CZ20003995A3 - Polyol and interferon-beta conjugate - Google Patents

Polyol and interferon-beta conjugate Download PDF

Info

Publication number
CZ20003995A3
CZ20003995A3 CZ20003995A CZ20003995A CZ20003995A3 CZ 20003995 A3 CZ20003995 A3 CZ 20003995A3 CZ 20003995 A CZ20003995 A CZ 20003995A CZ 20003995 A CZ20003995 A CZ 20003995A CZ 20003995 A3 CZ20003995 A3 CZ 20003995A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
peg
beta
polyol
interferon
group
Prior art date
Application number
CZ20003995A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298579B6 (cs
Inventor
Tayar Nabil El
Michael J Roberts
Milton Harris
Wayne Sawlivich
Original Assignee
Applied Research Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems filed Critical Applied Research Systems
Publication of CZ20003995A3 publication Critical patent/CZ20003995A3/cs
Publication of CZ298579B6 publication Critical patent/CZ298579B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká konjugátů polyolu a interferonu-beta, v nichž polyolová jednotka vázána na zbytek cysteinu v poloze 17, Cys17. Vynález se dále týká způsobu výroby těchto konjugátů s polyolovou jednotkou, uloženou specificky v určité poloze a použití těchto konjugátů k léčebným účelům nebo k diagnostice bakteriálních infekcí, virových infekcí, autoimunitních poruch a zánětlivých onemocnění. Vynález se rovněž týká způsobu postupné vazby dvou nebo většího počtu polyethylenglykolových skupin na polypeptid.
Dosavadní stav techniky
Interferon z lidských fibroblastů, IFN-beta, má protivírovou účinnost a může také stimulovat přirozené buňky zabiječe proti nádorovým buňkám. Jde o polypeptid s molekulovou hmotností přibližně 20 000, jehož tvorba je vyvolávána přítomností virů a RNA s dvojitým řetězcem. Z nukleotidové sekvence genu pro interferon z fibroblastů, klonovaný rekombinantní technologií DNA odvodili Derynk a další v Nátuře, 285, 542-547, 1980 úplnou sekvenci aminokyselin této bílkoviny, která obsahuje 166 zbytků aminokyselin.
V publikaci Shepard a další, Nátuře, 294, 563-565, 1981 se popisuje mutace na bázi v poloze 842 (Cys-Tyr v poloze 141), při níž dochází k vymizení protivirové účinnosti a variantního klonu, z nějž byla vypuštěna sekvence nukleotidů 1119-1121.
V publikaci Mark a další, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 81(18): 5662-5666, 1984 se popisuje vytvoření umělé mutace tak, že se baze T v poloze 469 nahradí baží A, čímž dojde k záměně aminokyseliny Cys za Ser v poloze 17. Popisuje se, že výsledný IFN-beta je stejně účinný jako přirozený IFN-beta a mimo to je stálý při dlouhodobém skladování při teplotě -70 °C.
Kovalentní vazba hydrofilního polymeru polyethylenglykolu, PEG, známého také jako polyethylenoxid, PEO na různé molekuly, má důležité použití v biotechnologii a v lékařství. Ve své nejběžnější formě je PEG lineární polymer, který má na každém svém konci hydroxylovou skupinu
HO-CH2CH2O (CH2CH2O) nCH2CH2-OH
Tento vzorec je možno vyjádřit kratším způsobem jako HO-PEG-OH, kde -PEG- znamená kostru polymeru bez jeho koncových skupin. -PEG- tedy znamená
-CH2CH2O (CH2CH2O) nCH2CH2-.
PEG se běžné užívá jako methoxy-PEG-OH (m-PEG), přičemž na jednom konci této látky se nachází poměrně inertní methoxyskupina, kdežto druhý konec tvoří hydroxylová skupina, která je snadno chemicky modifikována
CH3O- (CH2CH2O) nCH2CH2-OH.
Běžně se užívají také rozvětvené typy PEG. Tyto látky je možno vyjádřit vzorcem R(-PEG-OH)m, kde R znamená centrální skupinu, například pentaerythritol nebo glycerol a m znamená počet rozvětvení. Symbol m může mít • ·
hodnotu 3 až 100 nebo i více. I v tomto případě hydroxylové skupiny snadno podléhají chemické modifikaci.
Další rozvětvená forma byla popsána v dokumentu WO 96/21469 a má jediné zakončení, podléhající chemické modifikaci. Tento typ PEG je možno vyjádřit vzorcem (CH3O-PEG-) pR-X, kde p znamená 2 nebo 3, R znamená centrální skupinu, například zbytek lysinu nebo glycerolu a X znamená funkční skupinu, například karboxylovou skupinu, která se snadno podrobí chemické aktivaci. Ještě další rozvětvená forma obsahuje reaktivní skupiny, například karboxylové skupiny v průběhu řetězce PEG spíše než na jeho konci.
Kromě uvedených forem PEG je možno polymer také připravit tak, aby v řetězci obsahoval slabé nebo degradovatelné vazby. Například v US patentové přihlášce 06/026716 (Harris) se uvádí, že PEG je možno připravit s esterovými vazbami v polymerním řetězci, přičemž tyto vazby je možno hydrolyzovat. Hydrolýzou se polymer rozštěpí na fragmenty s nižší molekulovou hmotností podle reakčního schématu -PEG-CO2-PEG- + H2O —> -PEG-CO2H + + HO-PEG-.
V průběhu přihlášky vynálezu se pod pojmem polyethylenglykol nebo PEG rozumí kterákoliv ze svrchu popsaných forem.
Kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu jsou chemicky blízce příbuzné PEG a je možno je použít v řadě použití místo PEG. Tyto látky je možno vyjádřit obecným vzorcem HO-CH2-CHRO (CH2CHRO) nCH2CHR-OH, • · · ·
kde R znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu.
PEG je užitečný polymer, který je vysoce rozpustný ve vodě a také v celé řadě organických rozpouštědel. Je netoxický a nevyvolává reakci imunitního systému. V případě vazby PEG chemickým způsobem na sloučeninu, nerozpustnou ve vodě, je výsledný konjugát obvykle rozpustný ve vodě a také v řadě organických rozpouštědel.
Konjugáty PEG a proteinů jsou v současné době běžně užívány při náhradě bílkovin a pro další léčebná použití. Například polyethylenglykolovaná adenosíndeamináza, například ve formě prostředku AdagenR se užívá k léčení závažných kombinovaných onemocnění s imunodeficiencí, jako SCIDS, polyethylenglykolovaná L-aspargináza, například OncapsparR se užívá k léčení akutní lymfoblastické leukemie ALL a polyethylenglykolovaný ínterferon-alfa, například Intron(R) A se v současné době nachází ve stadiu klinických zkoušek fáze III pro léčení hepatitidy C.
Shrnutí poznatků o konjugátech PEG a proteinech s klinickým účinkem je možno nalézt v publikaci N. L. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15, 210-218, 1994.
Pro polyethylenglykolaci proteinů byla vyvinuta řada postupů. Vazbu PEG na reaktivní skupiny proteinu je možno typicky uskutečnit s využitím elektrofilně aktivovaných derivátů PEG. Vazba PEG na alfa- a epsilon-aminoskupiny lysinových zbytků a N-zakončení má za následek vznik konjugátu, tvořeného směsí produktů.
<♦ · · • · ·
9 99 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 · 9 9 9 ·
Obvykle je takový konjugát tvořen skupinou několika molekul PEG, vázaných na molekulu proteinu, směs může obsahovat proteiny, zcela prosté PEG až proteiny, v nichž je PEG vázán na každou aminoskupinu. V molekule proteinu s jednoduchou modifikací může být PEG vázán na zbytky aminokyseliny v různých polohách.
Tímto typem nespecifické polyethylenglykolace vzniká řada konjugátů, které jsou téměř neaktivní. Snížení aktivity je obvykle vyvoláno zastíněním aktivní vazné domény bílkovině, k tomu dochází například v případě řady cytokinů a protilátek. Například v publikaci Katre a další, US 4766106 a US 4917888 se popisuje polyethylenglykolace IFN-beta a IL-2 při použití velkého přebytku methoxypolyethylenglykoly1-N-succinimidylglutarátu a methoxypolyethylenglykolyl-N-succinimidylsukcinátu. Obě bílkoviny byly produkovány v mikrobiálních hostitelských buňkách, což umožnilo specifické mutace volného cysteinu na serin. Tato mutace byla potřebná pro mikrobiální expresi IFN-beta. IFN-beta, použitý při těchto pokusech byl běžně dodávaný
BetaseronR, v němž byl zbytek cysteinu v poloze 17 nahrazen zbytkem šeřinu. Nepřítomnost glykosylace snížila rozpustnost této látky ve vodném roztoku. Při nespecifické polyethylenglykolaci sice došlo ke zvýšení rozpustnosti, hlavní problém však spočíval ve snížené účinnosti a v nízkém výtěžku.
V evropském patentovém spisu EP 593868, který se týká konjugátu PEG a interferonu, se popisuje příprava konjugátů typu PEG-IFN-alfa. Avšak polyethylenglykolace je v tomto případě nespecifická, takže vzniká směs polohových izomerů těchto konjugátů, podobná situace je ·· · · « · 9 · • · · ♦ · · · ···· • · ·· ··« · · · • · · · <· · · ··· · · ···· · · ♦ · ·· · g ·· ·· ·· ·· ·· ··· popsána také v publikaci Monkarsh a další, ACS Symp.
Ser., 680, 207-216, 1997.
V EP 675201 (Kinstler a další) se popisuje selektivní modifikace N-terminálního zbytku faktoru pro růst a vývoj megakaryocytů, MGDF při použití mPEG-propionaldehydu. Tímto způsobem bylo možno dosáhnout reprodukovatelné polyethylenglykolace a farmakokinetiky v každé další šarži. V US 5711944 (Gilbert a další) se prokazuje, že je možno dosáhnout polyethylenglykolace IFN-alfa s optimální úrovní účinnosti. V tomto případě však bylo zapotřebí provést pracné čištění pro získání optimálního konjugátu.
Většina cytokinů i dalších bílkovin nemá specifické místo pro spojení s PEG a je tedy pravděpodobné, že vždy budou vznikat různé isomery, které budou zčásti nebo zcela neúčinné, takže dojde ke ztrátě účinnosti celé výsledné směsi.
Bylo by tedy zapotřebí dosáhnout monopolyethylenglykolace bílkovin, která by byla specifická pro určité místo proteinu a tímto způsobem připravit účinné konjugáty.
V publikaci Woghiren a další, Biokonjugate Chem., 4(5): 314-318, 1993 se popisuje syntéza thiolselektivního PEG derivátu pro tento způsob polyethylenglykolace, specifické pro určité místo v proteinu. Bylo prokázáno, že stálý derivát PEG s thiolovou ochrannou skupinou ve formě p-pyridyldisulfidové reaktivní skupiny se specificky váže na volné cysteinové zbytky v proteinu papainu. Nově vytvořená disulfidová vazba mezi papaínem a ·· ·· β· ··*· »* · ···· · · · · · · · • · ·· ··· · · · • · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9
PEG může být rozštěpena za mírných redukčních podmínek, čímž se regeneruje přírodní protein.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří konjugát polyolu a interferonu-beta, v němž je polyolová skupina kovalentně vázána na zbytek cysteinu v poloze 17, Cys17. Specifické konjugace se dosahuje tak, že se nechá reagovat polyol, obsahující thiolové reaktivní skupiny se zbytkem Cys17 v interferonu-beta. Předpokládá se, že konjugáty tohoto typu budou mít in vivo zvýšenou účinnost. Cílem je také dosáhnout zvýšené rozpustnosti při neutrálním pH, zvýšené stálosti s menší tendencí ke tvorbě shluků, snížené tendence vyvolávat reakci imunitního systému, přičemž by současně nemělo docházet ke ztrátě účinnosti ve srovnání s přirozeným IFN-beta. V případě těchto konjugátů by bylo možno snížit počet dávek k dosažení téhož účinku, současně by byla zjednodušená příprava stabilních farmaceutických prostředků a pravděpodobně by bylo možno dosáhnout prodlouženého účinku.
Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob postupné vazby skupin PEG na polypeptid.
Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.
9 99 ·« 9 • 999 ·· · 999
9· 99 999 99
99 999 9 499 4 • 9·· 9949 · ·
49 9 9 99 9 9 ·
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněn graf konjugátu PEG a IFN-beta před čištěním při použití kapilární elektroforézy CE.
Na obr. 2A až 2C je znázorněno čištění uvedeného konjugátu chromatografií na prostředku Superose 12, obr. 2A znázorňuje situaci po prvním průchodu, obr. 2B situaci po druhém průchodu a obr. 2C situaci po třetím průchodu.
Na obr. 3 je znázorněna chromatografie čištěného konjugátu PEG-IFN-beta po třetím průchodu chromatografickým sloupcem pomocí SDS-PAGE. Dráhy 1 a 4 jsou standardy pro molekulovou hmotnost proteinu, dráha 2 je dráha pro přírodní IFN-beta a v dráze 3 se nachází konjugát PEG-IFN-beta.
Na obr. 4 je uveden graf čištěného konjugátu PEG-IFN-beta, v němž byl IFN-beta polyethylenglykolován při použití mPEG-OPSS5k, při použití kapilární elektroforézy CE.
Na obr. 5 je znázorněno spektrum čištěného konjugátu při prováděné spektrometrie (Maldi).
Na obr. 6 je znázorněno srovnání mezi protivirovým účinkem nativního IFN-beta a konjugátu PEG-IFN-beta.
Buňky WISH byly inkubovány s uvedenými koncentracemi vzorku IFN-beta 24 hodin před uvedením do styku s cytopathickou dávkou viru vesiculární stomatitidy. Cytopatický účinek byl stanoven po dalších 48 hodinách přeměnou MTT.
• · • · · * ···· · · • · · » · · · • · · · ·· · ·· • · · · 0 » · ·♦· · • · · · · · · · · · « · « · » · · · · · ·
Na obr. 7 je znázorněn profil vazby IFN-beta a PEG-IFN při použiti buněk Daudi.
Na obr. 8 je znázorněn farmakokinetický profil IFN-beta a PEG-IFN u myši po nitrožilnim podáni. Přerušovaná čára znamená zkoušku LOQ pro každou standardní křivku.
Na obr. 9 je znázorněn farmakokinetický profil IFN-beta a PEG-IFN u myší při podkožním podání. Přerušovaná čára znázorňuje zkoušku LOQ pro každou standardní křivku.
Vynález je založen na zjištění, že při napojení polyolové skupiny, zvláště PEG skupiny na Cys17 lidského IFN-beta neočekávaně dochází ke zvýšení biologicky účinného IFN-beta ve srovnání s přírodním lidským interferonem-beta nebo alespoň nedochází ke snížení účinnosti.
To znamená, že pří uvedené konjugaci má výsledný konjugát stejnou nebo zvýšenou biologickou účinnost ve srovnání s původním IFN-beta a současně má jiné žádoucí vlastnosti polyolu, například zvýšenou rozpustnost.
Pod pojmem „IFN-beta se v průběhu přihlášky rozumí interferon z lidských fibroblastů, který se získává izolací z biologických tekutin nebo rekombinantní technikou s použitím DNA z prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk a také soli tohoto interferonu, jeho funkční deriváty, prekursory a účinné frakce za předpokladu, že tyto látky obsahují cysteinový zbytek, který se v přírodní formě nachází v poloze 17.
99
9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9999
9
Polyolová skupina v konjugátu polyolu a IFN-beta podle vynálezu může být jakákoliv ve vodě rozpustná mononebo bifunkční polyalkylenoxidová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Typicky je použitím polyolem polyalkylenglykol, jako polyethylenglykol PEG. Je zřejmé, že je možno použít i jiné polyoly, jako polypropylenglykol a také kopolymery polyethylenglykolu a polypropylenglykolu.
V průběhu přihlášky se pod pojmem „skupina PEG rozumí lineární i rozvětvený PEG, methoxy PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelný PEG, PEG s reaktivními skupinami v průběhu řetězce, dendrimer PEG, kopolymery PEG s jedním nebo větším počtem dalších polyolů a také kopolymery PEG a PLGA, to znamená kyselinou polymléčnou a polyglykolovou.
Pod pojmem „soli se v průběhu přihlášky rozumí soli, vytvořené na karboxylové skupině a také soli, vytvořené na aminoskupině. Tyto soli je možno připravit známým způsobem. Soli na karboxylové skupině zahrnují anorganické soli, jako soli sodné, draselné a vápenaté a také soli s organickými bázemi, například s aminy, jako triethanolaminem, argininem nebo lysínem. Soli na aminoskupině zahrnují například soli s anorganickými kyselinami, jako kyselinou chlorovodíkovou a soli s organickými kyselinami, jako kyselinou octovou.
Pod pojmem „funkční deriváty se v průběhu přihlášky rozumí deriváty, které je možno připravit z funkčních skupin na postranních řetězcích aminokyselin nebo na terminálních N- nebo C-koncových skupinách pomocí známých postupů a do rozsahu vynálezu spadají tyto funkční • · 99 · 9 deriváty v případě, že jsou farmaceuticky přijatelné, to znamená, že nenarušují účinnost proteinu a nejsou toxické. Takovými deriváty jsou například estery nebo alifatické amidy karboxylových skupin a N-acylové deriváty volných aminoskupin nebo O-acylové deriváty volných hydroxylových skupin, vytvořené na acylových skupinách, například na alkanoylových nebo aroylových skupinách.
Pod pojmem „prekursory se rozumí sloučeniny, které je možno převést nebo které jsou převáděny na IFN-beta v lidském nebo živočišném organismu.
„Aktivní frakce proteinu jsou podle vynálezu takové fragmenty nebo prekursory polypeptidového řetězce, které jako takové nebo v kombinaci s příbuznými molekulami mají stejnou účinnost jako IFN-beta. Molekuly, použité pro kombinaci mohou být například zbytky cukrů nebo fosfátů nebo může jít o agregáty polypeptidových molekul.
Konjugáty podle vynálezu je možno připravit známými postupy. Podle jednoho z možných provedení vynálezu se IFN-beta nechá reagovat s polyethylenglykolačním činidlem ve vhodném rozpouštědle a požadovaný konjugát se izoluje a čistí, například chromatografickými postupy.
Chromatografickým postupem je jakýkoliv postup, který se užívá k oddělení složek směsi nanesením této směsí na nosič nebo stacionární fázi, kterou protéká jako mobilní fáze rozpouštědlo. Dělící principy chromatografie jsou založeny na odlišné fyzikální povaze stacionární a mobilní fáze.
9
99
9.99 9
9 99
9 9 · • 9 9 9
Některé specifické typy chromatografíckých postupů, které jsou dobře známé z literatury zahrnují kapalinovou chromatografii, vysokotlakou chromatografii, chromatografii na iontoměniči, absorpční chromatografii, chromatografii afinitní, hydrofobní, dělicí, chromatografii v reversní fázi, filtraci na gelu, ultrafiltraci nebo chromatografii na tenké vrstvě.
Pod pojmem „thiolreaktivní polyethylenglykolační činidlo se v průběhu přihlášky rozumí jakýkoliv derivát PEG, schopný reagovat s thiolovou skupinou cysteinového zbytku. Může jít například o PEG, obsahující funkční skupinu ze skupiny orthopyridyldisulfidová skupina, vinylsulfonová, maleímidová, jodacetimidová skupina a podobné skupiny. Podle výhodného provedení vynálezu je polyethylenglykolačním činidlem derivát orthopyridyl disulfidu OPSS s PEG.
Polyethylenglykolační činidlo se užívá ve své monomethoxylované formě, v níž je pro konjugaci k dispozici pouze jedno zakončení nebo v bifunkční formě, kde se konjugace mohou účastnit obě zakončení, může například dojít ke tvorbě konjugátu s dvěma molekulami IFN-beta, kovalentně vázanými na jedinou skupinu PEG. Molekulová hmotnost je s výhodou v rozmezí 500 až 100 000.
Konjugace podle vynálezu typicky probíhá podle následujícího reakčního schématu:
·· · · • * · • · • ·
Protein-SH + mPEG-S_S·
pH<7 mPEG-S-S-Protein
P-men^iptoethanol
Protein-S-H + mPEG-S-H + HOCH2CH2-S-S-CH2CH2OH
Ve druhém řádku svrchu uvedeného schématu se uvádí postup pro rozštěpení vazby mezi PEG a proteinem. Derivát mPEG-OPSS je vysoce selektivní pro volné sulfhydrylové skupiny a rychle reaguje při kyselém pH, při němž je IFN-beta stálý. Vysokou selektivnost je možno prokázat při přeměně konjugátu na nativní formu IFN-beta a PEG.
Bylo prokázáno, že disulfidová vazba, která vzniká mezi proteinem a skupinami PEG je stálá v krevním oběhu, může však být rozrušena v po vstupu do buňky. Předpokládá se proto, že tento konjugát, který do buněk nevstupujebude v oběhu stálý až do svého vyloučení ledvinami.
Je nutno uvést, že svrchu uvedená reakce je specifická pro určité místo, vzhledem k tomu, že ostatní dva cysteinové zbytky, které se nacházejí v polohách 31 a 141 přírodního lidského IFN-beta, nemohou reagovat s použitím polyethylenglykolačním činidlem vzhledem k tomu, že již jsou součástí disulfidových můstků.
Vynález se rovněž týká způsobu postupné vazby dvou nebo většího počtu skupin PEG na polypeptid. Tento postup je založen na zjištění, že aktivovaný PEG s nižší • · *·· · » « · <1 • 9 9 I ·· ·· molekulovou hmotností reaguje úplněji než PEG s vyšší molekulovou hmotností se stericky bráněným reakčním místem na proteinu. Je nutno zajistit, aby nákladné proteiny, užívané k léčebným účelům byly použity ke tvorbě konjugátu s PEG tak, aby se výsledek vyplatil. Mimo to pro snížení glomerulární filtrace a pro optimalizaci farmakologických vlastností výsledného konjugátu PEG a proteinu by měl mít konjugát vhodný rozměr, ekvivalentní proteinu s molekulovou hmotností 70 000. To znamená, že v případě, že se bude vázat pouze jedna skupina PEG, užije se s výhodou derivát PEG s molekulovou hmotností vyšší než 20 000. V případě, že v místě modifikace existuje sterická zábrana, může reaktivní skupina velké skupiny PEG obtížně dosahovat do místa modifikace a výsledky reakce budou neuspokojivé, zejména bude dosaženo nízkých výtěžků. Výhodný způsob polyethylenglykolace polypeptidu podle vynálezu zvyšuje výtěžek polyethylenglykolace, specifické pro určitou polohu tak, že se nejprve naváže malá heterobifunkční nebo homobifunkční skupina PEG, která vzhledem ke svému poměrně malému rozměru může reagovat i v místech se sterickou zábranou. Pak se na tyto malé skupiny mohou navázat velké molekuly derivátů PEG, čímž je možno dosáhnout vysokého výtěžku požadovaného polyethylenglykolovaného proteinu.
Způsob postupného navázání dvou nebo většího počtu skupin PEG na polypeptid podle vynálezu zahrnuje postup, při němž se nejprve naváže na polypeptid heterobifunkční nebo homobifunkční skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností a pak se naváže monofunkční nebo bifunkční skupina PEG na volné zakončení této skupiny, která již j vázána na polypeptid. Tímto způsobem je postupně možno ·· ·«· · • · · · *· · 4 · · · 44 · · · 4 · • 4 · · · · · 4 · 4 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
44 44 44 99 9 navázat na polypeptid dvě nebo větší počet skupin PEG. Polypeptidem je s výhodou IFN-beta, výhodným místem pro vazbu je Cys17, uložený v místě se sterickou zábranou. Výsledný konjugát je možno čistit při použití jednoho nebo většího počtu čisticích postupů, jako jsou chromatografie na iontoměniči, chromatografie na gelu s vyloučením molekul s určitou molekulovou hmotností, hydrofobní interakční chromatografie, afinitní chromatografie a chromatografie v reverzní fázi.
Skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností může být vyjádřena obecným vzorcem
W-CH2CH2O (CH2CH2O) nCH2CH2-X, kde W a X jsou skupiny, které nezávisle reagují s aminoskupinou, sulfhydrylovou skupinou, karboxylovou skupinou nebo hydroxylovou funkční skupinou, čímž dochází k vazbě skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid. W a X se s výhodou nezávisle volí ze skupiny orthopyridyldisulfid, maleimidy, vinylsulfony, iodacedamidy, aminy, thioly, karboxylové skupiny, aktivní estery, benzotriazoluhličitany, p-nitrofenolkarbonáty, isokyanáty a biotin. Skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností mají s výhodou molekulovou hmotnost v rozmezí 100 až 5000.
Monofunkční a bifunkční skupiny PEG pro vazbu na volné zakončení skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností, které jsou již vázány na polypeptid, mají s výhodou molekulovou hmotnost v rozmezí 100 až 200 000, s výhodou jde o methoxy PEG, rozvětvené typy PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelné skupiny PEG, skupiny PEG s reaktivními skupinami v průběhu řetězce
4444
44
4 4 4 4 ·
4 44 4 «
4 4 4 4 4 4
4 4 · 4 4
44 44
4 nebo dendrimery PEG. Monofunkční nebo bifunkční skupiny PEG je možno vyjádřit obecným-vzorcem
Y-CH2CH2O (CH2GH2O) mCH2CH2-Z kde Y je reaktivní skupina pro koncovou skupinu volného zakončení skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností, která již je vázána na polypeptid a Z znamená skupinu OCH3 nebo skupinu, která je reaktivní a může tvořit bifunkční konjugát.
Konjugát PEG a polypeptidu, získaný svrchu uvedeným způsobem postupné vazby dvou nebo většího počtu skupin PEG může být použit při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch, při nichž se jako účinná látka při léčení používá polypeptid.
Součást podstaty vynálezu tvoří také konjugáty v čištěné formě, které jsou vhodné pro použití jako součást farmaceutického prostředku, jako účinná složka pro léčení některých chorob, k diagnostice bakteriálních a virových. infekcí a také autoimunitních onemocnění, zánětlivých chorob a nádorů. Farmaceutický prostředek tohoto typu rovněž tvoří součást podstaty vynálezu.
Jako příklady svrchu uvedených chorob lze uvést zejména septický šok, AIDS, reumatoidní arthritis, lupus erythematosus a roztroušenou sklerózu.
Konjugáty, připravené způsobem podle vynálezu, je tedy možno podávat ve farmakologicky účinném množství nemocným, kteří jsou ohroženi některým ze svrchu uvedených onemocnění, nebo u nichž se již některé z těchto onemocnění vyskytlo.
99
9 9 9
9 99 • 9 9 ·
9 9 9
99 e« e···
9· 9
9 9
9 9
9 9 9
99
Farmaceutické prostředky podle vynálezu je možno podávat jakýmkoliv způsobem, který je kompatibilní s účinnou složkou tohoto prostředku. Výhodné je parenterální podání, například podání podkožní, nitrosvalové nebo nitrožilní. Dávka účinné látky závisí na různých faktorech, zejména na věku, hmotnosti a celkovém stavu nemocného a vždy ji určí ošetřující lékař.
Předpokládá se dávka v rozmezí 10 mikrogramů až 1 mg denně pro nemocného s hmotností 75 kg, výhodná denní dávka se bude pohybovat v rozmezí 20 až 200 mikrogramů.
Farmaceutický prostředek pro parenterální podání může být připraven v injekční formě, která obsahuje účinnou složku a vhodné nosné prostředí. Tato prostředí jsou v oboru známá, jde např. o vodu, fyziologický roztok chloridu sodného, Ringerův roztok a/nebo roztok dextrózy. Nosné prostředí může obsahovat malá množství pomocných látek k udržení stálosti a osmotického tlaku farmaceutického prostředku. Tyto lékové formy se připravují obvyklým způsobem.
Vynález byl svrchu popsán v souvislosti s několika specifickými provedeními, je však zřejmé, že vynález zahrnuje také různé modifikace a obvyklé změny postupů, které by mohl provést každý odborník.
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
• 4 ··<· ·· ·* • » · · • · ·· • · * · • · · · ·« »· ·« • · · · • · • · · · • · · ·· ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava konjugátu PEG-IFN-beta
Modifikace IFN-beta s použitím mPEGsk-OPSS
Pro přípravu konjugátu PEG-IFN-beta byl užit rekombinantní lidský IFN-beta, stálý pří koncentraci 0,37 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,6.
Postup se provádí tak, že se přibližně 1,0 ml 6 M roztoku močoviny přidá ke 2 ml IFN-beta v koncentraci 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 χ 108 mol). Pak se přidá mPEGsk-OPSS v molárním přebytku 50 mol na jeden mol IFN-beta a reakce se nechá probíhat v polypropylenové lahvičce 2 hodiny při teplotě 37 °C nebo 1 hodinu při teplotě 50 °C. Reakční směs se analyzuje pomocí kapilární elektroforézy CE ke zjištění rozsahu tvorby konjugátu PEG-IFN-beta před jakýmkoliv čištěním, jak je znázorněno na obr. 1. Typický výtěžek této reakce je 50 % PEG-IFN-beta. Reakční produkty se z reakční směsi odfiltrují při použití filtru ve formě injekční stříkačky s průměrem 0,22 m a zfiltrovaný roztok se pak nanese na sloupec pro oddělení látek od určité molekulové hmotnosti, náplň sloupce tvoří Superose 12 nebo Superdex 75 (Pharmacia), jako eluční činidlo se užije pufr s obsahem 50 mM fosfátu sodného a 150 mM NaCl o pH 7,0. Na obr. 2A je znázorněn profil eluce při čištění uvedeného konjugátu na sloupci s obsahem prostředku Superose 12. Materiál s obsahem požadovaného konjugátu byl analyzován pomocí SDS-PAGE, jak je znázorněno na obr. 3. Frakce, obsahující uvedený konjugát byly spojeny a koncentrát byl znovu nanesen na obdobný sloupec k dalšímu čištění konjugátu vzhledem k
0000
0 0
0
0 * ·
0 • 0 00
0 0 ·
0 00
0 0 0 · · ·
00
0 0
0 0
0 0 0 0
0 0 0
00 velké blízkosti frakcí s obsahem nativního IFN-beta, jak je znázorněno na obr. 2B. Tento postup byl ještě po třetí opakován k zajištění dostatečné čistoty, jak je znázorněno na obr. 2C. Na obr. 4 a 5 jsou pak znázorněny výsledky kapilární elektroforézy a hmotové spektrum (Maldi) čištěného konjugátu PEG-IFN-beta.
Modifikace IFN-beta s použitím mPEG30K-OPSS
Rekombinantní lidský IFN-beta byl připraven jako stálá látka v roztoku při koncentraci 0,36 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,6. Postup byl prováděn tak, že se přibližně 36 mg mPEG30K-OPSS ve 3 ml deionizované vody přidá ke 3 ml IFN-beta s koncentrací 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4,9 χ 10-8 mol) a reakce probíhala v polypropylenové lahvičce 2 hodiny při teplotě 50 °C. Pak byla reakční směs analyzována na rozsah modifikace pomocí kapilární elektroforézy. Typický výtěžek této reakce je nižší než 30 %. Roztok pak byl nanesen na sloupec s obsahem prostředku Superose 12 (Pharmacia), jako eluční činidlo byl užit pufr s obsahem 5 mM fosfátu sodného a 150 mM NaCl o pH 7,0. Frakce s obsahem konjugátu byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE.
Příklad 2
Biologická účinnost konjugátu
Aby bylo možno stanovit účinky polyethylenglykolace na protivirovou účinnost lidského rekombinantního IFN-beta, byly lidské amniotické buňky WISH předem inkubovány s čerstvě připraveným IFN-beta ze stejné šarže, která byla užita pro polyethylenglykolaci nebo s konjugátem PEG-IFN-beta. Protivirová účinnost byla měřena ·· ·« ·· 4 4 · 4 ·· · ···· · 4 · · · · ·
4 4 4 4 4 4 4 · 4 • · · ··· · ··· · 4
4 4 · 4444 4 · 4
44 44 · 4 44 4·· cytopathickou zkouškou WISH-VSV a byla stanovena na základě antivirového biologického účinku způsobem podle publikace Novick a další, J. Immunol·., 129: 2244-2247, 1982. Při této zkoušce byly užity následující materiály:
- buňky WISH ATCC CCL 25,
- zásobní virus vesikulární stomatitidy, ATCC V-520-001522, skladovaný při -70 °C,
- lidský rekombinantní IFN-beta (InterPharm Laboratories LTD, 32, typ 075, šarže 205035) v množství 82 x 106 IU/ml, specifická účinnost 222 x 106 IU/mg,
- konjugát PEG-IFN-beta, připravený podle příkladu 1, uložený v PBS o pH 7,4,
- růstové prostředí WISH (prostředí MEM s vysokým obsahem glukózy a Earlovou směsí solí + 10 % FBS + 1,0 % L-glutaminu + penicilin/streptomycin (100 j./ml,
100 mikrogramů/ml),
- prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH (prostředí MEM s vysokým obsahem glukózy a Earlovou směsí solí + % FBS + 1,0 % L-glutaminu + penicilin/streptomycin (100 j./ml, 100 mikrogramů/ml),
- MTT v koncentraci 5 mg/ml v PBS, skladování při -70 °C.
Zkouška byla provedena následujícím způsobem:
Vzorky IFN-beta byly zředěny na dvojnásobnou výchozí koncentraci v prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH.
Vytvoří se trojnásobné zředění vzorků IFN-beta v prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH na plotně s 96 plochými vyhloubeními, takže každé vyhloubení obsahuje 50 μΐ zředěného vzorku IFN-beta, do kontrolních vyhloubení se uloží pouze 50 μΐ prostředí.
0 0 0
Buňky WISH se v růstové log fázi oddělí roztokem trypsinu a EDTA, promyjí se prostředím k provedení zkoušky a upraví na konečnou koncentraci 0,8 x 106 buněk/ml.
Do každého vyhloubení se přidá 50 μΐ suspenze buněk WISH, to znamená 4 x 104 buněk na jedno vyhloubení. Konečná koncentrace IFN-beta, jíž jsou vystaveny buňky, je nyní předem určená koncentrace.
Po inkubaci 24 hodin v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého v inkubátoru s vysokým obsahem vlhkosti se přidá do každého vyhloubení 50 μΐ zásobního VSV v ředění 1:10 v prostředí k provedení zkoušky, jde o předem určenou dávku, která rozruší 100 % buněk WISH v průběhu 48 hodin, materiál se nepřidává do kontrolních vyhloubení bez viru, do nichž se přidá pouze stejný objem prostředí pro provedení zkoušky.
Po dalších 48 hodinách se do všech vyhloubení přidá 25 μΐ roztoku MTT, načež se buňky inkubují ještě 2 hodiny v inkubátoru.
Pak se obsah vyhloubení odstraní převrácením plotny a do každého vyhloubení se uloží 200 μΐ 100% ethanolu.
Po 1 hodině se plotny odečítají při vlnové délce 595 nm při použití systému Soft max Pro (software) a spektrofotometru Spectramax (Molecular Devices).
• · ·· · ♦ · · · · ·· • · · · ·· · · · · • · · · · · · · · • · · ·«· · ··· ·
Tabulka 1. Protivirová účinnost polyethylenglykolovaného vzorku IFN-beta a vzorku se simulovanou polyethylenglykolaci.
Vzorek IFN-beta* EC50**
Konjugát PEG-IFN-beta 3,9 ± 0,7 pg/ml
IFN-beta 16,4 ± 1,0 pg/ml
* Koncentrace zásobního roztoku ve vzorcích IFN-beta byla stanovena analýzou aminokyselin ** EC50 (± směrodatná odchylka, S.D.) byla stanovena pomocí softwaru Microcal Origin 4.1.
Jak je shrnuto na obr. 6 a v tabulce 1, udržuje si konjugát PEG-IFN-beta úroveň protivirové účinnosti, která je vyšší než protivirová účinnost čerstvě připraveného původního IFN-beta. Pozorování, že získaný konjugát má přibližně 4krát vyšší biologickou účinnost než čerstvě připravený IFN-beta, může také být důsledkem zvýšené stálosti konjugátu ve srovnání s přírodním IFN-beta po přidání těchto látek do prostředí k provedení zkoušek s buňkami WISH.
Příklad 3
Zkoušky in vitro na relativní účinnost vzorků PEG-IFN
Relativní biologická účinnost PEG-IFN-beta s molekulovou hmotností PEG 30 000 byla stanovena s použitím buněk WISH podle příkladu 2, získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 2. Byly provedeny 3 nezávislé zkoušky třemi odlišnými pracovníky v odlišných časech.
Tabulka 2. Relativní protivirová účinnost PEG-IFN-beta • · ···· · · · ····
9 99 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·
99 99 99 99 999
Relativní účinnost Interferonu*
(3 zkoušky)
Vzorek Zkouška 1 Zkouška 2 Zkouška 3 Průměr
(S.D.)
PEG(30000)- 3,2 krát 3,lkrát 1,8krát 3,0x(0,78)
IFN-beta vyšší vyšší vyšší vyšší
PEG(2x20000)- 4,2krát 1,3krát 0,8 5krát 2,lx(l,8)
IFN-beta vyšší vyšší vyšší vyšší
* EC50 ve srovnání se standardem IFN -beta pro caždou
zkoušku ★* Srovnání je založeno na koncentraci IFN-beta 330 μς/ΐΏΐ. Pomocí AAA byly stanoveny zásobní koncentrace pro PEG (30 000)-IFN-beta 5,41 μς/ιηΐ a pro PEG (2x20 000) -IFN-beta 6,86 μς/ιηΐ.
Vazba PEG-IFN-beta na buněčné receptory byla vyhodnocena v přítomnosti předem určeného množství 125I-IFN-alfa2a. IFN-alfa2a byl radioaktivně značen 125I při použití chloraminu T. Značený interferon byl oddělen od volného jodu průchodem reakčních složek sloupcem s obsahem prostředku Sephadex G25 s následným spojením frakcí, obsahující bílkovinu (Pharmacia). Množství značeného interferonu bylo stanoveno kvantitativně zkouškou ELISA (Biosource, USA) a byla stanovena specifická aktivita. Buňky Daudi byly vypěstovány a sklizeny v exponenciální fázi a 2 χ 106 buněk bylo inkubováno 3 hodiny s 0,5 nM 125I-IFN-alfa2a při teplotě místnosti v přítomnosti různých koncentrací PEG-IFN-beta nebo IFN-alfa2a v pufru k provedení zkoušky, jde o prostředí RPMI 1640, obsahující 2 % fetálního telecího séra a 0,1 % azidu sodíku. Na konci inkubace byl buněčný materiál odstředěn přes vrstvu ftalátového oleje a radioaktivita, vázaná na buněčný materiál byla stanovena počítačem gamma-záření. Vazba PEG(30 000)-IFN-beta a PEG(2x20 000)-IFN-beta na receptor byla velmi podobná vazbě IFN-beta, jak je znázorněno na obr. 7.
Mimo to byla stanovena relativní účinnost na buňkách Daudi (buňky lidského lymfomu B) při zkoušce na zástavu proliferace, jak je uvedeno v tabulce 3. Všechny typy interferonu byly rozpuštěny ve dvojnásobné koncentraci 200 ng/ml. Vzorky byly 3krát zředěny v průběhu délky plotny v konečném objemu 100 μΐ. Do každého vyhloubení bylo uloženo 1 x 105 buněk v objemu 100 μΐ a buňky byly inkubovány v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou celkem 72 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti oxidu uhličitého.
Po 48 hodinách byl přidán do vyhloubení triciovaný 3H-thymídín v množství 1 μCi/vyhloubení v objemu 20 μΐ.
Na konci inkubace, trvající 72 hodin byl obsah ploten odebrán při použití zařízení Tomtek Plate Harvester. Výsledky, shrnuté v tabulce 3, prokazují, že po polyethylenglykolaci nedošlo k žádné prokazatelné ztrátě účinnosti IFN. Ve skutečnosti byla účinnost konjugátu o něco vyšší než účinnost volného IFN-beta. Toto pozorování může být způsobeno tvorbou neúčinných agregátů ve volném IFN nebo také rozdílem v použitých metodách (analýza aminokyselin pro vzorky PEG-IFN a HPLC v reverzní fázi pro IFN-beta).
• · ·» · · ···· ·· • · « · · · · · · · • · · · * · · ··· ·
Tabulka 3. Zkouška na inhibici proliferace, buňky Daudi
Dávka IC5o* Vzestup proti IFN
IFN-beta (plotna 1) 1153,1 -
PEG(30000)-IFN(71 A) 695,6 1,6x
IFN-beta (plotna 2) 1005,8 -
PEG(40000)-IFN (71 B) 629,4 1,7x
* pg/ml
Příklad 4
Farmakokinetické zkoušky na myších
Nítrožílní podání
Myším bylo podáno 100 ng IFN-beta PEG(30000) -IFN-beta nebo PEG (2x20000)-IFN-beta a krev byla odebírána v předem určených časových intervalech. Pak byly stanoveny koncentrace IFN-beta v krevním séru specifickou zkouškou ELIAS (Toray Industries), výsledky jsou uvedeny na obr. 8. Pokus byl prováděn tak, že 28 myších samic kmene B6D2F1 ve.stáří 6 až 8 týdnů s hmotností přibližně 20 g bylo rozděleno do 4 skupin následujícím způsobem: skupina 1 obsahovala 9 myší, jimž bylo jednorázové podáno 200 μΐ materiálu s obsahem 500 ng/ml lidského IFN-beta, konečná dávka byla 100 ng/myš. Skupina 2 obsahovala rovněž 9 myší, jimž bylo podáno v objemu 200 μΐ ekvivalentní množství PEG(30000)-IFN-beta. Skupině 3 bylo podáno 200 μΐ ekvivalentního množství PEG(2x20000)-IFN-beta, skupina 4 obsahovala 3 myši jako negativní kontroly. Krevní vzorky v množství přibližně 200 μΐ, byly odebírány v 9 předem určených časových intervalech z retroorbitální žilní pleteně pomocí kapiláry. Krevní vzorky se v průběhu • · « « «««I • · · · « srazily a pak byly Sérum bylo uloženo při hodiny při teplotě místnosti odstředěny v mikroodstředivce.
teplotě -70 °C až do zpracování všech vzorků. Pak byla séra podrobena zkouškám na přítomnost biologicky účinného lidského IFN-beta svrchu uvedenou zkouškou (Toray Industries). Výsledky prokazují, že plocha pod křivkou, AUC je značně zvětšena u vzorků s obsahem PEG-IFN ve srovnání se vzorky s obsahem volného IFN-beta, takže vzorky PEG-IFN mají zřejmě vyšší účinnost ve srovnání s volným IFN-beta, mimo to je výsledek pro PEG(2x20000)-IFN-beta vyšší ve srovnání s výsledkem pro PEG(30000)~ -IFN-beta.
Podkožní podání
Myším byl podkožně podán IFN-beta a PEG-IFN v dávce 100 mg/myš. Na obr. 9 je znázorněno, že celková plocha pod křivkou AUC je podstatně zvětšena pro vzorky PEG-IFN ve srovnání se vzorky, které obsahovaly volný IFN-beta. Farmakokinetické zkoušky jsou v souladu s těmito poznatky, vzorky s obsahem PEG-IFN mají delší biologický poločas a zvýšenou AUC.
Příklad 5
Vazba skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid
Vazba interferonu-beta na OPSS-PEG2k-hydrazid
Proteín-S-S~PEG-2K—Č-NH-NHj • · • · · · • 00 · • · 0 « ·
0· 0 0 0 0 • 0
Rekombinantní lidský interferon-beta se připraví v roztoku v koncentraci 0,33 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,8. Pak se přibližně 3,6 mg (přebytek 40 mol na 1 mol bílkoviny) heterobifunkčního reakčního činidla pro zavedení PEG, OPSS-PEG2k-hydrazidu ve 2 ml deionizované vody přidá ke 3 ml IFN-beta s koncentrací 0,33 mg/ml (celkem 0,99 mg) a reakce se nechá probíhat v polypropylenové nádobce 1 hodinu při teplotě 45 °C. Pak se reakční směs analyzuje kapilární elektroforézou ke stanovení rozsahu modifikace. Typické výtěžky se pohybují v rozmezí 90 až 97 % v závislosti na čistotě interferonu B a reakčního činidla pro zavedení PEG. Pak byl roztok nanesen na sloupec, naplněný materiálem Superdex 75 (Pharmacia), k eluci byl užit pufr s 5 mM fosfátem sodným a 150 mM chloridem sodným o pH 7,0. Frakce s obsahem požadovaného materiálu byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE. Frakce s obsahem monopolyethylenglykolovaného interferonu-beta byly spojeny a užity v dalším stupni pro modifikaci PEG s vysokou molekulovou hmotností.
Vazba interferonu-beta na (OPSS) 2-PEG3400
Protein-SH
Rekombinantní lidský interferon-beta byl připraven v koncentraci 0,33 mg/ml v 50 mM pufru s acetátem sodným o • to ·· ·· to · » to ·· to • · · · · to · ···· • toto· ··· toto· • ·· to to to · to·· 9 to 28 ·· ·· ·* ·· ·· ··· pH 3,8. Pak bylo přibližně 6,1 mg (přebytek 40 mol na 1 mol bílkoviny) homobifunkčního reakčního činidla pro zavedení PEG, (OPSS) 2-PEG3400 ve 2 ml deionizované vody přidáno ke 3 ml interferonu-beta s koncentrací 0,33 mg/ml (celkové množství 0,99 mg), reakce probíhala 2 hodiny v polypropylenové nádobce při teplotě 50 °C. Reakce byla sledována za neredukujících podmínek na SDS-PAGE, výsledná reakční směs byla analyzována kapilární elektroforézou ke stanovení rozsahu modifikace. Typická modifikace při této reakci s interferonem-beta byla více než 95 %. Výsledný roztok byl nanesen na sloupec s náplní Superdex 75 (Pharmacia), k eluci byl užit pufr s 50 mM fosfátem sodným a 150 mM chloridem sodným o pH 7,0. Příslušné frakce byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE, frakce, obsahující monopolyethylenglykolovaný interferon-beta byly spojeny.
Příklad 6
Vazba druhé skupiny PEG na polyethylenglykolovaný polypeptid s obsahem PEG s nízkou molekulovou hmotností
Modifikace IFN-S-S-PEG2k-hydrazidu působením mPEG3ok-
-aldehydu, ALD
Protein-S-S-PEG^-C-NH-NH, +
O
Proleia-S-S-PEG2K-C-NH-N=CH-mPEG30K mPEG30K-CH2CH2CH
Ke spojeným frakcím IFN-S-S-PEG2k-hydrazidu z příkladu 5 se přidá mPEG30k-ALD v přebytku 20 mol na 1 mol proteinu. Reakce probíhá při teplotě místností 25 °C
0 · · · * · 0 » 0 00 • 000 · 0 0 · * 0
00 ·00 0 00t 0 0
0000 0000 00 0
00 00 00 00 0·· celkem 4 hodiny, vzorek reakční směsi se pak uloží na vrchol sloupce s náplní Superose 6 (Pharmacia) ke stanovení výtěžku modifikace. Tento výtěžek při uvedené reakci je typicky vyšší než 80 % v závislosti na čistotě reakčního činidla pro zavedení PEG a na reakčních podmínkách.
Vynález byl popsán na základě svých některých provedení, je však zřejmé, že by bylo možno zvolit ještě širokou škálu ekvivalentních parametrů, jako je koncentrace a další reakční podmínky, které by rovněž spadaly do rozsahu vynálezu.
Bylo by však možno uskutečnit ještě řadu dalších modifikací. Vynález proto zahrnuje jakékoliv variace, použití nebo změny, které jsou založeny na principech vynálezu a u nichž jde pouze o běžné úpravy, které může uskutečnit běžný odborník.
V případě, že se uvádějí známé postupy, neznamená to, že by zmiňované postupy byly známým stavem techniky vzhledem k poznatkům, uvedeným v přihlášce vynálezu.

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Konjugát polyolu a interferonu-beta, v němž je polyolová skupina kovalentně vázána na Cys17 lidského interferonu-beta.
  2. 2. Konjugát polyolu a interferonu-beta podle nároku 1, v němž je polyolovou skupinou polyalkylenglykolová skupina.
  3. 3. Konjugát polyolu a interferonu-beta podle nároku 2, v němž je polyalkylenglykolovou skupinou polyethylenglykolové skupina PEG.
  4. 4. Konjugát polyolu a interferonu-beta podle některého z nároků 1 až 3, který má stejnou nebo vyšší účinnost interferonu-beta ve srovnání s přírodním lidským interferonem-beta.
  5. 5. Způsob výroby konjugátu polyolu a interferonu-beta podle nároku 1,vyznačující se tím, že se nechá reagovat interferon-beta s thiolreaktivním činidlem pro zavedení polyolové skupiny na specifické místo za kovalentní vazby polyolové skupiny na Cys17 lidského interferonu-beta za vzniku konjugátu polyolu a interferonu-beta, načež se vzniklý konjugát polyolu a interferonu-beta izoluje.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se jako thioireaktivní činidlo pro zavedení • 9 «9 9 · ·· 9 · «9 • •«9 99 9 9*9
    9 99 999 · 9 9 ϊ 9 9 • 999 9999 99 9
    31 .............
    polyolové skupiny užije thiolreaktivní polyethylenglykolační činidlo.
  7. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačuj íc se t i m, že thiolreaktivní činidlo pro zavedení polyolové skupiny je monomethoxylováno.
  8. 8. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačuj i c se t i m, že thiolreaktivní činidlo pro zavedení polyolové skupiny je bifunkční.
  9. 9. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačujíc se t i m, že thiolreaktivní činidlo je polyolový derivát, jehož funkční skupina se volí ze skupiny orthopyridyl disulfid, vinylsulfon, maleimid a jodacetimid.
  10. 10. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačuj íc se t i m, že thiolreaktivní činidlo pro zavedení polyolové skupiny je orthopyridyldisulfidový derivát monomethoxylovaného polyolu.
  11. 11. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se reakce provádí při kyselém pH, při němž je interferon-beta stálý.
  12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že jako svou účinnou složku obsahuje konjugát polyolu a interferonu-beta podle některého z nároků 1 až 3 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnými látkami.
    9· «9 99 99«· 99
    9 9 « 9 99 9 999
    99 99 999 99
    9*9 999 9 999 ·
    9999 9999 99
  13. 13. Způsob léčení infekcí, nádorů a autoimunitních a zánětlivých onemocnění, vyznačující se tím, že se podává účinné množství farmaceutického prostředku podle nároku 12.
  14. 14. Způsob postupné vazby polyethylenglykolových skupin PEG na polypeptid, vyznačující se tím, že se nechá reagovat polypeptid s heterobifunkční nebo homobifunkční skupinou PEG s nízkou molekulovou hmotností obecného vzorce
    W-CH2CH2O (CH2CH2O) nCH2CH2-X, kde W a X jsou skupiny, nezávisle reagující s aminoskupinou, sulfhydrylovou, karboxylovou nebo hydroxylovou funkční skupinou za vazby skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid, načež se nechá reagovat skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností, vázaná na polypeptid s monofunkční nebo bifunkční skupinou PEG pro vazbu této monofunkční nebo bifunkční skupiny PEG na volné zakončení skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností za vzniku konjugátu typu PEG-polypeptid.
  15. 15. Způsob podle nároku 14,vyznačující se tím, že se užije monofunkční nebo bifunkční skupina PEG obecného vzorce
    Y-CH2CH2O (CH2CH2O)mCH2CH2-Z kde Y je skupina, reaktivní vzhledem ke koncové skupině volného zakončení skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností, vázané na polypeptid a Z znamená skupinu -OCH3 nebo skupinu, reaktivní se skupinou X za vzniku bifunkčního konjugátu.
    •0 0000
    00 00 •000 · 0 t 0 · ··
    00 00 000 000 0 00 000 « 000 0 0 0000 0000 00 0
    33 *· ** ·· *......
  16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se jako monofunkční nebo bifunkční skupina PEG užije methoxy PEG, rozvětvená PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelná PEG, PEG s funkčními skupinami podél řetězce nebo dendrimer PEG.
  17. 17. Způsob podle nároku 14,vyznačující se tím, že se W a X nezávisle volí ze skupiny orthopyridyldisulfid, maleimidy, vinylsulfony, jodacetamidy, hydrazidy, aldehydy, sukcinimidylestery, epoxidy, aminy, thioly, karboxylové skupiny, aktivní estery, benzotriazolkarbonáty, p-nitrofenolkarbonáty,. isokyanáty a biotin.
  18. 18. Způsob podle nároku 14,vyznačující se tím, že skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností má molekulovou hmotnost v rozmezí 100 až 5000.
  19. 19. Způsob podle nároku 14,vyznačující se tím, že monofunkční nebo bifunkční skupina PEG má molekulovou hmotnost v rozmezí 100 až 200 000.
  20. 20. Způsob podle nároku 14,vyznačující se tím, že se jako skupina PEG a nízkou molekulovou hmotností a/nebo monofunkční nebo bifunkční skupinu PEG užije kopolymer polyethylenglykolu.
  21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se použitý kopolymer polyethylenglykolu volí ze skupiny kopolymerů polyethylenglykolu a polypropylenglykolu a kopolymerů polyethylenglykolu a kyseliny polymléčné/polyglykolové.
    9 9 · 9
    9 9
    9 9 9 9
    9 9 9
  22. 22. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se po postupné vazbě dvou skupin PEG za sebou na polypeptid konjugát PEG a polypeptidů dále čistí.
    99 99
    9 9 9 ♦
    9 9 99
    9 9 9 9 9
    9 ·9 9
    99 99 •9 9999
  23. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že čištění zahrnuje jeden nebo větší počet čisticích postupů, které se volí ze skupiny chromatografie na iontoměniči, chromatografie na gelu s vyloučením látek od určité molekulové hmotnosti, chromatografie s hydrofobní interakcí, afinitní chromatografie a chromatografie v reversní fázi.
  24. 24. Způsob podle některého z nároků 14 až 23, vyznačující se tím, že se jako polypeptid užije interferon-beta.
  25. 25. Použití konjugátu PEG-polypeptid, získaných způsobem podle některého z nároků 14 až 23 pro výrobu farmaceutického prostředku.
CZ20003995A 1998-04-28 1999-04-28 Konjugát polyolu a interferonu-beta CZ298579B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20003995A3 true CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
CZ298579B6 CZ298579B6 (cs) 2007-11-14

Family

ID=22177687

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003995A CZ298579B6 (cs) 1998-04-28 1999-04-28 Konjugát polyolu a interferonu-beta
CZ20050048A CZ298597B6 (cs) 1998-04-28 1999-04-28 Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20050048A CZ298597B6 (cs) 1998-04-28 1999-04-28 Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid

Country Status (31)

Country Link
US (3) US6638500B1 (cs)
EP (2) EP1075281B1 (cs)
JP (2) JP4574007B2 (cs)
KR (1) KR100622796B1 (cs)
CN (2) CN1187094C (cs)
AR (1) AR020070A1 (cs)
AT (2) ATE365563T1 (cs)
AU (1) AU762621B2 (cs)
BG (2) BG64694B1 (cs)
BR (1) BR9910023A (cs)
CA (2) CA2565375A1 (cs)
CY (1) CY1108022T1 (cs)
CZ (2) CZ298579B6 (cs)
DE (2) DE69936409T2 (cs)
DK (2) DK1421956T3 (cs)
EA (2) EA003789B1 (cs)
EE (1) EE05214B1 (cs)
ES (2) ES2285286T3 (cs)
HK (2) HK1038194A1 (cs)
HU (1) HUP0300548A3 (cs)
IL (1) IL139286A (cs)
NO (2) NO329749B1 (cs)
NZ (1) NZ507456A (cs)
PL (2) PL196533B1 (cs)
PT (2) PT1421956E (cs)
SI (2) SI1075281T1 (cs)
SK (2) SK286217B6 (cs)
TR (2) TR200003161T2 (cs)
TW (2) TWI232882B (cs)
UA (2) UA79430C2 (cs)
WO (1) WO1999055377A2 (cs)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
EP1656952B1 (en) * 1998-10-16 2013-12-18 Biogen Idec MA Inc. Polyalkylene glycol conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
PL200586B1 (pl) 1998-10-16 2009-01-30 Biogen Idec Inc Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów
IL146055A0 (en) * 1999-04-23 2002-07-25 Alza Corp Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
TR200101086A3 (cs) * 1999-10-15 2001-08-21
JP4593048B2 (ja) 1999-12-24 2010-12-08 協和発酵キリン株式会社 分岐型ポリアルキレングリコール類
ATE435033T1 (de) 2000-01-10 2009-07-15 Maxygen Holdings Ltd G-csf konjugate
RU2278123C2 (ru) 2000-02-11 2006-06-20 Максиджен Холдингз Лтд. Молекулы, подобные фактору vii или viia
WO2002060978A1 (fr) 2001-01-30 2002-08-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polyalkylene glycols ramifies
EP1234583A1 (en) 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
BR0207576A (pt) 2001-02-27 2004-04-27 Maxygen Aps Variante glicosilada de um polipeptìdeo de interferon beta precursor (ifnb), processos de aumentar a glicosilação in vivo de uma molécula de ifnb precursora, de produzir uma molécula de ifnb glicosilada, para preparar uma variante conjugada e de tratar um mamìfero com esclerose múltiplam composição farmacêutica, molécula de ifnb variante, sequência de nucleotìdeo, vetor de expressão, célula hospedeira de glicosilação conjugado, e, uso de um conjugado
AU2002325819B2 (en) 2001-07-11 2008-06-19 Maxygen, Inc. G-CSF Conjugates
EP1476181B1 (en) 2002-01-18 2016-03-23 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
AU2003303635B2 (en) * 2002-12-26 2009-07-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
DK2085470T3 (da) 2003-03-20 2012-08-06 Bayer Healthcare Llc FVII- eller FVIIa-varianter
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
JP2007519422A (ja) * 2004-02-02 2007-07-19 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
ZA200609412B (en) 2004-05-17 2008-07-30 Ares Trading Sa Hydrogel interferon formulations
CA2567309A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Ares Trading S.A. Method of stabilizing proteins
US7731948B2 (en) 2004-06-01 2010-06-08 Ares Trading S.A. Stabilized interferon liquid formulations
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
AU2005318984B2 (en) 2004-12-21 2011-12-01 Nektar Therapeutics Stabilized polymeric thiol reagents
SG161210A1 (en) 2004-12-22 2010-05-27 Ambrx Inc Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
AU2005322019B2 (en) * 2004-12-22 2010-08-26 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
EP2360170A3 (en) 2005-06-17 2012-03-28 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine
CA2617064A1 (en) * 2005-08-04 2007-02-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of a g-csf moiety and a polymer
SI1917276T1 (en) 2005-08-26 2018-05-31 Ares Trading S.A. PROCEDURE FOR PREPARATION OF GLYCOSYLATED INTERFERONE BETA
WO2007025991A2 (en) 2005-09-01 2007-03-08 Ares Trading S.A. Treatment of optic neuritis
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
WO2007130453A2 (en) * 2006-05-02 2007-11-15 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
KR20090019810A (ko) 2006-05-24 2009-02-25 라보라뚜와르 세로노 에스. 에이. 다발성 경화증 치료를 위한 클라드리빈 요법
US20090252720A1 (en) 2006-05-24 2009-10-08 Novo Nordisk Health Care Ag Prolonged FIX Analogues and Derivatives
CA2685596A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2234645B1 (en) 2007-12-20 2012-05-02 Merck Serono S.A. Peg-interferon-beta formulations
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
US20100112660A1 (en) * 2008-05-30 2010-05-06 Barofold, Inc. Method for Derivatization of Proteins Using Hydrostatic Pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
CN102770449B (zh) 2010-02-16 2016-02-24 诺沃—诺迪斯克有限公司 具有降低的vwf结合的因子viii分子
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
EP2569331A1 (en) 2010-05-10 2013-03-20 Perseid Therapeutics LLC Polypeptide inhibitors of vla4
EP2593130A2 (en) 2010-07-15 2013-05-22 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
PL2616486T3 (pl) 2010-09-15 2019-05-31 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Warianty czynnika viii mające zmniejszony wychwyt komórkowy
KR101451357B1 (ko) * 2011-02-18 2014-10-15 주식회사 스템디알 Ｓｉｒｔ１ 발현 유도 물질을 포함하는 패혈증 또는 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물
CN103930440A (zh) 2011-07-01 2014-07-16 拜耳知识产权有限责任公司 松弛素融合多肽及其用途
US10358470B2 (en) * 2011-10-01 2019-07-23 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
MX366864B (es) 2012-02-27 2019-07-26 Amunix Operating Inc Composiciones de conjugados de xten y métodos para realizarlas.
AU2013226944B2 (en) 2012-02-29 2017-03-23 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
DK2982686T3 (en) 2013-03-29 2018-10-08 Glytech Inc POLYPEPTIDE WITH SIALYLED SUGAR CHAIN CONNECTED
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
WO2016013911A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
SI3183264T1 (sl) 2014-08-19 2021-03-31 Biogen Ma Inc. Metoda pegilacije
EP3288577B1 (en) 2015-05-01 2021-10-27 Allysta Pharmaceuticals, Inc. Adiponectin peptidomimetics for treating ocular disorders
PE20180498A1 (es) * 2015-06-19 2018-03-09 Eisai Randd Man Co Ltd Inmunoglobulinas conjugadas en cys80
WO2018195006A1 (en) * 2017-04-17 2018-10-25 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Optimization of enzyme replacement therapy for treatment of homocystinuria
WO2020158691A1 (ja) 2019-01-28 2020-08-06 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
CA3125320A1 (en) 2019-01-28 2020-08-06 Toray Industries, Inc. Polyethylene glycol-modified form of hepatocyte growth factor or active fragment thereof

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JP2524586B2 (ja) * 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
HU218893B (hu) * 1994-03-31 2000-12-28 Amgen Inc. A megakariocita szaporodás és differenciálódás stimulálására szolgáló módszerek és vízoldható készítmények
AU696387B2 (en) * 1994-05-18 1998-09-10 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
JP2001508783A (ja) * 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
ATE375363T1 (de) * 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
TWI232882B (en) 2005-05-21
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
BG109291A (en) 2006-04-28
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
NO20100324L (no) 2000-12-28
CZ298579B6 (cs) 2007-11-14
BG104871A (en) 2001-07-31
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
EE200000614A (et) 2002-04-15
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04
BR9910023A (pt) 2000-12-26
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
BG64694B1 (bg) 2005-12-30
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
CN1637020A (zh) 2005-07-13
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
NZ507456A (en) 2003-10-31
IL139286A0 (en) 2001-11-25
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
PL196533B1 (pl) 2008-01-31
AU3767499A (en) 1999-11-16
US6638500B1 (en) 2003-10-28
HK1076115A1 (en) 2006-01-06
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
US7357925B2 (en) 2008-04-15
TWI266800B (en) 2006-11-21
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
UA79430C2 (en) 2007-06-25
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
AR020070A1 (es) 2002-04-10
PT1421956E (pt) 2007-07-13
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
IL139286A (en) 2005-12-18
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
CN100335503C (zh) 2007-09-05
SK286654B6 (sk) 2009-03-05
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
US7700314B2 (en) 2010-04-20
CN1302209A (zh) 2001-07-04
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
NO20005337L (no) 2000-12-28
HK1038194A1 (en) 2002-03-08
EA003789B1 (ru) 2003-10-30
UA66857C2 (uk) 2004-06-15
SK286217B6 (sk) 2008-05-06
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
NO332224B1 (no) 2012-07-30
PL344490A1 (en) 2001-11-05
AU762621B2 (en) 2003-07-03
PT1075281E (pt) 2004-11-30
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
NO329749B1 (no) 2010-12-13
CN1187094C (zh) 2005-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20003995A3 (en) Polyol and interferon-beta conjugate
FI107927B (fi) Menetelmä polyetyleeni-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi
CA1291708C (en) Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
PL186949B1 (pl) Fizjologicznie czynny koniugat PEG-IFN-alfa, sposób jego wytwarzania oraz zawierające go kompozycjefarmaceutyczne
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130428