DK168954B1 - Imidazopyridazincarbamatderivater, forbindelserne til anvendelse som antitumormidler, anvendelse af forbindelserne til fremstilling af antitumormidler, farmaceutiske præparater indeholdende forbindelserne samt fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne - Google Patents

Description

DK 168954 Bl

Opfindelsen angår hidtil ukendte imidazopyrida-zincarbamatderivater, der har vist sig at have cytoto-xisk virkning. Opfindelsen angår endvidere sådanne forbindelser til anvendelse som antitumormidler, anvendel-5 se af forbindelserne til fremstilling af antitumormidler, farmaceutiske præparater indeholdende forbindelserne samt fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne.

Forskning indenfor cancerkemoterapiområdet har 10 tilvejebragt en række forskellige antitumormidler, der har forskellig grad af effektivitet. Klinisk anvendte standardmidler omfatter adriamycin, actinomycin D, me-thotrexat, 5-fluoruracil, cis-platin, vineristin og vinblastin. Disse, idag tilgængelige antitumormidler 15 vides imidlertid at have forskellige ulemper, såsom to-xicitet overfor raske celler og resistens i forbindelse med visse tumortyper.

Foruden at have antitumorvirkning er vineristin kendt som en inhibitor for mikrotubulusfunktion. Andre 20 forbindelser, der udviser mikrotubulusinhibitorisk virkning, og som er beskrevet som potentielle antitumormidler er nocodazol, tubulazol og NSC-181928; 25 OvOCV—

s o H

NOCODAZOL

3° II > NHC0£t I 1

TUBULAZOL

35 Cl Cl DK 168954 B1 2 H NHCOÆt 5 m rrt 10 NSC-181928 15 Ingen af disse forbindelser er imidlertid endnu godkendt klinisk.

Der er således et behov for nye og forbedrede antitumormidler.

Der har nu vist sig en hidtil ukendt klasse af 20 imidazopyridazinderivater, der udviser stærk antitumorvirkning .

I overensstemmelse hermed er forbindelserne ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at de har formlen (I) 25 f , \ N—CO? R* (I) R1-V — __// 30- hvori . R1 betegner phenyl, naphthyl, thienyl, furyl eller py-ridyl, der hver eventuelt er substitueret med 1-4 sub-35 stituenter udvalgt blandt C-j^g-alkyl, C1_4-alkoxy (der eventuelt er substitueret med C1_2-alkoxy eller DK 168954 B1 3 alkoxy-C1_2-alkoxy), halogen, amino, mono- eller di-C1_4-alkylamino og phenyl; eller R1 betegner C1_10-al-kyl, C2_10-alfceiiyl, C3_10-cycloalkyl eller C3_10-cyclo-alkenyl, der hver eventuelt er substitueret med halo-5 gen, C1_4-alkoxy, hydroxy eller C1_4-halogenalkyl; R2 betegner C-^Q-alkyl, C2_10-alkenyl, c2-io-alky-nyl, C3_1g-cycloalkyl eller C3_10-cycloalkenyl, der hver eventuelt er substitueret med halogen, 01-4-alkoxy, amino, mono- eller di-C1_4-alkylamino, eller 10 C1_4-halogenalkyl, eller R2 betegner phenyl, naphthyl eller morpholinoethyl, der hver eventuelt er substitueret med substituenter som defineret for de øvrige R2-grupper.

R3 betegner et hydrogenatom eller en C2_4-alkylgruppe, 15 og enten betegner X oxygen eller svovl, og Y betegner en -CH2- eller -CH2CH2-gruppe, eller X-Y betegner sammen gruppen 20 -CH=CH-; eller salte og fysiologisk funktionelle derivater der af.

Substituenter, der kan være tilstede på den car-bocycliske eller heterocycliske arylgruppe, omfatter 25 som nævnt C1_g-alkyl, C2_4-alkoxy (der selv eventuelt kan være substitueret med en C-L^-alkoxv eller C-]__2-alkoxy-, c1_2-alkoxygruppe), halogen (fx fluor, chlor eller brom), amino (eventuelt substitueret med 1 eller 2 C1_A-alkylgrupper), C-^-halogenalkyl (fx trifluor-30 methyl) og phenyl. Den carbocycliske eller heterocycliske arylgruppe kan som nævnt bære fra l til 4 substituenter.

Undtagen hvor andet er angivet, kan alkylgrup-perne R1 og R2, der er til stede i den almene formel 35 (I), være ligekædede eller forgrenede alkylgrupper, som kan indeholde 1-10 carbonatomer, fx 3-10 carbonatomer.

DK 168954 B1 4

En alkenyl- eller alkynylgruppe kan indeholde 2-10 carbonatomer, fx 3-10 carbonatomer. En cycloalkyl- eller cycloalkenylgruppe kan indeholde fra 3-10 carbonatomer. Substituenter der kan være til stede på en alkyl-, 5 alkenyl-, alkynyl-, cycloalkyl- eller cycloalkenylgruppe omfatter som nævnt halogenatomer, C-^_A-alkoxygrupper, hydroxy, amino (eventuelt substitueret med en eller to C1_4-alkylgrupper) og C1_4-halogenalkyl (fx trifluormethyl).

10 Når R1 betegner en alkylgruppe, indeholder denne fortrinsvis mere end to carbonatomer, fx C3_6-alkyl.

Når R2 betegner en alkylgruppe, indeholder denne fortrinsvis fra 1-6 carbonatomer, fx 1 til 4.

Når R3 betegner en C·^-alkylgruppe, kan denne 15 være ligekædet eller forgrenet.

Visse forbindelser med formlen (I) kan danne salte. Forbindelser med formlen (I), der indeholder en basisk aminogruppe, kan således danne salte med syrer, og forbindelser der indeholder en sur gruppe, kan danne 20 salte med baser.

Egnede syreadditionssalte omfatter saltene dannet ud fra salt-, hydrogenbromid-, salpeter-, per-chlor-, svovl-, citron-, vin-, phosphor-, mælke-, benzoe-, glutamin-, oxal-, asparagin-, pyrodrue-, eddi-25 ke-, rav-, fumar-, malein-, oxaloeddike-, isethion-, stearin-, phthal-, methansulfon-, p-toluensulfon-, benzensulfon-, lactobion- og glucuronsyre. Egnede basesalte omfatter uorganiske basesalte, såsom alkalimetalsalte (fx natrium og kaliumsalte) og jordalkalimetal-30'salte (fx calciumsalte), organiske baser, fx phenyl-ethylbenzylamin-, dibenzylethvlendiamin-, ethanolamin-og diethanolaminsalte, og aminosyresalte, fx lysin- og argininsalte. Saltene ifølge opfindelsen skal være farmaceutisk acceptable.

35 I forbindelse med den almene formel (I) betegner R1 som nævnt en eventuelt substitueret phenyl-, naph- DK 168954 B1 5 thyl-, thienyl-, furyl- eller pyridylgruppe. Foretrukne substituenter på R1-gruppen omfatter Cj^-alkoxy-, C^_^-alkyl-, og mono-eller-di-(C1_4)alkylaminogrupper og halogenatomer. R1 betegner endvidere foretrukket en 5 usubstitueret alkylgruppe, fx en C3_6-alkylgruppe.

R2 betegner fortrinsvis en phenylgruppe eller en eventuelt substitueret C1_4-alkylgruppe. Foretrukne substituenter på R2-gruppen omfatter C^^-halogenalkyl (fx trifluormethyl), C^-alkoxy, hydroxy, halogen, 10 mono-ellerdi-(C]__4) alkylamino og en N-vedhæftet mor-pholinogruppe. R2 er hensigtsmæssigt en C1_4-alkylgrup- pe.

R3 er fortrinsvis hydrogen eller methyl.

Y betegner fortrinsvis -CH2-· Gruppen -Y-X- be-15 tegner fortrinsvis -CH20-, -CH2S-, -CH2CH2- eller -CH=CH-.

En særligt foretrukket gruppe af forbindelser med formlen (I) er de forbindelser, hvori S1 betegner en phenyl- eller naphthylgruppe, der kan være substi-20 tueret med 1-4 substituenter valgt blandt C-]__4-alkoxy (fx methoxy eller ethoxy), C-^-alkyl (fx methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl eller t-butyl), og halogen (fx brom eller chlor), R2 betegner en C-j^-alkylgruppe (fortrinsvis methyl 25 eller ethyl), R3 betegner hydrogen eller methyl, og Y-X beregner gruppen -CH20-, og salte og fysiologisk funktionelle derivater deraf.

Særligt foretrukne forbindelser ifølge den fore-30- liggende opfindelse omfatter på basis af deres aktivitet: 35 6 DK 168954 B1 mechyl-ϋ*[6-(3,4,5- crimechoxybenzyloxy)imidazo[1,2 -b ] pyridazin-2-yl] carbamac, t methyl- fi-[6-(3,5-dimechoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]carbaraaty 5 methyl ϋ*[6-(2,5-dimechoxybenzyloxy)imidazo[ 1,2-b ]pyridazin-2-yl]carbamat, mechyl-ϋ- [6·(1-naphchylmechyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]carbamat, mechyl-ϋ*[6-(3-mechylbenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]carbamat, 10 mechyl-ϋ- [6-(2,3-dimethoxybenzyloxy) imidazo [ 1,2-b ]pyridazin-2-yl] carbamatj methyl-{I-[6-(2,5-dimechylbenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]carbamatj

15 ethyl-ϋ-[6-(2,5-dimethoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b[pyridazin-2-yl]carbamatA

ethyl- ϋ- [6* (3,4,5-trimechoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl] carbamac, methyl-^oethyl -J3-[6*(3,4,5 - trimethoxybenzyloxy) imidazo [1,2 -bjpyridazin-2-20 yl] carbamat, methyl-ϋ*[6 * (2-brom— 3,4,5-crimechoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl] carbamat, - n-propyl N-[6-(3,4,5-crimechoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl] 2 5 carbamac, 30 n-butyl N-[6*(3.^.5-trimethoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl] carbamac, 3q.· 2-methoxyechvl-S- [6 - (3,4.5-trimethoxybenzyloxy)imidazo(1,2-b]pyridazin-2- y 1 ] carbamac, mechyi-N-[6-(3,5-dimethoxy-4-echoxybenzyioxy)imidazoil,2-bipyridazin-2-ylj carbamac, 35 DK 168954 B1 7 og fysiologisk funktionelle derivater deraf.

Forbindelserne ifølge opfindelsen har cytotoxisk virkning, dvs. de er toxiske over for visse levende 5 celler, der er skadelige for pattedyr, fx tumorceller.

Antitumorvirkningen af forbindelser med den almene formel (I) er vist i et antal standardtests, både in vitro og in vivo, primært ved aktivitet over for murine leukæmicellelinier, fx P388.

10 Forbindelserne med den almene formel (I) har så ledes vist sig at udvise stærk antitumorvirkning mod P388 in vitro ved proliferationsassays og ved de mere stringente kolonidannelsesassays. In vivo fremkaldte forbindelserne ifølge opfindelsen en reduktion af an-15 tallet af tumorceller i mus med ascites P388/0-leukæmi-tumorer og en deraf følgende forlængelse af overlevelsestiden sammenlignet med en ubehandlet kontrolgruppe med tumorer.

Aktiviteten ved de ovennævnte in vivo standard 20 tumortest er beskrevet som værende tegn på antitumorvirkningen i mennesker (A. Goldin et al, i Methods in Cancer Research red. V.T. DeVita Jr. og H. Busch, 16 198-199, Academic Press N.Y. 1979).

Forbindelser ifølge opfindelsen har også vist 25 sig at interferere med tubulinfunktionen, som vist ved inhibering af tubulinpolymerisation in vitro.

Det er tidligere beskrevet, at forbindelser, der virker som mikrotubulusinhibitorer synes at blokere den retningsbestemte migrering af tumorceller. Det for-30’modes derfor, at forbindelserne ifølge opfindelsen vil have antiinvasions- og antimetastaseegenskaber.

Foruden de ovennævnte egenskaber har adskillige foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen vist sig at udvise virkning mod en række forskellige humane tumor-35 cellelinier in vitro (DLD-1 human coloncarcinoma,

WiDr human colonadenocarcinoma, HCT-116 human colon- 8 DK 168954 B1 carcinoma og A549 human lungecarcinoma), hvilket viser, at forbindelserne har bredspektret antitumorvirkning.

En særlig foretrukket forbindelse på basis af dens aktivitet er methyl-N-[6-(3,4,5-trimethoxybenzyl-5 oxy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]carbamat, og fysiologisk funktionelle derivater deraf. Denne forbindelse har desuden vist sig at have god virkning mod forskellige murine tumorer in vivo (Bl6 melanoma og L1210 leukaemia). Desuden har den også fordelagtigt vist sig at 10 udvise god aktivitet in vivo mod stammer af P388, der er resistente for hovedparten af de klinisk anvendte antitumormidler herunder cyclophosphamid, methotrexat, actinomycin D, vineristin, adriamycin, 5-fluoruracil, cis-platin, bis-chlornitrosourinstof og amsacrin.

15 Det formodes, at adriamycin-, vineristin- og actino-mycin-D-resistente tumorer faktisk er resistente mod et bredt udvalg af antitumormedikamenter.

Uden ønske om at være bundet teoretisk, formodes det, at visse forbindelser ifølge opfindelsen virker 20 som promedikamenter. Forbindelserne med formlen (I), hvori R3 er en alkylgruppe har således større virkning in vivo, end det skulle forventes på basis af deres in vitro-virkning, og det formodes, at de in vivo omdannes til en forbindelse med formlen (I), hvori R1 er hydro-25 gen.

Opfindelsen· angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med den almene formel (I), der er ejendommelig ved det i krav 10's kendetegnede del angivne, nemlig: 30: (A) omsætning af et pyridazinderivat med den almene formel (II) 35 DK 168954 B1 9 £_γ_χ-/ \-.NH, (II) 5 (hvori R1 og X og Y er som tidligere defineret) med en forbindelse med den almene formel (III): 10 R3 zch2conco2r2 (III) 15 (hvori R2 og R3 er som defineret tidligere, og z betegner et halogenatom, fx et chlor- eller bromatom), (B) omsætning af et pyridazinderivat med den almene formel (IV) ^ 3

20 N R

i \ NCOj R2 (IV) 25 (hvori R2 og R3 er som defineret tidligere, og z^ betegner en afgående gruppe, såsom et halogenatom eller en suifonatgruppe, fx methansulfonat eller p-toluen-sulfonat) med en foroindelse med den almene formel (V) 3 0- RiCH2X1H (V) (hvori R1 er som tidligere defineret, og X1 betegner et oxygen- eller svovlatom eller en gruppe NR4 som defineret tidligere), 35 (C) omsætning af en forbindelse med formlen (VI) 5 10 DK 168954 B1 al_Y_x_r I ./ ^ <VI> med en passende alkohol R2OH (i hvilke formler R1, R2, X og Y er som tidligere defineret), (D) omsætning af en forbindelse med formlen (VII) 10 1 )>-^ »— *- *—L N // 15 (VII) med et reagens, hvis funktion er at indføre gruppen -C0oR2 (i hvilke formler R1, R2, X og Y er som tidlige-re defineret), eller 20 (E) omdannelse af en forbindelse med formlen (I) til en anden forbindelse med formlen (I) , fx ved udskiftning af en esterificeringsgruppe R2 med en anden este-rificeringsgruppe R2 eller ved alkylering af en forbindelse med formlen (I), hvori R3 betegner hydrogen, 25 om ønsket og/eiler hensigtsmæssigt efterfulgt af saltdannelse.

Den almene fremgangsmåde (A) kan hensigtsmæssigt udføres i et aprotisk opløsningsmiddel, såsom dimethvl-formamid, 1,3-dimethylimidazolidinon eller hexamethyl- 30 phosphoramid, ved en ikke-ekstrem temperatur, fx mellem 50 og 120°C.

Forbindelser med den almene formel (II), hvori X betegner oxygen eller svovl, kan fremstilles ved omsætning af en passende alkohol eller thiol med formlen 35 (V) som defineret ovenfor, med en forbindelse med formlen (VIII): DK 168954 B1 11 S1 _tf XS-* NH* (VIII) (hvori Z1 er som defineret i det foregående).

Omsætningen vil hensigtsmæssigt blive udført i 10 tilstedeværelse af en base, såsom kalium-t-butoxid i et opløsningsmiddel, såsom dimethoxyethan. Alternative baser og opløsningsmiddel, der kan anvendes til denne reaktion, omfatter natriumhydrid i et aprotisk opløsningsmiddel, såsom dimethylformamid eller dimethylsul-15 foxid, og natriummethoxid eller -ethoxid i en alkohol, såsom methanol eller ethanol, eller et aprotisk opløsningsmiddel, som dem der er nævnt ovenfor.

Forbindelser med formlen (II), hvori X og ϊ sammen betegner gruppen -CH=CH-, kan fremstilles ud fra en 20 forbindelse med formlen (IX) ved successiv omsætning med et halogeneringsmiddel, såsom phosphortrichlorid, og ammoniak.

Λ rY

s'-ch=ch—r-citCH—5 “CH=ai (IX) (IXA) (IIA) 3 0·’ (R1 er som ovenfor definereti

Forbindelser med formlen (IX) kan fremstilles ved omsætning af et passende arylaldehvd, R1CHO, med 3-oxo-pentansvre (laevulinsyre) i tilstedeværelse af en base 35 i vandig alkohol efterfulgt af omsætning med hydrazin under sure betingelser til opnåelse af en forbindelse med formlen (X): DK 168954 B1 12 ΓΎ“ (R1 er som ovenfor defineret) der kan dehydrogeneres, fx ved anvendelse af selendio-xid i en alkohol, fx ethanol til opnåelse af en forbin-10 delse med formlen (IX).

Når det ønskes at fremstille en forbindelse med formlen (II), hvori X og Y begge er methylengrupper, kan ethenyldelen i forbindelsen med formlen (IX) eller (X) først reduceres, fx ved katalytisk hydrogenering, 15 fx under anvendelse af palladium på trækul.

Forbindelser med formlen (III) kan fremstilles ved omsætning af det tilsvarende halogenacetamid med formlen (XI): 20 R3 ZCH2CONH (XI) R3 og Z er som defineret ved formel (III)).

25 med oxaiylchlorid og en alkohol, R2OH (hvor R3 er som ovenfor defineret) efter fremgangsmåder der er velkendte inden for teknikken.

Alkoholer med den almene formel (V) kan fremstilles ud fra de tilsvarende carboxylsyrer eller car-30· boxaldehvder under anvendelse af standardmetoder, fx ved reduktion med natriumborhvdrid i et opløsningsmiddel, såsom methanol eller ethanol, eller med lithiumalu-miniumhydrid i et opløsningsmiddel, såsom diethylether eller tetrahydrofuran.

35 En thiol med den almene formel (V) kan fremsril les ud fra det tilsvarende halogenid R1 CH2Z3 (hvor Z3 DK 168954 B1 13 er et halogenatom og R1 er som ovenfor defineret) ved omsætning med thiourinstof i et opløsningsmiddel, såsom ethanol, til opnåelse af det tilsvarende isothiouroni-umsalt og efterfølgende hydrolyse, fx med natriumhydro-5 xidopløsning.

Omsætning af en forbindelse med den almene formel (IV) med en forbindelse med den almene formel (V) ifølge fremgangsmåden (B) vil i almindelighed blive udført i tilstedeværelse af en base. Egende baser omfatter al-10 kalimetalalkoxider, såsom natrium- eller kaliummetho-xid, -ethoxid eller -t-butoxid. Omsætnigen kan hensigtsmæssigt udføres i et opløsningsmiddel, såsom di-methoxyethan, en alkohol, fx methanol eller ethanol, eller et aprotisk opløsningsmiddel, såsom dimethylfor-15 mamid eller dimethylsulfoxid.

Forbindelser med den almene formel (IV) kan fremstilles ved omsætning af en forbindelse med formlen (VII) med en forbindelse med formlen (III) på analog måde med den almene fremgangsmåde (A) beskrevet ovenfor.

20 Den almene fremgangsmåde (C) kan udføres ved op varmning af en forbindelse med formlen (VI) til en temperatur i området 80-150°C, eventuelt i tilstedeværelse af et opløsningsmiddel, og omsætning med en alkohol, R^OH (hvor R2 er som ovenfor defineret).

25 Egnede opløsningsmidler omfatter indifferente, organiske opløsningsmidler, såsom carbonhydrider, fx benzen eller toluen. Alternativt kan alkoholen, R20H, selv virke som opløsningsmidlet.

Det formodes, at fremgangsmåden (C) forløber via 30· et mellemprodukt, der er et isocyanatderivat med formlen (XII) DK 168954 B1 14 \- N = C = O (XII)

5 R1-Y x-1^ N

(hvori R1, X og Y er som ovenfor defineret).

Acyl-azidderivater med formlen (VI) kan fremstilles ud fra de tilsvarende carboxylsyrer ved dannel-10 se af et aktiveret syrederivat (fx et syrehalogenid, såsom et syrechlorid dannet ved omsætning med et halogener ingsmiddel, såsom oxalylchlorid, thionylchlorid eller phosphorpentachlorid) efterfulgt af omsætningen med et azid, fx et alkalimetalazid, hensigtsmæssigt i 15 vandig etheropløsning, fx vandig dioxan.

Carboxylsyrederivaterne svarende til forbindelserne med formlen (VI) kan selv fremstilles ved omsætning af en forbindelse med formlen (II) med ethylbrompvruvat under anvendelse af analoge betingelser til den almene frem-20 gangsmåde (A) ovenfor til opnåelse af en ester, efterfulgt af hydrolyse til opnåelse af den ønskede syre.

Ved fremgangsmåde (D) kan reagenset, hvis funktion er af indføre gruppen -C02R2, være det tilsvarende halogenformiat, fx alkylhalogenformiat, såsom methyl-25 eller ethylchlorformiat. Forbindelser med formlen (Vil) kan selv fremsrilles ud fra en forbindelse med formlen (I) ved fjernelse af en gruppe -C02R2 (fortrinsvis en labil gruppe, såsom t-butoxvcarbonyl) under sure betingelser (fx under anvendelse af en eventuelt halogeneret 30' carboxylsyre, såsom myre-, chlormyre- eller trifluor-eddikesyre), eventuelt i tilstedeværelse af et opløsningsmiddel, fx et halogeneret carbonhydrid, såsom dichlormethan. Ved en særlig udførelsesform af fremgangsmåden (D) kan en forbindelse med formlen (I) såle-35 des omdannes til en anden forbindelse med formlen (I) ved fjernelse af en -C00R2-gruppe og omsætning til indføring af en anden -CO^R2-gruppe som beskrevet ovenfor.

DK 168954 Bl 15

Omdannelse af en forbindelse med formlen (I) til en anden forbindelse med formlen (I) ifølge den almene fremgangsmåde (E) kan fx opnås ved udskiftning af en esterificeringsgruppe R2 i forbindelse med formlen (I) 5 med en anden gruppe R2 ved opvarmning af en forbindelse med formlen (I) med en passende alkohol i tilstedeværelse af en base, fx et alkalimetaloxid, såsom kalium-t-butoxid, ved en temperatur i området fra 50-180°C.

Skønt sådan omesterificering kan udføres som et separat 10 reaktionstrin, kan den også hensigtsmæssigt udføres under reaktionen mellem en forbindelse med formlen (VI) og en forbindelse med formlen (V) ifølge den almene fremgangsmåde (B).

Indbyrdes omdannelser ifølge fremgangsmåde (E) 15 kan også opnås ved alkylering af en forbindelse, hvori R3 er et hydrogenatom til opnåelse af en forbindelse, hvori R3 er en alkvlgruppe. Alkylering kan opnås på sædvanlig måde, fx ved anvendelse af et alkylhalogenid, fx methyl- eller ethyliodid, i tilstedeværelse af en 20 base, fx natriumhvdrid.

Opfindelsen angår endvidere hidtil ukendte mellemprodukter, der er ejendommelige ved det i krav 11's kendetegnende del angivne. Foretrukne mellemprodukter er mellemprodukterne med formlerne (II), (IV) og (VI).

25 Forbindelserne ifølge opfindelsen er nyttige til behandling af tumorer. De kan anvendes til behandling af forskellige former for cancer, herunder leukæmi, lymphoma- og sarcoma sygdomme og faste tumorer.

Der tilvejebringes således en fremgangsmåde til 30' behandling af tumorer i dyr eller mennesker, især i mennesker, hvilken fremgangsmåde omfatter administrering af en klinisk nyttig mængde af en forbindelse med formlen (I) eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller fysiologisk funktionelt derivat deraf på en farma-35 ceutisk anvendelig form, en eller flere gange dagligt eller efter et vilkårligt andet egnet skema, oralt, rektalt, parenteralt eller topisk.

DK 168954 B1 16

Desuden tilvejebringes ifølge opfindelsen, som angivet i henholdsis krav 8 og 9, forbindelserne ifølge opfindelsen til anvendelse som antitumormidler og anvendelse af forbindelserne ifølge opfindelsen til frem-5 stilling af lægemidler til behandling af tumorer.

Den mængde af forbindelsen med formlen (I), der er nødvendig til opnåelse af effektivitet som cytoto-xisk middel, vil selvfølgelig variere og er i den sidste ende den praktiserende læges eller dyrlæges skøn.

10 Paktorer, der skal tages i betragtning, omfatter den sygdom, der behandles, formuleringens administreringsvej og art, mammaliets legems- eller kropsvægt, overfladeareal, alder og almentilstand, og den særlige forbindelse, der skal administreres. En passende, effektiv 15 antitumordosis er i området fra ca. 0,01 til ca. 120 mg/kg legems- eller kropsvægt, f.eks. fra ca. 0,1 til ca. 120 mg/kg legems- eller kropsvægt, fortrinsvis i området fra ca. 0,1 til 50 mg/kg, fx 0,5-5 mg/kg. Den totale, daglige dosis kan gives som en enkeltdosis, 20 flere doser, fx 2 til 6 gange dagligt, eller ved intravenøs infusion i et valgt tidsrum. Til et pattedyr på 75 kg vil dosisområdet fx være fra ca. 8 til ca. 9.000 mg pr. dag, og en typisk dosis kan være ca. 50 mg pr. dag. Hvis diskrete, multiple doser indiceres, kan be-25 handling typisk bestå af 15 mg af en forbindelse med formlen (I) givet indtil 4 gange dagligt.

Skønt det er muligt at administrere den aktive forbindelse alene, foretrækkes det at præsentere den aktive forbindelse i et farmaceutisk præparat. Præpa-30· rater ifølge opfindelsen til medicinsk anvendelse er ejendommelige ved det i krav 7's kendetegnende del angivne og omfatter således en forbindelse med formlen (I) eller et salt deraf sammen med en eller flere farmaceutisk acceptable bærere og eventuelt andre terapeu-35 tiske bestanddele. Bærerne skal være farmaceutisk acceptable i den betydning, at de skal være kompatible DK 168954 B1 17 med præparatets øvrige bestanddele og ikke skadelige for recipienten derfor.

Præparater ifølge opfindelsen omfatter præparater der er egnede til oral, topisk, rectal eller paren-5 teral (herunder subcutan, intramuskulær og intravenøs) administrering. Foretrukne præparater er præparater egnet til oral eller parenteral administrering.

Præparaterne kan hensigtsmæssigt præsenteres i enhedsdosisform, og de kan fremstilles ved en vilkårlig 10 af de velkendte fremgangsmåder inden for farmacien.

Alle fremgangsmåder omfatter at den aktive forbindelse blandes med en flydende bærer eller en findelt, fast bærer eller begge, hvorefter produktet om nødvendigt formgives til ønskede præparater.

15 Præparaterne ifølge opfindelsen, der er egnede til oral administrering, kan præcenteres som diskrete enheder, såsom kapsler, cachetter, tabletter eller pastiller, der hver indeholder en forudbestemt mængde af den aktive forbindelse; som et pulver eller granulat, 20 eller en opløsning eller suspension i en vandig eller ikke-vandig væske, såsom en sirup, en eleksir, en emulsion eller en drik.

En tablet kan fremstilles ved presning eller støbning, eventuelt med en eller flere hjælpebestandde-25 le. Pressede tabletter kan fremstilles ved presning af den aktive forbindelse i en fritflydende form, såsom et pulver eller granulat, eventuelt blandet med et bindemiddel, smøremiddel, indifferent fortyndingsmiddel, overfladeaktivt middel eller dispersionsmiddel, i en 30 egnet maskine. Støbte tabletter kan fremstilles ved støbning af en blanding af den pulveriserede, aktive forbindelse med vilkårlige, egnede bærere i en passende maskine.

En sirup kan fremstilles ved tilsætning af den 35 aktive forbindelse til en koncentreret, vandig opløsning af sukker, fx sucrose, til hvilken der også kan DK 168954 B1

IS

sættes vilkårlige additiver. Sådanne additiver kan omfatte aromastoffer, et middel til forsinkelse af krystallisation af sukkeret, eller et middel til forøgelse af opløseligheden af vilkårlige andre bestanddele, så-5 som en polyvalent alkohol, fx glycerol eller sorbitol.

Formuleringer til rectal administrering kan præsenteres som et suppositorium med en sædvanlig bærer, såsom kakaosmør.

Formuleringer egnet til parenteral administre-10 ring, omfatter hensigtsmæssigt et sterilt vandigt præparat af den aktive forbindelse, hvilket fortrinsvis er isotonisk med recipientens blod. Sådanne formuleringer omfatter hensigtsmæssigt en opløsning af et farmaceutisk og farmakologisk acceptabelt syreadditionssalt af 15 forbindelsen med formlen (I), og der isotonisk med recipientens blod.

Nyttige formuleringer omfatter også koncentrerede opløsninger eller faststoffer indeholdende forbindelsen med formlen (I), hvilke formuleringer efter for-20 tynding med et passende opløsningsmiddel giver en opløsning til parenteral administrering som beskrevet ovenfor.

Foruden de ovennævnte bestanddele kan formuleringerne ifølge opfindelsen desuden indeholde et eller 25 flere additiver valgt blandt fortyndingsmidler, puffere, aromatiseringsmidler, bindemidler, overfladeaktive midler, fortykkelsesmidler, smøremidler, konserveringsmidler (herunder antioxidanter) og lignende.

Et yderligere aspekt af den foreliggende opfin-30' delse angår anvendelsen af en forbindelse med formlen (I) eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller fysiologisk funktionelt derivat deraf til fremstilling af et lægemiddel til behandling af tumorer.

Opfindelsen vil nu blive belyst nærmere ved 35 hjælp af de følgende eksempler.

DK 168954 B1 19

Alle temperaturer er givet i grader (°C). Protonkernemagnetiske resonansspektre blev optaget på et Bruker AH200 FT NMR- eller Bruker HFX90 FT NMR-apparat .

5 De følgende forkortelser anvendes i eksemplerne: DME - dimethoxythan DMEU - 1,3-dimethyl-2-imidazolidon LAH - 1 i thium- aluminumum- hy d r id 10 Fremstilling af mellemprodukter

Mellemprodukt 1 3-Amino-6-(3,4,5-trimethoxybenzvloxv)pyridazin 3,4,5-Trimethoxybenzylalkohol (Aldrich 19,82 g, 0,1 mol), opløst i 20 ml DME sattes i løbet af 15 mi-15 nutter til en suspension af kalium-t-butoxid (11,82 g, 0,1 mol) i DME (80 ml) under omrøring under N2 og afkøling i isbad. Efter 0,5 timer behandledes blandingen med 12,95 g (0,1 mol) 3-amino-6-chlorpyridazin (Helv.

Chim. Acta. 1954, 37.' 121, J· Druev, Kd. Meier og K.

2 0 Eichenberger) og opvarmedes efter 1,5 time under tilbagesvaling i 3 timer. 3landingen afkøledes og filtreredes, og det frafiltrerede faststof vaskedes med ether. Filtratet inddampedes i vakuum til opnåelse af en olie, der blev fordelt mellem ethvlacetat og vand. Den orga-25 niske fase vaskedes med vand, tørredes (Na?so4) og inddampedes til opnåelse af en olie (A), der chromatogra-feredes på silicagel under eluering med 5% methanol-chloroform. Eluerede fraktioner kombineredes til opnåelse af en olie (B), der tritureredes med chloroform 30 og di-isopropylether til opnåelse af titelforbindelsen som et et off-white fast stof (9,44 g), smp. 142-4°.

DK 168954 B1 20

Nmr. 5H (CDC1,) 6.87 (IH, J4D8.8Hz i AB

5-H), 6.78 (IH, . 8Hz, 4-H), 6.72 (2H, s, PhH), 5.38 (2H, s. CHj), 4.45 (2H, br. s, NH2) 3.87 (6H,s,OMe) og 3.84(3H,s,OMe).

5

Mellemprodukt 2 3-Amino-6-(2,5-dimethoxvbenzyloxv)pyridazin 30,6 g, (0,182 mol) 2,5-Dimethoxvbenzylalkohol i 20 ml DME sattes til 20,38 g (0,182 mol) kalium-t-10 butoxid i 60 ml DME under omrøring, under N2 og afkøling i isbad. Efter 0,5 timer behandledes blandingen med 3-amino-6-chloropyridazin, og efter halvanden time opvarmedes den under tilbagesvaling i 5 timer, hvorefter den afkøledes og filtreredes. Filtratet inddampedes i va-15 kuum og og fordeltes mellem ethylacetat og vand. Den organiske fase vaskedes med vand, tørredes (Na2SOA) og inddampedes til opnåelse af et fast stof (A), der omkrystalliseredes af toluen til opnåelse af et fast stof (B). Dette chromatograferedes på silicagel under elue-20 ring med 5% methanol/chloroform til opnåelse af titelforbindelsen som et hvidt fast stof (27 g), smp. - 94-94.50, Nmr 5H(CDC13) 7.05 (lH.m, PhH), 6.90-6.73 (4H.rn.ArH), 5.42 (2H.S.CH,), 4.5 (2H,brs, NHj) og 3.78 og 3.75 (6H.s,0Me).

25

Mellemprodukt 3 til 12

De følgende forbindelser fremstilledes ud fra de rette alkoholer ved den almene fremgangsmåde beskrevet for mellemprodukterne 1 og 2: DK 168954 B1 21 (3) 3-Amtno-6-(l-naphthylmethyloxy)pyridazin, smp. 143-144°,Nmr 6^

(d,-DMSO) 8.00 (3H,m,napch H), 7.55 (4H,m,napch H>, 6.97 (IH, J „ b AB

8.8Hz 4-H), 6.89 (IH, J._ 8.8Hz 5-H), 6,0. (2H,s,CH.) og 5.80

Ao c (2H,s,NH2).

5 (Ud fra 1-naphthylmethanol, Aldrich) (4) 3-Amino-6-(S-methoxybenzyloxylpyridazin/ smp. 55-60°, Nmr 6^ (dg-DHSO) 7.38 (lH.dd, J8-4Hz,PhH), 7.13-6.89 (5H,m,ArH), 6.05 (2H,s,NHj), 5.35 (2H,s,CH2) og 3.82 (3H,s,OMe).

10 (5) 3-Amino-6-(3,5-dimechoxybenzyloxy)pyridazin, smP· 89-92°,Nmr S„

H

(d,-DMSO) 6.88 (IH, J._ 8.8Hz,5-H), 6.75 (IH, J>n 8.8Hz, 4-H), 6.62 o Ad Ad (2H,d, 2'-H og 6'-H), 6.42 (1H,C,4'-H), 5.35 (2H,s,CH2), 4.53 (2H,br.s, NH2) og 3.75 (6H,s,0Me).

15 (6) 3-Amino-6-(3-Methylbenzyloxy)pyridazin/ Nmr <5^ (dg-DMSO) 7.40-7.10 (4H,m,PhH), 6.90 (2H, J,e 8.8Hz, 4-H and 5-H), 5.91 (2H,br.s,NH.), 5.17 (2H,s,CH2) cg 2.31 (3H,s,Me); M/Z 215 (M , 30%), 198 (9), 123 (23). 111(31) og 105(100).

20 ( 7 ) 3-Amino-6-(3-dimethylaminobenzyloxy)pyridazin ,Jm.p. 127-129°, Nmr (d6-DMS0) 7.25 (IH, t,5' -H), 7.00 (IH, 1^8.8Hz, 4-H), 6.92 (IH.

8.8Hz, 5-H), 6.90-6.70 (3H,m, 2’-,4'- 0g 6'-H), 5.95 (2H,s,CH2), 5.30 (2H,br.s,NH2) og 2.98 (6H,s,NMe2).

pg (Ud fra 3-dimetnvlanunooenzyialkonoi. fremstillet \.ed LAH-reauKtion af 3-dimethyiaminoDenzoesyre, Aldricn- (8) 3 - Amino-6- (2-menhoxybenzyloxy)pyridazine, 5m.p. 166-168°, Nmr 5^ (CDC13) 7.8 (lH.dd, J6.7 og 2.2Hz, PhH), 7.30 (lH.dd, J6.6 og 2 2Hz,PhH), 6.98 (lH.de, J6.6Hz,PhH), 6.92 (lH,d,J6.6Hz, PhH), 6.90 (lH.J^ 8.8Hz,5-H), 6.78 (IH, 8.8Hz, 4-H), 5.5 (2H,s,CH2), 4.42 (2H.br.s,NHj) og 3.87 (3H,s,OMe).

DK 168954 B1 22 ( 9 ) 3-Amino-6 - [3,5-dimenhoxy(4-methoxyechoxymechoxy)benzyloxy]pyridazin , 5m.p. 110-114°, Nmr, SR (CDC13) 6.88 (IH, 8.8Hz, 5-H), 6.78 (IH, J „ 8.8Hz, 4-H), 6.7 (2H.5.2'- °9 6'-H), 5.35 (2H.S.CH,), 5.2 AB * (2H,s,CH2), 4.49 (2H,br.s,HH2), 4.05 (2H,m,CH2) 3,85 (6H,s,0Me), 3.61-3.51 (2H,m,CH.) og 3.35 (3H,s,0Me).

5 ^ (10) 3-Amino-6-(3-chlor benzyloxy)pyridazin , Nmr 6^ (dg-DMSO) 7.51-7.32 (4H,m,PhH), 6.91 (2H, 8.8Hz, 4H og 5-H), 5.92 (2H,br.s,NH2) og 5.34 (2H,s,CH2); M/Z 235 (M+, 68%), 218(10), 125 (65) og 97-(100).

10 (11) 3-Amino-6-(2-thienylmethyloxy)pyridazin , 5 a.p. 101-103°, Nmr S„

H

(d6-DHS0), 7.52 (lH,d,5'-H), 7.20 (lH,d,3'-H), 7.02 (lH,dd,4'-H), 6.94 og 6.85 (2H, 8.8Hz. 4-H og 5-H), 5.95 (2H,s,CH2) og 5.50 (2H,3,NH2).

15 (12) 3-Amino-6-(3,4,5-trimethoxybenzylthio)pyridazin fremstilledes efter fremgangsmåden beskrevet for mellemprodukterne 1 og 2 under anvendelse af 3,4,5-trime-thoxybenzylthiol og 3-amino-6-chlor-pyridazin til op-20 nåelse af produktet, smp. 143-146°, Nmr 5 (CDCl3) 7,07 og 6,63 (2H, JAB 3,8 Hz, 4-H og 5-H), 6,66 (2H,s,PhH) 4,63 (2H,br.s,NH2), 4,44 (2H,s,CH2), 3,85 (6H,s,0Me) og 3,84 (3H,s,OMe).

25

Mellemprodukt 13 2-Methoxvethyl-N-chloracetylcarbamat.

Fremgangsmåden beskrevet af R.J. Bochis et.al, J.Med.Chem 1978, 21, 235 fulgtes til opnåelse af titel-30 forbindelsen. Smp. 97-99°, Nmr δΗ (dg-DMSO) 11,07 (lH.br.s,NH), 4.56 (2h,s,ClCH,), 4.28 (2H.m, C0.0CH2), 3.62 (2H,m,CH2OHe) oq 3.34 (3H,s.He).

35 De følgende mellemprodukter med formlen (III) er kendte fra de angivne litteraturreferencer: DK 168954 Bl 23 z-ch2conhco2R2

Mellemprodukt Z R2 Litteraturret.

Nr.

14 Cl CH3 a 5 15 Br t-butyl b 16 Cl -CH2CH3 c 17 Cl -CH2CH2CH3 c 18 Cl -(CH2)3CH3 c 19 Cl -isopropyl d 10 (a) R.J. Bochis et.al J. Med.Chem. 1978, 21 235.

(b) N.J. Leonard og K.A. Cruikshank - J.Org.Chem, 1985, 50 2480 (c) M. Pianka og D.J. Pelton J.Chem.Soc. 1960,983.

15 (d) G.I. Derkach og V.P. Belaya, Zh. Obsch. Khim, 1966, 36, 1942.

Mellemprodukterne 20-32

De følgende mellemprodukter fremstilledes ved de 20 almene fremgangsmåder beskrevet for mellemprodukterne (1) og (2) under anvendelse af de rette alkoholer som udgangsmaterialer.

Mellemprodukt 20 25 3-Amino-6-(2,S-dimerhoxvbenzvloxy)pvridazin

Ud fra 2,3-dimethoxybenzylalkohol (Aldrich) til opnåelse af titelforbindelsen smp.

103-106°, NMR SH(CDC13) 7.12-7.05(2H,m,5' 0g 6*H); 6.91(lH,m,4'H), til 6,85(1H,J d9Hz,5H) , S^UH.J.^Hz^H); 5.50(2H,s,ArCH,); 4.50(2H,brs, "3 g ' AB Ab c NH2) 3.89(6H,s,OCH3).

24 DK 168954 B1

Mellemprodukt 21 3-Amino-6-(3,5-dimethoxy-4-ethoxybenzyloxy)pyridazin

Ud fra 3,5-dimethoxy-4-ethoxybenzylakohol til opnåelse af titelforbindelsen smp.

5 169-171°, NMR 6H(CDCl,)6.89(lH,J,_8.8Hz,5H); 6.79(lH,J4_8.8Hz.4H);

i AD AD

6.70(2H,s,ArH); 5.38(2Η:£,ΑγΟΗ,); 4.48(2H,brs,NH2); 4.06(2H,q,J7Hz, CHjCHj); 3.88(6H,s,OCH3) og 1.38(3H,t,J7Hz,CH2Cii3).

3,5-Dimethoxy-4-ethoxybenzylalkohol fremstilledes som følger: 10 a) 3,5-Dimethoxy-4-ethoxybenzaldehyd

En blanding af 50 g (0,275 mol) syringaaldehyd, 85,8 g (0,55 mol) ethyliodid og 151,7 g (1,09 mol) ka-liumcarbonat i 60 ml DMF omrørtes og opvarmedes ved 60-15 70° i 6 timer. Blandingen afkøledes og inddampedes i vakuum og behandledes dernæst med vand og ekstraheredes med diethylether. Ekstrakterne tørredes (Na2S04) og inddampedes til opnåelse af 59 g af titelforbindelsen som et hvidt fast stof, som var rent ved tic og anvend-20 tes uden yderligere rensning.

b) 3,5-Dimethoxv-4-ethoxvbenzvlalkohol

Produkter af den foregående reaktion (59 g, 0,28 mol) opløstes i methanol-ethanol (600 ml, 1:1) og be-25 handledes med 10,8 g (0,285 mol) natrium borhvdrid portionsvist i løber af en time. Blandingen omrørtes i 24 timer ved stuetemperatur og behandledes dernæst langsomt med 50 ml vand til dannelse af et bundfald. Blandingen inddampedes til fjernelse af organiske opløs-30' ningsmidler, behandledes med 300 ml vand og ekstraheredes med chloroform. Ekstrakterne tørredes (Na2S04) og inddampedes ril opnåelse af er hvidt fast stof, der om-krystalliseredes af ether til opnåelse af 26 g af titelforbindelsen som hvide nåle.

35 DK 168954 B1 25

Mellemprodukt 22 3-Amino-6-(2-t-butvlbenzyloxv)pyridazin

Ud fra 2-t-butylbenzylalkohol til opnåelse af titelforbindelsen, srnp. 147-9° SH(DMSO) 7,4(2H,m,ArH), 5 7,28(2H,m,ArH), 6,9(1H,JAB/8Hz,4H), 6,85(IH,JAB,8Hz, 5H), 6,0(2H,brs,NH2), 5,5(2H,S,CH2), 1,4(9H,S,Me3).

(Alkohol fremstilles ved LAH-reduktion af 2-t-butyl-benzoesyre; M. Crawford og F.H.C. Stewart, J.Chem.Soc., 1952, 4444).

10

Mellemprodukt 23 3-Amino-6-(2-ethvlbenzyloxv)pyridazin Ud fra 2-ethylbenzylalkohol.

Alkohol fremstillet ud fra 2-ethylbenzoesyre (M.

15 Crawford og F.H.C. Stewart, J. Chem. Soc. 1952, 4444) ved reduktion med LAH.

Mellemprodukt 24 3-Amino-6-(2,5-dimethylbenzvloxv)pyridazin 20 Ud fra 2,5-dimethvlbenzylalkohol til opnåelse af titelforbindelsen, srnp. 109-111°.

Alkohol fremstillet ved LAH reduktion af 2,5-dimethyl-benzoesyre (Aldrich).

25 Mellemprodukt 25 3-Amino-6-(3,4,5-trimethvlbenzvloxy)pyridazin Ud fra 3,4,5-trimethylbenzylaikohol.

Alkohol fremstillet ved LAH-reduktion ud fra 3,4,5-trimethylbenzoesyre (G.H. Kosolapoff, J. Am.

30 Chem. Soc. 6_9, 1652, 1947).

Mellemprodukt 26 3-Amino-6-(2-phenvlbenzvloxy)pyridazin Ud fra 2-phenylbenzylaikohol.

3 5 Alkohol fremstillet ved LAH-reduktion ud fra 2- phenylbenzoesyre (Aldrich).

DK 168954 B1 26

Mellemprodukt 27 3-Amino-6-(3-diethylaminobenzyloxy)pyridazin

Ud fra 3-diethylaminobenzylalkohol til opnåelse af titelforbindelsen smp. 115-118°.

5 SH(DMSO), 7.15(lH,t,5’H), 6.95(^.^,8^,AH), 6.85(1^1^, 8Hz,5H), 6.75(lH,brs,2'H), 6.65(2H,m,A'H+6'H), 5.9(2H,s,NH2), 5.25(2H,s,CH20), 3.3(4H, quad,2xCH2N), 1.05(6H,t,2xMe).

Alkohol fremstillet ved LAH-reduktion ud fra 3-diethyl-10 aminobenzoesyre (P. Griess, Chem. Ber., 1041, 1872).

Mellemprodukt 28 3-Amino-6-(3-methylaminobenzvloxy)pyridazin

Ud fra 3-methylaminobenzylalkohol til opnåelse 15 af titelforbindelsen som en gummi.

5H(DMSO) 7.1(1H,C,5'H), 6.95(lH,J^,8Hz,4H), β.βδίΙΗ,Ι^,δΗζ,ΰΗ), 6.6(2H.m,2ArH), 6.A5(lH,d,ArH). 5.95(2H,s,NH2). 5.65(lH,brs,NH), 5.2(2H,s,CH20), 2.65(3H,s,MeN).

20

Alkohol fremstillet ved LAH-reduktion ud fra 3-methylaminobenzoesyre (J. Houben og W. Brassert.

Chem. Ber., 43^ 209, 1910).

25 Mellemprodukt 29 3-Amino-6-(3-methoxy-l-naphthvlmethoxy)pyridazin

Ud fra 3-methoxy-l-naphthylmethanol til opnåelse af titelforbindelsen smp. 157-170°.

iH(DMSO), 7.95(2H,2d,2ArH), 7.A0(3H,m,3ArH), 7.30(lH,sr2'H), 30. 7.0(lH,J,_,8Hz,4H), 6.90(lH,J,o,3Hz,5H) , 6.00(2H,s,NH,), 5.75(2H,s,CHo0),

ÅD ÅD L L

3.90(3H,s,OMe).

35 Alkohol fremstillet ved LAH-reduktion ud fra 3- methoxy-l-naphthalencarboxylsyre (R. Lesser og G.Gad, 27 DK 168954 Bl

Chem. Ber., 58B, 2551 - 9, 1925).

Mellemprodukt 30 5 3-Amino-6- Γ 2-(3,4,5-trimethoxvphenvl) ethoxy 1 pyridazin

Ud fra 2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethanol til opnåelse af en olie.

5H(DMS0), 6.95(1H,J^jj,8Hz,4H) , 6.90(1^1^,8Hz,5H), 6.60(2H,s,2ArH) 6.25(2H,brs,NH2), 4.45(2H,t.CHjO), 3.75(6H,s,3MeO og 5MeO), 10 3.58(3H,s,4MeO), 3.0(2H,t,CHj).

Alkohol fremstillet ved LAH-reduktion ud fra 3,4, 5-trimethoxyphenyleddikesyre (Aldrich).

15

Mellemprodukt 31 3-Amino-6-(2-pyridylmethoxv)pyridazin

Ud fra 2-pyridylmethanol (Aldrich) til opnåelse af titelforbindelsen smp. 114-115° 20 Nmr 5H (dg-DMSO), 8.65(lH,d,6'*H), 7.85(1H, Cr af d, 5’-H), 7,55(lH.d,3'-H), 7,45(lH,m,4'-H), 7.10(1H, 8.8Hz, 4-H), 6.95(1H.

8.8Hz. 5-H), 6.05(2H,s,NH2), 5.45(2H,s,CH2).

25

Mellemprodukt 32

Amino-6-(2-furfurvloxv)pyridzain

Ud fra furfuryalkohol til opnåelse af titelforbindelsen smp. 96-99°.

3 0' -l,mr (dg-DMSO), 7.70(lH,d,S'-H), 6.90(1H, J S.8H_, 4-H), 6.85(1H, JA_ 8.8H .

Afl «j ΛΒ 2 5-H). 6.60(1H, d,4' -H), 6.50(1H, s, 3'-H), 5.95 (2H, s ,.NH2), 5.30(2H, s, CH2).

DK 168954 B1 28

Eksempel 1

Metiiyl-N-[6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxv) imidazo\± ,2-blpyridazin-2-yllcarbamat 5 29,1 g (0,1 mol) mellemprodukt 1 og 15,15 g (0,1 mol) methyl-N-chloracetylcarbamat opvarmedes til 100° i 3 timer under omrøring og under N2 i 100 ml tør 1,3-dime-thyl-2-imidazolidinon (DMEU). Blandingen afkøledes, hældtes i isholdig natriumhydrogencarbonatopløsning og 10 filtreredes til opnåelse af et fast stof, der vaskedes med vand. Faststoffet opløstes i 5% methanol-chloroform og elueredes gennem florosil. Inddampning gav et faststof, der omkrystalliseredes af dimethyl formamid og vand til opnåelse af 14 g af titelforbindelsen som et hvidt 15 pulver, smp. 217-220°, Nmr δΗ (dg-DMSO) 10.36 (IH, br.s, NH), 7.87 (IH, 8.8Hz, 8-H), 7.85 (lH,s,3-H), 6.-87 (IH, 8.8Hz, 7-H), 6.85 (2H,s,PhH), 5.25 (2H,s,CH2), 3.79, 3.70 °9 3.56 (2H,s,0Me).

20

Eksempel 2

Ethyl—N—Γ 6-(2,5-dimethoxybenzvloxv)imidazo Γ1,2-bIpyri-dazin-2-yl1carbamat 2,61 g (10 mmol) mellemprodukt 2, 1,04 g (10 mmol) 25 2,6-lutidin og 1,66 g (10 mmol) ethyl-N-chloracetyicar-bamat opvarmedes til 100° i tre timer under omrøring og under N0 i 10 mi tør DMEU. 3landingen afkøledes og filtreredes, og faststoffet vaskedes med vand og ether og ledtes dernæst gennem florosil under eluering med 30 5% methanol-chloroform. Inddampning af eluatet gav et fast stof, der omkrystalliseredes af dimethylformamid og vand til opnåelse af 1,26 g af titelforbindelsen som er hvidt pulver, smp. 210-211°, Nmr δΗ 35 DK 168954 B1 29 (dg-DMSO) 10.24 (lH.br.s,NH), 7.85 (2H.M.3-H og 8-H), 7.10-6.86 (iH,m,7-H og PhH), 5.27 (2H,s,CH2Ar). 4.17 (2H.q. J 6.6Hz, CH2CH3) . 3.78 og 3.73 (6H,s,0Me) og 1.27 (3H,t,J 6.6Hz, CH^).

5

Eksempel 3

Methyl-N-[6-(2,5-dimethoxybenzyloxv)imidazo f1,2-b1pyri-10 dazin-2-yl]carbamat 12,0 g (0,46 mol) mellemprodukt 2, 4,92 g (0,046 mol) 2,6-lutidin og 6,97 g (0,046 mol) methyl-N-chlor-acetylcarbamat opvarmedes under omrøring og under N2 ved 100° i 4 timer i 46 ml tør DMEU. Blandingen sattes til 15 isvand og filtreredes dernæst til opnåelse af et fast stof, der omkrystalliseredes af dimethylformamid og vand til opnåelse af 2,46 g af titelforbindelsen som et lyst brunt pulver, smp. 228-230°, Nmr δΗ (dg-DMSO) 10.30 (IH, br. S, NH), 7,88 (IH, JAB 8.8Hz, 8-H), 7,85 20 (IH,S,3 —H), 7,12-6,85 (4H,m, ArH), 5,32 (2H,S,CH2), og 3,79, 3,72 og 3,69 (9H,s, OMe).

Eksempel 4 til 22

De følgende fremstilledes ved den almene frem-25 gangsmåde beskrevet i eksemplerne 1-3 ved omsætning af de 6-substituerede 3-aminopyridaziner med de rette chloracetylcarbamater.

( 4 ) n-Propyl-N-[6-(3,4,5-crimechoxybenzyloxy)imidazo[l,2-b]pyridazin-30' 2-yl carbamat ,Sm.p. 174-175°, Nmr S (d,-DMS0) 10.25 (IH.br.s,NH), rt 0 7.87 (IH, J D 8.8Hz,’8-H), 7.85 (lH,s,3-H) 6.87 (IH, J>n 8.8Hz, 7-H),

AS AB

6.85 (2H,s,PhH), 5.26 (2H,s,CH2Ar), 4.07 (2H,t,J6Hz, CH0CH2CH3), 3.80 (6H,s,OMe), 3.68 (3H,s,0Me), 1.55 (2H,dt,J6Hz. CH2CH0CH3) og 0.94 ;3H,t,J6Hz. CH„CH2CH3) 35 DK 168954 B1 30 ( 5 ) n-Butyl - N-[6-(3,4,5-trimechoxybenzyloxy) Imidazo(1,2-b]pyridazin-2-yl]-carbamac .Sm.p. 185-187°, Nmr i (dg-DHSO) 10.23 (lH.br.s.NH), 7.85 (1H'JAB 8·8Ηζ· 8'H)’ 7·8 (1H.s,3-H), 6.86 (IH, 8.8Hz, 7-H), 6.65 (2H.e,FhH), 5.27 (2H,s,CH2Ar), 4.12 (2H.C.J 6Hz, CH^HjCHjC^) , 3.80 5 (6H.s.0Me), 3.67 (3H,s,0Me), 1.61 UH.m.CHjCgjCHjCHj), 1.38 (2H,m,CH2CH2CH2CH3) 0g 0.92 (3H,t,J6Hz. CH^CH^).

(6) n-Propyl “ ii-[6*(2,5-dimeehoxybenzyloxy)imidazo(l,2-b]pyridazin-2-yl}- carbamac .ffm.p. 199-200°, Nmr 5^ (dg-DMSO) 9.93 (lH.br.s.NH), 7.87 (2H,o.3-H og 8-H), 7.17-6.89 (4H,m, 7-H og. PhH), 5.42 (2H,s.CHjAr), 10 4.17 (2H.C.J6HZ, CBjCHjCHj), 3.85 og 3.80 (6H.s,0Me). 1.73 (2H,dc.J6Hz, CH2SH2CH3) og 1.04 (3H,t,J6Hz, CHjCH^).

(7) Echyl—H* (6-(3,4,5- crime choxybenzyloxy) imidazo [ 1,2 -b ] pyridazin- 2 - y 1 ]- carbamac „sm.p. 204-206°, Nmr Sytdg-DMSO) 10.25 (lH.br.s.NH), 7.85 (IH. 8.8Hz, 8-H), 7.83 (lH,s,3-H) 6.85 (IH, 8.8Hz, 7-H), 6.64 15 (2H,s,PhH), 5.27 (2H,s,CH2Ar), 4.15 (2H,q,J6Hz, £H2CH3), 3.28 (6H,s,0Me), 3.16 (3H,s,0Me) og 1.25 (3H,t,J6Hz, CHjCf^).

(8) 2 -Me thoxyechyl-JI- [6-(3,4,5- triae choxybenzyloxy) imidazo (1,2 -b ] pyridazin -2-yl[carbamac ,Sm.p. 183-185°, Nmr i„(d,-DMSO) 10.36 (IH, br.s, NH), n b 2Q 7.85 (IH, 8.8Hz, 8-H), 7.83 (lH,s,3-H), 6.85 (IH, 8.8Hz. 7-H), 6.84 (2H,s,?hH), 5.26 (2H,s,CH2Ar), 4.25 (2H.m, C0CH2), 3.79 (6H,s,OMe). 3.18 (3H.s,0Me) 3.08 (2H,m,CH2OMe) og 3.32 (3H,s,CH20Me).

(9) Methyl-g-(6-(l-Naphchylmethoxy)imidazo[ 1,2-b Jpyridazin-2-yl J-carbamac ,sa.p. 243-246°, 5H(dcDMS0) 10.05 (IH,br.s, NH), 8.25-7.55

O

25 (9H,m,napch H and 3-H -og 8-H), 6.92 (1H,J^ 8.8Hz, 7-H), 5.92 (2H,s, CH2 jo 3.80 (3H,s,0fte).

DK 168954 B1 31 (10) Me thyl- JJ- [6-(2-Methoxyben2yloxy)lmidazo(l,2-b]pyr^^az^n*2yl]*· carbamac ,sm.p. 241-243°, S^dgDMSO) 10.1 (lH.br.s, NH), 7.92 (IH, s,

3-H), 7.65 (IH, JA_ 8.8Hz, 8-H), 7.45 (lH.d,J7Hz, PhH), 7.35 AB

(lH,dd,J7Hz, PhH), 6.95 (2H,m,PhH), 6.72 (IH, 8.8Hz, 7-H), 5.36 5 (2H,s,CH2), 3.89 (3H,s,0Me), og 3.77 (3H,s,0Me).

(11) MethylrN- [6- (3,5-Diaechoxybenzyloxy)imidazo[l ,2-b)pyridazin-2-yl J - carbamat , Sm.p. 236-238°, S„ (d.DMSO) 10.30 (lH.br.s,NH), 7.88 (IH, n o J^, 8.8Hz, 8-H), 7.82 (IH,s,3-H), 6.90 (lH.J^ 8.8Hz, 7-H), 6.66 (2H,d,J0.9Hz, 2'-H og 6'-H), 6.46 (lH,t,J0.9Hz, 4'-H), 5.36 10 (2H,s,CH2), 3.78 (6H,s,0Me) og 3.70 (3H,s,0He).

(12) Mechyl-{i-[6-(3-Bechylbenzyloxy)lniidazo(l,2-b]pyrldazin-2-yl]carbamac/ snip. 205-208°. Sar Su (d,-DMS0) 9.95 (lH.br.a.HH), 7.85 (IH,a,3-H).

H o 7.80 (IH. J „ 3.8Hz, 8-H). 7.30 (3H,o, 2'-H.4'-H and 6'-H), 7.15 15 Ab lH,m,5'-H), 6.82 (IH, 8.8Hz, 7-H), 5.80 (2H,3,CH2), 3.72 (3H,s,OMe) og 2.34 (3H,s,He).

(13) t·Butyl- H- [6·(3,4,5-trimechoxyoenzyloxy)laidazof 1,2-bJpyridazin-2-ylJ-carbamat, snip. 191.5-192.5°, Nmr «H (dg-DMSO) 9.95 (lH.br.s, HH), 20 7.85 (lH.J^ 3.8Hz. 8-H). 7.79 (IH. br.a. 3-H) 6.87 (IH. 8.8Hz, 7-H) 6.86 (2H,s,?hH), 5.25 (2H.s,CH„), 3.79 (6H.s.0Me), 3.68 (3H,s,OMe) cg 1.50 (9H. s, c-Bu).

(14) Methyl- [6-(3,4,5-crimethoxybenzylthio)imidazo(1,2-b]pyridazin-2-yl]-carbamat ,im.p. 221-223°. Hmr i (dg-DMSO) 10.51 (lH.br.s.HH), 8.11 25 (IH.s.3-H), 7.87 (IH, 3.8Hz, 3-H), 7.17 (IH, 3.8Hz, 7-H), 6.88

AB AB

(2H,s.PhH), i.49 (ZH.s.CH,). 3.33 (6H.s,0Me) og 3.70 (3H.s,OMe).

DK 168954 B1 32 (15) Methyl-Ν-[6-ί3-dimethylaminobenzyloxy;imidazo[1,2-bJpyridazin-2-ylJ- carbaaat, snip. 200-203°, Nar $H (dg-DMSO) 10.05 (IH, br.s.NH), 7.93 (1H.S.3-H) 7.90 (IH, 8.8Hz. 8-H), 7.30 (lH.t.S'-H), 6.95-6.80 (4H.m,2’-H.4'-H, 6’-H og 7-H). 5.40 (2H,s,CH2), 3.78 (3H,s,MeO) og 2.98 (6H,s,NMe,) 5 2 (16) Methyl· g- [ 6 - (3 -Methoxybenzyloxy) iaidazo (1,2 -b ] pyridazin-2 -y 1 ] earbamat, smp. 184-189.5°, Nar *H (CDC1..) 10.55 (IH, br.s, NH), 8.02 (IH, br.s, 3.-H), 7.75 (IH. 8.8Hz, 8-H),7.32 (lH.dd,J7.5Hz. 5'-H), 7.07 (2H,m,ArH), 6.88 (lH.dd.J7.5 and 2Hz. ArH). 6.70 (IH, 3.8Hz. 7-H).

10 5.34 (2H.S.CH,), 3.88 og 3.83 (6H.s.0Me>.

(17) Ethyl-g-(6-benzyioxyimidazo{l,2-b]pyridazin-2-yl]carbaaac > 211° (deKomp), Nar (d,-DMS0) 10.25 (lH,br.s,NH), 7.87 (IH, 8.8Hz, 8-H), 7.72 (1H.S.3-H), 7.57-7.37 (5H.rn.Ph), 5.35 (2H.s,CH2Ar), 4.15 (2H,q,J6Hz, ££,01,)00 1.27 (3H,t,J6Hz, ΟΗ,Ο^).

15 (18) Methyl— tJ-(6*n-bucylthloiaidazo(l,2-b]pyridazin-2-ylJcarbaaat^ ^Β.ρ.

170-171°. Nar 6H(dg-DHS0) 10.40 (lH.br.a.NH). 7.94 (1H.S.3H), 7.76 (IH. J _8.8Hz. 8-H). 7.06 (IH, Jao8.8Hz, 7-H), 3.72 (3H,s,0Me), 3.18

AB AB

20 (2H.C,J6Hz. CH.S), 1.68 (2H.e,£H„CH,S), 1.44 (2H.a.£H,CH,CH,S) °9 te te £ te i a· 0.93 (3H.C.J6HZ. G^O^O^S).

(19) Methyl — iJ-(6-benzylthioiaidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]carbaaac. sa.p.

223-225° idekomp;. Nar j (dg-DMS0) 10.42 (lH.br.s.NH), 7.99 (1H.S.3-H), 7.77 (IH. J..8.8H«, 8-H). 7.52-7.20 (SH.a.Ph), 7.07 (IH, 25 " J.a3.8Hz. 7-H). 4.45 (2H.S.CH.) 30 3.68 (3H,s,0Me).

AB l DK 168954 B1 33 (20) Methyl — g- [6-(3,5-dimethoxy-4-(mechoxyethoxynechoxy)benzyloxy)imidazo· [ 1,2-b] pyridazin· 2-yljcarbamac, jm.p. 149*150°, Nmr 5jj (CDCl^) 9.58 (lH.br.s, NH), 8.02 (IH, br.s, 3-H) 7.75 (IH, ,Γ^δ.δΗζ, 8-H), 6.75 (IH. J,a 8.8Hz, 7-H), 6.70 (2H,s,2’-H ..ag 6'-H), 5.29 (2H.S.CH,), 5.18

Ao L

(2H,s,CH2), 4.08-3.91 (2H,m,CH2), 3.85 (9H,s,0Me), 3.6-3.45 (2H,m,CH2) ag 3.35 (3H,s,0Me).

(21) Methyl— ϋ- [6-(3-chlor- benzyloxy) imidazo (1,2-b ]pyridazin-2-yl]carbamac. snip.. 268-270°, Nmr (dg-DMSO) 10.32 (lH.br.s,NH) 7.87 (lH.J^ 8.8Hz,8-H),7.83 (1H.S.3-H), 7.61 (lH,s,2'-H), 7.53-7.41 (3H.m,PhH).

10 6.91 (IH.J^S .8Hz. 7-H) 5.38 (2H.s,CH2) 3.68 (3H,s,0Me).

(22) Methyl — fi- [6-(2-thienylme thyloxv ; imidazo[ 1,2-b Jpyridazin-2-y 1 jcarbamat.

smo. 207-209°, Nmr i<H (dg-DMSO), 10.38 (lH.br.s.NH), 7.85 (lH,s,3-H), 7.82 (lH.J,_8.8Hz,8-H), 7.58 (lH.d,5'-H), 7.30 (lH.d,3’-H), 7.05

Aa (lH.t, 4'-H), 6.82 (1H. Jin 3.8Hz, 7-H), 5.56 (2H,s,CH„) oa 3.66

Ad i, 15 (3H,s ,OMe).

20 Eksempel 23 2,2,2-Trifluorethvl-N- [6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy) -imi-dazo r1,2-b1-pyridazin-2-yl1carbamat 25 a) Ethyl-6-(3,4,5-trimethoxvbenzyloxy)imidazof1,2-b1 pyrldazin-2-carboxylat 117 g (0,6 mol) ethylbrompyruvat sattes til 174,6 g (0,6 mol) 3-amino-6-(3,4,5-trimethoxy)pyridazin og 62,4 g (0,6 mol) 2,6-lutidin i 600 ml tør DMF under om- 30 røring og under N2- Blandingen opvarmedes til 100° i tre timer, afkøledes og koncentreredes i vakuum, hvorefter den behandledes med vand og filtreredes til opnåelse af et brunt fast stof, der vaskedes med vand og ether. Faststoffet omkrystalliseredes fra DMF og vand 35 til opnåelse af 88 g af titelforbindelsen som et krystallinsk fast stof, smp. 159-163°, DK 168954 B1 34

Nmr f (CDC13) 8.31 (1H.S.3H), 7.84 (lH.J^ 8.8Hz, 8H), 6.82 (IH.

8.8Hz, 7H), 6.70 (2H,s,ArH), 5.30 (2H,s,CH2Ar). 4.45 (2H,q, J7Hz, OCH2CH3), 3.88 (6H,s,OCH3), 3.86 (3H, s, OCHj) og 1.44 (3H,t,J7Hz.CH3).

5 b) 6-(3,4,5-Trimethoxvbenzvloxv)imidazo Γ1,2-b-1pyrida-zin-2-carboxylsyre 194 g (5 mmol) af produktet fra trin (a) opvarmedes under tilbagesvaling og omrøring med et ml 10M, (10 10 mmol) natriumhydroxidopløsning, 9 ml vand og 5 ml methanol i 20 minutter. Blandingen afkøledes og surgjordes med fortyndet saltsyre og filtreredes til opnåelse af et fast stof, der tørredes ved 60° i vakuum til opnåelse af 1,5 g af titelforbindelsen som et pulver, smp.

15 224-226° (dekomp.), Nmr 6„(d,-DMS0) 8.56 (lH,s,3H), ri o 8.07 (1H,J.„ 8.8Hz, 8H), 7.05 (IH, J._ 8.8Hz, 7H) 6.88 (2H,s,ArH),

ÅD ÅD

5.29 (2H,s,CH2Ar), 3.82 (6H, s, OCH3>3.68 (3H, s, OCH-j) 0g 3.32 (IH, br.s, C02H).

20 c) 6-(3,4,5-Trimethoxybenzyloxv)imidazori,2-blpyrida-zin-2-carboxvlsyre 0,13 ml (1,5 mmol) oxalylchlorid sattes til 0,36 g (1 mmol) af produktet fra trin (b) og 0,079 g (l mmol) pyridin i 5 ml tør benzen under omrøring og under 25 N2· Blandingen opvarmedes under tilbagesvaling i 3 timer, afkøledes oginddampedes i vakuum til opnåelse af et gråt faststof:

Detre faststof behandledes med 10 ml dioxan, 10 ml vand og overskud af natriumazid og omrørtes kraf-30 tigt natten over ved stuetemperatur. Blandingen filtreredes, og faststoffet tørredes i vakuum til opnåelse af 0,29 g af titelforbindelsen som et pulver, smp. >139° (dekomp.), Nmr 6H (CDC13) 8,35 (1H,S,3H) 7,85 (IH, 8,8Hz, 8H), 6,85 (IH, JAB 8,8Hz, 7H), 6,70 (2H,S, ArH), 35 5,31(2H,s,CH2Ar), 3,90 (6H,s,OCH3) og 3,88(3H,s,OCH3).

DK 168954 B1 35 d) 2,2,2-Trifluorethvl-N-Γ 6—(3,4,5-trimethoxybenzyl-oxy)imidazo Γ1,2-b1-pyridazin-2-yl1carbamat 2,3 g (6 mmol) af produktet fra trin (c), ca. 3 ml 2,2,2-trifluorethanol og 60 ml toluen opvarmedes under 5 omrøring og under N2 ved tilbagesvaling indtil t.l.c. viste fuldstændig reaktion (ca. 2 timer).

Blandingen afkøledes natten over og filtreredes til opnåelse af et fast stof, der vaskedes med ether og tørredes til opnåelse af 0,43 g af titelforbindelsen 10 som et pulver, smp. 205-210° (dekomp.) Nmr 6H(dg DMSO) 10,81 (IH, br. s ,NH) , 7,88 (IH, JAB 8,8Hz, 8H) , 7,85 (IH, S, 3H) , 6,90 (1H,Jab 8Hz, 7H) , 6,85 (2H,S, ArH) , 5,25 (2H, s, CH2Ar) 4,83 (2H,q, J9Hz, CH2CF3) , 3,76 (6H,s, OCH3) og 3,65 (3H, S, 0CH3).

15

Eksempel 24 2-Hydroxvethvl-N-[6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazo Γ1,2-b1-pyridazin-2-yl1-carbamat

Samme fremgangsmåde som beskrevet i Eksempel 20 23(d) fulgtes, bortset fra at råproduktet chromatogra-feredes på Si02 under eluering med 5% methanol-chloroform med efterfølgende omkrystallation af DMF-vand til opnåelse af titelforbindelsen som et pulver, smp. 19 3-5°, NMR δΗ (dg DMSO) 10,35 (IH, br. S, NH) 7,85 (IH, 25 JAB 8,3Hz, 3H) , 7,85(IH,s,3H),6,86(IH,JAB 8, 3Hz,3H) 6,84 (2H, S, ArH), 5,25 (2H, S, CHoAr) , 4,82 (IH, t, J4Hz, OH), 4,15 (2H,m), 3,80 (6H, s, OCH3) og 3,66 (5H, m, 0CHo og OCH3).

30 Eksempel 25 2-(l-morpholino)ethvl-N-Γ 6-(3,4,5-trimethoxybenzvloxy) imidazo Γ1,2-b1pyridazin-2-yl1carbamat

Samme fremgangsmåde som beskrevet i Eksempel 23 (d) fulgtes, bortset fra at råproduktet chromatografe-35 redes på Si02 under eluering med 5% methanol-chloroform og kogtes med lidt ethanol til opnåelse af titelforbin- DK 168954 B1 36 delsen som et pulver, smp. 161-162°, Nmr 5H (dg DMSO) 10,30 (IH, br. s, NH), 7,88 (IH, S, 3H), 7,85 (IH, JAB, 8,8Hz, 7H) , 6,87 (IH, JAB 8,8HZ,7H,6,85 (2H, S, ArH) , 5,26 (2H, s,CH2Ar), 4,22 (2H, t, J5Hz, CO.OCH2)/ 3,80 5 (6H,S, OCH3), 3,68 (3H, s, OCH3), 3,58 (4H, m, CH2OCH2), 2,59 (2H, t, J5Hz, CO. OCH2CH2N) og 2,45 (4H, m, CH2NCH2).

Eksempel 26 10 Methyl-N-rN-methyl-6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazo Γ1,2-blpyridazln-2-vncarbamat 1,26 g 60% (31,5 mmol) natriumhydrid sattes portionsvist til en omrørt suspension af methyl-N-[6-(3,4, 5-trimethoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]-pyridazin-2-yl] 15 carbamat (9,51 g, 24,5 mmol) i 100 ml DMEU under N2 ved stuetemperatur. Blandingen behandledes med 4,9 g (2,15 ml, 35 mmol) iodmethan, og efter yderligere 1 time behandledes blandingen med molært ækvivalente mængder natriumhydrid og iodmethan. Efter 2 timer hældtes blan-20 dingen i 100 ml vand og filtreredes til opnåelse af et hvidt, fast stof der chromatograferedes på Si02 under eluering med 2% methanol-chloroform. Produktet omkrystalliseredes af DMF og vand til opnåelse af 8,29 g af titelforbindelsen som et hvidt pulver smp. 177-178°, 25 NMR 5H (dg DMSO) 8,04(IH,S,3H), 7,96(IH,JAB,8,8Hz,8H), 6,92(IH,JAB,8,8Hz,7H), 6,86(2H,S,ArH), 5,25 ( 2H,s,CH2), 3,79(9H,s,OCH3), 3,68(3H,s,CO.OCH3) og3,42(3H,S,NCH3).

Eksempel 27 30 Methvl-N-fN-ethvl-6-(3,4,5-trimethoxybenzyioxy)imidazo Γ1,2-b1pyridazin-2-vi1-carbamat

Samme fremgangsmåde som beskrevet i Eksempel 26 anvendtes til opnåelse af titelforbindelsen som et 35 hvidt fast stof, smp. 153-155°, NMR 6H(dgDMSO), 5 37 DK 168954 B1 8.0M1H.S.3H), 7.96(^.^,8.8HZ.8H), 6.92(^,^,8.8Hz,7H), 6.86(2H,s,ArH), 5.25((2H,s,ArCH2), 3.90(2H,q.Ql2CH3). 3.78(9H,s,ArOCH3), 3.66(3H,s,NCH3) og 1.19(3H,t,CH2CJi3).

Eksempel 28 2,3-Dihydroxypropyl-N-Γ 6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxv) imidazof1,2-b1pyridazin-2-yl]carbamat

Produktet fra Eksempel 23(c) omsattes med solke-10 tal under anvendelse af samme fremgangsmåde som den beskrevet i Eksempel 23(d), bortset fra at råproduktet efter afslutning af omsætningen mellem acylazid og sol-ketal inddampedes i vakuum og dernæst opvarmedes til 60-70°i 0,5 timer med fortyndet saltsyre og ethanol.

15 Reaktionsblandingen neutraliseredes med natriumhydro-gencarbonatopløsning, inddampedes i vakuum og chromato-graferedes på Si02 under eluering med 7% methanol-chloroform til opnåelse af titelforbindelsen som et hvidt fast stof, smp. 175-176°, NMR 6H(dgDMSO)10,28(IH, 20 brs,NH), 7,88(1H,Jab 8,8Hz,8H), 7,86(IH,s ,3H), 6,87(1H, JAB 8,8Hz,7H), 6,85(2H,s,ArH), 5,28(2H,s,AfCH2), 4,90 (lH,d,J4HZ,2' -OH), 4,65(IH,t,J4Hz,1' -OH),4,20-4,0(2H, m,Co.OCH2), 3,80(6H,s,OCH3), 3,80-3,70(lH,m,HO-CH).

3,69(3H,S,OCH3) og 3,40(2H,t,J4Hz,HOCH2).

25

Eksempel 29 2-Dimethviaminoerhvl-N-r3,4,S-trimethoxvbenzvloxy)imi-dazo Γ1,2-b1pvridazin-2-yl1carbamat

Produktet fra Eksempel 23(c) omsattes med (2-di-3 0 methvlamino) ethanol under anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet i Eksempel 23(d), bortset fra at råproduktet chromatograferedes på Si02 under eluering med 5% methanol-chloroform til opnåelse af et fast stof, der vaskedes med ethanol og tørredes til opnåelse 35 af titelforbindelsen som et hvidt pulver, smp. 185-186°, NMR 5H (dgDMSO), 10,32(IH,brs,NH), 7,88(1H,JAB, DK 168954 B1 38 8,8Hz,7H), 6,85(2H,S,ArH), 5,77(2H,s,ArCH2) , 4,60(2H, t,J4Hz, CO.OCH2), 3,80(6H,s,OCH3), 3,69(3H,S,OCH3), 2,50(2H,t,CH2N) og 2,21(6H,s,NMe2).

5 Eksempel 30

Phenvl-N-Γ 6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazof1,2-bl pyridazin-2-yl]-carbamat

Produktet fra Eksempel 23(c) omsattes med phenol under anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet i 10 Eksempel 23(d), bortset fra at råproduktet chromatogra-feredes på Si02 under eluering med 5% methanol-chloroform til opnåelse af et fast stof, der vaskedes med acetonitril og tørredes til opnåelse af titelforbindelsen som et hvidt pulver, smp. 210-213°, NMR 5H(CDC13) 15 10,12(IH,brs,NH), 8,05(1H,S,3H), 7,80(1H,Jab,8,8Hz,8H), 7,55-7,15(5H,m,Ph), 6,69(2H,S,ArH), 6,67(IH,JAB,8,8HZ, 7H), 5,28(2H,s,ArCH2) og 3,90(9H,S,0CH3).

Eksempel 31 20 Methyl-N-f6-(2-brom-3,4,5-trimethoxvbenzyloxv)imidazo-f1,2-b1pyridazin-2-vl1carbamat a) 3-amino-6-(2-brom-3,4,5-trimethoxybenzvloxv)pyrida-zin 25 2,91 g (10 mmoi) 3-amino-6-(3,4,5-trimethoxyben zyloxy )pyridazin (Mellemprodukt 1) i 20 mi eddikesyre behandledes dråbevis med en opløsning af 1,59 g (10 mmol) brom i 2 ml eddikesyre i løbet af 5 minutter. Efter 0,5 timer filtreredes blandingen til opnåelse af et 3 0 cremeagtigt, fast stof, der suspenderedes i vand og gjordes basisk med natriumhydroxidopløsning. 3landingen ekstraheredes med chloroform, og ekstrakterne vaskedes med vand, tørredes (Na2S0^) og inddampedes i vakuum til opnåelse af et cremefarvet, fast stof, der omkrystalli-35 seredes af toluen til opnåelse af 2,76 g af titelforbindelsen som cremefarvede nåle, smp. 160-161°,NMR 6H(CDC13) DK 168954 B1 39 6.93(IH,s,ArH) 6.91(1H, J^, 8.8Hz,5H), δ.δΟαΗ,^,δ.δΗζΛΗ), 5.49(2H,s,CH2), 4.95(2H, brs.NHj), 3.91(3H,s,OCH3), 3.90(3H,s,0CH3) og 3.89(3H,s,OCH3).

b) Methyl-N-Γ 6-(2-brom-3,4,5-trimethoxvbenzyloxy)imi-5 dazof 1,2-bTpyridazin-2-yncarbamat

Samme fremgangsmåde som den der er beskrevet i eksemplerne 1-3, fulgtes til opnåelse af titelforbindelsen som et hvidt pulver smp. 218-219°, NMR 6H

(CDC13) 9.45(lH,brs,NH), 8.03(lH,brs, 3H), 7.75(1^.^,8.8^,8^, 10 6.94(lH,s,ArH), ^ .6.75(lH,JAB,8.8Hz,7H). 5.40(2H,s,ArCH2) og 3.96-3.86(12H,jn,OCH3).

Eksempel 32-35 15 De følgende forbindelser fremstilledes under an vendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet i eksemplerne 1-3:

Eksempel 32

Methvl - S - i 6 - (2, 3-dlroethoxvbenzvloxv)lmlda2of1,2-blDvrldazln-2-vl1carbamat smp. 210-211°C, NMR <SH dg(DMSO) 10.35(lH,brs,NH), 7.86(1H, ^,8.8Ηζ,8Η).

7.84(IH,s,3H), 7.10(3H,s,PhH). 6.88(1H,J 8.8Hz,7H). 5.35(2H.s.CH2). oq 3,86,3.80 og 3.72(9H,s,OCH3).

25 Eksempel 33

Marhvl- N-Γ6-C 3 . 5-dlmethoxv-4-echoxvbenzvloxv)Imidazoil.2-b1pyrtdazln-2·vi 1 carbamag smp. 190-193°, NMR iH (d.DMSO) 10.33(lH,brs,NH), 7.88(lH,J..,8,8Hz,8H), 30' 6 ^ 7.85(lH,s,3H), 6.88(lH,J^.8.8Hz.7H), 6.85(2H,s,ArH), 5.77(2H,s,ArCH2, 3.90(2H,q,J7Hz.CH2CH3), 3.80(6H,s, ArOCH3), 3.69(3H,s,CO.OCH3) °9 1.24(3H.c,J7Hz,CH2CJ13).

Eksempel 34 40 DK 168954 B1

Methvl-N- f6-(2-t-butvlbenzvloxv)-lmidazo_ fl.2-b]pyridazin-2-vn .carbamar 5 smp. 220 - 223° SH(DMSO) 9.95 (IH, brs, NH), 7.85 (IH, s, 3H), 7.8 (IH, 8Hz, 8H), 7.5(2H, m, ArH), 7.28 (2H, m, ArH), 6.8 (IH, 8Hz, 7H), 5.5 (2H, s, CH2), 3.7(3H, λ,' OMe), 1.4(9H, s, Me3).

, Ud fra mellemprodukt 22.' ^ Eksempel 35

Methyl’N- f 6-f2-ethylbenzyloxv)imidazoil.2-blpvridazin-2--^11031:031113^ smp. 190 - 191° SH(DMSO) 9.95 (IH, brs, NH), 7.85( IH, s, 3H), 7.8(1H,

AB

15 8Hz, 8H), 7.45 (IH, d, ArH), 7.3 (3H, m, ArH), 6.8 (IH, J 8Hz, 7H) 5.4 (2H, s, 0-CH2), 3.7 (3H, s, OMe), 2.7 (2H, kvad, CH2), 1.2 (3H, t, Me).

(Ud fra mellemprodukt 23)

Eksempel 56 20 π-Propyl-N-f 6- (2.5-dimechvlbenzvloxv)Imldazo f1,2-blpyrldazin-2-vn -carbamar

Smo.196 - 7° SH(DMSO) 9.85 (IH, brs, NH), 7.85 (IH, s, 3H), 7.80 (IH, J „

AB

8Hz, 8H), 7.25 (IH, s, 6Ή), 7.1 (2H, 2d, 3Ή and 4Ή), 6.8 (IH, 8Hz, 25 ^ 413 7H), 5.35 (2H, s, OCH,), 4.1 (2H, c, OCHJ, 2.3 (6H, 2s, 2 x ArMe), 1.7(2H, quad, CHj), 0.95 (3H, c, Me).

( Ud fra n-propvichloracetvlcarbamar og.mellemprodukt 24)

Eksemoel 37 3 0 -

Methyl-N-Γ6-f3.4,5- trimechvlbenzvloxv)imidazoi2.l-blpvridazin-2-yl1-carbamac

Smp. 227 - 229° ÆH(DMSO) 9.90 (IH, brs, NH), 7.85 (IH, s, 3H), 7.75 (IH, 35 JAB 8HZ' 3H)’ 7·15 (2H’ S’ Aril)’ 6,80 (1H’ JAB 8Hz’ 7H)’ 5·25 (2H’ s’ 0CH2), 3.7 (3H, s, OMe), 2.28 (6H, s, 2 x ArMe), 2.15 (3H, s, ArMe).

>Ud fra mellemprodukt 25;

Eksempel 38 41 DK 168954 B1

Methyl-N-f6 -(2-pheTwlbenzvloxv)imidazo Γ1.2-blpvridazin-2-vlj carbamat 5 Smp. 203-204. SH(DMSO) 9.92(lH,brs,NH), 7.75(^,^ 8Hz,8H), 7.70(lH,s,3H) 7.4(9H,rn,9ArH), 6.75(1H,J 8Hz,7H), 5.3(2H,s,OCH2), 3.7(3H,s,OCH3).

flid fra mellemprodukt 26)

Eksempel 39

Me.thvl- N- f 6-(3-dlethvlaroinobenzyloxv) Imidazo i 1.2 -b bvrldazin· 2 - vi 1-carbamat -hydrochlorid smp. 220 - 225° <5H(DMS0), 10.35 (IH, brs, NH), 7.9 (IH, 8Hz, 8H). 7.8 (IH, s, 3H), 7.6 (4H, m, 4 x ArH), 6.9 (IH, J B 8Hz, 7H), 5.4 (2H. s,

Ad CH 0), 3.7 (3H, s, OMe) 3.5 (4H, brs, 2 x CH N), 1.05 (6H, t, 2 x Me).

15 z 1 ( Ud fra mellemprodukt 27)

Eksempel 40 2 0 Methyl- N-r 6- (3-methylaminobenzyloxy) imidazo Γ1.2 -blpvridazin-2-vl 1-carbamat - hydrochlorid smp. 213 - 215° (dek) SH(DMSO) 10.4 (IH, brs, NH), 7.9 (IH, J B 8Hz, 8H),

Ad 7.85 (IH, s, 3H), 7.3 (4H, m, 4ArH), 6.9 (IH, 8Hz, 7H), 5.4 (2H, s, CH20), 3.7 (3H, s, OMe), 2.85 (3H, s, MeN).

25 (Ud fra mellemprodukt 23.'

Eksempel 41

Ethvl* N- f 6 - (3 - dimethylaminobenzyloxy') imidazo 11.2 -b Ipvridazin- 2 - vi I- 3 0 carbamat

smp. 204 - 8 SH(DMSO) 9.95 (IH. brs. NH), '.85 (IH, s, 3H), 7.80 (IH, J

8Hz, SH). 7.2 (IH. C. 5Ή), 6.85 (IH, J4D 3Hz. 7H), 6.75 (3H, m. 3ArH), 5.3 (2H, s. CH-0). 4.2 (2H, ^aa. OCH,), 2.9 (6H. s, Me.N), 1.25 (3H, t, Me).

35 (Ud fra mellemprodukt . -

Eksempel 42 42 DK 168954 B1

Eehvl'H-;6-fl-naphchvlniethoxY)t!nidazo! 1. 2-blpvrldazln-2-vlIcarbamac _smp. 240 - 245° SH(DMSO), 10.0 (IH, brs, NH), 8.2 (IH, ra, ArH), 8.05 (2H, b, 2ArH), 7.95 (IH. s, 3H), 7.90 (IH, J._ 8Hz, 8H), 7.85 (IH, d, 2Ή), 7.65

AE

(3H, m, 3ArH), 6.90 (IH, 8Hz, 7H), 5.95 (2H, s. CHjO). 4.25 (2H,kvad, OCH2), 1.35 (3H, t. Me).

(3d' fra mellemprodukt 3) 10

Eksempel 43 n-Propvl-N- f 6 - (1-naphthvlmechoxvHmidazo f 1,2-blpvridazin-2-vl.j-carbamat smp. 208 - 210° SH(DMSO), 10.25 (IH, brs, NH), 8.15 (IH, m, ArH), 8.00 (2H, 15 m, 2ArH), 7.90 (IH, s, 3H), 7.85 (IH, 8Hz, 8H), 7.75 (IH, d, 2Ή), 7.60

AB

(3H, m, 3ArH), 6.85 (IH, J_ 8Hz, 7H), 5.8 (2H, s, OCH,), 4,1 (2H, c, AB i 0CH2), 1.65 (2H, ra, CH2), 0.9 (3H, C, Me).

( Ud fra meiiemprooukt 3; ^ Eksempel 44 -Jetpvi -N- Γ6 - (3 -rnethoxv-l-naphthvlmechoxv) imidazol'l. 2-b lpyridazin-2-vl 1 ~ carbamac 25 iH(DMSO) 10.0 (IH, brs. NH), 8.1 (IH. c, ArH), 7.9 (2H, ra, ArH + 3H), 7.85 (IH, J,D SHz, SH), 6.85 (IH, 3Hz. Ή), 5.3 (2H, s, CH„0). 3.90 (3H, s.

An An ± OMe), 3.7 (3H, s, CMe).

( Ud fra meiiemprooukt 29)

Eksempel 45 30

Uethv f 6- < 2 -; 3,4.5- crlmechoxvpher.vDechoxv i imldazof 1. 2 -b; pyrldazln-2-vl·lcarb3mac

smp.203 - 6° SH(DMSO) 9.95 (IH. brs, NH), 7.80 (IH. s, 3H), 7.75 (IH, J

AB

8Hz, 8H), 6.8 (IH, J 8Hz, 7H), 6.65 (2H, s, 2ArH), 4.5 (2H, C, CH,0), 3.8 35 AB 2 (6H, s, 3MeO, 5MeO). 3.7 (3H, s, OMe), 3.65 (3H, s, 4MeO), 3.0 (2H, c, ch2).

(Ud fra meiiemprooukt 30) DK 168954 B1 43

Eksempel 46

Methyl-N-6-(3,4,5-trimethoxyphenethyl)imidazo Γ1,2-b1 5 pyridazin-2-ylcarbamat a) 4-Oxo-6-(3,4,5-trimethoxyphenethyl)hex-5-ensyre

En opløsning af 50 g (0,43 mol) lævulinsyre i 200 ml vand sattes til en blanding af 85g (0,43 mol) 3,3,5-10 trimethoxybenzaldehyd i 150 ml ethanol og 700 ml 5% natriumhydroxidopløsning. Blandingen opvarmedes under kraftig omrøring indtil al aldehydet var opløst og hældtes dernæst på is (ca. 2 kg). Den surgjordes dernæst til pH 3-4 og henstod natten over. Det dannede, 15 krystallinske materiale filtreredes fra, vaskedes i vakuum og omkrystalliseredes dernæst af ethanol til opnåelse af bleggule krystaller (30,08 g) smp. 187-9°.

N.m.r. SH(dg-DMSO), 7.57 (IH, d, JAm - 18.0Hz, CH), 7.08(2H, s, 2Ή, 6Ή), 6.91 (IH, d, J,n - 18.0 Hz, CH), 3.83 (6H, s, 3'-MeO og 5'MeO),

AB

2Q 3.70 (IH, s, 4'MeO), 3.33 (IH, br. m. gres, CO^), 2.92 (2H. c, Ja2b2 - 7.0 Hz, CH2) cg 2.50 2H, =, Ja2b2 - 7.0Hz, CHj).

b) 4,5-dihydro-6-i 3,4,5-trimethoxy-a-styryl)pyridazin-3(2H)-on 25 20 g (0,068 mol) 4-ΟΧΟ-6-(3,4,5-trimethoxyphen ethyl ) hex-5-ensyre' opløstes i 240 ml iseddikesyre, hvorefter 3,4 g (0,068 mol) hydrazinhydrat tilsattes blandingen. Blandingen opvarmedes under tilbagesvaiing i 2,5 timer, afkøledes og hældtes i vand (ca. 2 1). Efter 30 henstand natten over filtreredes de dannede krystaller fra ved vandstrålepumpetrvk og tørredes i vakuum til opnåelse af produktet (13,58 g). En portion af 3,5 g omkrystalliseredes af methanol til opnåelse af bleggule krystaller (3,18 g), smp. 173-5°.

35 5 44 DK 168954 B1 N.m.r. 5H(CDC13), 8.91 (IH, brs. NH), 6.82 (2H, s, CH, CH), 6.70 (2H, s, CH. CH). 3.89 (6H, s, 3'-Me0 og 5’-MeO), 3.87 (3H, s. 4'MeO), 2.82 (2H, t. JM - 9.0Hz) og 2.56 (2H, c, - 9.0Hz).

c) 4,5-Dihydro-6-(3,4,5-trimethoxyphenethvl)pvridazin-3(2H)-on 10 5 g (0,017 mol) 4,5-dihydro-6-(3,4,5-trimethoxy- a-styryl)pyridazin-3(2H)-on hydrogeneredes (85°, lOatm H2) på 150 ml iseddikesyre i tilstedeværelse af 0,25 g 10% Pd/C katalysator indtil den krævede optagelse af hydrogen havde fundet sted. Blandingen filtreredes der-15 næst gennem HYFLO®, og filtratet inddampedes i vakuum ved 35°. De resterende spor af iseddikesyre fjernedes ved azeotrop destillation med toluen, og det brune faststof (4,9 g) rensedes yderligere ved silicagelchro-matografi med 1% ethanol/dichlormethan som eluerings-20 middel. Fjernelse af opløsningsmidlerne fra de relevante fraktioner gav 3,04 g af produktet som et hvidt, fast stof, smp. 116-117°.

N.m.r. 5H(CHC13), 8.46 (IH. s. br, NH). 6.43 (2H. s. 2Ή, 6Ή), 3.83 (6H, s, 3'MeO cg 5'HeO), 3.81 (3H. s. 4'MeO), 2.34 (2H. s. - 7Hz.

25 CH2), 2.61 (2H. c, J - 7Hz) cq 1.95 (4H. a. pare. res. CH.,, CH2) .

d) 6-(3,4,5-Trimethoxvphenethvl)pyridazin-3(2H)-on 30 1,72 g (5,93 mmol) 4,5-dihydro-6-(3,4,5-trime- thoxvphenethvl)pyridazin-3(2H)-on og 0,98 g (8,83 mmol) selendioxid opvarmedes under tilbagesvaling i 80 ml ethanol i 4,5 dage. Mere selendioxid (0,5 g, 4,51 mmol) tilsattes og blandingen opvarmedes under tilbagesvaling 35 i yderligere 5 dage. Blandingen filtreredes til fjernelse af udskilt selen, og filtratet inddampedes i va- DK 168954 B1 45 kuum til opnåelse af 2,21 g af et brunt, klæbrigt fast stof. Dette faste stof udsattes for flashchromatografi på silica med 1-2% methanol-dichlormethan som elue-ringsmiddel. Kombination af de relevante fraktioner gav 5 1,43 g af produktet som et sandbrunt, krystallinsk fast stof, smp. 122-4°.

N.m.r. iH (CDC13) 11.64 (IH, brs, NH), 7.08 (IH, d, - 6Hz, HetCH), 6.89 (IH, d, - 6Hz, HetCH), 6.48 (2H, s, 2Ή, 6Ή). 3.83 (9H, 2s, 3’MeO oq 5'MeO, 4'MeO) og 2.82 (4H, s, CH,-CH.).

im £ 10 e) 3-Chlor-6-i 3,4, 5-trimethoxvphenethyl)pyridazin

En blanding af 2,80 g (9,65 mmol) 6-(3,4,5-trime-15 thoxyphenethyl)pyridazin-3(2H)-on og 70 ml phosphoroxy-chlorid opvarmedes til 100° i en time, afkøledes til stuetemperatur og hydrolyseredes ved forsigtig, gradvis tilsætning til vand i løbet af 3 timer, således at temperaturen ikke overskred 30°. Blandingen indstille-20 des dernæst basisk til en pH-værdi på 12 ved tilsætning af 700 ml 10N natriumhydroxidopløsning og henstod ved 4° natten over. Bundfaldet filtreredes fra under vand-strålepumpetryk, vaskedes godt med vand til fjernelse af uorganiske salte, og remanencen på sinteret blev op-25 taget i dichlormethan. Efter tørring (natriumsulfat), gav fjernelse af opløsningsmidlet 2,84 g af et lysé-brunt fast stof, der rensedes ved flashchromatografi på silica med 10% ethylacetat/dichlormethan som eluerings-middel. Relevante fraktioner kombineredes til opnåelse 30 af 2,16 g af et hvidt, fast stof, smp. 105-106°.

DK 168954 B1 46

N.m.r. 5H(CDC1 ) 7.38 (IH. d. J,D - 9Hz, HecCH), 7.16 (IH, d, J

Ad AB

9Hz, HetCH), 6.37 (2H, s. 2Ή. 6Ή). 3.82 (9H, s. 3'MeO, 4'MeO °9

S'MeO), 3.37 (2H, c, - 9H, CHj), og 3.04 (2H, t, J

9HzCH2) .

5 f) 3-Amino-6- (3,4,5-trimethoxvphenethvl jpyridazin 1,97 g (6,38 mol) 3-Chlor-6-(3,4,5-trimethoxyphe-nethyl)pyridazin i 800 ml mættet methanolsk ammoniak 10 opvarmedes i en rustfri stålautoklav ved 150° i 65 timer, hvorefter man lod det afkøle. Blandingen inddampedes dernæst i vakuum til opnåelse af 2,84 g af et mørkebrunt, klæbrigt, fast stof, der underkastedes flash-chromatografi på silica med 3% methanol/dichlormethan 15 som elueringsmiddel. Kombination af de relevante fraktioner gav 0,56 g af produkter som et hvidt, fast stof, smp. 130-132°.

N.m.r. £H(CDC13) 6.96 (IH. d, - 9.0Hz, HetCH), 6.67 (IH, br, d, JAB “ 9·0Ηζ· HetCH), 6.42 (2H, s, 2Ή. 6Ή). 4.74 og 1.98 (2H, brs, 20 -NH2), 3.83 (9H, s, 3'MeO, 4'MeO 5'Meo), 3.13 (2H, part res m., CH2) □g 3.01 (2H part res. m., CH2).

g) Methyl-N-6-(3,4,5-trimerhoxyphenethvl)imidazofl,2-25 b1-pyridazin-2-vl-carbamat 50 g (1,79 mmol) 3-Amino-6-(3,4,5-trimethoxy-phenethyl)pyridazin og 0,26 g (1,74 mmol) methyl-N-chloracetylcarbamat opvarmedes i 15 ml tør hexamethyl-phosphoramid (destilleret fra CaH9 i vakuum) under om-30 røring i 4 timer ved 100° under nitrogen. Blandingen afkøledes dernæst og hældtes i 150 ml vand, hvorved et bundfald dannedes. Efter henstand natten over filtreredes bundfaldet fra, og det tørredes i vakuum til opnåelse af 0,53 g af et cremefarvet, krystallinsk fast-35 stof. Dette rensedes yderligere ved flashchromatografi (silica, 1-2% methanol/dichlormethan som elueringsmid- DK 168954 B1 47 del) og omkrystallisation af ethylacetat til opnåelse af 0,18 g offwhite krystaller, smp. 175-6°.

N.M.R. iH(CDCl3) 10.17 (IH, br.s, NH), 8.18 (IH, br.s, Het 3-H); 7.77 (lH.d.JAB - 10Hz, Hec CH), 6.85 (lH.d.JAB - 10Hz, HecCH), 5 6.42(2H,s,2'-H,6'-H), 3.88 (3H,s, COjMe) ag. 3.82 (9H,s, 3-HeO, 4'-HeO, 5'-MeO), 3.12 (2H,part.res.ra, CHj) and 3.02 (2H,parc.res.m,CH2).

10 Eksempel 47

Methvl-N-6-(3,4,5-trimethoxy-a-stvryl)imidazof1,2—b1 pyridazin-2-vlcarbamat a) 6-(3,4,5-trimethoxv-a-stvryl)pyridazin—3(2H)-on 15 10,0 g (34,4 mmol) af forbindelsen fra Eksempel 46 (b) og 10 g (90,1 mmol) selendioxid opvarmedes under tilbagesvaling i 300 ml ethanol i 80 timer. En yderligere portion af 10 g selendioxid tilsattes, og opvarmningen under tilbagesvaling fortsattes i yderligere 40 20 timer. Reaktionsblandingen filtreredes dernæst gennem "HYFLO®", inddampedes, og remanensen tørredes i vakuum til opnåelse af 14,48 g af et mørkebrunt, klæbrigt fast stof. Dette chromatograferedes dernæst på silica med 1-2% methanoi/dichlormethan. Kombination af de relevan-25 te fraktioner efterfulgt af krystallisation af methanol gav 5,57 g af produktet som et sandbrunt faststof, smp. 194-196°.

N.M.R. <5h (CDC1,) 11.95(lH,br.s,NH),7.66(IH,d.J -lOHz.Het CH), 7.10 J 11 (lH.d.J B -18H2,CH).7.01(lH.d,JA -10Hz,HecCH),6.92(lH,d, 30’ JA B -1·8Αζ^Η)·6·74(2Η·3·2'-Η-δ'·^' 3·91 (6H’S· 3'-Me0- 5'-MeO) og 3.$82(3H,4'-MeO).

b) 3-Chlor-6-(3,4,5-trimethoxy-a-styrvl)pyridazin 35 5,3 g, 0,018 mol) 6-(3,4,5-trimethoxv-a-styryl) pyridazin-3(2H)-on i 150 ml phosphoroxychlorid opvarme- DK 168954 B1 48 des til 100° i 1,25 timer. Blandingen sattes dernæst til 3 1 vand i løbet af 2 timer, idet temperaturen holdtes i området 10-30°C. Blandingen gjordes dernæst forsigtigt basisk til en pH-værdi på 10 med 1,3 1 ION 5 natriumhydroxidopløsning. Efter henstand natten over filtreredes bundfaldet fra, og det tørredes i vakuum til opnåelse af 6,24 g af produktet som et sandbrunt faststof. En portion omkrystalliseret af ethanol havde et smp. på 162-163,5°.

10 N.m.r. ih (CDC13) 7.64 (lH.d,JA β -lOHz.HeC CH). 7.54 (lH,d.JA -18Hz. CH). 7.48(lH.d,JA * -lOHz.Het CH). 7.27 (lH.d.JA2B2-18Hz.CH). 6.82 (2H.s,2'-H.6'M. 3.92 (6H.S.3'-MeO og 5'-MeO) oq23.88 <3H,s.4'-MeO).

15 c) 3-Amino-6-(trimethoxy-a-styryl)pyridazin 5,5 g (17,1 mmol) 3-chlor-6-(3,4,5-trimethoxy-a-styryl)pyridazin i 800 ml mættet ethanolsk ammoniak opvarmedes i en rustfri stålautoklav til 150° i 100 ti-20 mer, hvorefter man lod det afkøle. Fjernelse af opløsningsmidlet og chromatografi på silica (2% methanol/di-chlormethan) gav 1,58 g af produktet som et lysebrunt faststof, smp. 139-142°.

N.m.r. Sh (CDC1.) 7.49 (lH.d.J, _ -10Hz CH), 7.24 (2H.2 x overleqrdt J A,fl.

25 d,JA g dA b “ (10Hz,2xCH)J, 6.75 (3H,d o ver-lej rende fe.

J, n1-loHz,CI?,-H,6'-H) 4.85 (2H.br.s. NH_), 3.92(6H,s, A2B2 2 3-MeO cg 5-MeO) og 3.87(3H,s,4-MeO).

30 (d) Methvl-N-6-(3,4,5-trimethoxv-a-stvrvl)imidazoΓ1,2-blpyridazin-2-yl-carbamat 1,36 g (4,72 mmol) 3-Amino-6-(3,4,5-trimethoxy-a-styryl) pyridazin og 0,68 g (4,49 mol) methyl-N-chlor-acetylcarbamat opvarmedes i 30 ml tør hexamethylphos-35 phoramid (destilleret fra CaH2 i vakuum) under omrøring i 4 timer ved 100°. Blandingen afkøledes dernæst og 4Θ DK 168954 B1 hældtes i 40 ml vand. Bundfaldet, der dannedes, filtreredes fra og tørredes i vakuum til opnåelse af 1,0 g af et gulbrunt fast stof. Dette chromatograferedes på silica til opnåelse af 0,4 g af produktet som et bleggult 5 fast stof, smp. 217-9°.

N.m.r. 5H(d,-DMS0) 10.49(lH,br.s,NH), 7.99(lH,s,Hec 3-H) 0 7.94(2H,d,JA1B1-10Hz, HetCH), 7.60(2H,d,JA2B2-i3Hz, CH), 7.58(2H,d, JA.B.-IOHz, HecCH), 7.28C2H,d,JA2B2-18Hz,CH), 7.04(2H,s,2'H,6'H), 3.87(6H,s,3'-MeO og 5'-MeO), (3.72(3H.s) og 3.70(2H,s)] (COjMe og 10 4' .MeO).

Eksempel 48

Methyl-N- Γ 6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazo Γ1,2-b1 15 pyridazin-2-yl1-carbamat 1,0 g (2,6 mmoi) 6-(3,4,5-Trimethoxybenzyloxy) imidazo[1,2-b]pyridazin-2-carboxylsyreazid (Eksempel 23C) opvarmedes under tilbagesvaling 1 24 timer i 20 ml 20 toluen og ca. 1,5 ml ethanol. Blandingen afkøledes og inddampedes i vakuum til opnåelse af et gult fast stof, der omkrystalliseredes af DMF og vand til opnåelse af 1,0 g af titelforbindelsen, smp. 213-215° og NMR-spektrum identisk med spektret for produkter fra Eksem-25 pel 1.

Eksempel 49

Methyl-N- [6-(3,4,5-trimethoxvbenzvloxy)imidazo Γ1,2-b1 pyridazin-2-vl1-carbamat 30 a) 2-Amino-6-i 3,4,5-trimethoxvbenzvloxy)imidazofl,2-blpvridazin-trifluoracetat 0,43 g (1 mmoi) t-Butyl-N-[6-(3,4,5-trimethoxy-benzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yi]carbamat 35 (Eksempel 13) opløsret i 2 ml dichlormethan og behandledes med 1 ml trifluoreddikesyre. Efter 2 timer ved DK 168954 B1 50 stuetemperatur inddampedes blandingen i vakuum til opnåelse af en brun olie, der tritureredes med diethyle-ther til opnåelse af 0,25 g af titelforbindelsen som et chremefarvet fast stof, smp. 150-157°, NMR 6jj (DMSO)8.0 5 (IH, J,„ 3.8Hz, 8H), 7.48(1H. s, 3H). 7.16(1H, 8.8Hz, 7H),

Ad Ad 6.44(2H, s, CH2), 4.5(brs, NH,), 3.89(6H, s, OMe) og 3.75(3H, s, OMe).

b) Methyl-N-6-(3,4,5-trimethoxvbenzyloxy)imidazo f1,2- 10 blpyridazin-2-yll-carbamat 1,0 g (3,03 mmol) af produktet fra trin (a) suspenderedes i dichlormethan og omrystedes med fortyndet natriumhydroxidopløsning. Den organiske fase tørredes (Na2S04) og inddampedes til opnåelse af en brun olie, 15 der opløstes i dichlormethan og under omrøring behandledes med 0,42 ml (3,03 mmol) triethylamin, 0,23 ml (3,03 mmol) methyichlorformiat og 18 mg (0,3 mmol) 4-dimethylaminopyridin. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 17 timer og derefter under tilbagesvaling i 2 20 timer og inddampedes i vakuum. Det resulterende faste stof fordeltes mellem chloroform og vand, den organiske fase skiltes fra, tørredes (Na2S04) og inddampedes til opnåelse af et fast stof, der chromatograferedes på Si02 under eluering med 2% methanol-chloroform. Produk-25 tet omkrystalliseredes af DMF-H20 til opnåelse af 0,27 g af titelforbindelsen, smp. 210-212°, NMT identisk med NMR for produktet fra Eksempel 1.

Eksempel 50-52 30 De følgende forbindelser fremstilledes ved samme fremgangsmåde som beskrevet i eksemplerne 1-3: DK 168954 B1 51

Eksempel 50

Methvl-N-Γ 6-(2,5-Dimethylbenzyloxy) imidazo Γ1,2-blpyrida-2in-2-yl1-carbamat 5 Smp. 208-209° Nmr 5H (d,-DMS0), 10.05(1H, br.s, NH), 7.95 (IH, J4D 8.8Hz,

o AB

8H), 7.85(lH,s,3-H), 7.35(1H,s,6'-H), 7.20(2H, J „ 8.8 Hz, 7H + d, 3' or

AB

V-H), 6.90(1H,d,3' or 4'-H), 5.90(2H,s,CHj), 3.80(3H,s,OMe), 2.4(3H,s,Me). 2.35(3H,s,Me) 10 (Ud fra mellemprodukt 24)

Eksempel 51

Methyl-N-Γ 6-(2-pyridylmethoxv)ImidazoΓl,2-blpyridazin- 2-yllcarbamat 15 smp. 231-233°(dek) Nmr aH (dg-DMSO), 9.95(1H, br.s.NH), 8.55(lH,d,6'-H),

7.85(3H,m,8-H + 3-H + 5'-H), 7.55(lH,d,3'-H), 7.35(lH,m,4'-H), 6.90(1H, J4B

AB

8.8H2, 7-H), 5.45(2H,s,CH2), 3.70(3H,s,0Me).

20 (Ud fra mellemprodukt 31)

Eksempel 52

Methyl-N-Γ 6-(2-furfurvloxv)imidazo Γ1,2-blpyridazin-2-yllcarbamat 25 o smD> 220-224 Nmr $H (d.-DMSO), 10.05(1H, br.s, NH), 7.95(lH,s,3-H), 7.90( IH, 8.8H., 3-H), 7.75(lH,brs, 5' -H), 6.90(1H, 8.8Hz, 7-H), 6.75(lH,d,4'-H), 6.55(IH. br.s,3'-H), 5.45(2H.s,CHj), 3.80(3H,s,OMe).

30 (Ud fra mellemprodukt 32) DK 168954 B1 52

Biologiske testresultater A) Tubulin Polymerisationsassay 5

MATERIALER OG FREMGANGSMÅDER

l. Fremstilling af tubulin 10 a) Frisk hestehjerne b) puffere:

BBG BB BB2G

lOOmM MES*/NaOH som BBG men uden som BBG men med 15 2mM EGTA* glycerol 8M glycerol og lmM MgS04 ImM GTP*

4M glycerol 2mM

20 ph 6,9 ved 23°.

* MES = 2(N-morpholino)ethansulfonsyre EGTA=ethylenglycol-bis(β-aminoethyl-ether)N,N,N'-tetra-eddikesyrer 25 GTP = guanosintriphosphat

Alle behandlinger udføres ved 4°, undtagen hvor andet er angivet. Hestehjernen vaskes i iskold BBG-puffer og overfladehjernehinderne og -blodkarrene 30 fjernes. Efter vejning skæres hjernebarken i stykker, den homogeniseres i 75 ml BBG-puffer/100 g hjerne, centrifugeres ved 6500 g i 15 minutter og centrifugeres efter fjernelse af supernatanten igen ved 100.000 g i 75 minutter. Supernatantens volumen (Vml) måles, og V/ 35 10 ml lOmM GTP (Li-salt) i H20 tilsættes. Blandingen inkuberes i lukkede centrifugerør (30 minutter, 34°) i DK 168954 B1 53 et rystevandbad til polymerisation af tubulinet. Efter polymerisation bringes rørene i ligevægt og centrifugeres ved 100.000 g (1 time ved 27°) i en forvarmet centrifuge. Præhastighedspelleten resuspenderes i V/4 ml 5 BB-puffer, og præparatet omrøres på is i 30 minutter og centrifugeres ved 100.000 g (1 time ved 4°) til fjernelse af de kuldestabile mikrotubuli. En ligeså stor volumen BB2G-puffer sættes til supernatanten, som fryses hurtigt i 5 ml prøver i plastvejeskåle, der flyder 10 på en fast C02/ethanol-opslemning og opbevares natten over ved -80°. Efter ca. 18 timer optøs de frosne tubu-linprøver, lQmM GTP i H20 tilsættes til opnåelse af en slutkoncentration på ImM, og det nye volumen (Wml) måles. Polymerisations/depolymerisationscyclusen genta-15 ges nøjagtigt som ovenfor men under indsættelse af W i stedet for V til opnåelse af tubulin udsat for to cy-clusser.

2. Turbidimetrisk assay for tubulinpolymerisation 20 Apparatur: registrerende spektrofotometer med en 6- stilling, termostateret cuvetteholder; fuld skalaudslag = 0,2 absorbanceenheder.

I en lmi spektrofotometer cyvette blandes 100 μΐ 25 lOmM GTP (li-salt) i en BB-puffer, 10 μΐ H20 eller DMSO (afhængigt af det valgte medikamentopløsningsmiddel), BB-puffer og tubulinpræparat, således at slutstigningen i A350nm er 0,15 enheder efter 16 minutter (ca. 100 μΐ tubulinpræparat eller 2,5 mg protein) i et slutvolumen 30' på 1 ml 37°. Alle reagenser opbevares på is.

Polymerisation startes ved hævelse af temperaturen til 37°, og forøgelsen i A350nm tredobbeltprøver i forhold til en referencecuverte registreres. Referenceprøven indeholder en lignende inkubationsblanding enten 35 uden tubulin eller med tilsætning af 1 mM Ca2+. Forøgelsen i forhold til start-A350nrn 10 minutter efter DK 168954 B1 54 afslutningen af log-fasen (kontrolpolymerisation er 80% færdig inden for dette tidsrum) beregnes og udtrykkes som en procentdel af kontrolværdien for et interval af medikamentkoncentration. Den medikamentkoncentra-5 tion, der er nødvendig til opnåelse af en 50%'s ændring (IC50) af kontrolværdien bestemmes.

Resultater 10 TABEL 1

Forbindelse ifølge Total tubulinpolymerisation

Ex. nr. IC50 (JJin) 1 0 742 15 2 0,14 3 0,41 4 0,37 5 0,49 7 0,52 20 8 0,23 9 0,89 11 4,24 12 1,21 25 B) P338D-,-Koloni-dannelsesassav Fremgangsmåde:

Ved denne assay udsættes celler fra en in vitro tilpasset linie af muselymfoid neoplasma, P388, først 30 for en fortyndings række af testforbindelse i løbet af en 24 timers periode i kultur. Derefter bestemmes evnen af således behandlede celler til at danne diskrete kolonier i løbet af en 14 dages periode efter resuspension i et halvfast, medikamentfrit medium.

35 Først udplattes celler i logaritmisk vægtfase i individuelle 25 cm^ vævskulturkobler, der hver indehol- DK 168954 B1 55 der et slutvolumen af 5 ml hepes på puf ret RPMI 1640-kulturmedium tilsat 10% kalvefosterserum, antibiotika og testforbindelse. Alle forbindelser formuleres indledningsvist til de rette koncentrationer i DMSO, hvo-5 raf 25 μΐ sættes til hver kolbe. Alle forbindelser bedømmes ved koncentrationer, der varierer i en serie med en 4 ganges formindskelse hver gang fra en maksimal koncentration, der er ca. 4 gange større end den koncentration, som i forvejen vides at inhibere prolifera-10 tionen af disse celler med ca. 80-90% ved en primær prolifarationsassav.

Efter 24 timers udsættelse for testforbindelsen tælles cellerne, og et antal af levende celler overføres til et 15 ml centrifugerør, til hvilket 4 ml er en 15 0,25% lavtemperaturgelerende agaroseopløsning i fuldstændigt RPMI-vævskulturmedium sættes. Efter 13 dages inkubation ved 37° sættes 1% p-iodnitrotetrazoliumvio-let til toppen af hvert rør, og det lades permeere gennem agarosen i yderligere 24-48 timer. Dette farvestof 20 metaboliseres af de levende celler til dannelse af et uopløseligt, rødt, krystallinsk produkt, der letter tællingen af kolonierne. Prøver udtages fra hvert rør, og antallet af kolonier indeholdende mindst 50 celler bestemmes. Den koncentration af en forbindelse der er 25 nødvendig til at inhibere koionidannelse med 50% i forhold til kolonidannelsen for kontrolceiler inkuberer under samme betingelser med uden tilstedeværelse af testforbindelse, bestemmes.

Resultater: 56 DK 168954 B1 TABEL 2 P388 D1-Kolonidannelsesassay 5 Forbindelse ifølge Eksempel nr. IC50 (M) 1 1,32 x 10_8 2 5,16 x 10"10 3 2,15 x 10~9 4 5,12 X 10-9 10 5 1,26 x 10“8 7 6,34 x 10"9 8 2,93 x 10-9 11 4,10 x 10"8 15 C. Lymfocyt-leukæmia P388/0-test

Fremgangsmåde CD2-Ffi mus af samme køn, hvis vægt ligger inden for 3-grams interval omkring 20 g, anvendes til denne 20 test. Kontrol- og testdyr injiseres intraperitonalt med en suspension af 106-levende P388/0-tumorceller på dag 0. Ved hver test bedømmes flere dosisniveauer, der omkranser hD2ø-værdien for forbindelserne. Hver dosisni-veaugruppe indeholder 6 dyr. Testforbindelserne præpa-25 reres enten i fysiologisk saltopløsning indeholdende 0,05% Tween® 80 eller destilleret vand indeholdende 5% dextroxe og administreres intraperitonalt på dag 1, 5 og 9 efter tumorinplantation. Dødsdagen for hvert dyr registreres, og dødsdagmedianen identificeret for hver 30 gruppe. Forskellen mellem overlevelsestidsmedianen for behandlede grupper og kontrolgrupper udtrykkes som en procentvis forøgelse af levetiden (%ILS).

DK 168954 Bl

Resultater 57 TABEL 3

Lymfocyt-Leukæmia P388/0-Test 5 Forbindelse ifølge Dosis (mg/kg) %ILS 30.dag 60.dag Eksempel nr. overle- overle vende vende 1 10 300 6/6 2/6 2 7,3 31 10 3 50 136 4 20 44 5 150 61 7 5 111 8 10 44 15 9 200 180 11 675 155 1/6 0/6 12 675 170 26 300 263 32 750 280 1/6 20 33 200 240 3/6 (dag 51) D LD2q (Mus) 25 Fremgangsmåde

Testforbindelser præpareres som beskrevet under lymfocyt-leukemia ?388/0-testen (C) og administreres intraperitonalt i forskellige doser til grupper af 6 CD2-F1-mus af samme køn vejende 20+3g, på dag 1, 5 og 30 9. Musene observeres i indtil 14 dage (fra dag 1), antallet af døde i hver gruppe registreres, og 1Ί>20~ν$Γ“ dien bestemmes.

35

Resultater 58 DK 168954 B1 TABEL 4

Forbindelse ifølge

Eksempel nr. LD2q-(nu;/]tg) 5 1 20-30 2 5 3 200 4 20- 5 140 10 7 15 8 15 9 450 11 >450 12 >450 15 26 450 31 165 32 >450 E. virknina mod medikamentresistente tumorer -* - 20 Under anvendelse af samme fremgangsmåde som ved lymfocyt-leukaemia P388/0-testen bedømtes forbindelsen ifølge Eksempel 1 over for P388/0-tumorer der var gjort resistente over for de følgende klinisk anvendte stan-dardantitumormidler: 25 bis-chlornitrosourinstof (BCNU) cyclophosphamid (CPA) adriamvcin (ADR) actinomycin D (ActD) methotrexat (MTX) 30 5-fluoruracil (5FU)

Cis-platin (Cis-Pt)

Vineristin (VCR)

Amsacrin (AMSA) 35

Resultater: 59 DK 168954 B1 TABEL 5

In vivo-aktivitet af forbindelsen ifølge Eksempel l 5

Tumor/Resistens Forbindelse Optimal %ILS 60.dag overle-

Dose(mq/kq) vende 10 P388/BCNU Eks.1 7,5 +131 0/6 BCNU 2,0 +36 0/6 P388/Cis-Pt Eks.l 10,0 +50 1/6

CiS-Pt 5,3 +21 0/6 15 P388/AMSA Eks.l 5,0 +134 4/6 (dag 31) P 3 8 8/ADR Eks.l 10,0 +90 0/6 20 ADR 4,5 +27 0/6 P388/MTX Eks.l 7,5 +100 1/6 MTX 3,0 +15 0/6 25 P388/ActD Eks.l 12,5 +109 1/6 ' ActD 0,5 +27 0/6 P388/CPA Eks.l 12,5 +150 1/6 CPA 265,0 +55 0/6 30' P388/VDR Eks.l 12,5 +145 3/6 VCR 1,5 +36 0/6 P388/5FU Eks.l 10,0 +92 0/6 35 ActD 0,5 +27 0/6 DK 168954 B1

bO

F. In vitro-virkninq mod humane tumorcellelinier Fremgangsmåde 5 Celler af de humane tumorcellelinier DLD-1, HCT- 116, wiDr og A549 udsættes for fortyndingsrækker af testforbindelser i løbet af 96 timer i kultur. Sådanne cellers evne til proliferation i løbet af testperioden bestemmes.

10 Celler i logvækstfase udplattes i 96 brøndes vævskulturplader i 100 μΐ/brønd af RPMI 1640-kulturmedium tilsat 10% kalvefosterserum, antibiotika og testforbindelse. Alle forbindelser formuleres indledningsvist til passende koncentrationer i DMSO, slutkoncen-15 trationerne i dette opløsningsmiddel er 20 gange dem, der kræves i pladen. En endelig 1 til 10 fortynding i fuldstændigt medium laves derfor inden tilsætning af 100 μΐ til hver brønd af pladen. Alle forbindelser bedømmes ved koncentrationer, der varierer i en serie med 20 4 ganges formindskelse hver gang fra en maksimal koncentration, der er ca. 4 gange større end den koncentration, der i forvejen vides at inhibere prolifera-tionen af celler fra muselymfoidneoplasmaet, P388D1, med ca. 80-90% ved en primær proliferationsassav.

25 Efter 96 timer sammenlignes proliferationen af celler udsat for testforbindelsen med ubehandlede kontrolceller ved en af to metoder: a) Kultursupernatanter suges bort og celler fikseres 30- og farves ved tilsætning af en methylenblåopløsning (5 g/1 50% ethanol:vand, 100 μΐ/brønd). Efter 30 minutter ved stuetemperatur vaskes ubundet farvestof bort ved neddvpning af pladerne i vand. Farvede celler solubili-seres natten over ved anvendelse af 1% Sarkosvl (Sigma) 35 i phosphatpufret saltopløsning (100 μΐ/brønd). Absor-banser aflæses med et Elisa-pladespektrofotometer ved DK 168954 B1 61 en bølgelængde på 620 nm. iCgg-værdien defineres som den koncentration af medikament, der sænker absorbansen til 50% af absorbansen i kontrolkulturer (medikamentfrie) . Denne fremgangsmåde anvendes for DLD-l-celleli-5 nien.

b) 20 μΐ MTT (5 mg/ml i PBS) sættes til hver brønd. Efter en inkubationsperiode på 4 timer bortsuges mediet fra hver brønd og udskiftes med 200 μΐ DMSO til opløs-10 ning af de dannede formazankrystaller. Absorbanser aflæses med et Elisa-pladespektrofotometer ved en bølgelængde på 540nm. IC50-værdien defineres som den koncentration af medikament, der sænker absorbansen til 50% af absorbansen for kontrolkulturer (medikament-15 frie). Denne fremgangsmåde anvendes for WiDr-HCT-116-og A549-cellelinierne.

Tabel 6

In vitro-virkninq mod humane tumorcellelinier 20 Forbindelse IC50(yM)xl0~3

Eks.l nr. DLD-1(a) WiDr(b) HCT-116 A549(b) 1 11,60 30,00 9,20 23,97 2 2,90 4,57 2,80 3,42 3 1,35 0,92 1,91 1,92 25 4 6,63 10,98 5,45 20,81 5 7,34 3,65 3,30 4,36 7 5,92 19,70 8,25 22,40 8 8,82 41,00 20,52 38,96 30 G. In vivo-virkning af forbindelsen ifølge Eksempel 1 mod murine tumorer

Under anvendelse af samme fremgangsmåde som under lymfocyt-leukaemia P388/0-testen bedømtes forbindelsen ifølge Eksempel 1 mod de murine tumorer B16, L1210 og 35 M5076. En suspension af 106 tumorceller implanteres in-traperitonealt i kontrol -og testdyr på dag 0. Bl6-tu- 62 DK 168954 B1 morceller administreres intraperitonalt som en 1:10 homogenat af celler på dag 0. Testforbindelsen administreres intraperitonealt på dag l, 5 og 9. ved B16- og M5076-testene er der 10 mus pr. behandlet gruppe, og 5 ved LI210 er der 6 mus pr. behandlet gruppe. Dødsdagen for hvert dyr registreres, og %ILS (procentvis forlængelse af levetiden) beregnes. Resultaterne er givet i Tabel 7.

10 Tabel 7

In vivo-virkninq mod murine tumorer Tumor Dosis Middel % ILS Antal forsøg (mg/kg) ( + SEM) M5076 5 28 1 15 L1210 10 134 (+72) 2 B16 5 69 (+4) 3

Formuleringseksempler

20 A. TABLETTER

Forbindelse med formlen I (som hvdrochlorid) 100,0 mg

Prægelatineret majsstivelse 60,0 mg

Natriumstivelsesglycolat 20,0 mg

Magnesiumstearat 4,0 mg 25

Forbindelsen med formlen (I) formales fint og blandes indgående med de pulveriserede excipienter, prægelatineret majsstivele og natriumstivelsesglycolat. Pulverne befugtes med renset vand til dannelse af et 30 granulat. Granulatet tørres og blandes med magnesiumstearat. Formuleringen presses dernæst til tabletter, der hver vejer ca. 184 mg.

35 DK 168954 B1 63

B. TABLETTER

Forbindelse med formlen (I) 100,0 mg

Natriumstivelsesglycolat 20,0 mg

Lactose 83,8 mg 5 Magnesiumstearat 4,2 mg

Polyvinylpyrrolidon 14,0 mg

Forbindelsen med formlen (I) formales fint og blandes indgående med de pulveriserede excipienter, na-10 triumstivelsesglycolat og lactose. Pulveret befugtes med en opløsning af polyvinylpyrrolidon opløst i renset vand og denatureret alkohol til dannelse af et granulat. Granulatet tørres og blandes med magnesiumstearat. Formuleringen presses dernæst til tabletter der hver 15 vejer ca. 222 mg.

C. KAPSLER

Forbindelse med (I) 100,0 mg

Majsstivelse 50,0 mg 20 Magnesiumstearat 3,0 mg

Den findelse forbindelse med formlen (I) blandes med pulveriseret majsstivelse. Det tørrede pulver blandes med magnesiumstearat og fyldes i gelatinekapsler 25 med hård skal.

D. SUSPENSION

Forbindelse med formlen (I) 100,0 mg

Dispergerbar cellulose 100,0 mg 30 Glyceol 500,0 mg

Sucrose 3.500,0 mg

Aromatiseringsmiddel q.s.

Farvemiddel q.s

Konserveringsmiddel 0,1% 35 Renset vand q.s. til 5,0 ml DK 168954 B1 64

Forbindelsen med formlen (I) suspenderes i glyce-rolet og en del af det rensede vand. Sucrose og konserveringsmiddel opløses i en anden del af varmt, renset vand, og dernæst tilsættes og opløses farvestoffet, 5 hvorefter det dispergerbare cellulose tilsættes. De 2 præparater blandes og afkøles inden aromatiseringsmid-let tilsættes. Renset vand tilsættes til slutvolumerne.

Den resulterende suspension blandes omhyggeligt.

10 E. PRÆPARAT Til IV INJEKTION

Forbindelse med formlen (I) 5,0 mg

Saltsyre efter behov til pH-indstilling

Vand til injektionsformål q.s. til 10 ml 15

Forbindelsen med formlen (I) sættes til en portion af vandet til injektionsformål. pH-værdien indstilles med saltsyre til opløsning af forbindelsen.

Vand til injektionsformål tilsættes til slutvolumet, og 20 opløsning er fuldstændig efter indgående blanding. Opløsningen steriliseres ved filtrering gennem et 0,22 μΐΐΐ-membranfilter og fyldes aseptisk i sterile 10 ml ampuller eller hætteglas.

Claims (14)

15 R1 betegner phenyl, naphthyl, thienyl, furyl eller py-ridyl, der hver eventuelt er substitueret med 1-4 sub-stituenter udvalgt blandt C1-6-alkyl, C1_4-alkoxy (der eventuelt er substitueret med C-j__2-alkoxy eller alkoxy-C1_2-alkoxy), halogen, amino, mono- eller di-20 C1_4-alkylamino og phenyl; eller R1 betegner C-^Q-al-kyl, C2_10-alkenyl, C3_10-cycloalkyl eller C3_10-cyclo-alkenyl, der hver eventuelt er substitueret med halogen, Cj^-aikoxy, hydroxy eller C1_4~halogenalkyl; R2 betegner C^·. g-alkyl, c2_io-alkenyl, c2-10~al^_ 25 nyl, Cn_10-cycloaikyl eller C3_:LQ-cycloalkenyl, der hver eventuelt er substitueret med halogen, alkoxy, amino, mono- eller di-C1_4-alkvlamino, eller Ci_4-halogenaikyi, eller R2 betegner phenyl, naphthyl eller morpholinoethyl, der hver eventuelt er substitue-30 ret med substituenter som defineret for de øvrige R -grupper. R3 betegner et hydrogenatom eller en _4-aikylgruppe, og enten betegner X oxygen eller svovl, og 35 Y betegner en -CHo- eller -CH2CH2-gruppe, eller DK 168954 B1 66 X-Y betegner sammen gruppen -CH=CH-; eller salte og fysiologisk funktionelle derivater der af.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendeteg net ved, at R1 betegner phenyl, naphthyl, thienyl, furyl eller pyridyl, der hver eventuelt er substitueret som angivet, eller R1 betegner C3_g-alkyl.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, kende-lOtegnet ved, at R^ betegner phenyl eller eventuelt substitueret C1_4-alkyl.

4. Forbindelse ifølge et vilkårligt af kravene l til 3, kendetegnet ved, at R^ betegner hydrogen eller methyl.

5. Forbindelse ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, at Y betegner -CH2-, og X betegner oxygen eller svovl, eller gruppen Y-X betegner -CH=CH-.

6. Forbindelse ifølge krav 1, kendeteg-20 n e t ved, at den er udvalgt blandt: methyl"N-[6-(3,4,5-crimethoxybenzyloxy)imidazo[ 1,2-b]pyridazin-2-yl] carbamat , methyl-N- [ 6- (3,5 -dimethoxybenzyloxy) imidazo[ 1,2-b]pyridazin-2-yl] 25 carbamat , methyl-N-[6 (2,5- dimethoxybenzyloxy)imidazo[ 1,2-bjpyridazin-2-yl] carbamat , • methyl-N- [6 - (1-nap'nthylmechyloxy) imidazo [ 1,2-b]pyridazin-2-yl] ^ carbamat , methyl-N - (6 -(3-methylbenzyloxy) imidazo [ 1,2-b]pyridazin-2-yl]carbamate, methyl-N - [6 - (2,3 - dime thoxybenzyloxy) imidazo i 1,2-b j pyridazin-2-yl] 3£ carbamat , methyl-N - [6-(2,5 -dime thylbenzv loxy) imidazo i 1,2 -b; pyridazin- 2 -yl ] carbamat , DK 168954 B1 67 ethyl-ϋ'[6-(2,5-dimethoxybenzyloxy)imidazoi1,2-b]pyridazin-2-yl] carbaraat,. ^ ethyl- [6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl] carbamat. methyl-fi-methyl-E-(6*(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazo(1,2-b] pyridazin-2-yl]carbamat, 10 methyl-fi-[6-(2-brom -3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b] pyr idaz in- 2 -y 1 ] carbamat., n - propyl -N -.(16 · (3,4,5 - tr ime thoxybenzy loxy) imidazo [ 1,2-b] pyridazin- 2-yl]carbamate, og 15 n-butyl H-[6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)imidazo[1,2- b]pyridazin-2-yl]carbaraatf 2-methoxyethyl N-[6-(3,4,5-trimethoxybenzyloxy)J.midazo(1,2-b] 2g pyridazin-2-yl]carbamat, methyl_N-(6-(3,5-dimethoxy-4-e thoxybenzyloxy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]carbamat,. 25 og fysiologisk funktionelle derivater deraf.

7. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer derfor.

8. Forbindelse ifølge krav 1 til anvendelse som 30 et antitumormiddel.

9. Anvendelse af en forbindelse ifølge krav 1 til fremstilling af et lægemiddel til behandling af tumo rer.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbin-35 delse med den almene formel (I), kendetegnet ved, at den omfatter: 68 DK 168954 B1 (A) omsætning af et pyridazinderivat med den almene formel (II) 5 /^\ R/'-'Y-X-/)- (II) \ —N / 10 (hvori R1 og x og Y er som defineret i krav 1) med en forbindelse med den almene formel (III): R3

15 ZCH2C0NC02R2 (III) (hvori R2 og R3 er som defineret i krav l, og z betegner et halogenatom), (B) omsætning af et pyridazinderivat med den almene 20 formel (IV) R3 i vJ p (iv) 21-1 I /-"-co2r2 25 (hvori R2 og R3 er som defineret i krav i, og Z1 betegner en afgående gruppe) med en forbindelse med den almene formel (V) 30 R1CH2X1H (V) (hvori R1 er som defineret i krav 1, og X1 betegner oxygen eller svovl), 35 (C) omsætning af en forbindelse med formlen (VI) _ _\ __________ "* 69 DK 168954 B1 fYK-X (hvori E1, X og ! er som defineret i krav 1), med en passende alkohol, R2OH (hvori R2 er som defineret i krav 1), 10 (D) omsætning af en forbindelse med formlen (VII) />-m 15 _Y ~X_ (VII) (hvori R1, X og ! er som defineret i krav 1), med et reagens, hvis funktion er at indføre gruppen -C02R2 20 (hvori R2 er som defineret i krav 1), (E) omdannelse af en forbindelse med formlen (I) til en anden forbindelse med formlen (I), om ønsket og/eller passende efterfulgt af saltdannelse.

11. Mellemprodukter kendetegnet ved, 25 at de har de i krav 11 definerede formler (II), (IV), (VI) eller (VII), eller har formlerne (VIII), (IX) eller (X): , f~\ 30 2 -// \)- NH, (hvori Z 1 er en afgående gruppe), 35 DK 168954 B1 70 O /y

5 RX^=CH—L* (IX) 10 (hvori R1 er som defineret i krav 1), 1 (X)

15 B— (hvori R1 er som defineret i krav 1).