CN111491950A - 效应子功能被消除的IgG1 Fc突变体 - Google Patents

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Abstract

提供了在Fc区中具有变化的、与C1q和Fcγ受体的结合降低的抗体和其他含Fc分子，其可以用于治疗各种疾病和障碍。

Description

效应子功能被消除的IgG1 Fc突变体
技术领域
本文提供的披露内容涉及突变的人抗体IgG1恒定区(Fc区)，使得它们保留FcRn结合，但基本上失去特异性结合Fcγ受体和C1q的能力。
背景技术
免疫球蛋白是存在于每种哺乳动物的血清、组织或体液中的糖蛋白，具有识别外来抗原的功能。免疫球蛋白通过抗体结合抗原经由补体系统的活化或经由效应子功能的活化(例如增强细胞吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和由与效应细胞表面上存在的Fc受体(FcR)相互作用引发的介质释放)参与生物防御。
人免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE这5种不同的类别。IgG可以进一步分为由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的4个亚类，而IgA可以进一步分为由IgA1和IgA2组成的两个亚类。免疫球蛋白的基本结构包含两条同源轻链(L链)和两条同源重链(H链)。免疫球蛋白的种类和亚类取决于H链。
已知不同类型的免疫球蛋白具有不同的功能。例如，补体结合能力从高到低是IgM>IgG3>IgG1>IgG2的顺序，对Fcγ受体I的亲和力从高到低是IgG3>IgG1>IgG4>IgG2的顺序。此外，IgG1、IgG2和IgG4能够结合蛋白A。
近年来，许多单克隆抗体已进行了临床试验，并已投放市场用于药物应用。这些单克隆抗体的大多数衍生自IgG1亚类。
以IgG1为起点，已努力产生含Fc分子，其具有减弱的Fc受体结合和效应子功能，但保留了FcRn结合、延长的稳定性和低免疫原性。这些类型的分子可以提供改善的抗体治疗剂，例如具有更好的安全性。
在以下意义方面IgG抗体是双功能分子：IgG抗体除了经由其Fab臂与抗原特异性结合外，还可以经由其Fcγ结构域与Fcγ受体(FcγR)接合(Woof JM和DR Burton(2004).Nat Rev Immunol[自然免疫学评论]4(2):89-99)。Fcγ、FcγRI-FcγRIII有三种类型的受体，对IgG的亲和力不同(Bruhns P等人(2009).Blood[血液]113(16):3716-3725)。FcγR在介导Fcγ介导的免疫效应子功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP))的各种细胞类型上表达。所述抗体Fcγ结构域也结合所述补体因子C1q，从而可以激活补体途径，最终导致补体依赖性细胞毒性(CDC)。据信由FcγR或C1q介导的效应子功能在若干种治疗性抗体的活性中起作用(Redman JM等人(2015).Mol Immunol[分子免疫学]67(2Pt A):28-45。
除了经由表达FcγR的免疫细胞诱导效应外，FcγR的接合还形成更高阶的抗体簇，这导致与抗体Fab结合的细胞膜抗原发生更高阶的聚簇或交联，从而触发下游信号传导(Stewart RH等人(2014).Journal of ImmunoTherapy of Cancer[癌症免疫治疗杂志]2(29))。例如，已显示CD40特异性抗体以FcγR依赖性方式活化CD40下游信号传导(White AL等人(2011).J Immunol[免疫学杂志]187(4):1754-1763)。
尽管对于许多治疗性抗体应用而言，理想的是具有强大的Fcγ介导的效应子功能，但某些应用依赖于不需要效应子功能的作用模式，或甚至需要不诱导FcγR介导的效应的惰性抗体。由于这个原因，在此类抗体中使用效应子功能降低的IgG同种型(例如IgG2或IgG4)或带有在Fcγ-FcγR界面中的降低对FcγR的亲和力的突变的工程改造的Fcγ序列的IgG同种型。例如，通过阻断T细胞抑制性受体(例如PD-1或PD-L1)来增强T细胞的抗肿瘤抗体优先呈惰性，因为完全有能力的Fc区通过ADCC或CDC耗减T细胞来抵消抗体的作用方式(Stewart RH等人(2014).Journal of ImmunoTherapy of Cancer[癌症免疫治疗杂志]2(29))。因此，对于与FcγR的结合减少或消除的抗体具有广泛的应用。
通过在抗体Fcγ结构域中引入靶向突变，该领域找到了若干种寻找对FcγR亲和力降低的Fcγ这一技术难题的解决方案。Nose和Wigzell描述了在N297处没有N连接的碳水化合物的抗体不与表达FcγR的细胞结合并且缺乏ADCC活性(Nose M和H Wigzell(1983).Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊]80(21):6632-6636)。Tao和Morrison,以及Bolt等人在位置N297处进行了定点诱变，导致糖基化抗体与FcγR和C1q的结合降低(Tao MH和SL Morrison(1989).JImmunol[免疫学杂志]143(8):2595-2601；Bolt S,等人(1993).Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]23(2):403-411)。若干种临床阶段抗体或Fcγ融合蛋白在N297处带有突变，例如抗PDL1 mAb阿特珠单抗、抗GITR mAb TRX518、抗CD3 mAb奥特昔珠单抗或肽-Fcγ融合蛋白罗米司亭(Strohl WR(2009).Curr Opin Biotechnol[生物 技术现状]20(6):685-691；Stewart RH,等人(2014).Journal of ImmunoTherapy of Cancer[癌症免疫治疗杂志]2(29))。
CD3特异性抗体诱导FcR依赖性T细胞活化和细胞因子释放(Parren PW等人(1992).J Immunol[免疫学杂志]148(3):695-701；Xu D,等人(2000).Cell Immunol[细胞 免疫学]200(1):16-26)。观察到，Fcγ中具有N297A突变的CD3特异性IgG1抗体仍然导致T细胞活化(WO 2012143524)，尽管已经描述了N297A与表达FcγR的细胞没有可检测的结合(Bolt S等人(1993).Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]23(2):403-411)。这些观察表明，用CD3特异性抗体进行的体外T细胞活化测定对残留的FcγR结合非常敏感。因此，用CD3抗体进行的体外T细胞测定代表了一种最佳的功能测定，可以鉴定出对FcγR没有结合亲和力或具有最小结合亲和力的工程化的Fcγ序列。
Canfield和Morrison描述了IgG的铰链区有助于结合至高亲和力的FcγRI(Canfield SM和SL Morrison(1991).J Exp Med[实验医学杂志]173(6):1483-1491)。Xu等人证明人源化的抗CD3抗体hOKT3在下部铰链中包含L234A和L235A双重突变(也称为“Ala-Ala”或“LALA”)，显示C1q和FcγR结合降低，从而导致体外FcγR介导的T细胞活化减弱和细胞因子释放减弱(Xu D等人(2000).Cell Immunol[细胞免疫学]200(1):16-26)。这种抗体，被称为hOKT3γ1(Ala-Ala)或替利珠单抗，随后在临床试验中进行研究，其中发现引入LALA突变可降低不良细胞因子释放的发生率(Herold KC,等人(2005).Diabetes[糖尿病]54(6):1763-1769)。
(Shields等人(2001),J Biol Chem[生物化学杂志]276(9):6591-6604)对整个抗体Fcγ进行了丙氨酸扫描诱变方法，以鉴定有助于FcγR结合的残基。他们发现D265的突变降低了对所有Fcγ受体的亲和力。另外，显示突变位置P329降低与Fcγ受体的结合。Idusogie等人绘制了利妥昔单抗(一种嵌合IgG1抗体)的C1q结合位点，并且发现在D270、K322、P329或P331处的突变降低了与C1q的结合(Idusogie EE等人(2000).J Immunol[免疫 学杂志]164(8):4178-4184)。Wilson等人描述了D265和N297处突变为丙氨酸的突变组合，称为“DANA”。这些组合的突变被认为具有降低的与FcγR的结合，但检测到与小鼠FcγRIII的残留结合(Wilson NS等人(2011).Cancer Cell[癌细胞]19(1):101-113)。Gong等人描述了“DANA”突变在补体活化方面表现出部分降低(Gong Q等人(2005).J Immunol[免疫学杂 志]174(2):817-826)。
其他报道也描述了抗体的Fc部分中某些氨基酸的突变(例如D265N和D265E：Shields RL等人(2001).J Biol Chem[生物化学杂志]276:6591-6604；N297Q：StavenhagenJB等人(2007).Cancer Res[癌症研究]67:8882-8890；N297D：Sazinsky SL等人(2008)ProcNatl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]105:20167-20172，Kelton W,等人(2014)ChemBiol[化学生物学]21:1603-1609；P329G：Schlothauer T,等人(2016)Protein Eng DesSel[蛋白质工程设计与选择]29:457-466)，尽管并非所有这些研究都与Fc功能受损有关。
已描述了若干种降低与FcγR结合的Fcγ突变，但以上提到的突变均未完全消除FcγR结合和C1q结合。Shields等人已经描述了通过组合单个突变进一步降低FcγR结合的可能性(Shields RL等人(2001).J Biol Chem[生物化学杂志]276(9):6591-6604)，这个概念也是上述“LALA”或“DANA”组合突变的基础。
然而，挑战仍然是鉴定突变的组合，所述组合导致最佳地降低FcγR结合，并且重要的是不会负面影响对药品重要的其他关键特性，例如可加工性、药代动力学或抗原性。
例如，WO 2014/108483描述了若干种Fcγ序列，其包含具有降低的FcγR结合的突变组合。大多数Fcγ突变的抗体在小鼠中的清除速度都快于相应的未修饰的IgG1抗体。因此，在Fcγ结构域中引入突变可能对药代动力学特性产生影响是已知的。
所述Fcγ结构域还与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用(Kuo TT和VG Aveson(2011).MAbs[单克隆抗体]3(5):422-430)。这种相互作用负责抗体的再循环，从溶酶体降解中拯救出来，从而负责IgG1抗体的长半衰期。所述FcRn结合位点位于Fcγ1的CH2-CH3界面(Martin WL等人(2001).Mol Cell[分子细胞]7(4):867-877)。因此，在CH2结构域中具有突变的新颖的工程改造的Fcγ结构域可以具有受损的FcRn亲和力，并因此具有受损的药代动力学特性(Shields RL,等人(2001).J Biol Chem[生物化学杂志]276(9):6591-6604)。
因此，需要新的工程改造的Fcγ序列，其对FcγR和C1q没有或具有最小的结合亲和力，但保留对药品重要的其他特性，例如药代动力学谱或可加工性。
发明内容
本文提供了包括可用于抗体或抗体样治疗剂的工程改造的修饰的免疫球蛋白恒定结构域的组合物，例如包含Fc区的那些组合物。还描述了能够编码所述提供的修饰的恒定结构域的相关多核苷酸、表达所述提供的修饰的恒定结构域的细胞，以及相关的载体。另外，描述了使用所述提供的修饰的恒定结构域的方法。
所述组合物是表现出降低的FcγR结合能力但具有保守的FcRn结合的IgG1Fc突变体。这些IgG Fc突变体能够治疗性靶向可溶性或细胞表面抗原，同时使免疫效应细胞的与Fc相关的接合和补体介导的细胞毒性最小化。一方面，含IgG1Fc分子包含CH2结构域，其中如Kabat等人的EU索引中所示的位置265、297和329处的氨基酸被其他氨基酸替代。
在一个实施例中，将含IgG1 Fc分子的位置265处的氨基酸替代为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)或谷氨酸(E)，将位置297处的氨基酸替代为丙氨酸、天冬氨酸(D)或谷氨酰胺(Q)，以及将位置329处的氨基酸替代为丙氨酸、甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。
在某些实施例中，所述IgG1 Fc突变体组合物用于以下适应症，在所述适应症中，通过与FcRn相互作用保持治疗性抗体(或Fc融合体)半衰期，而衍生自与免疫细胞和效应子功能相关的C1q和FcγR的结合和/或活化的不希望的效应，例如i)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，ii)补体依赖性细胞毒性(CDC)，iii)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，iv)FcγR介导的细胞活化，v)FcγR介导的血小板活化/消耗，和/或vi)结合的靶标的FcγR介导的交联，被最小化或消除。
在一方面，将IgG1 Fc突变掺入治疗性抗体或结合剂(例如多价结合剂)的Fc-融合物中，靶向与癌症、神经障碍、免疫系统障碍(例如与B细胞或T细胞活化有关的那些)有关的细胞上或在与组织修复或愈合有关的细胞(例如成纤维细胞或干细胞)上的配体。
在某些实施例中，所述IgG1 Fc突变体包括在药物组合物中。在某些实施例中，所述IgG1 Fc突变体是药物活性分子的一部分。包含含有IgG1 Fc突变体或活性IgG1 Fc突变体的分子的药物组合物用于治疗疾病或障碍，例如癌症。
本文还提供了重组的含IgG1 Fc分子，其与具有野生型Fc结构域的含Fc的分子相比，对C1q和至少一种Fcγ受体(FcγR)的亲和力降低，所述重组的含IgG1 Fc分子包含在氨基酸位置265、297和329处的突变，其中残基编号如在Kabat等人的EU索引中所示。
本文还提供了重组多肽，其包括(a)一个或多个能够结合至少一个靶分子的结合结构域；和(b)包括在氨基酸位置265、297和329处突变的IgG1 Fc结构域，其中所述多肽能够结合靶分子而不触发显著的Fcγ介导的效应，例如补体依赖性裂解、细胞介导的靶分子破坏，和/或结合的靶标的FcγR介导的交联。
附图说明
图1：mAb1 IgG1和mAb1 DANAPA IgG1的尺寸排阻色谱图谱。
图2：带有突变的Fc的抗CD3抗体mAb1突变体与CD3+Jurkat细胞的结合。
图3A和3B：A)通过CD69表面染色确定，带有突变的Fcγ1的mAb1突变体诱导人PBMC中的淋巴细胞活化。虚线表示在含有CD2/CD3/CD28活化珠的阳性对照孔中获得的CD69阳性细胞百分比。B)通过IFNγELISA确定，带有突变的Fcγ1的mAb1突变体诱导人PBMC中的细胞因子释放。虚线表示在含有CD2/CD3/CD28活化珠的阳性对照孔中获得的IFNγ水平。
图4A-4D：A)AlphaScreenTM Fc受体竞争结合测定的示意图。B)通过AlphaScreenTMFc受体竞争结合测定分析，Fc突变的mAb1突变体与人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的结合。C,D)通过表面等离子共振(BIAcore)分析，Fc突变的mAb1突变体与人FcγRI(C)和人FcγRIIIA(D)的结合。
图5：通过AlphaScreenTM Fc受体竞争结合测定分析，DANAPA IgG1形式的不同抗体与人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的结合。
图6：通过AlphaScreenTM Fc受体竞争结合测定分析，在位置D265、N297和P329处具有不同取代的mAb1与人FcγRI的结合。
图7：通过表面等离子共振分析(BIAcore)分析，mAb1 DANAPA IgG1与人C1q的结合。
图8：通过表面等离子共振(BIAcore)分析，在pH 6.0时mAb1 DANAPA IgG1与人FcRn的结合。
图9：静脉内分别施用10mg/kg mAb1 DANAPA IgG1或mAb1 IgG1后C57BL/6小鼠的抗体血浆浓度。数据表示为平均值±标准偏差(n＝5)
图10：通过AlphaScreenTM Fc受体竞争结合测定分析，不同的CD3/CD33FynomAb与人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的结合。
具体实施方式
为了可以更完整地理解本申请，下文列出了几个定义。此类定义意在涵盖语法等义语。
在整个说明书和权利要求书中，所述Fc区中的残基编号是免疫球蛋白重链的编号，其是根据Kabat等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学目的蛋白质序列],第5版.Public Health Service[公共卫生署],National Institutesof Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(1991)(通过引用明确地并入本文)中的EU索引。本文的“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。该编号是技术人员众所周知的，并且经常在本领域中使用。
本文所用的“多肽”或“蛋白质”意指至少两个共价附接的氨基酸，所述氨基酸包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。
本文所用的“氨基酸”是指可以存在于特定、限定位置上的20种天然存在的氨基酸之一或任何非天然类似物。
“在位置265、297和329处具有取代(或’突变’、或’替代’)的含Fc分子”是指这样的分子，其中位置265处的氨基酸不同于天冬氨酸(D)、位置297处的氨基酸不同于天冬酰胺(N)、位置329处的氨基酸不同于脯氨酸(P)，其中所述Fc区的所有编号均根据Kabat等人的EU索引进行。
本文的“氨基酸变化”包括氨基酸突变，例如多肽序列中的取代、插入，和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一种氨基酸替代亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。例如，取代P329A是指突变体多肽，在这种情况下是Fc突变体，其中位置329处的脯氨酸被丙氨酸替代。
如果是氨基酸突变组合，则优选的形式如下：D265A/N297A/P329A。这意味着，与其亲本多肽相比，突变体的Fc区存在三个氨基酸突变：一个在位置265(天冬氨酸(D)替代为丙氨酸(A))、一个在位置297(天冬酰胺(N)替代为丙氨酸)，并且一个在位置329(脯氨酸(P)替代为丙氨酸)。
本文以最广义使用术语“抗体”。“抗体”是指任何多肽，其至少包含(i)Fc区和(ii)衍生自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域。因此，抗体包括但不限于全长免疫球蛋白、多特异性抗体、包含至少一个可变区的Fc融合蛋白、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、异二聚体抗体、抗体融合蛋白、抗体缀合物以及各自的片段。如下文更详细描述的“FynomAb”也包括抗体。
本文所用的“全长抗体”或“免疫球蛋白”是指构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。“全长抗体”涵盖单克隆全长抗体、野生型全长抗体、嵌合全长抗体、人源化全长抗体、完全人全长抗体，所述列表不限于此。
在大多数哺乳动物中，包括人和小鼠，全长抗体的结构通常为四聚体。所述四聚体由多肽链的两个相同对组成，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(典型地具有约50kDa-70kDa的分子量)。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中，全长抗体可能只由两条重链组成，每条重链都包含与Fc区相连的可变结构域。
每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别并包含所谓的互补决定区(CDR)。
每条链的羧基末端部分限定通常主要负责效应子功能的恒定区。
在人免疫球蛋白的情况下，轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α、或ε，并将抗体的同种型分别地定义为IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。
如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体。
如本文所用，“IgG”是指属于基本上由识别的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人中，IgG包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类或同种型。在小鼠中，IgG包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。全长IgG由两条免疫球蛋白链的两个相同对组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，并且每条重链包含免疫球蛋白结构域VH、Cγ1(也称为CH1)、Cγ2(也称为CH2)和Cγ3(也称为CH3)。就人IgG1而言，根据Kabat中的EU索引，“CH1”是指位置118-215，CH2结构域是指位置231-340，并且CH3结构域是指位置341-447。IgG1还包含铰链结构域，在IgG1的情况下，其指位置216-230。
如本文所用，“Fc”或“Fc区”是指全长免疫球蛋白的除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及在这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域CH2、CH3以及CH1和CH2之间的下部铰链区。IgG1的Fc区包含从氨基酸C226到羧基末端的结构域，其中所述编号是根据Kabat中的EU索引进行的。例如，所述“Fc”或“Fc区”可以包括但不限于IgG1的Fc区，其包含序列SEQ ID NO:43和52-58中任何一个(其中的每个都是人野生型IgG1 Fc氨基酸序列的实例)，或包含与SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:52-58中任何一个至少80％、至少85％、优选地至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、更优选地至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在优选的实施例中，根据本发明的从位置226(Kabat编号)开始的Fc区包含与SEQ ID NO:43至少80％、至少85％、优选地至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、更优选地至少95％、至少96％、至少97％或至少98％相同的序列，并且其中265处的氨基酸不同于天冬氨酸(D)、位置297处的氨基酸不同于天冬酰胺(N)，并且位置329处的氨基酸不同于脯氨酸(P)。其他IgG亚类的类似结构域可以通过所述IgG亚类的重链或重链片段与人IgG1的重链或重链片段的氨基酸序列比对来确定。
如本文所用的“CH2结构域”优选地是人IgG1的Fc区，并且包含与SEQ ID NO:60至少80％、85％、90％，优选地至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。如本文所述的人IgG1的Fc区的“CH3结构域”包含与SEQ ID NO:61至少80％、85％、90％，优选地至少95％、至少98％或100％相同的氨基酸序列。
如本文所用，“含Fc分子”是指包括Fc区的多肽。含Fc分子包括但不限于抗体、Fc融合体、分离的Fc、Fc缀合物、抗体融合体、FynomAb等。
本文中的“野生型”或“WT”是指在自然界中发现的，即天然存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有未被例如诱变的分子生物学技术故意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。例如，“野生型Fc区”可包括但不限于包含序列SEQ ID NO:43的IgG1的Fc区(其是人野生型IgG1 Fc氨基酸序列的实例)，或包含SEQ ID NO:52-58中任一序列的IgG的Fc区(其中的每个也是人野生型IgG1 Fc氨基酸序列的实例)。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与Fc区(例如，抗体的Fc区)结合的受体。
术语“Fc gamma受体”、“Fcγ受体”或“FcγR”是指结合IgG抗体的Fc区的人受体。如本文所用，FcγR包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)亚类，包括其等位基因突变体以及这些受体的可变剪接形式。
这些FcγR也被定义为活化性受体(FcγRI、FcγRIIa/c、FcγRIIIa/b)或抑制性受体(FcγRIIb)，因为它们引起或抑制免疫功能。
FcγRI家族由三个基因组成(FCGRIA、FCGRIB和FCGRIC)，但只有FCGRIA的产物被鉴定为全长表面受体。所述产物，即FcγRI，通过树突状细胞(DC)、巨噬细胞以及活化的中性粒细胞表达。
FcγRII家族由三个基因(FCGR2A、FCGR2B和FCGR2C)组成，它们编码FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc蛋白。FcγRIIa在单核细胞、某些树突状细胞和中性粒细胞上表达。FcγRIIc在自然杀伤(NK)细胞上表达。FcγRIIb是广泛表达的FcγR。FcγRIIb实际上存在于除NK细胞和T细胞之外的所有白细胞上。
FcγRIII家族由两个基因FCGR3A和FCGR3B(其编码FcγRIIIa和FcγRIIIb)组成。所述FcγRIIIa蛋白在单核细胞、组织特异性巨噬细胞、树突状细胞、γδT细胞和自然杀伤细胞上表达为跨膜蛋白。FcγRIIIb是在中性粒细胞和嗜碱性粒细胞表面表达的GPI锚定受体。
编码FcγRIIa的基因的两个等位基因产生2个在位置131处不同的突变体(低应答者FcγRIIaR131和高应答者FcγRIIaH131)。类似地，编码FcγRIIIa的基因的两个等位基因产生2个在位置158处不同的突变体(低应答者FcγRIIIaF158和高应答者FcγRIIIaV158)。
值得注意的是，被认为是抗体依赖性细胞毒性的关键介质的NK细胞仅表达FcγRIIIa和FcγRIIc，而不表达其他FcγR，特别是抑制性FcγRIIb。
每个FcγR蛋白在IgG亚类方面具有不同的配体结合偏好，并且对IgG亚类具有不同的亲和力。
活化性FcγR通过抗原递呈细胞(APC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及中性粒细胞和NK细胞脱颗粒等途径触发多种免疫应答，例如吞噬作用、呼吸爆发和细胞因子产生(TNF-α、IL-6)。活化性FcγR在清除免疫复合物中也起重要作用。另一方面，抑制性受体FcγRIIb是B细胞稳态中的关键调控元件。它控制细胞活化的阈值和程度。
Fcγ受体及其功能在Nimmerjahn和Ravetch的Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述],2008,8,34-47中进行了综述。
如本文所用，“C1q”是分子量约为460,000的六价分子，其结构类似于一束郁金香，其中六个胶原“茎”连接至六个球状头部区域。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s形成复合物C1，其为补体级联途径的第一组分。
C1q及其功能在例如Kishore等人,Immunopharmacology[免疫药理学],2000,49:159-170和
Figure BDA0002431529960000111
等人,Trends Immunol[趋势免疫].2009,30(2):83-90中进行了综述。
如本文所用，“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区并且至少部分由FCRN基因编码的蛋白质。如本领域已知的，功能性FcRn蛋白质包含两种多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，并且重链由FCRN基因编码。FcRn或FcRn蛋白是指α链与β-2-微球蛋白的复合物。在人中，编码FcRn的基因称为FCGRT。FcRn参与被动体液免疫从母亲到胎儿的转移，也参与IgG清除的控制。
FcRn及其功能在例如Roopenian,Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述],2007,7,715-725中进行了综述。
如本文所用的，如使用表面等离子共振(SPR)进行测量(其中所述KD在pH 6.0下测量)，当分子以低于亲本含Fc分子(没有氨基酸取代(例如野生型IgG1))5倍、优选低于4倍，更优选低于3倍，再更优选低于2倍的KD结合FcRn时，所述分子“保持与FcRn的结合”。在某些实施例中，所述KD是所述亲本分子的KD的约1至2倍，例如约1.5倍，或约与所述亲本分子的KD相同(即1倍)，并且在某些实施例中，所述KD也可低于所述亲本分子的KD。
“降低的结合”是指在本文所述的Fc区中具有至少一个氨基酸取代的本发明的含Fc分子例如当与没有所述氨基酸取代的亲本含Fc分子的结合相比，与C1q和/或FcγR受体的降低的结合。“降低的结合”可以是至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、至少约75倍或至少约100倍降低的结合。可以使用本领域已知的多种技术来测定含Fc分子的结合，包括但不限于表面等离子共振(SPR)。可以使用
Figure BDA0002431529960000121
仪器执行SPR测量。在实践中，表现出与特定FcγR“降低的结合”的含Fc分子是指具有显著降低或消除的由特定FcγR介导的效应子功能的含Fc分子。
如本文所用，“重组”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体和其他蛋白质。
“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸典型地包含元件，例如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或维持。此类生物系统的实例可包括利用能够复制载体的生物成分的细胞、病毒、动物、植物和重构生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或它们的杂合体。
“多核苷酸”是指包括通过糖-磷酸主链或其他等效共价化学共价连接的核苷酸链的分子。双链和单链DNA和RNA是多核苷酸的典型实例。
与C1q和FcγR的结合降低的Fc突变体
本发明是在IgG1恒定区(Fc)的位置265、297和329处(根据Kabat中的EU索引)组合的取代的首次证明。多个残基取代的直接选择出乎意料地提供用于抗体工程改造和用作融合多肽的功能性Fc结构域，以及提供缺乏可测量的效应子功能的治疗性实体的可能性。
本发明由此提供重组的含IgG1 Fc分子，其包含CH2结构域，在所述CH2结构域中，位置265处的氨基酸D、位置297处的氨基酸N、和位置329处的氨基酸P(由Kabat中的EU索引指示)被替代为其他氨基酸。
优选的含IgG1 Fc分子包括但不限于在位置265、297和329处包含氨基酸取代的那些分子。如下所讨论，此类多肽可在Fc区内具有一个或多个另外的缺失、添加或取代。由此，在本发明的范围内的是含IgG1 Fc分子，其在以下位置处具有氨基酸取代：位置265(即在该位置具有与D不同的氨基酸)、位置297(即在该位置具有与N不同的氨基酸)和位置329(即在该位置具有与P不同的氨基酸)，同时从位置226(Kabat编号)向前的Fc区与SEQ ID NO:43至少80％、至少85％、优选地至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、更优选地至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％相同。
术语“百分比(％)序列一致性”或“％一致性”描述了两个或更多个经比对的氨基酸序列与组成这些氨基酸序列的总长度的氨基酸残基数相比而言一致的氨基酸的匹配(“命中”)数。换句话说，使用比对，针对两个或更多个序列，当为了最大对应性(如使用本领域已知的序列比较算法所测量)对序列进行比较和比对时，或当手动比对和目视检查时，可以确定相同的氨基酸残基的百分比(例如90％、95％、97％或98％相同)。被比较以确定序列同一性的序列由此可以由氨基酸的一个或多个取代、一个或多个添加或一个或多个缺失相区别。用于比对蛋白序列的适合程序是本领域技术人员已知的。蛋白序列的百分比序列一致性可以例如用程序如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST来确定，例如使用NCBIBLAST算法(Altschul SF等人(1997),Nucleic Acids Res[核酸研究].25:3389-3402)。
例如，对于氨基酸序列，可以通过使用本领域已知的标准技术、或通过检查来确定序列同一性和/或相似性，所述技术包括但不限于以下：Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482的局部序列同一算法、Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的序列同一性比对算法、Pearson和Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性搜索方法、这些算法的计算机化实现(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)、575科学驱动(Science Drive)，威斯康星州麦迪逊)、Devereux等人,1984,Nucl.Acid Res.[核酸研究]12:387-395描述的最佳拟合序列程序(优选地使用默认设置)。在某些实施例中，基于以下参数由FastDB计算百分比同一性：不匹配罚分为1；空位罚分为1；空位大小罚分为0.33；以及结合罚分为30，“Current Methods inSequence Comparison and Analysis[序列比较和分析中的当前方法],”MacromoleculeSequencing and Synthesis[大分子测序和合成],Selected Methods and Applications[选择的方法和应用],第127-149页(1988年),Alan R.Liss公司。
有用的算法的另一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、成对的比对从一组相关序列中创建多重的序列比对。它还可以绘制树，其示出用于创建比对的聚类关系。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。
有用的算法的另一个实例是BLAST算法，其描述于：
Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410；Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402；和Karin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:5873-5787。一种特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获自Altschul等人,1996,Methods in Enzymology[酶学方法]266:460-480。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，将其中大多数设置为默认值。
另外的有用的算法是由Altschul等人,1993,Nucl.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402报道的空位BLAST。
基于多取代的IgG1突变体对人FcR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcRn)的相对亲和力(由AlphaScreenTM竞争测定和SPR/Biacore分析进行评估)来对其进行选择。对这些突变体进行进一步检测，并针对它们诱导PBMC释放细胞因子的能力在适当的细胞系统中进行排名。在本文提供的该组实验数据中，将IgG1 Fc突变体与野生型含IgG1Fc分子进行比较。在若干体外生物测定中对这些突变体的进一步分析证实了最小至无法检测的活性水平和极大消除的对FcγR的结合亲和力。基于这些筛选，令人惊讶地鉴定出，IgG1 Fc突变体(在所有三个氨基酸位置265、297和329处均含有取代)对FcγR没有亲和力或具有最小可检测的亲和力，并且在各种上述的效应子/免疫刺激生物测定中几乎或完全缺乏活性。本发明的IgG1 Fc突变体可以认为是真正的“沉默的”Fc，因为其不具有或具有最小的结合FcγR、介导效应子功能、或参与Fc介导的细胞因子释放的能力。
基于本发明，在氨基酸位置265、297和329处的取代可以任选地与其他氨基酸突变组合，或者所述取代可以用于另一种IgG同种型中以实现与本文所教导的效应子功能相似的或选择性的沉默，并与本领域中已知的组合。与之前描述的Fc突变N297A或Fc双突变L234A/L235A(其中的每种已用于需要最小残基FcγR相互作用的临床阶段治疗性抗体/含有Fc的蛋白质(Herold KC等人(2005).Diabetes[糖尿病]54(6):1763-1769))相比，在位置265、297和329处的突变的这种组合令人惊讶地导致显著改善的沉默。
根据本发明的D265、N297和P329三重突变体与其野生型对应物相比显示出与第一补体组分C1q的结合降低。换句话说，突变体对C1q的亲和力低于野生型对C1q的亲和力。
根据本发明的D265、N297和P329三重突变体还表现出对至少一种Fcγ受体的亲和力低于其亲本多肽对所述至少一种Fcγ受体的亲和力。如本文所用，Fcγ受体包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII受体。优选地，所述至少一种FcγR选自以下组，该组由FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa组成。
与野生型对应物相比，D265、N297和P329三重突变体表现出与C1q和Fcγ受体两者的结合均降低。
在某些实施例中，与野生型对应物相比，突变型含IgG1 Fc分子表现出与C1q、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、和FcγRIIIa的结合降低。
对C1q或任何Fc受体的结合都可以通过本领域众所周知的方法(例如AlphaScreenTM和表面等离子共振(SPR))进行评估。
例如，可以通过计算具体的IC50值(由实例4中所述的AlphaScreenTM竞争测定获得)的比率，可以将本发明突变体相比于其野生型对应物对目标蛋白(例如C1q或FcγR)的结合强度进行比较。AlphaScreenTM(用于高通量筛选)是均相测定技术，其允许检测分子事件(例如结合)。经包被的“供体”和“接受体”珠子是所述测定技术的基础。作为基于珠子的测定，AlphaScreenTM通过以下进行工作：紧密靠近的珠子之间相互作用，从而导致一系列化学反应，所述化学反应作用以产生极大放大的信号。可以应用直接或间接(例如，竞争性结合)测量来评估蛋白质多个之间和两个之间的相对亲和力和亲合力。
作为替代，通过由适当的ELISA测定法确定EC50，可以比较突变型含IgG1 Fc分子和它的野生型对应物对目标蛋白(例如，C1q和/或FcγR)的结合。EC50是指突变体浓度，所述突变体浓度提供的信号代表与结合的目标蛋白的百分比相比于突变体浓度的对数有关的曲线的饱和度的50％。一般而言，如果突变型含IgG1Fc分子的EC50值比其野生型对应物高至少1.5倍，则认为与其野生型对应物相比，所述突变型含IgG1 Fc分子表现为与目标蛋白(例如C1q和/或FcγR)的结合降低。
还可以通过确定离解常数(Kd)，使用SPR评估突变型含IgG1 Fc分子与目标蛋白(例如，C1q和/或FcγR)的结合亲和力。一般而言，如果突变型含IgG1 Fc分子的Kd值比其多肽亲本高至少1.5倍，则认为与其野生型对应物相比，所述突变型含IgG1 Fc分子表现为与目标蛋白(例如C1q和/或FcγR)的结合降低。
突变体对C1q或FcγR的亲和力可能很弱，以至于无法准确确定AlphaScreenTM测定的特异性信号乃至SPR的Kd或ELISA测定的EC50(由于结合信号处于背景噪声中或低于检测阈值)。在此情况下，认为突变型含IgG1 Fc分子不结合C1q和/或各FcγR。
例如，根据本发明的含三重突变IgG1 Fc的分子可以不结合至少一种FcγR，并且表现出与C1q的结合降低或不结合。在本申请的实例中清楚地说明了此类突变型含IgG1 Fc分子。
在一些实施例中，本发明的突变型含IgG1 Fc分子不结合选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质。
申请人示出，在D265、N297和P329处引入突变足以显著削弱与C1q和Fcγ受体的结合。换句话说，为获得与C1q和/或Fcγ受体的结合适当降低的突变型含IgG1 Fc分子，除了在D265、N297和P329处的那些突变外，不再需要在IgG1野生型对应物的IgG1 Fc区内引入突变。然而，如果需要(例如，改变分子的其他功能)的话，任选地向本发明的含Fc的分子添加另外的突变将是可能的。
不受任何理论的束缚，申请人认为，本发明提供的氨基酸取代不会显著引起IgG1Fc区中的主要结构重排，因此在某些情况下，其他不由结合C1q和FcγR所介导的功能与多肽亲本的那些相比没有显著改变。值得注意的是，申请人示出，在IgG1 Fc区中的位置D265、N297和P329处引入取代突变不会显著削弱其对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力。例如，包含D265A、N297A和P329A IgG1 Fc取代(DANAPA)的mAb1的解离常数KD为500nM，而它的野生型对应物的KD为470nM(参见实例8)。换句话说，野生型含IgG1 Fc分子和根据本发明的突变型含IgG1 Fc分子对FcRn显示出相近的结合特性。
如上所述，野生型的Fc区可以选自以下组，该组由人IgG的野生型Fc区、其片段及其突变体组成。
如上所述，本发明的Fc区可以包含IgG1 Fc中至少三个氨基酸的氨基酸取代。为了提醒，野生型Fc区包括但不限于具有SEQ ID NO:43的人IgG1的Fc区。人Fc区的等位基因变体是已知的，并且也可以用作亲本分子以引入根据本发明的突变的组合。人IgG1 Fc的等位基因变体在位置356(谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))、和/或在位置358(甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L))和/或在位置431(丙氨酸(A)或甘氨酸(G))处彼此不同。等位基因变体包括天然存在的等位基因变体以及非天然等位基因变体。非天然等位基因变体包含确实存在于天然存在的等位基因变体中但是在自然界中未发现以组合存在的残基。Jefferis等人提供有关人IgG等位基因变体的综述，该综述允许技术人员获得Fc序列的天然存在的和非天然的等位基因变体(Jefferis R和M-P Lefranc(2009)mAbs[单克隆抗体]1:1-7)。因此，在某些实施例中，用于引入根据本发明的突变的组合(即根据Kabat编号的位置265、297和329处的突变)的亲本分子是包含选自下组的人IgG1 Fc序列的分子，该组由SEQ ID NO:43、52、53、54、55、56、57、和58组成。本发明在具体的实施例中由此提供包含重组IgG1 Fc的多肽，所述多肽包含根据SEQ ID No:43、52、53、54、55、56、57、和58中的任何一个的氨基酸序列，其特征在于：(i)位置265处的氨基酸D已被另一种氨基酸替代，(ii)位置297处的氨基酸N已被另一种氨基酸替代，以及(iii)位置329处的氨基酸P已被另一种氨基酸替代，其中编号由Kabat中的EU索引指示。
与野生型或亲本Fc区相比，根据本发明的Fc区具有突变的组合，使得位置265、297和329处的氨基酸残基分别不同于D、N和P，其中编号根据Kabat等人的EU索引。在某些实施例中，位置265处的氨基酸残基是A、N或E。在某些实施例中，位置297处的氨基酸残基是A、D或Q。在某些实施例中，位置329处的氨基酸残基是A、G或S。本领域技术人员将理解，其他氨基酸可以在这些位置上取代(例如R、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V在位置265处；R、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V在位置297处；R、C、Q、N、H、I、L、K、M、F、E、D、T、W、Y或V在位置329处)，以及可以通过常规方法检测所得的在位置265、297和329处具有指示氨基酸的Fc变体具有与本文工作实例中示例性的实施例基本相同的结合Fc受体和C1q的特性，并且此类变体包括在本发明中。
在一些实施例中，含IgG1 Fc分子的氨基酸取代包含氨基酸取代D265A、N297A、P329A。
在一些其他实施例中，含IgG1 Fc分子的氨基酸取代包含氨基酸取代D265N、N297D、P329G。
在一些其他实施例中，含IgG1 Fc分子的氨基酸取代包含氨基酸取代D265E、N297Q、P329S。
在具体的实施例中，突变型含IgG1 Fc分子(与野生型含IgG1 Fc分子相比，该突变体显示出与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的结合降低)的特征在于：
1.位置265处的氨基酸被丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸替代，
2.位置297处的氨基酸被丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酰胺替代，并且
3.位置329处的氨基酸被丙氨酸、甘氨酸、或丝氨酸替代，
其中氨基酸的编号由Kabat中的EU索引指示。
在一些实施例中，制备重组的含IgG1 Fc分子(包含CH2结构域，其中在位置265、297和329处的氨基酸分别被D、N和P以外的其他氨基酸替代，所述位置由Kabat中的EU索引指示)的方法包括以下步骤：
(a)提供编码含亲本IgG1 Fc的分子的核酸，
(b)修饰步骤(a)中提供的核酸，以获得编码重组的含IgG1 Fc分子的核酸，其中位置265、297和329中的至少一处的氨基酸被替代，使得在得到的编码的含Fc的分子中，这些位置的上氨基酸不同于D(位置265)、N(位置297)和P(位置329)，并且
(c)在宿主细胞中表达在步骤(b)中获得的核酸并回收所述突变体。
当然，如果亲本分子已经包含在位置265处与D不同、在位置297处与N不同或在位置329处与P不同的氨基酸，则仍需修饰这三个位置中的仅一个或两个，来创建根据本发明的含Fc的分子。
此类步骤可以通过分子生物学的常规实践来执行。为了进行制备本发明的重组的含IgG1 Fc分子的方法，本领域技术人员可以参考本领域中描述的众所周知的程序，所述程序可以在以下中找到：例如Molecular Cloning-A Laboratory Manual[分子克隆-实验室手册],第3版(Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约,2001)、The condensed protocols from Molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆浓缩指南：实验室手册](Sambrook,Russell,CSHL出版社,2006)、和CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学当代指南](John Wiley&Sons[约翰威利父子出版社],2004)。
野生型含IgG1 Fc分子的核酸可以是商业的，或者可以通过分子生物学或化学合成的经典步骤获得。编码步骤(b)中提及的突变型含IgG1 Fc分子的核酸可以通过化学合成实现，或通过使用本领域已知的各种方法对亲本多肽的核酸进行修饰来实现。这些方法包括但不限于定点诱变、随机诱变、PCR诱变和盒式诱变。
可以将编码突变型含IgG1 Fc分子的核酸并入表达载体中以在宿主细胞中表达。
表达载体通常包括蛋白质编码序列，所述蛋白质编码序列与控制或调节序列(例如启动子)可操作地连接(即处于功能关系)，并且任选地包括可选择的标志物、任何融合伴侣、和/或另外的元件。可以通过在适当条件下培养用核酸(优选地为表达载体，含有编码突变型含IgG1 Fc分子的核酸)转化的宿主细胞来诱导或引起蛋白质的表达，来制备本发明的突变型含IgG1 Fc分子。可以广泛使用各种合适的宿主细胞系，其包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、和酵母。
例如，可以从美国典型培养物保藏中心获得的ATCC细胞系目录中描述了可以使用的各种哺乳动物细胞系。宿主细胞可以是但不限于以下：YB2/0(YB2/3HL.P2.GII.IGAg.20细胞(保藏于美国典型培养物保藏中心)、ATCC n℃RL-1662)、SP2/0、YE2/0、1R983F、Namalwa、PER.C6、CHO细胞系(尤其是CHO-K-1、CHO-Lecl0、CHO-Lecl、CHO-Lecl3、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、HEK293、BHK、Vero、MDCK、永生化羊膜细胞系(CAP)、EB66、KGH6、NSO、SP2/0-Ag 14、P3X63Ag8.653、C127、JC、LA7、ZR-45-30、hTERT、NM2C5、UACC-812等。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并且可以随所用的宿主细胞而变化。
宿主细胞可以任选地属于转基因非人动物或转基因植物。在这种情况下，突变型含IgG1 Fc分子由此从转基因生物获得。
可通过将所需基因直接注射到受精卵中来获得转基因非人动物(Gordon等人,1980Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]；77:7380-4)。转基因非人动物包括小鼠、兔、大鼠、山羊、奶牛、家牛或家禽等。可以通过将所需基因导入胚胎干细胞中并由聚集嵌合体方法或注射嵌合体方法制备动物(Manipulating the Mouse Embryo[操作小鼠胚胎],A Laboratory Manual[实验室手册],第二版,冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach[基因靶向实用方法],牛津大学出版社的IRL出版社(IRL Press at Oxford University Press)(1993))来获得具有所需基因的转基因非人动物。胚胎干细胞的实例包括小鼠的胚胎干细胞(Evans和Kaufman,1981,Nature[自然]；292:154-156)、大鼠、山羊、兔、猴、家禽、家牛等。另外，还可以使用克隆技术制备转基因非人动物，所述克隆技术将导入了所需基因的细胞核移植到去核的卵中(Ryan等人,1997Science[科学]；278:873-876；Cibelli等人,1998Science[科学],280:1256-1258)。突变型含IgG1 Fc分子可以通过如下产生：将编码突变型含IgG1 Fc分子的DNA导入由上述方法制备的动物中，从而在动物中形成和积累突变体分子，然后从动物中收集突变体。可以使突变型含IgG1 Fc分子在动物的乳、蛋等中形成并积累。
在所有以上引用的实施例中，含IgG1 Fc分子可以是天然存在的多肽(野生型多肽)、天然存在的多肽的突变体或工程改造版本、或合成的多肽。
在一些实施例中，含IgG1 Fc分子选自以下组，该组由IgG1 Fc融合蛋白、IgG1 Fc缀合物和抗体组成。
如本文所用，Fc融合蛋白和Fc缀合物由连接至伴侣的Fc区组成。Fc区可以在有或没有间隔子(也称为接头)的情况下连接至其伴侣。
合适的接头是技术人员可以安排的。接头可以例如选自由以下组成的组：具有1至30个碳原子的烷基，具有1至20个乙烯部分的聚乙二醇，具有1至20个残基的聚丙氨酸，己酸，取代或未取代的聚对亚苯基和三唑。优选肽接头，更具体地，优选长度为1至30个氨基酸的寡肽。优选的长度范围是5至15个氨基酸。
特别优选的接头是肽，其由至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的小氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸)组成。特别优选的是仅由甘氨酸和丝氨酸组成的接头。合适的接头的非限制性实例是(G4S)3接头(SEQ ID NO:40)。
根据本发明，Fc融合蛋白是包含共价连接至Fc区的蛋白质、多肽或小肽的蛋白质。Fc融合蛋白任选地包含如上所述的肽接头。实际上，任何蛋白质或小肽都可以连接至Fc区以产生Fc融合体。蛋白质融合伴侣可以包括但不限于受体的靶结合区域、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或某些其他蛋白质或蛋白质结构域。Fc融合蛋白的一些非限制性实例包括阿法赛特(alefacept)、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)、列洛西普(rilonacept)、依那西普(etanercept)、罗米司亭(romiplostim)和阿柏西普(albifercept)。
特别地，Fc融合蛋白可以是免疫粘附素，即抗体样蛋白，其将异源“粘附”蛋白(即受体、配体或酶)的结合结构域与免疫球蛋白恒定结构域的片段(即Fc区)结合(参见有关免疫粘附素的综述，Ashkenazi A,Chamow SM.1997,Curr Opin Immunol.[免疫学当前观点]9(2):195-200)。
小肽可包括但不限于将Fc融合物导向治疗靶标的任何治疗剂。
根据本发明，在某些实施例中，Fc缀合物可以由Fc区与缀合物伴侣的化学偶联产生，并且任选地包含将Fc区与缀合物伴侣连接的间隔子。缀合物伴侣可以是蛋白质的或非蛋白质的。偶联反应通常使用Fc区上的和缀合物伴侣上的官能团。
合适的缀合物伴侣包括但不限于治疗性多肽、标记物(例如参见下文的标记物)、药物、细胞毒性剂、细胞毒性药物(例如化学治疗剂)、毒素和此类毒素的活性片段。合适的毒素及其相应的片段包括但不限于白喉毒素A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链等。细胞毒性剂可以是任何放射性核素，其可以直接与IgG1 Fc突变体偶联，或被与IgG1 Fc突变体共价附接的螯合剂隔离。在另外的实施例中，缀合物伴侣可以选自由以下组成的组：加利车霉素、瑞奥西汀(auristatins)、格尔德霉素、美登素和多卡米新(duocarmycins)和类似物。
在一个实施例中，含IgG1 Fc分子包含“Fynomer”。Fynomer是小的7-kDa球状蛋白，其衍生自人Fyn激酶的SH3结构域(Fyn SH3，Fyn激酶的aa 83-145：GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQIL
Figure BDA0002431529960000221
GDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO:59)。在如上所示的SEQ ID NO:59中，RT和src环的序列分别用下划线和双下划线标出，并且可以通过Fyn SH3结构域表面上的两个环(RT-和src-环)的随机突变(任选地与Fyn SH3结构域中其他选择的位置的突变组合)，将此类分子工程改造以抗体样的亲和力与特异性与几乎任何选择的靶标结合(参见，例如WO 2008/022759)。Fyn SH3衍生的多肽或Fynomer在本领域中是众所周知的，并且已经描述于下：例如Grabulovski等人(2007)JBC[生物化学杂志],282,第3196-3204页；WO 2008/022759；Bertschinger等人(2007)Protein Eng DesSel[蛋白质工程设计和选择]20(2):57-68；以及Gebauer和Skerra(2009)Curr Opinion inChemical Biology[化学生物当前选择]13:245-255。术语“Fyn SH3衍生的多肽”在本文中与术语“Fynomer”互换使用，是指衍生自人Fyn SH3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合多肽(例如，如Gebauer和Skerra(2009)Curr Opinion in Chemical Biology[化学生物当前选择]13:245-255中所述的所谓支架)。可以将Fynomer与其他分子(例如抗体)遗传融合，以创建所谓的FynomAb，所述FynomAb可经工程改造以具有双重特异性(例如Silacci等人,2016,mAbs[单克隆抗体]8:1,141-149；Brack等人,2014,Mol Cancer Ther[分子癌症治疗]13(8):第2030-9页；WO 2014/044758A1；WO 2014/170063A1；WO 2015/141862 A1)。
如所提到的，术语“抗体”在本文中以最广义使用。根据本发明，“抗体”是指任何多肽，其至少包含(i)Fc区和(ii)衍生自免疫球蛋白可变结构域的结合多肽结构域。所述结合多肽结构域能够特异性结合一个给定的靶抗原或一组靶抗原。源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域包含至少一个或多个CDR。本文中，抗体包括但不限于全长抗体、多特异性抗体、包含至少一个可变区的Fc融合蛋白或合成的抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、抗体融合蛋白、抗体缀合物和每种各自的片段。根据本发明的FynomAb还包含具有Fc区的抗体。本发明由此还提供包含具有根据本发明的突变(即在位置265处具有不同于D的氨基酸，在位置297处具有不同于N的氨基酸，在位置329处具有不同于P的氨基酸，其中编号根据Kabat等人的EU索引)的Fc区的FynomAb(即偶联至抗体的Fynomer的一个或多个拷贝)。Fynomer可以通过接头肽与抗体共价连接，或者可以直接与抗体融合。在某些实施例中，Fynomer可位于抗体重链的C末端的下游、或抗体重链的N末端的上游、或抗体轻链的C末端的下游、或抗体轻链的N末端的上游。优选地，将Fynomer的两个拷贝与抗体偶联，每个中的一个拷贝与抗体的两条链中的相应末端连接，例如一个拷贝位于抗体的第一半部分的轻链的N末端以及一个拷贝位于抗体的第二半部分的轻链的N末端(抗体的“半”在本文中指一起组成结合区的重链和轻链)，或者一个拷贝位于抗体的第一半部分的重链的N末端以及一个拷贝位于抗体的第二半部分的重链的N末端，或者一个拷贝位于抗体的第一半部分的轻链的C末端以及一个拷贝位于抗体的第二半部分的轻链的C末端，或者一个拷贝位于抗体的第一半部分的重链的C末端以及一个拷贝位于抗体的第二半部分的重链的C末端(参见例如Brack等人,2014,Mol Cancer Ther[分子癌症治疗]13:2030-2039，以及WO 2013/135588的图8，例如在IgG抗体四个末端的不同位置的Fynomer)。可以通过以下来产生此类融合：将编码Fynomer部分和各抗体链的核酸遗传工程改造、克隆在读框中以形成单个融合分子。在细胞内与抗体的另一条链(例如，如果Fynomer与重链融合，则为轻链；或如果Fynomer与轻链融合，则为重链)共表达将导致功能性Fynomab的表达。Fynomer部分可以结合至与抗体部分不同的靶分子(非限制性实例参见例如描述于Silacci等人,2016,mAbs[单克隆抗体]8:1,141-149；WO 2014/044758A1；WO 2014/170063 A1；WO 2015/141862 A1)或Fynomer部分可以与抗体部分结合同一靶分子上的不同表位(对于非限制性实例，参见在Brack等人,2014,Mol Cancer Ther[分子癌症治疗]13(8):第2030-9页；WO 2013/135588中描述的Fynomab)。
包含至少一个可变区的Fc融合蛋白是指工程改造的蛋白，其包含(i)Fc区和(ii)衍生自免疫球蛋白可变结构域的结合多肽结构域。特别受关注的是以下抗体，其包含(a)本发明的IgG1 Fc突变体，和(b)以下衍生自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域之一(即包含至少一个CDR)：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段、(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段、(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)分离的CDR区、(v)F(ab’)2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段(vi)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接(这允许两个结构域关联以形成抗原结合位点)、(vii)双特异性单链Fv和(viii)“双抗体”或“三抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段，该列表不是限制性的。
本文的“全长抗体”是指具有抗体的天然存在的生物形式的抗体，其包括可变区和恒定区。全长抗体可以是野生型抗体、野生型抗体的突变体(例如包含现存的修饰)、野生型抗体的工程改造形式(例如，比如嵌合的、人源化的抗体或完全人抗体，参见下文)，此列表不是限制性的。众所周知，全长抗体的结构通常是四聚体，除了一些哺乳动物(例如美洲驼和骆驼)，在所述一些哺乳动物中一些免疫球蛋白是二聚体。
全长抗体的支架成分可以是来自不同物种的混合物。此类抗体突变体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”均指组合来自一种以上物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自非人动物(通常是小鼠(或在某些情况下是大鼠))的一个或多个可变区和来自人的一个或多个恒定区。在大多数情况下，人源化抗体是嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，在人源化抗体中，除CDR外的整个抗体由人源的多核苷酸编码或与人抗体相同(除了其CDR之内)。将CDR(其一部分或全部由起源于非人有机体的核酸编码)移植到人抗体可变区的β-片层框架中以创建抗体，该抗体的特异性由移植的CDR确定。制备此类抗体的方法是众所周知的，并描述于例如，WO 92/11018；Jones,1986,Nature[自然]321:522-525；Verhoeyen等人,1988,Science[自然]239:1534-1536，Tsurushita和Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells[单克隆抗体的人源化，B细胞的分子生物学],533-545,Elsevier Science[爱思唯尔科学](美国))。
如本文所用，“完全人抗体”或“完整人抗体”是指完全包含起源于人基因的序列的抗体。在一些情况下，这可以是人抗体，其具有衍生自人染色体的带有本文概述的修饰的抗体的基因序列。可替代地，抗体的成分可以是人，但不是衍生自单个基因。因此，例如，可以将来自一个抗体的人CDR与来自一个或多个人抗体的序列(例如支架序列)组合。例如，各种种系序列可以组合以形成人抗体或人支架。
包含共价修饰的全长抗体也包括在本发明的范围内。此类修饰包括但不限于糖基化、进行标记和缀合。
进行标记是指可检测的标记与全长抗体的偶联。如本文所用，标记包括但不限于：a)同位素标记，其可以是放射性的或重同位素；b)磁性标记(例如，磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料例如发色团、荧光体和荧光团；酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)被二级报告子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。
缀合是指全长抗体与以下各项的偶联：多肽或非肽分子，例如受体的靶标结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、药物、细胞毒性剂(例如化学治疗剂)或毒素。
在某些实施例中，含IgG1 Fc分子选自以下组，该组由以下组成：嵌合免疫球蛋白、人源化免疫球蛋白、完全人免疫球蛋白、优选选自IgG并且任选地缀合或标记的免疫球蛋白。
因此除了结合C1q和Fcγ受体外(由于突变体与C1q和FcγRs的结合是由位置265、297和329处的氨基酸修饰控制的)，通常可以从野生型含IgG1 Fc分子的特性中推导突变型含IgG1 Fc分子的特性。除了这些高度相关的差异外，本发明的含Fc的分子及其相应的野生型在特性上也有一些细微的差异，例如由于缺乏N-联糖基化而导致的热稳定性轻微下降。
本发明的另一个目的是分离的核酸，其编码上文定义的突变型含IgG1 Fc分子。本发明还涉及载体，其包含编码突变型含IgG1 Fc分子的核酸，并且涉及包含所述载体的宿主细胞。在一个优选的实施例中，编码所述载体的核酸已经稳定地整合在宿主细胞的基因组中。本发明还涉及非人转基因动物，其包含稳定整合在其基因组中的所述核酸或所述载体。
根据本发明的方法和突变体的用途
申请人示出，IgG1 Fc区的氨基酸265、297和329的取代极大地削弱Fc突变体对C1q和对FcγR(例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIa)的亲和力。这些效应分子的亲和力的降低非常明显，以致在某些情况下，常规的AlphaScreenTM/SPR测定无法在体外观察到Fc突变体与C1q和/或某些FcγR的结合。IgG1 Fc区与C1q的结合对于体内CDC的诱导至关重要。同样地，IgG1 Fc区与FcγRIIa和FcγRIIIa的结合是体内诱导ADCC和ADCP的关键步骤。与FcγR的结合可以诱导同源受体的聚簇，这可以通过该受体向靶细胞提供激动信号。
因此，由于它们对C1q的亲和力较差，因此预期与野生型对应物(即含IgG1 Fc分子，其包含的IgG1 Fc区在位置265处具有氨基酸D，在位置297处具有氨基酸N，以及在位置329处具有氨基酸P，其中编号参考Kabat中的EU索引)相比，本发明的突变型含IgG1 Fc分子在体内不具有CDC活性或诱导的CDC应答显著降低。同样地，由于它们与某些FcγR(特别是FcγRIIa和FcγRIIIa)的亲和力较差，因此预期与野生型对应物相比，本发明的突变体在体内不具有ADCC活性或诱导的ADCC应答显著降低。同样地，预期本发明的突变体在体内不诱导经由FcγR参与的受体聚簇或激动。预期体外CDC测定\ADCC测定和受体聚簇测定也会获得相同的结果。
由于它们的效应子活性谱，本发明的突变体可以在广泛范围的科学领域中找到用途。特别地，本发明的突变体可以用作研究试剂、诊断剂或治疗剂。
例如，可以用荧光团或用同位素(例如铟-111或锝-99m)标记突变体并将其用于体内成像，因为在这种应用中不需要激活ADCC或CDC。
当用作治疗剂时，该突变体可用于将治疗剂(例如放射性核素、毒素、细胞因子或酶)运送至靶细胞(例如癌细胞)。在这种情况下，突变体可以是抗体和细胞毒性剂之间的缀合物，并且其治疗活性依赖于细胞毒性剂(例如Gilliland等人,PNAS[美国国家科学院院刊],1980,77,4539-4543)。
本发明的含IgG1 Fc分子还可以作用为靶分子的阻断剂或中和剂。它也可以激动、拮抗或抑制靶分子。
本发明的含IgG1 Fc分子可以用于在不诱导经由FcγR的聚簇或激动的情况下靶向受体。
靶分子可以是任何种类，并且包括外源和内源分子。靶分子(当多肽突变体是抗体或包含抗体时也称为抗原)包括但不限于病毒、细菌和真菌蛋白、朊病毒、毒素、酶、膜受体、药物和可溶性蛋白。
膜受体包括但不限于RhD抗原、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD32B、CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD71(转铁蛋白受体)、CD80、CD86、CTLA-4、CD147、CD160、CD224、生长因子受体(例如属于受体ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4(EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)的ErbB家族的那些)、PD1、VEGF-R1、VEGF-R2、IGF-R1、PIGF-R、I类MHC和II类MHC分子(例如HLA-DR)、、I型干扰素受体、白介素受体(例如IL-1R、IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ)、IL-6R、激素受体(例如缪勒(Müllerian)抑制性物质II型受体)、LDL受体、NKp44L、趋化因子受体(例如CXCR4、CCR5、TNFR、CD137、整合素、粘附分子(例如CD2、ICAM、EpCAM、G蛋白偶联受体)等。
其他潜在的靶蛋白包括肿瘤标志物(例如GD2、GD3、CA125、MUC-1、MUC-16、癌胚抗原(CEA)、Tn、糖蛋白72、PSMA、HMW-MAA)、其他对DC细胞具有特异性的蛋白(例如BDCA-2)、胰高血糖素样肽(例如、GLP-1等)、酶(例如、葡萄糖脑苷脂酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α半乳糖苷酶-A、半乳糖苷酶α和β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性内肽酶、髓过氧化物酶等)、白介素和细胞因子结合蛋白(例如IL-18bp、TNF结合蛋白等)、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子等。
可溶性蛋白包括但不限于细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、TGFβ、TNFα、IFNγ)、趋化因子、生长因子(例如VEGF、G-CSF、GM-CSF、EGF、PIGF、PDGF、IGF、激素和抑制性抗体(例如FVIII抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、抗凝血酶III、凝血酶受体活化肽、血栓调节蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XIII、纤溶酶原活化因子、血纤蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、B细胞活化因子受体、受体拮抗剂(例如IL1-Ra)、补体蛋白C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、H因子、I因子、P因子、其他蛋白质(例如CSAP、CD137-配体、凝集素、唾液酸化的蛋白质)。
在一些示例性和非限制性实施例中，含IgG1 Fc分子可以选自抗CD3、抗HER2和抗PD1抗体或包含此类抗体的分子。
在某些实施例中，含IgG1 Fc分子包含抗CD3抗体。在某些实施例中，本发明的分子包含与CD3结合的抗体，以及与另一靶标结合的另一结合部分，例如Fynomer，即它具有双特异性结合活性。此类分子可以是用于治疗癌症的激动性mAb，并且例如在本文的实例中更详细地描述。
在一些实施例中，突变型含IgG1 Fc分子是或包含针对靶分子的中和抗体，所述靶分子选自下组：膜受体、人可溶性蛋白、毒素、病毒、细菌和真菌蛋白。
由于其与C1q和某些FcγR的低结合，本发明的突变体特别适合用于治疗以下病症：其中免疫系统通过ADCC或CDC的募集、或经由FcγR的同源受体聚簇或激动对于治疗效率不是至关重要的。
在一些情况下，预期与大多数在IgG1 Fc区的氨基酸位置265、297和329处不包含突变的抗体和免疫粘附素相比，本发明的突变型含IgG1 Fc分子的施用会诱导更少的副作用和更少的IgG介导的细胞毒性。
因此，本发明的另一个目的是本发明的突变型含IgG1 Fc分子用于预防或治疗病理病症的用途，在所述病理病症中，FcR介导的作用(包括诱导ADCC和/或CDC应答、或经由FcγR的同源受体聚簇)是不期望的。
当突变体的治疗功效不需要效应细胞活化或CDC活化时，诱导ADCC和CDC应答是不期望的。此类突变体包括例如阻断抗体或中和抗体。
治疗或预防不需要诱导CDC和ADCC的病理状况包括但不限于移植物排斥、自身免疫性疾病、炎性疾病。
当突变体的治疗功效不需要FcγR介导的受体聚簇以达到治疗功效时，诱导经由FcγR的受体聚簇是不期望的。此类突变体包括例如CD3/肿瘤抗原双特异性分子，其需要以严格的肿瘤抗原依赖性方式(而不是以FcγR依赖性方式)使CD3受体聚簇。
在某些实施例中，本发明提供根据本发明的FynomAb(即包含具有CH2结构域的IgG1 Fc区，其中位置265处的氨基酸不是D、位置297处的氨基酸不是N、以及位置329处的氨基酸不是P，其中编号根据Kabat中的EU索引)，其具有与CD3结合的抗体部分和与CD33结合的Fynomer部分。
本发明的另一个目的是本发明的突变体用于制备药物组合物的用途。
本发明的另一个目的是提供包含所述突变体的药物组合物。当突变型含IgG1 Fc分子是抗体时，所述突变体可以单克隆或多克隆抗体的形式存在。通过将具有所需纯度的多肽突变体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制品或水溶液形式来制备药物组合物。
本发明的药物组合物可以根据标准方法配制，所述标准方法例如描述在Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践](Lippincott Williams&Wilkins[利平科特威廉姆斯.威尔金斯]；第二十一版,2005)中的那些。
可以使用的药学上可接受的赋形剂特别地描述在Handbook of PharmaceuticalsExcipients[药物赋形剂手册](美国药学学会(American Pharmaceutical Association)(医药出版社(Pharmaceutical Press)；第6版修订,2009))中。
为了治疗有此需要的患者，可以施用治疗有效剂量的本发明的突变型含IgG1Fc分子。本文的“治疗有效剂量”是指针对其施用产生效果的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定。剂量可以在0.0001mg/kg至100mg/kg体重或更高的范围内，例如0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、或50mg/kg体重，其中0.001mg/kg至10mg/kg是优选的。如本领域中已知的，对蛋白质降解、全身相对于局部递送、和新蛋白酶合成的速率、以及年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症的严重性的调节可能是必要的，并且将由本领域技术人员通过常规实验确定。
包含本发明的突变型含IgG1 Fc分子的药物组合物的施用可以多种方式进行，其包括但不限于：口服、皮下、静脉内、肠胃外、鼻内、皮质内、眼内、直肠、阴道、经皮、局部(例如，凝胶)、腹膜内、肌肉内、肺内。
本文所述的突变型含IgG1 Fc分子可以任选地与其他治疗剂伴随施用，即，本文所述的治疗剂可以任选地与其他疗法或治疗剂(包括例如，小分子、其他生物制剂、放射疗法、手术等)共同施用。
所述主题的示例性实施例
为了更好和更全面地描述本文的主题，本节提供了所提出主题的列举的示例性实施例。
列举的实施例：
实施例
1.一种重组的含IgG1 Fc分子，所述重组的含IgG1 Fc分子包含CH2结构域，在所述CH2结构域中，位置265处的氨基酸不同于天冬氨酸(D)、位置297处的氨基酸不同于天冬酰胺(N)、位置329处的氨基酸不同于脯氨酸(P)，其中编号由Kabat中的EU索引指示。
2.如实施例1所述的分子，其中所述分子与具有包含位置265处的D、位置297处的N和位置329处的P的野生型CH2结构域的含IgG1 Fc分子相比，具有降低的与C1q和与至少一种Fcγ受体(FcγR)的结合。
3.如实施例1或2所述的分子，其中所述分子保留与FcRn的结合。
4.如实施例2-3中任一项所述的分子，其中至少一种FcγR是FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、和FcγRIIIb。
5.如实施例1-4中任一项所述的分子，其中
i.位置265处的氨基酸是丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)或谷氨酸(E)，
ii.位置297处的氨基酸是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)或谷氨酰胺(Q)，并且
iii.位置329处的氨基酸被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或丝氨酸(S)替代。
6.如实施例1-5中任一项所述的分子，其中所述Fc结构域氨基酸序列与人IgG1 Fc结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)至少90％相同。
7.如实施例1-6中任一项所述的分子，其中所述分子是抗体、Fc区、Fc融合蛋白或抗体融合蛋白例如FynomAb。
8.如实施例1-7中任一项所述的分子，其中所述分子是抗体。
9.如实施例1-7中任一项所述的分子，其中所述分子是抗体融合蛋白。
10.如实施例1-7中任一项所述的分子，其中所述分子是FynomAb。
11.如实施例1-10中任一项所述的分子，其中所述分子包含Fc区，所述Fc区包含根据SEQ ID NO:43、52、53、54、55、56、57或58中任一项的序列，其中位置265处的氨基酸D、位置297处的氨基酸N和位置329处的氨基酸P被其他氨基酸替代。
12.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码如前述实施例中任一项所述的分子。
13.一种载体，所述载体包含如实施例12所述的多核苷酸。
14.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如实施例12所述的重组多核苷酸或如实施例13所述的载体。
15.一种制备重组的含IgG1 Fc分子的方法，所述重组的含IgG1 Fc分子包含CH2结构域，在所述CH2结构域中在位置265、297和329处的氨基酸被其他氨基酸替代，所述位置由Kabat中的EU索引指示，所述方法包括以下步骤：
a.提供编码野生型含IgG1 Fc分子的核酸，
b.修饰步骤(a)中提供的核酸，以获得编码重组的含IgG1 Fc分子的核酸，其中位置265、297和329处的氨基酸分别被D、N和P以外的氨基酸替代，以及
c.在宿主细胞中表达在步骤(b)中获得的核酸并回收所述突变体。
16.一种重组多肽，所述重组多肽包含
a.至少一个能够结合靶分子的结合结构域；和
b.IgG1 Fc结构域，其中根据Kabat中的EU索引的位置265、297和329处的氨基酸分别不同于D、N和P，
其中所述多肽能够结合所述靶分子而不会触发显著的淋巴细胞活化、补体依赖性裂解和/或所述靶分子和/或在其表面展示所述靶分子的细胞的细胞介导的破坏。
17.如实施例16所述的重组多肽，其中所述至少一个结合结构域选自由以下组成的组：抗体的结合位点、Fynomer、酶、激素、受体的细胞外结构域、细胞因子、免疫细胞表面抗原、配体和粘附分子。
18.如实施例16或17所述的重组多肽，其中所述Fc结构域与人IgG1 Fc结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)至少90％相同。
19.如实施例16-18中任一项所述的重组多肽，其中所述结合结构域是抗体的结合位点。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施例1-11中任一项所述的含IgG1Fc分子、如实施例12所述的重组多核苷酸、如实施例13所述的载体或如实施例16-19中任一项所述的重组多肽、和药学上可接受的赋形剂。
21.一种治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者或患者施用如实施例1-11中任一项所述的含IgG1 Fc分子、如实施例12所述的重组多核苷酸、如实施例13所述的载体、如实施例16-19中任一项所述的重组多肽、或如实施例20所述的药物组合物。
22.如实施例21所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。
23.如实施例1-11中任一项所述的含IgG1 Fc分子、如实施例12所述的重组多核苷酸、如实施例13所述的载体、如实施例16-19中任一项所述的重组多肽、或如实施例20所述的药物组合物，用于治疗疾病或障碍。
24.如实施例23所述的含IgG1 Fc分子、重组多核苷酸、载体或重组多肽，其中所述疾病或障碍是癌症。
25.如实施例1-11中任一项所述的含IgG1 Fc分子、如实施例12所述的重组多核苷酸、如实施例13所述的载体、如实施例16-19中任一项所述的重组多肽、或如实施例20所述的药物组合物用于制造用于治疗疾病或障碍的药物的用途。
26.如实施例25所述的用途，其中所述疾病或障碍是癌症。
27.一种产生重组的含IgG1 Fc分子的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达如实施例12所述的重组多核苷酸并收获所述重组多肽。
实例
提供以下实例以补充现有披露并提供对本文所述主题的更好理解。这些实例不应被视为限制所描述的主题。应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且根据其进行的各种修改或改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且将被包括在其中并且可以在不脱离本发明的范围的情况下做出。
实例1.Fc突变的抗体的表达和纯化
产生了若干种基于mAb1(mAb1是对人CD3特异的人IgG1抗体)的在CH2结构域中具有不同的突变的抗体。所述突变是：
-i)N297A，
-ii)D265加P329A(DAPA)，
-iii)D265加N297A加P329A(DANAPA)，和
-iv)L234A加L235A(LALA)
(根据Kabat的EU编号(Kabat,E.A.(1991).Sequences of proteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列],贝塞斯达,马里兰州:美国卫生与公共服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service)，美国国立卫生研究院，1991)。
为了表达抗体，通常存在前导序列，其被切除并且不再存在于分泌产物中。SEQ IDNO:42中提供了用于在本文所述的实例中表达的前导序列的实例，而SEQ ID NO:41中提供了编码该前导序列的核苷酸序列的实例。
将编码具有不同Fc突变的抗体的表达载体瞬时转染到FreeStyle CHO-S细胞中，并在无血清/无动物成分的培养基中表达6天。用
Figure BDA0002431529960000342
Purifier仪器(GE医疗集团(GEHealthcare))通过蛋白A亲和色谱(GE医疗集团目录号89928)从上清液中纯化抗CD3抗体，并针对PBS进行透析。通过在280nm处的吸光度测量来确定浓度。
使用SEC-5柱(安捷伦公司(Agilent)，5μm粒径，
Figure BDA0002431529960000343
)在安捷伦HPLC1260系统上进行SEC。将10μl纯化的蛋白质上样到柱上，并通过OD280测量记录洗脱。
Fc突变的抗体突变体可以通过一步蛋白A亲和色谱法以高产率和高纯度进行纯化。产率列于表1。
SEC发现，所有蛋白质均为约95％单体。mAb1 IgG1和mAb1 DANAPA IgG1的SEC图谱如图1所示。
这些结果表明，插入人IgG1序列中的DANAPA三重突变保留了良好的表达和单分散性，这两者都是医药产品的关键标准。
表1.mAb1突变体的蛋白质产率
Figure BDA0002431529960000341
Figure BDA0002431529960000351
实例2：Fc突变的抗体以与未修饰的抗体相同的亲和力结合至表达CD3的细胞
在CD3+Jurkat细胞(
Figure BDA0002431529960000352
TIB-152TM)上滴定不同的Fc突变的mAb1，以评估其与人CD3的结合亲和力。将浓度在50nM和0.13pM之间的Fc突变的抗体的系列稀释液添加到Jurkat细胞中，并用抗人IgG-Alexa488缀合抗体检测结合的抗体。将在细胞计数器上确定的平均荧光强度(MFI)针对抗体浓度(对数标度)作图。
在CD3+Jurkat细胞上获得的结合曲线如图2所示。
Fc突变的抗体突变体以相同的亲和力与CD3结合，表明Fc突变对靶细胞的结合没有任何影响。
实例3：MAb1 DANAPA IgG1不诱导淋巴细胞活化
为了研究Fc突变的mAb1对免疫细胞活化的影响，将新鲜分离的人PBMC在Fc突变的mAb1存在的情况下进行孵育。通过以下来检测免疫细胞活化：i)孵育14h后CD69表面染色，或ii)孵育3天后上清液中的IFNγ定量。
在PBMC分离的前一天，从瑞士的Blutspende Bern收集的血沉棕黄层制剂中分离出人PBMC。根据制造商的说明，使用Pancoll管(泛生物技术公司(Pan-BioTech))通过密度离心分离PBMC。PBMC分离后，将残留的红细胞用1x RBC裂解缓冲液(美天旎公司(Miltenyi))裂解。
将100’000新鲜分离的PBMC在96孔U型底板的孔中在补充10％热灭活FBS的总体积200μl RPMI1640中与mAb1的各种Fc突变体的系列稀释液混合(浓度在300nM和0.15pM之间)作为阳性对照，PBMC在购自美天旎公司的人T细胞活化/扩增试剂盒中所含的抗CD2/CD3/CD28活化MACSi珠的存在下孵育。
孵育14小时后确定CD69表面表达。混合测定孔的内容物，并将每孔100μl转移至96孔U型底板中，用于随后的CD69染色。沉淀细胞并重悬于含有1％FBS和0.2％叠氮化钠的FACS缓冲液中的40μl抗CD69-FITC偶联抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))中。在冰上孵育45分钟后，将未结合的抗体洗掉，将样品在冰上在50μl 1.8％福尔马林中固定15分钟，然后在Guava easeCyte 8HT流式细胞仪(密理博公司(Millipore))上进行分析。将CD69阳性淋巴细胞百分比针对抗体浓度(对数标度)作图。
孵育3天后，根据制造商的说明使用BD OptEIA人类IFNγELISA试剂盒(BD生物科学公司)确定上清液中的IFNγ水平。将IFNγ浓度针对抗体浓度(对数标度)作图。
出乎意料的是，mAb1 DANAPA IgG1是唯一不诱导淋巴细胞活化的构建体，如在PBMC上缺乏CD69表达的诱导(图3A)和在培养上清液中缺乏IFNγ(图3B)所证明。相比之下，含有先前报道可降低FcR结合的其他单个或组合Fc突变的所有突变体仍会诱导显著的淋巴细胞活化。重要的是，DANAPA Fc序列比N297A Fc序列或LALA Fc序列(在临床阶段的含治疗性Fc的若干种蛋白中使用的两个沉默Fc序列，对于这些蛋白需要最小的FcR相互作用)产生更好的沉默。这些结果表明，在人PBMC测定中，DANAPA Fc序列赋予诱导T细胞活化和细胞因子释放的强烈降低的潜力。
实例4：DANAPA IgG1展示了与人类Fcγ受体的最小结合
通过AlphaScreenTM竞争测定来表征与FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)和FcγRIIIA(CD16A)的结合(Vafa,O.,G.L.Gilliland,R.J.Brezski,B.Strake,T.Wilkinson,E.R.Lacy,B.Scallon,A.Teplyakov,T.J.Malia和W.R.Strohl(2014).Methods[方法]65(1):114-126)。该测定在图4A中示意性地示出。生物素化的对照抗体被捕获在链霉亲和素供体珠上；带His标签的Fcγ受体被捕获在Ni2+接受体珠上；将未标记的具有目标Fc的抗体的系列稀释液用作竞争者。当竞争者的受体结合发生时，这种形式产生的信号降低。
B21M(一种对呼吸道合胞病毒具有特异性的人IgG1对照抗体，并且被认为不会与健康哺乳动物中的任何靶标特异性结合(Vafa,O.,G.L.Gilliland,R.J.Brezski,B.Strake,T.Wilkinson,E.R.Lacy,B.Scallon,A.Teplyakov,T.J.Malia和W.R.Strohl(2014).Methods[方法]65(1):114-126))用生物素标记(SureLINK生色生物素标记试剂盒(SureLINK Chromophoric Biotin Labeling Kit),KPL)。将0.2μg/ml生物素化B21M IgG1对照抗体、Fc突变的测试抗体(400μg/ml，及其八个系列3倍稀释)、带His标签的人Fcγ受体(R&D，无载体配制品)，Ni2+-接受体珠(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)，1:250稀释)、和链霉亲和素供体珠(珀金埃尔默公司，1:250稀释)按照上述顺序在测定缓冲液(PBS，0.05％BSA，0.01％Tween 20，pH 7.2)中混合。人Fcγ受体的使用浓度如下：FcγRI和FcγRIIIA，浓度是200ng/ml；FcγRIIA是10ng/ml；FcγRIIB是14ng/ml。
对于FcγRI的结合评估，使用生物素化的B21M LALA IgG1代替B21M IgG1(重链SEQ ID NO:18；轻链SEQ ID NO:32)以提高测定的灵敏度。B21M LALA IgG1(重链SEQ IDNO:30；轻链SEQ ID NO:32)在L234和L235处带有两个丙氨酸取代(也参见实例1)，这降低了对FcγRI的结合亲和力。
孵育30分钟后，在EnVision读板器中分析板。
通过使用以下公式归一化为最小和最大信号，从原始EnVision数据中获取％Max信号：
％Max＝(Exp-Min)/(Max-Min)*100
其中
Exp＝EnVision原始孔信号
Min＝在板上所有测试的竞争者中，在最高竞争者浓度下获得的最小信号。
Max＝最大信号，即通常在没有竞争者的情况下。
％Max值在GraphPad Prism中绘制为在y轴上的平均值±标准偏差(n＝3)，和在x轴上的log(抑制剂)。使用具有可变希尔斜率的四参数Log(抑制剂)相比应答模型，通过非线性回归拟合数据，
为了证实AlphaScreenTM竞争测定的结果，通过表面等离子共振(SPR)分析了Fc突变的mAb1突变体与高亲和力FcγRI(CD64)和与低亲和力FcγRIIIA(CD16A)的结合。使用BIAcore胺偶联试剂盒(GE医疗集团)，将1400RU的人重组FcγRIIIA(158F；R&D系统公司(R&D Systems))或1500RU的人重组FcγRI(义翘神州科技有限公司(Sino Biological))包被BIAcore CM5芯片。制备了在2000nM和31nM之间浓度的Fc突变的mAb1的系列两倍稀释液，并在补充0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS中以30μl/min注射到FcR包被的芯片表面上以及未包被的参考表面上。在各注射之间，芯片表面用10mM NaOH再生。将获得的结合曲线减去参考值，然后减去缓冲液，然后使用BIAcore评估软件(使用1:1Langmuir动力学模型获得动力学缔合和解离常数kon和koff，从中计算热力学解离常数KD为koff/kon，或者使用稳态亲和力模型直接获得热力学解离常数KD)评估生成的双参考曲线。
AlphaScreenTM竞争测定的结果如图4B和表2所示。mAb1 DANAPA IgG1显示出对FcγRI的最小竞争(IC50>1000nM)，其与未修饰的IgG1相比降低了400倍以上，表明该Fc序列具有最小的残留FcγRI结合活性。出乎意料的是，与临床阶段抗体(对于其需要最小的FcR相互作用)中使用的LALA Fc或N297A Fc序列相比，DANAPA Fc显示出与FcγRI的显著降低的结合。mAb1 LALA IgG1、mAb1 N297A IgG1和mAb1 DAPA IgG1显示出与人FcγRI降低的结合，但仍比mAb1 DANAPA IgG1强37倍以上(IC50＝27nM、24nM和18nM)。
没有发现mAb1 DANAPA IgG1、mAb1 DAPA IgG1和mAb1 N297A IgG1与任何其他人FcγR结合。观察到mAb1 LALA IgG1与FcγRIIIA结合，与FcγRIIB的结合非常弱。
BIAcore结合测定的结果示于图4C和表3(FcγRI结合)，以及示于图4D和表4(FcγRIIIA结合)。出乎意料的是，mAb1 DANAPA IgG1完全消除了与FcγRI的结合。尽管与mAb1IgG1相比亲和力降低，但mAb1 DAPA IgG1、mAb1 N297A IgG1和mAb1 LALA IgG1保留了与FcγRI的残留结合活性。mAb1 DANAPA IgG1不与人FcγRIIIA结合。类似地，mAb1 DAPA IgG1和mAb1 N297A IgG1不显示结合，而mAb1 LALA IgG1显示与FcγRIIIA的残留结合，尽管与mAb1 IgG1相比活性降低。
结论是，这些结果证明了DANAPA Fc序列与人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的结合显著降低。与先前已知导致FcγR结合活性降低的其他单个或组合Fc突变相比，DANAPA Fc序列具有的降低FcR结合活性的程度要好得多。这些结果进一步表明，DANAPAFc与此处测试的其他Fc之间的主要区别在于与FcγRI的结合显著降低。
表2-与FcγRI竞争结合的IC50值
Figure BDA0002431529960000391
表3-与FcγRI结合的参数(BIAcore)
Figure BDA0002431529960000392
n.b.:未观察到结合(已分析数据)
n.d.:未确定(观察到结合，但未分析动力学数据)
表4-与FcγRIIIA结合的参数(BIAcore)
Figure BDA0002431529960000393
n.b.:未观察到结合(未分析数据)
实例5：DANAPA IgG1 FC在不同抗体序列的背景下显示出降低的FcγR结合
除了以上先前实例中提供的mAb1 DANAPA IgG1以外，还以如实例1中针对mAb1所述的DANAPA IgG1形式生成了具有不同Fab序列和不同同源靶标的三种抗体：抗CD3抗体mAb2(重链SEQ ID NO:14；轻链SEQ ID NO:16)、抗HER2抗体(重链SEQ ID NO:10；轻链SEQID NO:12)和抗PD1抗体(重链SEQ ID NO:6；轻链SEQ ID NO:8)。如实例4中所述，在AlphaScreenTM竞争测定中将FcγR结合活性与mAb1 DANAPA IgG1进行比较。
结果如图5所示。DANAPA IgG1形式的CD3特异性抗体mAb2、HER2特异性抗体和PD-1特异性抗体均显示出与FcγRI的最小结合(IC50＝600nM或更高)，并且与其他测试的FcR无结合。这些数据表明，无论Fab序列或同源靶标如何，DANAPA IgG1序列均会大大降低FcR结合，并可能使FcγR与几乎任何抗体的结合最小。
实例6：在D265、N297、和P329处具有取代的MAb1显示与人FcγR1降低的结合
为了确定DANAPA Fc与Fc受体结合的能力大大降低是否可以通过用与丙氨酸不同的氨基酸取代同一组残基(即D265、N297和P329)来反映，如实例1中所述产生了具有以下取代的mAb1：
a)D265N、N297D、P329G(称为DNNDPG)
(重链SEQ ID NO:18；轻链SEQ ID NO:4)
b)D265E、N297Q、P329S(称为DENQPS)
(重链SEQ ID NO:20；轻链SEQ ID NO:4)
如实例4中所述，在AlphaScreenTM竞争测定中将FcγRI结合活性与mAb1 DANAPAIgG1进行比较。
结果如图6所示。所有这三种抗体均显示出与FcγRI的最小结合，这种相互作用显然是最难于通过Fc工程来消除的(参见实例4)。这些结果表明，可以通过用不同的氨基酸残基取代三个残基D265、N297和P329来降低FcγRI相互作用，而不仅仅是通过用丙氨酸取代。
实例7：DANAPA IgG1消除C1q结合
C1q与抗体Fc的结合是诱导抗体介导的补体活化和随后的补体介导的靶细胞裂解的第一步。在BIAcore T100仪器上的SPR结合测定中测量了mAb1DANAPA IgG1与人C1q的结合。通过胺偶联以5000RU的包被密度将抗体包被到CM5芯片上。将人C1q(默克密理博(EMDMillipore))在运行缓冲液(PBS pH7.4，0.05％TWEEN-20)中以200nM和其三倍系列稀释液以流速30μl/min进行注射。记录结合，并且使用BIAcore软件使用稳态亲和力模型通过曲线拟合确定KD。
实验结果如图7所示。mAb1 IgG1以30nM的表观KD表现出与C1q的强结合，这与该相互作用的已公开亲和力值一致，并验证了测定设置(Moore GL,等人(2010),Mabs[单克隆抗 体]2(2):181-189)。
mAb1 DANAPA IgG1未显示与C1q的任何可检测结合。
值得注意的是，类似的Fcγ1序列DANA Fcγ1(其组合了D265A和N297A突变，但缺乏DANAPA Fcγ1中存在的P329A突变)已在文献中描述为显示出残留的C1q结合(Gong,Q,等人(2005),J Immunol[免疫学杂志]174(2):817-826)。
与DANA Fcγ1相比，mAb1 DANAPA IgG1显著证明了完全丧失与C1q的结合。
实例8：DANAPA突变不会削弱与人FcRn的结合
IgG Fc与FcRn的相互作用在抗体周转中起重要作用(Kuo TT和VG Aveson(2011),MAbs[单克隆抗体]3(5):422-430)。细胞通过胞吞作用摄取的IgG在内体的酸性环境中与FcRn受体接合。FcRn将IgG循环回到细胞表面，在此处抗体在中性或碱性pH下从FcRn解离，从而从溶酶体降解中解救出来。该机制为IgG的较长血清半衰期提供了解释。因此，为了具有长的循环半衰期，重要的是在酸性pH下在Fc中具有取代的抗体保持与FcRn的完全结合并且在中性pH下容易解离。
人FcγR结合至IgG抗体下部铰链的残基和CH2结构域(Woof JM和DR Burton(2004),Nat Rev Immunol[自然免疫学评论]4(2):89-99)，而人FcRn与CH2-CH3界面中的多个残基相互作用(Martin WL等人(2001),Mol Cell[分子细胞]7(4):867-877)。因此，以降低FcR结合为目的引入的突变可能对Fc-FcRn相互作用产生影响。例如，Shields等人观察到下部铰链或CH2结构域中的某些导致FcγR结合降低的突变也导致FcRn结合降低(例如E233P，Q295A)。因此，评估DANAPA突变对FcRn结合的影响尤为重要。
通过表面等离子共振(SPR)分析DANAPA IgG1与FcRn的结合。使用BIAcore胺偶联试剂盒(GE医疗集团)，将600RU的人重组FcRn(义翘神州科技有限公司)包被BIAcore CM5芯片。制备了在2000nM和31nM之间浓度的DANAPA Fc突变的mAb1的和未突变的mAb1 IgG1的系列两倍稀释液，并在补充0.05％Tween-20的pH 6.0的PBS中以30μl/min注射到FcRn包被的表面上以及未包被的参考表面上。在各注射之间，芯片表面用PBS pH 7.4再生。将获得的结合曲线减去参考，然后减去缓冲液，然后使用BIAcore评估软件，使用稳态亲和力模型评估所得的双参考曲线，以获得热力学解离常数KD。
与人FcRn的结合测定结果如图8所示。解离常数KD对于mAb1 DANAPA IgG1是500nM，并且对于mAb1 IgG1是470nM，表明与人FcRn的结合没有差异。mAb1 DANAPA IgG1在中性pH下显示出快速解离，并且具有与mAb1 IgG1基本相同的解离动力学。这些结果表明，尽管与FcγR的结合被消除，mAb1 DANAPA IgG1仍保留与FcRn的IgG1样结合。
实例9：MAb1 DANAPA IgG1展示出IgG1样药代动力学谱
良好的药代动力学特性，即循环中的半衰期长，是基于抗体的药物产品必须满足的关键标准之一。抗体Fc序列的工程改造可能对药代动力学谱有意想不到的影响。例如，具有包含五个突变以降低Fc受体结合的Fc序列(“LFLEDANQPS”[注意：根据Kabat编号，最后的P至S突变位于位置331，即，与本公开中的突变体不同的位置])的抗体的清除率与野生型IgG1相比提高了3至5倍，导致终末半衰期比相应的野生型IgG1更短(WO 2014108483)
研究了mAb1 DANAPA IgG1在C57BL/6小鼠(查尔斯河(Charles River))中的药代动力学谱，并将其与mAb1 IgG1进行了比较。用10mg/kg mAb1 DANAPA IgG1或mAb1 IgG1静脉内注射五只C57BL/6小鼠。在10分钟、6小时、24小时、48小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时和216小时后，将血液收集到EDTA包被的微量容器(microvettes)(莎斯特公司(Sarstedt))中，在9300g下离心10分钟，并通过Fc特异性夹心ELISA测定mAb1 DANAPAIgG1和mAb1 IgG1的血清水平。透明的maxisorp微量滴定板(Nunc)用440倍稀释的Fc特异性抗人IgG1捕获抗体(I2134，西格玛公司(Sigma))包被。用PBS中的2％BSA(西格玛公司)封闭后，应用40μl PBS和10μl适当稀释度的血浆。孵育1小时后，将孔用PBS洗涤，并用10’000倍稀释的Fc特异性HRP缀合抗人IgG1检测抗体(A0170，西格玛公司)检测结合的mAb1 DANAPAIgG1或mAb1 IgG1。用QuantaRed荧光底物(皮尔斯公司(Pierce))进行测定，并在2至4分钟后在544nm(激发)和590nm(发射)下测量荧光强度。使用相应抗体的标准曲线确定mAb1DANAPA IgG1和mAb1 IgG1的血浆水平。血浆中的抗体暴露以历时216小时的半对数图显示。
mAb1 DANAPA IgG1和mAb1 IgG1的药代动力学谱显示在图9中。重要且不可预测地，在本发明之前，mAb1 DANAPA IgG1具有与mAb1 IgG1基本相同的药代动力学特性。
实例10：具有DANAPA IgG1 Fc的CD33 X CD3双特异性FYNOMAB显示出降低的FcγR结合
与表达Fc受体的细胞相互作用后，含Fc的双特异性T细胞结合分子(其具有对肿瘤抗原特异的第一结合位点和对T细胞特异的第二结合位点)可以诱导肿瘤非依赖性T细胞活化和细胞因子释放(脱肿瘤效应)(参见WO 2012143524)。为了减轻这种风险，可以为此类分子配备具有最小内在FcγR亲和力的工程改造的Fc序列。
CD3/CD33双特异性FynomAb通过使用柔性(G4S)3接头(SEQ ID NO:40)将CD33特异性Fynomer G1(SEQ ID NO:36)或CD33特异性Fynomer D5(SEQ ID NO:38)与人源化CD3特异性抗体mAb2(重链SEQ ID NO:14；轻链SEQ ID NO:16)的轻链的C末端融合而产生。如实例4所述，在AlphaScreenTM竞争测定中确定这些FynomAb的FcγR结合。
将CD3/CD33 FynomAb的FcγR结合与COVA467(重链SEQ ID NO:26；轻链SEQ IDNO:28)进行比较，COVA467是先前描述的具有LALA IgG1 Fc(即具有L234A和L235A突变的IgG1 Fc)的CD3/CD33 FynomAb，通过将CD33特异性Fynomer B3融合到CD3特异性抗体mAb3轻链的C末端而产生(参见WO 2014170063)。B21M IgG1用作阳性对照(参见实例4)。
结果如图10所示。尽管COVA467显示出与人FcγRIIIA和FcγRI的残留结合(IC50＝390nM和29nM)，但与COVA467相比，具有DANAPA IgG1 Fc的两种FynomAb没有显示与FcγRIIIA的任何结合并且与FcγRI的结合大大降低(分别地，IC50＝206nM或800nM)。对于所述构建体未发现与FcγRII A和B的显著结合。
这些结果表明，与COVA467相比，具有DANAPA IgG1 Fc的CD3/CD33双特异性FynomAb显示出降低的FcγR结合。因此，它们诱导不希望的非肿瘤T细胞活化和细胞因子释放的潜力降低，并且代表了CD3/CD33双特异性FynomAb的改进突变体。
表5-序列
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Claims (20)

1.一种重组的含IgG1Fc分子，所述重组的含IgG1Fc分子包含CH2结构域，在所述CH2结构域中，位置265处的氨基酸不同于天冬氨酸(D)、位置297处的氨基酸不同于天冬酰胺(N)、并且位置329处的氨基酸不同于脯氨酸(P)，其中
所述分子与包含位置265处的D、位置297处的N和位置329处的P的野生型含IgG1Fc分子相比，具有降低的与C1q和与至少一种Fcγ受体(FcγR)的结合，
并且其中编号由Kabat中的EU索引指示。
2.如权利要求1所述的分子，其中所述分子保留与FcRn的结合。
3.如权利要求1或2所述的分子，其中至少一种FcγR是FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、和FcγRIIIb。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分子，其中
i.位置265处的氨基酸是丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)或谷氨酸(E)，
ii.位置297处的氨基酸是丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)或谷氨酰胺(Q)，并且
iii.位置329处的氨基酸被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或丝氨酸(S)替代。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分子，其中所述CH2结构域包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少80％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分子，其中所述Fc结构域包含与包含SEQ ID NO:43的人IgG1Fc结构域的氨基酸序列至少80％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分子，其中所述分子是抗体、Fc区、Fc融合蛋白或抗体融合蛋白例如FynomAb。
8.如权利要求1-7中任一项所述的分子，其中所述分子包含Fc区，所述Fc区包含根据SEQ ID NO:43、52、53、54、55、56、57或58中任一项的序列，其中位置265处的氨基酸D、位置297处的氨基酸N和位置329处的氨基酸P被其他氨基酸替代。
9.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码如前述权利要求中任一项所述的分子。
10.一种载体，所述载体包含如权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求9所述的重组多核苷酸或如权利要求10所述的载体。
12.一种制备重组的含IgG1Fc分子的方法，所述重组的含IgG1Fc分子包含CH2结构域，在所述CH2结构域中在位置265、297和329处的氨基酸被其他氨基酸替代，所述位置由Kabat中的EU索引指示，所述方法包括以下步骤：
a.提供编码野生型含IgG1Fc分子的核酸，
b.修饰步骤(a)中提供的核酸，以获得编码重组的含IgG1Fc分子的核酸，其中位置265、297和329处的氨基酸分别被D、N和P以外的氨基酸替代，并且
c.在宿主细胞中表达在步骤(b)中获得的核酸并回收所述突变体。
13.一种重组多肽，所述重组多肽包含
a.至少一个能够结合靶分子的结合结构域；以及
b.IgG1Fc结构域，其中根据Kabat中的EU索引的位置265、297和329处的氨基酸分别不同于D、N和P，
其中所述多肽能够结合所述靶分子而不会触发显著的淋巴细胞活化、补体依赖性裂解和/或所述靶分子和/或在其表面表达所述靶分子的细胞的细胞介导的破坏。
14.如权利要求13所述的重组多肽，其中所述至少一个结合结构域选自由以下组成的组：抗体的结合位点、Fynomer、酶、激素、受体的细胞外结构域、细胞因子、免疫细胞表面抗原、配体和粘附分子。
15.如权利要求13或14所述的重组多肽，其中所述Fc结构域与包含SEQ ID NO:43的人IgG1Fc结构域的氨基酸序列至少80％，优选至少90％相同。
16.如权利要求13-15中任一项所述的重组多肽，其中所述结合结构域是抗体的结合位点。
17.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-8中任一项所述的含IgG1Fc分子、如权利要求9所述的重组多核苷酸、如权利要求10所述的载体或如权利要求13-16中任一项所述的重组多肽、和药学上可接受的赋形剂。
18.一种治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者或患者施用如权利要求1-8中任一项所述的含IgG1Fc分子、如权利要求9所述的重组多核苷酸、如权利要求10所述的载体、如权利要求13-16中任一项所述的重组多肽、或如权利要求17所述的药物组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。
20.一种产生重组的含IgG1Fc分子的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达如权利要求9所述的重组多核苷酸并收获所述重组多肽。
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