KR20120116947A - 이펙터 기능이 제거된 항체 Ｆｃ 돌연변이체 - Google Patents

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Abstract

Fc 영역에서 변이를 갖는 항체 및 기타 Fc-함유 분자는 Fc 감마 수용체에의 결합 및 생성된 활성을 감소시키며, 다양한 질환 및 장애의 치료에 사용될 수 있다.

Description

이펙터 기능이 제거된 항체 Ｆｃ 돌연변이체{ANTIBODY Fc MUTANTS WITH ABLATED EFFECTOR FUNCTIONS}
본 발명은 표면 표적 항원들의 Fc 수용체 매개된 가교결합에 의해 면역 세포에 의해 세포 분열 반응을 활성화하거나 또는 Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하는 능력이 사실상 손실되도록 돌연변이된 인간 항체 IgG2 불변 영역(Fc 영역)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 돌연변이된 IgG2 불변 영역이 포함될 수 있는 신규한 항체를 제공한다.
세포 표면 항원을 표적화하는 항체는 면역 세포 상에서의 Fc 수용체(FcR) 참여(engagement) 및 보체 활성화와 관련된 원하지 않는 면역자극 및 이펙터(effector) 기능을 촉발한다. 치료적 항체 및 Fc-융합 제작물은 표적 리간드 기능을 표적화하여 그를 활성화하거나 또는 중화시키지만 필요한 국소적 세포 또는 조직은 손상시키지 않거나 파괴하지 않도록 의도되었기 때문에, 이펙터 기능이 제거된 Fc 돌연변이체가 추구되었다.
인간 IgG 아이소타입(isotype)(성숙 감마 글로불린 클래스 G 항체의 하위클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)은 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity)(ADCC, 예를 들어, IgG1 및 IgG3), 항체 의존성 세포 식작용(antibody-dependent cellular phagocytosis)(ADCP, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 및 보체 의존성 세포 독성(complement dependent cytotoxicity)(CDC, 예를 들어, IgG1, IgG3)과 같은 면역 기능을 모집하는 차등적 능력을 나타낸다. 이러한 면역 기능의 아이소타입-특이적 참여는 특유한 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 선택성 및 C1q에 결합하여 막 공격 복합체(membrane attack complex; MAC)의 어셈블리(assembly)를 활성화시키는 능력을 기반으로 한다. 다양한 아이소토프들 중에서, Fcγ 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIa/b/c, FcγRIIIa/b)에 대한 상대적인 친화성은 IgG1 및 IgG3에 있어서 높지만, IgG2 (FcγRIIa 131H 다형성에 제한됨)에 있어서는 친화성이 최소이고 단지 IgG4가 FcγRI에 대하여 측정가능한 친화성을 갖는다. 비교 서열 분석 및 동시 결정 구조를 이용하면, 수용체 결합에 있어서의 핵심 접촉 잔기는 하부 힌지(힌지) 및 CH2 영역에 스패닝하는(spanning) 아미노산 잔기에 맵핑되었다. 표준 단백질 공학 기술을 이용하면, 보체의 C1q 성분 및 Fc 수용체에 대한 항체 제제의 친화성의 향상 또는 감소에서 약간의 성공이 성취되었다.
아이소타입들 중에서, IgG2가 Fc 수용체의 패밀리에 가장 적게 결합할 수 있다. IgG2를 출발점으로 이용하여, 이펙터 기능이 감소되었지만 FcRn 결합성, 장기간 안정성 및 낮은 면역원성을 보유하는 돌연변이원을 찾으려는 노력이 있어왔다. 이러한 성질의 개선된 돌연변이체는 안전성이 유지된 개선된 항체 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명은 항체 또는 항체 유사 치료제의 조작에서 유용한 변경된 글리코실화 면역글로불린 불변 도메인의 조성물, 예를 들어 Fc 영역을 포함하고 세포 표면 리간드를 표적화하는 것을 제공한다. 본 발명의 조성물은 감소된 FcγR 결합 능력을 나타내지만 FcRn 결합성이 보존된 IgG2 Fc 돌연변이체이다. 이들 IgG Fc 돌연변이체는 보체 매개된 세포 독성 및 면역 이펙터 기능의 Fc-관련된 참여를 최소화하면서 용해성 항원 또는 세포 표면 항원의 치료적 표적화를 가능하게 한다. 일 태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 EU 넘버링(numbering) 시스템에 따라 V234A, G237A, P238S를 포함한다. 다른 태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 EU 넘버링 시스템에 따라 V234A, G237A, H268Q 또는 H268A, V309L, A330S, P331S를 포함한다. 특정 태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 EU 넘버링 시스템에 따라 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S, 및 선택적으로 P233S를 포함한다.
일 실시 형태에서, IgG2 Fc 돌연변이체 조성물은 치료적 항체(또는 Fc-융합물)의 반감기의 유지가 FcRn과의 상호 작용을 통하여 보존되는 반면 면역 및 이펙터 기능과 관련된 FcγR의 활성화로부터 유래되는 잠재적인 독성, 예를 들어 i) 항체 의존성 세포 독성(ADCC), ii) 보체 의존성 세포 독성(CDC), iii) 항체 의존성 세포 식작용(ADCP), iv) FcR-매개된 세포 활성화(예를 들어 FcR 가교결합을 통한 사이토카인 방출), 및 v) FcR-매개된 혈소판 활성화/고갈이 최소화되거나 또는 제거된 징후에서 사용된다. 일 태양에서, IgG2 Fc 돌연변이는 바인더(binder), 예를 들어 다가 바인더, 신경 장애, 예를 들어 기저 세포 결절종; 면역계 장애, 예를 들어 B-세포 또는 T-세포 활성화에 관련된 것에 연루된 세포, 또는 조직 복구 또는 치유에 연루된 세포, 예를 들어 섬유아세포 또는 줄기 세포 상의 표적화 리간드의 치료적 항체 또는 Fc-융합물 내로 포함된다.
다른 실시 형태에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 약학 조성물에 포함된다. 다른 실시 형태에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 약학적 활성 분자의 일부분에 포함된다. IgG2 Fc 돌연변이체 또는 활성 IgG2 Fc 돌연변이체-함유 분자를 포함하는 약학 조성물은 대식세포 또는 단구의 이동 및 집중을 특징으로 하는 질환의 치료에 유용하다. 일 태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체-함유 분자는 신경 조직, 내분비 조직, 혈관 조직, 심장 조직, 활막 조직, 피부 조직 또는 점막 조직 내의 표적의 결합에 유용하다. 본 발명의 IgG2 Fc 돌연변이체의 많은 용도들 중 하나는 이식편 대 숙주 질환; 숙주 대 이식편 질환; 기관 이식 거부; 골수 이식 거부; 자가면역, 예를 들어 맥관염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판 감소증 및 관절염; 동종면역, 예를 들어 태아/신생아 동종면역성 혈소판 감소증; 천식 및 알러지; 만성 또는 급성 염증성 질환, 예를 들어 크론병(Crohn's Disease) 또는 경피증; 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 관상 동맥 폐색증의 치료에 있어서의 것이 있다.
<도 1>
도 1은 각각의 잔기에 있어서의 상응하는 EU 넘버링을 나타내는 야생형 인간 IgG2 (서열 번호 1), IgG4 (서열 번호 2), 및 IgG1 (서열 번호 3)의 아미노산 서열의 정렬을 나타내며; IgG2의 힌지 영역은 EU 잔기 218에서 시작한다.
<도 2>
도 2는 변경된 잔기 (EU 넘버링)의 표면 위치를 나타내는 Fc 단편의 구조를 나타낸다.
<도 3a 내지 도 3c>
도 3a 내지 도 3c는 알파스크린(AlphaScreen) 비드 분석 플랫폼(platform)을 이용한, 항-Her2/neu 결합 항체로서 제작된 각각의 아이소타입 및 돌연변이체와 인간 IgG1 야생형 아이소타입의 항체의 경쟁을 나타내는 그래프이다: FcgRI (도시되지 않음), FcgRIIa (도 a), FcgRIIb (도 b), FcgRIIIa (도시되지 않음), 및 FcRn (도 c).
<도 4a 내지 도 4c>
도 4a 내지 도 4c는 알파스크린 비드 분석법을 이용한, 항-Her2/neu 결합 항체로서 제작된 각각의 아이소타입 및 돌연변이체의 직접적인 결합을 나타내는 그래프이다: FcgRIIIa (도 a), FcgRI (도 b), 및 FcgRIIa (도 c).
<도 5>
도 5는 ADCC 분석 및 항-Her2/neu 결합 항체로서 제작된 그리고 인간 PBMC (25X 과량) 및 SK-Br3 유방암 세포를 표적으로 사용한 선택된 아이소타입 및 돌연변이체의 결과를 나타낸다.
<도 6>
도 6은 인간 보체 및 WIL2-S 림프종 세포를 표적으로 사용한 선택된 항-CD20 제작물의 CDC 분석의 결과를 나타낸다.
<도 7>
도 7은 Sk-Br3 표적 세포 및 GM-CSF-분화 대식세포를 사용한 선택된 항-Her2/neu 제작물의 유세포 분석법적 분석으로부터의 ADCP 분석의 결과를 나타낸다.
<도 8>
도 8은 IgG2 야생형 및 6가지의 돌연변이체를 비롯하여 다양한 제작물에 있어서 IgG 아이소타입에 결합된 비드를 이용하여 PBMC를 자극한지 24시간 후 사이토카인(TNFα) 방출을 나타내는 그래프이다.
<도 9>
도 9는 다양한 Fc 영역을 포함하거나 또는 Fc-영역(Fab')2가 결여된 항-CD20 결합 도메인 항체 제작물을 주사한 사이노몰루구스(cynomologous) 원숭이 군에서 시간이 지남에 따른 평균 순환 B-세포의 수의 그래프이다.
서열 목록의 간단한 설명
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약어
ADCC = 항체 의존성 세포 독성; ADCP, 항체 의존성 세포 식작용; CDC = 보체 의존성 세포 독성; IgG = 면역글로불린 G; ITAM = 면역수용체 타이로신 활성화 모티프(motif); ITIM = 면역수용체 타이로신 저해 모티프; Mab = 단클론 항체; FDCR = Fc 의존성 사이토카인 방출(Fc-dependent cytokine release); FcγR, FcgR, 또는 Fc감마R = Fc 감마 수용체
정의 및 용어의 설명
"항체 의존성 세포 매개 세포 독성" 또는 "ADCC"는 분비된 Ig가 소정의 세포 독성 세포(예를 들어, 자연 살해(Natural Killer; NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합하는 형태의 세포 독성을 말하며, 이는 이들 세포 독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 후속적으로 표적 세포를 세포 독소로 살해하는 것을 가능하게 한다. 표적 세포의 표면으로 인도된 리간드 특이적 고친화성 IgG 항체는 세포 독성 세포를 자극하고 이러한 살해에 절대적으로 필요하다. 표적 세포의 용해는 세포외적인 것이며, 직접적인 세포-세포 접촉을 필요로 하고, 보체를 수반하지 않는다.
임의의 특정 항체가 ADCC에 의해 표적 세포의 용해를 매개하는 능력이 분석될 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위하여, 관심있는 항체는 면역 이펙터 세포와 조합된 표적 리간드를 디스플레이하는 표적 세포에 첨가되며, 이는 항원 항체 복합체에 의해 활성화되어 표적 세포를 세포 분해시킬 수 있다. 일반적으로 세포 분해는 용해된 세포로부터의 표지체(예를 들어, 방사능 기질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 탐지된다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 시험관 내 ADCC 분석법의 구체적인 예가 문헌[Wisecarver et al, 1985, 19:211]; 문헌[Bruggemann et al, 1987, J Exp Med 166:1351]; 문헌[Wilkinson et al, 2001, J Immunol Methods 258:183]; 문헌[Patel et al, 1995 J Immunol Methods 184:29] )이들 각각은 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심있는 항체의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 동물 모델에서, 예컨대 문헌[Clynes et al, 1998, PNAS USA 95:652]에 개시된 것에서 평가될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 전체적으로 참고로 포함된다.
"보체 유도성 세포 독성(Complement-directed cytotoxicity)" 또는 CDC는 보체 캐스케이드(cascade)가 항체 Fc에의 보체 성분 C1q의 결합에 의해 활성화되는 형태의 세포 독성을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc", "Fc-함유 단백질" 또는 "Fc-함유 분자"는 적어도 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 단량체형, 이량체형 또는 헤테로이량체형 단백질을 말한다. CH2 및 CH3 도메인은 단백질/분자(예를 들어, 항체)의 이량체 영역의 적어도 일부분을 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체"는 동물 항체의 적어도 하나의 종의 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 도메인의 적어도 하나에 대하여 상당한 상동성을 보유하는 적어도 하나의 리간드 결합 도메인을 포함하는 Fc-함유 단백질의 특정한 형태이다.
"야생형 인간 IgG2 Fc 영역"은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG Fc 영역 또는 그의 단편을 말하며, 이는 카밧(Kabat)의 EU 넘버링에 따르면 인간 IgG 중쇄의 잔기 K218 내지 잔기 K447이다. 불변 영역 내의 아미노산은 인간 IgG1 항체, EU IgG1 (서열 번호 3)과의 정렬에 의해 넘버링된다 (문헌[Cunningham et al., 1970 J. Biol. Chem., 9: 3161-70] 참조). 즉, 항체의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 동일성이 최대화되도록 EU의 중쇄 및 경쇄와 정렬되며, 항체에서의 각각의 아미노산은 EU에서의 상응하는 아미노산과 동일한 번호를 할당받는다. EU 넘버링 시스템은 당업계에서 통상적으로 사용된다 (일반적으로, 문헌[Kabat et al, Sequences of Protein of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services (1991)] 참조). 이러한 관례에 따르면, 기재된 "야생형 IgG2" 불변 영역은 236 위치의 아미노산이 결여되어 있다 (도 1, 서열 번호 1).
개관
본 발명은 사이토카인 방출을 야기하는 것에 대한 무능력 또는 표적 리간드 디스플레이 세포 및 표적화 세포를 둘러싸고 있는 조직을 손상시키거나 또는 살해하는 것에 대한 무능력의 견지에서 안전성이 개선된 치료적 항체, Fc-융합물 및 유사 바이오의약품의 제조에서 사용하기 위한 Fc 도메인을 확인하는 데 있어서의 관심에 의해 동기가 부여되었다.
인간 IgG4 아이소타입 항체 및 Fc-융합 단백질은 유의한 ADCC (배타적으로 FcgRIIIa를 발현하는 NK에 의한 것임)를 불러 일으키지 않지만, 대식세포 (FcγRI, IIa 및 IIIa를 발현함)에 의해 식작용(ADCP)을 유도하고 가능하게는 단구를 활성화시키는 능력을 유지하는데, 이는 면역 복합체 형태로 있고 특정 면역 세포 상의 활성화 FcγR의 분포에 기인할 때 그러하다. 잔여 활성을 최소화하려는 노력은 야생형 IgG4 Fc (서열 번호 2) 내에 V234A, L235A (ala/ala)를 포함하는 돌연변이체의 개발 및 그의 사용으로 이어졌다.
아무르(Armour) 등은 다수의 점 돌연변이를 IgG2 내에서 생성하여 FcgRI에의 결합 (문헌[Armour et al, 1999]) 및 FcgRIIa 및 IIIa에의 결합 (문헌[Armour et al. 2003])을 최소화하였다. 뮐러(Mueller) 등의 국제특허 공개 WO97/11971호에 개시된 추가의 돌연변이는 IgG2 CH2 및 IgG4 CH3 도메인으로 이루어진 IgG2/IgG4 하이브리드로부터 유래되며, 구체적으로 잔기 330 및 331은 본 발명의 IgG2 돌연변이체에서의 IgG4로부터의 것이다. 면역자극 효과를 감소시키기 위한 뮤팅(muting) 또는 사일런싱(silencing) 노력이 또한 이용되었다. IgG1 (서열 번호 3)에 있어서 최소 이펙터 기능을 갖는 mAb를 생성하기 위한 두 하위클래스 사이에서의 IgG2 또는 IgG4 또는 도메인 스와핑(swapping) (문헌[Tao et al, 1991]). 스트롤(Strohl)의 미국 특허 공개 제2007/0148167호에는 잔기 EU 위치 268, 309, 330 및 331에서의 IgG2에서의 4개의 돌연변이가 개시되어 있다. 문헌[Shields et al. (2001)]에는 추가의 치환, H268A가 개시되어 있다.
본 발명은 카밧/EU 넘버링 시스템에 따라 IgG2 불변 영역(Fc)의 다수의 위치에서의 IgG4 잔기 H268Q 또는 A, V309L, A330S 및 P331S에 의한 치환을 처음으로 보여준다. 예기치 않게도, 다수의 잔기 치환의 유도된 선택은 측정가능한 이펙터 기능이 없는 치료적 실체(entity)를 제공할 가능성 뿐만 아니라 융합 폴리펩티드로서 이용되는 그리고 항체 공학에서 사용하기 위한 기능적 Fc 도메인도 제공하였다.
다중 치환된 IgG2 돌연변이체는 알파스크린 경쟁 분석법 및 SPR/바이아코어(Biacore) 분석법에 의해 평가되는 인간 FcR (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 FcRn)에 대한 그의 상대적인 친화성을 바탕으로 하여 선발되었다. 이들 돌연변이체는 추가로 PBMC에 의한 TNF-α 분비를 촉발할 뿐만 아니라 CDC, ADCC 및 ADCP를 유도하기도 하는 그의 능력에 대하여 적절한 세포 시스템에서 시험되고 순위가 매겨졌다. 본 명세서에 제공된 실험 데이터 세트에서, IgG2 돌연변이체는 야생형 IgG1 및 IgG2에 더하여 IgG1 ag 및 IgG4 Ala/Ala를 포함하는 돌연변이체 또는 공지된 제제와도 비교되었다. 몇몇 시험관 내 생물분석법에서의 이들 돌연변이체의 추가의 분석에 의하면 최소 수준 내지 검출불가능한 수준의 활성 및 FcR에 대한 크게 제거된 결합 친화성이 입증되었다. 이들 스크린을 기반으로 하면, IgG2c4d로 표기되는 IgG2 Fc 돌연변이체는 FcR에 대한 검출가능한 친화성 또는 친화력이 없는 것으로 확인되었으며 (단량체형 리간드 결합 대 바이-다량체형 리간드 결합), 이는 다양한 전술한 이펙터/면역자극 생물분석법에서 활성이 없다. IgG2c4d Fc는 알라닌, 세린 및 류신 치환, 즉 V234A, G237A, P238S, H28A, V309L, A330S, P331S (EU 넘버링)를 포함한다. 7개의 잔기가 치환된 IgG2, IgG2c4d는 그의 FcR에의 결합에 대한 무능력, 이펙터 기능을 매개하는 것에 대한 무능력 또는 Fc-매개된 사이토카인 방출에의 참여에 대한 무능력 면에서 첫 번째의 실제로 "사일런싱된" Fc로 간주될 수 있다.
본 발명의 발견을 기반으로 하면, IgG2c4d의 7개의 돌연변이의 하위세트가 사용될 수 있거나 또는 이것이 다른 아미노산 돌연변이체와 조합될 수 있거나, 또는 당해 돌연변이가 다른 IgG 아이소타입에서 사용되어 본 명세서에 교시된 그리고 당업계에 공지된 것과 조합된 이펙터 기능들의 유사한 또는 선택적인 사일런싱이 성취되게 할 수 있다.
본 명세서에 구체적으로 예시된 바와 같이, 삼중 V234A, G237A, P238S 치환은 당해 분자의 FcRn 결합 친화성을 유지하면서 FcγRIIa 결합 친화성 및 FcγRIIa 결합 친화력을 감소시키고 ADCP 및 Fc-의존성 사이토카인 방출을 제거한다.
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변경된 Fc-함유 분자의 제조 방법
천연 항체 Fc의 구조적 특징, 유지된 FcRn 결합성, 우수한 안정성, 및 보체 캐스케이드, 세포 용해, 세포 식작용 또는 사이토카인 방출의 감소된 자극 능력을 갖는 조성물을 생성하려는 욕구를 기반으로 하여 치환 부위가 선택되었다.
IgG 클래스 항체는 2가이기 때문에, 이는 기능적 회합에 있어서 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 2개의 전 Fv 도메인을 갖는다. 2가는 동일하거나 또는 특유한 세포 상의 표적 항원 또는 Fc 수용체를 가교결합시키는 능력 뿐만 아니라 친화력 효과도 제공하고, 이로써 항체의 표적 비-특이적 수용체 결합 유도 생물활성의 스펙트럼을 유발하게 된다. 이러한 이유 때문에, 본 발명의 Fc 돌연변이체는 "친화력 맥락" 내에서 시험되었으며, 이는 IgG의 Fc 돌연변이체가 표면 상에서 다량체화되었으며 이것이 특정 Fc 수용체의 다량체와의 상호 작용에 대하여 시험되었음을 의미하였다.
돌연변이체의 생물학적 특성화
Fc-함유 단백질은 몇몇의 잘 알려진 시험관 내 분석법에 의해 기능성에 대하여 비교될 수 있다. 특히, Fcγ 수용체의 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 패밀리의 구성원에 대한 친화성이 관심있다. 이들 측정은 재조합 용해성 형태의 수용체 또는 세포-회합된 형태의 수용체를 이용하여 행해질 수 있다. 게다가, IgG의 장기간 순환 반감기에 책임이 있는 수용체인 FcRn에 대한 친화성이 예를 들어 재조합 용해성 FcRn을 이용한 "알파스크린"의 리간드 결합 비드 포맷을 이용하여 측정될 수 있다. 높은 처리량의 스크리닝에 사용되는 알파스크린은 결합과 같은 분자적 사건의 검출을 허용하는 균질 분석 기술이다. 코팅된 "도너(donor)" 및 "억셉터(acceptor)" 비드는 이 분석 기술의 기초이다. 비드 기반 분석법으로서, 알파스크린은 매우 근접한 비드들의 상호 작용을 통하여 작용하며, 이는 크게 증폭된 시그널을 생성하는 작용을 하는 화학 반응들의 캐스케이드로 이어진다. 직접적인 또는 간접적인, 예를 들어 경쟁적인 결합의 측정은 단백질들 중에서 그리고 그 사이에서 상대적인 친화성 및 친화력을 평가하는 데 적용될 수 있다.
인간 IgG 아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)의 자연 진화는 각각이 면역 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 독성(ADCC, 예를 들어 IgG1 및 IgG3), 항체 의존성 세포 식작용(ADCP, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 및 보체 의존성 세포 독성 (CDC, 예를 들어 IgG1, IgG3)을 모집하는 능력의 상이한 스펙트럼을 나타내게 하였다. 이들 기능의 아이소타입-특이적 참여는 특유한 면역 세포 상에 존재하는 Fc 수용체에 대한 차등적인 선택성을 기반으로 하며, 이외에도 C1q에 결합하여 막 공격 복합체(MAC)의 어셈블리를 활성화시키는 능력을 기반으로 하는데, 이는 이펙터 대식세포 상의 특정 수용체 결합 보체 성분을 통한 CDC 및 CDP(보체 의존성 식작용)로 이어진다. 인간 아이소타입의, 보체 캐스케이드의 처음 성분, C1q에 결합하는 능력의 계급은, 미생물 감염에 있어서 IgG2 및 IgG4에 의한 보체 활성화가 잘 입증되어 있기는 하지만, IgG1>IgG3>IgG2>IgG4 이다.
세포 기반의 기능 분석, 예를 들어 ADCC 및 CDC는 특정한 변이형 구조의 가능한 기능적 결과의 통찰을 제공한다. 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)은 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포 독성 세포(예를 들어, 천연 살해 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개된 반응이다. 일 실시 형태에서, ADCC 분석은 일차 이펙터 세포로서 NK 세포를 갖도록 구성되며, 이는 이들 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 유일한 Fcγ형 수용체인 FcγRIIIA에 대한 기능적 영향을 반영한다.
또한 식작용 분석을 이용하여 상이한 돌연변이체들의 면역 이펙터 기능을 비교할 수 있으며, 이는 세포 반응, 예를 들어 수퍼옥사이드(superoxide) 또는 염증 매개자 방출을 측정하는 분석법이 그러할 수 있는 바와 같다. 생체 내 모델은 Fc 변이체의 연구에 유용한 것으로 증명되었다. 예를 들어, 생쥐에서 T 세포 활성화를 측정하기 위하여 항-CD3 항체의 돌연변이체를 이용하여 입증되는 바와 같이, 특정 리간드, 예를 들어 Fcγ 수용체에 참여하는 Fc 도메인에 의존적인 활성. 대식세포의 항체 유도 활성화는 항체 의존성 세포 식작용(ADCP)을 매개하며, 이는 옵소닌화된 표적 세포가 대식세포에 의해 휩싸여져서 소화되게 한다. 시험관 내에서, 높은 수준의 FcR을 발현하는 분화된 대식세포는 IFNγ 또는 GM-CSF를 이용하여 M1 표현형으로 분화시켜서 단구에 비하여 상승된 수준의 모든 FcR((FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa)이 발현되게 할 수 있다. 이러한 분석법은 항체 공학 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
항체의 제조 방법
Fc 돌연변이체의 생성 및 시험에서 출발점으로 사용되는 인간 IgG2 불변 도메인의 서열에서의 지시된 돌연변이(directed mutation)를 생성하기 위하여 일상적인 재조합 공정을 이용하였다. 회수 및 시험을 위하여 다양한 숙주 세포에서 원하는 아미노산 서열의 발현에 적합한 벡터를 생성하기 위하여 코딩 서열에서 변화를 생성하는 다양한 기술이 사용될 수 있음이 당업자에게 인식될 것이다.
숙주 세포 선발 또는 숙주 세포 조작
본 명세서에 기재된 바와 같이, 재조합 Fc-함유 단백질 또는 단클론 항체의 발현용으로 선택된 숙주 세포는 제한 없이 면역글로불린 CH2 도메인에서 단백질을 장식하는 올리고당 부분(moiety)의 조성에서의 변이를 비롯하여 최종 조성에의 중요한 기여자이다. 따라서, 본 발명의 일 태양은 원하는 치료적 단백질을 발현하는 생산 세포의 사용 및/또는 개발에 적절한 숙주 세포의 선발을 포함한다.
또한, 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 있거나, 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이들의 임의의 유도체, 불사화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어 원핵 세포 또는 유기체, 예를 들어 천연 또는 조작 이. 콜라이(E. coli) spp, 클렙시엘라(Klebsiella) spp., 또는 슈도모나스(Pseudomonas) spp.로부터 선택될 수 있다.
항체
본 출원에 기재된 항체는 임의의 포유류, 예를 들어, 그에 한정되는 것은 아니지만 인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류, 염소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 또는 그로부터 유래될 수 있으며, 이는 단리된 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화 및/또는 CDR-그래프팅(grafted) 항체, 면역글로불린, 이들의 절단 생성물 및 기타 특정 부분 및 변이체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 항체, Fc-함유 단백질 또는 Fc 단편은 당업계에 잘 알려진 몇몇 방식으로 유도될 수 있다. 일 태양에서, 항체는 편리하게는 생쥐 또는 기타 동물을 표적 펩티드, 세포 또는 조직 추출물로 면역화함으로써 제조되는 하이브리도마로부터 얻어진다. 이와 같이 항체는 당업계에 잘 알려진 임의의 하이브리도마 기술을 이용하여 얻어질 수 있으며, 예를 들어 전적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]을 참조하라.
항체 또는 Fc-융합 단백질 또는 이들의 구성요소 및 도메인이 또한 이러한 도메인 또는 구성요소의 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리로부터의 선발에 의해 얻어질 수 있다. 파지 라이브러리는 면역화된 동물 또는 인간의 B-세포 유래의 것과 같은 관심있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 삽입함으로써 생성될 수 있다 (문헌[Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317]). 항체 파지 라이브러리는 하나의 파지 내에 중쇄(H) 및 경쇄(L) 가변 영역 쌍을 함유하는데, 이는 단쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편의 발현을 허용한다 (문헌[Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8]). 파지미드 라이브러리의 다양성은 추가의 바람직한 인간 단클론 항체를 생성하고 후속적으로 확인하기 위하여 라이브러리의 단클론 항체의 면역특이성을 증가시키고/시키거나 변경하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 중쇄(H) 및 경쇄(L) 면역글로불린 분자 코딩 유전자는 어셈블링된 면역글로불린 분자에서 새로운 HL 쌍을 생성하도록 랜덤하게 혼합될(셔플링될) 수 있다. 부가적으로, 어느 하나의 또는 둘 모두의 H 및 L 사슬 코딩 유전자는 면역글로불린 폴리펩티드의 가변 영역의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)에서 돌연변이되고, 후속적으로 바람직한 친화성 및 중화 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 또한 항체 라이브러리는 하나 이상의 인간 프레임워크(framework) 서열을 선발하고, 인간 항체 레퍼토리로부터 유래된 또는 설계된 변이를 통하여 유래된 CDR 카세트의 콜렉션(collection)을 도입함으로써 합성에 의해 생성될 수 있다 (문헌[Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602]). 다양성의 위치는 CDR에 한정되지 않지만, 가변 영역의 프레임워크 절편을 또한 포함할 수 있거나, 또는 펩티드와 같은 항체 가변 영역 이외의 것을 포함할 수도 있다.
항체 가변 영역 이외의 것을 포함할 수도 있는 표적 결합 성분의 다른 라이브러리로는 리보좀 디스플레이, 효모 디스플레이 및 박테리아 디스플레이가 있다. 리보좀 디스플레이는 단백질이 RNA에 계속하여 부착되게 하면서 mRNA를 그의 동계 단백질로 번역하는 방법이다. 핵산 코딩 서열은 RT-PCR에 의해 회복된다 (문헌[Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022]). 효모 디스플레이는 교배형 시스템의 일부인 막-회합된 알파-응집소 효모 부착 수용체, aga1 및 aga2의 융합 단백질의 제작을 기반으로 한다 (문헌[Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7]). 박테리아 디스플레이는 세포막 또는 세포벽과 회합된 엑스포트된(exported) 박테리아 단백질에의 표적의 융합을 기반으로 한다 (문헌[Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503]).
하이브리도마 기술과 비교하여, 파지 및 기타 항체 디스플레이 방법은 시험관 내에서 그리고 항원에 대한 숙주의 영향의 가능성의 제한 없이 항원 표적에 대한 선발을 조작할 기회를 주거나 또는 반대의 경우도 마찬가지이다.
또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 코딩하는 핵산을 조성물 또는 그의 유도된 돌연변이원의 원핵, 진핵 또는 사상 파지 발현, 분비 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 포함하는 발현 벡터의 부분으로서 또는 단리된 폴리뉴클레오티드로서 제공한다.
Fc-함유 분자의 용도
임의의 상기에 기재된 방법에 의해 생성된 조성물(항체, Fc-융합물, Fc 단편)은 세포, 조직, 기관, 유체, 또는 일반적으로 숙주에서 인간 질환 또는 특정 병상을 진단, 치료, 탐지 또는 조정하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 교시된 바와 같이, Fc 감마 수용체 결합 및 특정 이펙터 기능이 감소되거나 또는 제거되지만 항체가 원래의 표적화 특성을 유지하도록 항체, Fc-융합 단백질, 또는 Fc 단편의 Fc 부분을 변경시키면 탁월한 스펙트럼의 활성, 생물물리학적 특성, 안정성 및 숙주의 신체 내에서 지속되는 능력을 갖는 항체 및 Fc-제작물이 제공된다.
본 발명에 의해 제공되는 조성물을 이용한 치료에 따를 수 있는 질환 또는 병상은 알츠하이머병과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 그리고 신경병증성 통증을 포함하는 신경 장애; 피부병; 대사성 질환; 골관절염; 및 화상 또는 상해에서 생긴 병태; 심근 경색, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중 및 출혈을 포함하지만 이에 한정되지 않는 심혈관 장애와; 이외에도 류마티스성 질환, 건선 및 경피증을 포함하는 전신적 면역 매개 장애를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명을 일반적인 개념으로 개시하였지만, 본 발명의 실시 형태는 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.
실시예 1: Fc 돌연변이체의 제작 및 시험
표 4에 나타낸 인간 IgG2 항체로부터 유래시킨 돌연변이된 일련의 제작물을 표준 재조합 방법을 이용하여 제작하였다. 전 가변 도메인을 갖는 항체에 있어서, 항-HER2 및 항-CD20 항체의 공지된 CDR 서열을 이용하여 아이소타입 및 Fc 돌연변이체를 제작하였으며, 이는 나타낸 바와 같았다. 항체 돌연변이체는 표준 클로닝 및 발현 절차를 이용하여 293T 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 단백질 A 컬럼을 이용하여 Mab를 95% 초과의 균질성이 되도록 정제한 후 추가의 실험 분석을 하였다.
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바이아코어 친화성 연구
바이아코어 3000 광 바이오센서 (스웨덴 웁살라 소재의 바이아코어 아베(Biacore AB); 현재 지이 헬스케어(GE Healthcare)의 일부)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 실시하였다. 실험은 3 mM EDTA 및 0.01% 계면활성제 P20을 함유하는 D-PBS 완충제에서 25℃에서 실시하였다. 수용체와 Fc 돌연변이체의 상호 작용을 분석하기 위하여, 생쥐 항-His IgG (알앤디 시스템즈(R&D systems) 카탈로그 번호 MAB050)를 CM-5 센서 칩에 공유적으로 커플링시킴으로써 포획 표면을 생성하였다. 항-His Ab를 pH 4.5의 10 mM 아세트산나트륨 완충제 (바이아코어 아베) 내에 희석시키고, 아민-커플링 화학에 대한 제조업자의 지시를 이용하여 CM-5 칩 (대략 3000 RU)의 카르복시메틸화 덱스트란 표면에 커플링시켰다. 표면 상의 남아있는 반응기를 에탄올아민-HCl을 이용하여 불활성화시켰다. 동력학적 실험을 실시하기 위하여, 각각 165, 351 및 208 반응 단위(response unit; RU)의 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 이 표면 상에 포획하였다. 수용체 포획에 이어서 연속 희석의 야생형 또는 Fc 돌연변이체 (4배 희석 단계에서 4000 nM로부터 3.9 nM까지)를 30 uL/min으로 주입하였다. 회합 시기를 3분 동안 모니터링하였다. 이것에 이어서 20분 동안 완충제를 유동시켜 결합 해리를 모니터링하였다. 포획 표면은 100 uL/min의 100 mM 인산의 9초 펄스, 이어서 러닝(running) 완충제의 주입을 이용하여 재생시켰다.
기준을 위하여 스크루버(Scrubber) 소프트웨어 버전 1.1g (바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software))를 이용하여 시그널 및 기기 노이즈(noise)에 대한 완충제 기여에 대하여 보정하기 위하여 데이터의 이중 기준 차감(Double reference subtraction)을 실시하였다 (문헌[Myszka 1999]). 이러한 초기의 데이터 프로세싱 후, 간단한 1:1 결합 모델을 가정하여 BIA 평가 소프트웨어, 버전 4.0.1 (바이아코어, 아베)을 이용하여 데이터의 동력학적 분석을 실시하였다.
알파스크린 및 결합 연구
다양한 FcγR에의 IgG의 경쟁적 및 직접적 결합 둘 모두를 균질 비드-기반 결합 분석법, 알파스크린™ (미국 매사추세츠주 월탐 소재의 퍼킨엘머(PerkinElmer))을 사용하여 평가하였다. 간략하게는, 실험을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였으며 (문헌[Lazar et al 2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103(11): 4005-10]), 이때 약간 변경하여 수행하였다. FcγRI, IIa를 알앤디 시스템즈로부터 구매하였다. FcγRIIIa 및 FcRn을 클로닝하고, 발현시키고, 정제하였다. 2:1의 비로 피어스(Pierce)의 NLS-바이오틴을 이용하여 바이오티닐화한 바이오티닐화 CNT06234(비특이적 대조 인간 IgG1 하위클래스 항체) 또는 항 -Her2/neu (인간 IgG2 항체)에 대한 경쟁적 결합에서 IgG Fc 돌연변이체를 시험하였다.
경쟁적 결합 연구에서, 바이오티닐화 항체를 200 ng/ml의 최종 분석 농도가 되도록 첨가하고, 이어서 경쟁 시험 항체들을 각각의 실험 도면에 명시된 표기된 최종 농도로 첨가하였다. FcγR를 96웰 플레이트에 200 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고, 이어서 스트렙타비딘 도너 및 Ni-킬레이트 억셉터 비드를 연속적으로 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 진탕시킨 후, 플레이트를 엔비전(Envision) 플레이트 판독기를 이용하여 판독하고, 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에서 그래프화하여 도시하였다. 시험 IgG 분자를 2:1의 비로 바이오티닐화하고 직접적인 FcR 결합을 대조 항체에 대한 경쟁의 부재 하에 평가한 것을 제외하고는, 완료 연구와 유사하게 친화력 연구를 수행하였다.
결과
TSPR/바이아코어 분석에 의해 평가하고 센소그램(sensogram)으로부터 유도한 인간 FcR (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa)에 대한 IgG 변이체의 상대적인 친화성이 표 5에 예시되어 있다.
Figure pct00006
이들 수는 하나의 실험의 전체적 피팅(fit)을 위하여 생성한 파라미터에 상응한다.
이들 4개의 세트의 데이터에 있어서, 단순 1:1 결합 모델의 동력학적 피팅을 이용하여 피팅을 실시함으로써 친화성을 얻었다. 모든 기타의 것에 있어서, 친화성은 단순 1:1 결합 정상 상태 친화성 분석법을 이용하여 피팅을 실시함으로써 얻었다.
인간 IgG1(CNTO6234)을 이용하는 알파스크린™ 경쟁 분석법을 이용하여 측정한, 짙은 표적 필드(field)에의 2가 항체 결합에 대한 것인 친화력 맥락에서의 인간 FcR (FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcRn)에 대한 IgG 돌연변이체의 상대적인 친화성이 각각 도 3a 내지 도 3c에 도시되어 있다.
데이터는 IgG1 ag 및 IgG4 Ala/Ala뿐만 아니라 IgG2 돌연변이체도, FcRn (생체 내 반감기를 부여하는 신생아 Fc 수용체)에 결합하는 그의 능력은 유지하면서 IgG1과 비교하여 Fc 감마 수용체에 대하여 유의하게 감소된 결합 친화성을 나타냄을 입증하였다. 구체적으로, IgG2에 대한 경쟁적 결합에서 그리고 FcgRIIa에의 결합에서 높은 친화성으로부터 최저 친화성으로 등급을 매기면 그 순서는 하기와 같다: IgG1>IgG2c4a>IgG2m4>IgG2=IgGc4c>IgG2c4b>IgG4 ala/ala>IgG4 agly>IgG2c4d. 이 순서는 FcgRIIb에의 결합에 있어서 IgG1 (CNTO6234)에 대한 경쟁에서 일치한다. pH 6.4에서의 FcRn에의 결합에 있어서의 IgG1 (CNTO6234)에 대한 추가의 경쟁적 결합 분석은 모든 아이소타입 및 돌연변이체가 FcRn에 상대적으로 동일하게 결합함을 나타냈다. 중요하게는, IgG2c4d 및 IgG1 agly는, 만약에 있다면, FcgRIIa 및 FcgRIIb에의 최소의 검출가능한 결합을 나타낸다.
실시예 2: ADCC 및 CDC
CDC는 하기 3가지 카테고리의 경로에서 개시되며, 이들 모두는 표적 세포 또는 미생물을 결국 용해시키게 되는 막 공격 복합체의 어셈블리에 이르게 되는 단백질 분해 단계들의 캐스케이드를 생성한다: 항체 의존성 (고전적인 경로), 다당류 의존성 (렉틴 의존성), 및 외래 표면 구조 (대안적인 경로) (문헌[W.E. Paul Immunology] 참조). 실시예 1에 기재한 Fc 돌연변이체 및 아이소타입의 하위세트를 항-CD20 항체의 가변 도메인을 이용하여 제조하고, 인간 혈청의 존재 하에 WIL2-S B-세포 림프종 표적 세포를 용해시키는 그의 능력에 대하여 평가하였다. WIL2-S 세포의 CDC를 매개하는 것으로 공지된 치료적 항-CD20인 구매가능한 리툭산(Rituxan)(등록상표)을 용해의 양성 대조군으로 사용하였다. CDC 분석에 있어서, Wil2-S 표적 세포를 96웰 플레이트에 접종하고, 인간 혈청 보충물(1/6 희석)과 함께 인큐베이션하고, 상대적인 세포 생육성을 알라마르블루(AlamarBlue)를 이용하여 평가하였다.
ADCC 분석은 표적으로서 SkBr3 유방암 세포, 그리고 실시예 1에서 설명한 상이한 IgG 아이소타입 또는 변이체의 다양한 Fc 도메인과 조합된 항-HER2/neu 가변 도메인을 이용하여 실시하였다. 이 분석은 세포 용해 탐지의 EuTDA법 (미국 매사추세츠주 월탐 소재의 퍼킨엘머)을 이용하여 이전에 설명한 바와 같이 수행하였다. TDA-로딩된 SkBr3 유방암 표적 세포를 U자형 바닥의 96웰 플레이트에 접종하고, 표기된 농도의 항체를 이용하여 옵소닌화하고, 37℃에서 류코팩(leukopack)으로부터 단리한 25x 과량의 PBMC와 함께 동시 배양하였다. 3시간 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 TDA 방출에 대하여 분석하였는데, 이는 제조업자의 지시에 따른 것이었다. 미가공 데이터를 그래프패드 프리즘을 이용하여 정규화하여 도시하였다. CDC 분석에 있어서, Wil2-S 표적 세포를 96웰 플레이트의 웰 당 50,000개로 접종하고, 인간 혈청 보충물 (1/6 희석)과 함께 인큐베이션하고, 상대적인 세포 생육성을 알라마르블루를 이용하여 평가하였다.
결과
NK 세포 상의 FcgRIIIa를 주로 참여시키는 ADCC는 IgG2, IgG2m4, IgG2c4d 및 e, IgG1 agly 및 IgG4 ala/ala를 포함하는 시험 제작물 시리즈에 있어서는 검출불가능하였으며 (도 5), 이는 알파스크린™ 분석법에서의 친화력 결합의 결여 뿐만 아니라 더욱 높은 친화성의 FcgRIIIa (V) 수용체에 대하여 나타낸 감소된 결합 특징과도 일치한다 (도 4a). 이 연구에서와 같이 유방암 세포 상의 HER2/neu와 같은 고밀도 표적의 이용은 FcgRIIIa에 대한 Fc 친화성 (40 uM보다 낮음)이 표적 세포 용해를 유도하기에 불충분한 것으로 보임을 입증하였다. 이와 유사하게, IgG1은 별도로 하고서 항체 또는 Fc-돌연변이체 중 어느 것도 시험한 항-CD20 제작물에서 WIL2-S 표적 세포에 대하여 유의한 수준의 CDC를 보이지 않았다 (도 6). 시험한 IgG 하위클래스들 및 돌연변이체들 중에서, IgG1만이 검출가능한 수준의 CDC를 보였으며, 이는 C1q 결합과 관계없이 나머지 돌연변이체들 중 어느 것도 CDC를 촉발할 수 없음을 시사하는 것이었다 (도 6). 이전의 노력은 고전적인 경로의 C1q 결합 및 활성화를 통하여 최소 CDC를 갖는 것으로서 IgG2를 지적하였지만, 본 출원인은 항-CD20 맥락에서 유의한 수준의 활성을 관찰하지 못하였으며 이는 이전의 관찰과 일치하였다 (문헌[Idusogie, Presta et al. 2000 J Immunol 164(8): 4178-84]). 더욱이, 잔여 보체 활성을 갖는 IgG1 agly의 이전의 증거는 또한 항-CD20 및 인간 혈청을 이용해서는 검출되지 않았다 (문헌[Dorai, Mueller et al. 1991 Hybridoma 10(2): 211-7]). 이러한 불일치에 대한 설명은 낮은 수준의 보체 활성화가 IgG2에 의해 매개될 수 있지만 활성화는 옵소닌화 세포를 용해시키기에 충분한 막 공격 복합체(MAC)의 어셈블리를 촉발하기에는 불충분할 수 있다는 것이다.
이들 데이터는 보체 활성화 수준에 관계없이, 결국 표적 세포를 용해시키는 막 공격 복합체의 어셈블리가 결합 IgG1 이외의 아이소타입의 항체에 대해서는 부족하거나 불충분함을 시사한다.
실시예 3: 항체 의존성 세포 식작용
항-HER2/neu 결합 Fc 돌연변이체를 옵소닌화 표적 유방암 세포, Sk-Br3 및 대식세포를 이용하여 항체 의존성 세포 식작용(ADCP)을 매개하는 그의 능력에 대하여 평가하였다.
항체 의존성 세포 식작용(ADCP)
말초 혈액 단핵 세포를 류코팩 (바이올로지칼 스페셜티 코포레이션(Biological Specialty Corporation)으로부터 표준 피콜-파크(Ficoll-Paque) (지이 헬스케어) 밀도 구배 제조에 의해 단리하고, 세포를 분취하고, 질소 중에 보관하였다. PBMC를 해동시키고, CD14 양성 세포를 제조업자의 지시에 따라 CD16 고갈이 없는 CD14 단리 키트(스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies)를 이용하여 음성 고갈(negative depletion)에 의해 단리하였다. 7일 동안 20ng/ml의 GM-CSF (알앤디 시스템즈)의 존재 하에 RPMI/5%의 가열 불활성화 FBS/50μg/ml의 겐티미신 중 0.1×106개의 세포/cm2로 세포를 도말하여 단구-유래된 대식세포를 생성하였다. SK-BR-3 종양 세포를 제조업자의 지시에 따라 PKH67 (시그마(Sigma))로 표지하였다. 표적 세포를 세척하고, 항체의 존재 하에 4개의 이펙터 세포에 대하여 1개의 표적 세포의 비로 단구-유래된 대식세포와 함께 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 아큐타아제(Accutase) (밀리포어(Millipore))를 이용하여 탈리시키고, 대식세포를 알렉사플루오르(AlexaFluor)-647 (인비트로겐(Invitrogen))에 콘쥬게이션된 항-CD11b 항체 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))로 표지하였다. 세포를 유세포 분석법으로 분석하였더니 단독의 종양 세포 (PKH67pos,CD11bneg), 단독의 대식세포 (PKH67neg, CD11bpos), 및 식작용된(phagocytosed) 종양 세포 (PKH67pos, CD11bpos)인 것으로 결정되었다. 식작용 퍼센트를 하기 등식으로 결정하였다: (식작용된 종양 세포)/(식작용된 종양 세포 + 단독의 종양 세포) × 100%. 세포를 FACS 칼리버(Calibur) (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에서 획득하고, 그 결과를 플로조(FloJo) 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))로 분석하였다.
단리된 단구를 시험관 내에서 GM-CSF를 이용하여 분화시키고, 유세포 분석법적 분석에 의해 FcR의 발현 수준에 대하여 추가로 특성화하였다. 다른 이들에 의한 이전의 연구에서 나타낸 바와 같이, GM-CSF 활성화된 대식세포는 모 단구에 비하여 상승된 수준의 모든 FcR (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa)을 발현하였다 (데이터는 예시하지 않음). 항-HER2/neu IgG Fc 돌연변이체 제작물을 후속적으로 M1 대식세포를 이용하여 식작용 분석에서 시험하였다.
결과
각각의 mAb의 존재 하에 SkBr3 세포와 함께 4시간 동시 배양한 후, 유의한 수준의 ADCP가 IgG1에 있어서 명백하였지만, 항체의 더욱 높은 농도에서 비글리코실화(aglycosylated) IgG1, IgG2, IgG2m4, 및 IgG4 S>P ala/ala에 있어서 최소 수준의 ADCP가 또한 관찰되었다 (도 7). 이와는 대조적으로, IgG2c4d는 검출가능한 수준의 ADCP를 보이지 않았다. 이러한 관찰은 FcR에 대한 다양한 IgG의 이전에 입증된 결합 프로파일과 일치한다. 예를 들어, IgG1, IgG agly 및 IgG4 ala/ala는 다수의 리간드 디스플레이 비드를 사용함에 있어서 (예를 들어, 알파스크린(등록상표) 시스템을 사용함에 있어서) FcγRI에 대하여 결합을 보였지만, 상기의 모든 3가지는 ADCP를 또한 보였다. IgG2 및 IgG2M4 및 IgG4 ala/ala는 더욱 높은 농도에서는 최소 ADCP를 나타냈다. 친화력 연구에 의해 나타낸 바와 같이 IgG2 및 IgG2m4에 의한 FcγRIIa의 참여는 FcγRIIa의 기여가 그 자체로는 그리고 제 스스로는 유의한 수준의 ADCP를 유도하기에 불충분할 수 있음을 시사한다. 추가로 바이아코어 및 알파스크린™ 결과 (표 5 및 도 4b 및 도 4c)는 IgG agly가 FcγRI에의 결합성을 유지한 반면 IgG4 ala/ala는 FcγRI 및 FcγRIIa 둘 모두에 대하여 친화력을 나타내지만 ADCP는 IgG4 ala/ala보다 IgG1 agly에 있어서 비교적 더 강함을 나타냈다. IgG1 agly는, 만약에 있다면, FcγRIIa에 대하여 최소의 결합성을 갖기 때문에 그리고 고도로 유사한 저해 FcγRIIb (세포외 도메인에서 서열 동일성 >95%를 기반으로 함)까지의 연장에 의하면, FcγRI 시그널링을 통한 ITAM의 활성화는 FcγRIIb 활성화와 관련된 ITIM을 통한 시그널링에 의해 무효로 되지 않는다. 이와는 대조적으로, IgG4 S>P ala/ala는 약해진 식작용을 나타내며, 이는 FcγRIIb의 활성화로 인한 것일 가능성이 있다. 마지막으로, 추가로 다양한 FcR에의 IgG2c4d의 결합을 기반으로 한 검출가능한 단량체 또는 친화력의 완전한 결여는 이 Fc 골격의 유일무이한 무효화 식작용 능력을 지원한다.
실시예 4: 항체-매개된 사이토카인 방출
면역 세포 상의 FcR의 Fc-참여는 가교결합될 때 사이토카인 방출을 촉진한다. 면역 세포 상의 FcR의 친화력-기반의 참여를 모방하기 위하여, mAb를 폴리스티렌 비드에 결합시켰다.
항-HER2/neu IgG 돌연변이체를 이용한 사이토카인 방출은 하룻밤 인큐베이션 후의 라텍스 비드에의 IgG의 직접적인 결합 후 실시하였다. 세척한 비드를 ml 당 약 1500 내지 250,000개의 명시된 다양한 농도로 단리된 인간 PBMC에 첨가하였으며, 하룻밤 인큐베이션한 후 동시 배양물 상청액을 제거하여 분비된 TNFα를 측정하였는데, 이는 퍼킨엘머 (미국 매사추세츠주 월탐 소재)로부터의 표준 알파ELISA 키트를 이용하였다.
시험한 IgG 아이소타입 및 Fc 돌연변이체는 PBMC로부터의 Fc 수용체 매개된 TNF알파 분비를 통하여 사이토카인 방출을 자극하는 차등적인 능력을 보유한다 (도 8). 따라서, 다양한 아이소타입 및 그의 Fc 돌연변이체에 의한 TNF 분비의 수준은 높은 것으로부터 낮은 것으로 하기와 같다: IgG1>IgG2>IgG2m4>IgG2c4a>IgG1agly>IgG4ala/ala> IgG2c4b> IgG2c4c> IgG4c4d 및 e. 중요하게는, IgG4d 및 e Fc 돌연변이체 둘 모두는, 만약에 있다면, 검출가능한 사이토카인(TNF) 방출을 유도하는 최소의 능력을 보유한다.
실시예 5: 생체 외(Ex vivo) B 세포 고갈
아이소타입 및 돌연변이체의, 그의 사일런싱 수준에 있어서의 능력을 더욱 잘 이해하기 위하여, 헤파린 처리한 인간 전혈의 존재 하에 WIL2-S B-세포의 생체 내, 생체 외 고갈을 측정하였다. 항-CD20 IgG1은 모든 이펙터 기능(ADCC, CDC, ADCP)에 참여하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 과도한 IgG, 인간 보체 및 PMN(호중구, 호염기구 등)의 존재를 포함하는 전혈 시스템은 각각의 변이체에 의해 주어지는 '사일런싱'의 수준을 나타내는 것으로 간주하였다.
간략하게는, 인간 전혈은 ADCC 분석에 있어서의 표적 세포로서의 역할을 하는 WIL2-S 세포 및 이펙터 세포를 제공하였다. 표적 세포를 BATDA (퍼킨엘머)로 37℃에서 30분 동안 사전 표지시키고, 2회 세척하고, DMEM/5% 가열 불활성화 FBS에 재현탁시키고, 이어서 50 ㎕의 표적 (2 × 104개의 세포/웰)을 96웰 U자형 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 추가의 50 ㎕를 다양한 농도의 항체와 함께 또는 상기 항체 없이 첨가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 인간 전혈 (100 ㎕)을 웰에 첨가하였다. 모든 샘플을 세 벌로 실시하였다. 플레이트를 200 g에서 3분 동안 원심분리하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 200 g에서 3분 동안 다시 원심분리하였다. 웰 당 총 20 ㎕의 상청액을 제거하고, 200 ㎕의 델피아(DELPHIA) 유로퓸-기반 시약 (퍼킨엘머)의 첨가에 의해 세포 용해를 측정하였다. 엔비전 2101 다중표지체 판독기 (퍼킨엘머)를 이용하여 형광을 측정하였다. 세포를 트리톤(Triton) X-100 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich))으로 처리함으로써 얻은 최대 세포독성 및 표적 세포 단독으로부터의 BATDA의 자발적인 방출에 의해 결정한 최소 대조군에 대하여 데이터를 정규화하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 v5.01을 이용하여 S자형 용량-반응 모델에 피팅시켰다.
인간 혈액의 존재 하에서의 WIL2-S의 동시 배양물은 IgG1을 사용하면 그리고 어느 정도는 IgG2 및 IgG2M4에 의해 표지 WIL2-S의 극심한 이펙터-매개 고갈을 나타냈다. 중요하게는, (Fab')2 및 Fab 항-CD20 단편 둘 모두는 약간의 수준의 WIL2-S 고갈을 유도하였으며, 이는 이펙터 기능을 회복시킬 수 있는 혈청 중 절단 IgG 자가항체의 존재를 나타낼 수 있다 (예를 들어, 문헌[Breski et al. 2008 J Immunol 181:3183-3192] 참조). 이전의 ADCC, CDC 및 ADCP 데이터와 일치하여, 유의한 또는 검출가능한 수준의 사이토카인 방출은 IgG2c4e에서 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 6: CD20 표적화에서의 생체 내 B 세포 생존성
IgG2c4e와 관련된 생체 내 이펙터 기능은 항-CD20의 확립된 사이노몰로구스 B-세포 고갈 모델을 이용하여 평가하였다 (문헌[Reff et al, 1994, Blood 83:435-445]).
사이노몰로구스 원숭이 (n=3마리/군)는 0.2 ㎎/㎏ 또는 2 ㎎/㎏의 IgG1 또는 IgG2Σ의 단회 볼루스 정맥내 용량 7일 전에 염수를 주사하였다. 주사 후 표기된 날에, 전혈 샘플로부터의 B 세포 수준을 각각 항-CD20 및 항-CD3을 마커로 이용하여 B 및 T 세포의 유세포 분석법적 분석에 의해 결정하였다. 각각의 군에 있어서의 평균 B-세포 수준 (CD20+/CD3-)을 주사 후 3주 동안 도시하였다 (도 9). 낮은 용량의 IgG1 (0.2 ㎎/㎏)은 주사한지 1일 후 모든 B-세포의 거의 완전한 고갈을 유도한 반면 (99%), 항-CD20 IgG2c4e에 의해서는 유의한 고갈이 유도되지 않았다 (군 내에서 평균 15%). B 세포 수준은 후속적인 날들에 걸쳐 항-CD20 IgG2c4e 처리 동물에 있어서 상대적으로 정상으로 남아있었으며, 후속적인 주 동안 IgG1 처리 원숭이에 있어서는 B 세포 수준의 회복쪽으로의 점진적인 추세가 관찰되었다. 중요하게는, IgG2c4e 및 IgG1 둘 모두는 2 ㎎/㎏의 더욱 높은 용량에서 B 세포의 거의 완전한 고갈을 유도하였다.
항-CD20 매개된 B-세포 고갈은 ADCC, CDC 및 아폽토시스(apoptosis)를 비롯한 몇몇 메커니즘에 의해 매개되는 것으로 생각된다. IgG2c4e에 의한 더욱 높은 용량(2 ㎎/㎏)에서의 B 세포의 고갈을 나타내는 원숭이 B-세포 고갈 데이터를 고려하여, B-세포 고갈의 기본 메커니즘을 단리 B-세포에서의 항체에 의해 유도된 아폽토시스의 수준의 측정에 의해 추가로 평가하였다.
단리된 B-세포를 0, 0.26, 2.6 및 26 ㎍/ml의 농도의 IgG1, IgG2c4e, (Fab')2 및 IgG2와, 비-결합 대조 mAb (BM21)로 4시간 동안 처리하고, 아넥신(Annexin) V 양성, 7AAD 음성 세포를 유세포 분석법에 의해 정량화하였다. 2.6 및 26 ㎍/ml의 특정 최종 농도를 선택하여, 0.2 및 2 ㎎/㎏의 볼루스 주사 후 혈청중 IgG의 개산된 최대 생체 내 농도를 반영하였다.
모든 3가지 결합 항체에 있어서, 아폽토시스의 용량 의존적 유도가 (Fab')2를 비롯한 모든 IgG에 대하여 관찰되었으며, 이는 항-CD20 매개된 가교결합이 더욱 높은 용량에서는 세포 사멸의 유도에 충분하지만 더욱 낮은 용량에서는 그러하지 못함 - IgG2c4e의 경우 - 을 나타냈다. 중요하게는, (Fab')2는 또한 Fc의 부재 하에 유의한 아폽토시스를 보였으며, 이는 항-IgG 매개된 아폽토시스가 Fc 매개된 가교결합과 관계 없이 유도될 수 있다는 견해를 확인해 주는 것인데, 이는 이전에 관찰된 바와 같았다.
따라서, 세포 상의 표적 항원의 가교결합과 관련된 정상적인 기능은 변경된 Fc 변이체에 의해 제거되지 않는다.
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Claims (17)

  1. 돌연변이된 IgG 불변 영역을 갖는 항체 Fc 도메인을 포함하고, 여기에서 EU 넘버링(numbering) 시스템에 의해 정의된 아미노산 잔기 233, 234, 235, 237 및 238은 PAAAP (서열 번호 4), PAAAS (서열 번호 5), 및 SAAAS (서열 번호 6)로부터 선택되는 서열을 포함하는, 야생형 Fc와 비교하여 적어도 하나의 Fcγ 수용체에 대한 친화성이 감소된 Fc-함유 분자.
  2. 제1항에 있어서, Fc 도메인이 EU 넘버링 시스템에 의해 정의할 때 돌연변이 H268A 또는 H268Q, V309L, A330S 및 P331S를 추가로 포함하는 Fc-함유 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 도메인이 FcRn에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc-함유 분자.
  4. 제1항에 있어서, Fc 도메인 서열이 인간 IgG2 중쇄 CH2 도메인과의 동일성이 90% 이상인 Fc-함유 분자.
  5. 제1항에 있어서, 항체 또는 Fc 융합 단백질인 Fc-함유 분자.
  6. 제1항에 있어서, 잔기 228이 S로부터 P로 돌연변이된 Fc-함유 분자.
  7. (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인, 및 (ii) 인간 면역글로불린 중쇄의 CH2 및 CH3 불변 도메인의 전부 또는 일부에 대하여 사실상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 EU 넘버링 시스템에 의해 정의된 잔기 233, 234, 235, 237 및 238은 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 결합 분자는 표적의 유의한 보체 의존성 용해 또는 세포 매개 파괴의 촉발(triggering) 없이 표적 분자에 결합할 수 있는 재조합 폴리펩티드 기반 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서, Fc 도메인이 FcRn에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, 결합 도메인이 항체의 결합 부위; 효소; 호르몬; 수용체; 사이토카인; 면역 세포 표면 항원; 리간드 및 부착 분자로부터 선택되는 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 친화력(avidity)을 나타내는 결합 분자.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 신경 조직, 내분비 조직, 맥관 조직, 심장 조직, 활막 조직, 피부 조직 또는 점막 조직 내의 표적에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  12. 대상 또는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 Fc-함유 단백질 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대식세포의 이동 및 집중을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법.
  13. 대상 또는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 Fc-함유 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 이식편 대 숙주 질환; 숙주 대 이식편 질환; 기관 이식 거부; 골수 이식 거부; 자가면역, 맥관염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판 감소증 및 관절염; 태아/신생아 동종면역성 혈소판 감소증 등의 동종면역; 천식 및 알러지; 만성 또는 급성 염증성 질환, 크론병(Crohn's Disease) 또는 경피증; 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 또는 관상 동맥 폐색증을 치료하는 방법.
  14. 대상 또는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 Fc-함유 분자를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 결합 분자는 환자에게 투여되거나 또는 선택적으로 환자가 태어나지 않은 아이일 경우 환자의 어머니에게 투여되는, 병태의 치료 방법.
  15. EU 넘버링 시스템에 의해 정의된 아미노산 잔기 233, 234, 235, 237 및 238이 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터 선택된 서열을 포함하는, IgG2 불변 영역을 기반으로 하며 EU 넘버링 시스템에 의해 정의할 때 돌연변이 H268A 또는 H268Q, V309L, A330S 및 P331S를 추가로 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하는, 야생형 Fc와 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 친화성이 감소된 Fc-함유 분자.
  16. EU 넘버링 시스템에 의해 정의된 아미노산 잔기 233, 234, 235, 237 및 238에서 IgG2 불변 영역을 기반으로 하는 Fc 도메인의 서열을 변경시켜 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터 선택되는 서열을 포함하게 하고, 돌연변이 H268A 또는 H268Q, V309L, A330S 및 P331S를 포함하게 하는 단계를 포함하는, 야생형 IgG2 기반 Fc와 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 IgG2 기반 Fc-함유 분자의 결합성을 변경시키는 방법.
  17. 본 명세서에 기재된 임의의 발명.
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