CN113876724B - 一种负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载帕瑞昔布、白介素‑4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球及其制备方法，属于药物载体研究技术领域，本发明采用两次复乳溶剂挥发法制备载理化性质不同的药物，目的在于解决目前临床上制约骨关节炎药物治疗的瓶颈问题或亟待满足的患者需求——骨关节炎发作期间炎症反应引起疼痛与行动不便等问题、关节腔注射面临需要反复注射引起感染问题、口服非甾体抗炎药引起的心脏毒性与胃肠道反应、骨关节炎的长期慢性性质导致的患者用药依存性差问题。

Description

一种负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎 治疗的双层微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球及其制备方法，属于药物载体研究技术领域。
背景技术
针对骨关节炎的治疗，选择性COX-2抑制剂的NSAIDs药物（如塞来昔布、依托考昔等）目前在临床上广泛运用，但是消化道不良反应发生率仍较高，同时口服NSAIDs药物的心血管风险仍不能低估，且长期口服药物患者依从性较差。由于关节炎发病部位的特殊性，对于那些非药物干预或缓解症状药物无效的患者，建议进行关节内注射，以尝试更直接地针对潜在的病理生理过程，但直接关节腔注射单剂量药物作用持续时间有限，因此，常需要重复应用以维持较长时间的疼痛缓解，这又将导致感染，肌肉无力和激素失衡等不良反应。
具有长期可控的释放特性的药物载体——微球，可减少给药次数、减少给药风险，提高患者依从性。微球作为一种药物可控释放体系载体，其常用的载体材料如聚酯、聚酰胺、聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）等已被广泛用于开发药物递送系统，且具有良好的生物降解性，降解时间和药物释放速率应能可根据需求进行调控，且降解后产物对细胞无毒害作用，具有极高的安全性。由于骨关节炎发病及其他临床疾病的病理特征，临床上在采取药物治疗措施的时候常常采用联合给药的方式，以期解决患者多方面的痛苦，使患者及时得到有效的治疗。以骨关节炎为例，常需要首先给予患者快速抗炎药物，如高效高选择性的非甾体抗炎药物，与此同时，为达到更好的长期预后效果，需同时给予软骨修复药物，提高患者生存质量。两种药物常常具有不同的物理性质，如溶解度的差异，微球作为水溶性、脂溶性药物的良好载体，对于同时携带两种性质不同的药物具有巨大的潜能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载帕瑞昔布（PXB）、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球及其制备方法，满足在微球中同时携带性质不同的药物的需求。滑膜炎症引起OA的许多体征和症状，包括疼痛和肿胀。临床上已经使用的小分子高效抗炎镇痛药物帕瑞昔布可以与IL-4一起在单个系统中共同给药，以增强治疗效果。当用于关节内（IA）注射时，由于帕瑞昔布的快速释放，该组合可引起炎症的快速沉降和疼痛的减轻，随后关节软骨的再生以及IL-4的持续释放。本发明为长效缓释制剂，选用了内外两种不同的载体材料，制备出负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白（牛血清白蛋白为保护剂）的双层微球，使得非甾体抗炎药帕瑞昔布（PXB）与巨噬细胞极化因子白介素-4（IL-4）联用，同时逐级、持续、稳定地释放出药物，解决膝关节炎注射抗炎药物所带来的副作用，提高治疗效果及患者的依从性。本发明的技术方案如下：
一种负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球的制备方法，步骤如下：
（1）取白介素-4（IL-4）溶于含模型蛋白牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液作为内水相A；
（2）称取内层载体材料酯封端聚乳酸乙醇酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR溶于二氯甲烷中，形成浓度100mg/mL的载体材料溶液作为油相A，配制1%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）作为外水相；优选的，所述聚乳酸乙醇酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR中LA:GA为75：25，分子量为75000。
（3）将内水相A逐滴加入溶有载体材料的油相A中，经高速剪切机以8000rpm的速度剪切2min后，将形成的W1/O1型乳液，然后再将W1/O1型乳液逐滴加入1%（w/v）的PVA中，经匀浆机以8000rpm的速度剪切2min，得到W1-O1-W2型复乳；
优选的，以1：5的体积比将内水相A逐滴加入溶有载体材料的油相A中；将W1/O1型乳液以1：5的体积比逐滴加入1%（w/v）的PVA中。
（4）将W1-O1-W2型复乳置于磁力搅拌器上挥发有机溶剂4h，以8000rpm的转速离心10min收集上清液，用双蒸水洗涤离心3次洗去多余PVA溶液，汇总洗涤液与上清液，下层沉淀即为单层微球；
（5）将离心后的单层微球用蒸馏水复溶后做内水相B，将外层载体材料端羟基聚乳酸乙醇酸共聚物50/50 OH-PLGA-OH50/50和帕瑞昔布溶于二氯甲烷中，形成浓度50mg/mL的载体材料溶液作为油相B；
（6）将内水相B逐滴加入溶有载体材料的油相B中，10000rpm的速度剪切2min后，将形成的W/O型乳液，然后再将W/O型乳液逐滴加入1%（w/v）的PVA中，经匀浆机以10000rpm的速度剪切2min后得到W3-O2-W4型复乳；
优选的，将内水相B以1：5的体积比逐滴加入溶有载体材料的油相B中；将W/O型乳液以1：10的体积比逐滴加入1%（w/v）的PVA中。
（7）将W3-O2-W4型复乳置于磁力搅拌器上挥发有机溶剂4h，离心收集上清液，用双蒸水洗涤离心3次洗去多余PVA溶液，汇总所有洗涤液与上清液，离心后的下层沉淀即为双层微球，用蒸馏水重悬后加入冻干保护剂，然后冷冻干燥，得到干燥的双层微球。
本发明还包括，通过上述方法获得的负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明制备的双层微球冷冻干燥后外观为白色疏松粉末状，具有较好的流动性，重悬后的混悬液比较均匀，单层及双层载药微球外观圆整，大小均匀。双层微球的PXB包封率为（91.31±1.31）%，载药量为（8.64±1.82）%，牛血清白蛋白包封率为（70.37±1.76）%，载药量为（2.64+1.93）%，且具有长期释放潜力。在将双层载药微球注射到骨关节炎大鼠的关节腔内治疗后的第6周发现药频率较低的组的关节处肿胀抑制程度低于双层微球组，且双层微球组随着治疗时间的延长，12周时两足关节周径已接近相似。结果表明延长药物在关节内的停留时间导致其作用持续以覆盖整个研究期间，可显著抑制关节肿胀程度。microCT扫描结果显示，双层微球制剂组显著减轻了软骨下骨的侵蚀破坏，且关节表面更加光滑完整，分离出骨小梁发现密度亦增加，表示骨关节炎症的缓解与骨修复的进展。组织病理学分析和免疫组化结果显示治疗组不同程度地抑制骨关节炎的进展，表现为炎症细胞浸润减少、炎性因子表达降低、软骨厚度的增加和抑制软骨细胞凋亡。总之，抗炎联合软骨修复治疗在患骨关节炎的大鼠膝关节中表现出较好的抗炎疗效与软骨保护活性。
附图说明
图1为本发明获得的双层微球的形态表征图；图1A为冻干后的白色粉末，图1B为重悬后为均匀的白色混悬液；
图2为本发明获得的单、双层微球的SEM形态表征图；其中，图2A为粒径分布在4-5.5μm的单层微球，图2B为粒径分布在8-10μm的双层微球；
图3为双层微球的傅立叶变换红外吸收光谱仪的特征峰表征图；
图4为双层微球的X射线衍射晶体性质表征图；
图5为双层微球中：牛血清白蛋白的释放曲线图；
图6为双层微球中帕瑞昔布的释放曲线图；
图7为实验鼠治疗过程示意图；
图8为不同给药组治疗骨关节炎大鼠的膝关节肿胀抑制情况；
图9为离体骨组织micro CT扫描与骨小梁分离结果；
图10为苏木精和曙红（H＆E）染色对关节软骨和滑膜的组织学评估、番红固绿染色（F-O）；
图11为肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、II型胶原蛋白（COL2）、糖胺聚糖（AGGRECAN）、前列腺素E2（PGE2）、白介素-10（IL-10）的免疫组化结果图；
图12为免疫组化检测中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的定量分析图；
图13为免疫组化检测中II型胶原蛋白（COL2）表达的定量分析图；
图14为免疫组化检测中糖胺聚糖（AGGRECAN）表达的定量分析图；
图15为免疫组化检测中前列腺素E2（PGE2）表达的定量分析图；
图16为免疫组化检测中白介素-10（IL-10）表达的定量分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：一种负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球中内层微球的制备方法
（1）取1ug的白介素-4（IL-4）溶于100ul含0.1%（w/v）模型蛋白牛血清白蛋白的PBS溶液作为内水相；
（2）称取50mg内层载体材料酯封端聚乳酸乙醇酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR（LA:GA为75：25，分子量为75000）溶于0.5mL二氯甲烷中，形成浓度100mg/mL的溶液作为油相，配制1%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）作为外水相；
（3）先将内水相以1：5的水相/油相比例逐滴加入溶有载体材料的油相中，经高速剪切机以8000rpm的速度剪切2min后，将形成的W1/O1型乳液，然后再将该乳液以1：5的比例逐滴加入1%（w/v）的2.5mL PVA中，经匀浆机以8000rpm的速度剪切2min后得到W1-O1-W2型复乳；
（4）再将W1-O1-W2型复乳置于磁力搅拌器上以600r/min的速度挥发有机溶剂4h，离心收集上清液，用双蒸水洗涤离心3次洗去多余PVA溶液，汇总所有洗涤液与上清液待测包封率与载药量，下层沉淀为单层微球。其粒径与形态SEM表征如图2A中所示。
实施例2：一种负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球的制备方法
（1）将实施例1获得单层微球用蒸馏水复溶后做新的内水相，体积为0.5mL，将外层载体材料端羟基聚乳酸乙醇酸共聚物50/50 OH-PLGA-OH50/50（LA:GA为50：50，分子量为8000）和10mg帕瑞昔布溶于2.5mL二氯甲烷中，形成载体浓度50mg/mL的溶液作为油相；
（2）先将内水相以1：5的水相/油相比例逐滴加入溶有载体材料的油相中，10000rpm的速度剪切2min后，将形成的W/O型乳液，然后再将该乳液以1：10的比例逐滴加入到25mL，1%（w/v）的PVA中，经匀浆机以同样的的速度剪切2min后得到W3-O2-W4型复乳；
（3）再将W3-O2-W4型复乳置于磁力搅拌器上以600r/min的速度挥发有机溶剂4h，离心收集上清液，用双蒸水洗涤离心3次洗去多余PVA溶液，汇总所有洗涤液与上清液待测包封率与载药量；离心后的下层沉淀为双层微球，用蒸馏水重悬后加入冻干保护剂后进行冷冻干燥后最终得到干燥的双层微球。
将该实施例获得双层微球重悬于溶液中，通过超景深三位观察显微系统（KeyenceVHX-5000，日本）观察溶液中的微球形态并测量其粒径分布。将冻干后成粉末状的微球粘在导电胶上，利用超高分辨电子束曝光成像系统（SEM-EDS-FIB）（蔡司Pioneer Two，德国）观察双层微球的形态。获得的双层微球冷冻干燥后外观为白色疏松粉末状，如图1A所示，具有较好的流动性，重悬后的混悬液比较均匀，如图1B所示。冻干后SEM形态表征如图2所示，单层（图2A）及双层（图2B）载药微球外观圆整，大小均匀，单层微球粒径为4-5.5μm，双层微球粒径分布在8-10μm。双层微球的外层药物PXB包封率为（91.31±1.31）%，载药量为（8.64±1.82）%，牛血清白蛋白BSA包封率为（70.37±1.76）%，载药量为（2.64+1.93）%。
试验例1：验证药物在双层微球中的负载情况
采用X射线衍射（XRD）分析和傅里叶变换红外光谱（FTIR）。进行XRD扫描之前，将完全干燥的微球研磨成细粉。取10mg使用范围从0度到80度的衍射角（2θ）用高分辨X射线衍射仪（理学smartlab 3kw，日本）扫描粉末样品，获取本发明实施例2获得的双层微球、空白双层微球和PXB粉末混合物、载IL-4和BSA的单层PLGA1和载PXB的单层PLGA2微球的混合物、载PXB的单层PLGA2微球、PXB粉末、PLGA2、载IL-4和BSA的单层PLGA1微球及PLGA1的XRD曲线，如图3所示载帕瑞昔布的单层微球经历了非晶化过程，而帕瑞昔布粉末在10到25度之间显示出丰富的典型峰，表明处于结晶状态。PXB在PLGA1中的非晶化可能促进了它的快速释放。而对比载IL-4和BSA的单层微球在20度左右处的特征峰在双层微球中消失，代表IL-4和BSA完全被封装在双层微球内部。由此证明帕瑞昔布与IL-4分别被负载在双层微球的外层与内层。将本发明实施例2获得的双层微球、空白双层微球和PXB粉末混合物、载IL-4和BSA的单层PLGA1和载PXB的单层PLGA2微球的混合物、PLGA2、PXB粉末及PLGA1的FTIR光谱在IRAffinity-1 CE（日本岛津）光谱仪上记录，波长范围为400-4000cm-1。使用KBr压片法测试。如图4所示，帕瑞昔布粉末在500-2000cm-1范围内和3000、3500cm-1处共有特征吸收峰。载帕瑞昔布的单层微球的这些吸收峰在空白双层微球（D-BL-MS）与帕瑞昔布粉末的物理混合物中仍然存在，只是强度降低了，这表明大部分帕瑞昔布被负载在微球外层载体内，另有少部分可能嵌合在外层载体上。而位于3000cm-1处的PLGA1载体的特征吸收峰几乎消失了，这表明PLGA1载体材料被完全包载在内部。而载帕瑞昔布的单层微球与载IL-4和BSA的单层微球的物理混合物显示在3200cm-1一个明显的特征吸收峰，此峰在双层微球中消失。综合分析XRD和FTIR结果表明，IL-4被成功包载于双层微球的内层，帕瑞昔布被大部分被包载在外层，另有少部分可能嵌合在外层载体上。
试验例2：对本发明双层微球的长期释放性检测
将载有本发明实施例2获得的双层微球（50mg）用2mL释放介质置于透析袋（截留分子量为70000）中，使其悬浮在30mL试管中，释放介质为含有吐温80（0.5wt%）的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4和6.8，37℃）中。将试管在蒸气浴恒温振动器中以100rpm的速度振荡。在所需的时间间隔内，从释放介质中提取2mL释放介质，然后添加2mL新鲜介质。释放的帕瑞昔布样品通过测量265nm波长处的吸光度进行定量，直至释放研究完成。释放出的牛血清白蛋白样品储存在冰箱中直到进行ELISA试剂盒进行定量。释放出的帕瑞昔布需要将所有样品溶液均通过0.22μm有机过滤器过滤，转移至HPLC小瓶里并使用Agilent 1200 HPLC系统（安捷伦，美国）在265nm的紫外吸收波长下通过HPLC进行分析。DTX的色谱条件如下：λmax=265nm，流动相，乙腈：醋酸铵缓冲液（10Mm，pH=5.0）=55:45（v/v），一式三份测量分析，然后使用以下等式计算药物包封效率和装载效率：
EE%=W包载药量/W总药量×100%
DL%=W包载药量/W药物与材料总量×100%
通过体外释放实验，如图5和图6所示，内外层药物释放性能存在较大差异，同种药物在不同pH条件下释放性能也存在差异性，在两种不同的pH条件下，酸性环境下帕瑞昔布释放较快，如图6所示，于第9天就已经基本释放完毕，而在中性环境中可释放持续到超过17天；如图5所示，模型蛋白牛血清白蛋白的释药曲线显示在中性环境中可见其释放缓慢，在第17天才释放至20%左右，具有长期释放潜力。
试验例3：对本发明双层微球的抗骨关节炎与软骨修复效用检测
取健康Wistar雄性大鼠50只，6周龄，体重约200-250g，将大鼠使用3％戊巴比妥钠（按体重40mg/Kg）进行腹腔注射麻醉，观察大鼠呼吸，待大鼠翻身反射消失后，右侧膝关节备皮。将大鼠仰卧位固定于手术台上，术区常规碘酒酒精消毒，铺无菌巾。取膝内侧髌骨旁切口，切断并切除内侧副韧带，逐层进入，打开关节囊后，髌骨外翻，屈膝位切除内侧半月板，髌骨复位及青霉素生理盐水冲洗后关闭关节囊，缝合手术切口，术中少量出血用无菌纱布按压止血。充分冲洗，止血，逐层关闭，切口用无菌纱布按压止血。注意保护胫骨平台关节软骨面。术后常规应用青霉素3天，对大鼠进行手术后感染和其他并发症的监测，自由活动。假手术组只进行膝关节关节囊切开暴露，不行内侧副韧带及半月板切除手术。抗生素生理盐水冲洗后关闭切口。其余处理同手术组。如图7所示，造模4周后，手术组分为5组，分别为PBS组（OA）、游离PXB组（PXB-FREE）、游离IL-4组（IL-4-FREE），同时给予游离PXB和IL-4组（PXB+IL-4-FREE）和本发明实施例2获得的双层微球制剂组（D-MS）。OA组每天给予PBS0.1mL；PXB-FREE组的给药频率为1次/周，每次100mg/0.1mL；IL-4-FREE组的给药频率为1次/天，每次20ng/0.1mL；PXB+IL-4-FREE组中IL-4的给药频率为1次/天，PXB的给药频率为1次/周，给药量与PXB-FREE和IL-4-FREE组保持一致；上述四组均连续给药4周；实施例2获得的双层微球制剂组一次性注射至关节腔内。用游标卡尺监测每只老鼠两侧膝关节的周径，如图8所示。
治疗的第6周，抽取治疗侧关节液和对照健康侧关节液后，冻存在-80℃里等待细胞因子包括TGF-α、PGE2和IL-1β的检测。杀死OA组、PXB-FREE组、IL-4-FREE组、PXB+IL-4-FREE组的全部与制剂实施例2获得的双层微球制剂组的一半老鼠，进行micro CT扫描和组织学分析。取出各个分组的大鼠右侧膝关节的胫骨平台及股骨髁部关节面，注意不要损伤滑膜组织和注意保持骨面尤其软骨面的平整，放于含4％的多聚甲醛中固定。在小动物的微CT 成像系统（PerkinElmer Quantum GX2，日本）上进行扫描。每个样品逐层扫描（扫描厚度18μm，扫描电压90kV，电流88μA），得到扫描的图像。并在micro CT数据处理工作站（PerkinElmer Quantum GX2，日本）上对胫骨的软骨下骨的骨密度（BMD）和骨小梁厚度、骨小梁间距和骨小梁数量进行定量分析。BMD通过相同条件下拍摄5种标准羟基磷灰石（HA）模型（0、50、200、800、1200 mgHA/cm3）后，在三维图像中选取相同大小的定标体模的截面，在截面上选取相同大小的体模区域，计算每个区域的密度平均值，绘制标准曲线来确定样品的密度。其余老鼠在治疗后的第12周杀死，同样进行micro CT扫描和组织学分析。
为确定双层微球对于骨关节炎的不同治疗效果，将micro CT扫描后的组织重新放于含4％的多聚甲醛中固定，采用EDTA溶液梯度脱钙。取脱钙后组织分别做苏木精和伊红染色、番红-固绿染色和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、II型胶原蛋白（COL2）、糖胺聚糖（AGGRECAN）、前列腺素E2（PGE2）、白介素-10（IL-10）的免疫组化分析。
在治疗后第6周，如图8所示，给药频率较低的组，如游离PXB组和实施例2获得的双层微球制剂组的骨关节的肿胀抑制程度更低，制剂组随着治疗时间的延长，12周时两足关节周径已接近相似。结果表明延长药物在关节内的停留时间导致其作用持续以覆盖整个研究期间，可显著抑制关节肿胀程度。micro CT扫描结果，如图9显示，实施例2获得的双层微球制剂组显著减轻了软骨下骨的侵蚀破坏，且与假手术组相比，关节间隙宽度有增加的趋势，且关节表面更加光滑完整，分离出骨小梁发现密度亦增加，这些表示骨关节炎症的缓解与骨修复的进展。组织病理学H&E与F-O染色分析如图10所示，与假手术组相比，PBS组大鼠骨关节炎软骨中软骨厚度显著减少，典型的骨关节炎特征，如表面不规则、侵蚀裂隙在PBS组中最为明显。而治疗组不同程度地抑制骨关节炎的进展，表现为软骨厚度的增加和抑制软骨细胞凋亡。总之，抗炎联合软骨修复治疗在患骨关节炎的大鼠膝关节中表现出较好的抗炎疗效与软骨保护活性。同时，如图11-16免疫组化分析结果与定量分析所示，相较于给予PBS组和游离IL-4的组，给予帕瑞昔布的游离PXB组和同时给予游离PXB和IL-4组、实施例2获得的双层微球制剂组降低了TNF-α、PGE-2的水平，给予白介素-4的游离IL-4组，同时给予游离PXB和IL-4组和实施例2获得的双层微球制剂组胶原蛋白II、软骨蛋白聚糖、IL-10表达水平升高，且制剂组D-MS治疗效果最好。

Claims (3)

1.一种负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：
（1）取白介素-4溶于含模型蛋白牛血清白蛋白的PBS溶液作为内水相A；
（2）称取内层载体材料酯封端聚乳酸乙醇酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR溶于二氯甲烷中，形成浓度100mg/mL的载体材料溶液作为油相A，配制质量浓度为1%的聚乙烯醇（PVA）作为外水相；
（3）将内水相A逐滴加入溶有载体材料的油相A中，经高速剪切机以8000rpm的速度剪切2min后，将形成的W1/O1型乳液，然后再将W1/O1型乳液逐滴加入质量浓度为1%的PVA中，经匀浆机以8000rpm的速度剪切2min，得到W1-O1-W2型复乳；
（4）将W1-O1-W2型复乳置于磁力搅拌器上挥发有机溶剂4h，以8000rpm的转速离心10min收集上清液，用双蒸水洗涤离心3次洗去多余PVA溶液，汇总洗涤液与上清液，下层沉淀即为单层微球；
（5）将离心后的单层微球用蒸馏水复溶后做内水相B，将外层载体材料端羟基聚乳酸乙醇酸共聚物50/50 OH-PLGA-OH50/50和帕瑞昔布溶于二氯甲烷中，形成浓度50mg/mL的载体材料溶液作为油相B；
（6）将内水相B逐滴加入溶有载体材料的油相B中，10000rpm的速度剪切2min后，将形成的W/O型乳液，然后再将W/O型乳液逐滴加入质量浓度为1%的PVA中，经匀浆机以10000rpm的速度剪切2min后得到W3-O2-W4型复乳；
（7）将W3-O2-W4型复乳置于磁力搅拌器上挥发有机溶剂4h，离心收集上清液，用双蒸水洗涤离心3次洗去多余PVA溶液，汇总所有洗涤液与上清液，离心后的下层沉淀即为双层微球，用蒸馏水重悬后加入冻干保护剂，然后冷冻干燥，得到干燥的双层微球；
所述步骤（3）中以1：5的体积比将内水相A逐滴加入溶有载体材料的油相A中；所述步骤（3）中将W1/O1型乳液以1：5的体积比逐滴加入质量浓度为1%的PVA中；所述步骤（6）中将内水相B以1：5的体积比逐滴加入溶有载体材料的油相B；所述步骤（6）中将W/O型乳液以1：10的体积比逐滴加入质量浓度为1%的PVA中。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中聚乳酸乙醇酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR中LA:GA为75：25，分子量为75000。
3.通过如权利要求1或2所述制备方法获得的负载帕瑞昔布、白介素-4和牛血清白蛋白用于骨关节炎治疗的双层微球。
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