KR20040007596A - 골절 치료 촉진용 조성물 - Google Patents

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KR20040007596A KR10-2003-7015231A KR20037015231A KR20040007596A KR 20040007596 A KR20040007596 A KR 20040007596A KR 20037015231 A KR20037015231 A KR 20037015231A KR 20040007596 A KR20040007596 A KR 20040007596A
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나오끼 사꾸라이
도시끼 다까기
노리유끼 야나까
유지 호리끼리
다까시 다무라
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다나베 세이야꾸 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 유효 성분으로서 PDE4 저해제를 함유하는 골절 치료 촉진용 조성물에 관한 것으로, 특히 PDE4 저해제, 및 생체적합성 및 생분해성 중합체를 함유하는 조성물을 제공하며, 이 조성물을 마이크로스피어 제제와 같은 국부 투여에 적합한 형태로 제형화하는 경우, 골절의 초기 치료에 뛰어난 효과를 나타내는 약학 조성물을 제공할 수 있다. 상기 조성물은 고령자 및 당뇨병 또는 골다공증 환자의 난치성 골절의 치료에 유용하다.

Description

골절 치료 촉진용 조성물{COMPOSITIONS FOR PROMOTING HEALING OF BONE FRACTURE}
골절은 골 조직의 생리학적 연속성이 일부 또는 전부 부러진 상태로, 그 발생 메카니즘에 근거하여 일반적으로 (a) 외부 힘에 의한 골절, (b) 병적 골절, 및 (c) 피로 골절로 분류된다. 또한, 골절 상태는 골절선 (골 절단에 의해 발생된 뼈 끝단을 따른 선)에 근거하여, 균열골절, 그린스틱 (greenstick) 골절, 횡상 골절, 사상 골절, 나선상 골절, 분절골절, 분쇄골절, 견열골절, 압박골절, 함몰골절 등으로 분류된다 (IGAKU-DAIJITEN, 18 판, pp. 719-720, Nanzando 출판).
일반적으로, 골절의 치료에는 상당한 기간이 걸리며, 이는 일상 생활에 장애가 될 수 있다. 또한, 인구 고령화에 따라 병적 골절의 하나인 골다공증 환자의 골절이 현저히 증가되고 있다. 특히, 대퇴부 경부 골절 (transcervicalfracture)는 장기간 입원이 요구되며, 장기 입원으로 인한 치매 등을 포함한 내과적 합병증을 종종 발현하여, 이는 주요한 사회문제 및 경제적 이슈가 되고 있다.
골절 치료 과정은 크게 하기의 삼단계로 분류되며 ("Kossetsu Chiryougaku (골절치료학)", 2000 년 4 월, pp. 29~37, 46~51, Nanko-do), 골절 치료에 있어서 중요한 단계인 수복기 중의 치료 과정은 골 형성 및 골 용해 (골 흡수)가 반복적으로 일어나는 골 리모델링 (remodeling) 단계와 상이한 메카니즘으로 진행되는 것으로 생각된다.
(1) 염증기: 골 주변의 조직이 손상되고, 골절 간극에 혈종이 차게되어, 골절 부위에 염증이 발생됨.
(2) 수복기: 골절 간극 내에서 혈종이 제거되어 육아 (granulation) 조직으로 되고, 연가골 (soft callus)이 형성되고, 점진적으로 골 형성 메카니즘에 의해 경가골로 치환되는 과정 (연골내 골화), 및 골막에 존재하는 골 형성 세포에 의해 새로운 골이 형성되는 과정 (섬유성/막 내 골화)인 2 개의 과정이 병행하여 진행됨.
(3) 리모델링기: 형성된 새로운 골이, 골 흡수 및 골 형성의 반복에 의해 장기간에 걸쳐 신장되는 한편, 골 변형이 교정되고, 골 결함 부위가 보강됨.
리모델링기 동안 형성된 새로운 골은 일정 정도의 강도를 가져, 일상생활이 덜 제한받게 되지만, 수복기는 오랜 기간이 걸려, 이는 환자의 일상생활을 크게 제한한다. 따라서, 수복기 기간을 단축하는 것이 임상적으로 중요하다.
골절 치료를 촉진하는 성분으로서, 골 형성단백질 (BMP), 변형 성장인자(TGF)와 같은 펩티드형의 생리학적 활성 성분이 개시되어 왔다 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 87, pp. 2220-2224 (1989)). 또한, 하기 화학식의 화합물 (JP-04-364179A (1992))을 골 형성 촉진제로서 함유하고, 이를 락트산-글리콜산 공중합체 (PLGA)로 마이크로캡슐화한 국부 투여용 약학 제제가 JP-09-263545A (1997)에 개시되어 있다.
포스포디에스테라아제 (PDE) 저해제를 사용하여 세포내 환형 AMP (cAMP) 수준을 증가시킴으로써 골 질량을 향상시키는 가능성이 연구되었으며, 일반적인 PDE 저해제인 펜톡시필린, 또는 선택적인 PDE4 저해제인 롤리프람을 매일 피하주사받은 마우스에서 척추 및 대퇴골의 골 무기질 밀도의 증가 및 겉질 뼈 (cortical bone)의 과다형성이 관찰된다는 것이 보고되었다 (Bone, vol. 27., 6 판, pp. 811-817 (2000)).
그러나, 상기 조사는 리모델링 과정 동안의 골 형성 부위인 일반적인 부위에 대한 약리학적 효과에 중점을 둔 것으로, 골절 부위에 대한 것은 아니며, PED4 저해제의 골절 치료 촉진 활성에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다.
본 발명은 골절 치료 촉진용 조성물, 특히 PDE4 저해제를 함유하고, 바람직하게는 생체적합성 및 생분해성 중합체와 함께 PDE4 저해제를 유효성분으로서 함유하고, 특히 마이크로스피어 (microsphere) 제제 형태이며, 보다 바람직하게는 마이크로스피어 함유 주사용 제제이고, 국부 투여시 골절 치료를 촉진할 수 있는, 골절 치료 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다.
도 1 은 토끼의 늑연골 세포에서 화합물 (1)의 연골세포의 석회화 (칼슘 침착) 효과를 나타내는 사진의 모식도이다.
도 2 는 PDE4 저해제 (화합물 (2)) 마이크로스피어로 처리된 토끼에서 결손 요골의 재생을 나타내는 그래프이다. 총 골 면적 (단면적) (㎟) 또는 응력 변형 (stress-strain) 지수 (SSI: ㎣) 및 화합물 (2) 의 투여량의 관계를 각각 아래 위 도에 나타낸 것이다.
도 3 은 PDE4 저해제 (화합물 (2)) 마이크로스피어로 처리된 쥐의 종아리뼈 (fibula) 골절 부위에서의 시간에 따른 cAMP 의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 4 는 정상 및 STZ-유도된 당뇨 쥐에서의 종아리뼈 골절 부위에서의 cAMP 함량을 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5 는 실시예 1-(4), 2-(1) 및 3-(1)에서 수득된 마이크로스피어의 시험관내 용출 특성을 나타내는 그래프이다.
도 6 은 정맥 투여된 화합물 (1) 의 혈장 농도를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. 데이타는 평균 ± 표준편차 (n=3)로 나타내었다.
도 7 은 실시예 1-(5), 2-(2), 또는 3-(2)에서 수득된 마이크로스피어 분산액의 피하 주사 후, 유효성분의 혈장 농도를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. 데이타는 평균 ± 표준편차 (n=5)로 나타내었다.
도 8 은 실시예 2-(2) 에서 수득된 마이크로스피어 분산액의 피하 주사 후, 제제 중에 잔류하는 화합물 (1)의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이다. 데이타는 평균 ± 표준편차 (n=5)로 나타내었다.
도 9 는 실시예 6-(5) 또는 7-(2)에서 수득된 마이크로스피어 분산액의 피하 주사 후, 제제 중에 잔류하는 화합물 (2)의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이다. 데이타는 평균 ± 표준편차 (n=5)로 나타내었다.
발명을 실시하기 위한 최상의 모드
본 발명의 골절 치료 촉진 조성물은, 특히 수복기 중의, 골절 치료 과정에 뛰어난 효과를 갖는다. 본 발명의 조성물은, 골절 부위에서 연가골이 형성되고, 이어서 경가골로 치환되는 연골내 골형성을 촉진함으로써 골절 치료를 촉진할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분으로서 PDE4 저해제와 그를 위한 종래의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제를 조합함으로써 제조할 수 있다. 바람직한 약학 조성물은 PDE4 저해제(들)과 생체적합성 및 생분해성인 중합체(들)을 함유하는 국부 투여용 서방성 조성물이다. 상기 국부 투여용 조성물은 마이크로스피어의 형태인 것이 더욱 바람직하며, 마이크로스피어는 주사용 제제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 유효 성분으로서 사용될 수 있는 PDE4 저해제의 예들은 PDE4 저해 활성을 갖는 모든 화합물들, 예를 들면, JP 제 05-229987A호(1993), JP 제 09-59255A호(1997), JP 제 10-226685A호(1998), EP 제 158380호, WO/94/25437호, US 특허 제 5,223,504호, WO/95/4045호, EP 제 497564호, EP 제 569414호, EP 제 623607호, EP 제 163965호, US 특허 제 5,605,914호, WO/95/35282호, WO/96/215호, US 특허 제 5,804,588호, US 특허 제 5,552,438호, WO/93/9118호, WO/96/31485호, EP 제 459505호, WO/97/22585호, EP 제 738715호, WO/91/16314호, WO/96/218호, WO/97/18208호, EP 제 158380호, WO/99/50270호, EP 제 260817호, WO/98/11113호, WO/94/22852호, EP 제 432856호, US 특허 제 4193926호, WO/98/13348호, WO/96/6843호, JP 제 2000-503678A호(WO/98/14432호), JP 제 2000-502724A호(WO/98/9961호), JP 제 2000-510105A호(WO/97/40032호), JP 제 2000-514804A호(WO/98/2440호), JP 제 2000-502350A호(WO/97/23457호), JP 제2000-501741A호(WO/97/2585호) 등에 기재되어 있는 것들을 포함한다.
PDE는 "Trends in Pharmacological Sciences, vol. 11, pp. 150-155"의 가르침에 따르면 PDE1-5로 분류될 수 있고, 본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물에 적합한 PDE4 저해제들은 바람직하게는 다른 것들 (PDE1-3, 5)에 비교시, PDE4에 대해 더 높은 저해 활성을 갖는 PDE4에 대해 선택적이며, 다른 PDE들보다 PDE4에 대해 10 배 이상의 저해 활성을 갖는 것이 더욱 바람직하다. PDE4에 대한 그러한 PDE4 저해제의 저해 활성은 특히 바람직하게는 50 배 이상이지만, 더욱 바람직하게는 다른 PDE들에 대한 저해활성 보다 100 배 이상이다.
바람직한 PDE4 저해제들은, "Advances in Cyclic Nucleotide Research", vol. 10, pp. 69-92, 1979, Raven Press 에 기재된 방법에 의해 측정시 PDE4 저해 활성의 IC50이 0.1-1,000 nM, 바람직하게는 0.1-100 nM, 더욱 바람직하게는 100 nM 미만인 화합물들이다.
선택적인 PDE4 저해제들의 구체적인 예들은 하기 식들로 표현되는 화합물 (1)-(57) 또는 그들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
PDE4 저해 활성을 갖는 화합물들은 화학적 구조에 따라서 하기의 (A) 내지 (D)로 분류될 수 있고, 본 발명을 위한 PDE4 저해제는 그러한 화합물들 중에서 적당하게 선택될 수 있지만; 바람직한 화합물들은 (A)와 (B)에 속하며, 특히 (A)이다.
(A) 나프탈렌 골격 또는 그에 유사한 부분 구조를 갖는 화합물들 [예를 들면, 화합물 (1), (2), (38), (47) 및 (52) 내지 (57)];
(B) 3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐 구조 또는 그에 유사한 부분 구조를 갖는 화합물들 [예를 들면, 화합물 (6), (9), (11), (12), (14), (17), (19), (20), (21), (24), (25), (26), (27), (33), (34), (35), (39), (40), (44), (49), (50) 및 (51)];
(C) 잔틴 골격 또는 그에 유사한 부분 구조를 갖는 화합물들 [예를 들면, 화합물 (5), (7), (28), (29), (30), (31), (32),(36), (37), (41), (43) 및 (46)]; 및
(D) 상기 (A) 내지 (C)에 기재된 것들과 상이한 구조를 갖는 화합물들 [예를 들면, 화합물 (3), (4), (8), (10), (13), (15), (16), (18), (22), (23), (42), (45) 및 (48)].
그룹 (A)의 화합물의 예는 하기 화학식 I 내지 III 에서 나타낸 것과 그들의 약학적으로 허용가능한 염들을 포함한다.
식 중, R1및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 수소 원자, 히드록실기, 시클로-저급 알킬옥시기, 또는 임의 치환된 저급 알콕시기, 또는 말단에서 함께 결합하여 저급 알킬렌디옥시기를 형성하며;
R3는 임의 치환된 질소-함유 6 원 헤테로시클릭기; 및 -OR4및 -OR5는 동일하거나 상이하며, 각각 임의 보호된 히드록실기이다 (JP 제 05-229987A호(1993)).
식 중, R1'및 R2'는 동일하거나 상이하며, 각각 수소 원자 또는 임의 보호된 히드록실기이며;
R3'및 R4'중 하나는 임의 보호된 히드록시-치환 메틸기이고, 다른 하나는 수소 원자, 저급 알킬기 또는 임의 보호된 히드록시-치환 메틸기이며;
R5'및 R6'는 동일하거나 상이하며, 각각 수소 원자, 임의 치환된 저급 알킬기, 임의 치환된 페닐기 또는 임의 보호된 아미노기, 또는 말단에서 함께 결합하고, 인접 질소원자와 결합하여 임의 치환된 헤테로시클릭기를 형성한다 (JP 제 09-59255A호, (1993)).
식 중, A 는 하기 식들로 나타낸 것들 중에서 선택된 기이다:
식 중, R1"및 R2"는 동일하거나 상이하며, 각각 수소 원자 또는 임의 보호된 히드록실기이며;
R31은 임의 보호된 히드록시메틸기;
R32는 수소 원자, 저급 알킬기 또는 임의 보호된 히드록시메틸기;
R33은 임의 치환된 저급 알킬기;
R41은 임의 보호된 히드록시 메틸기;
R42는 임의 보호된 히드록시 메틸기;
점선은 이중 결합의 존재 또는 부재를 나타내며;
R5"및 R6"은 동일하거나 상이하며, 각각 수소 원자 또는 임의 보호된 아미노기이거나, 또는 말단에서 함께 결합하고, 인접 질소원자와 결합하여 임의 치환된 헤테로시클릭기를 형성한다 (JP 제 10-226685A호(1998)).
본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물의 유효 성분인 PDE4 저해제로서, 그룹 (A) 중에서, 나프탈렌 또는 이소퀴놀린 골격을 갖는 화합물 및 그들의 약학적으로 허용가능한 염을 갖는 화합물들이 더욱 바람직하며, 화합물 (1) 및 (2) 및 그들의 약학적으로 허용가능한 염들이 보다 더 바람직하다.
PDE4 저해제들은 전신에 작용할 때에는 투약량에 따라서 구토 또는 위산 분비를 유발할 수 있으므로 (Cellular Signaling, 9 (3-4), pp. 227-236 (1997)), 본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물은 골절 부위 부근에 국부적으로 적용되어, 전신 혈액 중의 약물 농도가 증가되지는 않지만 골절 부위에서의 농도는 유지되도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 조성물을 서방성 형태로 제형화하는 것이 바람직하며, 이는 유리하게 투여의 빈도를 줄일 수 있고, 또한 환자들의 부담을 줄일 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 구현예들의 예들은 국부 투여시 약물을 서서히 방출하는 저장 제제들 (예를 들면, 펠렛 제제, 겔 제제, 매트릭스 제제, 마이크로스피어 제제, 약물을 생체적합성 및 생분해성인 중합체의 수용액에 첨가함으로써 수득되는 서방성 제제, 투여 시에는 액체이며 투여 후 생체 내에서 겔을 형성하도록 고안된 제제, 정형외과 분야에서 일반적으로 사용되는 것으로 보고된 다양한 기질들에 임베딩된(embedded) 제제 등)을 포함한다.
펠렛 제제들의 예로는 약물 및 알콜 등에 의해 말단 카르복실기가 에스테르화된 락트산-글리콜산 공중합체의 미세 입자들을 압축함으로써 수득가능한 장기 서방성 제제를 포함한다 (JP 제 2001-187749A호).
겔 제제들의 예는 인산염 버퍼에 약물 및 폴리에틸렌 글리콜에 화학적으로 결합된 히알루론산 등을 용해시킴으로써 수득되는 것들을 포함한다 (Journal of Controlled Release, 59 (1999) pp. 77-86).
약물을 함유하는 매트릭스 제제들의 예는 약물을 콜라겐의 과립상 물질 또는 섬유성 막 제제에 함침시킴으로써, 또는 약물을 콜라겐의 과립상 물질 또는 섬유성 막 제제를 제조하기 위한 반응 혼합물에 첨가함으로써 수득되는 것들 등을 포함한다 (JP 제 10-182499A호(1998), JP 제 O6-305983호(1994)).
생체적합성 및 생분해성인 중합체의 수용액에 약물을 첨가하여 수득되는 서방성 제제의 예로는 약물을 나트륨 히알루로레이트 수용액에 첨가함으로써 수득되는 것 등을 포함한다.
투여 시에는 액체이며 투여 후 생체 내에서 겔을 형성하도록 고안된 제제의 예는 약물 및 락트산-글리콜산 공중합체를 N-메틸-2-피롤리돈 중에 용해한 것들 (Journal of Controlled Release, 33(1995) pp. 237-243), 또는 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리에틸렌 글리콜의 블록 공중합체와 같은 중합체 및 약물을 함유하는, 저온에서는 용액으로 존재하지만 체온에서 겔을 형성하는 제제를 포함한다 (ibid., 27(1993), p. 139-147).
정형외과 분야에서 일반적으로 사용되는 것으로 보고된 다양한 기질들에 임베딩된 제제의 예는 약물 및 염기 (예를 들면, 수불용성, 생체적합성 및 생분해성인 중합체, 폴리메틸 메타크릴레이트, 히드록시아파타이트, 트리칼슘 포스페이트 등)를 혼합함으로써 제조되는 것들을 포함한다 (Biomaterials, vol. 21, pp. 2405-2412 (2000); 및 International Journal of Pharmaceutics, vol. 206, pp. 1-12 (2000)).
장애가 있는 골절 부위에서 PDE4 저해제의 유효한 양을 서서히 방출하는 국부 투여용 제제들이, 골절 치료에 요구되는 기간 동안 투여 빈도를 줄일 수 있다는 점에서 바람직하다.
저장부 제제들 중, 주사에 의해 국부 투여될 수 있는 마이크로스피어들의 경우, 그러한 마이크로스피어들의 입자크기는 바람직하게는 주사 바늘을 통과하기에 적합한 범위이며, 장애 부위의 자극을 감소시킬 수 있다는 점에서 더욱 바람직하게는 0.01-150㎛, 특히 바람직하게는 0.1-100㎛이다.
PDE4 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물은 골절 부위 부근에 국부적으로 투여되므로, 투약량을 적게 하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 마이크로스피어 제제와 같은 조성물 중의 PDE4 저해제 함량은 바람직하게는 0.0001-80 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001-50 중량%, 및 더욱 더 바람직하게는 0.01-50 중량%이다.
유효 성분으로서 PDE4 저해제의 투여량은 사용되는 PDE4 저해제의 종류, 대상의 체중, 연령, 상태 또는 적용될 부위에 따라 변할 수 있고, 일반적으로 외과의사에 의해 결정되지만; 국부 투여를 위해서는, 투여량은 일반적으로 장애 부위 당 1 ng 내지 1 g 의 범위일 수 있다.
본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물은 PDE4 저해제 및 그에 대한 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 사용하여 종래의 방식으로 제조될 수 있다. 바람직한 조성물은 PDE4 저해제 및 생체적합성 및 생분해성인 중합체를 조합함으로써 제조될 수 있다.
그들 중, 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체는 25 ℃에서 중합체 1 g 이 용해되는데 1,000㎖ 이상의 물이 필요한 수불용성인 생체적합성 및 생분해성인 중합체이며, 구체적인 예는 히드록시 지방산 폴리에스테르 및 그의 유도체들 (예를 들면, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리 시트르산, 폴리 말산, 폴리-β-히드록시부티르산, 개환 중합 ε-카프로락톤, 락트산-글리콜산 공중합체, 2-히드록시부티르산-글리콜산 공중합체, 폴리 락트산과 폴리에틸렌 글리콜의 블록 공중합체, 폴리글리콜산과 폴리에틸렌 글리콜의 블록 공중합체, 및 락트산-글리콜산 공중합체와 폴리에틸렌 글리콜의 블록 공중합체 등), 알킬 α-시아노아크릴레이트의 중합체들 (예를 들면, 폴리부틸-2-시아노아크릴레이트 등), 폴리알킬렌 옥살레이트 (예를 들면, 폴리트리메틸렌 옥살레이트, 폴리테트라메틸렌 옥살레이트 등),폴리오르토-에스테르, 폴리카보네이트(예를 들면, 폴리에틸렌 카보네이트, 폴리에틸렌프로필렌 카보네이트 등), 폴리오르토-카보네이트, 폴리아미노산(예를 들면, 폴리-γ-L-알라닌, 폴리-γ-벤질-L-글루탐산, 폴리-γ-메틸-L-글루탐산 등), 히알루론산 에스테르 를 포함한다. 이러한 중합체들 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 기타 생체적합성 및 생분해성 중합체들은 나트륨 히알루로네이트, 콘드로이틴 설페이트, 콜라겐, 젤라틴, 피브린 등을 포함한다.
상기의 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체들 중, 히드록시 지방산 폴리에스테르가 특히 바람직하다. 그 중, 평균 분자량이 2,000 내지 약800,000 범위 내에 있는 것이 바람직하며, 2,000 내지 약 200,000 범위 내인 것이 보다 바람직하며, 5,000 내지 50,000 범위 내에 있는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 히드록시 지방산 폴리에스테르 중, 폴리 락트산, 락트산-글리콜산 공중합체 및 2-히드록시 부티르산-글리콜산 공중합체가 더욱 바람직하다. 락트산-글리콜산 공중합체 내의 락트산과 글리콜산의 몰비율은 바람직하게는 90:10 내지 30:70, 더욱 바람직하게는 80:20 내지 40:60이며, 2-히드록시 부티르산-글리콜산 공중합체 내의 2-히드록시 부티르산과 글리콜산의 몰비율은 바람직하게는 90:10 내지 30:70, 더욱 바람직하게는 80:20 내지 40:60이다.
상기의 PDE4 저해제를 저장부 제제로 제형화할 때, 이는 의도하는 구현예에 따라서 적절하게 실시될 수 있으며, 선택적으로, 필요하다면 PDE4 저해제를 분쇄한 후에 실시될 수 있다.
PDE4 저해제의 분쇄는 미립자를 제조하기 위한 종래의 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 실시할 수 있으며, 이는 제트 밀(mill), 해머 밀, 콘볼루션 (convolution) 볼 밀, 자 (jar) 볼 밀, 비드 (beads) 밀, 쉐이커 밀, 로드 (rod) 밀 및 튜브 밀 분쇄와 같은 기계적인 분쇄 방법들, 또는 소위 결정화 방법, 즉 약물을 먼저 용매에 용해시킨 후, pH 조절, 온도 변화, 또는 용매 구성의 변경 및 원심분리, 여과 등으로 입자를 회수하여 재결정화하는 방법을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물의 상기 언급한 다양한 유형들의 제형들을 제조시, 선택된 PDE4 저해제에 따라서 임의의 적당한 방법을 사용할 수 있다.
예를 들면, 마이크로스피어 제제는 하기의 방법들에 의해서 제조될 수 있다.PDE4 저해제의 염이 마이크로스피어에 낮은 혼입율 (incorporation rate)을 나타내면, 마이크로스피어들의 제제 전에 산 또는 염기를 사용하여 상응하는 자유 형태로 전환시킬 수 있다.
(1) 수중 건조법 (In-Water Drying Method)
이 방법에서, 물보다 끓는점이 낮은 수-비혼화성 유기 용매 중의 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체 용액 (수불용성 중합체 용액)에 약물을 첨가하고, 생성된 유기상을 수상에 분산하여 O/W 에멀젼을 제공하고, 그 후 유기 용매를 제거한다. 이 방법은 예를 들면, JP 제 56-19324B 호 (1981), JP 제 63-91325A 호 (1988), JP 제 08-151321A 호 (1996), Kajeev Jain 등., "Controlled Drug Delivery by Biodegradabla Poly (Ester) Devices: Different Preparative Approaches", Drug Development and Industrial Pharmacy, vol. 24(8), pp. 703-727, 1998, JP 제 60-1005l6A 호 (1985), JP 제 62-201816A 호 (1987), JP 제 09-221417A 호 (1997) 및 JP 제 06-21l648A 호 (1994)에 기재된 것과 유사한 방식으로 실시할 수 있다.
(2) 상 분리법
이 방법에서, 유기 용매 중의 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체 용액에 약물을 용해 또는 분산시키거나, 또는 약물 수용액을 분산시킨다. 그 후, 교반하면서 경화제를 서서히 첨가하여 고체 침전물을 수득한다. 이 방법은 예를 들면, JP 제 60-67417A 호 (1985), US 특허 제 5503851 호, US 특허 제 5000886 호, Eur. J. Pharm. Biopharm. vol. 42 (1), pp.16-24 (1996) 및 앞서 인용한 Jain등 (ibid.) 에 기재된 것과 유사한 방식으로 실시할 수 있다.
(3) 분무 건조법
이 방법에서, 유기 용매 중의 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체의 용액에 약물을 용해 또는 분산시키거나, 또는 약물 수용액을 분산시킨다. 그 후, 생성된 용액 또는 분산액을 노즐을 통해 분무건조기의 건조 챔버로 분무하여 유기 용매를 매우 짧은 시간안에 미세한 작은 액적들로 휘발시킨다. 이 방법은 예를 들면, JP 제 01-155942A 호 (1989), JP 제 05-194200A 호 (1993), JP 제 05-70363A 호 (1993), JP 제 08-l5l321A 호 (1996), JP 제 09-221417A 호 (1997), US 특허 제 5,922,253 호, "Spray Drying Handbook" (John Wiley & Sons, New York 1984), Partick B. Deasy, "Microcapsulation and Related Drug Processes" (Marcel Dekker, Inc., New York (1984) 및 앞서 인용한 Jam 등(ibid), 등에 기재된 것과 유사한 방식으로 실시할 수 있다.
(4) 용매 확산법
이 방법에서, 수혼화성 유기 용매 중의 수불용성 생체적합성 및 생분해성인 중합체 및 약물의 용액을 보호 콜로이드의 수용액에 첨가하고, 그 후 교반하면서 유화시켜 미립자들을 수득한다. 이 방법은 예를 들면, JP 제 05-58882A 호 (1993), JP 제 09-110678A 호 (1997) 및 International Journal of Pharmaceutics, vol. 187, pp. 143-152 (1999)에 기재된 것과 유사한 방식으로 실시할 수 있다.
상기에서 언급한 "수중 건조법"에서, 비록 그들 모두는 종래의 방식에 따라서 실시될 수 있으나 유기상의 유형에 따라서 다른 제제 방법들이 사용될 수 있다.유기층의 예는 하기를 포함한다.
(a) 약물을 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체에 직접적으로 용해 또는 분산시킨 유기상. 이것이 수상에 분산되는 경우, 0/W 에멀젼이 수득된다 (JP 제 56-19324B 호 (1981), JP 제 63-9l325A 호 (1988), JP 제 06-32732A 호 (1994), JP 제 08-151321A 호 (1996), JP 제 06-32732A 호 (1994), 및 앞서 언급한 Jam, 등).
(b) 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체의 용액에 약물 수용액을 분산시킨 W/O 에멀젼인 유기상. 상기 W/0 에멀젼이 수상에 분산되는 경우, (W/O)/W 에멀젼이 수득된다 (JP 제 60-100516A 호 (1985), JP 제 62-201816A 호 (1987), JP 제 09-221417A 호 (1997), 및 앞서 언급한 Jam, 등).
(c) 약물을 다른 것들 중에 분산되어 있는 중합체 용액에 용해 또는 분산시킨, 2 이상의 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체들을 사용하는, 0/0 에멀젼인 유기상. 상기 0/0 에멀젼이 수상에 분산되는 경우, (O/0)W 에멀젼이 수득된다 (JP 제 06-211648A 호 (1994)).
상기 유기상들 중 임의의 것을 사용함으로써, 종래의 방법, 예를 들면, 간헐적인 진탕법, 프로펠러 진탕기 또는 터빈 진탕기 같은 혼합기를 사용하는 방법, 콜로이드성 밀 방법, 호모지나이저 (homogenizer) 방법 및 초음파처리 방법에 의해 유화가 달성될 수 있다.
이러한 방법들에 사용가능한 유기 용매의 예로는 할로겐화 탄화수소 (염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄 등),지방족 에스테르 (에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트 등), 방향족 탄화수소 (벤젠 등), 지방족 탄화수소 (n-헥산, n-펜탄, 시클로헥산 등),케톤 (메틸에틸케톤 등), 에테르 (디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 메틸 이소부틸 에테르 등)을 포함한다.
상기 에멀젼 제조시, 에멀젼을 안정화시키기 위해서 수상에 유화제가 첨가될 수 있는데, 유화제는 예를 들면, 음이온성 계면활성제 (나트륨 올리에이트, 나트륨 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 등), 비이온성 계면활성제{폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 [Tween 80, Tween 60 (Nikko Chemicals, Co., Ltd.)], 폴리에틸렌 캐스터 오일 유도체 [HCO-60, HCO-50 (Nikko Chemicals, Co., Ltd.)], 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 레시틴, 젤라틴 등을 포함한다.
게다가, PDE4 저해제 외에 하나 이상의 기타 성분들이 혼입되는 경우, 이는 바람직하게는 0/W 에멀젼의 제조시 유기상에 첨가될 수 있다. 의약 성분을 높은 농도로 갖는 마이크로스피어 제제를 얻기 위해서는, 고농도의 유효 성분을 함유하는 유기상을 제조하는 것이 필요하다. 이 목적을 위해서, 유효 성분이 수상으로 유출되는 것을 막기 위해서 삼투 조절제를 수상에 첨가할 수 있다 (JP 제 2608245호).
상기에서 언급한 방식에 의해 수득된 0/W 에멀젼을, 수중 건조를 통해 에멀젼 내에 존재하는 유기 용매를 제거하여 마이크로스피어를 수득한다.
유기 용매는 가열, 감압 하에 배치, 공기 취입 등과 같은 종래의 방법에 의해 에멀젼으로부터 제거될 수 있고, 예를 들면, 용매를 개방계 내에서 증류하여 제거하는 방법 (JP 제 56-19324B 호 (1981), JP 제 63-91325A 호 (1988), JP 제 08-151321A 호 (1996), JP 제 06-211648A 호 (1994)) 또는 용매를 폐쇄계 내에서 증류하여 제거하는 방법 (JP 제 09-2214181A 호 (1997))이 사용될 수 있다. 또한, 용매를 추출하고 다량의 외부 수상으로써 제거하는 방법 (JP 제 2582186호) 또한 사용할 수 있다.
게다가, PDE4 저해제에 따라서 하기의 방법들이 적절하게 사용될 수 있다.
약물, 생분해성 중합체 및 수혼화성인 상기 중합체에 적당한 용매 (용매 A: 아세톤, 테트라하이드로푸란 등)를 함유하는 용액을, 우선 용매 A와 혼화성인 상기 중합체에 대해 적당치 않은 용매 (용매 B: 물, 에탄올 등) 및 용매 A와 비혼화성인 상기 중합체에 대한 적당치 않은 용매 (용매 C: 글리세린 등)를 함유하는 균질 혼합 용액에 첨가한다. 혼합물은, 유화에 의해, 분산-상을 구성하는 중합체 용액 및 연속-상을 구성하는 균질의 혼합 용액인 에멀젼을 제공한다. 그 후, 용매 A 를 분산-상으로부터 제거한다 (WO/O1/80835호).
수중 건조법에 의한 에멀젼으로부터의 마이크로스피어 제조 방법은, 그 에멀젼 내에 물보다 낮은 끓는 점을 갖는 유기용매 (염화메틸렌, 에틸 아세테이트 등)및 수불용성 중합체를 함유하는 유기상이 수상에 유화되어 있으며, (1) 기체 분리막 (투과성 증발막, 다공성 막 등)이 갖추어진 장치를 사용하고, (2) 에멀젼을 수중 건조하기 위해 기체 분리막의 한 면으로 제공하고, (3) 기체 분리막의 다른 면으로 에멀젼 내의 유기 용매를 증류 제거하는 것 (WO/01/83594호)을 포함한다.
또한, 마이크로스피어에 잔류하는 유기 용매는, 유기 용매의 끓는점 보다 높은 온도에서 수상 내의 마이크로스피어를 가열함으로써 제거될 수 있거나 (JP 제 2000-239152A호), 또는 높은 녹는점을 갖는 첨가제로 마이크로스피어를 코팅한 후 마이크로스피어를 가열건조시킴으로써 제거될 수 있다 (JP 제 09-221417A호(1997)).
생성된 마이크로스피어들을 원심분리, 여과 또는 체질 (sieving)에 의해 회수하고, 첨가제들 같이 표면에 부착된 물질들을 제거하기 위해 수상 중에서 세척하고, 임의로 마이크로스피어들의 응집을 방지하기 위한 응집 저해제, 예를 들면 당, 당알콜 또는 무기염, 바람직하게는 락토오스, 만니톨 또는 소르비톨과 조합한 후, 동결건조시킨다. 목적하는 입자 크기의 마이크로스피어들을 수득하기 위해 체를 사용하는 것이 바람직하며, 마이크로스피어 제제들이 주사용 용액으로서 사용되는 경우 주사가능성 (syringeability)을 향상시키기 위해, 예를 들면, 150㎛ 이하의 입자를 통과시키는 체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
"상 분리 방법"에 의해 마이크로스피어들을 제조하기 위해서, 상기의 "수중 건조법"에서 사용된 유기 용매들 외에 아세톤, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 같은 양쪽성 용매를 사용할 수 있다. PDE4 저해제 및 임의의 하나 이상의 부가 성분들, 또는 그의 용액을 이들 유기 용매들 중 임의의 한 용매 중의 수불용성 중합체의 유기 용액 내에 용해 또는 분산시켜 유기상을 형성한다. 이 유기상을 상기 언급한 유기 용매에 비혼화성인 용매 (분산 매질), 예를 들면, 실리콘유, 액체 파라핀, 참깨유, 대두유, 옥수수유, 목화씨유, 코코넛유, 아마씨유에, 교반하면서 서서히 첨가하여 0/0 에멀젼을 형성한다. 바람직한 경우, 계면활성제를 분산 매질에 첨가할 수 있다. 수불용성 중합체는 에멀젼을 냉각 또는 유기상 내의 용매를 가열 증발시킴으로써 고체화할 수 있다. 다른 방법으로, 헥산, 시클로헥산, 메틸 에틸 케톤, 옥타메틸-시클로테트라실록산 등 같은 경화제를 교반하면서 에멀젼에 서서히 첨가하거나 또는 상기의 경화제에 에멀젼을 교반하면서 서서히 첨가하여 수불용성 중합체를 에멀젼으로부터 분리하여 마이크로스피어들을 형성할 수 있다.
생서된 마이크로스피어들을 원심분리, 여과 또는 체질에 의해 회수하고, 헥산 또는 정제수로 세척하여 그 표면에 부착된 용매, 첨가제 등을 제거하고, 임의로 공기-건조, 진공-건조 또는 동결건조시킨다. 다른 방법으로, 상기에서 언급한 수중 건조 방법에서 사용된 것과 유사한 방식으로 응집 저해제를 첨가한 후에 동결건조할 수 있다.
상 분리 방법에서 내부 유기상의 예는 하기의 구현예들을 포함한다.
(a) 약물을 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체에 직접적으로 용해 또는 분산시킨 유기상,
(b) 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체의 용액에 약물의 수용액을 분산시킨 W/O 에멀젼인 유기상,
(c) 약물 또는 그의 용액을 다른 것들에 분산되어 있는 중합체 용액에 용해 또는 분산시킨, 2 이상의 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체들을 사용하는, 0/0 에멀젼인 유기상.
또한, "분무 건조 방법"에 의한 마이크로스피어들의 제조는 상기 언급된 상 분리 방법에서 사용된 것과 동일한 유기 용매를 사용하여 실시된다. 유기용매에 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체를 용해시키고, 그 용액에 PDE4 저해제 및 임의로 하나 이상의 부가 성분들, 또는 그의 용액을 용해 또는 분산시키고, 노즐을 통해 분무 건조기의 건조 챔버에 분무건조하여 유기 용매를 휘발시켜 마이크로스피어들을 형성한다.
본 발명에는, 임의의 상업적으로 이용가능한 분무 건조기들, 예를 들면, 펄비스 미니 분무기 GS31 (Pulvis Mini Spray GS31; YAMATO Scientific Co., Ltd.), 미니 분무 건조기 (Mini Spray Dryer; Shibata Scientific Technology, Co., Ltd.) 같은 것이 사용될 수 있다.
생성된 마이크로스피어들을 그 후 수중 건조법에서 사용된 것과 유사한 방식으로 처리하여 원하는 마이크로스피어 제제를 수득한다.
"용매 확산법"에 사용가능한 수혼화성 유기 용매들의 예는 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 그들의 혼합물을 포함하고, 필요하다면 그 안에 약물이 용해될 수 있는 휘발성 용매 (염화메틸렌, 클로로포름)를 더 함유할 수 있다. 콜로이드 보호제의 예는 폴리비닐 알콜을 포함한다.
PDE4 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물의 마이크로스피어 제제를 골절 부위 부근에 투여시, 바람직하게는 국부적으로, 더욱 바람직하게는 주사 또는 임플랜트로써 적용될 수 있다.
마이크로스피어의 주사용 제제는, 본 발명에 의해 수득된 마이크로스피어들을, 분산제를 함유하는 수용액에 0.0001 내지 1000 ㎎/㎖의 농도, 바람직하게는 0.0005 내지 800 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 500 ㎎/㎖ 농도로 분산/현탁시킴으로써 제조할 수 있다.
분산제의 예는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (Tween80, Tween60, Nikko Chemicals Co., Ltd.), 폴리에틸렌 캐스터 오일 (HCO-60, HCO-50, Nikko Chemicals Co., Ltd.)과 같은 비이온성 계면활성제, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소듐 알기네이트, 덱스트란, 나트륨 히알루로네이트 등과 같은 셀룰로오스-유래의 분산제들을 포함한다. 이러한 분산제들은 마이크로스피어들의 분산성을 향상시키고 유효 성분의 용출을 안정화시킬 수 있다. 일반적으로 분산제는 조성물에 0.01 내지 2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 1 중량%의 농도로 첨가될 수 있다.
상기 주사용 제제는 임의의 보존제 (메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 소르브산, 붕산, 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 등), 등장화제 (염화나트륨, 글리세린, 소르비톨, 글루코오스, 만니톨 등), pH 조절제 (수산화나트륨, 수산화칼륨, 염산, 인산, 시트르산, 옥살산, 카르본산, 아세트산, 아르기닌, 리신 등), 버퍼 (인산수소나트륨, 인산수소칼슘 등) 등을 함유할 수 있다.
필요하다면, 스테로이드성 소염 진통제 또는 비-스테로이드성 소염 진통제를 주사용 제제에 용해 또는 분산시킬 수 있다. 스테로이드성 소염 진통제의 예는 덱사메타손, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 할로프레돈, 파라메타손, 히드로코티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손 등을 포함한다. 비-스테로이드성 소염 진통제의 예는 이부프로펜, 케토프로펜, 인도메타신, 나프록센, 피록시캠 등을 포함한다.
상기에서 언급한 현탁액 외에, PDE4 저해제를 함유하는 마이크로스피어 주사액은 사용시에 주사용 제제로 제조하기 위한 키트의 형태일 수 있으며, 그 키트는 응집 저해제와 마이크로스피어들의 고체 제제, 분산제 및 주사용 증류수를 포함한다.
키트 내에 사용되는 고체 제제는 마이크로스피어들을 응집 저해제를 함유하는 수용액 내에 현탁시키고, 그 현탁액을 동결건조, 진공 건조, 분무 건조 등을 함으로써 제조할 수 있다. 동결건조가 특히 바람직하다.
고체 제제의 제조시, 주사용 증류수로의 재분산성을 향상시키기 위해서 분산제를 응집 저해제 (만니톨, 소르비톨, 락토오스, 글루코오스, 자일리톨, 말토오스, 갈락토오스, 수크로오스 등)을 함유하는 수용액에 첨가할 수 있는데, 그로 인해 좋은 분산가능성을 갖는 고체 제제가 제공된다. 필요하다면, 주사용 제제를 제조하기 위한 키트로 제형될 수 있는데, 그 안에서 분산제 뿐만 아니라 스테로이드성 소염 진통제 및/또는 비-스테로이드성 소염 진통제가 조합된다.
PDE4 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물은 인간, 가축 (말, 황소, 양, 돼지), 애완동물 (개, 고양이) 등과 같은 다양한 온혈 포유류들의 치료에 사용될 수 있다.
PDE4 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물이 적용될 수 있는 질병들의 예는 (a) 외부 힘에 의한 골절, (b) 병적 골절 (골다공증, 골 연화증, 악성 종양, 다발 골수증, 선천성 불완전 골형성증, 골낭포증, 화농성 골수염, 골화석증 또는 영양 장애와 관련된 골절), 및 (c) 피로 골절을 포함한다. 또한, PDE4 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물은 균열골절, 그린스틱 골절, 횡상 골절, 사상 골절, 나선상 골절, 분절골절, 분쇄골절, 견열골절, 압박골절, 함몰골절 등을 포함하는 골절들 중 임의의 것에 적용될 수 있다.
본 발명의 한 목적은, 초기 단계에 골절의 치료를 촉진하는, 신규 골절 치료촉진용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 골절 부위에 적용시, 유효 성분의 전신 작용의 징후는 피하면서 단지 목적 부위에서만 골절 치료 촉진 활성을 효과적으로 발현하는, 국부 투여용의 신규 약학 조성물을 제공하는 것이다. 한편, 본 발명의 또다른 목적은, 국부 투여시 유효 성분을 서서히 방출하여 일회 투여에 의해 장기간 동안 약효가 발현될 수 있는, 골절 치료 촉진용 서방성 저장부 (depot) 제형을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 각종 화합물들의 약리학적 작용을 연구하여, PDE4 저해 활성을 갖는 화합물이 골절 치료 과정에 영향을 미친다는 것을 알았다. 그 후, 본 발명자들은 PDE4 저해 작용을 갖는 화합물들이 골절 치료를 촉진할 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 유효 성분으로서 PDE4 저해제를 함유하는 골절 치료용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 골절 부위에 대한 국부 투여에 적합한 약학 제제, 특히 저장부 제제 형태의 골절 촉진 조성물을 제공한다.
하기의 실험예들, 실시예들 및 시험예들은 본 발명을 더 설명하기 위해 제공된다. 하기의 예들을 통해서, 소정 숫자의 화합물은 화학적 구조를 갖는 바람직한 화합물들의 구체적인 예를 나타내는 상기의 리스트 내에서 동일한 숫자로 표시되는 것과 동일한 화합물이다.
실험예 1: 정상 쥐에서 골절 치료의 촉진
(예비사육)
CD (SD) IGS 쥐 (Charles River Japan, Inc.; 수컷; 7 주령)들을 실온 (23±2 ℃) 및 40~70 % 습도에서 7 일 동안 사육하였다. 사육기간 동안, 쥐들에게 시판 사료 (Oriental Bio; CE-2)를 자유 취식시켰다.
(골절치료)
에테르 마취 하에, 쥐의 좌측 하지부의 털을 깍고, 70 % 수성 에탄올로 소독하고, 종아리뼈를 가위에 노출시켜 손톱가위 (Natsume Seisakusyo; B17)로 절단하였다. 상기 종아리뼈의 절단부를 핀셋으로 다시 맞추었다. 시험군 (20 마리 쥐/군)에 대해, 실시예 2-(1) 에서 제조된, 0.1 또는 0.5 mg 의 화합물 (1)을 함유하는 약물 함유 마이크로스피어들을 약수저로 각 쥐의 절단 부위 주변에 위치시킨 후 견사로 봉합하였다. 대조군 (20 마리 쥐/군)에 대조예 1-(1) 에서 제조된 동량의 약물이 없는 마이크로스피어를 약수저를 사용하여 절단 부위 주변에 위치시킨 후 견사로 봉합하였다. 봉합 후, 각 군의 동물들을 70 % 수성 에탄올로 소독하였다. 봉합 후 6 째 주에, 에테르 마취 하에 각 군으로부터 10 마리의 쥐들을 개복 방혈하여 희생시키고, 종아리뼈를 적출하였다.
(시험 결과)
(1) 종아리뼈 무기질 밀도 및 무기질 함량의 측정
봉합 후 6 주에 적출한 종아리뼈를 DXA 골밀도측정기 (Aloka; DCS-600)로, 골절 부위에서의 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량을 측정하였다 (스캐닝 폭: 1 mm).
골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량 측정 결과를 표 1 및 표 2 에 각각 나타내었다.
종아리뼈 무기질 밀도 (mg/㎠)
약물 약물 함량 골 무기질 밀도 (mg/㎠)
대조구 0 33.69±0.80
화합물 (1) 0.1 mg 36.77±1.52
화합물 (1) 0.5 mg 40.05±1.34
종아리뼈 무기질 함량 (mg)
약물 약물함량 골 무기질 밀도 (mg)
대조구 0 11.99±0.50
화합물 (1) 0.1 mg 14.27±0.76
화합물 (2) 0.5 mg 15.20±0.82
표 1 및 표 2 에 나타낸 것과 같이, 약물 함유 마이크로스피어로 처리된 군에서, 골절영역에서의 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량이 투여량-의존 방식으로 증가되었다.
(2) 종아리뼈 부피의 측정
봉합 후 6 주째에 적출한 종아리뼈의 부피를, 부종측정기 (Muromachi Kikai Co., Ltd.; TK-101)을 사용하여 결정하였다.
골 부피 측정 결과를 표 3 에 나타내었다.
종아리뼈 부피 (㎕)
약물 약물 함량 골 부피 (㎕)
대조구 0 62.7±2.0
화합물 (1) 0.1 mg 68.1±2.9
화합물 (1) 0.5 mg 77.2±2.9
표 3 에 나타낸 것과 같이, 약물 함유 마이크로스피어로 처리된 군에서, 종아리뼈의 골 부피가 투여량-의존 방식으로 증가됨을 발견하였다.
(3) 종아리뼈 강도의 측정
봉합 후 6 주째에 적출한 종아리뼈를 골 강도 시험기 (Muromachi Kikai Co., Ltd.; TK-252C)로 3 점 굽힘 시험하여 골 강도를 측정하였다. 즉, 종아리뼈를 서로 8 mm 떨어진 두 개의 지지물로 지지시키고, 절단부를 이들 지지물의 중앙, 즉 각각의 두 개의 지지물로부터 4 mm 떨어진 지점에 위치시켰다. 종아리뼈가 골절되기 시작할 때까지 상부 방향으로부터 종아리뼈의 중앙 지점 (골절부) 상에 하중 (3 mm/분)을 가하였다. 상기 뼈를 파단시키는데 필요한 최대 압력을 파단력으로서 정의하고, 상기 뼈를 파단시키는데 소비된 총 에너지를 파단 에너지로서 정의하였다.
파단 에너지 및 파단력 측정 결과를 각각 표 4 및 표 5 에 나타내었다.
파단 에너지 (mJ)
약물 약물 함량 파단 에너지 (mJ)
대조구 0 2.27±0.14
화합물 (1) 0.1 mg 4.37±0.71
화합물 (1) 0.5 mg 6.44±1.06
파단력 (N)
약물 약물 함량 파단력 (N)
대조구 0 15.0±0.94
화합물 (1) 0.1 mg 19.8±2.14
화합물 (1) 0.5 mg 23.0±1.68
표 4 및 표 5 에 나타낸 것과 같이, 약물 함유 마이크로스피어로 처리된 군에서, 골절부위에서의 골 강도가 투여량-의존 방식으로 증가됨을 발견하였다.
실험예 2: 정상 쥐에서 골절 치료의 촉진
(예비사육)
CD (SD) IGS 쥐 (Charles River Japan, Inc.; 수컷; 7 주령)들을 실온 (23±2 ℃) 및 50±20 % 습도에서 7 일 동안 사육하였다. 사육기간 동안, 쥐들에게 시판 사료 (Oriental Bio; CE-2)를 자유 취식시켰다.
(골절치료)
에테르 마취 하에, 쥐의 좌측 하지부의 털을 깍고, 70 % 수성 에탄올로 소독하고, 종아리뼈를 가위에 노출시켜 손톱가위 (Natsume Seisakusyo; B17)로 절단하였다. 상기 종아리뼈의 절단부를 핀셋으로 다시 맞추었다. 시험군 (15 마리 쥐/군)에 대해, 실시예 7 에서 제조된, 0.004, 0.02, 0.1 또는 0.5 mg 의 화합물 (2)를 함유하는 약물 함유 마이크로스피어들을 절단 부위 주변에 위치시킨 후 견사로 봉합하였다. 대조군 (15 마리 쥐/군)에 대해, 대조예 2 에서 제조된 약물이 없는 동량의 마이크로스피어를 약수저로 절단 부위 주변에 위치시킨 후 견사로 봉합하였다. 봉합 후, 모든 동물들을 70 % 수성 에탄올로 소독하였다. 2 주 후 쥐 5 마리, 그리고 4 주 후 쥐 10 마리를 각 군으로부터 취하여 에테르 마취하에 개복 방혈시켜 희생시키고, 종아리뼈를 적출하였다.
(시험 결과)
(1) 종아리뼈 무기질 밀도 및 무기질 함량의 측정
봉합 후 2 주에 적출한 종아리뼈를 DXA 골밀도측정기 (Aloka; DCS-600)로, 골절 부위에서의 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량을 측정하였다 (스캐닝 폭: 1 mm).
골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량 측정 결과를 표 6 및 표 7 에 각각 나타내었다.
종아리뼈 무기질 밀도 (mg/㎠)
약물 약물 함량 골 무기질 밀도 (mg/㎠)
대조구 0 40.48±1.36
화합물 (2) 0.004 mg 46.18±3.18
화합물 (2) 0.02 mg 50.72±2.68
화합물 (2) 0.1 mg 56.06±4.19
화합물 (2) 0.5 mg 52.18±4.36
종아리뼈 무기물 함량 (mg)
약물 약물 함량 골 무기질 밀도 (mg/㎠)
대조구 0 13.62±0.78
화합물 (2) 0.004 mg 15.90±1.88
화합물 (2) 0.02 mg 19.86±1.75
화합물 (2) 0.1 mg 23.10±2.72
화합물 (2) 0.5 mg 23.24±2.97
표 6 및 표 7 에 나타낸 것과 같이, 약물 함유 마이크로스피어로 처리된 군에서, 골절영역에서 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량이 투여량-의존 방식으로 증가되었음을 발견하였다.
(2) 종아리뼈 부피의 측정
봉합 후 2 주째에 적출한 종아리뼈의 부피를, 부종측정기 (Muromachi Kikai Co., Ltd.; TK-101)를 사용하여 결정하였다. 골 부피 측정 결과를 표 8 에 나타내었다.
종아리뼈 부피
약물 약물 함량 골 부피 (㎕)
대조구 0 79.20±4.87
화합물 (2) 0.004 mg 85.0±8.14
화합물 (2) 0.02 mg 97.6±4.99
화합물 (2) 0.1 mg 121.6±13.76
화합물 (2) 0.5 mg 132.2±11.72
표 8 에 나타낸 것과 같이, 약물 함유 마이크로스피어로 처리된 군에서, 종아리뼈의 골 부피가 투여량-의존 방식으로 증가됨을 발견하였다.
(3) 종아리뼈 강도의 측정
봉합 후 4 주째에 적출한 종아리뼈를 골 강도 시험기 (Muromachi Kikai Co., Ltd.; TK-252C)로 3 점 굽힘 시험하여 골 강도를 측정하였다. 즉, 종아리뼈를 서로 8 mm 떨어진 두 개의 지지물로 지지시키고, 절단부를 이들 지지물의 중앙, 즉각각의 두 개의 지지물로부터 4 mm 떨어진 지점에 위치시켰다. 종아리뼈가 골절되기 시작할 때까지 상부 방향으로부터 종아리뼈의 중앙 지점 (골절부) 상에 하중 (3 mm/분)을 가하였다. 파단력 및 상기 뼈를 파단시키는데 소비된 총 에너지를 파단에너지로서 정의하였다.
파단 에너지측정 결과를 표 9 에 나타내었다.
파단 에너지 (mJ)
약물 약물 함량 파단 에너지 (mJ)
대조구 0 2.19±0.33
화합물 (2) 0.004 mg 2.66±0.49
화합물 (2) 0.02 mg 2.59±0.55
화합물 (2) 0.1 mg 3.15±0.54
화합물 (2) 0.5 mg 3.27±0.61
표 9 에 나타낸 것과 같이, 약물 함유 마이크로스피어로 처리된 군에서, 골절부위에서의 골 강도가 투여량-의존 방식으로 증가됨을 발견하였다.
실험예 3: 시험관 내 시험
(늑연골 세포의 단리)
NZ 계 토끼 (Kitayama Labes., Co. Ltd.; 수컷; 4 주령)로부터 늑연골을 단리하고, 행크 (Hank's) 평형 염용액 (칼슘 및 마그네슘이 없음; LifeTech Co., Ltd.; 이하, "HBSS" 라 함) 중에 침지시켰다. 하나의 늑연골 및 하나의 늑골을 함께 적출하고, 지방 조직 및 근육 조직을 제거한 후, 늑연골의 성장 (proliferating) 연골세포 층을 적출하였다. 수집된 성장 연골세포층을 수술용 칼 (FEATHER Safety Razor Co., Ltd.)을 사용하여 절편으로 잘라내고, 4 마리 토끼로부터의 모든 성장 연골세포층 절편을 하나의 원심분리관에 합하였다. 상기원심분리관에 0.1 % 테트라나트륨 에틸렌디아민 테트라아세테이트가 용해된 40 ㎖ 의 HBSS (pH 7.2)를 첨가하여 성장 연골세포층 절편의 현탁액을 수득하고, 이를 37 ℃ 에서 20 분 동안 진탕하고 원심분리하였다 (1500 rpm, 10 분). 상등액을 흡기하여 제거하고, 0.2 % 트립신이 용해된 HBSS (pH 7.2) 40 ㎖ 를 상기 관에 첨가하여 침전물을 현탁시키고, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 진탕하였다. 상기 관을 원심분리하고 (1500 rpm, 10 분), 상등액을 흡기하여 제거하였다. 침전물을 HBSS 로 2 회 세척하고, 0.1 % 콜라게나아제 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 034-10533)가 용해된 HBSS 100 ㎖ 중에 현탁하고, 37 ℃ 에서 3 시간 동안 진탕하였다. 상기 관의 내용물을 세포 스트레이너 (Cell strainer) (공극 크기 40 ㎛)를 통해 통과시키고, 여과물을 4 개의 원심분리관에 나누어 넣었다. 4 개 관들 모두 각각에 40 ㎖ 의 배양액 (α-MEM, LifeTech Co., Ltd.)을 첨가하고, 상기 관들을 원심분리시켰다 (1500 rmp, 10 분). 상등액을 흡기하여 제거하고, 생성된 침전물을 피펫맨 (Pipetman)으로 하나의 관에 수집하였다. 동일한 배양액 40 ㎖ 를 첨가한 후, 상기 관을 재원심분리하였다 (1500 rpm, 10 분). 원심분리 후 배양액의 첨가를 포함하는 세척 과정을 추가로 3 회 반복하였다. 침전물을 동일한 배양액 중에 현탁하여 약 5 ㎖ 의 현탁액을 제공하였으며, 그 세포 수를 계수하였다.
(늑연골 세포의 배양)
상기 기재된 늑연골 세포의 현탁액을, 웰 당 50,000 세포로 24 웰 플레이트에 첨가하였다 (1 일). 그 다음날, 배양액을 새 배양액으로 교체하였다. 5일 째에 매질 교환 후, 시험 샘플에 대해 웰 중의 배양액을 하기 표 10 에 나타낸 시험 화합물을 함유하는 배양액 (비이클 (vehicle)로서 0.1 % 디메틸술폭시드 포함)으로 교체하였다. 동시에, 대조시험을 위해 웰 중의 배양액을, 시험 화합물을 함유하지 않은 것을 제외하고는 동일한 배양액 (비이클만 존재)으로 교체하였다. 이때, 아스코르베이트-인산에스테르를 2 mM 의 최종 농도로 상기 배양액에 첨가하였다. 알시안 블루 (Alcian blue) 염색의 경우, 배양액을 5, 7, 9, 12 및 14 일에 바꿔주고, 배양 개시일로부터 16 일에 알시안 블루 염색을 실시하였다.
(연골 기질 생산)
배양액을 제거한 후, 4 % 의 파라포름알데히드를 함유하는 중성 버퍼 1 ㎖ 를 각 웰 중의 세포들에 첨가하여 고정시키고, 30 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후 세포들을 1 ㎖ 의 인산 버퍼 (pH 7.2) 로 2 회 세척하고, 각 웰에, 연골 기질 프로테오글리칸을 선택적으로 염색하는 0.1 % 알시안 블루 BGX (Sigma; A3157)를 함유하는 예비 여과된 0.1 M HCl 1 ㎖ 를 첨가하였다. 알시안 블루는 0.5 ㎖ 의 6 M 의 구아니딘 하이드로클로라이드 수용액을 각 웰에 첨가하여 용해시켰다. 620 nm 에서 흡광도를 측정하고, 각 웰 중의 연골 기질 양 (프로테오글리칸 생산량)을 평가하고, 비이클 (100%)에 대한 각 시험 화합물의 프로테오글리칸 생산률 (%)을 계산하였다. 결과를 표 10 에 나타내었다.
시험 화합물 농도 (M) 프로테오글리칸 생산률 (%)
비이클 - 100
화합물 (1) 1×10-4 524
화합물 (2)화합물 (2) 1×10-61×10-5 204906
화합물 (9)화합물 (9) 1×10-61×10-5 132149
화합물 (11)화합물 (11) 1×10-61×10-5 161149
화합물 (21)화합물 (21) 1×10-61×10-5 156339
화합물 (27)화합물 (27) 1×10-61×10-5 151157
화합물 (44)화합물 (44) 1×10-51×10-4 185263
실험예 4: 시험관 내 시험
다른 화합물 (비교를 위해 화합물 (52)-(55)) 및 화합물 (2))을 사용하여, 상기 연골 기질 (프로테오글리칸) 생산을 상기 실험예 3 과 동일한 방식으로 결정하였다.
시험 화합물 농도 (M) 프로테오글리칸 생산률 (%)
비이클 - 100
화합물 (2)화합물 (2)화합물 (2) 1×10-7M1×10-6M1×10-5M 128183686
화합물 (52)화합물 (52)화합물 (52) 1×10-7M1×10-6M1×10-5M 213774820
화합물 (53) 1×10-6M 729
화합물 (54)화합물 (54) 1×10-6M1×10-5M 171396
화합물 (55)화합물 (55) 1×10-6M1×10-5M 171188
표 10 및 표 11 에 나타낸 것과 같이, PDE4 저해 활성을 갖는 모든 화합물들이 연골 기질 (프로테오글리칸) 생산 촉진 효과를 나타내었다. 무엇보다도, 화합물 (1), (2), (52) 및 (53) 은 현저한 기질 생산 촉진 효과를 나타내었다.
실험예 5: 연골세포의 석회화
화합물 (1) (10-4M)을 시험 화합물로서 사용한 것을 제외하고, 실험예 3 에 기재된 "늑연골 세포의 단리" 및 "늑연골 세포의 배양" 기재의 방법에 따라 세포들을 처리하였다. 각 웰 중의 배양액을 제거하고, 세포들을 4 % 의 포름알데히드를 함유하는 중성 버퍼 1 ㎖ 를 첨가하여 고정시키고 30 분간 실온에서 인큐베이션 하였다. 웰들을 1 ㎖ 의 인산 버퍼 (pH 7.2)로 2 회 세척하였다. 석회화된 부분을 선택적으로 염색하는 5 % 질산은 수용액을 첨가한 후, 발색될때까지 웰들을 실온에서 인큐베이션하였다. 각 웰을 증류수로 세척하고, 5 % 의 나트륨 티오술페이트 수용액을 첨가하여 반응을 켄칭하고 (quench), 웰들을 증류수로 다시 세척한 후, 촬영하였다. 세포들을 1 ㎖ 의 100% 에탄올로 1 시간 동안 고정시키고, 에탄올 중의 0.1 % 알리자린 레드 (Alizarin Red) 용액 (Sigma 사)으로 염색하고, 100 % 에탄올로 2 회 세척하고 촬영하였다.
결과를 도 1 에 나타내었다. 도 1 에 나타낸 것과 같이, 세포들을 PDE4 저해제인 화합물 (1)을 함유하는 배양액 중에서 배양하는 경우, 4 주 배양까지 칼슘 침착이 명백히 관찰되었으며, 이는 화합물 (1) 이 석회화 증강 효과를 갖는다는 것을 증명하는 것이다.
실험예 6: 토끼에서의 결손 요골의 재생
(예비사육)
일본 흰 토끼 (수컷; 11 주령; 4 마리 토끼/군)들을 7 일 동안 실온 (23 ±2 ℃) 및 55 ±15 % 습도에서 사육하였다. 사육 기간 동안, 쥐들에게 시판 사료 (Oriental Bio Service; LRC4)를 자유 취식시켰다.
(골절치료)
에테르 마취 하에, 토끼의 오른쪽 앞다리의 근육 조직으로부터 요골을 분리하고; 골막을 벗겨내고, 뼈 절단기로 절단하여 10 mm 의 골간을 제거하였다. 젤라틴 캡슐 (CAPSUGEL, 크기 5)에, 8 ㎍ 또는 40 ㎍ 의 화합물 (2)를 함유하는 실시예 7-(1)에서 제조된 마이크로스피어를 충전시키고, 대조예 2 에서 제조된 마이크로스피어를 충전시킴으로써 상기 캡슐 내에 함유된 마이크로스피어들의 총 량을 15 mg 으로 조정하였다. 하나의 캡슐 각각을 골 결손 부위에 위치시키고, 캡슐이 포함되도록 골막을 다시 위치시키고 봉합하였다. 대조군에서는, 대조예 2 에서 제조된 마이크로스피어로 동일한 방식으로 충전시킨 젤라틴 캡슐을 사용하였다. 근육 및 피부를 각각 봉합하고, 소독하였다. 봉합 후 6 주째에, 펜토바르비탈 마취 하에, 토끼들을 방혈하여 희생시키고, 요골을 적출하였다.
(시험 결과)
오른쪽 앞다리의 적출된 요골에 있어서, 골절선 상의 어깨 쪽을 근위 말단 (proximal end)으로서 정의하고, 근위 말단으로부터 손목쪽으로 5 mm 떨어진 지점을 원위 (dista) 말단으로서 정의하였다. 총 골 면적 (단면적) (㎟) 및 원위 말단에서의 응력 변형 지수 (SSI: ㎣)를 pQCT (Norland Stratec;XCT-960A)(Clinical Calcium Vol. 10, 35-41, 2000)를 사용하여 결정하였다.
결과를 도 2 에 나타내었다. 도 2 에 나타난 것과 같이, 본 발명의 PDE4 저해제를 함유하는 마이크로스피어 제제로 처리된 군은 총 골 단면적 및 응력 변형 지수가 대조군에 비해 모두 개선되었다. 이러한 결과는 PDE4 저해제의 효과를 나타내는 것이다.
실험예 7: 당뇨 쥐에서 골절 치료의 촉진
(예비사육)
CD (SD) IGS 쥐 (Charles River Japan, Inc.; 수컷; 7 주령)들을 실온 (23±2 ℃) 및 55±15 % 습도에서 7 일 동안 사육하였다. 사육기간 동안, 쥐들에게 시판 사료 (Oriental Bio; CRF-1)를 자유 취식시켰다.
(당뇨병의 유도)
당뇨병을 유도하는 스트렙토조토신 (Sigma)을 시트레이트 버퍼화 염용액 (pH 4.5) 중에 용해시켜 0.05 M 의 스트렙토조신 용액을 수득하고, 쥐들에게 각각 60 mg/kg 으로 정맥 주사하였다. 1 주 후, 꼬리 말단에서 채혈하여, 혈당 모니터 (Molecular Devices; M-SPmax250)을 사용하여 혈당치를 결정하였다. 측정치에 근거하여, 군 간에 혈당치의 현저한 차이가 발생되지 않도록 쥐들을 군으로 나누었다. 평균 혈당치는 426.12 내지 428.23 mg/dl 이었다.
(골절치료)
에테르 마취 하에, 쥐의 좌측 하지부의 털을 깍고, 70 % 수성 에탄올로 소독하고, 종아리뼈를 가위에 노출시켜 손톱가위 (Natsume Seisakusyo; B17)로 절단하였다. 상기 종아리뼈의 절단부를 핀셋으로 다시 맞추었다. 시험군 (12 마리 쥐/군)에 대해, 실시예 7-(1) 에서 제조된, 0.03 또는 0.1 mg 의 화합물 (2)를 함유하는 약물 함유 마이크로스피어들을 약수저를 사용하여 절단 부위 주변에 위치시킨 후, 견사로 봉합하였다. 대조군 (12 마리 쥐/군)에 대해, 대조예 2 에서 제조된 약물이 없는 동량의 마이크로스피어를 약수저로 절단 부위 주변에 위치시킨 후, 견사로 봉합하였다. 봉합 후, 모든 동물들을 70 % 수성 에탄올로 소독하였다. 봉합한지 6 주 후, 쥐들을 에테르 마취하에 개복 방혈하여 희생시키고, 종아리뼈를 적출하였다.
(시험 결과)
종아리뼈 무기질 함량의 측정
봉합 후 6 주에 적출한 것으로부터, 8 개의 종아리뼈를 임의로 선택하여, DXA 골밀도측정기 (Aloka; DCS-600)로, 골절 부위에서의 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량을 측정하였다 (스캐닝 폭: 1 mm). 결과를 표 12 에 나타내었다.
약물 약물 함량 골 무기질 함량 (mg)
대조구 0 10.25±1.27
화합물 (2) 0.03 mg 13.69±0.96
화합물 (2) 0.1 mg 14.60±0.69
표 12 에 나타낸 것과 같이, 당뇨병 모델 동물에서 증명된 것과 같이, 치료가 지연되는 것으로 알려진 당뇨병 대상의 골절의 경우에서도, PDE4 저해제가 투여량-의존 방식으로 골 무기질 함량 증가 효과를 가진다는 것을 발견하였다.
(종아리뼈 강도의 측정)
무기질 함량의 측정에 사용된 종아리뼈를 골 강도 시험기 (Muromachi Kikai Co., Ltd.; TK-252C)로 3 점 굽힘 시험하여 골 강도를 측정하였다. 즉, 종아리뼈를 서로 8 mm 떨어진 두 개의 지지물로 지지시키고, 절단부를 이들 지지물의 중앙, 즉 각각의 두 개의 지지물로부터 4 mm 떨어진 지점에 위치시켰다. 종아리뼈가 골절되기 시작할 때까지 상부 방향으로부터 종아리뼈의 중앙 지점 (골절부) 상에 하중 (3 mm/분)을 가하였다. 상기 뼈를 파단시키는데 필요한 최대 압력을 파단력으로서 정의하였다. 상기 뼈를 파단시키는데 소비된 총 에너지를 파단 에너지로서 정의하였다. 결과를 표 13 에 나타내었다.
약물 약물 함량 파단력 (N)
대조구 0 6.25±0.70
화합물 (2) 0.03 mg 8.13±1.20
화합물 (2) 0.1 mg 11.75±2.14
약물 약물 함량 파단 에너지 (mJ)
대조구 0 0.69±0.08
화합물 (2) 0.03 mg 1.53±0.39
화합물 (2) 0.1 mg 2.91±0.82
표 13 에 나타낸 것과 같이, 당뇨병 모델 동물에서 증명된 것과 같이, 치료가 지연되는 것으로 알려진 당뇨병 대상의 골절의 경우에서도, PDE4 저해제가 파단력 및 파단 에너지를 증가시킨다는 것을 발견하였다.
(X 선 사진)
봉합 후 6 주째에 적출된 4 개의 종아리뼈를 마이크로포커스 X 선 확대 촬영 시스템 (Fuji Photo Film Co. Ltd.; μFX-1000; 관 전압: 25 kV; 관 전류: 80 μA; 20 초)으로 촬영하였다.
대조구에서, 골 결함부의 공극을 충전하지 않았다. 반면, 골 결함부의공극을 충전하면, 시험군으로부터의 모든 샘플로부터 골 돌출이 관찰되었다.
실험예 8: 정상 쥐에서 골절부에서의 cAMP 함량의 증가
(예비사육)
CD (SD) IGS 쥐 (Charles River Japan, Inc.; 수컷; 7 주령)들을 실온 (23±2 ℃) 및 55±15 % 습도에서 7 일 동안 사육하였다. 사육기간 동안, 쥐들에게 시판 사료 (Oriental Bio; CRF-1)를 자유 취식시켰다.
(골절치료)
에테르 마취 하에, 쥐의 좌측 하지부의 털을 깍고, 70 % 수성 에탄올로 소독하고, 종아리뼈를 가위에 노출시켜 손톱가위 (Natsume Seisakusyo; B17)로 절단하였다. 상기 종아리뼈의 절단부를 핀셋으로 다시 맞추었다. 처리군 (시험 화합물 투여군) (6 마리 쥐/군)에 대해, 실시예 7-(1) 에서 제조된, 0.1 mg 의 화합물 (2)를 함유하는 약물 함유 마이크로스피어들을 약수저를 사용하여 절단 부위 주변에 위치시킨 후, 견사로 봉합하였다. 비처리군 (6 마리 쥐/군)에 대해, 대조예 2 에서 제조된 약물이 없는 동량의 마이크로스피어를 절단부 주변에 약수저를 사용하여 위치시킨 후, 견사로 봉합하였다. 대조군 (6 마리 쥐/군)에 대해, 절단부를 핀셋으로 다시 맞추고, 어떤 처리도 없이 봉합하였다. 봉합 후, 모든 동물들을 70 % 수성 에탄올로 소독하였다. 봉합한지 0, 3, 7, 14, 28 또는 42 일 후, 각 군으로부터 각각 한 마리의 쥐를 에테르 마취하에 개복 방혈하여 희생시키고, 종아리뼈를 적출하였다.
(cAMP 함량의 측정)
적출된 종아리뼈의 골절부를 1 cm 절편으로 절단하고, 액체 질소로 냉동시켰다. 생성된 절편을 -80 ℃ 에서 분쇄하고, 300 ㎕의 6 % 트리클로로아세트산 중에 현탁시키고, 초음파처리하였다. 상기 현탁액을 12000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 에테르로 추출하여 트리클로로아세트산을 제거하고, 75 ℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션하여 상등액으로부터 에테르를 제거하였다. 생성된 상등액 중의 cAMP 를 cAMP EIA 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 측정하였다.
(시험 결과)
cAMP 측정 결과를 도 3 에 나타내었다. 도 3 에 나타낸 것과 같이, PDE4 비처리군 (▲) 및 대조군 (○)에서, cAMP 의 양 (cAMP 함량)은 완만히 증가되었으며, 7 일째에 최고이고, 그 이후 서서히 감소되었다. 한편, 처리군 (●)에서, cAMP 함량은 현저히 증가하여 7 일째에 그 최고점에 도달하였으며, 대조군과 동일한 수준으로 신속히 되돌아왔다. 이러한 결과는 세포내 cAMP 의 분해가 PDE4 저해제에 의해 방지되며, 이는 골절부에서 cAMP 함량을 증가시킨다는 것을 암시한다.
실험예 9: 당뇨병 쥐에서 골절 부위에서의 cAMP 함량의 증가
(예비사육)
CD (SD) IGS 쥐 (Charles River Japan, Inc.; 수컷; 8 주령)들을 실온 (23±2 ℃) 및 55±15 % 습도에서 7 일 동안 사육하였다. 사육기간 동안, 쥐들에게 시판 사료 (Oriental Bio; CRF-1)를 자유 취식시켰다.
(당뇨병의 유도)
당뇨병을 유도하는 스트렙토조토신 ("STZ", Sigma)을 시트레이트 버퍼화 염용액 (pH 4.5) 중에 용해시켜 0.05 M 의 스트렙토조신 용액을 수득하고, 이를 쥐들에게 각각 60 mg/kg 으로 정맥 주사하였다. 1 주 후, 꼬리 말단에서 채혈하여, 혈당 모니터 (Molecular Devices; M-SPmax250)을 사용하여 혈당치를 결정하였다. 측정치에 근거하여, 군 간의 혈당치에서 현저한 차이가 발생되지 않도록 쥐들을 군으로 나누었다. 평균 혈당치는 404.5 내지 410.00 mg/dl 이었다.
(골절치료)
에테르 마취 하에, 당뇨병 쥐 (5 개 군, 5 마리 쥐/군) 및 (비처리된) 정상 쥐 (5 개 군, 5 마리 쥐/군)의 좌측 하지부의 털을 깍고, 70 % 수성 에탄올로 소독하고, 종아리뼈를 가위에 노출시켜 손톱가위 (Natsume Seisakusyo; B17)로 절단하였다. 상기 종아리뼈의 절단부를 핀셋으로 다시 맞추고, 견사로 봉합하였다. 봉합 후, 모든 동물들을 70 % 수성 에탄올로 소독하였다. 봉합한 후 0, 3, 7, 14 또는 28 일에, 각 군으로부터의 5 마리의 쥐들을 에테르 마취하에 개복 방혈하여 희생시키고, 종아리뼈를 적출하였다.
(cAMP 함량의 측정)
적출된 종아리뼈의 골절부를 1 cm 절편으로 절단하고, 액체 질소로 냉동시켰다. 생성된 절편을 -80 ℃ 에서 분쇄하고, 300 ㎕의 6 % 트리클로로아세트산 중에 현탁시키고, 초음파처리하였다. 상기 현탁액을 12000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 에테르로 추출하여 트리클로로아세트산을 제거하고, 75 ℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션하여 상등액으로부터 에테르를 제거하였다. 생성된 상등액 중의 cAMP 를 cAMP EIA 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 측정하였다.
(시험 결과)
STZ-처리군 (당뇨병 쥐) (○) 및 PDE4 저해제로 처리한 후의 비처리군 (일반 쥐) (●)에서의 cAMP 측정 결과 (골절부에서의 cAMP 함량을 나타냄)를 도 4 에 나타내었다.
실시예 1
(1) 화합물(1) 0.1 g 및 락트산-글리콜산 공중합체 (락트산:글리콜산 = 50:50; 평균 분자량 20,000; PLGA5O2O: Wako Pure Chemical Industries; Ltd.) 1.9 g 에 염화메틸렌 4.0 g 을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 철저히 진탕하여 유상 (O) 을 형성하였다.
(2) 유상을 폴리비닐알콜 (POVAL PVA-220C: Kuraray Co., Ltd.)의 0.5% 수용액 8 ㎖ 에 첨가하고, 25 ℃ 에서 5 분 동안 호모지나이저 (Polytron, Kinematica A.G.)로 유화시켜 유상이 수상에 분산된 (O/W) 에멀젼을 형성하였다.
(3) 에멀젼을 증류수 1,000 ㎖ 에 첨가하고, Three-one 모터 (Shinto Scientific Co., Ltd.)로 400 rpm으로 교반하고, 염화메틸렌을 제거하기 위해서 25 ℃ 에서 3시간 동안 수중 건조법을 실시하였다.
(4) 생성된 마이크로스피어 현탁액을 150 ㎛ 필터로 여과하여 응집물을 제거하고, 20㎛ 필터를 통해 감압 여과하여 수상을 제거하였다. 생성된 마이크로스피어를 소량의 증류수와 조합하고, 동결 건조시켜 마이크로스피어 1.6 g 을 얻었다.
생성된 마이크로스피어 10 ㎎ 을 아세토니트릴 3 ㎖ 에 용해시켰다. 용액을 0.5M 염화나트륨 수용액과 조합하고, 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 교반하면서, 2000 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 상등액을 분리하였다. 상등액 일부를 FL-HPLC (칼럼; Hypersil 5-ODS, 직경: 4 ㎜, 길이: 300 ㎜, GL Sciences, Inc., 여기 파장: 315 ㎚, 형광 파장: 465 ㎚)에 로딩하고 약물 용액을 사용하여 별도로 만든 표준 곡선과 비교함으로써 상등액 내의 약물 농도를 결정하였다. 생성된 상등액의 농도 및 부피에 근거하여, 마이크로스피어 내의 약물 함량은 4.21 %로서 계산되었다.
생성된 마이크로스피어의 적당량을 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (Tween 80: Nikko Chemicals Co., Ltd.)의 희석 용액 내에 분산시켰다. 입자 분포를 입자 크기 분석기 SALD-1100 (Shimadzu Corporation)로 측정하였고, 평균 입자 크기를 계산하였다. 평균 입자 크기는 57 ㎛ 이었다.
(5) 상기 (4)에서 수득된 마이크로스피어를 0.5 % 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 (Nichirin Chemical Industries) 및 0.1 % 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (Tween 80: Nikko Chemicals Co., Ltd.)를 함유하는 생리 식염수 (분산 매질)에 최종 약물 농도가 2.5 ㎎/㎖ 로 되도록 첨가하고, 이 혼합물을 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 철저히 교반하여 마이크로스피어 분산액을 수득하였다.
실시예 2
(1) 락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 = 50:50; 평균 분자량 20,000; PLGA5O2O: Wako Pure Chemical Industries; Ltd.) 0.57 g 및 락트산 중합체 (평균 분자량 20,000; PLA0O2O: Wako Pure Chemical Industries; Ltd.) 1.33g 의 혼합물을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1-(1) 내지 (4)에서 기재된 것과 유사한 방식으로 마이크로스피어 (1.6g)를 제조하였다.
실시예 1-(4)에 기재된 것과 유사한 방식으로 마이크로스피어의 약물 함량 및 평균입자크기를 측정하였으며, 각각 3.70 % 와 47.7 ㎛ 로 측정되었다.
(2) 상기 (1)에서 수득된 마이크로스피어를 실시예 1-(5)에서 기재된 것과 유사한 방식으로 처리하여 마이크로스피어 분산액 (약물 비율: 2.5 ㎎/㎖)을 수득하였다.
실시예 3
(1) 락트산 중합체 (평균 분자량 20,000; PLA0O2O: Wako Pure Chemical Industries; Ltd.) 를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1-(1) 내지 (4)에서 기재된 것과 유사한 방식으로 마이크로스피어 (1.5 g)를 제조하였다.
마이크로스피어의 약물 함량 및 평균 입자 크기를 실시예 1-(4)에서 기재된 것과 유사한 방식으로 측정하였고, 각각 3.73 % 및 52.2 ㎛ 으로 측정되었다.
(2) 상기 (1)에서 수득된 마이크로스피어를 실시예 1-(5)에서 기재된 것과 유사한 방식으로 처리하여, 마이크로스피어 분산액 (약물 비율: 2.5 ㎎/㎖)을 수득하였다.
실시예 4
(1) 화합물 (1) 0.2 g 및 락트산 중합체 (평균 분자량 20,000; PLAOO2O: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.3 g 을 염화메틸렌 1.0 g 에 첨가하고, 이 혼합물을 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 철저히 진탕하여 유상 (0) 을 형성하였다.
(2) 유상을 메틸 셀룰로오스 (METOLOSE: Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.)의 0.25 % 수용액 4 ㎖ 에 첨가하고, 25 ℃ 에서 5 분 동안 호모지나이저 (Polytron, Kinematica A.G.)로 유화시켜, 유상이 수상에 분산된 (O/W) 에멀젼을 형성하였다.
(3) 에멀젼을 증류수 400 ㎖ 에 첨가하고, Three-one 모터 (Shinto Scientific Co., Ltd.)로 400 rpm 으로 교반하고, 25 ℃ 에서 3시간 동안 수중 건조법을 실시하여 염화메틸렌을 제거하였다.
(4) 생성된 마이크로스피어 현탁액을 150 ㎛ 필터로 여과하여 응집물을 제거하고, 20 ㎛ 필터를 통해 감압 여과하여 수상을 제거하였다. 생성된 마이크로스피어를 소량의 증류수와 조합하고 동결 건조시켜, 마이크로스피어를 수득하였다. 마이크로스피어의 약물 함량 및 평균 입자 크기를 실시예 1-(4)에서 기재된 것과 유사한 방식으로 측정하였으며, 각각 39.6 % 및 33.4 ㎛ 로 측정되었다.
실시예 5
(1) 화합물 (1) 0.05 g 및 락트산-글리콜산 공중합체 (락트산:글리콜산 = 50:50; 평균 분자량 20,000; R202H: Boehringer Ingelheim Co., Ltd.) 0.45 g 에 염화 메틸렌 1.0 g 을 첨가하고, 이 혼합물을 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATOScientific Co., Ltd.)로 철저히 진탕하여 유상 (O) 을 형성하였다.
(2) 유상을 폴리비닐알콜 (GOHSENOL EG-40: The Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.)의 0.5 % 수용액 40 ㎖ 에 첨가하고, 25 ℃ 에서 4 분 동안 호모지나이저 (Polytron, Kinematica A.G.)로 유화시켜, 유상이 수상에 분산된 (O/W) 에멀젼을 형성하였다.
(3) 에멀젼을 정제수 400 ㎖ 를 함유하는 실린더형의 밀폐 용기 (내부 직경: 110㎜; 부피; 1,000㎖)에 붓고, 25 ℃ 의 온도에서 Three-one 모터 (BL-600; HEIDON)가 장착된 4-날의 프로펠러 (직경: 50㎜, 프로펠러 R 타입:HEIDON)를 사용하여, 용기 내에 삽입된 실리콘 고무로 만들어진 실린더형 중공 섬유 막 모듈 (NAGAYANAGI Co., Ltd.)의 중공 섬유들에 질소 가스를 공급하면서 (기체 유속은 2 L/분이다), 400 rpm으로 교반함으로써 용기로부터 염화메틸렌을 제거하였다. 이 절차를 1시간 동안 실시하였다.
이 절차에서 사용된 실리콘 고무로 만들어진 실린더형의 중공 섬유 막 모듈은 하기 세부내용의 실리더형 NAGASEP M60-1800 이었다.
실린더 직경 : 100 ㎜
실린더 길이 : 120 ㎜ x 120 ㎜
중공 섬유막의 막 두께 : 60 ㎛
중공 섬유막의 내부 직경 : 200 ㎛
중공 섬유막의 외부 직경 : 320 ㎛
중공 섬유의 수 : 1800
중공 섬유막의 유효한 막 구역: 0.15m2
(4) 생성된 마이크로스피어 현탁액을 150㎛ 필터로 여과하여 응집물을 제거하고, 20㎛ 필터를 통해 감압 여과하여 수상을 제거하였다. 생성된 마이크로스피어를 소량의 증류수와 조합하고 동결 건조시켜, 마이크로스피어 0.26 g 을 수득하였다. 마이크로스피어의 약물 함량과 평균 입자 크기를 실시예 1-(4)에 기재된 것과 유사한 방식으로 측정하였고, 각각 3.07 % 및 71.7㎛ 로 측정되었다.
실시예 6
(1) 화합물 (2) 0.05 g 및 락트산-글리콜산 공중합체 (락트산:글리콜산 = 50:50; 평균 분자량 20,000; RG502H: Boehringer Ingelheim Co., Ltd.) 0.45 g 에 염화메틸렌 2.5 g을 첨가하고, 이를 혼합기 (Touch mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 철저히 진탕하여 유상 (O) 을 형성하였다.
(2) 유상을 폴리비닐알콜 (POVAL PVA-220C: Kuraray Co., Ltd.)의 0.5% 수용액에 첨가하고, 22 ℃ 에서 5 분 동안 호모지나이저 (Polytron: Kinematica A.G.)로 유화하여 유상이 수상에 분산된 (O/W) 에멀젼을 형성하였다.
(3) 상기 절차 (1) 및 (2)를 5 회 반복하였다. 생성된 에멀젼들 (5 회의 시도로부터)을 증류수 1,000 ㎖에 첨가하고 Three-one 모터 (Shinto Scientific Co., Ltd.)에서 400 rpm으로 교반하여 조합하고, 25 ℃ 에서 1.5 시간 동안, 40 ℃ 에서 1 시간 동안 및 25 ℃에서 0.5 시간 동안 수중 건조를 실시함으로써 염화메틸렌을 제거하였다.
(4) 생성된 마이크로스피어 현탁액을 150 ㎛ 필터로 여과하여 응집물을 제거하고, 20 ㎛ 필터로 감압 여과하여 수상을 제거하였다. 생성된 마이크로스피어를 소량의 증류수와 조합하고 동결 건조시켜, 마이크로스피어 2.3 g을 수득하였다.
생성된 마이크로스피어 10 ㎎ 을 아세토니트릴 3 ㎖ 에 용해시켰다. 용액을 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 교반하면서 0.5 M 염화나트륨 수용액 6 ㎖ 와 조합한 후, 2000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액의 일부를 UV-HPLC (칼럼; Hypersil 5-ODS, 직경: 4 ㎜, 길이: 300 ㎜, GL Sciences, Inc., 검출 파장: 240 ㎚)에 로딩하고, 약물 용액을 사용하여 별도로 만든 표준 곡선과 비교함으로써 상등액 내의 약물 농도를 결정하였다. 생성된 상등액의 농도와 부피에 근거하여, 마이크로스피어 내의 약물 함량을 계산하였다. 또한, 평균 입자 크기를 실시예 1-(4)에 기재된 것과 유사한 방식으로 측정하였다. 그 결과, 약물 함량은 9.9% 이었고, 평균 입자 크기는 26.4 ㎛ 이었다.
(5) (4)에서 수득된 마이크로스피어를 실시예 1-(5)에서 기재된 것과 유사한 방식으로 처리하여 마이크로스피어 분산액을 수득하였다 (약물 비율: 0.1 ㎎/㎖).
실시예 7
(1) 락트산-글리콜산 공중합체 (락트산:글리콜산 = 75:25; 평균 분자량 20,000; PLGA752O: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 사용하고, 염화메틸렌 2.0 g 을 첨가한 것을 제외하고는 실시예 6-(1) 내지 (4)에 기재된 것과 유사한 방식으로 마이크로스피어(2.2 g)를 제조하였다.
마이크로스피어의 약물 함량 및 평균 입자크기를 실시예 6-(4)에 기재된 것과 유사한 방식으로 측정하였고, 각각 10.1 % 및 27.0 ㎛ 으로 측정되었다.
(2) 상기 (1)에서 수득된 마이크로스피어를 실시예 6-(5)에 기재된 것과 유사한 방식으로 처리하여 마이크로스피어 분산액을 수득하였다 (약물 비율: 0.1 ㎎/㎖).
대조예 1: 실시예 2의 대조구
(1) 락트산-글리콜산 공중합체 (락트산:글리콜산 = 50:50; 평균 분자량 20,000; PLGA5O2O: Wako Pure Chemical Industries; Ltd.) 0.6 g 및 락트산 중합체 (평균 분자량 20,000) 1.4 g 에 염화메틸렌 4.0 g 을 첨가하고, 이 혼합물을 30 분 동안 철저히 진탕하여 유상 (O) 을 형성하였다. 실시예 1-(1) 내지 (4)에 기재된 절차들에 따라서, 약이 없는 마이크로스피어 1.7 g 을 수득하였다.
(2) 플래시보 (Placebo) 분산용액의 제조
상기 (1) 에서 수득된 마이크로스피어를 실시예 1-(5) 에 기재된 것과 유사한 방식으로 처리하여 마이크로스피어 분산액을 제조하였다.
대조예 2 (실시예 7 의 대조구)
락트산-글리콜산 공중합체 (락트산:글리콜산 = 75:25; 평균 분자량 20,000; PLGA752O: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 염화메틸렌 2.0 g 을 첨가하고, 이 혼합물을 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 철저히 진탕하여 유상을 형성하였다. 실시예 6-(2) 내지 (4)에 기재된 절차에 따라, 약물이 없는 마이크로스피어 2.2 g 을 수득하였다.
시험예 1
시험관 내의 마이크로스피어 10 mg 에 0.05 % 의 Tween 80 을 함유하는, 10 ㎖ 의 인산 버퍼화된 식염수 (pH 7.4)를 첨가하고, 37 ℃ 로 공기조절된 캐비넷 중의 회전 배양기에서 25 rpm 으로 교반하였다. 교반의 개시 후 지정된 기간의 시간이 경과하면, 시험관을 원심분리하고 (2000 rpm, 5 분), 상등액 9 ㎖ 를 샘플링하여 FL-HPLC (칼럼; Hypersil 5-ODS, 직경: 4 mm, 길이: 300 mm, GL Sciences, Inc., 여기 파장: 315㎚, 형광 파장: 465 ㎚)에 로딩하고, 약물 용액을 사용하여 별도로 만든 표준 곡선과 비교함으로써 약물 함량을 결정하였다. 상기 결과 및 샘플링 부피를 기초로, 약물의 용출양을 계산하였다.
또한, 샘플링 후, 포스페이트 버퍼화된 식염수 (pH 7.4) 9 ㎖ 를 시험관에 첨가하고, 동일한 조건하에서 교반, 샘플링 및 계산을 포함하는 동일한 절차들을 실시함으로써 약물의 용출양의 계산을 규칙적으로 반복하였다.
최종 샘플링 후, 잔류 용출액을 시험관으로부터 제거하고, 잔류 마이크로스피어 내의 약물 함량을 실시예 1-(4)에 기재된 방법에 따라서 결정하였다.
상기 절차들을 실시예 1 내지 3 에서 수득된 마이크로스피어들에 대해 실시하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
용출율은 마이크로스피어로부터 용출된 것과 마이크로스피어 내에 남아 있는 것의 합을 100 %라고 가정하여 계산하였다.
시험예 2
수컷 SD 쥐들 (7 주령, 3 마리 쥐/군, Japan SLC)을 일주일 동안 실온(23±2℃)에서 12 시간 명암(light-dark) 사이클로 음식과 물을 임의로 공급하면서 사육하였다. 그 후, 각 쥐에게 폴리에틸렌 글리콜 400 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 % 를 함유하는 생리 식염수에 용해된 화합물 (1)을 대퇴부 정맥을 통해 0.5 ㎖/동물 (총 약물 투약량: 0.5 ㎎/쥐)로 급속-주사 (1㎎/㎖) 하였다.
약물 투여 후, 에테르 마취 하에, 헤파린을 함유하는 주사기로 경정맥으로부터 규칙적인 시간 간격으로 혈액 샘플들을 수집하고, 원심분리하여 혈장 샘플들을 수득하였다. 혈장 0.1 ㎖ 에 내부 표준 용액 0.2 ㎖ 및 1 M 의 2 염기성 인산칼륨을 첨가하고, 그 후 클로로포름 7.0 ㎖ 를 첨가하였다. 이 혼합물을 10 분 동안 진탕하고 5 분 동안 원심분리하여 유기상 5 ㎖ 를 분리하였다. 생성된 유기상을 질소 대기 하에서 40 ℃ 의 온도에서 증발건조시키고, 이동상 0.5 ㎖ 에 재용해한 후, FL-HPLC (칼럼; Hypersil 5-ODS, 직경: 4 ㎜, 길이: 300 ㎜, GL Sciences, Inc., 여기 파장: 315 ㎚, 형광 파장: 465 ㎚)에 로딩하여 혈장 농도를 결정하였다. 그 결과를 도 6 에 나타내었다.
시험예 3
수컷 SD 쥐들 (7 주령, 5 마리 쥐/군, Japan SLC)을 일주일 동안 실온 (23±2℃)에서 12 시간 명암 사이클로 음식과 물을 임의로 공급하면서 사육하였다. 그 후 각 쥐에게 실시예 1-(5), 2-(2) 또는 3-(2)에서 수득된 마이크로스피어 분산액을 등에 2 ㎖/쥐 (총 약물 투약량: 5 ㎎/쥐)로 피하 주사하였다. 약물 투여 후, 에테르 마취 하에, 헤파린을 함유하는 주사기로 경정맥으로부터 규칙적인 시간간격으로 혈액 샘플들을 수집하고, 원심분리하여 혈장 샘플들을 수득하였다. 혈장 내의 화합물의 농도는 시험예 2 에 기재된 것과 유사한 방식으로 결정하였다. PDE4 저해제를 마이크로스피어로 제형화한 결과, PDE4 저해제의 1/10 양만을 함유하는 식염수의 정맥 주사에 의해 이루어지는 것 (시험예 2)과 비교해도, PDE4 저해제의 최대 혈장 농도를 1/25 내지 1/100로 감소시킬 수 있었다. 그 결과를 도 7 에 나타내었다.
시험예 4
수컷 SD 쥐들 (7 주령, 5 마리 쥐/군, Japan SLC)을 일주일 동안 실온 (23±2℃)에서 12 시간 명암 사이클로 음식과 물을 임의로 공급하면서 사육하였다. 그 후 각 쥐에게 실시예 2-(2)에서 수득된 마이크로스피어 분산액을 2 ㎖/쥐 (총 약물 투약량: 5 ㎎/쥐) 로 등에 피하 주사하였다.
약물 투여 후 3, 7, 10, 14, 21 및 35일에, 마이크로스피어들을 투여한 위치로부터 수집하였다. 수집된 마이크로스피어들에, 내부 대조 물질을 함유하는 아세토니트릴 5 ㎖ 를 첨가하고, 호모지나이저 (Polytron: Kinematica A.G.)로 용해시켰다. 3,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리한 후, 상등액 3 ㎖를 수집하고, 0.5 M 염화나트륨 수용액 7 ㎖ 와 조합하고, 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 교반한 후, 2,000 rpm 으로 5 분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액 일부를 KC 프렙-옴니 (prep-omni) 13 (Katayama Chemistry Inc.)로 여과하고 FL-HPLC (칼럼; Hypersil 5-ODS, 직경: 4 ㎜, 길이: 300 ㎜, GL Sciences, Inc., 여기 파장: 315 ㎚, 형광 파장: 465 ㎚)에 로딩하였다. 약물 농도는 약물 용액을 사용하여 별도로 만든 표준 곡선과 비교함으로써 결정하였다. 상등액의 결과 농도 및 부피에 근거하여, 마이크로스피어 내에 잔류하는 약물의 잔류율을 계산하였다. 그 결과를 도 8 에 나타내었다.
시험예 5
수컷 SD 쥐들 (7 주령, Japan SLC)을 일주일 동안 실온 (23±2℃)에서 12 시간 명암 사이클로 음식과 물을 임의로 공급하면서 사육하였다. 그 후, 각 쥐에게 실시예 6-(5)와 7-(2)에서 수득된 화합물 (2)를 함유한 마이크로스피어 분산액을 1㎖/쥐 (총 약물 투약량: 0.1 ㎎/쥐)로 등에 피하주사하였다.
규칙적인 시간 간격으로 투여 위치로부터 마이크로스피어들을 수집하였다. 수집된 마이크로스피어들에, 아세토니트릴 10 ㎖ 를 첨가하고, 호모지나이저 (Polytron: Kinematica A.G.)로 용해시켰다. 3,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리한 후, 상등액 3 ㎖ 를 수집하여, 0.5M 염화나트륨 수용액 6 ㎖와 조합하고, 혼합기 (Touch Mixer MT-51: YAMATO Scientific Co., Ltd.)로 교반한 후, 2,000 rpm 으로 5분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액 일부를 KC 프렙-옴니 13 (Katayama Chemistry Inc.)로 여과하고, UV-HPLC (칼럼; 5 Hypersil 5-ODS, 직경: 4 ㎜, 길이: 300 ㎜, GL Sciences, Inc., 검출 파장: 240 ㎚)에 로딩하였다. 약물 농도는 약물 용액을 사용하여 별도로 만든 표준 곡선과 비교함으로써 결정하였다. 상등액의 생성 농도 및 부피에 근거하여, 마이크로스피어 내에 잔류하는 약물의 잔류율을 계산하였다. 그 결과를 도 9 에 나타내었다.
본 발명의 골절 치료 촉진용 조성물은 유효성분으로서 PDE4 저해제를 함유하며, 이를 골절부위에 국부 투여시 PDE4 저해제의 전신 작용으로 인한 부작용을 일으키지 않으면서 수복기 중의 연골내 골화를 촉진함으로써 골절 치료를 촉진할 수 있으며, 최근 주요 사회적 문제가 되고 있는 고령자 및 당뇨병 또는 골다공증 환자에서의 초기 단계에서의 골절 치료를 촉진할 수 있어, 이에 의해 환자들이 누워서 지내는 것을 방지하여 그들의 정상적인 일상 생활을 보장하는 효과를 발현한다. PDE4 저해제 및 생채 적합성 및 생분해성 중합체를 함유하는 조성물을 저장부 제제로, 특히 주사용 마이크로스피어 제제로 제형화하고, 이를 골절 부위에 국부 투여함으로써 효능이 지속되어 보다 큰 효과를 달성할 수 있다.

Claims (19)

  1. 유효성분으로서 PDE4 저해제를 함유하는 골절 치료 촉진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 골절 부위에서 PDE4 저해제를 서서히 방출하도록 제조된 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 생체적합성 및 생분해성 중합체를 함유하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 생체적합성 및 생분해성 중합체가 수불용성인 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 마이크로스피어 (microsphere) 제제 형태인 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 마이크로스피어의 입자 크기가 0.1~150 ㎛ 인 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, PDE4 저해제 함량이 0.0001~80 중량% 인 조성물.
  8. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체가 히드록시 지방산 폴리에스테르인 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체가 폴리락트산, 락트산-글리콜산 공중합체 및 2-히드록시부티르산-글리콜산 공중합체로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 중합체인 조성물.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 수불용성인 생체적합성 및 생분해성 중합체의 평균 분자량이 2000~800000 인 조성물.
  11. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분산제를 함유하는 수용액 중에 마이크로스피어를 0.0001~1000 mg/㎖ 의 농도로 분산시킴으로써 제조된 주사용 마이크로스피어 제제인 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 분산제를 0.01~2 중량% 의 농도로 함유하는 조성물.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 분산제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 캐스터 오일, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 나트륨 알기네이트, 덱스트란, 나트륨 히알루로네이트로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, PDE4 저해제가 선택적인PDE4 저해제인 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, PDE4 저해제의 IC50이 100 nM 미만인 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, PDE4 저해제가 하기와 같은 PDE4 저해 활성을 갖는 부분 구조를 갖는 화합물인 조성물:
    (A) 나프탈렌 또는 그에 유사한 화학 구조; 또는
    (B) 3-시클로펜틸옥시-4-메틸옥시페닐 또는 그에 유사한 화학 구조.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, PDE4 저해제가 PDE4 저해 활성을 갖는 나프탈렌 또는 이소퀴놀린 골격의 부분 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염인 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, PDE4 저해제가 2,3-비스(히드록시메틸)-6,7-디에톡시-1-[1-(2-메톡시에틸)-2-옥소-4-피리딜]나프탈렌 또는 2,3-비스(히드록시메틸)-6,7-디에톡시-1-[2-(4-(3-피리딜)-1(2H)-프탈라디논-2-일)-4-피리딜]나프탈렌 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염인 조성물.
  19. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 마이크로스피어를 응집 저해제를 함유하는 수용액 내에 현탁하고, 생성된 현탁액을 동결건조함으로써 수득가능한 주사용 제제 제조용 조성물.
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