MX2012006243A - Mutantes fc del anticuerpo con ablacion de las funciones efectoras. - Google Patents

Mutantes fc del anticuerpo con ablacion de las funciones efectoras.

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Abstract

Las moléculas de anticuerpo y otras que contienen Fc con variaciones en la región Fc reducen la unión a los receptores de Fc gamma y la actividad resultante y pueden usarse en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos.

Description

MUTANTES FC DEL ANTICUERPO CON ABLACION DE LAS FUNCIONES EFECTORAS ANTECEDENTES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con las regiones constantes del anticuerpo de lgG2 humana (regiones Fe) mutadas de manera que pierdan sustancialmente la capacidad para unirse específicamente a los receptores de Fcy o activar las respuestas mitógenas por las células inmunes por el reticulamiento de los antígenos objetivo de superficie mediado por el receptor de Fe. La invención proporciona, además, anticuerpos nuevos en los cuales pueden incorporarse las regiones constantes de lgG2 mutadas.
Discusión del campo técnico Los anticuerpos que se dirigen a antígenos de superficie celular desencadenan funciones efectoras e inmunoestimulantes no deseadas asociadas con el acoplamiento del receptor de Fe (FcR) en las células inmunes y la activación del complemento. Como los anticuerpos terapéuticos y los constructos de fusión-Fc pretenden dirigir y activar o neutralizar las funciones del ligando objetivo pero no dañar o destruir las células o tejidos locales que son necesarios, se buscan mutantes Fe con funciones efectoras con ablación.
Los isotipos de IgG humana (las subclases de los anticuerpos clase G de gamma globulina madura; lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4) exhiben capacidad diferencial para recrudecer las funciones inmunes, tales como citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC, por ejemplo, lgG1 e lgG3), fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4), y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por ejemplo, lgG1 , lgG3). El acoplamiento isotipo-específico de tales funciones inmunes se basa en la selectividad por los receptores de Fe en distintas células inmunes y la capacidad de unirse a C1q y activar el ensamble de un complejo de ataque a la membrana (MAC). Entre los diversos isotipos, la afinidad relativa por los receptores de Fcy (por ejemplo, FcyRI, FcYRIIa/b/c, FcyRIIIa/b) es alta para lgG1 e lgG3; sin embargo, existe una afinidad mínima por lgG2 (restringido al polimorfismo FcyRIIa 131H), e lgG4 solamente tiene afinidad medible por FcyRI. Mediante el uso del análisis comparativo de secuencias y estructuras del co-cristal, los residuos claves de contacto para la unión del receptor se mapearon para los residuos de aminoácidos en el intervalo de la región bisagra inferior y CH2. Mediante el uso de técnicas de modificación de proteína estándar, se logró cierto éxito en mejorar o reducir la afinidad de una preparación de anticuerpo para los receptores de Fe y el componente C1q del complemento.
Entre los isotipos, la lgG2 es menos capaz de unirse a la familia de los receptores de Fe. Mediante el uso de lgG2 como un punto de partida, se hicieron esfuerzos por encontrar un mutágeno con funciones efectoras disminuidas pero que mantuviera la unión FcRn, estabilidad prolongada, y baja inmunogenicidad. Los mutantes mejorados de esta naturaleza pueden proporcionar compuestos terapéuticos de anticuerpo mejorados y que mantengan la seguridad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones de dominios constantes de inmunoglobulina glicosilada, modificados, útiles en el diseño de anticuerpos o similares a anticuerpos terapéuticos, tales como aquellos que comprenden una región Fe, y ligandos objetivo de superficie celular. La composición de la invención es un mutante Fe de lgG2 que exhibe una capacidad de unión a FcyR disminuida pero que conserva la unión a FcRn. Estos mutantes Fe de IgG posibilitan objetivos terapéuticos de antígenos de superficie celular o soluble mientras minimizan el acoplamiento de la función efectora inmune asociado a Fe y la citotoxicidad mediada por el complemento. En un aspecto, el mutante Fe de lgG2 comprende V234A, G237A, P238S de acuerdo con el sistema de numeración EU. En otro aspecto, el mutante Fe de lgG2 comprende V234A, G237A, H268Q o H268A, V309L, A330S, P331 S de acuerdo con el sistema de numeración EU. En un aspecto particular, el mutante Fe de lgG2 comprende V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331 S y, opcionalmente, P233S de acuerdo con el sistema de numeración EU.
En una modalidad, las composiciones del mutante Fe de lgG2 se usan en indicaciones donde la retención de la vida media del anticuerpo terapéutico (o fusión-Fc) se conserva a través de interacciones con FcRn, mientras que la toxicidad potencial derivada de la activación de los FcyR asociada con las funciones efectoras e inmunes tales como i) citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC), ii) citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), iii) fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP), iv) activación celular mediada por FcR (por ejemplo, liberación de citocina a través del entrecruzamiento FcR), y v) activación/reducción plaquetaria mediada por FcR se minimiza o elimina. En un aspecto, las mutaciones Fe lgG2 se incorporan en los anticuerpos terapéuticos o fusiones-Fc de los aglomerantes, tales como aglomerantes multivalentes, ligandos objetivos en las células involucradas en los trastornos neurológicos, tal como el ganglio basal; trastornos del sistema inmune tales como los relacionados con la activación de la célula B o la célula T, o con las células involucradas en la reparación o curación de tejidos, tales como los fibroblastos o las células madre.
En otra modalidad, el mutante Fe de lgG2 comprende una composición farmacéutica. En otra modalidad el mutante Fe de lgG2 comprende una porción de una molécula farmacéuticamente activa. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el mutante Fe de lgG2 o moléculas que comprenden el mutante Fe de lgG2 activas son útiles para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por la migración y concentración de macrófagos o monocitos. En un aspecto, las moléculas que comprenden el mutante Fe de lgG2 son útiles para unir un objetivo con un tejido neurológico, un tejido endocrino, un tejido vascular, un tejido cardiaco, un tejido sinovial, un tejido dérmico, o un tejido mucoso. Uno de los muchos usos de los mutantes Fe de lgG2 de la invención se encuentra en el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped; enfermedad del huésped contra el injerto; rechazo al trasplante de órganos; rechazo al trasplante de médula ósea; autoinmunidad tal como vasculitis, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune y artritis; aloinmunidad, tal como trombocitopenia aloinmune fetal/neonatal; asma y alergia; enfermedades inflamatorias agudas o crónicas tales como la enfermedad de Crohn o esclerodermia; enfermedad de Alzheimer, oclusión de la arteria coronaria.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácido de lgG2 humana tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 ), lgG4 (SEQ ID NO: 2), e lgG1 (SEQ ID NO: 3) que muestra la numeración EU correspondiente para cada residuo; la región bisagra de lgG2 comienza en el residuo EU 218.
La Figura 2 muestra la estructura de un fragmento Fe que muestra las posiciones de superficie de los residuos modificados (numeración EU).
Las Figuras 3A-3C son gráficos que muestran la competencia de cada isotipo y mutante construido como un anticuerpo de unión anti-Her2/neu con el anticuerpo del isotipo lgG1 humano tipo silvestre por medio del uso de la plataforma de ensayo de bolillas AlphaScreen: FcgRI (no se muestra), FcgRIIa (figura 3A), FcgRllb (figura 3B), FcgRllla (no se muestra), y FcRn (figura 3C).
Las Figuras 4A-4C son gráficos que muestran la unión directa de cada isotipo y mutante construido como un anticuerpo de unión anti-Her2/neu por medio del uso del ensayo de bolillas AlphaScreen: FcgRllla (figura 4A), FcgRI (figura 4B), y FcgRIIa (figura 4C).
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo ADCC y los isotipos y mutantes seleccionados construidos como un anticuerpo de unión anti-Her2/neu y mediante el uso de PBMC humanas (25X exceso) y células de cáncer de mama SK-Br3 como objetivos.
La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo CDC de constructos anti-CD20 seleccionados por medio del uso del complemento humano y células de linfoma WIL2-S como objetivos.
La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo ADCP a partir de un análisis de citometría de flujo de constructos anti-Her2/neu seleccionados por medio del uso de células objetivo Sk-Br3 y macrófagos GM-CSF-diferenciados.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la liberación de citocina (TNFa) a partir de 24 horas después de la estimulación de las PBMC con bolillas unidas a los isotipos IgG para varios constructos, que incluyen lgG2 tipo silvestre y seis mutantes.
La Figura 9 es un gráfico de los números promedio de linfocitos B circulantes durante el tiempo en grupos de monos cynomologous inyectados con constructos de anticuerpo del dominio de unión anti-CD20 con varias regiones Fe o carentes de un región Fe (Fab')2.
BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Abreviaturas ADCC = citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo; ADCP, fagocitosis celular dependiente del anticuerpo; CDC = citotoxicidad dependiente del complemento; IgG = inmunoglobulina G; ITA = motivo de activación de inmunoreceptor basado en tirosina; ITIM = motivo de inhibición de inmunoreceptor basado en tirosina; Mab = anticuerpo monoclonal; FDCR = liberación de citocina dependiente de Fe; FcgR, FcgR, o FcgammaR = receptor de Fe gamma Definiciones v Explicación de la terminología "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada se une a los receptores de Fe (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) que posibilitan que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula objetivo que porta el antígeno y, posteriormente, mata la célula objetivo con las citotoxinas. Los anticuerpos IgG de alta afinidad al ligando específico que se dirigen a la superficie de las células objetivo estimulan las células citotóxicas y se requieren absolutamente para esta muerte. La lisis de la célula objetivo es extracelular, requiere el contacto directo célula-a-célula, y no involucra al complemento.
Puede probarse la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar la lisis de la célula objetivo por ADCC. Para evaluar la actividad ADCC, se añade un anticuerpo de interés a las células objetivo que muestran el ligando objetivo en combinación con las células efectoras inmunes, las que pueden activarse por los complejos antígeno anticuerpo lo que resulta en la citolisis de la célula objetivo. La citolisis se detecta generalmente por la liberación del marcador (por ejemplo, sustratos radioactivos, colorantes fluorescentes o proteínas ¡ntracelulares naturales) de las células Usadas. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Los ejemplos específicos de ensayos ADCC in vitro se describen en Wisecarver y otros, 1985, 19:211 ; Bruggemann y otros, 1987, J Exp Med 166:1351 ; Wilkinson y otros, 2001 , J Immunol Methods 258:183; Patel y otros, 1995 J Immunol Methods 184:29 (cada uno de estos se incorpora como referencia). Alternativamente, o además, la actividad ADCC del anticuerpo de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes y otros, 1 98, PNAS USA 95:652, el contenido del cual se incorpora como referencia en su totalidad.
"Citotoxicidad dirigida por el complemento" o CDC se refiere a la forma de citotoxicidad en la cual la cascada del complemento se activa por la unión del componente C1q del complemento al anticuerpo Fe.
Los términos "Fe," "proteína que contiene Fe" o "molécula que contiene Fe", como se usan en la presente descripción, se refieren a una proteína monomérica, dimérica o heterodimérica que tiene al menos un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulina. Los dominios CH2 y CH3 pueden formar al menos una parte de la región dimérica de la proteína/molécula (por ejemplo, anticuerpo).
El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente descripción, es una forma específica de la proteína que contiene Fe que comprende al menos un dominio de unión al ligando el cual mantiene homología sustancial con al menos uno de un dominio variable del anticuerpo de cadena ligera o pesada de al menos una especie de anticuerpo animal.
"Región Fe de lgG2 humana tipo silvestre" se refiere a una región Fe de lgG2 humana que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de esta, la cual es del residuo K2 8 al residuo K447 de la cadena pesada de IgG humana, de acuerdo con la numeración EU de Kabat. Los aminoácidos en la región constante se enumeran por el alineamiento con el anticuerpo lgG1 humano, EU lgG1 (SEQ ID NO: 3) (ver Cunningham y otros, 1970 J. Biol. Chem., 9: 3161-70). Es decir, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo se alinean con las cadenas ligera y pesada de EU para maximizar la identidad de la secuencia de aminoácido y a cada aminoácido en el anticuerpo se le asigna el mismo número que el aminoácido correspondiente en EU. El sistema de numeración EU se usa convencionalmente en la materia (ver generalmente, Kabat y otros, Sequences of Protein of Immunological Interest, NIH, publicación núm. 91-3242, US Department of Health and Human Services (1991)). De acuerdo con esta convención, la región constante "lgG2 tipo silvestre" descrita carece de un aminoácido en la posición 236 (Figura 1 , SEQ ID NO: 1).
Información general La presente invención se motivó por un interés en identificar un dominio Fe para usar en la fabricación de anticuerpos terapéuticos, fusiones-Fe, y biofarmacéuticos similares con seguridad mejorada en términos de la incapacidad para provocar la liberación de citocina o dañar o matar las células de exposición al ligando objetivo y los tejidos que rodean las células objetivo.
Los anticuerpos del isotipo lgG4 humano y las proteínas de fusión-Fc no provocan ADCC significativa (por las NK, que expresan exclusivamente FcgRIIIa), pero si mantienen la capacidad para inducir la fagocitosis (ADCP) por los macrófagos (que expresan FcyRI, Ha y Illa) y posiblemente activan los monocitos cuando están en un complejo inmune y atribuible para la distribución de los FcyR de activación en células inmunes específicas. Los esfuerzos para minimizar la actividad residual resultó en un desarrollo de y uso de mutantes que comprenden V234A, L235A (ala/ala) en el Fe de lgG4 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).
Armour y otros generaron múltiples mutaciones puntuales en lgG2 para minimizar la unión a FcgRI (Armour y otros, 1999) y FcgRIIa y Illa (Armour y otros 2003). Las mutaciones adicionales descritas en la solicitud de patente de Mueller y otros (PCTWO97/1 1971 ) se derivan de los híbridos de lgG2/lgG4, que consisten en un dominio CH2 de lgG2 y uno CH3 de lgG4, específicamente los residuos 330 y 331 son de lgG4 en los mutantes lgG2 de la presente invención. Además, se usaron esfuerzos de mutación o silenciamiento para diminuir los efectos inmunoestímulantes. La lgG2 o lgG4 o el dominio se intercambiaron entre las dos subclases para generar mAb con función efectora mínima en lgG1 (SEQ ID NO: 3) (Tao y otros, 1991 ). La solicitud de patente de Strohl (US2007/0 48167) describe cuatro mutaciones en lgG2 en las posiciones EU de los residuos 268, 309, 330 y 331. Shields y otros (2001) describe una sustitución adicional, H268A.
La presente invención es una demostración para las cuatro primeras sustituciones en múltiples posiciones de las regiones constantes de lgG2 (Fe) con los residuos de lgG4 H268Q o A, V309L, A330S y P331 S de acuerdo con sistema de numeración EU/Kabat. La selección dirigida de múltiples sustituciones de residuos proporcionó inesperadamente un dominio Fe funcional para usar en el diseño del anticuerpo y se usó como un polipéptido de fusión así como la posibilidad de proporcionar una entidad terapéutica que está desprovista de función efectora medible.
Los mutantes de lgG2 multi-sustituidos se seleccionaron sobre la base de sus afinidades relativas para los FcR humanos (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcYRIIIa y FcRn) evaluados por ensayos de competencia Alpha Screen y análisis SPR/Biacore. Estos mutantes se probaron y clasificaron después en los sistemas celulares adecuados para su capacidad de inducir CDC, ADCC y ADCP así como desencadenar la secreción de TNF-a por las PBMC. En el conjunto de datos experimentales que se proporcionan en la presente descripción, los mutantes de lgG2 se compararon con las preparaciones o mutantes conocidos que incluyen; lgG1 ag e lgG4 Ala/Ala adicionalmente a lgG1 e lgG2 tipo silvestre. Otros análisis de estos mutantes en varios bioensayos in vitro demostraron niveles mínimos a indetectables de la actividad y gran ablación de la afinidad de unión por los FcR. Basado en esas selecciones, se identificó que un mutante Fe de lgG2, designado como lgG2c4d, no tenía afinidad detectable o avidez por los FcR (unión al ligando monomérico contra bi- multimérico) y está desprovisto de actividad en los diversos bioensayos efector/inmunoestimulante antes mencionados. El Fe lgG2c4d comprende las sustituciones alanina, serina, y leucina: V234A, G237A, P238S, H28A, V309L, A330S, P331 S (numeración EU). El residuo siete sustituido lgG2, lgG2c4d, puede considerarse el primer Fe verdaderamente "silenciado" en su incapacidad de unirse a los FcR, mediar las funciones efectoras, o engranar la liberación de citocina mediada por Fe.
Basado en el presente descubrimiento, los subconjuntos de siete mutaciones de lgG2c4d pueden usarse, o combinarse con otros mutantes de aminoácido, o las mutaciones pueden usarse en otro isotipo IgG para alcanzar el silenciamiento similar o selectivo de las funciones efectoras como se enseña en la presente descripción y combinado con lo que se conoce en la materia.
Como se ejemplificó específicamente en la presente descripción, las sustituciones triples V234A, G237A, P238S reducen la afinidad de unión a FcYRIIa y la avidez de unión a FcyRIIa y destruyen la ADCP y la liberación de citocina dependiente de Fe mientras que mantienen la afinidad de unión a FcRn de la molécula.
CUADRO 1 Sumario de la afinidad de unión relativa por biacore.
CUADRO 2 Sumario de la avidez relativa.
CUADRO 3 Sumario de las funciones efectoras y liberación de citocina (CR).
Método para preparar moléculas que contienen Fe alteradas Los sitios para la sustitución se seleccionaron en base al deseo de producir una composición con las características estructurales de un anticuerpo Fe nativo, unión a FcRn conservada, buena estabilidad, y una capacidad disminuida para estimular la cascada del complemento, lisis celular, fagocitosis celular o liberación de citocina.
Ya que las clases de anticuerpos IgG son bivalentes, tienen dos dominios Fv completos que consisten en los dominios variables pesado y ligero en asociación funcional. La bivalencia proporciona efectos de avidez así como la capacidad de entrecruzar el antígeno objetivo o receptores de Fe en las mismas células o en otras células distintas, y provocan así un espectro de bioactividades de los anticuerpos dirigidas a la unión del receptor específico no objetivo. Por esta razón, los mutantes Fe de la presente invención se probaron dentro de un "contexto de avidez" lo que significa que los mutantes Fe de IgG se multimerizaron en una superficie y se probaron para la interacción con un multímero de los receptores de Fe específico.
Caracterización biológica de los mutantes Las proteínas que contienen Fe pueden compararse para la funcionalidad por muchos ensayos in vitro que se conocen bien. Particularmente, es de interés la afinidad por los miembros de la familia FcyRI, FcyRI I, y FCYRIII de los receptores de Fcy. Estas mediciones pueden realizarse por medio del uso de formas solubles recombinantes de los receptores o las formas asociadas a las células de los receptores. Adicionalmente, la afinidad por FcRn, el receptor responsable de la vida media circulante prolongada de las IgG, puede medirse, por ejemplo, por medio del uso de un formato de bolilla de unión al ligando de "ALPHASCREEN" por medio del uso de FcRn soluble recombinante. El ALPHASCREEN, usado en el análisis de alta productividad, es una tecnología de ensayo homogénea que permite la detección de eventos moleculares tales como la unión. Las bolillas "dadoras" y "aceptoras" recubiertas son la base de la tecnología del ensayo. Al igual que un ensayo basado en bolillas, ALPHASCREEN funciona a través de la interacción de las bolillas en estrecha proximidad, lo que resulta en una cascada de reacciones químicas que actúan para producir una señal muy amplificada. Las mediciones directas o indirectas, por ejemplo, unión competitiva, pueden aplicarse para evaluar las afinidades relativas y avidez entre las proteínas.
La evolución natural de los isotipos de IgG humana (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4), permitió a cada uno exhibir un espectro de capacidades diferentes para reclutar funciones inmunes, tales como la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC, por ejemplo, lgG1 e lgG3), fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4), y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por ejemplo, lgG1 , lgG3). El acoplamiento isotipo-específico de estas funciones se basa en la selectividad diferencial por los receptores de Fe que residen en distintas células inmunes, así como la capacidad de unirse a C1q y activar el ensamble de un complejo de ataque a la membrana (MAC) que resulta en CDC y CDP (fagocitosis dependiente del complemento) a través de los componentes del complemento de unión al receptor específicos en los macrófagos efectores. La jerarquía de la capacidad de unir el componente inicial, C1q, de la cascada del complemento, de los isotipos humanos es lgG1 >lgG3>lgG2>lgG4 aunque la activación del complemento por lgG2 e lgG4 en la infección microbiana está bien documentada.
Los ensayos funcionales basados en células, tales como los ensayos ADCC y los ensayos CDC, proporcionan una percepción de las consecuencias funcionales probables de las estructuras de la variante particular. La citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) es una reacción mediada por la célula en la que las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores de Fe (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo de unión en una célula objetivo y posteriormente causan la lisis de la célula objetivo. En una modalidad, el ensayo ADCC se configura para tener células NK como la célula efectora primaria, lo que refleja los efectos funcionales en FCYRIIIA que es el único receptor tipo FCY que se conoce para expresase por estas células.
Los ensayos de fagocitosis pueden usarse, además, para comparar las funciones inmunoefectoras de diferentes mutantes, ya que los ensayos pueden medir esas respuestas celulares, tales como la liberación del mediador inflamatorio o superóxido. Los modelos in vivo probaron su utilidad en el estudio de las variantes Fe. Por ejemplo, como se demostró por medio del uso de los mutantes de los anticuerpos anti-CD3 para medir la activación de células T en ratones, una actividad que es dependiente de los dominios Fe que se acoplan a ligandos específicos, tal como los receptores Fcy. El anticuerpo dirigido a la activación de los macrófagos media la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP), y causa que las células objetivo opsonizadas se ingieran y digieran por los macrófagos. Los macrófagos diferenciados in vitro que expresan altos niveles de FcR pueden diferenciarse en el fenotipo M1 mediante el uso de IFNy o GM-CSF para niveles elevados expresados de todos los FcR (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa) con relación a los monocitos. Aquellos con experiencia en la materia de la modificación de anticuerpos conocen tales ensayos.
Método para preparar el anticuerpo Los procesos recombinantes de rutina se usaron para crear mutaciones dirigidas en las secuencias por los dominios constantes de lgG2 humana usados como el punto de partida en la generación y prueba de los mutantes Fe. Aquellos con experiencia en la materia apreciarán que pueden usarse varias técnicas para crear cambios en las secuencias codificantes para crear vectores adecuados para la expresión de las secuencias de aminoácido deseadas en una variedad de células huésped para la recuperación y prueba.
Selección de la célula huésped o modificación de la célula huésped Como se describe en la presente descripción, la célula huésped escogida para la expresión del anticuerpo monoclonal o proteína que contiene Fe recombinante es un contribuyente importante para la composición final, que incluye, sin limitarse a, la variación en la composición de las porciones de oligosacárido que decoran la proteína en el dominio CH2 de la inmunoglobulina. Así, un aspecto de la invención involucra la selección de células huéspedes adecuadas para el uso y/o desarrollo de una célula de producción que expresa la proteína terapéutica deseada.
Más aún, la célula huésped puede ser de origen mamífero o puede seleccionarse de células COS-1 , COS-7, HEK293, BHK21 , CHO, BSC-1 , Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, linfoma, levadura, insecto o planta, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de estas.
Alternativamente, la célula huésped puede seleccionarse de una especie u organismo incapaz de glicosilar los polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariótico, tal como de E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp. natural o modificado.
Anticuerpos Un anticuerpo descrito en esta solicitud puede incluir o derivarse de cualquier mamífero, tal como, pero sin limitarse a, un humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, una cabra, o cualquier combinación de estos e incluye anticuerpos aislados humanos, de primate, roedor, mamífero, quimérico, humanizado y/o anticuerpos ¡njertados-CDR, inmunoglobulinas, productos de clivaje y otras porciones especificadas y variantes de estos.
Los anticuerpos, las proteínas que comprenden Fe, o los fragmentos Fe descritos en la presente descripción pueden derivarse de muchas formas que se conocen bien en la materia. En un aspecto, los anticuerpos se obtienen convenientemente a partir de hibridomas preparados por inmunización de un ratón u otro animal con los péptidos objetivo, células o extractos de tejido. Los anticuerpos pueden obtenerse así por medio del uso de cualquier técnica de hibridoma conocida en la materia, ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989) que se incorpora completamente en la presente descripción como referencia.
Los anticuerpos o proteínas de fusión Fe o los componentes y dominios de estos pueden obtenerse, además, a partir de la selección de genotecas de esos dominios o componentes, por ejemplo, una genoteca de fagos. Una genoteca de fagos puede crearse al insertar una genoteca de oligonucleótidos aleatorios o una genoteca de polinucleótidos que contiene secuencias de interés, tal como a partir de los linfocitos B de un animal o un humano inmunizado (Smith, G. P. 1985. Science 228: 1315-1317). Las genotecas de fago del anticuerpo contienen pares de región variable de cadena pesada (H) y ligera (L) en un fago y permiten la expresión de fragmentos Fv o fragmentos Fab de cadena sencilla (Hoogenboom, y otros 2000, Immunol. Today 21 (8) 371-8). La diversidad de una genoteca de fagómidos puede manipularse para aumentar y/o alterar las inmunoespecificidades de los anticuerpos monoclonales de la genoteca para producir y posteriormente identificar anticuerpos monoclonales humanos deseables, adicionales. Por ejemplo, los genes que codifican la molécula de inmunoglobulina de cadena ligera (L) y pesada (H) pueden mezclarse aleatoriamente (barajado) para crear nuevos pares HL en una molécula de inmunoglobulina ensamblada. Adicionalmente, uno o los dos genes que codifican la cadena H y L pueden mutagenizarse en una región determinante de complementariedad (CDR) de la región variable del polipéptido de inmunoglobulina, y posteriormente seleccionarse para las capacidades de afinidad y neutralización. Las genotecas de anticuerpos pueden crearse, además, sintéticamente al seleccionar una o más secuencias marco humanas e introducir colecciones de casetes de CDR derivados de repertorios de anticuerpos humanos o a través de una variación diseñada (Kretzschmar y von Ruden 2000, Current Opinión in Biotechnology, 13:598-602). Las posiciones de diversidad no se limitan a las CDR, sino que pueden incluir, además, los segmentos marco de las regiones variables o pueden incluir regiones variables distintas del anticuerpo, tales como los péptidos.
Otras genotecas de componentes de unión objetivo que pudieran incluirse además de las regiones variables del anticuerpo son la exhibición de ribosoma, exhibición de levadura, y exhibiciones de bacterias. La exhibición de ribosoma es un método para traducir ARNm en sus proteínas cognadas mientras mantiene la proteína unida al ARN. La secuencia codificante de ácido nucleico se recupera por RT-PCR (Mattheakis, L.C. y otros 1994. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 , 9022). La exhibición de levadura se basa en la construcción de proteínas de fusión del receptor de adhesión de la levadura alfa-aglutinina asociado a la membrana, agal y aga2, una parte del sistema de tipo de apareamiento (Broder, y otros 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7). La exhibición de bacterias se basa en la fusión del objetivo a las proteínas bacterianas exportadas que se asocian con la membrana celular o pared celular (Chen y Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503).
En comparación a la tecnología del hibridoma, los métodos de exhibición de fago y otros anticuerpos proporcionan la oportunidad de manipular la selección contra el antígeno objetivo in vitro y sin la limitación de la posibilidad de los efectos del huésped en el antígeno o viceversa.
La invención proporciona, además, ácidos nucleicos que codifican las composiciones de la invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión que incluyen los vectores compatibles con la expresión, secreción y/o exhibición de fagos filamentosos, procarióticos o eucarióticos de las composiciones o los mutágenos dirigidos de estos.
Uso de las moléculas que contienen Fe Las composiciones (anticuerpo, fusiones Fe, fragmentos Fe) generadas por cualquiera de los métodos anteriormente descritos pueden usarse para diagnosticar, tratar, detectar, o modular enfermedades humanas o patologías específicas en las células, tejidos, órganos, fluido, o, generalmente, un huésped. Como se enseña en la presente descripción, la modificación de la porción Fe de un anticuerpo, proteína de fusión-Fc, o fragmento Fe para reducir o extirpar la unión del receptor gamma de Fe y las funciones efectoras especificadas, pero donde el anticuerpo mantiene las propiedades objetivo originales, proporciona anticuerpos y constructos Fe con un espectro de actividades superior, propiedades biofísicas, estabilidad y capacidad para persistir en el cuerpo de un huésped.
Las enfermedades o patologías que pueden ser susceptibles de tratamiento mediante el uso de una composición proporcionada por la invención incluyen, pero sin limitarse a: trastornos neurológicos, tales como pero sin limitarse a enfermedad de Alzheimer y que incluyen dolor neuropático; enfermedad dermatológica; enfermedades metabólicas; osteoartritis; y afecciones resultantes de quemaduras o lesiones; trastornoscardiovasculares que incluyen, pero no se limitan a, infarto del miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, ataque, ataque isquémico, y hemorragia; así como trastornos generales mediados por el sistema inmune, que incluyen las enfermedades reumáticas, soriasis, y esclerodermia.
Aunque la invención se describió en términos generales, las modalidades de la invención se describirán adicionalmente en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.
EJEMPLO 1 Construcción de v prueba de mutantes Fe Una serie de constructos con derivados mutados de un anticuerpo lgG2 humano como se muestra en el cuadro 4 se construyeron por medio del uso de métodos recombinantes estándar. Para los anticuerpos con dominios variables completos, las secuencias CDR conocidas de anticuerpos anti-HER2 y anti-CD20 se usaron para construir el isotipo y mutantes Fe como se indicó. Los mutantes del anticuerpo se expresaron transitoriamente en células 293T mediante el uso de clonación estándar y procedimientos de expresión. Los MAb se purificaron por medio del uso de columnas de proteína A para una homogeneidad mayor que 95 % antes de los análisis experimentales adicionales.
CUADRO 4 Estudios Biacore de afinidades Los experimentos de resonancia del plasmón de superficie se realizaron por medio del uso de un biosensor óptico Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia; actualmente parte de GE Healthcare). Los experimentos se realizaron a 25 °C en amortiguador D-PBS que contenía 3 mM EDTA y 0.01 % surfactante P20. Para analizar la interacción de los receptores con los mutantes Fe se generó una superficie de captura por acoplamiento covalente de IgG anti-His de ratón (R&D systems cat. núm. MAB050) a un chip sensor CM-5. El Ab anti-His se diluyó en 10 mM de amortiguador de acetato sódico pH 4.5 (Biacore AB) y se acopló a la superficie de dextrano carboximetilada del chip CM-5 (~3000 RU) según las instrucciones del fabricante para la química del acoplamiento amina. Los grupos reactivos restantes en la superficie se desactivaron por medio del uso de etanolamina-HCI. Para realizar los experimentos cinéticos, se capturaron las unidades de respuesta (RU) 165, 351 y 208 de FcyRI, FcyRII y FcyRIII, respectivamente, en esta superficie. A la captura del receptor siguió la inyección de una dilución en serie de los mutantes Fe o tipo silvestres (de 4000 nM a 3.9 nM en etapas de dilución de 4 veces) a 30 ul/min. Esta fase de asociación se monitoreó por 3 minutos. A esto siguió un flujo de amortiguador por 20 minutos para monitorear la disociación de la unión. La superficie de captura se regeneró mediante el uso de un pulso de 9 segundos de 100 mM de ácido fosfórico a 100 ul/min seguido por la inyección del amortiguador de corrida.
La sustracción de la doble referencia de los datos se realizó para corregir la contribución del amortiguador para la señal y ruido del instrumento (Myszka 1999) mediante el uso del programa Scrubber versión 1 .1g (BioLogic Software) como referencia. Después de este procesamiento inicial de los datos, se realizó el análisis cinético de los datos mediante el uso del programa de evaluación BIA, versión 4.0.1 (Biacore, AB) y se asumió un modelo de unión simple 1 :1.
Estudios de unión y AlphaScreen La unión de competencia y la unión directa de los IgG a varios FcyRs se evaluó por medio del uso del ensayo de unión basado en bolillas homogéneas, AlphaScreen™ (PerkinElmer, Waltham, MA). En resumen, los experimentos se llevaron a cabo como se describió previamente (Lazar y otros 2006 Proc Nati Acad Sci U S A 103(11): 4005-10) con modificaciones menores. FcyRI, lia, se compraron a R&D systems. FcyRIIIa y FcRn se clonaron, se expresaron y purificaron. Los mutantes Fe de IgG se probaron en unión de competencia contra CNT06234 biotinilado (un anticuerpo de la subclase lgG1 humano control no específico) o anti-Her2/neu (un anticuerpo lgG2 humano) que se biotinilaron mediante el uso de NLS-biotina, Pierce, relación 2:1.
En los estudios de unión de competencia, los anticuerpos biotinilados se añadieron a una concentración final del ensayo de 200 ng/ml, seguido por los anticuerpos de la prueba de competencia a concentraciones finales diseñadas especificadas en cada figura experimental. Los FcyR se añadieron a una concentración final de 200 ng/ml a placas de 96-pocillos, seguido por la adición en serie de bolillas donantes de estreptavidina y aceptoras de Ni-quelato. Después de sellar las placas y agitar a temperatura ambiente, las placas se leyeron por medio del uso de un lector de placa Envision y los datos se graficaron y trazaron en GraphPad Prism. Los estudios de avidez se llevaron a cabo de forma similar a los estudios de completamiento, con la excepción de que las moléculas IgG de prueba se biotinilaron a una relación 2:1 y la unión de FcR directa se evaluó en ausencia de competencia contra un anticuerpo control. Resultados Las afinidades relativas de las variantes IgG para los FcR (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, and FcYRIIIa) humanos evaluados por análisis SPR/Biacore y derivados de los sensogramas se muestran en el cuadro 5.
CUADRO 5 Datos Biacore para la interacción de mutantes Fe con receptores de Fe.
Estos números corresponden a los parámetros generados para el ajuste global de un experimento.
Para estos 4 conjuntos de datos, las afinidades se obtuvieron al realizar un ajuste mediante el uso de un ajuste cinético de modelo de unión 1 :1 simple. Para todos los otros, las afinidades se obtuvieron al realizar un ajuste por medio del uso de un análisis de afinidad de unión en estado estable 1 :1 simple.
Las afinidades relativas de los mutantes IgG para los FcR humanos (FcYRIIa, FcYRIIb, y FcRn) en un contexto de avidez, o sea, para la unión al anticuerpo bivalente para un campo objetivo denso, medido mediante el uso de ensayos de competencia Alpha Screen™ con lgG1 humano (CNTO6234) se muestran en las Figuras 3A-3C, respectivamente.
Los datos experimentales demostraron que los mutantes lgG2 así como lgG1 ag e lgG4 Ala/Ala muestran una afinidad de unión significativamente disminuida a los receptores de Fe gamma comparado con lgG1 , mientras que mantienen su capacidad de unión a FcRn (el receptor neonatal de Fe que confiere vida media in vivo). Específicamente, en la unión de competencia contra lgG2 y en la unión a FcgRIIa en el intervalo de afinidad alta a más baja, la secuencia es como sigue: lgG1 >lgG2c4a>lgG2m4>lgG2=lgGc4c>lgG2c4b>lgG4 ala/ala>lgG4 agly>lgG2c4d. Esta secuencia es consistente en competencia contra lgG1 (CNTO6234) en la unión a FcgRIlb. Otros análisis de unión de competencia contra lgG1 (CNT06234) en la unión a FcRn a pH 6.4 indicaron que todos los isotipos y mutantes se unen relativamente igual a FcRn. En gran medida, lgG2c4d e lgG1 agly muestran una unión detectable mínima, si hubiera, a FcgRIIa y FcgRIlb.
EJEMPLO 2 ADCC y CDC CDC se inicia en tres categorías de ruta: dependiente de anticuerpo (ruta clásica), dependiente de polisacárido (dependiente de lectina), y estructuras de superficie externa (ruta alternativa), y todas producen una cascada de etapas proteolíticas que conducen al ensamble de un complejo de ataque a la membrana que culmina en la célula objetivo o lisis microbiana (ref. W.E. Paul Immunology). Un subconjunto de isotipos y mutantes Fe descritos en el Ejemplo 1 se prepararon por medio del uso de los dominios variables de un anticuerpo anti-CD20 y se evaluaron para su capacidad de lisar las células objetivo de linfoma de linfocitos B WIL2-S en presencia de suero humano. El Rituxan® comercialmente disponible, un anti-CD20 terapéutico conocido para mediar la CDC de células WIL2-S se usó como un control positivo para la lisis. Para el análisis de la CDC, las células objetivo WN2-S se sembraron en una placa de 96 pocilios, incubadas con complemento de suero humano (1/6 dilución) y la viabilidad celular relativa se evaluó por medio del uso de AlamarBIue.
El ensayo de la CDC se realizó por medio del uso del dominio variable anti-HER2/neu combinado con varios dominios Fe de isotipos o variantes de IgG diferentes como se describió en el Ejemplo 1 y células de cáncer de mama SkBr3 como objetivos. Los ensayos se llevaron a cabo como se describió anteriormente por medio del uso del método EuTDA de detección de lisis celular (PerkinElmer, Waltham, MA). Las células objetivo de cáncer de mama SkBr3 cargadas en TDA se sembraron en placas de 96 pocilios de fondo en U, se opsonizaron con concentraciones designadas de anticuerpos y se co-cultivaron con un exceso de 25x de PBMC aislados de paquetes leucocitarios a 37 °C. Después de 3 horas, las placas se centrifugaron, y los sobrenadantes se analizaron para la liberación de TDA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos iniciales se normalizaron y trazaron mediante el uso de GraphPad Prism. Para el análisis de la CDC, las células objetivo WN2-S se sembraron a 50,000 por pocilio de una placa de 96 pocilios, se incubaron con complemento de suero humano (1/6 dilución) y la viabilidad celular relativa se evaluó por medio del uso de AlamarBIue.
Resultados El ADCC, el cual se acopla fundamentalmente a FcgRIIIa en las células NK, fue indetectable para la serie de constructos probados la que incluyó lgG2, lgG2m4, lgG2c4d e, lgG1 agly e lgG4 ala/ala (Figura 5), consistente con las características de unión reducidas que se muestran para el receptor FcgRIIIa (V) de afinidad superior así como la pérdida de avidez por la unión en el ensayo AlphaScreen™ (Figura 4A). El uso de objetivos de alta densidad, tal como HER2/neu en células de cáncer de mama como en este estudio, demostró que la afinidad de Fe por FcgRIIIa (menor que 40 uM) parece insuficiente para inducir la lisis celular objetivo. Igualmente, ninguno de los anticuerpos o mutantes Fe, aparte de lgG1 , demostraron un nivel significativo de CDC contra las células objetivo WIL2-S en los constructos anti-CD20 probados (Fig. 6). Entre las subclases de IgG y los mutantes probados, solamente lgG1 demostró niveles detectables de CDC, lo cual sugiere que independiente de la unión de C1q, ninguno de los mutantes restantes puede desencadenar la CDC (Figura 6). Aunque esfuerzos anteriores han señalado que la lgG2 tiene una CDC mínima a través de la unión de C1q y activación de la ruta clásica, no observamos niveles significativos de actividad en el contexto ant¡-CD20, consistente con una observación anterior (Idusogie, Presta y otros 2000 J Immunol 164(8): 4178-84). Además, las indicaciones anteriores de lgG1 agly que tienen actividad residual del complemento tampoco se detectaron mediante el uso de anti-CD20 y suero humano (Dorai, Mueller y otros 1991 Hybridoma 10(2): 211-7). Una explicación para esta discrepancia es que mientras los niveles bajos de activación del complemento pueden mediarse por lgG2, la activación puede ser insuficiente para desencadenar el ensamble de un complejo de ataque a la membrana (MAC) suficiente para lisar células opsonizadas.
Estos datos sugieren que, sin importar el nivel de activación del complemento, el ensamble del complejo de ataque a la membrana que culminan en la lisis celular objetivo son deficientes o insuficientes para los anticuerpos de isotipos distintos a lgG1 unido.
EJEMPLO 3 Fagocitosis celular dependiente de anticuerpo Los mutantes Fe de unión anti-HER2/neu se evaluaron para su capacidad para mediar la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP), mediante el uso de células de cáncer de mama objetivo opsonizadas, Sk-Br3 y macrófagos.
Fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron por preparaciones densidad-gradiente de Ficoll-Paque estándar (GE Healthcare) a partir de los paquetes leucocitarios (Biological Specialty Corporation), y las células se formaron en alícuotas y se almacenaron en nitrógeno. Las PBMC se descongelaron y las células positivas CD14 se aislaron por reducción negativa mediante el uso de un estuche de aislamiento CD14 sin reducción de CD16 (Stem Cell Technologies) por instrucciones del fabricante. Las células se colocaron en placas a 0.1x106 células/cm2 en RPMI/5 % FBS inactivado con calor/50 pg/ml gentimicina en presencia de 20 ng/ml GM-CSF (R&D Systems) por 7 días para generar macrófagos derivados de monocitos. Las células tumorales SK-BR-3 se marcaron con PKH67 (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células objetivo se lavaron y se incubaron con macrófagos derivados de monocitos a una relación de 1 célula objetivo a 4 células efectoras en presencia de anticuerpos por 4 horas a 37 °C en una incubadora con 5 % CO2. Después de la incubación, las células se desprendieron con Accutase (Millipore), y los macrófagos se marcaron con los anticuerpos anti-CD11b (BD Biosciences) conjugados con AlexaFluor-647 (Invitrogen). Las células se analizaron por citometría de flujo para determinar las células tumorales solas (PKH67pos, CD11 bnes), macrófagos solos (PKH67neg, CD11bpos), y células tumorales fagocitosadas (PKH67pos, CD11bpos). El porcentaje de fagocitosis se determinó por la siguiente ecuación: (células tumorales fagocitosadas)/(células tumorales fagocitosadas más células tumorales solas) x 100 %. Las células se adquirieron en un FACS Calibur (Becton Dickinson), y los resultados se analizaron con FloJo Software (Tree Star).
Los monocitos aislados se diferenciaron in vitro por medio del uso de GM-CSF y se caracterizaron posteriormente para los niveles de expresión de FcRs por análisis citométrico de flujo. Como se observó en estudios anteriores por otros, los macrófagos activados por GM-CSF expresaron niveles elevados de todos los FcR (FcyRI, FcyRIIa, FcYRIIIa) en relación con los monocitos parentales (no se muestran los datos). Los constructos mutantes de FC anti-HER2/neu IgG se probaron posteriormente en ensayos de fagocitosis mediante el uso de los macrófagos M1.
Resultados Después de 4 horas de co-cultivo con las células SkBr3 en presencia de cada mAb, los niveles significativos de ADCP fueron obvios para lgG1 ; sin embargo, se observaron además niveles mínimos de ADCP para lgG1 , lgG2, lgG2m4, e lgG4 S>P ala/ala glicosiladas a concentraciones superiores del anticuerpo (Fig. 7). En contraste, lgG2c4d demostró niveles no detectables de ADCP. Esta observación es consistente con los perfiles de unión anteriormente demostrados de varias IgG contra los FcR. Por ejemplo, mientras que lgG1 , IgG agly e lgG4 ala/ala demostraron unión al usar las bolillas que exhiben múltiples ligandos (por ejemplo, al usar el sistema AlphaScreen®) al FcyRI, las tres demostraron además ADCP. Las lgG2 e lgG2M4 e lgG4 ala/ala mostraron ADCP mínima a concentraciones superiores. El acoplamiento de FcYRIIa por lgG2 e lgG2m4, como se muestra por los estudios de avidez sugieren que la contribución de FcgRIIa puede en y por sí misma ser insuficiente para conducir los niveles significativos de ADCP. Los resultados de BiaCore y AlphaScreen™ (cuadro 5 y Figs. 4B y 4C) indicaron, además, que mientras IgG agly tiene unión conservada a FcyRI, lgG4 ala/ala muestra avidez por ambos FcyRI y FcyRIIa, todavía, ADCP es comparativamente más robusta para lgG1 agly que para lgG4 ala/ala. Debido a que la lgG1 agly tiene una unión mínima, si hubiera, a FcgRIIa y por extensión al FcgRIIb inhibidor muy similar (basado en >95 % de identidad de secuencia en el dominio extracelular) la activación de los ITAM a través de la señalización de FcyRI no se contrarresta por la señalización a través de los ITIM asociados con la activación de FcyRIlb. En contraste, la lgG4 S>P ala/ala muestra una fagocitosis apagada, probablemente debido a la activación de FcyRIlb. Finalmente, la pérdida completa de la unión monomérica detectable o basada en la avidez de lgG2c4d a varios FcR soporta adicionalmente la única capacidad fagocítica abolida de este esqueleto de Fe.
EJEMPLO 4 Liberación de citocina mediada por anticuerpos El acoplamiento-Fc de FcR en células inmunes promueve la liberación de citocina cuando se entrecruzan. Para imitar el acoplamiento basado en la avidez de los FcR en células inmunes, los mAb se unieron a las bolillas de poliestireno.
La liberación de citocina mediante el uso de mutantes anti-HER2/neu IgG se realizó después de la unión directa de las IgG a las bolillas de látex después de una incubación toda la noche. Se añadieron bolillas lavadas a las PBMC humanas aisladas a varias concentraciones como se especificó de aproximadamente 1500 a 250,000 por mi y se incubaron toda la noche antes de eliminar el sobrenadante de co-cultivo para medir el TNFa secretado por medio del uso del estuche AlphaELISA estándar de PerkinElmer (Waltham, MA).
Los isotipos IgG y mutantes Fe probados poseen capacidad diferencial para estimular la liberación de citocina a través de la secreción de TNFalpha mediada por el receptor Fe a partir de las PBMC (Fig. 8). En consecuencia, los niveles de secreción de TNF por varios isotipos y sus mutantes Fe de alto a bajo, son como sigue: lgG1 >lgG2>lgG2m4>lgG2c4a>lgG1agly>lgG4ala/ala> lgG2c4b> lgG2c4c> lgG4c4d y e. Cabe destacar que, lgG4d y los mutantes Fe e poseen una capacidad mínima, si hubiera, para inducir la liberación de citocina detectable (TNF).
EJEMPLO 5 Reducción de linfocitos B ex vivo Para entender mejor la capacidad de los isotipos y mutantes en su nivel de silenciamiento in vivo, se determinó la reducción ex vivo de los linfocitos B WIL2-S en presencia de sangre humana completa heparinizada. Ya que se conoce que una anti-CD20 lgG1 acopla todas las funciones efectoras (ADCC, CDC, ADCP), el sistema de sangre completa, que incluye la presencia de PMN (neutrófilos, basófilos, etc.), complemento humano, e IgG en exceso se consideró que era representativo del nivel de 'silenciamiento' conferido por cada variante.
En resumen, la sangre humana completa proporcionó que las células efectoras y las células WIL2-S sirvieran como células objetivo para los ensayos ADCC. Las célula objetivos se pre-marcaron con BATDA (PerkinElmer) por 30 minutos a 37 °C, se lavaron dos veces y se resuspendieron en DMEM/5 % FBS inactivado con calor y, después, se añadieron 50 µ? del objetivo (2 x 104 células por pocilio) a los pocilios de las placas de 96-pocillos de fondo en U. Unos 50 µ? adicionales se añadieron con o sin anticuerpos de varias concentraciones, y las células se incubaron a temperatura ambiente por 20 minutos. La sangre humana completa (100 µ?) se añadió después a los pocilios. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Las placas se centrifugaron a 200 g por 3 minutos, se incubaron a 37 °C en una incubadora con 5 % CO2 por 3 horas, y después se centrifugaron nuevamente a 200 g por 3 minutos. Un total de 20 µ? del sobrenadante se eliminó por pocilio y la lisis celular se midió por la adición de 200 µ? del reactivo basado en europio DELPHIA (PerkinElmer). La fluorescencia se midió por medio del uso de un lector Envision 2101 Multilabel (PerkinElmer). Los datos se normalizaron hasta la citotoxicidad máxima obtenida al tratar las células con Tritón X-100 (Sigma Aldrich) y control mínimo determinado por la liberación espontánea de BATDA a partir de las células objetivo solas. Los datos se ajustaron a un modelo de dosis-respuesta sigmoidal mediante el uso de GraphPad Prism v5.01.
El co-cultivo de WIL2-S en presencia de sangre humana reveló una reducción severa mediada por el efector de las WIL2-S marcadas por medio del uso de lgG1 y en alguna medida por lgG2 e lgG2M4. Cabe destacar que, los fragmentos (Fab')2 y Fab anti-CD20 indujeron algún nivel de reducción de WIL2-S lo que puede indicar la presencia de un autoanticuerpo IgG clivado en el suero (ver, por ejemplo, Breski y otros 2008 J Immunol 181 :3183-3192) capaz de restaurar la función efectora. Consistente con los datos de ADCC, CDC y ADCP anteriores, no se observaron niveles significativos o detectables de liberación de citocina con lgG2c4e.
EJEMPLO 6 Supervivencia de linfocitos B in vivo con CD20 objetivo La función efectora in vivo asociada con lgG2c4e se evaluó por medio del uso de un modelo de reducción de linfocitos B de cynomologous establecidas anti-CD20 (Reff y otros, 1994, Blood 83:435-445).
Los monos cynomologous (n=3/grupo) se inyectaron con solución salina 7 días antes de la dosis única de bolo intravenoso de lgG1 o lgG2? a 0.2 mg/Kg o 2 mg/Kg. En días designados posteriores a las inyecciones, los niveles de los linfocitos B a partir de muestras de sangre completa se determinaron por el análisis de citometría de flujo de los linfocitos B y T mediante el uso de anti-CD20 y anti-CD3 como marcadores, respectivamente. El promedio de los niveles de linfocitos B (CD20+/CD3-) para cada grupo se trazaron durante tres semanas después de la inyección (Figura 9). Aunque dosis bajas de lgG1 (0.2 mg/kg) indujeron una reducción casi completa de todos los linfocitos B, 1 día después de la inyección (99 %), no se indujo ninguna reducción significativa por anti-CD20 lgG2c4e (promedio de 15 % dentro del grupo). Los niveles de linfocitos B se mantuvieron relativamente normales para los animales tratados con anti-CD20 lgG2c4e después de los días siguientes, y existió una tendencia gradual hacia la recuperación de los niveles de linfocitos B observados para los monos tratados con lgG1 durante las semanas siguientes. Cabe destacar que ambos lgG2c4e e lgG1 indujeron la reducción casi completa de los linfocitos B a dosis más altas que 2 mg/Kg.
Se piensa que la reducción de linfocitos B mediada por anti-CD20 es mediada por muchos mecanismos, que incluyen ADCC, CDC y apoptosis. En vista de que los datos de la reducción de linfocitos B en monos indican la reducción de linfocitos B a la dosis más alta (2 mg/Kg) por lgG2c4e, las bases del mecanismo de reducción de linfocitos B se evaluó adicionalmente al medir los niveles de apoptosis inducida por los anticuerpos en linfocitos B aislados.
Los linfocitos B aislados se trataron con concentraciones de 0, 0.26, 2.6 y 26 pg/ml de lgG1 , lgG2c4e, (Fab')2 e lgG2 así como un mAb control sin unión (BM21 ) por 4 h y Annexin V positivo, las células 7AAD negativas se cuantificaron por citometría de flujo. Las concentraciones específicas finales de 2.6 y 26 pg/ml se seleccionaron para reflejar las concentraciones máximas estimadas in vivo de IgG en suero después de las inyecciones de bolo de 0.2 y 2 mg/Kg.
Para los tres anticuerpos de unión, se observó una inducción de apoptosis dependiente de la dosis para todas las IgG, que incluyen (Fab')2> los que indica que el entrecruzamiento mediado por anti-CD20 es suficiente para la inducción de la muerte celular a dosis más altas, pero no a la dosis inferior por lgG2c4e. Cabe destacar que, (Fab')2 demostró además apoptosis significativa en ausencia de un Fe, lo que confirma la noción de que la apoptosis mediada por anti-lgG puede inducirse independiente del entrecruzamiento mediado por Fe como se observó anteriormente.
Así, las funciones normales asociadas con el entrecruzamiento del antígeno objetivo en las células no se someten a la ablación por la variante de Fe modificada.

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES:
1.- Una molécula que contiene Fe que tiene afinidad disminuida por al menos un receptor Fcy comparado con un Fe tipo silvestre, que comprende un dominio Fe de anticuerpo con una región constante de IgG mutada, caracterizada porque los residuos de aminoácidos 233, 234, 235, 237, y 238 definidos por el sistema de numeración EU, comprenden una secuencia seleccionada de PAAAP (SEQ ID NO: 4), PAAAS (SEQ ID NO:5), y SAAAS (SEQ ID NO:6).
2 - La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el dominio Fe comprende, además, las mutaciones H268A o H268Q, V309L, A330S y P331 S según se define por el sistema de numeración EU.
3. - La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el dominio es capaz de unirse específicamente a FcRn.
4. - La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia del dominio Fe es al menos 90 % idéntica al dominio CH2 de cadena pesada de lgG2 humana.
5. - La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la molécula que contiene Fe es un anticuerpo o proteína de fusión Fe.
6. - La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el residuo 228 muta de S a P.
7. - Una molécula de unión basada en un polipéptido recombinante que comprende: (i) un dominio de unión capaz de unirse a una molécula objetivo, y (ii) un dominio Fe que tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente homologa a todo o parte de un dominio constante CH2 y CH3 de una cadena pesada de ¡nmunoglobulina humana, y en donde los residuos 233, 234, 235, 237 y 238 definidos por el sistema de numeración EU comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada de PAAAP (SEQ ID NO: 4), PAAAS (SEQ ID NO: 5) y SAAAS (SEQ ID NO: 6); en donde la molécula de unión es capaz de unirse a la molécula objetivo sin desencadenar una lisis dependiente del complemento significativa, o la destrucción del objetivo mediada por las células.
8. - La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el dominio Fe es capaz de unirse específicamente a FcRn.
9.- La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el dominio de unión se selecciona de: el sitio de unión de un anticuerpo; una enzima; una hormona; un receptor; una citocina; un antígeno de superficie celular inmune; un ligando y una molécula de adhesión.
10.- La molécula de unión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la molécula exhibe avidez.
11.- La molécula de unión de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 7-10, caracterizada además porque el dominio de unión se une específicamente al objetivo dentro de un tejido neurológico, un tejido endocrino, un tejido vascular, un tejido cardiaco, un tejido sinovial, un tejido dérmico, o un tejido mucoso.
12.- El uso de una molécula que contiene Fe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o una molécula de unión basada en un polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 7, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad caracterizada por la migración y concentración de macrófagos en un sujeto o paciente.
13.- El uso de una molécula que contiene Fe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o una molécula de unión basada en un polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 7, en la preparación de un medicamento para tratar la enfermedad del injerto contra el huésped; enfermedad del huésped contra el injerto; rechazo al trasplante de órganos; rechazo al trasplante de médula ósea; autoinmunidad, vasculitis, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune y artritis; aloinmunidad, tal como trombocitopenia aloinmune fetal/neonatal; asma y alergia; enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, enfermedad de Crohn o esclerodermia; enfermedad de Alzheimer, u oclusión de la arteria coronaria en un sujeto o paciente.
14. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, en donde si el paciente es un niño nonato, el medicamento es adaptado para ser administrable a la madre del paciente.
15. - Una molécula que contiene Fe que tiene afinidad disminuida por los receptores Fcy comparada con un Fe tipo silvestre, que comprende un dominio Fe de anticuerpo basado en una región constante de lgG2, en donde los residuos de aminoácidos 233, 234, 235, 237 y 238 definidos por el sistema de numeración EU comprenden una secuencia seleccionada de PAAAP (SEQ ID NO: 4), PAAAS (SEQ ID NO: 5), y SAAAS (SEQ ID NO: 6), y comprenden, adicionalmente, mutaciones H268A o H268Q, V309L, A330S y P331 S según se define por el sistema de numeración EU.
16. - Un método para alterar la unión de una molécula que contiene Fe basada en lgG2 a los receptoresFcy comparado con un Fe basado en la lgG2 tipo silvestre; el método comprende alterar la secuencia de un dominio Fe basado en una región constante de lgG2 en los residuos 233, 234, 235, 237, y 238 definida por el sistema de numeración EU, para comprender una secuencia seleccionada de PAAAP (SEQ ID NO: 4), PAAAS (SEQ ID NO: 5), y SAAAS (SEQ ID NO: 6), y comprender mutaciones H268A o H268Q, V309L, A330S y P331 S.
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