CN102711810A - 效应子功能已消除的抗体Fc区突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了Fc区发生变化的抗体和其他含Fc的分子，所述抗体和含Fc的分子降低了自身与Fcγ受体的结合及最终活性，并且可用于治疗各种疾病和障碍。

Description

效应子功能已消除的抗体Fc区突变体
背景技术
技术领域
本发明涉及突变的人源性抗体IgG2恒定区(Fc区)，由于突变而使其基本上失去通过Fc受体介导的表面靶抗原的交联作用来特异性结合Fcγ受体或激活免疫细胞的促有丝分裂反应的能力。本发明还提供了可复合突变的lgG2恒定区的新型抗体。
关于本领域的讨论
靶向细胞表面抗原的抗体可对免疫细胞诱发不必要的免疫刺激以及与Fc受体(FcR)结合相关的效应子功能及补体活化。由于治疗性抗体和Fc融合构建体往往需要靶向和活化或中和靶配体功能区，但又不能破坏或损害所需的局部细胞或组织，因此一直在寻求效应子功能已消除的Fc突变体。
人IgG同种型(成熟的γ球蛋白类G抗体的亚类；IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)显示具有不同的能力来发挥免疫功能，例如抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，以及补体依赖细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。此类免疫功能的同种型特异性结合是基于对不同免疫细胞上Fc受体的选择性以及结合C1q和活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力。在各种同种型中，Fcγ受体(例如FcγRI、FcγRIIa/b/c、FcγRIIIa/b)对IgG1和IgG3的相对亲和力较高，然而对IgG2的亲和力最低(仅限于FcγRIIa 131H多态性)，IgG4只对FcγRI具有可测量的亲和力。利用序列比较分析和共结晶结构，目前已将用于受体结合的关键接触残基定位到跨越下铰链区和CH2区的氨基酸残基。自采用标准蛋白工程技术后，已在一定程度上成功增加或降低抗体制品对Fc受体和补体的C1q成分的亲和力。
在这些同种型中，IgG2与Fc受体家族的结合能力最弱。以IgG2作为起点，已试图研发出效应子功能削弱但仍保留FcRn结合能力、长期稳定性和低免疫原性的突变原。这种特性的改良型突变体不仅能提高抗体药物疗效，而且还能确保安全性。
发明内容
本发明提供了经过修饰、糖基化的免疫球蛋白恒定域的组合物，其可用于工程化改造抗体或抗体类治疗剂，例如包含Fc区并且靶向细胞表面配体的抗体或抗体类治疗剂。本发明的组合物为IgG2Fc突变体，所述突变体显示其Fcγ结合能力已削弱但仍保留FcRn结合。这些lgG Fc突变体可使治疗剂靶向可溶性抗原或细胞表面抗原，同时最大限度降低产生免疫效应子功能的Fc相关结合以及补体介导的细胞毒性。在一个方面，IgG2Fc突变体包含V234A、G237A、P238S(以EU编号系统为依据)。在另一方面，IgG2Fc突变体包含V234A、G237A、H268Q或H268A、V309L、A330S、P331S(以EU编号系统为依据)。在某一特定方面，IgG2Fc突变体包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S，以及任选的P233S(以EU编号系统为依据)。
在一个实施例中，IgG2Fc突变体组合物用于指示哪个位点通过与FcRn相互作用可保持治疗性抗体(或Fc融合物)的半衰期保持，同时最大限度降低或消除与免疫和效应子功能相关的Fcγ活化所产生的潜在毒性，例如i)抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)，ii)补体依赖细胞毒性(CDC)，iii)抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)，iv)FcR介导的细胞活化(例如通过FcR交联作用的细胞因子释放)，以及v)FcR介导的血小板活化/减少。在一个方面，将IgG2Fc突变引入到治疗性抗体或结合物(例如多价结合物)的Fc融合物内，从而使配体靶向涉及神经障碍的细胞(例如基底细胞神经节)；涉及免疫系统紊乱的细胞(例如与B细胞或T细胞活化相关的细胞)，或靶向涉及组织修复或愈合的细胞(例如成纤维细胞或干细胞)。
在另一个实施例中，IgG2Fc突变体构成药物组合物。在另一个实施例中，IgG2Fc突变体构成药物活性分子的一部分。包含IgG2Fc突变体的药物组合物或包含活性IgG2Fc突变体的分子可用于治疗通过巨噬细胞或单核细胞的迁移和浓度来表征的疾病。在一个方面，包含IgG2Fc突变体的分子可用于结合下列组织内的靶标：神经组织、内分泌组织、血管组织、心肌组织、滑膜组织、皮肤组织或粘膜组织。本发明IgG2Fc突变体的众多用途之一是治疗移植物抗宿主疾病；宿主抗移植物疾病；器官移植排斥；骨髓移植排斥；自身免疫，例如血管炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症和关节炎；同种异体免疫，例如胎儿/新生儿同种异体免疫血小板减少症；哮喘和过敏症；慢性或急性炎性疾病，例如克罗恩病或硬皮病；阿尔茨海默病、冠状动脉血管闭塞。
附图说明
图1示出了野生型人IgG2(SEQ ID NO：1)、IgG4(SEQ ID NO：2)和IgG1(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列比对图，其中显示了各个残基对应的EU编号；IgG2的铰链区从EU第218位残基开始。
图2示出了Fc片段的结构，其中示出了已修饰残基的表面位置(EU编号)。
图3A-C中的坐标图示出了构建为抗Her2/neu结合抗体的各个同种型和突变体与人IgG1野生型同种型抗体的竞争结果(采用AlphaScreen微珠测定平台)：FcgRI(未示出)、FcgRIIa(A)、FcgRIIb(B)、FcgRIIIa(未示出)和FcRn(C)。
图4A-C中的坐标图示出了构建为抗Her2/neu结合抗体的各个同种型和突变体的直接结合(采用AlphaScreen微珠测定平台)：FcgRIIIa(A)、FcgRI(B)和FcgRIIa(C)。
图5示出了ADCC测定结果和构造为抗Her2/neu结合抗体的所选同种型和突变体，并且使用人PBMC(25倍过量的)和SK-Br3乳腺癌细胞作为靶标。
图6示出了所选抗CD20构建体的CDC测定结果，使用人补体和WIL2-S淋巴瘤细胞作为靶标。
图7示出了使用Sk-Br3靶细胞和GM-CSF分化巨噬细胞对所选抗Her2/neu构建体进行流式细胞术分析所得出的ADCP测定结果。
图8中的坐标图示出了使用微珠刺激PBMC后24小时内细胞因子(TNFα)的释放情况，所述微珠结合了不同构建体的IgG同种型，包括IgG2野生型和六个突变体。
图9中的坐标图是注射了抗CD20结合域抗体构建体的食蟹猴组中随时间变化所含有的平均循环B细胞数量，所述抗体构建体具有不同的Fc区或缺失Fc区(Fab′)2。
序列表简述
Figure BPA00001563865400041
具体实施方式
缩写
ADCC＝抗体依赖细胞介导的细胞毒性；ADCP，抗体依赖细胞吞噬作用；CDC＝补体依赖细胞毒性；IgG＝免疫球蛋白G；ITAM＝免疫受体酪氨酸活化基序；ITIM＝免疫受体酪氨酸抑制基序；Mab＝单克隆抗体；FDCR＝Fc依赖细胞因子释放；FcγR、FcgR或FcgammaR＝Fcγ受体
定义&术语解释
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(即ADCC)是一种细胞毒性形式，其中，所分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使这些细胞毒性效应细胞特异性结合到抗原附着的靶细胞上，然后借助细胞毒素将靶细胞杀死。指向靶细胞表面的配体特异高亲和性IgG抗体可刺激细胞毒性细胞，是完成此类毒杀作用所必需的。靶细胞的溶解过程发生于细胞外，其需要细胞与细胞的直接接触，此过程不需要补体。
可对任何具体抗体通过ADCC方式介导靶细胞溶解的能力进行检测。要检测ADCC的活性，将所关注的抗体加入到展示靶配体的靶细胞内，使靶配体与免疫效应子细胞结合，所述免疫效应细胞可由抗原抗体复合物激活，从而使靶细胞发生细胞溶解。通常根据从溶解细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞溶解。可用于此类检测的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。体外ADCC检测的具体例子在如下文献中有所描述：Wisecarver et al，1985，19：211(Wisecarver等人，1985年，第19卷，第211页)；Bruggemann etal，1987，J Exp Med 166：1351(Bruggemann等人，1987年，《实验医学杂志》，第166卷，第1351页)；Wilkinson et al，2001，J Immunol Methods258：183(Wilkinson等人，2001年，《免疫法杂志》，第258卷，第183页)；Patel et al，1995 J Immunol Methods 184：29(Patel等人，1995年，《免疫法杂志》，第184卷，第29页)(每个文献均以引用方式并入)。作为另外一种选择或除此之外，可在体内评估所关注的抗体的ADCC活性，例如在动物模型内，例如Clynes等人、1998，PNAS USA 95：652中所公开的，该文献内容全文以引用方式并入本文。
“补体引导的细胞毒性”或CDC是指通过使补体成分C1q与抗体Fc结合来激活补体级联的细胞毒性形式。
本文所用的术语“Fc”、“含Fc的蛋白质”或“含Fc的分子”是指具有至少一个免疫球蛋白CH2和CH3域的单体、二聚体或异二聚体蛋白质。CH2和CH3域可以形成蛋白质/分子(例如抗体)的二聚体区域的至少一部分。
本文所用的术语“单克隆抗体”是特定形式的含Fc的蛋白，所述蛋白包含至少一个配体结合域，所述结合域保持与至少一种动物抗体的至少一个重链或轻链抗体可变域的实质同源性。
“野生型人IgG2Fc区”是指包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段的人IgG Fc区，所述区域从人IgG重链的残基K218至残基K447(以Kabat EU编号为依据)。通过与人IgG1抗体EU IgG1(SEQ ID NO：3)比对来对恒定区的氨基酸编号(参见Cunningham et al.，1970 J.Biol.Chem.，9：3161-70(Cunningham等人，1970年，《生物化学杂志》，第9卷，第3161-3170页))。也就是说，将抗体的重链和轻链与EU的重链和轻链进行排列，以达到最大的氨基酸序列同一性，然后给抗体的各个氨基酸分配与EU中对应的氨基酸相同的编号。本领域习惯上使用EU编号系统(通常参见Kabat et al，Sequences of Protein of Immunological Interest，NIH PublicationNo.91-3242，US Department of Health and Human Services(1991)(Kabat等人，《具有免疫学重要性的蛋白序列》，NIH出版物No.91-3242，美国卫生与公共服务部，1991年))。根据该约定，所述的“野生型IgG2”恒定区在第236位上缺少氨基酸(图1，SEQ ID NO：1)。
概述
本发明的目的在于鉴定出Fc域以用于生产治疗性抗体、Fc融合物和类似生物药品，使其不引发细胞因子的释放或破坏或杀死展示靶配体的细胞和靶细胞周围的组织，由此提高安全性。
人IgG4同种型抗体和Fc融合蛋白不会引发显著的ADCC(经由NK细胞进行，专门表达FcgRIIIa)，但保留通过巨噬细胞(表达FcγI、IIa和IIIa)诱发吞噬作用(ADCP)的能力，并且当形成免疫复合物时，由于特异免疫细胞上活化Fcγ的分布而可能激活单核细胞。为了尽可能降低残基活性，因此在野生型IgG4Fc(SEQ ID NO：2)中开发和使用了包含V234A、L235A(ala/ala)的突变体。
Armour等人在lgG2中进行多点突变，目的在于最大限度降低与FcgRI(Armour等人，1999年)和FcgRIIa及IIIa(Armour等人，2003年)的结合能力。Mueller等人的专利申请(PCTWO97/11971)中公开的附加突变衍生自IgG2/IgG4的杂交体，其由IgG2CH2和IgG4CH3域组成，具体地讲，本发明的IgG2突变体中残基330和331来自IgG4。同时还采用抑制或沉默作用来消除免疫刺激作用。IgG2或IgG4或这两个亚型之间交换的域用于在IgG1(SEQ ID NO：3)中生产效应子功能最弱的mAb(Tao等人，1991年)。Strohl的专利申请(US2007/0148167)公开了IgG2第268、309、330和331EU位残基上的四个突变。Shields等人(2001)公开了附加的取代，即H268A。
本发明首次展示了IgG4残基在IgG2恒定区(Fc)的多个位点的取代，即H268Q或A、V309L、A330S和P331S(以Kabat/EU编号系统为依据)。通过对多个残基取代的定向选择出乎意料获得了在抗体工程中用作融合多肽的功能性Fc域，同时还可提供缺乏可测量的效应子功能的治疗性实体。
根据其对人FcR(FcγI、FcγIIa、FcγIIb、FcγIIIa和FcRn)的相对亲和力来选择多点取代IgG2突变体，所述亲和力是通过Alpha Screen竞争性测定和SPR/Biacore分析进行评估。再进一步在适当的细胞系统内测试这些突变体在诱发CDC、ADCC和ADCP以及引发PBMC分泌TNF-α方面的能力并进行评级。在本文提供的实验数据集中，将IgG2突变体与已知的制剂或突变体进行比较，所述制剂或突变体包括：除了野生型IgG1和IgG2外，还有IgG1ag和IgG4Ala/Ala。采用多次体外生物测定对这些突变体进一步分析，结果表明，其活性低至无法检测，对FcR的结合亲和力大大减弱。根据这些筛选结果，已鉴定出一种指定为IgG2c4d的IgG2Fc突变体，其在上述各种效应子/免疫刺激生物测定中对FcR(单体与双多聚体配体结合)没有可测的亲和力或亲合力，并且缺乏活性。IgG2c4d Fc包含丙氨酸、丝氨酸和亮氨酸取代：V234A、G237A、P238S、H28A、V309L、A330S、P331S(EU编号)。这七个残基取代的IgG2即IgG2c4d可被视为第一个真正的“沉默”Fc，因为其无法结合FcR、介导效应子功能或参与Fc介导的细胞因子释放。
根据当前的发现，可应用lgG2c4d的七个突变亚群或将其与其他氨基酸突变体结合，或可对另一lgG同种型进行此类突变以获得类似或可选择性的效应子功能沉默(如本文所述)并与本领域已知的突变体结合。
正如本文所特别例证的，三联体V234A、G237A、P238S取代降低了FcγRIIa结合亲和力和FcγRIIa结合亲合力并消除了ADCP和Fc依赖性细胞因子释放，同时保留该分子的FcRn结合亲和力。
表1.Biacore相对结合亲和力的汇总表。
Figure BPA00001563865400081
表2.相对亲合力汇总表。
 同种型/变体 FcγRI亲合力 FcγRIIa亲合力  FcγRIIIa亲合力
 IgG1 +++++ ++++  +++
 IgG1非糖基化形式(N297A) +++ -  -
 IgG4S＞P，ala/ala +++ ++  -
 IgG2 - +++  -
 IgG2m4 - +++  -
 IgG2c4d - -  -
表3.效应子功能和细胞因子释放(CR)的汇总表。
  同种型/变体   ADCC   ADCP   CDC   细胞因子释放
  IgG1   +++++   +++++   +++++   +++++
  IgG1非糖基化形式(N297A)   -   +++   -   ++
  IgG4S＞P，ala/ala   -   ++   -   ++
  IgG2   -   ++   -   +++
  IgG2m4   -   ++   -   ++
  IgG2c4d   -   -   -   -
制备含已改造的Fc的分子的方法
根据需要选择取代位点，所得组合物不仅具有天然抗体Fc的结构特点，而且还保留FcRn结合能力，具有良好的稳定性，同时削弱了刺激补体级联、细胞溶解、细胞吞噬或细胞因子释放的能力。
由于IgG类抗体为二价，其具有两个完整的Fv域，所述Fv域由功能关联的重链和轻链可变域组成。二价提供亲合力效应以及在相同或不同细胞上交联靶抗原或Fc受体的能力，因此引发由抗体生物活性驱动的一系列非靶特异性受体结合。为此，在“亲合力环境”内测试本发明的Fc突变体，意味着IgG的Fc突变体在表面上发生多聚化，进而测试与特定Fc受体的多聚体的相互作用。
突变体的生物学表征
可通过若干个熟知的体外测定法来比较含Fc的蛋白质的功能性。具体地说，所关注的是Fcγ受体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII家族的成员的亲和力。可利用重组可溶形式的受体或细胞结合形式的受体进行这些测量。此外，例如可使用采用重组可溶性FcRn的配体结合微珠格式的“ALPHASCREEN”对FcRn(FcRn是负责延长IgG的循环半衰期的受体)亲和力进行测量。用于高通量筛选的ALPHASCREEN是均相测定技术，可检测诸如结合等分子事件。包被的“供体”和“受体”微珠是该测定技术的基础。正如基于微珠的测定，ALPHASCREEN通过邻近微珠的相互作用进行操作，从而引发化学级联反应，使信号显著放大。可应用直接或间接(例如竞争性结合)测量来评估两种和多种蛋白质之间的相对亲和力和亲合力。
人IgG同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)经过自然进化后，各个同种型在发挥诸如以下免疫功能方面表现出不同的能力谱：抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，以及补体依赖细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。此类功能的同种型特异结合是基于不同免疫细胞表面上的Fc受体的不同选择性，以及结合C1q和活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力，此能力可通过特定受体与效应子吞噬细胞上的补体成分结合来引发CDC和CDP(补体依赖吞噬作用)。尽管已有充分证据证明微生物感染中由IgG2和IgG4进行的补体活化，但结合人同种型的补体级联的初始成分C1q的能力层级为IgG1＞IgG3＞IgG2＞IgG4。
利用基于细胞的功能性分析(例如ADCC和CDC)可深入了解特定变体结构的可能的功能结果。抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞介导的反应，在这个反应过程中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后将靶细胞溶解。在一个实施例中，ADCC测定被配置成将NK细胞作为主要效应细胞，对FcγRIIIA(已知这些细胞表达的唯一Fcγ型受体)发挥功能效应。
吞噬作用测定法也可用于比较不同突变体的免疫效应子功能，而测量细胞应答(例如过氧化物或炎性介质释放)的测定法也可用于进行比较。经验证，体内模型对Fc变体的研究很有用。例如，正如使用抗CD3抗体的突变体测量小鼠中T细胞活化的实验所示，该活性依赖于接合特定配体(例如Fcγ受体)的Fc域。抗体引导的巨噬细胞活化介导抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)，导致所调理的靶细胞被巨噬细胞吞噬和消化。可在体外利用IFNγ或GM-CSF将高水平表达FcR的分化型巨噬细胞分化为M1表型，以使其所有FcR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)表达水平相比单核细胞都高。此类测定为抗体工程领域的技术人员所熟知。
抗体制备方法
采用常规重组过程在人IgG2恒定域作为产生和测试Fc突变体起点的序列内进行定向突变。本领域技术人员应该理解，可使用各种更改编码序列的技术来构建载体，所述载体适用于各种待修复和测试的宿主细胞表达所需的氨基酸序列。
宿主细胞选择或宿主细胞工程改造
如本文所述，选择用于表达重组的含Fc的蛋白质或单克隆抗体的宿主细胞对最终组成至关重要，包括但不限于免疫球蛋白CH2域中装饰蛋白质的低聚糖部分的组成的变化。因此，本发明的一个方面涉及选择适当的宿主细胞，用于使用和/或开发表达所需治疗性蛋白质的生产细胞。
此外，宿主细胞可来源于哺乳动物，或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、海拉细胞、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生的、永生的或转化的细胞。
作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，例如天然或已工程化改造的大肠杆菌属(E.colispp.)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella spp.)或假单胞菌属(Pseudomonas spp.)。
抗体
本专利申请所描述的抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类、山羊或它们的任何组合，并且包括分离的人、灵长类、啮齿动物、哺乳动物、嵌合、人源化和/或CDR-移植抗体、免疫球蛋白、切割产物和其他指定部分和它们的变体。
通过本领域所熟知的若干方法可衍生本文描述的抗体、含Fc的蛋白质或Fc片段。在一个方面，从利用目标肽、细胞或组织提取物对小鼠或其他动物进行免疫而制得的杂交瘤中便利地获得抗体。因此可使用本领域熟知的任何杂种瘤技术来获取此抗体，参见例如Harlow and Lane，antibodies，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)(Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，Cold Spring Harbor，NY，1989年)，所述文献全文以引用的方式并入本文。
所述抗体或Fc融合蛋白或它们的组分和域也可通过从此类域或组分的库(例如噬菌体库)中选择来获得。可通过插入随机寡核苷酸的库或含所关注序列的多核苷酸的库来构建噬菌体库，如来自免疫的动物或人的B细胞(Smith，G.P.1985.Science 228：1315-1317(Smith G.P.，1985年，《科学》，第228卷，第1315-1317页))。抗体噬菌体库在一个噬菌体中含有重链(H)和轻链(L)可变区对，从而可表达单链Fv片段或Fab片段(Hoogenboom、等人，2000，Immunol.Today 21(8)371-8(Hoogenboom等人，2000年，《今日免疫学》，第21卷，第8期，第371-378页))。可操纵噬菌粒库的多样性来增加和/或改变该库中单克隆抗体的免疫特异性，以生产和随后鉴定另外的期望的人单克隆抗体。例如，可将重链(H)和轻链(L)免疫球蛋白分子编码基因随机混合(改组)，以在装配的免疫球蛋分子中产生新的HL对。另外，可在免疫球蛋白多肽可变区的互补决定区(CDR)中对重链和轻链编码基因中的一条和两条进行诱变，随后进行筛选以获得期望的亲和力和中和能力。还可如下以合成法产生抗体库：选择一个或多个人骨架序列，并引入源自人抗体谱(repertoires)的CDR基因盒的集合或通过所设计的变型(Kretzschmar and von Ruden 2000，Current Opinion inBiotechnology，13：598-602(Kretzschmar和von Ruden，2000年，《生物技术新见》，第13卷，第598-602页))。多样性的位置不限于CDR，而是还可包括可变区的骨架区段或可包括除抗体可变区之外的区段，例如肽。
其他可包括除抗体可变区之外的区段的靶结合组分的库为核糖体展示、酵母展示和细菌展示。核糖体展示是一种将mRNA翻译为它们的同源蛋白质的同时保持蛋白质附接到RNA的方法。通过RT-PCR回收核酸编码序列(Mattheakis，L.C.et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，9022(Mattheakis，L.C.等人，1994年，《美国科学院院刊》，第91卷，第9022页))。酵母展示是基于膜相关-凝集素酵母粘着受体aga1和aga2的融合蛋白的构建，是杂交型系统的一部分(Broder、等人，1997.NatureBiotechnology，15：553-7(Broder等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第553-557页))。细菌展示是基于靶标与输出的与细胞膜或细胞壁缔合的细菌蛋白的融合(Chen and Georgiou 2002.Biotechnol Bioeng，79：496-503(Chen和Georgiou，2002年，《生物技术与生物工程》，第79卷，第496-503页))。
相比杂交瘤技术，噬菌体和其他抗体展示方法可操纵在体外对抗原靶标的选择，没有宿主可能影响抗原的这一限制，或反之亦然。
本发明还提供编码本发明的组合物的核酸，其作为分离的多核苷酸或作为表达载体的部分，所述表达载体包括与所述组合物或它们的定向诱变剂的原核生物、真核生物或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。
含Fc的分子的用途
通过任何上述方法生产的组合物(抗体、Fc融合物、Fc片段)可用于诊断、治疗、检测或调节人疾病或细胞、组织、器官、体液或通常是宿主的具体病理。正如本文所提出的，通过修饰抗体Fc部分、Fc融合蛋白或Fc片段可降低或消除Fcγ受体的结合以及特定的效应子功能，但抗体仍保留最初的靶向特性，从而使抗体和Fc构建体具有极佳程度的活性、生物物理特性、稳定性和宿主体内存留的能力。
可使用本发明提供的组合物进行治疗的疾病或病理包括但不限于：神经障碍，例如但不限于阿尔茨海默病并包括神经性疼痛；皮肤疾病；代谢性疾病；骨关节炎；以及由烧伤或外伤引起的病症；心血管疾病，包括但不限于心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风和出血；以及一般的免疫介导疾病，包括风湿性疾病、牛皮癣和硬皮病。
虽然已用一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求所保护的范围的限制。
实例1.Fc突变体的构建和测试
使用标准的重组方法来构建衍生自人IgG2抗体的一系列突变构建体(如表4所示)。对于具有完整可变域的抗体，可使用抗HER2和抗CD20抗体的已知CDR序列来构建所示同种型和Fc突变体。使用标准的克隆和表达程序在293T细胞内瞬时表达抗体突变体。使用蛋白质A色谱柱将MAb纯化至同质性大于95％，然后再进一步进行实验分析。
表4
Figure BPA00001563865400131
亲和力的Biacore研究
使用Biacore 3000光学生物传感器(Biacore AB(Uppsala，Sweden)；目前是GE Healthcare的分部)进行表面等离子共振实验。在25℃下，使用含有3mM EDTA和0.01％表面活性剂P20的D-PBS缓冲液来进行实验。要分析受体与Fc突变体的相互作用，将小鼠抗His IgG(R&D systems产品目录号MAB050)共价耦联至CM-5传感芯片来产生捕获表面。根据用于氨基偶联化学过程的制造商说明书将抗His Ab稀释至10mM乙酸钠缓冲液pH 4.5(Biacore AB)并将其耦联至CM-5芯片的羧甲基葡聚糖表面(约3000RU)。使用乙醇胺盐酸盐来钝化表面上的剩余反应基团。要开展动力学实验，则分别在此表面上捕获165、351和208个响应单元(RU)的FcγRI、FcγRII和FcγRIII。捕获受体后，以30μL/min的速度注入系列稀释度的野生型或Fc突变体(通过四倍稀释步骤从4000nM稀释至3.9nM)。监测缔合相3分钟。然后流入缓冲液，时间为20分钟，目的在于监测结合解离。通过以下方式再生捕获表面：使用9秒脉冲的100mM磷酸以100μL/min的速度流入，然后注入电泳缓冲液。
使用参考用的Scrubber软件1.1g版(BioLogic Software)对数据进行双参考减法，以校正缓冲液对信号和仪器噪音的作用(Myszka 1999)。完成初始数据处理之后，使用BIA评价软件4.0.1版(Biacore，AB)(假设为简单的1:1结合模型)来对数据进行动力学分析。AlphaScreen与结合研究
使用均质的基于微珠的结合分析(AlphaScreenTM(PerkinElmer，Waltham，MA))来评估IgG的竞争性以及定向结合不同FcγR的能力。简言之，按照经过细微修改的之前描述方法(Lazar et al 2006 Proc Natl Acad Sci U S A103(11)：4005-10(Lazar等人，2006年，《美国国家科学院院刊》，第103卷第11期，第4005-4010页))进行实验。FcγRI、IIa购自R&D systems。对FcγRIIIa和FcRn进行克隆、表达和纯化。针对生物素酰化CNT06234(非特异性对照物人IgG1亚类抗体)或使用生物素标记的NLS(Pierce)以2∶1比率生物素酰化的抗Her2/neu(人IgG2抗体)，测试了IgG Fc突变体的竞争结合性。
在竞争结合性研究中，加入生物素酰化抗体，使其最终测定浓度达到200ng/ml，然后根据各实验图表中指定的最终浓度加入竞争性测试抗体。将FcγR加入96孔板中，使其最终浓度达到200ng/ml，然后依次加入链霉亲和素供体和镍螯合物标记的受体微珠。将微孔板密封并在室温下摇晃后，使用Envision微孔板检测仪来读取微孔板，并在GraphPad Prism中对数据作图和标绘。按照类似于竞争性研究的方法进行亲合力研究，但测试的IgG分子按2∶1的比率进行生物素酰化，并且在不存在与对照抗体竞争的情况下评估定向FcR结合。
结果
通过SPR/Biacore分析评估并从传感图得出的IgG变体对人FcR(FcγI、FcγIIa、FcγIIb和FcγIIIa)的相对亲和力在表5中示出。
表5.关于Fc突变体与Fc受体的相互作用的Biacore数据。
Figure BPA00001563865400141
Figure BPA00001563865400151
这些数字与对一个实验的整体拟合所建立的参数相对应。
对于这4组数据，通过使用简单的1:1结合模型动力学拟合方式进行拟合以得出亲和力。对于所有其他情况，通过使用简单的1:1结合稳态亲和力分析进行拟合以得出亲和力。
使用人IgG1(CNTO6234)进行Alpha ScreenTM竞争性分析所测得的IgG突变体在亲合力环境内对人FcR(FcγIIa、FcγIIb和FcRn)的相对亲和力(也就是说二价抗体与密集靶区结合)分别在图3A-C中示出。
实验数据表明，相比IgG1，IgG2突变体以及IgG1ag和IgG4 Ala/Ala与Fcγ受体的结合亲和力显著下降，同时仍保留与FcRn(赋予了体内半衰期的新生儿Fc受体)的结合能力。具体地讲，在相对IgG2的竞争结合以及与FcgRIIa的结合中，按高到最低的亲和力排列，顺序如下：IgG1＞IgG2c4a＞IgG2m4＞IgG2＝IgGc4c＞IgG2c4b＞IgG4ala/ala＞IgG4非糖基化形式＞IgG2c4d。此顺序同样适用于与IgG1(CNTO6234)竞争结合FcgRIIb的能力。在pH 6.4下与IgG1(CNTO6234)竞争结合FcRn的进一步竞争结合分析表明，所有同种型和突变体与FcRn的结合相当。重要的是，结果显示IgG2c4d和IgG1非糖基化形式与FcgRIIa和FcgRIIb具有最低的(如果有的话)可检测结合。
实例2：ADCC和CDC
通过三类途径引发CDC：抗体依赖型(经典途径)、多糖依赖型(凝集素依赖型)以及异源表面结构(替代途径)，所有三个途径均形成蛋白酶解步骤级联，导致膜攻击复合物的装配，最终将靶细胞杀死或进行微生物溶解(参见W.E.Paul Immunology)。使用抗CD20抗体的可变域来制备实例1中描述的同种型和Fc突变体的亚群并评估它们在存在人血清的情况下溶解WIL2-S B细胞淋巴瘤靶细胞的能力。市售的Rituxan
Figure BPA00001563865400152
已知是一种介导WIL2-S细胞CDC功能的治疗性抗CD20抗体，可用作细胞溶解的阳性对照。在CDC分析中，将Wil2-S靶细胞接种于96孔板中，然后将其与人血清补体(6倍稀释)进行温育，并使用AlamarBlue来评估相对细胞活力。
使用抗HER2/neu可变域与实例1中描述的不同IgG同种型或变体的多个Fc域以及作为靶标的SkBr3乳腺癌细胞来进行ADCC测定。如前所述，使用EuTDA细胞溶解检测方法(PerkinElmer，Waltham，MA)进行此项测定。将载有TDA的SkBr3乳腺癌靶细胞接种于U型底的96孔板中，然后使用规定浓度的抗体进行调理，同时在37℃下与从leukopacks分离的25倍过量的PBMC共培养。3小时后，根据制造商说明书对微孔板进行离心并分析上清液的TDA释放量。使用GraphPad Prism对原始数据进行归一化并绘图。在CDC分析中，将Wil2-S靶细胞以50,000/孔的密度接种于96孔板中，然后将其与人血清补体(6倍稀释)进行温育，并使用AlamarBlue来评估相对细胞活力。
结果
无法检测到一系列测试构建体(包括IgG2、IgG2m4、IgG2c4d和e、IgG1非糖基化形式和IgG4ala/ala)的ADCC(此作用主要由NK细胞上的FcgRIIIa参与)(图5)，这符合高亲和力FcgRIIIa(V)受体所显示的弱结合特性以及AlphaScreenTM测定中无亲合力结合的结果(图4A)。本研究采用高密度靶标，例如乳腺癌细胞上的HER2/neu，结果表明Fc对FcgRIIIa(低于40μM)的亲和力似乎不足以诱发靶细胞溶解。相似地，在所测试的抗CD20构建体中，除了IgG1外，没有其他的抗体或Fc突变体对WIL2-S靶细胞表现出显著水平的CDC(图6)。在所测试的IgG亚类和突变体中，只有IgG1表现出可检测水平的CDC，这表明不依赖于C1q结合，其余的突变体都无法引发CDC(图6)。之前的研究工作表明IgG2通过C1q结合和经典途径的活化获得了最低的CDC，我们在抗CD20环境中并未观察到高水平的活性，这符合之前的观察结果(Idusogie，Presta et al.2000 J Immunol164(8)：4178-84(Idusogie、Presta等人，2000年，《免疫学杂志》，第164卷第8期，第4178-4184页))。此外，使用抗CD20和人血清也未能检测到具有残余补体活性的IgG1非糖基化形式的以往迹象(Dorai，Mueller et al.1991 Hybridoma 10(2)：211-7(Dorai、Mueller等人，1991年，《杂交瘤》，第10卷第2期，第211-217页))。关于这一差异的解释是IgG2可介导低水平的补体活化，活化程度可能不足以引发膜攻击复合物(MAC)的装配，但足以溶解经调理的细胞。
这些数据表明，无论补体活化水平如何，对于同种型抗体(而不是结合的IgG1)，最终导致靶细胞溶解的膜攻击复合物的装配不足或有所缺乏。
实例3：抗体依赖细胞吞噬作用
使用经调理的靶乳腺癌细胞、Sk-Br3和巨噬细胞来评估结合抗HER2/neu的Fc突变体在介导抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)方面的能力。
抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)
采用标准的Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度梯度制剂从leukopacks(Biological Specialty Corporation)分离出外周血单核细胞，然后将细胞等分并用液氮冻存。根据制造商说明书将PBMC解冻并利用不去除CD16的CD14分离试剂盒(Stem Cell Technologies)通过阴性去除而分离出CD14阳性细胞。在存在20ng/ml GM-CSF(R&D Systems)的情况下，以0.1×106个细胞/cm2的密度将细胞接种在RPMI/5％热灭活的FBS/50μg/ml庆大霉素内培养7天，以产生单核细胞来源的巨噬细胞。根据制造商说明书使用PKH67(Sigma)来标记SK-BR-3肿瘤细胞。先冲洗靶细胞，然后在37℃下将靶细胞与单核细胞来源的巨噬细胞在存在抗体的情况下放入5％CO2培养箱内温育4小时，其中靶细胞与效应子细胞的比率为1∶4。温育结束后，用Accutase(Millipore)分离细胞，并用偶联了AlexaFluor-647(Invitrogen)的抗CD11b抗体(BDBiosciences)标记巨噬细胞。采用流式细胞术来分析细胞以确定单独的肿瘤细胞(PKH67pos、CD11bneg)、单独的巨噬细胞(PKH67neg、CD11bpos)以及吞噬的肿瘤细胞(PKH67pos、CD11bpos)。利用下列公式来确定吞噬百分数：(吞噬的肿瘤细胞)/(吞噬的肿瘤细胞加上单独的肿瘤细胞)×100％。在FACS Calibur(Becton Dickinson)上获取细胞，然后使用FloJo软件(Tree Star)来分析结果。
使用GM-CSF体外分化分离的单核细胞，然后通过流式细胞检测分析来进一步表征FcR的表达水平。如其他人在之前的研究中提到的，GM-CSF激活的巨噬细胞中所有FcR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)表达水平相对于亲代单核细胞都有所增加(数据未示出)。随后使用M1巨噬细胞通过吞噬作用测定来测试这些抗HER2/neu IgG Fc突变构建体。
结果
在各种mAb存在的情况下与SkBr3细胞共培养4个小时后，IgG1的ADCP作用表现明显，但也观察到，在抗体浓度较高时，非糖基化IgG1、IgG2、IgG2m4和IgG4S＞P ala/ala产生最低水平的ADCP(图7)。与此相反，IgG2c4d表现出ADCP水平无法检测到。此观察结果与之前展示的各种IgG相对FcR的结合谱图相符。例如，当使用多种配体展示微珠(例如使用AlphaScreen
Figure BPA00001563865400181
系统)过程中IgG1、IgG非糖基化形式和IgG4ala/ala显示出能结合到FcγRI时，所有这三种抗体也显示出ADCP。当浓度较高时，IgG2和IgG2M4以及IgG4ala/ala表现出最低的ADCP。FcγRIIa与IgG2和IgG2m4的结合(如亲合力研究所示)表明FcγRIIa本身可能不足以驱动高水平的ADCP。BiaCore和AlphaScreenTM结果(表5和图4B及4C)进一步表明IgG非糖基化形式仍保留与FcγRI的结合能力，而IgG4ala/ala显示对FcγRI和FcγRIIa均具有亲合力，相比lgG4ala/ala，IgG1非糖基化形式的ADCP更为强效。由于IgG1非糖基化形式与FcγRIIa具有最小的结合能力(如果有的话)，并进一步引申到与高度类似的抑制性FcγRIIb(基于胞外域中＞95％的序列同一性)具有最小的结合能力(如果有的话)，因此通过FcγRI信号传导实现的ITAM活化不会受经由FcγRIIb活化相关的ITIM的信号传导所抑制。相反地，IgG4S＞P ala/ala表现出吞噬作用受到抑制，这可能是由于FcγRIIb的激活。最后，IgG2c4d与不同的FcR之间完全不存在基于单体或亲合力的可检测结合，这进一步证明了Fc骨架唯一缺失了吞噬功能。
实例4：抗体介导的细胞因子释放
当发生交联时，Fc与FcR在免疫细胞上的结合将促进细胞因子的释放。为了模拟FcR在免疫细胞上进行基于亲合力的结合，将mAb与聚苯乙烯微珠结合。
利用抗HER2/neu IgG突变体，经过夜培养使IgG与乳胶微珠直接结合后，进行细胞因子释放。以不同的浓度将冲洗的微珠加入到分离的人PBMC中(具体为从1500个/ml到250,000个/ml)并温育过夜，然后取出共培养上清液以使用得自PerkinElmer(Waltham，MA)的标准AlphaELISA试剂盒测量分泌的TNFα。
所测试的IgG同种型和Fc突变体通过Fc受体介导PBMC分泌TNFalpha，以此来刺激细胞因子释放，两者在这方面的能力有所差别(图8)。因此，各种同种型及其Fc突变体的TNF分泌水平从高到低依次如下：IgG1＞IgG2＞IgG2m4＞IgG2c4a＞IgG1非糖基化形式＞IgG4ala/ala＞IgG2c4b＞IgG2c4c＞IgG4c4d和e。应注意，IgG4d和e Fc突变体诱发可检测细胞因子(TNF)释放的能力最低(如果有的话)。
实例5：体外B细胞去除
为了更好地理解同种型和突变体的体内沉默级别能力，在存在肝素化人全血的情况下测定WIL2-S B细胞的体外去除。由于已知抗CD20IgG1参与所有的效应子功能(ADCC、CDC、ADCP)，包括PMN(中性粒细胞、嗜碱粒细胞等)、人补体和过量的IgG在内的全血系统可视为代表各个变体赋予的“沉默”水平。
简而言之，人全血提供效应子细胞，而WIL2-S细胞可作为进行ADCC测定的靶细胞。在37℃下，使用BATDA(PerkinElmer))对靶细胞进行预标记30分钟，然后冲洗两次并重悬于DMEM/5％热灭活的FBS中，随后将50μl的靶标(2×104个细胞/孔)加入到U型底的96孔板的孔内。另外再加入带有或不带有不同浓度抗体的50μl靶标，并将细胞放在室温下温育20分钟。随后将人全血(100μl)加入到孔内。所有样品以一式三份操作。将微孔板以200g离心3分钟，然后在37℃放入5％CO2培养箱内温育3小时，随后再次以200g离心3分钟。从每个孔中取出总共20μl的上清液，然后加入200μl基于DELPHIA Europium的试剂(PerkinElmer)并测定细胞溶解。使用Envision 2101多标记微孔板检测仪(PerkinElmer)来测定荧光。根据使用Triton X-100(Sigma Aldrich)处理细胞所获得的最大细胞毒性以及通过单独的靶细胞自发释放的BATDA所确定的最小对照细胞毒性，来对数据进行归一化。使用GraphPad Prism v5.01将数据拟合为S形剂量响应模型。
在存在人血的情况下进行WIL2-S共培养，结果发现使用IgG1时(且一定程度上由IgG2和IgG2M4引起)导致已标记的WIL2-S出现严重的效应子介导去除现象。应注意，(Fab′)2和Fab抗CD20片段均诱发一定水平的WIL2-S去除，这表示可能存在血清中能够修复效应子功能的已裂解的IgG自身抗体(参见Breski et al.2008 J Immunol 181：3183-3192(Breski等人，2008年，《免疫学杂志》，第181卷，第3183-3192页)。这与之前的ADCC、CDC和ADCP数据相符，利用IgG2c4e未观察到高水平或可检测水平的细胞因子释放。
实例6：通过CD20靶向得出的体内B细胞存活率
使用已建立的抗CD20的食蟹猴B细胞去除模型来评估与IgG2c4e相关的体内效应子功能(Reff et al，1994，Blood 83：435-445(Reff等人，1994年，《血液》，第83卷，第435-445页))。
使用生理盐水注射食蟹猴(n＝3只/组)7天，然后以0.2mg/Kg或2mg/Kg的量静脉注射单次剂量的IgG1或IgG2∑。在注射后的指定天数内，使用B和T细胞的流式细胞术分析法来测定全血样品中的B细胞含量(分别使用抗CD20和抗CD3作为标记物)。在注射后的三周内，绘制各组的B细胞平均含量(CD20+/CD3-)(图9)。注射1天后，低剂量的IgG1(0.2mg/kg)便可诱发几乎所有B细胞完全去除(99％)，而抗CD20IgG2c4e未诱发明显的去除作用(该组平均值为15％)。动物经抗CD20IgG2c4e处理后的几天内，B细胞含量仍相对正常，同时观察到食蟹猴经IgG1处理后的几周内，B细胞含量存在逐步恢复的趋势。应注意，在2mg/Kg的较高剂量下，IgG2c4e和IgG1诱发了B细胞几乎完全去除。
据认为，抗CD20介导的B细胞去除由多个机制介导，包括ADCC、CDC和细胞凋亡。由于食蟹猴B细胞去除数据表明B细胞在较高剂量(2mg/Kg)的IgG2c4e作用下被去除，因此通过测定抗体对分离的B细胞诱发的细胞凋亡水平来进一步评价B细胞去除的机制。
使用浓度为0、0.26、2.6和26μg/ml的IgG1、IgG2c4e、(Fab′)2和IgG2以及非结合对照物mAb(BM21)处理分离的B细胞4个小时，然后通过流式细胞术对Annexin V阳性细胞、7AAD阴性细胞进行定量。选择2.6和26μg/ml的具体终浓度来反映经0.2和2mg/Kg的弹丸注射后所估计的血清IgG的最大体内浓度。
对于所有三种结合抗体，观察到所有IgG(包括(Fab′)2)的剂量相关的细胞凋亡诱导，这表明抗CD20介导的交联作用足以在较高剂量下诱导细胞凋亡，但如果是较低剂量的IgG2c4e则无法诱导细胞凋亡。应注意，当Fc不存在时，(Fab′)2也能产生显著的细胞凋亡，从而确证了不依赖Fc介导的交联作用也能诱导抗IgG介导的细胞凋亡的这一观点，如先前所观察到的。
因此，采用修饰后的Fc变体不能消除与细胞上靶抗原交联相关的正常功能。
Figure IPA00001563864800011
Figure IPA00001563864800021
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Figure IPA00001563864800041
Figure IPA00001563864800051

Claims (17)

1.一种含Fc的分子，相比野生型Fc，所述分子对至少一种Fcγ受体的亲和力下降并且包含带有突变的IgG恒定区的抗体Fc域，其中由EU编号系统定义的第233、234、235、237和238位氨基酸残基包含选自下列的序列：PAAAP(SEQ ID NO：4)、PAAAS(SEQ ID NO：5)和SAAAS(SEQ ID NO：6)。
2.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述Fc域还包含突变H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S，如EU编号系统所定义。
3.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述域能够特异性结合FcRn。
4.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述Fc域序列与人IgG2重链CH2域具有至少90％的同一性。
5.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子是抗体或Fc融合蛋白。
6.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中第228位残基从S突变为P。
7.一种基于重组多肽的结合分子，包含：(i)能够结合靶分子的结合域，以及(ii)氨基酸序列与人免疫球蛋白重链的CH2和CH3恒定域的全部或部分基本同源的Fc域，并且其中由EU编号系统定义的第233、234、235、237和238位残基包含选自下列的氨基酸序列：PAAAP、PAAAS和SAAAS；其中所述结合分子能够结合所述靶分子，而不会引发显著的补体依赖性溶解或细胞介导的所述靶标降解。
8.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述Fc域能够特异性结合FcRn。
9.根据权利要求8所述的结合分子，其中所述结合域选自如下物质的结合部位：抗体；酶；激素；受体；细胞因子；免疫细胞表面抗原；配体和粘附分子。
10.根据权利要求9所述的结合分子，其中所述分子显示具有亲合力。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的结合分子，其中所述结合域特异性结合神经组织、内分泌组织、血管组织、心肌组织、滑膜组织、皮肤组织或粘膜组织内的靶标。
12.一种治疗由巨噬细胞的迁移和浓度表征的疾病的方法，包括向受试者或患者施用根据权利要求1至7中任一项所述的含Fc的蛋白制剂。
13.一种治疗如下疾病的方法：移植物抗宿主疾病；宿主抗移植物疾病；器官移植排斥；骨髓移植排斥；自身免疫、血管炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症和关节炎；同种异体免疫，例如胎儿/新生儿同种异体免疫血小板减少症；哮喘和过敏症；慢性或急性炎性疾病、克罗恩病或硬皮病；阿尔茨海默病或冠状动脉血管闭塞，所述方法包括向受试者或患者施用根据权利要求1至7中任一项所述的含Fc的分子。
14.一种治疗病症的方法，包括向受试者或患者施用根据权利要求1至7中任一项所述的含Fc的分子，其中将所述结合分子施用于患者，或任选地，其中所述患者为未出生的婴儿，则施用于所述患者的母亲。
15.一种含Fc的分子，相比野生型Fc，所述分子对Fcγ受体的亲和力下降并且包含基于IgG2恒定区的抗体Fc域，其中由EU编号系统定义的第233、234、235、237和238位氨基酸残基包含选自下列的序列：PAAAP、PAAAS和SAAAS，同时还包含突变H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S，如EU编号系统所定义。
16.一种相比于基于IgG2的野生型Fc，对含基于IgG2的Fc的分子与Fcγ受体的结合进行改变的方法，所述方法包括改变基于IgG2恒定区的Fc域中由EU编号系统定义的第233、234、235、237和238位残基的序列，从而包含选自下列的序列：PAAAP、PAAAS和SAAAS，并且包含突变H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S。
17.本文描述的任何发明。
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