KR101338516B1 - 다기능성 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물 - Google Patents

다기능성 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다기능성 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항류마티스 약물을 포함하는 고분자 나노입자; 상기 나노입자의 표면 상에 부분 증착된 자성물질 박막; 상기 자성물질 박막 상에 증착된 금 박막을 포함하는 다기능성 나노입자를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 자성 박막을 통해 자석을 이용하여 염증 부위로 다기능성 나노입자를 타겟팅할 수 있으므로 약물이 타부위로 빠져 나가는 것을 막아 치료 효과를 높이는 한편 부작용을 줄일 수 있다는 점, 그리고 근적외선 요법을 통해 활막 제거술을 시행하지 않고도 비침습적 활막 제거가 가능하다.

Description

다기능성 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물{Pharmaceutical composition for treatment rheumatoid arthritis comprising multi-functional nanoparticles}
본 발명은 다기능성 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현재 류마티스 관절염의 치료에 다양한 약제들이 사용되고 있으나, 이러한 약제의 사용에도 불구하고 류마티스 관절염의 치료는 불완전하다고 알려져 있다. 즉, 초기에 치료를 시작하여도 20~25%의 환자에서만 관해의 기회가 있고 일정한 관해 기간이 지나면 대부분 재발하는 경우가 많다[비특허문헌 1, 2]. 뿐만 아니라 사용되고 있는 치료약제의 부작용으로 상부 위장관 출혈, 신장 및 간장 기능 장애, 감염, 면역기능장애 등이 야기된다고 알려져 있다. 따라서, 부작용이 적으면서 류마티스 관절염을 효과적으로 치료하는 수단의 개발이 무엇보다 중요하다고 할 수 있다.
류마티스 관절염의 병변은 관절강을 안쪽으로 둘러싸고 있는 활막의 염증(synovitis)이다. 활막 내에서 염증이 시작되면 더 많은 염증세포가 활막에 침윤되고, 활막 세포들이 증식하며, 신생혈관의 생성되는 과정을 통해 활막 조직은 더욱 증식되고 활성화된다. 병이 진행됨에 따라 염증반응의 결과로 활막 조직 주위의 관절 연골의 손상과 골파괴가 나타난다. 이러한 관절 내의 염증 반응에는 T 림프구와 B 림프구가 주로 관여하며 이들에서 분비되는 다양한 사이토카인들, 특히 TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터루킨(IL)-1, IL-6에 의해 염증이 지속되고 연골과 골의 파괴가 발생하게 된다.
류마티스 관절염에서 이러한 관절의 손상은 비가역적이며 70~80%의 환자에서 발병 초기에 발생하는 것으로 알려져 있다. 류마티스 관절염 환자에서 흔히 관찰되는 기능적 장애 및 골밀도의 감소 역시 류마티스 관절염의 발병 초기에 가장 많이 발생하고 이들의 발생은 관절 손상의 정도와 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 과거에는 비스테로이드성 항염증제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)를 먼저 투여하고 이의 효과가 충분치 않거나 골미란(bony erosion)이 발생한 경우 항류마티스 약물(disease-modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs)를 추가하는 피리미드식 접근(pyramidal approach)에 의한 단계적 치료가 류마티스 관절염 치료의 근간을 이루었다. 하지만, 최근에는 이러한 접근방법이 관절의 손상을 효과적으로 억제하지 못하는 것으로 보고되고 있으며, 류마티스 관절염이 진단되면 조기에 적극적인 치료를 시작하는 것이 필요하며, 특히 관절의 손상을 예방하기 위해서는 조기에 DMARD를 사용하는 것을 권장하고 있다[비특허문헌 3, 4].
DMARDs는 다른 치료 약제들과는 달리 골미란과 관절의 손상을 감소시키고 예방하는 효과가 입증되어 류마티스 관절염의 치료에 있어서 근간을 이루는 가장 중요한 약제이다. DMARD로 사용되는 약제로는 금 주사제(injectable gold), MTX(methotrexate), SSZ(sulfasalazine), 항말라리아제(hydroxychloroquine, HCQ), 레플루노마이드(leflunomide) 등이 있다. 지난 반세기 동안에는 근육 내 금 주사가 류마티스 관절염의 치료제의 근간을 이루었으나, 예측 불가능한 부작용(과민 반응(hypersensitivity reaction), 신장염(nephritis), 섬유화 폐렴(fibrosing alveolitis))으로 인해 최근 사용이 줄었으며, MTX의 등장으로 대부분의 류마티스 관절염 환자의 치료에 큰 발전이 있었다[비특허문헌 5].
류마티스 관절염 환자에게 어떤 종류의 DMARD를 선택할 것인지, 단일제제를 투여할 것인지, 아니면 2가지 이상의 DMARD를 병용 투여할 것인지 여부는 정답이 있지는 않다. 하지만 최근까지의 연구들을 살펴보면, 작용 시간 면에서는 MTX, SSZ, 그리고 레플루노마이드가 비교적 작용의 발현이 빨라서 약 3개월 이내에 치료 효과를 보이는 반면, HCQ와 부실라민(bucillamine)의 경우, 작용의 발현까지 평균 3개월 이상이 소요되는 것으로 보고되었고, 독성 대비 효능 면에서는 MTX와 HCQ가 가장 효과적이며 그 다음으로 SSZ와 부실라민의 순으로 보고되었다. DMARDs의 병용투여로서는 MTX + SSZ, MTX + SSZ + HCQ, MTX + 레플루노마이드 등의 조합들이 연구되었으며 단일 요법에 비해 우월한 관절 손상의 감소 효과를 보인 연구 결과들이 보고되고 있다. 이들을 바탕으로 최근 미국 류마티스 학회에서는 질병의 활성도에 따라서 시작하는 약제의 가이드라인을 제시하였고, MTX 단독요법은 모든 질병기간, 모든 질병 활성도에서 불량 예후인자 유무에 상관없이 시작하도록 추천된다. 또한, 두 가지 이상의 DMARDs를 복합요법으로 사용할 때에도 MTX 와 다른 DMARD를 병합하는 요법들이 흔하게 추천된다[비특허문헌 6, 7].
최근 2000년대에 류마티스 관절염의 병인기전이 밝혀지게 되면서 관절염 발병기전에 관여하는 TNF-α나 인터루킨 등의 사이토카인을 억제하는 생물학적 제제도 류마티스 관절염 치료에 널리 사용되기 시작하였다. 하지만, 이러한 생물학적 제제도 모든 환자에서 효과를 보는 것은 아니며 고비용이기 때문에 사용에 실제 임상에서 널리 사용하기에는 제한이 있다. 또한, 몇몇 연구에서는 다른 합성 DMARD나 생물학적 제제 단일 사용이 결코 MTX 단독 요법보다 우월하지 않다는 결과들이 보고되면서, 2010년 유럽 류마티스 학회에서 발표한 류마티스 관절염 치료 가이드라인에서는 MTX를 금기가 아닌 이상 류마티스 관절염의 1차 약제로 가능한 빨리 시작하는 것을 추천하고 있다[비특허문헌 8].
현재 MTX의 사용은 주 1회 요법으로 흔히 사용되며 용량은 7.5~10 mg/주에서 시작하여 20~25 mg/주까지 증량할 수 있다. MTX는 폴레이트(folate) 길항제로 퓨린의 합성을 억제하여 고용량에서는 세포 분열을 억제하는 작용을 하지만, 류마티스 관절염에서 사용되는 용량에서는 일반적인 세포독성은 잘 일어나지 않는다. MTX의 작용 기전으로는 주로 퓨린 합성 구조 경로(purine synthesis salvage pathway)가 없는 림프구에 작용하는 것이 알려져 있으며, 최근 연구에서는 세포외 아데노신 분비 역시 중요한 기전이라는 것이 제시되고 있다. MTX는 비교적 효과 발현이 빠르고 독성 대비 효능이 높아 보다 나은 임상경과를 위해서 유리할 것이며, 실제 임상에서도 MTX가 DMARD 중에서 가장 널리 사용되고 있다. 하지만, 그 효과가 탁월함에도 불구하고 일부 환자들은 약제의 부작용(오심, 구토 같은 위장관 부작용, 구내염, 탈모)으로 인하여 약제를 충분한 용량까지 증량하지 못하는 경우가 있으며, 다량을 장기 복용할 경우 폐섬유화, 약물유도성 간염 등의 부작용이 발생할 가능성이 있어 주의가 요구된다[비특허문헌 5].
류마티스 관절염 환자에서 약물 전신 투여에 따르는 부작용을 감소시키고 염증의 주요 부위인 관절강 내에 약물 농도를 높게 유지하는 방법은 매력적인 치료 방법이다. 실제 임상에서 염증이 심한 관절에 윤활액을 흡인하고 관절강 내 약물 주입하는 방법이 진단 및 치료적 목적으로 많이 사용되고 있다. 주로는 스테로이드 관절강 내 주입이 자주 시행되며 이는 급성 염증의 완화와 통증 감소에 효과적이지만 그 지속 효과가 길지 못하고 재발하는 경우가 잦으며 스테로이드는 관절의 손상 진행을 막지는 못한다는 단점이 있다. 따라서, 관절 손상 진행을 늦출 수 있는 DMARD를 관절강 내로 주입하고자 하는 시도도 고려하게 되었으나, 대부분의 연구에서 관절강 내 MTX 주입은 아주 큰 효과를 보이지 못하였다. 이는 관절 내로 주입된 MTX가 빠르게 관절강 내에서 빠져나가 작용부위에서 고농도로 유지되지 않았기 때문으로 판단된다[비특허문헌 9, 10]. 그 이후로 관절 내에 MTX를 더 고농도로 오래 머무르게 하기 위해 여러 약물 전달 체계를 이용한 연구들이 진행되어 리포좀(liposome), 중합성 마이크로입자(polymeric microparticle) 등에 MTX를 결합하여 관절강 내 전달을 높이고자 하는 시도들이 있었으나 아주 만족스러운 효과를 내지는 못하였다[비특허문헌 11 내지 13].
관절강 내로 직접 주사하는 국소 약물 전달 시스템은 류마티스 관절염 치료 약물의 전신 투여에 따르는 여러 부작용을 감소시키고 염증이 발생한 관절강 내의 높은 약물 농도를 유지할 수 있다. 관절강 내의 약물 농도는 약물 전달체의 형태, 크기, 고분자 전달체의 종류, 전달 약물의 종류에 따라서 크게 영향을 받는다[비특허문헌 14]. 지금까지 보고된 고분자 전달체로는 마이크로입자(microparticle), 나노입자(nanoparticle), 리포솜(liposome), 하이드로젤(hydorgel)들로 이루어진 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(l-lactic acid)), 젤라틴, 알부민, 키토산 알지네이트 등이 있으며, 류마티스 관절염 치료제인 베타메타손(betamethasone)[비특허문헌 15], 소듐 포스페이트 풀루엔세인아민(sodium phosphate flouesceinamine) [비특허문헌 16], 나프록센 소듐(naproxen sodium)[비특허문헌 17], MTX [비특허문헌 11-13,18] 등 다양한 약물이 담지되어 관절강 내로 전달되었다. 이 가운데 특히 가교된 알부민 마이크로스피어(albumin microsphere)와 PLGA 고분자 입자가 활막 염증 조직(synovial tissue)에서 약물 방출 및 체내 분해성 면에서 우수성을 나타내었다[비특허문헌 15-17, 19].
또한, 관절강 내에 전달된 약물 전달체가 관절강 내에 머무르는 시간을 더 연장시키기 위해 폴리(프로필렌 설파이드)(poly(propylene sulphide)) 나노입자에 특이 콜라겐 II 결합 펩타이드 리간드(special collagen II-binding peptide ligand), WYRGRL을 결합시키거나[비특허문헌 20], 리포좀에 세포 점착 형성을 돕는 분자(arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptide)를 연결시키는 연구도 보고되었다[비특허문헌 21].
또한, 본 발명자에 의해 출원된 특허문헌 1의 경우에는 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에 금박막이 증착되며, 상기 금박막에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자가 개시되어 있으나, 항체를 필수 구성요소로 하고 있고 약물의 방출율 조절, 표적성 등에 대한 실험을 진행하고 있을 뿐 구체적인 질환의 치료 용도에 사용된 예를 개시하고 있지 않으며,특히 류마티스 관절염 치료 용도에 대해서는 전혀 언급된 바 없다. 특히, Fe 박막을 통한 자성을 이용한 타겟팅 측면이나, 근적외선 요법을 통한 비침습적 활막 제거의 측면에 대해서도 고려된 바 없다.
따라서, 활막 제거술을 시행하지 않고도 비침습적 활막 제거가 가능한 류마티스 관절염 치료용 조성물이 요구되는 실정이다.
국내 특허 출원 제2006-0060678호(2006.06.30)
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이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 나노입자와 결합된 류마티스 관절염 지향성 물질 또는 외부자기장에 의한 나노입자의 자성박막에 의해 염증 부위로 타겟팅하여 염증 부위의 약물 농도를 높임으로써 치료 효과를 높이는 한편 부작용을 줄일 수 있고, 근적외선 조사를 통해 염증 부위에서의 약물방출 속도를 증가시킬 뿐만 아니라 근적외선 조사 요법을 통해 활막 제거술을 시행하지 않고도 비침습적 활막 제거가 가능한 류마티스 관절염 치료용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 항류마티스 약물을 포함하는 고분자 나노입자; 상기 나노입자의 표면 상에 부분 증착된 자성물질 박막; 및 상기 자성물질 박막 상에 증착된 금 박막을 포함하는 다기능성 나노입자를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물과, 상기 치료용 조성물의 나노입자 표면에 류마티스 관절염 지향성 물질이 추가적으로 결합된 류마티스 관절염 치료용 조성물, 및 이들의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서,
항류마티스 약물을 포함하는 고분자 나노입자;
상기 나노입자의 표면 상에 부분 증착된 자성물질 박막; 및
상기 자성물질 박막 상에 증착된 금 박막;
을 포함하는 다기능성 나노입자를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서,
고분자로 항류마티스 약물을 봉입시켜 고분자 나노입자를 제조하는 단계;
상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 자성물질 박막으로 증착시키는 단계; 및
상기 자성물질 박막 표면에 금 박막을 증착시키는 단계;
를 포함하는 다기능성 나노입자 함유 류마티스 관절염 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서,
상기 류마티스 관절염 치료용 조성물을 사람을 제외한 검체에 주입하는 단계;
외부 자기장을 통해 표적 부위에 다기능성 나노입자를 집중시키는 단계; 및
표적 부위에 근적외선 조사하는 단계
를 포함하는 류마티스 관절염 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 류마티스 관절염 치료용 조성물은 관절강 내에 주입시 생분해성 고분자가 서서히 분해되면서 담지되어 있는 항류마티스 약제가 방출되기 때문에 오랫동안 염증 부위에 높은 약물 농도를 제공할 수 있고, 혈관 내에 주입 시, 나노입자와 결합되어 있는 류마티스 관절염 지향성 물질에 의해서 염증 부위로 나노입자를 타겟팅할 수 있을 뿐 아니라, 자성물질 박막을 이용하여 외부 자기장을 염증 부위에 걸어주면 다기능성 나노입자가 염증 부위에 타겟팅할 수 있으므로 약물이 염증부위에 높은 약물 농도를 유지할 수 있어 치료효과를 높이는 한편 부작용을 줄일 수 있으며, MRI 조영제로도 활용 가능하다. 또한, 생분해성 고분자 나노입자 위에 증착된 금 박막은 근적외선(NIR)의 빛을 흡수하여 열로 변환시키는 특성을 갖고 있어, NIR를 조사하면 생분해성 나노입자의 분해속도를 조절하여 약물방출 속도를 조절할 수 있으며, 또한 열을 이용하여 염증세포를 사멸시킴으로써 활막제거술을 시행하지 않고도 비침습적 활막 제거가 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 류마티스 관절염 치료제를 담지된 금 박막 및 철 박막이 부분 증착된 다기능성 나노입자의 모식도이다.
도 2는 철 박막이 증착된 PLGA 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 금 박막-PLGA 나노입자(비교예 1), 금박막-철박막-PLGA 나노입자(실시예 1의 3)), RGD가 결합된 금박막-철박막-PLGA 나노입자(실시예 1의 4))의 UV-Vis/NIR 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 시간에 따른 메소트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자로부터의 메소트렉세이트 방출 거동을 나타낸 것이다.
도 5는 염증 발현에 따른 류마티스 관절염 조직 축적 거동을 나타낸 것으로, 근적외선 흡수 영상에서 흡수도가 크다는 것은 나노입자가 더 많이 축적되어 있다는 것을 의미하는 것이다.
도 6은 시간에 따른 다기능성 나노입자의 류마티스 관절염 조직 축적 거동을 나타낸 것으로, 근적외선 흡수 영상에서 흡수도가 크다는 것은 나노입자가 더 많이 축적되어 있다는 것을 의미하는 것이다.
도 7은 각 그룹 마우스의 시간에 따른 류마티스 관절염 치료 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 각 그룹 마우스의 류마티스 관절염 진행 정도(24일 후)를 나타낸 것이다.
도 9는 치료 그룹 마우스의 관절 CT 영상 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 금박막과 혈관내피세포 증식인자와의 결합능력 평가를 웨스턴 블랏(western blot)으로 확인한 것이다.
도 11은 외부자기장(자석)을 적용한 류마티스 관절염이 유발된 마우스 모델 사진이다.
도 12는 류마티스 관절염이 발현되지 않은 마우스와 류마티스 관절염이 유발된 마우스의 관절조직 및 금박막-철박막-PLGA 나노입자와 근적외선 레이저 조사를 통한 활막제거술이 시행된 마우스의 관절조직을 H&E 염색으로 확인한 것이다.
본 발명은 항류마티스 약물을 포함하는 고분자 나노입자; 상기 나노입자의 표면 상에 부분 증착된 자성물질 박막; 및 상기 자성물질 박막 상에 증착된 금 박막;을 포함하는 다기능성 나노입자를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 류마티스 관절염 치료용 조성물은 항류마티스 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 자성물질 박막이 증착되며, 상기 자성물질 박막 상에 금 박막이 증착된 다기능성 나노입자를 포함한다. 추가로 상기 금 박막에 류마티스 관절염 지향성 물질이 결합된 다기능성 나노입자도 포함한다(도 1 참조).
상기 다기능성 나노입자를 보다 명료하게 설명하기 위하여 먼저 다음 용어들을 정의한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "고분자 나노입자"는 약물을 중심으로 하여 고분자의 코팅층이 형성되어 이루어진 입자를 의미하는 것으로서, 편의상 "고분자의 종류 나노입자"의 형태로 표기할 수 있다. 예를 들면, 고분자의 종류가 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)인 경우에는 PLGA 나노입자로 표기된다.
본 발명의 명세서에서 용어 "자성 물질 박막-고분자 나노입자"는 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에 자성물질 박막이 코팅되어 이루어진 입자를 의미하는 것으로서, 편의상 "자성 물질의 종류 박막-고분자의 종류 나노입자"의 형태로 표기할 수 있다. 예를 들면, 고분자의 종류가 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)이고 자성 물질로 철을 사용한 경우에는 철박막-PLGA 나노입자로 표기된다.
본 발명의 명세서에서 용어 "금 박막-자성물질 박막-고분자 나노입자"는 상기 자성물질 박막-고분자 나노입자의 표면에 금 박막이 형성된 입자를 의미하는 것으로서, 편의상 "금 종류 박막-자성물질의 종류 박막-고분자의 종류 나노입자"의 형태로 표기할 수 있다. 예를 들면, 금은 Au이고, 자성 물질은 Fe이고, 고분자의 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)인 경우에는 Au 박막-Fe 박막-PLGA 나노입자로 표기된다. 또한, "금박막-철박막-고분자 나노입자"는 본 발명의 "다기능성 나노입자"와 상호 교환적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 "류마티스 관절염 지향성 물질-금 박막-자성물질 박막-고분자 나노입자"는 상기 금 박막-자성물질 박막-고분자 나노입자의 표면에 류마티스 관절염 지향성 물질이 결합된 입자를 의미하는 것으로서, 편의상 "류마티스 관절염 지향성 물질-금 종류 박막-자성물질의 종류 박막-고분자의 종류 나노입자"의 형태로 표기할 수 있다. 예를 들면, 류마티스 관절염 지향성 물질은 RGD이고, 금은 Au이고, 자성 물질은 Fe이고, 고분자의 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)인 경우에는 RGD-Au 박막-Fe 박막-PLGA 나노입자로 표기된다.
본 발명에 따른 류마티스 관절염 치료 다기능성 나노입자의 내부에 존재하는 약물은 류마티스 관절염 치료제로서, 약물이 고분자 나노입자의 내부 임의의 위치에 위치하고 있는 것이다. 관절강 내 다기능 나노입자 주입 시 고분자가 서서히 분해되면서 담지되어 있는 항류마티스 약물이 방출되기 때문에 오랫동안 염증 부위에 높은 약물 농도를 유지할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서는 항류마티스 약물로 메토트렉세이트(methotrexate, MTX), 설파살라진(sulfasalazine, SSZ), 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine, HCQ), 레플루노마이드(leflunomide), 부실라민(bucillamine), 금 주사제(injectable gold), 싸이클로스포린(cyclosporin), 타클로리무스(taclorimus), 에타네르셉(Etanercept, Enbrel®), 인플릭시맵(infliximab, Remicade®), 아달리무맵(adalimumab, Humira®), 리툭시맵(Rituximab, MabThera®), 아바타셉(Abatacept, Orencia®) 및 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
약물을 둘러싸는(즉, 코팅하는) 고분자로는 당업계에 공지된 생분해성 고분자(biodegradable polymer)가 이용될 수 있다. 또한, 체내에서 오랜 시간 동안 혈액순환계에 머물기 위해 다양한 분자량의 폴리에텔렌글리콜과 결합되어 있는 생분해성 고분자를 사용한다. 예를 들면 폴리스티렌-코-에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민-코-에틸렌글리콜, 폴리포스파겐-코-에틸렌글리콜, 폴리락타이드-코-에틸렌글리콜, 폴리락티드-코-글리콜라이드-코-에틸렌글리콜, 폴리카프로락톤-코-에틸렌글리콜, 폴리안하이드라이드-코-에틸렌글리콜, 폴리말릭산-코-에틸렌글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트-코-에틸렌글리콜, 폴리하이드로옥시부틸레이트-코-에틸렌글리콜, 폴리카르보네이트-코-에틸렌글리콜 및 폴리오르소에스테르-코-에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-라이신-코-에틸렌글리콜, 폴리글리콜라이드-코-에틸렌글리콜, 폴리메틸메타아크릴레이트-코-에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈-코-에틸렌글리콜, 및 이의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 이용될 수 있다. 상기 고분자들은 낮은 독성뿐만 아니라 탁월한 생체 적합성을 보여주는 것으로 알려져 있다[A. J. Domb, et al. Handbook of biodegradable polymers, Harwood academic publishers, USA, 1997). 본 발명에서는 미국 FDA에 의해 승인된 PLGA를 이용하는 것이 바람직하다.
고분자 표면에 증착된 자성물질 박막은 초상자성(superparamagnetism)을 보이기 때문에 외부 자기장을 이용하여 염증 부위로 다기능 나노입자를 집중할 수 있으므로 부작용을 줄이면서 치료 효과를 높일 수 있다. 또한, 자성물질 박막은 MRI 조영제로도 활용 가능하다.
특히, 본 발명에 따른 다능성 나노입자는 자성 박막이 고분자 나노입자 표면의 일부에만 증착되어 있는 것을 특징으로 하는데, 자성물질 박막이 증착되지 않은 부분은 약물이 방출되는 출구와 같은 역할을 하게 된다. 이러한 역할을 달성하기 위하여 자성물질 박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%, 보다 바람직하게는 30 내지 70%에 증착한다. 또한, 자성물질 박막은 Co, Mn, Fe, Ni 및 Gd로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어질 수 있다.
상기 자성물질 박막 상에 증착된 금 박막은 근적외선(NIR)의 빛을 열로 변환시키는 특성을 가지고 있다. 때문에 근적외선을 조사하면 고분자 나노입자의 분해 속도가 빨라지고, 약물 방출 속도가 가속화되므로 근적외선을 이용하여 약물 방출 속도 조절이 가능하다. 그리고, 금 박막이 근적외선 빛을 잘 흡수하기 때문에 생체 내(in vivo) NIR 흡수 이미징도 가능하다.
또한, 필요 시 파워가 높은 근적외선을 조사하면 국소적으로 온도를 60 ~ 70 ℃ 수준으로 올릴 수 있기 때문에 열을 이용하여 염증 세포를 사멸시킴으로써 수술하지 않고 활막층을 제거할 수 있다. 실제 임상적으로도 DMARD 치료 중에도 단일 관절에 염증이 잘 조절되지 않는 경우를 자주 경험하게 되는데, 이런 경우 국소 스테로이드 주사 치료가 흔하게 시행된다. 하지만, 이러한 국소 치료에도 불구하고 관절염이 자꾸 재발하거나 치료 효과가 완전치 않은 경우에는 활막절제술(synovectomy)을 시행한다. 이러한 활막 절제술의 방법으로는 수술적인 방법과 방사선적인 방법이 있고 방사선적인 방법은 비침습적으로 활막절제 효과를 낼 수 있음이 몇몇 연구에서 보고되고 있다[van der Zant FM, Boer RO, Moolenburgh JD, Jahangier ZN, Dijlsma JW, Jacobs JW. Radiation synovectomy with Yttrium, Rhenium and Erbium: a systemic literabure review with meta-analyses. Clin Exp Rheumatol 2009; 27: 130-139]. 본 발명에 따른 다기능 나노입자는 열을 가하면 방사선 활막제거술과 유사한 효과를 낼 수 있어 류마티스 관절염 치료 효과뿐 아니라 비침습적으로 활막절제술을 같이 시행하면서 방사선조사로부터 자유로울 수 있다는 장점이 있다.
또한, 금 자체가 류마티스 관절염의 치료 효과가 있음이 입증되어 이전 반세기에는 치료제로 흔하게 쓰였지만 예측 불가능한 부작용으로 인해 실제 그 사용에는 제한이 있었다[Vollenhoven RF. Treatment of rheumatoid arthritis: state of the art 2009. Nat Rev Rheumatol 2009;5:531-541]. 본 발명에서 다기능 나노입자를 관절강 내로 직접 주입할 때에는 항 류마티스 약물와 함께 금이 관절염 치료에 있어 시너지 효과를 기대할 수 있으며, 다기능 나노입자 표면에 관절염 표적지향 류마티스 관절염 지향성 물질(moiety)을 결합시키면 전신 투여 시에도 금의 전신적인 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 한층 높일 수 있다. 상기 류마티스 관절염 지향성 물질(moiety)은 구체적으로 아르기닌-글리신-아스파르트산 펩타이드(Arg-Gly-Asp peptide, RGD), 엽산(folic acid), 항-E-셀렉틴 항체(anti-E-selectin antibody), sLex(sialyl Lewis X), pHLIP(pH low insertion peptide), 3,5-디펜타-디사이클록시-벤카미딘 하이드로클로라이드(3,5-dipenta-decycloxy-benzamidine hydrochloride), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 트립토판-티로신-아르기닌-글리신-아르기닌-류신 펩타이드(Trp-Tyr-Arg-Gly-Arg-Leu peptide, WYRGRL) 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 상기 결합은 금박막의 표면과 결합되어 있는 폴리에틸렌글리콜의 반응성기와 에스테르 및 펩타이드 반응에 의한 공유 결합 또는 금박막의 표면과 결합되어 있는 프로테인 G와 항원 항체 반응에 의한 특이적 결합을 의미한다.
또한, 금 박막에 신생혈관 생성과 밀접한 관련이 있는 VEGF(vascular endothelial growth factor)가 잘 결합되므로 신생혈관 생성을 억제하는 효과도 있기 때문에 약물 치료와 함께 시너지 효과를 기대할 수 있다.
금 박막 역시 상기 자성물질 박막과 같이, 고분자 나노입자 표면에 증착되지 않은 부분은 약물이 방출되는 출구와 같은 역할을 하게 된다. 이러한 역할을 달성하기 위하여 금 박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 20 내지 80%, 바람직하게는 30 내지 70%, 보다 바람직하게는 40 내지 60%에 증착한다. 금 박막이 전체 표면 중 20% 미만으로 증착되면 근적외선을 흡수하여 열을 발생하지 못하는 문제가 있고, 80% 초과 증착되면 고분자 입자에서의 약물 방출 속도에 문제가 있어 바람직하지 못하다.
또한, 금 박막은 금뿐만 아니라 백금 또는 이 둘의 합금으로 이루어질 수 있다.
이와 같은 다기능 나노입자는 관절강 내 국소 주입형 약물 전달 뿐 아니라 전신 투여용 표적지향약물 전달도 가능하므로 다발성 류마티스 관절염 치료용 조성물의 유효성분으로 바람직하다.
특히, 본 발명은 관절강 내 다기능 나노입자 주입 시 고분자가 서서히 분해되면서 담지되어 있는 항류마티스 약물이 방출되기 때문에 오랫동안 염증 부위에 높은 약물 농도를 유지할 수 있다.
본 발명은 상기 다기능성 나노입자를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 류마티스 관절염 치료용 조성물은 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함한다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염 또는 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한,
고분자로 항류마티스 약물을 봉입시켜 고분자 나노입자를 제조하는 단계;
상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 자성물질 박막으로 증착시키는 단계; 및
상기 자성물질 박막 표면에 금 박막을 증착시키는 단계;
를 포함하는 다기능성 나노입자 함유 류마티스 관절염 치료용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조방법의 첫 단계는 고분자로 항류마티스 약물을 봉입시켜 고분자 나노입자를 제조하는 단계이다. 고분자로 항류마티스 약물을 봉입시켜 고분자 나노입자를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에서는 공지된 바에 의하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법의 두 번째 단계는 상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 자성물질 박막으로 증착시키는 단계이다. 먼저 고분자 나노입자를 예를 들면, 물과 같은 용매에 용해하여 현탁액을 제조한 후 상기 현탁액을 유리 또는 실리콘 기판 상에 뿌려주어 고분자 나노입자를 균일하게 분포시킨다. 기판 상에 고분자 나노입자를 균일하게 분포시키기 위하여, 유리 또는 실리콘 기판은 피라나(pirana)로 처리하여 친수성을 띄게 하는 것이 바람직하다. 유리 또는 실리콘 기판은 본래 소수성을 띄고 있어 물에 용해되어 친수성을 보이는 고분자 나노입자를 뿌려주면 방울로 뭉치면서 결과적으로 고분자 나노입자가 균일하게 분포되지 않기 때문이다.
또한, 기판 상에 고분자 나노입자를 균일하게 분포시키고 이후에 고분자 나노입자에 균일하게 자성물질 박막을 증착시키기 위하여, 기판을 스핀 코터(spin coater) 상에 위치시킨 상태로 실시하는 것이 바람직하다. 스핀 코터는 스핀을 발생시키는데, 이 스핀이 기판 상에 배열된 고분자 나노입자를 지정된 위치에 고정시키고 이후에 자성물질 박막이 균일하게 증착되도록 기여하기 때문이다.
기판 상에 고분자 나노입자를 균일하게 분포시킨 후에는 상기 고분자 나노입자 표면에 자성물질 박막을 증착시키는데, 이때 열증발증착기(thermal evaporator), 전자빔증발증착기(e-beam evaporator), 스퍼터링(sputtering)과 같은 박막 증착기를 이용하는 것이 바람직하다. 증발증착기는 고진공 상태에서 전자빔이나 전기 필라멘트를 이용해 보트를 가열하여 보트 위에 자성물질을 녹여 증류시키고 상기 증류된 자성물질는 기판 상에 배열된 고분자 나노입자와 접촉하게 되면 응축되어 고분자 나노입자에 자성물질 박막을 증착시킬 수 있다. 스퍼터링은 이온을 생성하기 위해 플라즈마를 사용하여, 플라즈마 내에서 생성된 이온들로 하여금 고분자 나노입자 위에 자성물질 박막을 증착시킬 수 있다. 여기서, 자성물질 박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 10 내지 90%에 증착되도록 한다.
본 발명에 따른 제조방법의 세 번째 단계는 상기 자성물질 박막이 증착된 나노입자 상에 금 박막을 증착시키는 단계이다.
상기 자성물질 박막이 증착된 고분자 나노입자 표면에 금 박막을 증착시키는데, 이때 열증발증착기(thermal evaporator), 전자빔증발증착기(e-beam evaporator), 스퍼터링(sputtering)과 같은 박막 증착기를 이용하는 것이 바람직하다. 증발증착기는 고진공 상태에서 전자빔이나 전기 필라멘트를 이용해 보트를 가열하여 보트 위에 금물질을 녹여 증류시키고 상기 증류된 금물질는 기판 상에 배열된 자성물질 박막-고분자 나노입자와 접촉하게 되면 응축 되어 자성물질 박막-고분자 나노입자의 자성물질 박막 위에 금물질 박막을 증착시킬 수 있다. 스퍼터링은 이온을 생성하기 위해 플라즈마를 사용하여, 플라즈마 내에서 생성된 이온들로 하여금 자성물질 박막-고분자 나노입자 위에 금물질 박막을 증착시킬 수 있다. 여기서, 금 박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 20 내지 80%에 증착되도록 한다.
이렇게 하여 금 박막-자성물질 박막이 증착된 나노입자는 물리적인 힘을 가하여 예를 들면, 초음파를 이용하여 기판으로부터 분리할 수 있다.
추가적으로 상기 금 박막 증착 후, 다기능성 나노 입자 표면에 류마티스 관절염 지향성 물질(moiety)을 화학적 공유 결합 또는 항원-항체 특이적 결합을 시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 류마티스 관절염 치료용 조성물을 사람을 제외한 검체에 주입하는 단계;
외부 자기장을 통하여 표적 부위에 다기능성 나노입자를 집중시키는 단계; 및
표적 부위에 근적외선을 조사하는 단계
를 포함하는 류마티스 관절염 치료방법에 관한 것이다.
다른 관점으로서, 본 발명은 상기 류마티스 관절염 치료용 조성물을 검체에 주입하는 단계; 외부 자기장을 통하여 표적 부위에 다기능성 나노입자를 집중시키는 단계; 및 표적 부위에 근적외선을 조사열을 발생시켜 표적 부위에 존재하는 세포를 살상하고, 상기 약물의 방출을 촉진하여 표적 부위를 치료하는 단계를 포함한 류마티스 관절염 치료방법에 관한 것이다.
상기 치료방법의 첫 번째 단계에서는 본 발명에 따른 다기능성 나노입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한 류마티스 관절염 치료용 조성물을 검체에 주입한다.
상기 치료방법의 두 번째 단계에서는 염증 부위에 외부 자기장을 적용시켜 나노입자 표면에 증착된 자성물질 박막으로 인하여 다기능성 나노입자를 염증 부위에 집중시킬 수 있다.
상기 치료방법의 세 번째 단계에서는 표적 부위에 근적외선(800 내지 1200 nm)을 조사하면 다기능성 나노입자의 금 박막이 근적외선을 흡수한 후 열을 발생시킨다. 이 열은 표적 부위와 이에 근접한 세포들을 살상할 수 있고, 또한 고분자의 분해를 촉진하여 고분자 내에 있던 약물의 방출을 촉진한다. 결국, 열 자체에 의한 세포 살상과 열에 의한 약물 방출 촉진에 의하여 표적 부위에서 목적한 치료 효과를 배가시키는 것이 가능하다.
[ 실시예 ]
이하 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 다기능성 나노입자의 제조
1) 메소트렉세이트를 함유한 PLGA 나노입자의 제조
2 mg의 메소트렉세이트와 100 ㎎의 PLGA 50:50 (분자량 5,000, Wako Chemicals Co.)을 10 ㎖의 디클로로에탄(Duksan Pure Chemicals Co.)에 용해하였고, 이 용액을 안정화제로서 폴록사머 F-127(0.1 wt%/V, Sigma-Aldrich)을 함유한 100 ㎖의 수상에 첨가하였다.　 이 혼합물을 유기 및 연속상의 상호간 포화 후에 초음파기로 350 W에서 10분 동안 유화시켰다.　 이어서, 용매를 증발시키고 교반하면서 여과 셀에서 세럼 교체 (serum replacement)하고 10,000 rpm에서 30분 동안의 원심분리를 3차례 반복하여 메소트렉세이트를 담지한 PLGA 나노입자를 수득하였다.　 이렇게 얻은 PLGA 나노입자는 입도 분석기(direct light scattering analysis)로 분석한 결과, 평균 직경이 약 100 nm인 것으로 확인되었다.
2) 고분자 나노입자에 철 박막 증착
상기 1)에서 얻은 메소트렉세이트를 담지한 PLGA 나노입자를 물에 용해하여 고분자 나노입자의 현탁액을 제조하였다.　 스핀 코터에 피라나(pirana) 처리된 실리콘 기판을 위치시킨 후 이의 표면에 상기 현탁액을 뿌려서 고분자 나노입자가 균일하게 분포되도록 하였다.　 그 다음 열증발증착기를 이용하여 고분자 나노입자 표면 60% 정도에 철박막이 증착되도록 하였다.　 이어서, 초음파(40 kHz)를 5 내지 10분 정도 처리한 후 철이 증착된 고분자 나노입자를 기판에서 분리하였다.
이렇게 하여 수득한 철박막이 증착된 나노입자를 TEM으로 관찰한 결과, PLGA 나노입자 표면 일부에 철박막이 증착된 것을 알 수 있었다[도 2].
3) 철박막이 증착된 고분자 나노입자에 금박막 증착
상기 2)에서 얻은 철 박막이 증착된 PLGA 나노입자 표면 50% 정도에 열증발증착기를 이용하여 금 박막이 증착되도록 하였다. 이어서, 초음파(40 kHz)를 5 내지 10분 정도 처리한 후 금과 철 박막이 증착된 고분자 나노입자를 기판에서 분리하였다.
이렇게 하여 수득한 금박막이 철박막 위에 증착된 나노입자를 광 흡수 스펙트럼으로 관찰한 결과, 근적외선 영역으로 흡수 스펙트럼의 이동된 것을 확인할 수 있어 PLGA 나노입자 표면 일부 위에 증착된 철박막 위에 금박막이 증착된 것을 알 수 있었다[도 3 참조].
4) 류마티스 관절염 지향성 물질이 결합된 나노입자의 제조
상기 실시예 1의 3)의 나노입자(50 mmol)의 금 박막 위에 기능성 PEG (HS-(CH2CH2)175-COOH, 10 mmol)와 24시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 미반응 기능성 PEG는 10,000 rpm 원심분리를 통해 제거하였다. 그 후, 기능성 PEG 동몰의 EDC(1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide, 10 mmol)와 NHS(N-hydroxysuccinimide, 10 mmol)를 이용하여 기능성 PEG 동몰의 류마티스 관절염 지향성 물질인 RGD(10 mmol)와 실온에서 24시간 동안 교반 반응시켜 류마티스 관절염 지향성 물질이 금박막의 PEG에 공유 결합된 나노입자를 제조하였다.
이렇게 하여 수득한 지향성 물질인 RGD가 금박막 위의 PEG와 공유 결합된 것을 알 수 있는 말레이미드(maleimide)의 1H-NMR 피크가 6.7 ppm에서 관찰되었다.
비교예 1: 고분자 나노입자에 금 박막 증착
상기 실시예 1의 1)에서 얻은 메소트렉세이트를 담지한 PLGA 나노입자를 물에 용해하여 고분자 나노입자의 현탁액을 제조하였다.　스핀 코터에 피라나 (pirana) 처리된 실리콘 기판을 위치시킨 후 이의 표면에 상기 현탁액을 뿌려서 고분자 나노입자가 균일하게 분포되도록 하였다.　그 다음 열증발증착기를 이용하여 고분자 나노입자 표면 50% 정도에 금박막이 증착되도록 하였다. 이어서, 초음파(40 kHz)를 5 내지 10분 정도 처리한 후 금이 증착된 고분자 나노입자를 기판에서 분리하였다.
이렇게 하여 수득한 금박막이 증착된 나노입자를 TEM으로 관찰한 결과, PLGA 나노입자 표면 일부에 금박막이 증착된 것을 알 수 있었다.
실험예 1: 본 발명에 따른 나노입자의 흡수 스펙트럼 분석
금박막-PLGA 나노입자(비교예 1), 금박막-철박막-PLGA 나노입자(실시예 1의 3)), RGD가 결합된 금박막-철박막-PLGA 나노입자(실시예 1의 4))에 대한 흡수 스펙트럼을 UV-Vis/NIR 분광계를 이용하여 분석하였다.
금박막-PLGA 나노입자, 금박막-철박막-PLGA 나노입자 및 RGD가 결합된 금박막-철박막-PLGA 나노입자의 흡수 피크는 NIR 영역에 위치하였다[도 3].
실험예2 : 시간에 따른 금박막 - 철박막 - PLGA 나노입자로부터 메소트렉세이트의 방출 거동
상기 실시예 1의 3)의 메소트렉세이트를 함유한 금박막-철박막-PLGA 나노입자를 3차 증류수에 200 ㎍/ml의 농도로 분산하고, 상기 용액 5 ml를 10,000 Da 분자량의 컷-오프 멤브레인을 구비한 투석 튜브에 로딩하였다. 상기 튜브는 4 ml의 탈염수로 채워진 투명한 바이알에서 위치시켰다. 메소트렉세이트가 방출된 용액에 UV-Vis/NIR 분광계를 이용하여 방출된 메소트렉세이트 양을 측정하였고, 그 결과는 도 4와 같다.
체온과 동일한 37 ℃에서는 나노입자로부터 4주 동안 메소트렉세이트가 천천히 방출됨을 확인하였다. In vivo 실험과 동일하게 NIR을 조사하여 10분간 50 ℃로 온도를 상승한 후, 37 ℃로 체온으로 이동한 경우, 처음 1일 동안 50%의 메소트렉세이트가 나노입자로부터 방출되었고 그 이후는 메소트렉세이트가 천천히 방출을 알 수 있었다.
실험예 3: 나노입자의 류마티스 관절염 조직에 축적 효과 평가
1) 류마티스 관절염 마우스 모델
자가면역질환 중 하나인 류마티스 관절염 동물 모델은 DBA1/J 마우스에 Type II 콜라겐에 0.01 mol/L의 아세트산과 complete Freund's adjuvant를 혼합한 후 200 ㎍을 마우스 꼬리 근육에 피하 주사하고 21일 후 동량을 주입하여 관절염을 유도하였다.
2) 나노입자의 류마티스 관절염 조직에 타겟 효과 평가
상기 실시예 1의 3)에서 제조한 메소트렉세이트를 함유한 금박막-철박막-PLGA 나노입자 200 ㎍이 식염수에 분산된 나노입자 용액 200 ㎕을 상기 1)의 류마티스 관절염 마우스에 정맥 주사 후, 12시간, 24시간, 48 시간 및 72 시간 후에 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상(GE Health Care, eXplore Optix, Pre-clinical Optical Imaging System)을 얻었다. 본 실험에 사용된 마우스는 왼쪽 발에는 류마티스 관절염이 발현이 되었고, 오른쪽 발에는 류마티스 관절염이 발현되지 않았다.
도 5에 의하면 염증이 심하게 일어난 류마티스 관절염이 발현된 오른쪽 발에는 나노입자의 흡수가 증가하여 파란색과 보라색으로 변함을 확인할 수 있었다. 하지만, 염증이 일어나지 않은 류마티스 관절염이 발현되지 않은 왼쪽 발에는 나노입자의 흡수가 거의 일어나지 않아 붉은색과 노란색 계통의 흡수 강도를 보여주었다.
3) 나노입자의 류마티스 관절염 조직에 축적 효과 평가
상기 실시예 1의 3)에서 제조한 메소트렉세이트를 함유한 금박막- 철박막-PLGA 나노입자 200 ㎍ 이 식염수(saline)에 분산된 나노입자 용액 200 ㎕를 상기 실험예 4-1의 류마티스 관절염 마우스에 정맥 주사 및 관절염 관절에 직접 주사한 후, 6시간, 12시간, 24시간, 48 시간 및 72 시간 후에 류마티스 관절염 조직의 근적외선 흡수 영상(GE Health Care, eXplore Optix, Pre-clinical Optical Imaging System)을 얻었다[도 6].
류마티스 관절염이 발현된 마우스의 발에서 시간에 따라 염증이 발현된 관절 부분에 나노입자의 흡수가 증가하여 붉은 색 계통에서 파란색과 보라색으로 변하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 류마티스 관절염 조직에 나노입자가 축적됨을 알 수 있다.
또한, 관절염 부위에서는 약물이 빠르게 빠져나가는 것에 비해서, 정맥 투여뿐만 아니라 관절 내 투여 경우에도 72시간 동안 오랫동안 염증이 발현된 관절염 부위에 오랫동안 머물러있다는 것을 알 수 있다.
실험예 4: 나노입자를 이용한 류마티스 관절염의 치료 효능 평가
상기 실험예 3의 1)에서와 같은 DAB1/J 마우스에 Type II 콜라겐을 꼬리 근육에 주사하여 관절염을 유도하였으며, 마우스를 하기 표 1과 같이 여섯 개의 군으로 분류한다.
류마티스 관절염 치료 평가 분류군
시료 약물 농도
(mg/kg)
그룹 1 식염수
그룹 2 메토트렉세이트 35
그룹 3 금박막-철박막-PLGA 나노입자
그룹 4 메토트렉세이트를 담지한 PLGA 나노입자 0.3
그룹 5 메토트렉세이트를 담지한 철박막-PLGA 나노입자 0.2
그룹 6 메토트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자 0.2
그룹 7 메토트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자 + 근적외선 조사 (10분) 0.2
그룹 1은 류마티스 관절염 마우스에 식염수 200 ㎕을 투여, 그룹 2는 류마티스 관절염 치료제인 메토트렉세이트 용액을 35 mg/kg 투여량으로 200 ㎕씩 주 1회 4주 동안 투여한 그룹, 그룹 3은 금박막-철박막-PLGA 나노입자 200 ㎍이 분산된 용액 200 ㎕을 투여한 그룹, 그룹 4는 메토트렉세이트를 담지한 PLGA 나노입자 200 ㎍이 분산된 용액 200 ㎕을 투여한 그룹, 그룹 5는 메토트렉세이트를 담지한 철박막-PLGA 나노입자를 200 ㎍이 분산된 용액 200 ㎕을 투여한 그룹, 그룹 6는 메토트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자를 200 ㎍ 이 분산된 용액 200 ㎕을 투여한 그룹, 그룹 7은 메토트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자를 200 ㎍이 분산된 용액 200 ㎕을 투여한 후, 24시간 후 근적외선 레이저(1.96 W/cm2)를 10분 동안 조사한 그룹이다.
1) 나노입자를 이용한 류마티스 관절염의 치료 효능 - 증상 평가
류마티스 관절염 마우스의 증상으로는 붉어짐, 부풀기 등이 있다. 관절염 징후를 Mann-Chitney U test의 기준에 따라 발병율(incidence, %)을 결정하고 1주일에 2회씩 4주간 기록하였다. 각 마우스의 네 발을 육안으로 관찰하여 부풀어 오른 정도를 다음의 기준에 따라 류마티스 관절염 유발 정도(arthritic score, 표2)를 부여하였다. 동물 당 부여된 score의 최소값은 0이고, 최대값은 16이 되도록 하였다.
류마티스 관절염 유발 평가표
단계 유발 정도
0 부풀기 없음, 정상적인 상태
1 경미한 부풀기
2 중간 이하의 부종
3 두드러진 부종
4 심각한 부종
각 군 당 5마리의 4발의 류마티스 관절염 단계를 합산하여 평균을 낸 후 그래프로 나타내었다(도 7). 식염수를 주입한 그룹 1은 발가락 및 발 전체가 부풀고 붉어짐이 관찰되었다.
도 8은 4주간의 치료 후, 각 치료군의 동물들의 사진이다. 1주일에 한 번씩 35 mg/kg의 투여량으로 메토트렉세이트을 4번 주입한 그룹 2는 현저히 발가락과 발 전체의 부풀고 붉어짐이 감소하였다. 메토트렉세이트를 담지하지 않은 금박막-철박막-PLGA 나노입자를 주입한 그룹 3은 그룹 1과 유사한 발가락 및 발 전체가 부풀고 붉어졌다. 메토트렉세이트를 담지한 PLGA 나노입자를 주입한 그룹 4, 메토트렉세이트를 담지한 철박막-PLGA 나노입자를 주입한 그룹 5, 메토트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자를 주입한 그룹 6, 메토트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자를 주입한 후 근적외선을 조사한 그룹 7 모두 관절과 발바닥 부위의 부기가 대조군에 비해 상대적으로 적은 것을 알 수 있었다.
특히, 그룹 7은 메소트렉세이트 용액을 투여한 그룹 2와 비교해 부기발생 정도가 경미함을 관절할 수 있었다. 이를 통해 근적외선 조사를 통한 관절염 부위에 온도 상승을 유도해준 그룹 7과 온도 상승을 하지 않은 그룹 6과의 치료 효과 비교를 통해서 금박막에 의한 온도 상승이 다기능성 나노입자를 이용한 류마티스 관절염 치료에 꼭 필요한 요건임을 알 수 있었다.
2) 나노입자를 이용한 류마티스 관절염의 치료 효능 - 영상학적 평가( micro CT 영상)
도 9의 마이크로 CT 영상에 의하면 나노입자를 이용해서 치료하지 않은 그룹의 마우스(그룹 1)의 관절은 많이 손상된 것을 확인할 수 있었다. 하지만 나노입자와 근적외선 레이져 조사를 함께 해준 마우스(그룹 7)의 관절은 메소트렉세이트 용액을 주입한 마우스(그룹 2)와 동일하게 관절의 손상을 입지 않은 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 류마티스 관절염 치료에서의 나노입자 금박막의 역할 평가
상기 실험예 4의 1)의 결과에서 메소트렉세이트를 담지한 철박막-PLGA 나노입자를 주입한 그룹 5보다 금박막이 나노입자에 있는 메소트렉세이트를 담지한 금박막-철박막-PLGA 나노입자를 주입한 그룹 6이 더욱 우수한 치료 효과를 보여주었다.
이를 규명하기 위해 금박막-철박막-PLGA 나노입자와 철박막-PLGA 나노입자를 준비하여 혈관내피세포증식인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 1시간 동안 반응시킨 후, 15000 rpm으로 분리시켰다.
그 후, 가라앉은 나노입자와 용액을 분리시켜 웨스턴 블랏을 시행하여 도 10과 같이 혈관내피세포증식인자가 금박막과 결합하였다는 것을 알 수 있었다.
이로서 금박막이 노출된 나노입자를 이용하면 류마티스 관절염 치료에 도움이 되는 것을 알 수 있었다.
실험예 6: 외부 자기장 및 자성박막 나노입자를 이용한 류마티스 관절염 부위의 표적지향성 및 관절염 내 축적 시간 측정
상기 실험예 3의 1)에서와 같은 DAB1/J 마우스에 Type II 콜라겐을 꼬리 근육에 주사하여 관절염을 유도하였으며, 도 11과 같이 류마티스 관절염이 발현된 다리 한쪽에 자석을 부착해두었다.
상기 실시예 1의 2)의 나노입자인 금박막-철박막-PLGA 나노입자 200 ㎍을 정맥 주사한 후, 24시간 후 관절 내의 금 농도를 ICP-MS로 측정하였다.
또한, 외부 자기장에 의해 류마티스 관절염 내로 표적 지향된 나노입자가 빠르게 빠져나가지 않고 오랜 시간 머물러 있음을 확인하기 위해, 72시간 후 관절 내의 금 농도를 ICP-MP로 측정하였다.
하기 표 3에 ICP-MS로 측정된 금 나노입자의 농도를 나타내었다. 외부자기장의 영향이 미치는 관절 쪽으로 나노입자가 2배 정도 더 많이 표적지향성을 가지고 또한 72시간이 지난 후, 7.8배의 더 많은 양이 류마티스 관절염이 유발된 관절 내에 나노입자가 머물러 있었다.
외부 자기장에 의한 나노입자의 류마티스 관절염 표적 지향성 및 관절염 내 시간에 따른 축적양 측정
구분 외부 자기장 적용 없음 외부 자기장 적용 있음
금 농도
(ug)		 나노입자농도 (%) 금 농도
(ug)		 나노입자농도 (%)
24 시간 1.7259 4.99 3.91 11.31
72시간 0.1567 0.45 1.21 3.51
실험예 7: 근적외선 레이져와 금박막 - 철박막 -나노입자를 이용한 비침습적 방법에 의한 활막제거술
상기 실험예 3의 1)에서와 같은 DAB1/J 마우스에 Type II 콜라겐을 꼬리 근육에 주사하여 관절염을 유도하는 경우, 류마티스 관절염이 심하게 발현된 경우 발가락이 잘려나가고, 심지어 다리를 제대로 사용하지 못하는 경우도 있다. 이런 경우, 염증이 너무 심한 활막을 외과적인 수술을 통해 제거해 주기도 하는데, 본 실험예에서는 비침습적 방법으로 금박막-철박막-PLGA 나노입자와 근적외선 레이저 조사를 통하여 활막을 제거할 수 있음을 보였다.
류마티스 관절염이 심하게 유발되어 있는 마우스의 발에 직접 금박막-철박막-PLGA 나노입자 50 ㎕(1 mg/ml)을 주입한 후, 근적외선 레이저를 2.56 W/cm2의 강도로 10분간 조사하였다. 2주 후, 관절 부분의 조직을 헤마톡 실린 염색(Hematoxylin and Eosin staining)하여 활막의 염증 제거를 확인하였다[도 12].

Claims (13)

  1. 항류마티스 약물을 포함하는 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA) 나노입자;
    상기 PLGA 나노입자의 전체 표면 중 30 내지 70%에 부분 증착된 자성물질 박막; 및
    상기 자성물질 박막 상에 증착하되, PLGA 나노입자의 전체 표면 중 40 내지 60%에 부분 증착된 금 박막
    을 포함하는 다기능성 나노입자를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항류마티스 약물은 메토트렉세이트(methotrexate, MTX), 설파살라진(sulfasalazine, SSZ), 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine, HCQ), 레플루노마이드(leflunomide), 부실라민(bucillamine), 금 주사제(injectable gold), 싸이클로스포린(cyclosporin), 타클로리무스(taclorimus), 에타네르셉(Etanercept, Enbrel®), 인플릭시맵(infliximab, Remicade®), 아달리무맵(adalimumab, Humira®), 리툭시맵(Rituximab, MabThera®), 아바타셉(Abatacept, Orencia®) 및 글루코코르티코이드(glucocorticoid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 류마티스 관절염 치료용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성물질은 Co, Mn, Fe, Ni 및 Gd로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 류마티스 관절염 치료용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 금 박막은 금, 백금, 또는 이의 합금인 류마티스 관절염 치료용 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)로 항류마티스 약물을 봉입시켜 PLGA 나노입자를 제조하는 단계;
    상기 PLGA 나노입자의 표면 상에 PLGA 나노입자의 전체 표면 중 30 내지 70%를 자성물질 박막으로 증착시키는 단계; 및
    상기 자성물질 박막 표면 상에 PLGA 나노입자의 전체 표면 중 40 내지 60%를 금 박막으로 증착시키는 단계;
    를 포함하는 다기능성 나노입자 함유 류마티스 관절염 치료용 조성물의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 자성물질 박막 또는 금 박막으로 증착시키는 단계는
    유리 또는 실리콘 기판 상에 상기 PLGA 나노입자를 균일하게 분포하고, 박막 증착기로 PLGA 나노입자에 자성 물질 박막 또는 금 박막을 증착시키는 다기능성 나노입자 함유 류마티스 관절염 치료용 조성물의 제조방법.
  13. 제 1 항의 류마티스 관절염 치료용 조성물을 사람을 제외한 검체에 주입하는 단계;
    외부 자기장을 통해 표적 부위에 다기능성 나노입자를 집중시키는 단계; 및
    표적 부위에 근적외선 조사하는 단계
    를 포함하는 류마티스 관절염 치료방법.
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