항체 변이체 N434S는 biacore™ 측정에 의해 확인되는 바와 같이, 야생형 항체와 비교하여 FcRn에 대한 4.4-배 증가된 결합 친화성을 갖는다(도 29). 상기 변이체는 또한, 세포 계수 측정(cell counting measurement)에 의해 확인되는 바와 같이, 세포 표면 결합된 FcRn에 증가된 결합을 보인다(도 30).

도 29 및 30에 도시된 결과에 기초하여, 434S 및 다른 변형을 포함하는 바람직한 변이체에는 V308F/434S, 428L/434S, 252Y/434S, 259I/308F/434S, 250I/308F/434S, 그리고 307Q/308F/434S가 포함될 것으로 예상된다.

실시예 14: 추가적인 변이체

추가적인 변이체는 본 명세서 및 기존 문헌(Dall' Acqua et al Journal of Biological Chemistry 2006 Aug 18;281(33):23514-24; Petkova et al. International Immunity 2006 Dec;18(12):1759-69; Dall' Acqua et al Journal of Immunology 2002, 169:5171-5180; Hinton et al, Journal of Biological Chemistry 2004 279(8): 6213-6216; Shields et al. Journal of Biological Chemistry 2001 276(9):6591-6604; Hinton et al. Journal of Immunology 2006, 176:346-356, 이들 모두 참조로서 편입됨)에 포함된 데이터에 기초될 수 있다. 이들 변이체에는 도 31에 도시된 것들이 포함된다.

도 29 및 30에서 결과, 그리고 Dall' Acqua et al(Journal of Biological Chemistry 2006 Aug 18;281(33):23514-24, 이는 참조로서 편입됨)의 결과에 기초하여, 바람직한 변이체에는 Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, M252Y/S254T/T256E/N434S, M252Y/S254T/T256E/V308F, M252Y/S254T/T256E/M428L, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L, 그리고 T250Q/V308F/M428L이 포함된다.

도 29 및 30에서 결과에 기초하여, 더욱 바람직한 변이체에는 Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L, 그리고 T250Q/V308F/M428L이 포함된다.

본 발명의 특정 구체예가 예시의 목적으로 앞서 기술되긴 했지만, 당업자는 본 발명의 특허청구범위에 기술된 발명의 범위를 벗어나지 않는, 이들 상세의 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 순전히 참조로서 포함된다.

<110> XENCOR, Inc. <120> Fc Variants with Altered Bindig to FcRn <130> IPP20100272US <150> US 11/932151 <151> 2007-10-31 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 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<400> 8 Leu Pro Leu Met Tyr His Leu Ala Ala Val Ser Asp Leu Ser Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Ala Gln Gln Tyr Leu 20 25 30 Thr Tyr Asn Asn Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys Gly Ala Trp Ile 35 40 45 Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu 50 55 60 Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe Leu Glu Ala Ile Arg Thr Leu Glu Asn 65 70 75 80 Gln Ile Asn Gly Thr Phe Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu 85 90 95 Ala Pro Asp Asn Ser Ser Leu Pro Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly 100 105 110 Glu Glu Phe Met Arg Phe Asn Pro Arg Thr Gly Asn Trp Ser Gly Glu 115 120 125 Trp Pro Glu Thr Asp Ile Val Gly Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Glu 130 135 140 Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu Phe Leu Leu Thr Ser Cys Pro Glu Arg 145 150 155 160 Leu Leu Gly His Leu Glu Arg Gly Arg Gln Asn Leu Glu Trp Lys Glu 165 170 175 Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser 180 185 190 Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe 195 200 205 Arg Phe Leu 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Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 23 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 180 185 190 His Val Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 24 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G385H Hybrid <400> 24 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn His Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims

Fc 영역 내에서 적어도 하나의 변형을 포함하는, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체로서, 상기 항체 또는 면역접합체는 상기 모 항체 또는 면역접합체와 비교하여 FcRn에 대한 변경된 결합성을 나타내고, 상기 변형은 259I, 307S, 319F, 319L, 및 434M으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 번호 매김(numbering)은 Kabat 등에서 제시된 EU 인덱스에 따르는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항에 있어서, 상기 Fc 영역은 246H, 246S, 247D, 247T, 248H, 248P, 248Q, 248R, 248Y, 249T, 249W, 250E, 250I, 250Q, 250V, 251D, 251E, 251H, 251I, 251K, 251M, 251N, 251T, 251V, 251Y, 252Q, 252Y, 253L, 253T, 253V, 254H, 254L, 254N, 254T, 254V, ^254N, 255E, 255F, 255H, 255K, 255S, 255V, 256E, 256V, 257A, 257C, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257Q, 257R, 257S, 257T, 257V, 257W, 257Y, 258R, 258V, 259I, 279A, 279D, 279C, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280H, ^281A, ^281D, ^281S, ^281T, 282D, 282F, 282H, 282I, 282T, 283F, 283I, 283L, 283Y, 284H, 284K, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284Y, 285S, 285V, 286D, 286#, 286L, 287H, 287S, 287V, 287Y, 288H, 288Q, 288S, 305H, 305T, 306F, 306H, 306I, 306N, 306T, 306V, 306Y, 307D, 307P, 307Q, 307S, 307V, 307Y, 308C, 308D, 308E, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308Q, 308P, 308R, 308S, 308W, 308Y, 309F, 309H, 309N, 309Q, 309V, 309Y, 310K, 310N, 310T, 311A, 311L, 311P, 311T, 311V, 311W, 312H, 313Y, 315E, 315G, 315H, 315Q, 315S, 315T, 317H, 317S, 319F, 319F, 319L, 339P, 340P, 341S, 374H, 374S, 376H, 376L, 378H, 378N, 380A, 380T, 380Y, 382H, 383H, 383K, 383Q, 384E, 384G, 384H, 385A, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385S, 385T, 385V, 385W, 385Y, 386E, 386K, 387#, 387A, 387H, 387K, 387Q, 389E, 389H, 426E, 426H, 426L, 426N, 426R, 426V, 426Y, 427I, 428F, 428L, 429D, 429F, 429K, 429N, 429Q, 429S, 429T, 429Y, 430D, 430H, 430K, 430L, 430Q, 430Y, 431G, 431H, 431I, 431P, 431P, 431S, 432F, 432H, 432N, 432S, 432V, 433E, 433P, 433S, 434A, 434F, 434H, 434L, 434M, 434Q, 434S, 434Y, 435N, 436E, 436F, 436L, 436V, 436W, 437E, 437V, 438H, 및 438K로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 변형을 더 포함하고,
여기서 ^는 지정된 위치 뒤의 삽입(insertion)을 타나태고, #는 지정된 위치의 결실(deletion)을 나타내는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 250Q/252Y, 250Q/256E, 250Q/286D, 250Q/308F, 250Q/308Y, 250Q/311A, 250Q/311V, 250Q/380A, 250Q/428L, 250Q/428F, 250Q/434H, 250Q/434F, 250Q/434Y, 250Q/434A, 250Q/434M, 250Q/434S, 250E/252Y, 250E/256E, 250E/286D, 250E/308F, 250E/308Y, 250E/311A, 250E/311V, 250E/380A, 250E/428L, 250E/428F, 250E/434H, 250E/434F, 250E/434Y, 250E/434A, 250E/434M, 및 250E/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 252Y/250Q, 252Y/250E, 252Y/256E, 252Y/286D, 252Y/308F, 252Y/308Y, 252Y/311A, 252Y/311V, 252Y/380A, 252Y/428L, 252Y/428F, 252Y/434H, 252Y/434F, 252Y/434Y, 252Y/434A, 252Y/434M, 및 252Y/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 256E/250Q, 256E/250E, 256E/252Y, 256E/286D, 256E/308F, 256E/308Y, 256E/311A, 256E/311V, 256E/380A, 256E/428L, 256E/428F, 256E/434H, 256E/434F, 256E/434Y, 256E/434A, 256E/434M, 및 256E/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 286D/250Q, 286D/250E, 286D/252Y, 286D/256E, 286D/308F, 286D/308Y, 286D/311A, 286D/311V, 286D/380A, 286D/428L, 286D/428F, 286D/434H, 286D/434F, 286D/434Y, 286D/434A, 286D/434M, 및 286D/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 308F/250Q, 308F/250E, 308F/252Y, 308F/256E, 308F/286D, 308F/311A, 308F/311V, 308F/380A, 308F/428L, 308F/428F, 308F/434H, 308F/434F, 308F/434Y, 308F/434A, 308F/434M, 308F/434S, 308Y/250Q, 308Y/250E, 308Y/252Y, 308Y/256E, 308Y/286D, 308Y/311A, 308Y/311V, 308Y/380A, 308Y/428L, 308Y/428F, 308Y/434H, 308Y/434F, 308Y/434Y, 308Y/434A, 308Y/434M, 및 308Y/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 311A/250Q, 311A/250E, 311A/252Y, 311A/256E, 311A/286D, 311A/308F, 311A/308Y, 311A/380A, 311A/428L, 311A/428F, 311A/434H, 311A/434F, 311A/434Y, 311A/434A, 311A/434M, 311A/434S, 311V/250Q, 311V/250E, 311V/252Y, 311V/256E, 311V/286D, 311V/308F, 311V/308Y, 311V/380A, 311V/428L, 311V/428F, 311V/434H, 311V/434F, 311V/434Y, 311V/434A, 311V/434M, 및 311V/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 380A/250Q, 380A/250E, 380A/252Y, 380A/256E, 380A/286D, 380A/308F, 380A/308Y, 380A/311A, 380A/311V, 380A/428L, 380A/428F, 380A/434H, 380A/434F, 380A/434Y, 380A/434A, 380A/434M, 및 380A/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 428L/250Q, 428L/250E, 428L/252Y, 428L/256E, 428L/286D, 428L/308F, 428L/308Y, 428L/311A, 428L/311V, 428L/380A, 428L/434H, 428L/434F, 428L/434Y, 428L/434A, 428L/434M, 428L/434S, 428F/250Q, 428F/250E, 428F/252Y, 428F/256E, 428F/286D, 428F/308F, 428F/308Y, 428F/311A, 428F/311V, 428F/380A, 428F/434H, 428F/434F, 428F/434Y, 428F/434A, 428F/434M, 및 428F/434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 434H/250Q, 434H/250E, 434H/252Y, 434H/256E, 434H/286D, 434H/308F, 434H/308Y, 434H/311A, 434H/311V, 434H/380A, 434H/428L, 34H/428F434F/250Q, 434F/250E, 434F/252Y, 434F/256E, 434F/286D, 434F/308F, 434F/308Y, 434F/311A, 434F/311V, 434F/380A, 434F/428L, 434F/428F, 434Y/250Q, 434Y/250E, 434Y/252Y, 434Y/256E, 434Y/286D, 434Y/308F, 434Y/308Y, 434Y/311A, 434Y/311V, 434Y/380A, 434Y/428L, 434Y/428F, 434A/250Q, 434A/250E, 434A/252Y, 434A/256E, 434A/286D, 434A/308F, 434A/308Y, 434A/311A, 434A/311V, 434A/380A, 434A/428L, 434A/428F, 434M/250Q, 434M/250E, 434M/252Y, 434M/256E, 434M/286D, 434M/308F, 434M/308Y, 434M/311A, 434M/311V, 434M/380A, 434M/428L, 434M/428F434S/250Q, 434S/250E, 434S/252Y, 434S/256E, 434S/286D, 434S/308F, 434S/308Y, 434S/311A, 434S/311V, 434S/380A, 434S/428L, 및 434S/428F로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 319L, 307Q, 259I, 252Y, 259I/434S, 428L/434S, 308F/434S, 252Y/254T/256E/434S, 252Y/254T/256E/308F, 252Y/254T/256E/428L, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S, 308F/319L/434S, 259I/308F/428L, 259I/307Q/308F, 250I/259I/308F, 259I/308F/319L, 307Q/308F/309Y, 307Q/308F/319L, 및 250Q/308F/428L로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 250I, 250V, 252Q, 252Y, 254T, 256V, 259I, 307P, 307Q, 307S, 308F, 309N, 309Y, 311P, 319F, 319L, 428L, 및 434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 250V/308F, 250I/308F, 254T/308F, 256V/308F, 259I/308F, 307P/208F, 307Q/308F, 307S/308F, 308F/309Y, 308F/309Y, V308F/311P, 308F/319L, 308F/319F, 308F/428L, 252Q/308F, M252Y/S254T/T256E, 259I/434S, 428L/434S, 308F/434S, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S, 308F/319L/434S, 259I/308F/428L, 259I/307Q/308F, 250I/259I/308F, 259I/308F/319L, 307Q/308F/309Y, 307Q/308F/319L, 및 250Q/308F/428L로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항의 항체 또는 면역접합체의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 환자의 치료 방법.
제1항 또는 제2항의 항체 또는 면역접합체를 변형하는 것을 포함하는, 항체 또는 면역접합체의 반감기를 증가시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 259I를 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 319L을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 307S를 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 영역은 252Y, 254T, 256E, 259I, 307Q, 308F, 311V, 380A, 428L, 434A, 및 434S로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 포함하는 것인, 모 Fc 폴리펩티드의 항체 또는 면역접합체.