CN1520313A - 一种加速骨折愈合的组合物 - Google Patents

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樱井直树
ϣ
高木聪希
֮
矢中规之
堀切勇儿
田村贵司
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Tanabe Seiyaku Co Ltd
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Abstract

一种用于加速骨折愈合的组合物，其中包括作为一种活性成分的一种PDE4抑制剂，特别是提供包括一种PDE4抑制剂和一种可生物相容的及可生物降解的聚合物的一种组合物，该组合物，当被制备入一种适合于局部给药剂型例如微球剂中的时候，能提供一种在骨折早期治疗方面显示极佳效应的药物组合物。该组合物用于治疗老年人和糖尿病或骨质疏松病人的顽固性骨折。

Description

一种加速骨折愈合的组合物
技术领域
本发明涉及一种加速骨折愈合的组合物，特别地，涉及一种加速骨折愈合的药物组合物，其中包含作为一种活性成分的PDE4抑制剂，优选与一个可生物相容的和可生物降解的聚合物一起的PDE4抑制剂，组合物尤其是以微球制剂的形式，更优选地是包含微球的注射剂，且当其局部应用时能够促进骨折愈合。
背景技术
骨折是骨组织生理连续性被部分或全部破坏的一种状态，根据骨折机制通常分为(a)外力骨折，(b)病理骨折，和(c)疲劳骨折。另外，根据骨折线(骨横切面形成的沿骨骺的线)骨折的状态被分成裂隙骨折、青枝骨折、横切骨折、倾斜骨折、螺旋形骨折、节段骨折、粉碎骨折、撕脱骨折、受压骨折、凹陷骨折及类似骨折。(IGAKU-DAIJITEN，18thed.，pp.719-720，published by Nanzando)
骨折愈合通常要经历相当长的时间，可能妨碍日常生活。而且，随着人们年龄增长，骨质疏松症患者的骨折(一种病理性骨折)数量明显增加。特别是，横切骨折需要长期住院治疗，且常常发生包括长期住院治疗引起的痴呆在内的内在并发症，其正在成为一种主要的社会和经济问题。
骨折愈合过程主要分为以下三个阶段(“Kossetsu Chiryougaku(Fracture Therapeutics)”，April，2000，pp.29-37，46-51，Nanko-do)，并且认为在修复期(骨折愈合的一个重要阶段)骨折愈合以一种不同于骨质重建期的机制进行，在骨质重建期骨生成和骨溶解(骨重吸收)重复发生。
(1)炎症期：骨周围组织损伤，骨折裂缝为血肿占据，骨折区出现炎症。
(2)修复期：两个过程平行进行；一个过程中骨折裂缝中的血肿被生出的肉芽组织消除，软骨痂形成并通过骨形成机制(软骨骨化)逐渐被硬骨痂取代，一个过程中骨膜中出现的骨形成细胞形成新骨(纤维性的/膜内的骨化)。
(3)重建期：所形成的新骨通过重复骨重吸收和骨形成伸展很长时期，期间骨畸形被矫正且缺损区被增强。
在重建期所形成的新骨有一定的强度，患者的日常生活较少阻碍；可是，修复期经历很长时期且严重限制患者的日常生活。因此，缩短修复期的时间是临床上的重点。
关于加速骨折愈合的物质，已经公开了肽类生理活性物质，如骨形态形成蛋白(BMP)和转化生长因子(TGF)(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，vol.87，pp.2220-2224(1989)。此外，已经公开了用于局部给药，包含在JP-09-263545A(1997)中与乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制成微胶囊后作为一种骨形成加速剂的下面化学式的一种化合物(JP-04-364179A(1992))的一种药学的制剂。
Figure A0281273300051
经过用磷酸二酯酶(PDE)抑制剂通过增加细胞内环AMP(cAMP)水平促进骨量的可能性的研究，报告了经过每天皮下注射己酮可可碱(一种通用PDE抑制剂)或选择性PDE4抑制剂Rolipram观察到小鼠脊椎骨和腓骨骨矿密度增加和皮质骨增生。(Bone，vol.27，6thissue，pp.811-817(2000))
然而，上面的研究集中于正常区域(是骨重建过程中的骨生成区)的药理作用，并不是骨折区，且未谈及PDE4抑制剂的加速骨折愈合活性。
本发明的公开
本发明的目的之一是提供一种新的加速骨折愈合的药用组合物，它加速骨折在早期的愈合。本发明的另一个目的是提供一种用于局部给药的新的药用组合物，其在骨折区使用时，只在目标点有效地发挥骨折愈合加速活性，同时避免活性成分的系统性作用的产生。本发明的再一个目的是提供一种加速骨折愈合的持续释放的存库制剂，其在局部应用时，能逐渐释放一种活性成分并通过一次给药发挥长期的药效。
本发明人调查研究了各种化合物的药理作用且注意到具有PDE4抑制活性的化合物能影响骨折愈合过程。然后发明人发现具有PDE4抑制活性的化合物能加速骨折愈合，并完成本发明。
本发明提供一种加速骨折愈合的组合物，其包含作为一种活性成分的PDE4抑制剂。特别地，本发明提供一种适合在骨折区局部应用的药物制剂，特别是一种存储制剂形式的骨折愈合加速的组合物。
绘图的简要说明
图1是显示化合物(1)在培养的兔肋软骨细胞中的软骨细胞钙化(钙沉积)作用的摄影的一个拷贝。
图2是显示使用PDE4抑制剂(化合物(2))微球治疗的兔桡骨缺损的再生的图。总骨面积(横截面的)(mm2)或压力应变指数(SSI：mm3)和化合物(2)的剂量两者间的关系相应地显示在上面的和下面的图中。
图3是显示使用PDE4抑制剂(化合物(2))微球治疗的兔腓骨骨折区内cAMP含量的时相的图。
图4是显示正常大鼠和STZ诱发的糖尿病大鼠的桡骨骨折区内的cAMP含量的时相的图。
图5是显示在实施例1-(4)、2-(1)和3-(1)中获得的微球的体外洗脱特征的图。
图6是显示静脉内应用化合物(1)的血浆浓度的时相的图。数据用均数±标准差表示(n＝3)。
图7是显示在实施例1-(5)、2-(2)或3-(2)中获得的微球分散体经皮下注射后的活性成分的血浆浓度的时相的图。数据用均数±标准差表示(n＝5)。
图8是显示在实施例2-(2)中获得的微球分散体经皮下注射后保持在制剂中的化合物(1)的时相的图。数据用均数±标准差表示(n-5)。
图9是显示在实施例6-(5)或7-(2)中获得的微球分散体经皮下注射后保持在制剂中的化合物(2)的时相的图。数据用均数±标准差表示(n-4)。
实施本发明的最佳方式
本发明的骨折愈合加速组合物对骨折愈合过程，尤其是在修复期具有优越的效果。该组合物能通过加速软骨骨化加速骨折愈合，期间在骨折区形成软骨痂，并依次被硬骨痂所取代。
本发明的药用组合物可以将作为一种活性成分的PDE4抑制剂和一种常规药学用的赋形剂或一种它的稀释剂结合来制备。优选的药用组合物是一种局部给药时持续性释放的组合物，包含PDE4抑制剂和一种可生物相容的及可生物降解的聚合物。更优选的所述局部给药的组合物是微球的形式，该微球可被制成注射剂。
本发明的药用组合物的用作活性成分的PDE4抑制剂的实例包括所有具有PDE4抑制活性的化合物，例如，在JP 05-229987A(1993)，JP 09-59255A(1997)，JP 10-226685A(1998)，EP 158380，WO/94/25437，USP 5,223,504，WO/95/4045，EP 497564，EP 569414，EP 623607，EP 163965，USP 5,605,914，WO/95/35282，WO/96/215，USP 5,804,588，USP 5,552,438，WO/93/9118，WO/96/31485，EP 459505，WO/97/22585，EP 738715，WO/91/16314，WO/96/218，WO/97/18208，EP 158380，WO/99/50270，EP 260817，WO/98/11113，WO/94/22852，EP 432856，USP 4193926，WO/98/13348，WO/96/6843，JP2000-503678A(WO/98/14432)，JP 2000-502724A(WO/98/9961)，JP 2000-510105A(WO/97/40032)，JP 2000-514804A(WO/98/2440)，JP 2000-502350A(WO/97/23457)，JP 2000-501741A(WO/97/2585)及类似文献当中描述的化合物。
按照“Trends in Pharmacological Sciences，vol.11，pp.150-155”的教导PDE可分为PDE1-5，且合适的该骨折愈合加速组合物的PDE4抑制剂，与其他的(PDE1-3，5)相比对PDE4有更优选的选择性，因为其对PDE4有较高的抑制活性，更优选与其他PDEs相比对PDE4有10倍或更高的抑制活性。与其他PDEs比较，PDE4抑制剂更优选对PDE4的抑制活性要高50倍及以上，更优选甚至100倍及以上。
按照“Advances in cyclic Nucleotide Research”，vol.10，pp.69-92，1979，Raven Press中描述的方法测定，优选的PDE4抑制剂是PDE4抑制活性的IC50为0.1-1000nM(优选0.1-100nM，更优选低于100nm)的化合物。
选择性PDE4抑制剂的具体实例包括下面结构式表示的化合物(1)到(57)或其可药用盐。
                    化合物(1)                                                       化合物(2)
化合物(3)                                             化合物(4)
Figure A0281273300092
化合物(5)                                             化合物(6)
Figure A0281273300093
化合物(7)                                                   化合物(8)
化合物(9)                                                   化合物(10)
Figure A0281273300101
化合物(11)                                           化合物(12)
Figure A0281273300102
化合物(13)                                           化合物(14)
Figure A0281273300103
化合物(15)                                           化合物(16)
Figure A0281273300111
化合物(17)                                              化合物(18)
化合物(19)                                              化合物(20)
Figure A0281273300113
化合物(21)                                              化合物(22)
化合物(23)                                          化合物(24)
化合物(25)                                           化合物(26)
化合物(27)                                           化合物(28)
化合物(29)                                             化合物(30)
化合物(31)                                             化合物(32)
Figure A0281273300133
化合物(33)                                                 化合物(34)
化合物(35)                                               化合物(36)
Figure A0281273300142
化合物(37)                                               化合物(38)
Figure A0281273300143
化合物(39)                                                化合物(40)
化合物(41)                                             化合物(42)
Figure A0281273300152
化合物(43)                                              化合物(44)
Figure A0281273300153
化合物(45)                                                               化合物(46)
化合物(47)                                           化合物(48)
化合物(49)                                            化合物(50)
Figure A0281273300163
化合物(51)                                           化合物(52)
化合物(53)                                                        化合物(54)
化合物(55)                                                                 化合物(56)
化合物(57)
根据化学结构，具有PDE4抑制活性的化合物可分为下面的(A)到(D)，且可以从这些化合物中正确选择一种本发明的PDE4抑制剂；然而，优选的化合物属于(A)和(B)，特别是(A)。(A)含有萘骨架的化合物或其部分结构类似物[例如，化合物(1)、(2)、(38)、(47)，和(52)到(57)]；
(B)含有3-环戊基氧基-4-甲氧基苯基结构的化合物或其部分结构类似物[例如，化合物(6)、(9)、(11)、(12)、(14)、(17)、(19)、(20)、(21)、(24)、(25)、(26)、(27)、(33)、(34)、(35)、(39)、(40)、(44)、(49)、(50)和(51)]；
(C)含有黄嘌呤骨架的化合物或其部分结构类似物[例如，化合物(5)、(7)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(36)、(37)、(41)、(43)和(46)]；和
(D)含有与上面(A)到(C)描述的化合物不同结构的化合物[例如，化合物(3)、(4)、(8)、(10)、(13)、(15)、(16)、(18)、(22)、(23)、(42)、(45)和(48)]。
(A)组化合物的实例包括下面结构式(I)到(III)显示的化合物和它们的可药用盐。
Figure A0281273300181
其中R1和R2，相同或不同，各代表氢原子、羟基、环-低级烷基氧基或可选择性取代的低级烷氧基，或在末端结合一起形成一个亚烷二氧基；R3是一个可选择取代的6-元含氮杂环基团；和-OR4和-OR5，相同或不同，各是一个可选择保护的羟基。JP 05-229987A，(1993)。
Figure A0281273300191
其中R1’和R2’，相同或不同，各是一个氢原子或一个可选择性保护的羟基；R3’和R4’之一是一个可选择性保护的羟基-取代的甲基，且另一个是一个氢原子、一个低级烷基或一个可选择保护的羟基-取代的甲基；且
R5’和R6’，相同或不同，各是一个氢原子、一个可选择取代的低级烷基、一个可选择取代的苯基或一个可选择保护的氨基，或在末端与相邻氮原子结合一起并形成一个可选择取代的杂环基。JP-09-59255A(1993)。
Figure A0281273300192
其中A是从下面显示的结构式中选择的基团：
Figure A0281273300193
其中，R1”和R2”，相同或不同，各是一个氢原子或一个可选择保护的羟基；R31是一个可选择保护的羟基甲基；R32是一个氢原子、一个低级烷基或一个可选择保护的羟基甲基；R33是一个可选择取代的低级烷基；R41是一个可选择保护的羟基甲基；R42是一个可选择保护的羟基甲基；图中的点线代表双键的存在或不存在；且
R5”和R6”，相同或不同，各是一个氢原子或一个可选择保护的氨基，或在末端结合一起并与相邻氮原子联合形成的一个可选择取代的杂环基。JP-10-226685A(1998)。
在(A)基团中，作为该骨折愈合加速组合物的一种活性成分的一种PDE4抑制剂，具有奈或异喹啉骨架的化合物和它们的可药用盐是优选的，且化合物(1)和(2)及其可药用盐还是更优选的。
当起全身作用时，由于PDE4抑制剂可引起呕吐或剂量依赖的胃酸分泌(Cellular Signaling，9(3-4)，pp.227-236(1997))，本发明的骨折愈合加速组合物优选局部应用于骨折区附近，以便于全身血液中的药物浓度不升高，而骨折区的药物浓度得到维持。为达此目的，将该组合物制备成持续释放的形式更可取，能有助于减少给药次数，也能减轻患者的负担。
该组合物的优选方案的实例包括存储剂(depot)，当局部给药时其逐渐释放药物(例如，小丸剂，凝胶剂，基质剂，微球剂，通过在可生物相容的和可生物降解的聚合物的水溶液中加入药物得到的持续释放剂，经设计在给药时是液体且在给药后在活体内形成凝胶的制剂、嵌入在经报道的在矫形外科领域中通常使用的各种基托中的制剂，等。)。
小丸剂的实施例包括通过压缩一种药物和终端羧基被醇所酯化的乳酸-羟基乙酸共聚物的细微颗粒，获得的一种长期持续释放制剂，及其类似物。(JP2001-187749A)
凝胶剂的实施例包括那些将一种药物和透明质酸(化学结合聚乙二醇上)溶解入磷酸盐缓冲液获得的制剂(Journal of ControlledRelease，59(1999)pp.77-86)，等。
包括药物的基质剂的实施例包括那些通过浸渗一种药物入胶原或纤维膜剂的颗粒物质内获得的，或者通过将药物加入到胶原或一种用于制备纤维膜的反应混合物的颗粒物质中获得的制剂，及其类似物(JP10-182499A(1998)，JP06-305983(1994))。
通过将药物加入到可生物相容的和可生物降解的聚合物的水溶液中得到的持续释放剂的实施例，包括通过将药物加入到透明质酸钠水溶液中获得的那些制剂，及其类似物。
经设计在给药时是液体且在给药后在活体内形成凝胶的制剂的实施例包括那些制剂，其中将一种药物和一种乳酸-羟基乙酸共聚物溶解入N-甲基-2-吡咯烷酮(Journal of Controlled Rilease，33(1995)pp.237-243)，或由一种药物和一种在低温时以溶液形式存在但在体温时形成胶体聚合物，如乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙二醇等的嵌段共聚物组成的制剂及其类似物(ibid.，27(1993)，139-147)。
嵌入在经报道的在矫形外科领域中通常使用的各种基托中的制剂的实施例包括那些通过混合一种药物和一种基托(例如，不溶于水的可生物相容的和可生物降解的聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、羟基磷灰石、磷酸三钙或类似物)制备的制剂。Biomaterials，vol.21，pp.2405-2412(2000)；和International.Journal of Pharmaceutics，vol.206，pp.1-12(2000)。
在所影响的骨折区逐渐释放一种有效数量的PDE4抑制剂的用于局部给药的制剂，优选在骨折愈合所需时间内能减少给药次数的。
在存储剂中，在适宜于通过注射局部给药微球情况下，这些微球的颗粒大小在适合通过针的范围是优选的，更为优选的范围是0.01-150μm，考虑到在效应点能减少刺激时0.1-100μm是特别优选的。
由于包含作为活性成分的PDE4抑制剂的该骨折愈合加速组合物被局部给药于骨折区的附近，优选使剂量变小。因此，组合物例如微球剂中的PDE4抑制剂含量，可优选为0.0001-80％重量，更优选为0.001-50％重量，且进一步更优选的是0.01-50％重量。
作为活性成分的PDE4抑制剂的剂量可变化，变化依赖于使用的PDE4抑制剂的种类，受治疗者的体重、年龄、状态，或使用部位，且通常由医师决定；然而，用于局部给药的剂量常常是每个受影响部位在1ng到1g范围内。
本发明的骨折愈合加速组合物可用一种PDE4抑制剂和一种药学可接受的赋形剂或其载体以常规方式来制备。优选的组合物可用一种PDE4抑制剂和一种可生物相容的及可生物降解的聚合物的结合来制备。
在它们中，不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物是要求至少1000ml水在25℃来溶解1g聚合物的一种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物，且特殊的实施例包括羟基脂肪酸聚酯及其衍生物(例如，聚乳酸、聚羟基乙酸、聚柠檬酸、聚苹果酸、聚-β-羟基丁酸、环开放的聚合ε-己内酯、乳酸-羟基乙酸共聚物、2-羟基丁酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸和聚乙二醇的嵌段共聚物、聚羟基乙酸和聚乙二醇的嵌段共聚物及乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙二醇的嵌段共聚物，等)、烷基α-氰基丙烯酸酯的聚合物(例如聚丁基-2-氰基丙烯酸酯，等)、聚亚烷基草酸酯(例如聚乙二酸亚丙基酯、聚乙二酸亚丁基酯，等)、聚原酸酯、聚碳酸酯(例如聚碳酸亚乙基酯、聚碳酸亚乙基亚丙基酯，等)、聚原碳酸酯、聚氨基酸(例如，聚γ-L-丙氨酸、聚γ-苄基-L-谷氨酸、聚γ-甲基-L-谷氨酸，等)、透明质酸酯。这些聚合物的一种或多种可被应用。其他可生物相容的及可生物降解的聚合物包括透明质酸钠、硫酸软骨素、胶原、明胶、纤维蛋白，和类似物。
在上面不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物中，羟基脂肪酸聚酯是特别优选的。首先，那些平均分子量在2000和大约800000范围的是优选的，在2000和大约200000范围的是特别优选的，在5000和大约50000范围的是最优选的。
另外，在上面的羟基脂肪酸聚酯中聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物和2-羟基丁酸-羟基乙酸共聚物是更优选的。在乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸和羟基乙酸的摩尔比优选的是90∶10到30∶70，更优选的是80∶20到40∶60，且在2-羟基丁酸-羟基乙酸共聚物中2-羟基丁酸和羟基乙酸的摩尔比优选的是90∶10到30∶70，更优选的是80∶20到40∶60。
当上面的一种PDE4抑制剂制备成存储剂时，其可依照预期的实施方案正确地实施，如果必要，可选择粉碎一种PDE4抑制剂后来实施。
PDE4抑制剂的粉碎可以用任何一种生产细微颗粒的常规方法来实施，包括机械粉碎方法，如喷射磨、锤磨、回旋球磨、瓷制球磨罐、珠磨、振动磨、棒磨机和管式磨粉碎，或用所谓的结晶方法，即一种药物先溶入一种溶剂，然后通过调节pH、改变温度或溶剂组成重结晶，并且通过离心、过滤或类似方法重新得到颗粒。
当制备本发明药物组合物的上面提及的各种类型制剂时，根据所选择的PDE4抑制剂，任何合适的方法可以被使用。
例如，可以按照下面的方法制备微球剂。在PDE4抑制剂的盐表现出进入微球的低结合率情况下，可在制备微球前使用酸或碱，使其转化为相应的游离形式。
(1)水内干燥法
在这种方法中，将药物加入到沸点低于水的不与水混合的有机溶剂中的不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物的溶液中(不溶于水的聚合物溶液)，且所得有机相被分散入水相中得到O/W乳状液，之后去除有机溶剂。这种方法能以文献中描述的类似方式被实施，例如在JP 56-19324B(1981)、JP 63-91325A(1988)、JP 08-151321A(1996)、Kajeev Jain et al.，“Contolled Drug Delivery byBiodegradable Poly (Ester)Devices：Different PreparativeApproaches”、Drug Development and Industrial Pharmacy，vol.24(8)，pp.703-727，1998、JP 60-100516A(1985)、JP 62-201816A(1987)、JP 09-221417A(1997)和JP 06-211648A(1994)中的描述。
(2)析相方法
在这种方法中，一种药物被溶解入或分散入，或该药物的水溶液被分散入不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物在有机溶剂中的溶液中。然后，在搅拌下逐渐加入一种硬化剂，以便得到固态沉淀。本方法能以文献中描述的类似方式被实施，例如在JP 60-67417A(1985)、USP 5503851、USP 5000886、Eur.J.Pham.Biopharm.vol.42(1)，pp.16-24(1996)和the forecited Jain et al.(ibid.)中的描述。
(3)喷雾干燥法
在这种方法中，一种药物被溶解入或分散入，或该药物的水溶液被分散入不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物在有机溶剂中的溶液中。然后所得溶液或分散液通过喷嘴喷雾到一个喷雾干燥器的干燥室中，以便在短时间内挥发细小液滴中的有机溶剂。本方法能以文献中描述的类似方式被实施，例如在JP 01-155942A(1989)、JP 05-194200A(1993)、JP 05-70363A(1993)、JP 08-151321A(1996)、JP 09-221417A(1997)、USP 5,922,253、“Spray Drying Handbook”(John Wiley & Sons，New York 1984)、Partick B.Deasy，“Microcapsulation and Related Drug Processes”(Marcel Dekker，Inc.，New York 1984)和the forecited Jain et al.(ibid.)，及类似文献中的描述。
(4)溶剂弥散法
在这种方法中，将一种药物和不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物在与水混溶的有机溶剂中的溶液加入一种保护胶体的水溶液中，随后搅拌乳化产生细小颗粒。本方法能以文献中描述的类似方式被实施，例如在JP 05-58882A(1993)、JP 09-110678A(1997)和International Journal of Pharmaceutics，vol.187，pp.143-152(1999)中的描述。
在上面提到的“水内干燥法”中，根据有机相的类型可使用不同的制备方法，尽管它们都能以常规方式实施。有机相的实施例包括下面内容。
(a)将一种药物直接溶解或分散入一种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物溶液中的有机相。当其分散入水相时得到O/W乳状液(JP 56-19324B(1981)、JP 63-91325A(1988)、JP 06-32732A(1994)、JP 08-151321A(1996)、JP 06-32732A(1994)和theforecited Jain，等。)
(b)W/O乳状液的有机相，其中将一种药物的水溶液分散入一种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物的溶液中。此W/O乳状液，当分散入水相时，得到(W/O)/W乳状液(JP 60-100516A(1985)、JP 62-201816A(1987)、JP 09-221417A(1997)和the forecited Jain，等。)
(c)O/O乳状液的有机相，使用两种或多种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物，其中一种药物被溶解或分散入一种分散在另一(几)种聚合物里的聚合物溶液中。此O/O乳状液，当分散入水相时，得到(O/O)/W乳状液(JP 06-211648A(1994))。
通过使用上面任何一种有机相，用常规方法可以获得乳化作用，例如，间歇振荡法、使用混合器如螺旋振荡器或汽轮振荡器的方法、胶体磨法、均化器法和超声破碎法。
可用在这些方法中的有机溶剂的实例包括卤代烃(二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷，等)、脂族酯(乙酸乙酯、乙酸丁酯，等)、芳烃(苯，等)、脂族烃(n-己烷、n-戊烷、环己烷，等)、酮类(甲基乙基酮，等)、醚类(二乙醚、二异丙醚、甲基异丁基醚，等)
在上面的乳状液的制剂中，为了稳定乳状液，可给水相加入一种乳化剂，包括，例如阴离子型表面活性剂(油酸钠、硬脂酸钠、十二烷基硫化钠，等)、非离子型表面活性剂(聚氧乙烯疏水山梨糖醇脂肪酸酯[Tween80，Tween60(Nikko Chemicals，Co.，Ltd.)]、聚乙烯蓖麻油衍生物[HCO-60，HCO-50(Nikko Chemicals，Co.，Ltd.)]、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、甲基纤维素、卵磷脂、明胶，等。
进一步，当一种或多种其他成分被加入时，除PDE4抑制剂之外，前者可优选加在制备O/W乳状液时的有机相。为了获得一种含一种升高浓度的医用成分的微球剂，制备一种含一种高浓度活性成分的有机相是必须的。为此目的，一种渗透调节剂可包含于水相中，以防止一种活性成分外流入水相中(JP 2608245)。
然后，在上面提到的方式中得到的O/W乳状液经过水内干燥，以除去存在于乳状液中的有机溶剂，得到微球。
有机溶剂能以常规方式从乳状液中去除，例如加热、减压下放置、吹风或类似方式，再比如，一种在开放系统中(JP 56-19324B(1981)、JP 63-91325A(1988)、JP 08-151321A(1996)、JP 06-211648A(1994))或在闭合系统中(JP 09-221418A(1997))将溶剂蒸馏掉的方法可被采用。另外，一种利用大量外面的水相将一种溶剂提取并去除(JP-2582186)的方法，也可被使用。
进一步，有赖于PDE4，下面的方法可以适当使用。
一种方法，即，将含一种药物、一种可生物降解的聚合物和一种该聚合物的水混溶性良好的溶剂(溶剂A：丙酮、四氢呋喃，等)的溶液，先加入含一种与溶剂A混溶的该聚合物的不良溶剂(溶剂B：水、乙醇，等)和一种与溶剂A不混溶的该聚合物的不良溶剂(溶剂C：甘油，等)的均匀混合的溶液中。该混合物，基于乳化作用，得到乳状液，其中该聚合物溶液构成分散相，该均匀混合的溶液构成连续相。然后，从分散相除去溶剂A(WO/01/80835)。
一种用水内干燥法从乳状液制备微球的方法，在该乳状液中，含有一种沸点低于水的有机溶剂(二氯甲烷、乙酸乙酯，等)和一种不溶于水的聚合物的有机相在水相中被乳化，包括(1)使用一种配备气体分离膜(可渗透的蒸发膜、多孔膜，等)的设备，(2)在气体分离膜的一侧加入可水内干燥的乳状液，和(3)蒸馏掉乳状液中的有机溶剂到气体分离膜的另一侧(WO/01/83594)。
此外，余留在微球中的该有机溶剂可通过在水相中以高于有机溶剂的沸点的温度加热微球被去除(JP 2000-239152A)或在涂敷高熔点的添加剂后将微球加热干燥(JP 09-221417A(1997))。
所得微球通过离心、过滤或筛分回收，洗涤以除去附着于其表面的物质，例如水相内的添加物，选择地在与一种聚集抑制剂，例如，糖、糖醇或无机盐，特别是乳糖、甘露糖醇或山梨糖醇结合后进行冻干以防止微球的附聚作用。优选用筛网以获得一种预计大小颗粒的微球，当微球剂被用为注射液时更优选使用允许例如150μm或以下的颗粒通过以改善注射性能的一种筛网。
为了用“析相方法”制备微球，除了上面“水内干燥法”所使用的有机溶剂之外，可以使用两亲型溶剂如丙酮、乙腈、四氢呋喃和二噁烷。PDE4抑制剂和可选择性的一种或多种添加成分，或它们的溶液，被溶解或分散入不溶于水的聚合物在这些有机溶剂的任何一种里的一种有机溶液之中，形成有机相。将该有机相逐渐搅拌加入到一种与上面的有机溶剂不混溶的溶剂(分散介质)，例如，硅油、液体石蜡、芝麻油、豆油(soybean oil)、玉米油、棉子油、椰子油、亚麻子油，形成O/O乳状液。如果需要，一种表面活性剂可加入到分散介质。通过冷却乳状液或加热蒸发有机相内的溶剂可以固化不溶于水的聚合物。可选择地，一种硬化剂象己烷、环己烷、甲基乙基酮、八甲基环四硅氧烷或其类似物，可轻轻地搅拌加入乳状液，或反之亦然，从乳状液分离出的不溶于水的聚合物，从而形成微球。
所得微球通过离心、过滤或筛分回收，用己烷或纯化水洗涤以除去附着于其表面的溶剂、添加剂等，并选择性的进行风干、真空干燥或冻干。可选择性地，在按照与上面提到的水内干燥法相似的方式加入一种聚集抑制剂后冻干微球。
在析相方法中的内在有机相的实施例包括下面方案。
(a)其中一种药物直接溶解或分散入一种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物中的有机相。
(b)属于W/O乳状液的有机相，其中将一种药物的水溶液分散入一种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物中。
(c)属于O/O乳状液的有机相，使用两种或多种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物，其中一种药物或其溶液被溶解或分散入一种分散入另一(几)种聚合物溶液里的聚合物溶液中。
进一步，使用与上述析相法中相同的有机溶剂，实施以“喷雾干燥法”制备微球。将一种不溶于水的可生物相容的及可生物降解的聚合物溶解到一种有机溶剂，将一种PDE4抑制剂和选择性地一种或多种添加成分，或其溶液，溶解或分散入该溶液中，并且通过喷嘴将其喷入喷雾干燥器的干燥箱中，以挥发有机溶剂形成微球。
对本发明来说，任何可获得的商用喷雾干燥器都可使用，例如，Pulvis Mini Spray GS31(YAMATO Scientific Co.，Ltd.)、Mini SprayDryer(Shibata Scientific Technology，Co.，Ltd.)。
然后按照与水内干燥法中使用的方法的类似方法逐步加工所得微球，产出所要求的微球剂。
可用在“溶剂弥散法”中的与水混溶的有机溶剂的实例，包括丙酮、甲醇、乙醇或它们的一种混合物，如果必要，可进一步包括能溶解一种药物的一种挥发性溶剂(二氯甲烷、氯仿)。胶体保护剂的实例包括聚乙烯醇。
当含一种PDE4抑制剂作为活性成分的加速骨折愈合的本发明组合物的微球剂，被给药在骨折区附近时，可以优选地局部地应用，更优选地，作为针剂或植入物局部地应用。
微球的一种可注射的制剂，可将应用本发明获得的微球，优选地以0.0001-1000mg/ml，更优选地以0.0005-800mg/ml，进一步优选地以0.001-500mg/ml的浓度分散/悬浮入含有一种分散剂的一种水溶液来制备。
分散剂的实例包括非离子表面活性剂，如聚氧乙烯疏水山梨醇脂肪酸酯(Tween80，Tween60，Nikko Chemicals，Co.，Ltd.)、聚乙烯蓖麻油(HCO-60，HCO-50，Nikko Chemicals，Co.，Ltd.)，纤维素-衍生的分散剂如羧甲基纤维素钠、藻酸钠、葡聚糖、透明质酸钠等。这些分散剂能适用于促进微球的分散性并稳定活性成分的洗脱液。分散剂通常可以0.01-2％重量百分比浓度，优选地在0.05-1％重量百分比浓度加入到组合物中。
上面的可注射的制剂可选择性地包括一种防腐剂(羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、苯甲醇、氯代丁醇、山梨酸、硼酸、氨基酸、聚乙二醇，等)、一种等渗剂(氯化钠、甘油、山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇，等)、一种pH调节剂(氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、磷酸、柠檬酸、草酸、碳酸、乙酸、精氨酸、赖氨酸，等)、一种缓冲液(磷酸氢二钠、磷酸氢二钾)或其类似物。
如果必要，一种甾体抗炎止痛药或非甾体抗炎止痛药可溶解或分散入该可注射的制剂中。甾体抗炎止痛药的实例包括地塞米松、氟羟脱氢皮质醇、氟羟脱氢皮质醇丙酮化合物、卤泼尼松、帕拉米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松，及其类似物。非甾体抗炎止痛药的实施例包括布洛芬、酮洛芬、吲哚美辛、萘普生、吡罗昔康，及其类似物。
除上面提到的悬浮液外，包含PDE4抑制剂的该微球注射剂可用试剂盒的形式，在使用时配制可注射的制剂，该试剂盒由一种聚集抑制剂及微球的一种固体制剂、一种分散体和注射用蒸馏水组成。
在试剂盒中使用的该固体制剂，可通过在含有一种聚集抑制剂的水溶液中悬浮微球，和将该悬浮液进行冻干、真空干燥或喷雾干燥，和/或类似方法来制备。冻干是特别优选的。
当制备一种固体制剂时，为了改进在注射用蒸馏水中的再分散性，一种分散体可加到包含聚集抑制剂(甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、木糖醇、麦芽糖、半乳糖、蔗糖，等)的水溶液中，从而产出良好分散性的一种固体制剂。如果必要，其可配制入制备可注射的制剂的试剂盒里，在其内部，结合了一种甾体抗炎止痛药和/或一种非甾体抗炎止痛药以及一种分散体。
包含作为活性成分的一种PDE4抑制剂的该骨折愈合加速组合物可被用于对各种温血哺乳动物治疗中，例如人类、家畜(马、牛、羊、猪)、宠物(狗、猫)，和类似动物。
包含作为活性成分的一种PDE4抑制剂的该骨折愈合加速组合物可应用的疾病的实例包括(a)外力骨折，(b)病理骨折(与骨质疏松症、骨软化症、恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、先天性成骨不全、cyctic骨、强活动性骨髓炎、骨硬化症或营养疾病)，和(c)疲劳骨折。另外，包含作为活性成分的一种PDE4抑制剂的该骨折愈合加速组合物可被应用于下面骨折中的任何一种，包括裂隙骨折、青枝骨折、横切骨折、倾斜骨折、螺旋形骨折、节段骨折、粉碎骨折、撕脱骨折、受压骨折、凹陷骨折及类似骨折。
[实施例]
下面的实验实施例、实施例和测试实施例为本发明提供进一步地说明。下面全部的实施例中，标明序号的化合物是在前面列表中序号相同的同一种化合物，该表显示带有化学结构的优选化合物的特殊实施例。
实验实施例1：加速正常大鼠骨折愈合
(水土适应)
CD(SD)IGS大鼠(Charles River Japan，Inc.；雄性；7周龄)室温(23±2℃)和湿度40-70％条件下室内饲养7天。在室内饲养期间，大鼠自由接近市售食物(产自Oriental Bio；CE-2)。(骨折愈合)
乙醚麻醉下，将大鼠左后腿剃毛，70％酒精消毒，用剪刀暴露腓骨，指甲剪切断腓骨(Natsume Seisakusyo；B17)。腓骨切面用镊子重新对合。实验组(20只大鼠/组)，将在实施例2-(1)中制备的含药微球，含0.1或0.5mg化合物(1)，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。对照组(20只大鼠/组)，将在对照实施例1-(1)中制备的同等剂量的不含药微球，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。缝合后，各组动物用70％酒精消毒。缝合后6周时，乙醚麻醉下，剖腹放血处死每组中的10只大鼠，切除腓骨。
(实验结果)
(1)腓骨骨矿密度和骨矿含量测量
缝合后6周时切除的腓骨在DXA骨密度仪(Aloka；DCS-600)下测定骨折区骨矿密度和骨矿含量(扫描宽度：1mm)。
骨矿密度和骨矿含量的测量结果相应显示在表1和表2中。
表1：腓骨骨矿密度(mg/cm2)
    药     药物含量     骨矿密度(mg/cm2)
    对照     0     33.69±0.80
化合物(1) 0.1mg 36.77±1.52
化合物(1) 0.5mg 40.05±1.34
表2：腓骨骨矿含量(mg)
    药     药物含量     骨矿含量(mg/cm2)
    对照     0     11.99±0.50
    化合物(1)     0.1mg     14.27±0.76
    化合物(1)     0.5mg     15.20±0.82
如表1和2所显示，发现含药微球治疗组中，骨折区域骨矿密度和骨矿含量剂量依赖性增加。
(2)腓骨体积测量
缝合后6周时切除的腓骨体积使用Plethysmometer(MuromachiKikai Co.，Ltd.；TK-101)测定。
骨体积的测量结果显示在表3中。
表3：腓骨体积(μl)
    药     药物含量     骨体积(μl)
    对照     0     62.7±2.0
    化合物(1)     0.1mg     68.1±2.9
    化合物(1)     0.5mg     77.2±2.9
如表3所显示，发现含药微球治疗组中，腓骨的骨体积剂量依赖性增加。
(3)腓骨强度测量
缝合后6周时切除的腓骨用骨强度测定仪(产自Muromachi KikaiCo.，Ltd.；TK-252C)进行三点弯曲实验以测定骨强度。简要地，腓骨以相距8mm的两个点支撑，且切面位于两点的正中，即距离相应的两点各4mm。在其中点(骨折面)维持自上向下的负荷(3mm/分钟)直到腓骨出现骨折。断裂骨所需要的最大压力定义为断裂力，断裂骨所需的总能量定义为断裂能。
断裂能和断裂力的测量结果相应显示在表4和5中。
表4：断裂能(mJ)
    药     药物含量     断裂能(mJ)
    对照     0     2.27±0.14
    化合物(1)     0.1mg     4.37±0.71
    化合物(1)     0.5mg     6.44±1.06
表5：断裂力(N)
    药     药物含量     断裂力(N)
    对照     0     15.0±0.94
    化合物(1)     0.1mg     19.8±2.14
    化合物(1)     0.5mg     23.0±1.68
如表4和5所显示，发现含药微球治疗组中，骨折区的骨强度剂量依赖性增加。
实验实施例2：加速正常大鼠骨折愈合
(水土适应)
CD(SD)IGS大鼠(Charles River Japan，Inc.；雄性；7周龄)室温(23±2℃)和湿度50±20％条件下室内饲养7天。在室内饲养期间，大鼠自由接近市售食物(产自Oriental Bio；CE-2)。
(骨折愈合)
乙醚麻醉下，将大鼠左后腿剃毛，70％酒精消毒；用剪刀暴露腓骨，指甲剪切断腓骨(Natsume Seisakusyo；B17)。腓骨切面用镊子重新对合。实验组(15只大鼠/组)，将在实施例7中制备的含药微球，含0.004、0.02、0.1或0.5mg化合物(2)，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。对照组(15只大鼠/组)，将在对照实施例2中制备的同等剂量的不含药微球，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。缝合后，每只动物都用70％酒精消毒。2周后每组取5只大鼠，4周后每组取10只大鼠，乙醚麻醉下，剖腹放血处死每组中的10只大鼠，切除腓骨。
(实验结果)
(1)腓骨骨矿密度和骨矿含量测量
缝合2周后切除的腓骨在DXA骨密度仪(产自Aloka；DCS-600)下测定骨折区骨矿密度和骨矿含量(扫描宽度：1mm)。
骨矿密度和骨矿含量的测量结果相应显示在表6和7中。
表6：腓骨骨矿密度(mg/cm2)
  药物     药物含量     骨矿密度(mg/cm2)
  对照     0     40.48±1.36
  化合物(2)     0.004mg     46.18±3.18
  化合物(2)     0.02mg     50.72±2.68
  化合物(2)     0.1mg     56.06±4.19
  化合物(2)     0.5mg     52.18±4.36
表7：腓骨骨矿密度(mg)
  药物     药物含量     骨矿密度(mg)
  对照     0     13.62±0.78
  化合物(2)     0.004mg     15.90±1.88
  化合物(2)     0.02mg     19.86±1.75
  化合物(2)     0.1mg     23.10±2.72
  化合物(2)     0.5mg     23.24±2.97
如表6和7所显示，发现含药微球治疗组中，骨折区域骨矿密度和骨矿含量剂量依赖性增加。
(2)腓骨体积测量
缝合2周后切除的腓骨体积使用Plethysmometer(MuromachiKikai Co.，Ltd.；TK-101)测定。骨体积的测量结果显示在表8中。
表8：腓骨体积(μl)
  药物     药物含量     骨体积(μl)
  对照     0     79.20±4.87
  化合物(2)     0.004mg     85.0±8.14
  化合物(2)     0.02mg     97.6±4.99
  化合物(2)     0.1mg     121.6±13.76
  化合物(2)     0.5mg     132.2±11.72
如表8所显示，发现含药微球治疗组中，腓骨的骨体积剂量依赖性增加。
(3)腓骨强度测量
缝合4周后切除的腓骨用骨强度测定仪(产自Muromachi KikaiCo.，Ltd.；TK-252C)进行三点弯曲实验以测定骨强度。简要地，腓骨以相距8mm的两个点支撑，且切面位于两点的正中，即距离相应的两点各4mm。在其中点(骨折面)维持自上向下的负荷(3mm/分钟)直到腓骨出现骨折。断裂骨所用的断裂力和总能量定义为断裂能。
断裂能的测量结果显示在表9中。
表9：断裂能(mJ)
  药物     药物含量     断裂能(mJ)
  对照     0     2.19±0.33
  化合物(2)     0.004mg     2.66±0.49
  化合物(2)     0.02mg     2.59±0.55
  化合物(2)     0.1mg     3.15±0.54
  化合物(2)     0.5mg     3.27±0.61
如表9所显示，发现含药微球治疗组中，骨折区的骨强度剂量依赖性增加。
实验实施例3：体外实验
(肋软骨细胞的分离)
分离自NZ种家兔(Kitayama Labes.，Co Ltd.；雄性；4周龄)的肋软骨，浸入Hank’s平衡盐溶液(不含钙-和镁-；LifeTech Co.，Ltd.；以下简称“HBSS”)。一块肋软骨和一块肋骨被一起切除，除去脂肪组织和肌肉组织，然后切除肋软骨的增殖软骨细胞层。收集到的增殖软骨细胞层用手术刀(FEATHER Safety Razor Co.，Ltd.)切成小块，将来自4只家兔的全部增殖软骨细胞层切块混合装入一支离心管中。在此离心管中加入加有0.1％乙二胺四乙酸四钠的40ml HBSS(pH7.2)以获得增殖软骨细胞层切块的悬浮液，37℃振荡20分钟并离心(1500rpm，10分钟)。吸弃上清，加入加有0.2％胰蛋白酶的40mlHBSS(pH7.2)到此离心管中以悬浮沉淀，37℃振荡1小时。离心(1500rpm，10分钟)该管，吸弃上清。沉淀以HBSS洗涤2次，悬浮于加有0.1％胶原酶(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，034-10533)的100ml HBSS中，37℃振荡3小时。该管内容物过细胞粗滤器(孔径大小为40μm)，将滤液分入4支离心管。给每一支离心管加入40ml培养基(α-MEM，LifeTech Co.，Ltd.)，离心(1500rpm，10分钟)。吸弃上清，用Pipetman将生成物沉淀收集入一支离心管中。加入40ml同一种培养基后，再离心(1500rpm，10分钟)。洗涤过程，包括添加培养基后的离心，另重复3次。将沉淀悬浮于同种培养基，得到约5ml悬浮液，计数细胞数。
(肋软骨细胞的培养)
将前述肋软骨细胞的悬浮液加入24-孔培养板，每孔50,000个细胞(第1天)。次日，用同种的培养基更换培养基。更换培养基后的第5天，用含有一种在下面表10中给出的测试化合物的一种培养基(含0.1％二甲亚砜作为载色剂)更换测试样品孔中的培养基。同时，用除了不含测试化合物之外前述的同种培养基(仅有载色剂)更换对照组的孔中的培养基。在那时，将终浓度为2nM的抗坏血酸-磷酸盐酯加入该培养基。就Alcian蓝染色法来说，培养基在第5、7、9、12和14天更换，且在培养开始的第16天实施Alcian蓝染色法。
(软骨基质生产)
去除培养基后，添加1ml含4％低聚甲醛的中性缓冲液，并在室温下孵育30分钟，固定每个培养孔中的细胞。然后，用1ml磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤细胞两次，每孔内加入1ml预先过滤的0.1M含0.1％Alcian蓝BGX(Sigma；A3157)(选择性地染色软骨基质蛋白多糖)的盐酸。通过在每个孔内加入0.5ml的6M盐酸胍水溶液解除Alcian蓝。测量在620nm的吸光度，估计每孔中软骨基质总量(蛋白多糖生产总量)，计算每种测试化合物相对于载色剂(100％)的蛋白多糖生产率。结果显示于表10中。
表10
实验化合物        浓度(M)        蛋白多糖生产(％)
赋形剂            -              100
化合物(1)         1×10-4       524
化合物(2)         1×10-6       204
化合物(2)         1×10-5       906
化合物(9)         1×10-6       132
化合物(9)         1×10-5       149
化合物(11)        1×10-6       161
化合物(11)        1×10-5       149
化合物(21)        1×10-6       156
化合物(21)        1×10-5       339
化合物(27)        1×10-6       151
化合物(27)        1×10-5       157
化合物(44)        1×10-5       185
化合物(44)        1×10-4       263
实验实施例4：体外实验
按照上面实验实施例3中完全相同的方法用其他化合物(化合物(52)-(55)和化合物(2)对比)测定软骨基质(蛋白多糖)生产。结果显示于表11中。
表11
实验化合物        浓度(M)         蛋白多糖生产(％)
赋形剂            -               100
化合物(2)         1×10-7M       128
化合物(2)         1×10-6M       183
化合物(2)         1×10-5M       686
化合物(52)        1×10-7M       213
化合物(52)        1×10-6M       774
化合物(52)        1×10-5M       820
化合物(53)        1×10-6M       729
化合物(54)        1×10-6M       171
化合物(54)        1×10-5M       396
化合物(55)        1×10-6M       171
化合物(55)        1×10-5M       188
如在表10和11中所显示，所有具有PDE4抑制剂活性的化合物都显示了软骨基质(蛋白多糖)生产促进作用。尤其是，化合物(1)、(2)、(52)和(53)显示了显著基质生产促进作用。
实验实施例5：软骨细胞的钙化
除使用化合物(1)(10-4M)作为测试化合物外，根据实验实施例3中描述过的“肋软骨细胞的分离”和“助软骨细胞的培养”所描述的方法，处理细胞。去除每个培养孔中的培养基，加入1ml含4％甲醛的中性缓冲液，室温下孵育30分钟固定细胞。用1ml磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤培养孔两次。加入5％硝酸银水溶液(选择性地染色钙化部分)后，室温下孵育培养孔直到显色。用蒸馏水洗涤各孔，加入5％硫代硫酸钠水溶液终止反应，用蒸馏水再次洗涤各孔，然后显相。细胞用1ml 100％乙醇固定1小时，用0.1％茜素红乙醇溶液(来自Sigma)染色1小时，100％乙醇洗涤两次并显相。
结果显示于图1中。如图1中所显示，当细胞在包含一种PDE4抑制剂(化合物(1))的培养基中培养时，经过4周培养可清楚地观察到钙沉积物，证明化合物(1)具有钙化增强作用。
实验实施例6：兔桡骨缺损的再生作用
(水土适应)
日本白兔(雄性；11周龄；4只/组)室温(23±2℃)和湿度55±15％条件下室内饲养7天。在室内饲养期间，动物自由接近市售食物(产自0riental Bio Service；LRC4)。
戊巴比妥钠麻醉下，从兔的右前肢肌肉组织分离桡骨；剥离骨膜用骨钳钳除10mm骨干。将在实施例7-(1)中制备的微球(含8μg或40μg化合物(2))装入一个明胶胶囊(CAPSULGEL，size 5)中，添加在对照实施例2中制备的微球，调节胶囊中微球总量为15mg。将胶囊一个靠一个地放置在骨缺损部分，复位骨膜包裹这些胶囊并缝合骨膜。对照组中，以同样的方法使用添加了在对照实施例2中制备的微球的明胶胶囊。缝合并消毒肌肉和皮肤。缝合6周后，戊巴比妥钠麻醉下放血处死兔，切除桡骨。
(实验结果)
关于切除的右前肢桡骨，骨折线的肩侧定义为近端，向腕部方向离近端5mm处定义为远端。用pQCT(Norland-Stratec；XCT-960A)(Clinical Calcium Vol.10，35-41，2000)测定远端的总(横截面的)骨面积(mm2)和压力-应变指数(SSI：mm3)。
结果显示于图2中。如图2所显示，应用了包含本发明的一种PDE4抑制剂的微球剂的治疗组与对照组相比，总(横截面的)骨面积和压力-应变指数改善。这些结果表明了PDE4抑制剂的效力。
实验实施例7：糖尿病大鼠骨折愈合的加速作用
CD(SD)IGS大鼠(Charles River Japan，Inc.；雄性；7周龄)室温(23±2℃)和湿度55±15％条件下室内饲养7天。在室内饲养期间，大鼠自由接近市售食物(产自Oriental Bio Service；CRF-1)。
(糖尿病的诱发)
将链脲佐菌素(Sigma)(诱发糖尿病)溶解入柠檬酸-缓冲盐水(pH4.5)中得到0.05M链脲佐菌素溶液，以60mg/kg剂量给各鼠静脉注射。一周后，尾端采血，用血糖监测仪(Molecular Devices；M-Spmax250)测定血糖水平。根据测量结果将大鼠分组，使各组间血糖水平不发生显著差异。其平均血糖水平在426.12到428.23mg/dl。
(骨折愈合)
乙醚麻醉下，将大鼠左后腿剃毛，70％酒精消毒，用剪刀暴露腓骨，指甲剪切断腓骨(Natsume Seisakusyo；B17)。腓骨切面用镊子重新对合。实验组(12只大鼠/组)，将在实施例7-(1)中制备的含药微球，含0.03或0.1mg化合物(2)，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。对照组(12只大鼠/组)，将在对照实施例2中制备的同等剂量的不含药微球，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。缝合后，每只动物都用70％酒精消毒。缝合6周后，乙醚麻醉下，剖腹放血处死大鼠，切除腓骨。
(实验结果)
腓骨骨矿含量的测量
在缝合后6周时切除的腓骨中随机选取8根腓骨，在DXA骨密度仪(产自Aloka；DCS-600)下测定骨折区骨矿密度和骨矿含量(扫描宽度：1mm)。结果显示在表12中。
表12
药物 药物含量  骨矿含量(mg)
对照 0  10.25±1.27
化合物(2) 0.03mg  13.69±0.96
化合物(2) 0.1mg  14.60±0.69
如表12所显示，发现PDE4抑制剂，正如在糖尿病模型大鼠中证实的，甚至于对糖尿病性骨折(认为其愈合延迟)具有剂量依赖性的骨矿含量增长效应。
(腓骨强度的测量)
在矿物含量测定中使用的腓骨，用骨强度测定仪(产自MuromachiKikai Co.，Ltd.；TK-252C)进行三点弯曲实验以测定骨强度。简要地，腓骨以相距8mm的两个点支撑，且切面位于两点的正中，即距离相应的两点各4mm。在其中点(骨折面)维持自上向下的负荷(3mm/分钟)直到腓骨出现骨折。断裂骨所需要的最大压力定义为断裂力，断裂骨所需的总能量定义为断裂能。结果显示在表13中。
表13
药物 药物含量 断裂力(N)
对照 0  6.25±0.70
化合物(2) 0.03mg  8.13±1.20
化合物(2) 0.1mg  11.75±2.14
药物 药物含量  断裂能(mJ)
对照 0  0.69±0.08
化合物(2) 0.03mg  1.53±0.39
化合物(2) 0.1mg  2.91±0.82
如表13所显示，发现，正如在糖尿病模型大鼠中证实的，甚至于对糖尿病性骨折(认为其愈合延迟)，PDE4抑制剂增加断裂力和断裂能。
(X线摄影)
用微聚焦放大放射摄影系统(Fuji Photo Film Co.Ltd.；μFX-1000；tube voltage：25kV；tube current：80μA；20 seconds)给4根腓骨缝合后6周时切除的腓骨摄片。
对照组中，骨缺损的空间未被充满。与之相反，在来自测试组的每个样本中，骨缺损的空间被充满，并观察到隆起骨。实验实施例8：正常大鼠骨折区cAMP含量的增加
(水土适应)
CD(SD)IGS大鼠(Charles River Japan，Inc.；雄性；7周龄)室温(23±2℃)和湿度55±15％条件下室内饲养7天。在室内饲养期间，大鼠自由接近市售食物(产自Oriental Bio Service；CRF-1)。
(骨折愈合)
乙醚麻醉下，将大鼠左后腿剃毛，70％酒精消毒；用剪刀暴露腓骨，指甲剪切断腓骨(Natsume Seisakusyo；B17)。腓骨切面用镊子重新对合。实验组(测试化合物-给药组)(6只大鼠/组)，将在实施例7-(1)中制备的含药微球，含0.1mg化合物(2)，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。非治疗组(6只大鼠/组)，将在对照实施例2中制备的同等剂量的不含药微球，用刮勺放置于每只大鼠切开部位的周围，丝线缝合。关于对照组(6只大鼠/组)，腓骨切面用镊子重新对合，不进行任何处理，丝线缝合。缝合后，所有动物都用70％酒精消毒。在缝合后的0、3、7、14、28或42天，各组中的6只大鼠，乙醚麻醉下，剖腹放血处死，切除腓骨。
(cAMP含量的测量)
将所切除腓骨的骨折段切成1cm小块，液氮冷冻。将生成的小块在-80℃磨碎，悬浮于300μ16％三氯乙酸中，声处理灭菌。12000rpm离心悬浮液15分钟。乙醚萃取上清液，去除三氯乙酸，75℃孵化5分钟以从上清液中去除乙醚。用cAMP EIA系统(Amersham PharmaciaBiotech)测量生成的上清液中的cAMP。
(实验结果)
cAMP的测量结果显示于图3中。如图3所显示，在非PDE4治疗组(▲)和对照组(○)中，cAMP的数量(cAMP含量)渐渐地升高且，在第7天达到峰值后，逐渐下降。另一方面，在治疗组(●)中，cAMP含量显著升高，在第7天达到其峰值，并迅速返回到与对照组相同的水平。这些结果提示细胞内cAMP分解被PDE4抑制剂所防止，导致骨折区cAMP含量升高。
实验实施例9：糖尿病大鼠骨折区cAMP含量的升高
(水土适应)
CD(SD)IGS大鼠(Charles River Japan，Inc.；雄性；8周龄)室温(23±2℃)和湿度55±15％条件下室内饲养7天。在室内饲养期间，大鼠自由接近市售食物(产自Oriental Bio Service；CRF-1)。
(糖尿病的诱发)
将链脲佐菌素(“STZ”，Sigma)(诱发糖尿病)溶解入柠檬酸-缓冲盐水(pH4.5)中得到0.05M链脲佐菌素溶液，以60mg/kg剂量给各鼠静脉注射。一周后，尾端采血，用血糖监测仪(MolecularDevices；M-Spmax250)测定血糖水平。根据测量结果将大鼠分组，使各组间血糖水平不发生显著差异。其平均血糖水平在404.5到410.00mg/dl。
(骨折愈合)
乙醚麻醉下，将糖尿病大鼠(5个组，5只大鼠/组)和正常大鼠(5个组，5只大鼠/组)的左后腿剃毛，70％酒精消毒，用剪刀暴露腓骨，指甲剪切断腓骨(Natsume Seisakusyo；B17)。腓骨切面用镊子对合，之后以丝线缝合。缝合后，全部动物用70％酒精消毒。在缝合后的0、3、7、14或28天，乙醚麻醉下，剖腹放血处死每个组中的5只大鼠，切除腓骨。
(cAMP含量的测量)
将所切除腓骨的骨折段切成1cm小块，液氮冷冻。将生成的小块在-80℃磨碎，悬浮于300μl 6％三氯乙酸中，声处理灭菌。12000rpm离心悬浮液15分钟。乙醚萃取上清液，去除三氯乙酸，75℃孵化5分钟以从上清液中去除乙醚。用cAMP EIA系统(Amersham PharmaciaBiotech)测量生成的上清液中的cAMP。
(实验结果)
在STZ-处理组(糖尿病大鼠)(○)和用PDE4抑制剂治疗后的非STZ-处理组(正常大鼠)(●)中cAMP的测量结果(代表骨折区的cAMP含量)显示于图4中。
实施例1
(1)向0.1g化合物(1)和1.9g乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸∶羟基乙酸＝50∶50；平均分子量20,000；PLGA5020：Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)加入4.0g二氯甲烷，充分地振摇该混合物以形成一个油相(O)。
(2)将该油相加入8ml 0.5％聚乙烯醇(POVAL PVA-220C：KurarayCo.，Ltd.)水溶液中，用均化器(Polytron，Kinematica A.G.)25℃乳化5分钟，以形成(O/W)乳状液，其中油相被分散入水相中。
(3)将该乳状液加入到1000ml蒸馏水中，用Three-one motor(Shinto Scientific Co.，Ltd.)400rpm搅拌，按水内干燥法25℃下干燥3小时以去除二氯甲烷。
(4)所生成的微球悬浮液经150μm过滤器过滤以去除聚集体，且经20μm过滤器减压过滤以去除水相。所生成的微球与少量蒸馏水结合，冻干得到1.6g微球。
将10mg所得微球溶解入3ml乙腈中。将该溶液与7ml 0.5M氯化钠水溶液结合，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATO ScientificCo.，Ltd.)搅拌，然后2000rpm离心5分钟以分离上清液。将一部分上清液装填上FL-HPLC(Column；Hypersil 5-ODS，直径：4mm，长度：300mm，GL Sciences，Inc.，激发波长：315nm，荧光波长：465nm)，上清液中药物浓度通过与预先单独用药物溶液制备的标准曲线比较来测定。根据所得浓度和上清液的容积，估计微球中的药物含量为4.21％。
将适量的所得微球分散入聚氧乙烯疏水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween80：Nikko Chemicals Co.，Ltd.)的稀溶液中。用一种粒子大小分析仪SALD-1100(Shimadzu Corporation)测量粒子分布，并计算平均粒子大小。平均的粒子大小为57μm。
(5)在终末药物浓度为2.5mg/ml时，将在上面(4)中获得的微球加入含0.5％羧甲基纤维素钠(Nichirin Chemical Industries)和0.1％聚氧乙烯疏水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween80：Nikko ChemicalsCo.，Ltd.)生理盐水(分散介质)中，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATO Scientific Co.，Ltd.)充分搅拌该混合物，产出微球分散体。
实施例2
(1)除了使用0.57g乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸∶羟基乙酸＝50∶50；平均分子量20,000；PLGA5020：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和1.33g乳酸聚合物(平均分子量20,000；PLA0020：Wako PureChemical Industries，Ltd.)之外，以类似于实施例1-(1)到(4)中描述的方法制备微球(1.6g)。
微球的药物含量和平均粒子大小以类似于实施例1-(4)中描述的方法测量，并证明相应为3.70％和47.7μm。
(2)在上面(1)中获得的微球以类似于实施例1-(5)中描述的方法处理，以得到微球分散体(药物比率：2.5mg/ml)。
实施例3
(1)除了使用乳酸聚合物(平均分子量20,000；PLA0020：WakoPure Chemical Industries，Ltd.)之外，以类似于实施例1-(1)到(4)中描述的方法制备微球(1.5g)。
微球的药物含量和平均粒子大小以类似于实施例1-(4)中描述的方法测量，并证明相应为3.73％和52.2μm。
(2)在上面(1)中获得的微球以类似于实施例1-(5)中描述的方法处理，以得到微球分散体(药物比率：2.5mg/ml)。
实施例4
(1)向0.2g化合物(1)和0.3g乳酸聚合物(平均分子量20,000；PLA0020：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)加入1.0g二氯甲烷，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATO Scientific Co.，Ltd.)充分地振摇该混合物以形成一个油相(O)。
(2)将该油相加入4ml 0.25％甲基纤维素(METOLOSE：Shin-EtsuChemical Co.，Ltd.)水溶液中，用均化器(Polytron，KinematicaA.G.)25℃乳化5分钟，以形成(O/W)乳状液，其中油相被分散入水相中。
(3)将该乳状液加入到400ml蒸馏水中，用Three-one motor(Shinto Scientific Co.，Ltd.)400rpm搅拌，按水内干燥法25℃下干燥3小时以去除二氯甲烷。
(4)所生成的微球悬浮液经150μm过滤器过滤以去除聚集体，且经20μm过滤器减压过滤以去除水相。所生成的微球与少量蒸馏水结合，冻干得到微球。微球的药物含量和平均粒子大小以类似于实施例1-(4)中描述的方法测量，并证明相应为39.6％和33.4μm。
实施例5
(1)向0.05g化合物(1)和0.45g乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸∶羟基乙酸＝50∶50；平均分子量20,000；R202H：Boehringer IngelheimCo，Ltd.)加入1.0g二氯甲烷，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATOScientific Co.，Ltd.)充分地振摇该混合物以形成一个油相(O)。
(2)将该油相加入40ml 0.5％聚乙烯醇(GOHSENOL EG-40：TheNippon Synthetic Chemical Industry Co.，Ltd.)水溶液中，用均化器(Polytron，Kinematica A.G.)25℃乳化4分钟，以形成(O/W)乳状液，其中油相被分散入水相中。
(3)将乳状液倒入一个内含400ml净化水的圆筒形的气密容器中(内径：110mm；容积1000ml)，当通入氮气到插入到由容器中的硅橡胶(NAGAYANAGI Co.，Ltd.)制成的筒形中空纤维膜模件的中空纤维时(气体流量为2L/分钟)，使用配备Three-one motor(BL-600；HEIDON)的4-叶片螺旋桨式搅拌器(直径：50mm，R型螺旋桨式搅拌器：HEIDON)25℃和400rpm下通过搅拌从容器中去除二氯甲烷。此步骤实施1小时。
此步骤中使用的硅橡胶制成的筒形中空纤维膜模件是以下规格的筒形NAGASEP M60-1800。
圆筒直径                  ：100mm
圆筒长度                  ：120mm×120mm
中空纤维膜的膜厚度        ：60μm
中空纤维膜的内部直径      ：200μm
中空纤维膜的外部直径      ：320μm
中空纤维数                ：1800
中空纤维膜的有效膜面积    ：0.15m2
(4)所生成的微球悬浮液经150μm过滤器过滤以去除聚集体，且经20μm过滤器减压过滤以去除水相。将所生成的微球与少量蒸馏水结合，冻干得到0.26g微球。微球的药物含量和平均粒子大小以类似于实施例1-(4)中描述的方法测量，并证明相应为3.07％和71.7μm。
实施例6
(1)向0.05g化合物(2)和0.45g乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸∶羟基乙酸＝50∶50；平均分子量20,000；RG502H：Boehringer IngelheimCo.，Ltd.)加入2.5g二氯甲烷，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATO Scientific Co.，Ltd.)充分地振摇以形成一个油相(O)。
(2)将该油相加入3ml 0.5％聚乙烯醇(POVAL PVA-220C：KurarayCo.，Ltd.)水溶液中，用均化器(Polytron，Kinematica A.G.)22℃乳化5分钟，以形成(O/W)乳状液，其中油相被分散入水相中。
(3)重复上面步骤(1)和(2)5次。合并所生成的乳状液(来自5次试验)，加入到1000ml蒸馏水中，用Three-one motor(ShintoScientific Co.，Ltd.)400rpm搅拌，25℃1.5小时、40℃ 1小时和25℃ 0.5小时实施水内干燥以去除二氯甲烷。
(4)所生成的微球悬浮液经150μm过滤器过滤以去除聚集体，且经20μm过滤器减压过滤以去除水相。所生成的微球与少量蒸馏水结合，冻干得到2.3g微球。
将10mg该微球溶解入3ml乙腈中。将该溶液与6ml 0.5M氯化钠水溶液结合，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATO Scientific Co.，Ltd.)搅拌，然后2000rpm离心5分钟以分离上清液。将一部分上清液装填上UV-HPLC(Column；Hypersil 5-ODS，直径：4mm，长度：300mm，GL Sciences，Inc.，检出波长：240nm)，上清液中药物浓度通过与预先单独用药物溶液制备的标准曲线比较来测定。根据生成物浓度和上清液的容积，估计微球中的药物含量。进一步，以类似于实施例1-(4)中描述的方法测量平均粒子大小。结果，药物含量为9.9％，平均的粒子大小为26.4μm。
(5)以类似于实施例1-(5)中描述的方法处理在上面(4)中获得的微球，得到微球分散体(药物比率：0.1mg/ml)。
实施例7
(1)除了使用乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸∶羟基乙酸＝75∶25；平均分子量20,000；PLGA7520：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)之外，以类似于实施例6-(1)到(4)中描述的方法制备微球(2.2g)。
微球的药物含量和平均粒子大小以类似于实施例6-(4)中描述的方法测量，并证明相应为10.1％和27.0μm。
(2)在上面(1)中获得的微球以类似于实施例6-(5)中描述的方法处理，以得到微球分散体(药物比率：0.1mg/ml)。
对照实施例1(实施例2的对照)
(1)向0.6g乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸∶羟基乙酸＝50∶50；平均分子量20,000；PLGA5020：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和1.4g乳酸聚合物(平均分子量20,000)中加入4.0g二氯甲烷，充分地振摇该混合物以形成一个油相(O)。按照在实施例1-(1)到(4)中描述的步骤，得到1.7g不含药物的微球。
(2)空白对照分散体溶液的制备
以类似于实施例1-(5)中描述的方法处理在上面(1)中获得的微球，以制备微球分散体。
对照实施例2(实施例7的对照)
向0.45g乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸∶乙酸＝75∶25；平均分子量20,000；PLGA7520：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)加入2.0g二氯甲烷，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATO ScientificCo.，Ltd.)充分地振摇该混合物以形成一个油相(O)。按照在实施例6-(2)到(4)中描述的步骤，得到2.2g不含药物的微球。
测试实施例1
向一支测试管中的10mg微球中加入10ml含0.05％Tween 80的磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)，用旋转培养器在一个空气温度控制箱中37℃ 25rpm搅拌。从开始搅拌起，到规定时间时，将测试管离心(2000rpm，5分钟)，9ml上清液被取样并装填上FL-HPLC(Column；Hypersil 5-ODS，直径：4mm，长度：300mm，GL Sciences，Inc.，激发波长：315nm，荧光波长：465nm)，药物含量通过与单独用药物溶液制备的标准曲线比较来测定。根据结果和样品的容积，估计药物的洗脱数量。
进一步，通过将9ml磷酸盐缓冲盐水加入到取样后的测试管中，并同样条件下实施相同的步骤，包括搅拌、取样和估计，来有规律地重复药物的洗脱数量的估计。
在最终取样后，从测试管中去除剩余的eluate，残留的微球中的药物含量根据在实施例1-(4)中描述的方法测定。
以上步骤对在实施例1到3中获得的微球实施。结果显示于图5中。
洗脱率的计算是基于从微球中洗脱的药物与保留在微球中的药物的总和为100％的假设。
测试实施例2
雄性SD大鼠(7周龄，3只大鼠/组，Japan SLC)在12小时昼-夜循环下室温(23±2℃)室内饲养适应一周，同时任意进食和饮水。然后以每只动物0.5ml的剂量给每只大鼠从股静脉快速注射溶解在含10％聚乙二醇400(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的生理盐水中的化合物(1)(1mg/ml)(总药物剂量：每只大鼠0.5mg)。
给药后，乙醚麻醉下，用含肝素的注射器从颈静脉以规律的时间间隔采集血液标本，并经离心获得血浆标本。向0.1ml血浆中加入0.2ml内部标准溶液和1M磷酸氢二钾，然后加入7.0ml氯仿。混合物振荡10分钟，离心5分钟以分离5ml有机相。所生成的有机相40℃氮气下蒸发至干燥，重新溶解入0.5ml流动相中，然后装填上FL-HPLC(Column；Hypersil 5-ODS，直径：4mm，长度：300mm，GL Sciences，Inc.，激发波长：315nm，荧光波长：465nm)以测定血浆浓度。结果显示于图6中。
测试实施例3
雄性SD大鼠(7周龄，5只大鼠/组，Japan SLC)在12小时昼-夜循环下室温(23±2℃)室内饲养适应一周，同时任意进食和饮水。然后以每只大鼠2ml的剂量给每只大鼠从背部皮下注射在实施例1-(5)、2-(2)或3-(2)中获得的微球分散体(总药物剂量：每只大鼠5mg)。给药后，乙醚麻醉下，用含肝素的注射器从颈静脉以规律的时间间隔采集血液标本，并经离心获得血浆标本。血浆中该化合物的浓度以类似于实施例2中描述的方法测定。甚至于当与静脉注射仅含十分之一量的PDE4抑制剂(测试实施例2)时达到的血浆浓度相比时，作为将PDE4抑制剂配制到微球中的结果，PDE4抑制剂的最大血浆浓度能减少至1/25到1/100。结果显示于图7中。
测试实施例4
雄性SD大鼠(7周龄，5只大鼠每组，Japan SLC)在12小时昼-夜循环下室温(23±2℃)室内饲养适应一周，同时任意进食和饮水。然后以每只大鼠2ml的剂量给每只大鼠从背部皮下注射在实施例2-(2)中获得的微球分散体(总药物剂量：每只大鼠5mg)。
在给药后的3、7、10、14、21和35天，从给药部位收集微球。向所收集的微球中加入5ml含内对照物质的乙腈，以均化器(Polytron，Kinematica A.G.)溶解。在3000rpm离心5分钟后，采集3ml上清液，与7ml 0.5M氯化钠水溶液结合，用混合器(Touchmixer MT-51：YAMATO Scientific Co.，Ltd.)搅拌，然后2000rpm离心5分钟以分离上清液。将一部分上清液通过KC prep-omni 13(Katayama Chemistry Inc.)过滤并装填上FL-HPLC(Column；Hypersil 5-ODS，直径：4mm，长度：300mm，GL Sciences，Inc.，激发波长：315nm，荧光波长：465nm)。药物浓度通过与单独用药物溶液制备的标准曲线比较来测定。根据所得浓度和上清液的容积，计算保留在微球中的药物的残留率。结果显示于图8中。
测试实施例5
雄性SD大鼠(7周龄，Japan SLC)在12小时昼-夜循环下室温(23±2℃)室内饲养适应一周，同时任意进食和饮水。然后以每只大鼠1ml的剂量给每只大鼠从背部皮下注射在实施例6-(5)和7-(2)中获得的含化合物(2)的微球分散体(总药物剂量：每只大鼠0.1mg)。
以规律的时间间隔从给药部位收集微球。向所收集的微球中加入10ml乙腈，以均化器(Polytron，Kinematica A.G.)溶解。在3000rpm离心5分钟后，采集3ml上清液，与6ml 0.5M氯化钠水溶液结合，用混合器(Touch mixer MT-51：YAMATO Scientific Co.，Ltd.)搅拌，然后2000rpm离心5分钟以分离上清液。将一部分上清液通过KCprep-omni 13(Katayama Chemi stry Inc.)过滤并装填上UV-HPLC(Column；Hypersil 5-ODS，直径：4mm，长度：300mm，GL Sciences，Inc.，检测波长：240nm)。药物浓度通过与单独用药物溶液制备的标准曲线比较来测定。根据所得浓度和上清液的容积，计算保留在微球中的药物的残留率。结果显示于图9中。
工业实用性
本发明的骨折愈合加速化合物包括作为活性成分的一种PDE4抑制剂，它，当局部应用于骨折区时，通过加速修复期内软骨骨化能促进骨折愈合，不伴随PDE4抑制剂的全身作用引起的副作用，并能够加速老年人、糖尿病或骨质疏松症患者早期骨折(正在成为近年的一个主要社会问题)的愈合，凭此发挥防止患者卧床不起的作用并保证他们的正常的日常生活。通过将含PDE4抑制剂和可生物相容的及可生物降解的聚合物的组合物配制成存储剂，特别是配制成注射用微球剂，和通过在骨折区局部应用同种制剂从而让功效持续，还能达到更高的效应。

Claims (19)

1.一种用于加速骨折愈合的组合物，其包括作为一种活性成分的一种PDE4抑制剂。
2.权利要求1的组合物，其被这样制备以致于在骨折区逐渐释放该种PDE4抑制剂。
3.权利要求2的组合物，其包括一种可生物相容的和可生物降解的聚合物。
4.权利要求3的组合物，其中可生物相容的和可生物降解的聚合物是水不溶性的。
5.权利要求4的组合物，其是以微球剂的形式。
6.权利要求5的组合物，其中微球的粒子大小为0.1-150μm。
7.权利要求5或6的组合物，其中该PDE4抑制剂的重量比含量为0.0001-80％。
8.权利要求4到7中任何一项的组合物，其中水不溶性的可生物相容的和可生物降解的聚合物为一种羟基脂肪酸聚酯。
9.权利要求8的组合物，该种水不溶性的可生物相容的和可生物降解的聚合物为选自乳酸聚合物、乳酸-羟基乙酸共聚物和2-羟基丁酸-羟基乙酸共聚物组成的组中的一种或多种的聚合物。
10.权利要求8或9的组合物，该种水不溶性的可生物相容的和可生物降解的聚合物具有2000-800000的平均分子量。
11.权利要求5到10中任何一项的组合物，其是通过分散0.0001-1000mg/ml浓度的微球入含有一种分散体的水溶液中所制备的一种可注射的微球剂。
12.权利要求11的组合物，其中包含0.01-2％重量浓度的一种分散体。
13.权利要求11或12的组合物，其中该分散体是选自聚氧乙烯疏水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙烯蓖麻油、羧甲基纤维素钠、藻酸钠、葡聚糖和透明质酸钠组成的组中的一种或多种的分散体。
14.权利要求1到13中任何一项的组合物，其中该PDE4抑制剂是一种选择性PDE4抑制剂。
15.权利要求1到14中任何一项的组合物，其中该PDE4抑制剂IC50小于100nM。
16.权利要求1到15中任何一项的组合物，其中该PDE4抑制剂是具有下面具有PDE4抑制剂活性的一部分结构的一种化合物：
(A)萘或其一种类似化学结构；或
(B)3-环戊氧基-4-甲氧苯基或其一种类似化学结构。
17.权利要求1到16中任何一项的组合物，其中该PDE4抑制剂是具有PDE4抑制剂活性的具有萘或异喹啉骨架的一部分结构的一种化合物或它们的可药用盐。
18.权利要求17的组合物，其中该PDE4抑制剂是2，3-双(羟甲基)-6，7-二乙氧基-1-[1-(2-甲氧基乙基)-2-氧代-4-吡啶基]萘或2，3-双(羟甲基)-6，7-二乙氧基-1-[2-(4-(3-吡啶基)-1(2H)-phthaladinon-2-基)-4-吡啶基]萘或它们的一种可药用盐。
19.一种用于制备可注射制剂的组合物，其可通过将权利要求5到10中任何一项阐明的微球悬浮到包含一种聚集抑制剂的水溶液中，并冻干生成的悬浮液获得。
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