BR112021000631A2

BR112021000631A2 - Composições, sistemas e métodos com baixo teor de endotoxina

Info

Publication number: BR112021000631A2
Application number: BR112021000631-1A
Authority: BR
Inventors: Christopher Michael Kevin Springate; Ian Millet; Sailesh Haresh Daswani; Hesong Sun; Aileen Shao Ting Yang; Hoi Ting Wong; Anuj Yadav; Gemma Regan
Original assignee: Arc Medical Devices Inc.
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2021-04-06
Also published as: WO2020019081A1; CA3106464A1; MX2021000863A; SG11202100390SA; WO2020019079A1; JP7477238B2; PH12021550106A1; US11938145B2; PH12021550105A1; US20210290658A1; JP2022177066A; AU2019312088A1; CN112533989A; US11446326B2; AU2019310360B2; BR112021000623A2; TW202019444A; PH12021550103A1; TW202007399A; AU2019310194B2

Abstract

composições, sistemas e métodos com baixo teor de endotoxina.composições de fucano com baixo teor de endotoxina compreendendo um fucano terapeuticamente eficaz, medicamente aceitável em uma composição que compreende menos de cerca de 0,2, 0,18, 0,1, 0,01, 0,001 ou 0,0005 unidades de endotoxina (eu) por miligrama de fucano são descritas. métodos e sistemas para remover ou reduzir a quantidade de endotoxinas de uma composição de fucano de partida são da mesma forma descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES, SISTEMAS E MÉTODOS COM BAIXO TEOR DE ENDOTOXINA".

PEDIDO DE PRIORIDADE

[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisória dos Estados Unidos copendente no. 62.711.364, depositado em 27 de julho de 2018; O pedido provisório de patente dos Estados Unidos nº 62.711.372, depositado em 27 de julho de 2018; O pedido provisório de patente dos Estados Unidos nº 62/711.335, depositado em 27 de julho de 2018; Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. de série 62/713.399, depositado em 1 de agosto de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos nº 62/722.135, depositado em 23 de agosto de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos No. 62/755.311, depositado em 2 de novembro de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos nº 62/793.514, depositado em 17 de janeiro de 2019; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos nº 62/861.223, depositado em 13 de junho de 2019; Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos copendente No. de série 62/713.392, depositado em 1 de agosto de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos No. 62/713.413, depositado em 1 de agosto de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos nº 62/722.137, depositado em 23 de agosto de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos No. 62/755.318, depositado em 2 de novembro de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos nº 62/861.228, depositado em 13 de junho de 2019; Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos copendente No. de série 62/755.328, depositado em 2 de novembro de 2018; Pedido de patente provisório dos Estados Unidos No. 62/793.654, depositado em 17 de janeiro de 2019; e, pedido de patente provisório dos Estados Unidos No. 62/861.235, depositado em

13 de junho de 2019, todos os pedidos são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] Fucanos (incluindo fucoidano) são polissacarídeos sulfatados. Em termos gerais, isso significa que eles são moléculas compostas por vários grupos de açúcar e também têm átomos de enxofre ligados aos grupos de açúcar. O principal grupo de açúcares é denominado "fucose", que é um açúcar com 6 átomos de carbono e fórmula química C6H12O5. "Fucoidano" (ou fucoidina) indica fucanos derivados de algas marrons (algas marinhas). Os fucanos podem existir sozinhos ou em uma mistura de outros açúcares, por exemplo, em uma mistura de açúcares como xilose, galactose, glicose, ácido glicurônico e/ou manose. Esses outros açúcares podem ser extraídos das algas marinhas ou de outra fonte com o fucano. Embora os fucanos sejam atualmente derivados de fontes naturais, como algas marrons (algas marinhas), pepinos do mar, etc., mencionados aqui, "fucanos" inclui moléculas de polímero com os motivos químicos e estruturais dos fucanos, conforme discutido neste documento, independentemente da fonte (s) final (is) dos fucanos.

[003] O fucoidano pode ser obtido a partir de uma variedade de espécies de algas marrons, incluindo, mas não se limitando a: Adenocystis utricularis, Ascophyllum nodosum, Chorda filum, Cystoseirabies marina, Durvillaea antarctica, Ecklonia kurome, Ecklonia maxima, Eisenia bicyclis, Fucus evanescens, Fucus vesiculosis, Hizikia fusiforme, Himanthalia Elongata, Kjellmaniella crassifolia, Laminaria brasiliensis, Laminaria cichorioides, Laminaria hyperborea, Laminaria japonica, Laminaria saccharina, Lessonia trabeculata, Macrocystis pyrifera, Pelvetia fastigiata, Pelvetia Canaliculata, Saccharina japonica, Saccharina latissima, Sargassum stenophylum, Sargassum thunbergii, Sargassum confusum,

Sargassum fusiforme e Undaria pinnatifida. Essas espécies exemplares são todas da classe taxonômica Phaeophyceae e a maioria dessas espécies se enquadra nas famílias de Fucales e Laminariaceae.

[004] Fucanos, incluindo fucoidano, mostraram ser eficazes em servir para inibir, prevenir, remover, reduzir ou tratar de outra forma a formação de aderências fibrosas. Eles também encontraram uso no tratamento de outras doenças e condições relacionadas.

[005] Os lipopolissacarídeos, também conhecidos como endotoxinas, são moléculas tóxicas mantidas dentro de uma célula bacteriana e liberadas após a destruição da parede celular bacteriana ou segregadas da parede celular bacteriana como parte da atividade fisiológica da bactéria. Existem muitos métodos bem apresentados na técnica para a separação de endotoxina de uma molécula de interesse. Esses métodos, embora eficientes para a maioria das aplicações, não funcionam adequadamente na presença de fucanos. Parte da relação para isso é que muitos desses métodos dependem do isolamento das endotoxinas com base em grupos fosfato carregados negativamente. Na presença de fucanos, esses métodos sofrem efeitos de interferência dos grupos sulfato presentes nas moléculas de fucanos. Outros métodos conhecidos envolvendo tratamentos químicos resultam na degradação do fucano, o que pode ser um efeito indesejável. A descrição atual aborda métodos econômicos, escalonáveis e/ou não destrutivos para degradação, eliminação e/ou remoção de endotoxinas e outras impurezas de composições de fucano, como fucanos matéria-prima e/ou outras vantagens.

SUMÁRIO

[006] Composições e métodos, etc., aqui compreendem composições com baixo teor de endotoxina com fucano tendo um baixo nível de endotoxinas que são adequadas para aplicações médicas e cirúrgicas, por exemplo, a inibição, prevenção, remoção, redução ou outro tratamento de aderências fibrosas. Estas composições de fucano com baixo teor de endotoxina reduzem complicações perigosas durante o uso médico e cirúrgico de fucanos devido a endotoxinas, tais como inflamação, febre e endotoxemia. Essas reduções de endotoxinas podem ser de cerca de uma redução de 95 % a cerca de uma redução de 99 %, 99,9 %, 99,99 %, 99,999 %, 99,9999 % a 99,99999 %. Em certas modalidades, as composições de fucano apresentadas neste documento têm níveis de endotoxina baixos o suficiente para tornar as composições adequadas para aplicações médicas e cirúrgicas.

[007] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina apresentadas neste documento fornecem composições de uma composição de fucano desejada obtida a partir de uma composição de fucano de partida (isto é, composições de fucano a partir das quais as composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser derivadas; tais composições de fucano de partida podem ou não ser cru ou ter sido previamente processado ou purificado, tal como uma composição de fucano matéria-prima), bem como métodos de obtenção de tais composições de fucano com baixo teor de endotoxina desejadas e métodos de uso de tais composições.

[008] Em alguns aspectos, as composições, sistemas, métodos, etc., aqui compreendem composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem compreender menos do que cerca de 0,2, 0,18, 0,16, 0,1, 0,09, 0,06, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,007, 0,003, 0,002, 0,001, 0,0006 ou 0,0005 unidades de endotoxina por miligrama de fucano.

[009] Em algumas modalidades, os fucanos podem ter uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 60 % em p/p da distribuição pode ser maior que 100 kDa quando medido usando uma cromatografia de permeação em gel aquoso configurada consistindo essencialmente em: uma coluna de cromatografia de permeação em gel analítica de 300 mm com um diâmetro interno de 7,8 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, tendo uma faixa de peso molecular efetivo entre cerca de 50 kDa e cerca de

5.000 kDa, uma coluna de cromatografia de permeação em gel analítica de 300 mm com um diâmetro interno de 7,8 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, tendo uma faixa de peso molecular efetivo de entre cerca de 1 kDa e cerca de 6.000 kDa e uma coluna de guarda de 40 mm com um diâmetro interno de 6 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, as duas colunas de cromatografia de permeação em gel analítica e uma coluna de guarda contida em um compartimento de coluna a cerca de 30 ⁰C; um detector de índice refrativo em cerca de 30 ⁰C; fase móvel de nitrato de sódio 0,1 M conduzida a 0,6 mL/min; e quantificação contra uma curva padrão de peso molecular máximo consistindo essencialmente em um primeiro padrão de dextrano com um peso molecular máximo de cerca de 2.200 kDa, um segundo padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 720 kDa e cerca de 760 kDa, um terceiro padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 470 kDa e cerca de 510 kDa, um quarto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 370 kDa e cerca de 410 kDa, um quinto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 180 kDa e cerca de 220 kDa, e um sexto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 40 kDa e 55 kDa.

[0010] Os fucanos podem ter uma distribuição de peso molecular em que pelo menos: 75 % em p/p da distribuição pode ser maior do que 100 kDa; 98 % em p/p da distribuição pode ser maior que 100 kDa; 81 % em p/p da distribuição pode ser maior que 200 kDa; 92 % em p/p da distribuição pode ser maior que 200 kDa; 97 % em p/p da distribuição pode ser maior que 200 kDa; 44 % em p/pda distribuição pode ser maior que 500 kDa; 61 % em p/p da distribuição pode ser maior que 500 kDa; 70 % em p/p da distribuição pode ser maior que 500 kDa; 80 % em p/p da distribuição pode ser maior que 500 kDa; 5% em p/p da distribuição pode ser maior que 1600 kDa; 10 % em p/p da distribuição pode ser maior que 1600 kDa; 24 % em p/p da distribuição pode ser maior do que 1600 kDa; 31 % em p/p da distribuição pode ser maior que 1600 kDa. Além disso, os fucanos podem ter um peso molecular médio ponderado superior a 100 kDa; maior que 200 kDa ou maior que 500 kDa.

[0011] Os fucanos podem ter um nível de sulfatação entre cerca de 20 % em p/p e 60 % em p/p, entre cerca de 30 % em p/p e 55 % em p/p, entre cerca de 32 % em p/p e 52 % em p/p. Os fucanos podem ter um teor total de carboidratos entre 27 % em p/p e 80 % em p/p e um teor total de fucose como uma porcentagem do teor total de carboidratos de pelo menos cerca de 30% em p/p, 50% em p/p, 70% em p/p, 80% em p/p, 90% em p/p ou 95% em p/p. Os fucanos podem ter um teor total de galactose como uma porcentagem do teor total de carboidratos abaixo de cerca de 60 % em p/p, entre cerca de 2% em p/p e 20% em p/p, ou abaixo de cerca de 10 % em p/p.

[0012] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina quando dissolvidas em água a uma concentração de 50 mg/mL podem ter uma viscosidade entre cerca de 4 cP e 50 cP, entre cerca de 10 cP e 40 cP, ou entre cerca de 15 cP e 30 cP. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser um sólido branco e, quando dissolvidas em água a uma concentração de 1 mg/mL a 100 mg/mL,

forma uma solução que pode ser incolor transparente. Os fucanos podem conter menos de 5 % ou 2 % em p/p de teor de acetila. Além disso, os fucanos podem compreender um teor de acetila de substancialmente 0 % em p/p quando medido por coerência quântica múltipla heteronuclear 1H-13C 2D a 70 °C com supressão de sinal de solvente em um espectrômetro de 600 MHz equipado com sonda fria de 5 mm, na faixa de 10-30 ppm na dimensão do carbono, em 8 incrementos de 256-512 varreduras cada.

[0013] Também estão incluídos aqui métodos de produção e uso de fucanos e composições de fucano com baixo teor de endotoxinas aqui. O uso pode compreender o tratamento de aderências fibrosas.

[0014] Em certos aspectos, as composições, sistemas, métodos, etc., aqui compreendem composições medicamente aceitáveis de fucano com baixo teor de endotoxina podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui em um tampão ou diluente medicamente aceitável. Também são fornecidas dosagens de fucano com baixo teor de endotoxina que podem compreender as composições medicamente aceitáveis de fucano com baixo teor de endotoxina aqui em que a dose medicamente aceitável de fucano com baixo teor de endotoxina tem um nível de endotoxina igual ou menor do que 250 EU, 50 EU, 20 EU, 10 EU, 2 EU, 1 EU, 0,1 EU ou 0,01 EU. Essas composições e dosagens medicamente aceitáveis de fucano com baixo teor de endotoxina podem ter as distribuições de peso molecular e outros parâmetros aqui discutidos, como nos parágrafos acima.

[0015] Em outros aspectos, as composições, sistemas, métodos, etc., aqui compreendem métodos de tratamento de uma condição ou doença em um animal que pode compreender a seleção das composições medicamente aceitáveis de fucano com baixo teor de endotoxina para tratar a condição ou doença e a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz pode compreender ou entre cerca de 0,5 mg/kg e 50 mg/kg dos fucanos para o animal. As quantidades também podem ser iguais ou entre cerca de 0,04 mg/kg e 25 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg e 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg e 5 mg/kg, 0,5 mg/kg e 3 mg/kg ou 5 mg/kg e 10 mg/kg.

[0016] A condição ou doença pode ser uma aderência fibrosa em um sítio alvo no animal e a administração pode compreender a administração da quantidade terapeuticamente eficaz ao sítio alvo. As composições médicas podem compreender entre cerca de 0,02 mg/mL e 100 mg/mL do fucano das composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui, e a composição médica pode ser configurada e composta para tratar uma doença ou condição em um animal. As quantidades também podem ser em ou entre cerca de 0,5 mg/mL e 5 mg/mL, ou cerca de 2,5 mg/mL. A composição médica pode ser um dispositivo médico, que pode ser um dispositivo médico líquido. A composição médica pode ser uma composição farmacêutica, incluindo uma composição farmacêutica líquida.

[0017] Os métodos aqui incluem o uso de uma faixa de dosagens que pode compreender entre cerca de 0,01 mL/kg e 15 mL/kg das composições médicas para tratar uma doença ou condição em um animal. As quantidades também podem ser em ou entre cerca de 0,03 mL/kg e 4 mL/kg, 0,06 mL/kg e 2 mL/kg, ou 2 mL/kg e 4 mL/kg.

[0018] Os métodos para o tratamento de aderências fibrosas em um paciente podem compreender a administração das composições médicas a um sítio alvo no paciente. O sítio alvo pode ser um sítio cirúrgico e a administração pode ser realizada pelo menos a) após a abertura de uma ferida cirúrgica no sítio cirúrgico, b) durante a cirurgia e c) após o fechamento da ferida cirúrgica, incluindo após a cirurgia, mas antes de fechar a ferida cirúrgica. A administração pode levar menos de 3 minutos, 2 minutos ou 1 minuto. O sítio alvo pode serpelo menos um dentre um sítio de lesão, abrasão e ferimento. O sítio alvo pode ser pelo menos um dentre uma cavidade pélvica, uma cavidade abdominal, uma cavidade dorsal, uma cavidade craniana, uma cavidade espinhal, uma cavidade ventral, uma cavidade torácica, uma cavidade pleural, uma cavidade pericárdica, pele, uma articulação, um músculo, um tendão e um ligamento.

[0019] Em outros aspectos, as composições, sistemas, métodos, etc., aqui compreendem métodos para remover impurezas de uma composição de fucano de partida para obter composições de baixo teor de endotoxina em fucano. Esses métodos podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida compreendendo impurezas; adicionar um auxiliar de floculação à composição de fucano de partida para produzir uma mistura de reação; flocular as impurezas por aquecimento da mistura de reação para produzir impurezas floculadas; e remover as impurezas floculadas.

[0020] O fornecimento da composição de fucano de partida pode compreender o fornecimento da composição de fucano de partida como uma solução e o método pode compreender ainda a coleta das composições de fucano com baixo teor de endotoxina em uma solução de impurezas reduzidas. Os métodos podem compreender ainda a floculação das impurezas por aquecimento da mistura de reação em excesso da pressão atmosférica. O auxiliar de floculação pode compreender um sal, que pode ser um cloreto, brometo, iodeto, fluoreto, sulfato, sulfito, carbonato, bicarbonato, fosfato, nitrato, nitrito, acetato, citrato, silicato e/ou cianeto de um metal alcalino, alcalino- terroso metal, alumínio e/ou amônio. O auxiliar de floculação pode compreender uma base, que pode ser um hidróxido e/ou óxido de um metal alcalino, metal alcalino-terroso, alumínio e/ou amônio.

[0021] Outros métodos podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida compreendendo impurezas e um agente de ruptura capaz de desregular as células e a agregação de endotoxinas em uma solução; e submeter a solução a filtração de fluxo tangencial através de um filtro de filtração de fluxo tangencial para produzir uma composição de fucano retentado que pode compreender as composições de fucano com baixo teor de endotoxina e agente de ruptura residual.

[0022] A remoção do agente de ruptura residual pode ser conseguida por filtração de fluxo tangencial através de um filtro de filtração de fluxo tangencial para produzir uma segunda composição de fucano retentado que pode compreender as composições de fucano com baixo teor de endotoxina. Os métodos podem compreender ainda: remover o agente de ruptura residual tratando a composição de fucano retentado com um agente precipitante capaz de precipitar o agente de desagregação para produzir um precipitado do agente de desagregação e uma composição de fucano sobrenadante; e separar o precipitado do agente de ruptura da composição de fucano sobrenadante.

[0023] Os métodos podem compreender ainda a coleta das composições de fucano com baixo teor de endotoxina em uma solução de impurezas reduzidas. O agente de ruptura pode compreender pelo menos um detergente, que pode ser um detergente aniônico, um detergente catiônico ou um detergente não iônico. O detergente pode compreender pelo menos um dentre dodecilsulfato de sódio (SDS), cloreto de benzalcônio, Triton® X 100, Triton® X 114 e desoxicolato de sódio.

[0024] O agente de precipitação pode compreender pelo menos um dentre cloreto de potássio, hidróxido de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de bário e carbonato de cálcio.

[0025] Outros métodos podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida como um sólido e um meio de extração incapaz de dissolver fucanos, configurado para dissolver impurezas; misturar a composição de fucano de partida com o meio de extração para produzir uma mistura das composições de fucano com baixo teor de endotoxina e o meio de extração; e separar as composições de fucano com baixo teor de endotoxina do meio de extração.

[0026] Os métodos podem compreender ainda a coleta das composições de fucano com baixo teor de endotoxina como um sólido. O meio de extração pode compreender pelo menos um solvente orgânico com uma polaridade relativa menor do que 0,765. O solvente orgânico pode compreender pelo menos um dentre etanol, isopropanol, metanol, benzeno, éter dietílico, decametilciclopentassiloxano, acetato de etila, butanol, hexano, heptano, heptanol, octanol e decanol. O meio de extração pode ainda compreender pelo menos um dentre uma base, um detergente e um agente oxidante. O fornecimento da composição de fucano de partida em uma forma sólida que pode compreender a precipitação da composição de fucano de partida de uma solução. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina contêm menos endotoxina do que a composição de fucano de partida.

[0027] Ainda outros métodos podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida compreendendo impurezas, incluindo impurezas suspensas em uma solução; precipitar as impurezas da solução usando um precipitante de impurezas multivalente iônico, produzindo assim uma mistura de impurezas suspensas, impurezas precipitadas e uma solução de sobrenadante; e separar as impurezas suspensas e as impurezas precipitadas da solução de sobrenadante.

[0028] Os métodos podem compreender ainda a coleta da solução de sobrenadante que pode compreender as composições de fucano com baixo teor de endotoxina. O precipitante de impureza multivalente iônico pode compreender um sal de um cátion divalente ou trivalente. O sal pode ser um cloreto, brometo, iodeto, fluoreto, sulfato, sulfito, carbonato, bicarbonato, fosfato, nitrato, nitrito, acetato, citrato, silicato e/ou cianeto. O cátion pode ser um metal alcalino-terroso, zinco, alumínio, cobre e/ou ferro. O precipitante de impureza pode compreender uma base de um cátion divalente ou trivalente. A base pode ser um hidróxido e/ou óxido de um metal alcalino-terroso, zinco, alumínio, cobre e/ou ferro. A separação das impurezas suspensas e impurezas precipitadas da solução de sobrenadante pode compreender a floculação das impurezas suspensas e impurezas precipitadas pela adição de um floculante à mistura de impurezas suspensas, impurezas precipitadas e solução de sobrenadante. O floculante pode compreender pelo menos um dentre sulfato de alumínio e potássio; sulfato de sódio e alumínio; sulfato de amônio e alumínio; cloreto de cálcio; fosfato de sódio; hidróxido de alumínio; cloreto de alumínio; cloreto férrico; sulfato férrico; sulfato ferroso; silicato de sódio; silicato de cálcio; fosfato de cálcio; cloreto de zinco; carbonato de cálcio; bicarbonato de cálcio; sulfato de potássio; fosfato de magnésio; acrilamidas; ácido acrílico; cloridrato de alumínio; cloreto de polialumínio; taninos; formaldeído; melamina; cloreto de metila de

N,N-dimetilaminoetil acrilato; quaternário de cloreto de metila de N,N- dimetilaminoetil metacrilato; e cloreto de polidialildimetil-amônio. Os métodos podem compreender ainda manter um pH entre cerca de 7 e 14; manter o pH pode compreender a adição de base.

[0029] Outros métodos podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida compreendendo impurezas; ajustar o pH da composição de fucano de partida entre cerca de 8 e 14; adicionar à composição de fucano de partida um agente de ruptura celular configurado para lisar componentes celulares para produzir uma mistura de reação que pode compreender o agente de desagregação celular, lisados biomoleculares e a composição de fucano de partida; e remover o agente de ruptura celular e lisados biomoleculares da mistura de reação.

[0030] O fornecimento da composição de fucano de partida pode compreender o fornecimento da composição de fucano de partida como uma solução. Os métodos também podem compreender a coleta das composições de fucano com baixo teor de endotoxina em uma solução de impurezas reduzidas. O agente de ruptura celular pode compreender um detergente. O detergente pode ser um detergente aniônico, um detergente catiônico ou um detergente não iônico. O detergente pode compreender pelo menos um dentre dodecilsulfato de sódio (SDS), cloreto de benzalcônio, Triton X 100®, Triton X 114®, detergentes Brij®, detergentes Tween®, desoxicolato de sódio e alquilbenzenossulfonatos.

[0031] A remoção do agente de ruptura celular e dos lisados biomoleculares pode compreender adicionar à mistura de reação um floculante configurado para flocular o agente de ruptura celular e os lisados biomoleculares. A remoção do agente de ruptura celular pode compreender adicionar à mistura de reação um precipitante capaz de tornar o agente de ruptura celular insolúvel na mistura de reação, produzindo precipitados. A remoção dos lisados biomoleculares pode compreender adicionar à mistura de reação um precipitante configurado para tornar os lisados biomoleculares insolúveis na mistura de reação, produzindo precipitados. Os métodos podem compreender ainda adicionar à mistura de reação um floculante configurado para flocular os precipitados. O floculante pode compreender pelo menos um dentre sulfato de alumínio e potássio; sulfato de sódio e alumínio; sulfato de amônio e alumínio; cloreto de cálcio; fosfato de sódio; hidróxido de alumínio; cloreto de alumínio; cloreto férrico; sulfato férrico; sulfato ferroso; silicato de sódio; silicato de cálcio; fosfato de cálcio; cloreto de zinco; carbonato de cálcio; bicarbonato de cálcio; sulfato de potássio; fosfato de magnésio; acrilamidas; ácido acrílico; cloridrato de alumínio; cloreto de polialumínio; taninos; formaldeído; melamina; cloreto de metila de N,N- dimetilaminoetil acrilato; quaternário de cloreto de metila de N,N- dimetilaminoetil metacrilato; e cloreto de polidialildimetil-amônio. A remoção do detergente aniônico pode compreender a adsorção aniônica. A remoção do detergente catiônico pode compreender adsorção catiônica; a remoção do detergente não iônico pode compreender a separação da fase micelar; a remoção do detergente pode compreender adsorção hidrofóbica.

[0032] A remoção do detergente pode compreender: diluir a mistura de reação até que a concentração do detergente possa estar abaixo de uma concentração predeterminada; e submeter a mistura de reação compreendendo o detergente à diafiltração sobre um filtro de filtração de fluxo tangencial com uma redução de peso molecular acima do maior peso molecular do detergente.

[0033] Os métodos podem compreender ainda adicionar um agente quelante à mistura de reação após fornecer a composição de fucano de partida e antes de remover o agente de ruptura celular. O agente quelante pode compreender ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), 2,3-dimercapto-1-propanol, etilenodiamina, porfina e/ou ácido cítrico. Os métodos também podem compreender a adição de um agente de extinção de oxidante à mistura de reação antes de remover o agente de ruptura celular para extinguir oxidantes na mistura de reação. Os métodos podem compreender ainda a adição de um agente bacteriostático à mistura de reação após fornecer a composição de fucano de partida e antes de remover o agente de ruptura celular. O agente bacteriostático pode compreender sulfito de sódio, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), cloreto de benzalcônio, etanol e/ou tioureia.

[0034] Ainda outros métodos podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida compreendendo endotoxinas e uma resina macroporosa de permuta aniônica; submeter a composição de fucano de partida a uma permuta aniônica com a resina macroporosa de permuta aniônica para produzir as composições de fucano com baixo teor de endotoxina.

[0035] Os métodos podem compreender ainda o pré-tratamento da composição de fucano de partida com um agente de ruptura capaz de romper a agregação das endotoxinas e podem compreender a dessalinização da composição de fucano de partida antes de submeter a composição de fucano de partida à permuta aniônica com a permuta aniônica resina macroporosa. A resina macroporosa de permuta aniônica pode ter um tamanho de poro maior do que o raio hidrodinâmico médio das endotoxinas na composição de fucano de partida. O fornecimento da composição de fucano de partida e da resina macroporosa de permuta aniônica pode compreender o fornecimento da composição de fucano de partida e da resina macroporosa de permuta aniônica em uma relação de massa da composição de fucano de partida: resina macroporosa de permuta aniônica entre cerca de 1:100 e cerca de 10:1 A relação de massa também pode estar entre cerca de 1:50 e cerca de 1:1, ou cerca de 1:10 e cerca de 1:1. A composição de fucano de partida pode ser submetida a permuta aniônica por um período entre cerca de 5 minutos e cerca de 100 horas, ou entre cerca de 1 hora e cerca de 30 horas. A resina macroporosa de permuta aniônica pode compreender grupos amina quaternária. A resina macroporosa de permuta aniônica pode compreender pelo menos um dentre grupos amina primária, secundária e terciária. A resina macroporosa de permuta aniônica pode ser composta de pelo menos um dentre estireno, agarose, dextrano, acrilato, metacrilato, metacrilato de metila, metacrilato de butila, divinilbenzeno, celulose, sílica e cerâmica. A resina macroporosa de permuta aniônica pode ter um tamanho de poro entre cerca de 5 nm e cerca de 1000 nm, ou entre cerca de 10 nm e cerca de 100 nm, ou entre cerca de 15 nm e cerca de 50 nm. A resina macroporosa de permuta aniônica pode ter um limite de exclusão entre cerca de 5 kDa e cerca de 50.000 kDa, ou entre cerca de 1.000 kDa e cerca de 9.000 kDa, ou entre cerca de 5 kDa e cerca de 200 kDa.

[0036] Ainda outros métodos adicionais podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida compreendendo impurezas em uma solução de partida aquosa; misturar a solução de partida aquosa com um solvente orgânico para produzir uma mistura de fase orgânica aquosa; e separar a mistura de fase aquosa-orgânica para obter uma porção aquosa e uma porção orgânica.

[0037] A coleta da porção aquosa pode compreender as composições de fucano com baixo teor de endotoxina. O solvente orgânico pode compreender pelo menos um solvente orgânico com uma polaridade relativa menor que 0,765. Os valores de polaridade relativa podem ser normalizados a partir de medições de desvios de solvente de espectros de absorção. Veja, por exemplo, Christian Reichardt, Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry, Wiley- VCH Publishers, 3a. ed., 2003. O solvente orgânico pode compreender pelo menos um dentre etanol, isopropanol, metanol, benzeno, decametilciclopentassiloxano, acetato de etila, hexano, heptanol, octanol, decanol, heptano, acetato de isobutilo, anisol, acetato de isopropilo, 1-butanol, acetato de butila, metilisobutilcetona, pentano, 1- pentanol, éter etílico e acetato de propila.

[0038] As composições processadas de fucano com baixo teor de endotoxina aqui contêm menos endotoxina do que a composição de fucano de partida.

[0039] Estes e outros aspectos, características e modalidades são apresentados neste pedido, incluindo a seguinte Descrição Detalhada e desenhos anexos. A menos que expressamente indicado de outra forma, todas as modalidades, aspectos, recursos, etc., podem ser misturados e pareados, combinados e permutados de qualquer maneira desejada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0040] A FIG. 1 representa esquematicamente um sistema de filtração de fluxo tangencial para obter uma redução de impurezas, incluindo endotoxinas, de uma composição de fucano de partida.

[0041] A FIG. 2 representa esquematicamente um sistema para obter uma redução desejada no nível de endotoxina em uma composição de fucano de partida usando absorção de ânions.

[0042] A FIG. 3A representa resultados de RMN demonstrando que certos fucanos tratados de acordo com métodos aqui sofrem alterações estruturais químicas para os fucanos.

[0043] A FIG. 3B representa resultados de RMN 2-D demonstrando que certos fucanos tratados de acordo com métodos aqui sofrem alterações estruturais químicas para os fucanos.

[0044] Os desenhos apresentam exemplos da presente descrição. Os desenhos não estão necessariamente em escala e certas características podem ser exageradas ou de outra forma representadas de uma maneira para ajudar a ilustrar e explicar os presentes sistemas, métodos, etc. As modalidades reais dos sistemas, métodos, etc., neste documento podem incluir outras características ou etapas não mostrado nos desenhos. As exemplificações apresentadas neste documento ilustram modalidades dos sistemas, métodos, etc., em uma ou mais formas, e tais exemplificações não devem ser interpretadas como limitando o escopo da descrição de qualquer maneira. As modalidades neste documento não são exaustivas e não limitam a descrição à forma precisa descrita, por exemplo, na seguinte descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0045] As composições, sistemas, métodos atuais, etc., aqui apresentados compreendem composições de fucano purificadas, por exemplo, composições de fucano com baixo teor de endotoxina. As presentes composições podem ser eficazes para tratamentos médicos, tratamentos pós-cirúrgicos, inibição de doenças, etc. Em algumas modalidades, o fucano é fucoidano. As presentes composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser, ou podem ser incluídas em ou em dispositivos médicos, materiais médicos, produtos de combinação ou em composições farmaceuticamente aceitáveis, terapeuticamente e/ou medicamente eficazes.

[0046] Os parágrafos a seguir se voltam para uma breve discussão geral de algumas das composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui, incluindo aquelas que podem ser criadas usando as metodologias aqui discutidas. Composições

[0047] As composições, sistemas, etc. atuais aqui apresentados fornecem, em certas modalidades, composições de fucanos e fucanos medicamente aceitáveis com baixo teor de endotoxina compreendendo quantidades terapeuticamente eficazes de fucanos com baixo teor de endotoxina para o tratamento de aderências fibrosas, tais como aderências cirúrgicas, artrite, psoríase ou outras doenças conforme desejado.

[0048] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina apresentadas neste documento podem ser usadas para uma pluralidade de aplicações, incluindo a inibição, prevenção, remoção, redução ou outro tratamento de aderências fibrosas e outros alvos, doenças e/ou condições. O tratamento inclui que as composições reduzem ou previnem o desenvolvimento de uma doença alvo ou outra condição, como a redução ou prevenção da formação de aderências fibrosas em um sítio alvo, que é tipicamente um sítio alvo selecionado identificado por um cirurgião ou outro médico como compreendendo ou sendo razoavelmente suscetível a ter aderências fibrosas (ou outras doenças ou condições), e também inclui a eliminação de doenças existentes ou outras condições, incluindo, por exemplo, a eliminação de aderências fibrosas já existentes. Para tal inibição, prevenção, remoção, redução ou outro tratamento, a composição de fucano pode ser fornecida em um dispositivo médico medicamente aceitável, materiais médicos, produto de combinação ou composição farmaceuticamente eficaz que contém componentes adicionais, tais como ligantes, adjuvantes, excipientes, etc., bem como, se desejado,

substâncias medicamente ativas adicionais, como fármacos secundários que estão contidos na composição, mas não ligados ao fucano e/ou que podem ser ligados ao fucano.

[0049] Assim, em algumas modalidades, a descrição atual apresenta composições de fucano com baixo teor de endotoxina com baixos níveis de endotoxinas, composições essas que são adequadas para aplicações médicas e cirúrgicas, por exemplo, a prevenção, inibição ou tratamento de aderências fibrosas.

[0050] Em certos aspectos e modalidades, as composições aqui compreendem um fucano terapeuticamente eficaz e medicamente aceitável compreendendo menos do que cerca de 0,2, 0,18, 0,12, 0,1, 0,09, 0,02, 0,01, 0,007, 0,005, 0,002 ou 0,001 unidades de endotoxina (EU) por miligrama (mg) de fucano (EU/mg).

[0051] A distribuição do peso molecular das composições de fucano com baixo teor de endotoxina pode ser medida usando qualquer sistema de medição apropriado desejado. Diferentes sistemas podem produzir diferentes leituras ou resultados de diferentes composições tendo essencialmente a mesma composição, ou mesmo da mesma batelada quando medido de forma diferente. Um sistema de medição adequado é um conjunto de cromatografia de permeação em gel aquoso que consiste essencialmente em uma coluna de cromatografia de permeação em gel analítica de 300 mm com um diâmetro interno de 7,8 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, tendo uma faixa de peso molecular efetivo entre cerca de 50 kDa e cerca de 5.000 kDa, uma coluna de cromatografia de permeação em gel analítica de 300 mm com um diâmetro interno de 7,8 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, tendo uma faixa de peso molecular efetivo entre cerca de 1 kDa e cerca de 6.000 kDa e uma coluna de guarda de 40 mm com um diâmetro interno de 6 mm acondicionada com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, as duas colunas analíticas de cromatografia de permeação em gel e uma coluna de guarda contida em um compartimento de coluna a cerca de 30⁰C, um detector de índice refrativo a cerca de 30⁰C, fase móvel de nitrato de sódio 0,1 M conduzida a 0,6 mL/min., e quantificação com base em uma curva padrão de peso molecular máximo consistindo essencialmente em um primeiro padrão de dextrano com um peso molecular máximo de cerca de 2.200 kDa, um segundo padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 720 kDa e cerca de 760 kDa, um terceiro padrão de dextrano com um pico peso molecular entre cerca de 470 kDa e cerca de 510 kDa, um quarto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 370 kDa e cerca de 410 kDa, um quinto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 180 kDa e cerca de 220 kDa, e um sexto dextrano padrão com um peso molecular máximo entre cerca de 40 kDa e 55 kDa. A curva padrão de peso molecular máximo pode compreender ainda um padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre 3 kDa e 5 kDa.

[0052] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem compreender ainda um fucano com uma distribuição de peso molecular em que pelo menos cerca de 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60%, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % e 99 % em p/p do fucano tem um peso molecular superior a 100 kDa. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui podem compreender um fucano com uma distribuição de peso molecular em que pelo menos cerca de 50%, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % e 99 % em p/p das fucanhas com peso molecular maior que 200 kDa. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui podem compreender um fucano com uma distribuição de peso molecular em que pelo menos cerca de 25%, 30%, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % em p/p do fucano têm um peso molecular superior a 500 kDa. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina neste documento podem compreender um fucano com uma distribuição de peso molecular em que pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou 40 % em p/p do fucano tem um peso molecular superior a 1600 kDa .

[0053] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui podem compreender um fucano com um peso molecular médio ponderado superior a cerca de 100 kDa, por exemplo, entre cerca de 100 kDa e cerca de 10.000 kDa, entre cerca de 200 kDa e cerca de

8.000 kDa, entre cerca de 350 kDa e cerca de 7.000 kDa, entre cerca de 450 kDa e cerca de 6.000 kDa, entre cerca de 580 kDa e cerca de

5.000 kDa, ou entre 500 kDa e cerca de 2.000 kDa. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui podem compreender um fucano com um peso molecular máximo maior que cerca de 70 kDa, por exemplo, entre cerca de 70 kDa e cerca de 1200 kDa, entre cerca de 100 kDa e cerca de 1200 kDa, entre cerca de 200 kDa e cerca de 1200 kDa, entre cerca de 400 kDa e cerca de 1200 kDa, ou entre cerca de 400 kDa e cerca de 900 kDa.

[0054] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui podem compreender um fucano com um peso molecular médio em número superior a cerca de 50 kDa, entre cerca de 50 kDa e cerca de 1.000 kDa, entre cerca de 70 kDa e cerca de 1000 kDa, entre cerca de 150 kDa e cerca de 1000 kDa, entre cerca de 250 kDa e cerca de 1000 kDa, ou entre cerca de 250 kDa e cerca de 700 kDa.

[0055] O fucano nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ter um nível de sulfatação entre cerca de 10 % em p/p e 70 % em p/p, entre cerca de 20 % em p/p e 65 % em p/p, entre cerca de 30 % em p/p e 55 % em p/p, entre cerca de 40 % em p/p e 60 % em p/p, ou entre cerca de 40 % em p/p e 50 % em p/p.

[0056] O fucano nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui podem ter uma relação molar de fucose total: sulfato total entre cerca de 1:0,5 e 1:4, entre cerca de 1:0,8 e 1:3,5, entre cerca de 1:1 e 1:2,5, entre cerca de 1:1,2 e 1:2,0, ou entre cerca de 1:1,5 e 1:3. O fucano nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui podem ter uma relação molar de fucose total mais galactose: sulfato total entre cerca de 1:0,5 e 1:4, entre cerca de 1:0,8 e 1:3,5, entre cerca de 1:1 e 1:2,5, entre cerca de 1:1,2 e 1:2,0, ou entre cerca de 1:1,5 e 1:3.

[0057] O fucano nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ter um teor total de carboidratos entre cerca de 27% em p/p e 80 % em p/p, 30 % em p/p e 70 % em p/p, entre cerca de 40 % em p/p e 90 % em p/p, entre cerca de 48 % em p/p, ou 50 % em p/p e 96 % em p/p. O fucano nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ter um teor de fucose como uma porcentagem do carboidrato total entre cerca de 30 % em p/p e 100 % em p/p, entre cerca de 40 % em p/p e 95 % em p/p ou entre cerca de 50 % em p/p e 90 % em p/p.

[0058] O fucano nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ter um teor de galactose como uma porcentagem do carboidrato total entre 0 % em p/p e 60 % em p/p, entre 0 % em p/p e 60 % em p/p, entre cerca de 5 % em p/p e 30 % em p/p, ou entre cerca de 0 % em p/p e 10 % em p/p ou 15 % em p/p. O fucano nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ter um teor de ácido glicurônico como uma porcentagem do teor total de carboidratos entre cerca de 0 % em p/p e 10 % em p/p, um teor de manose como uma porcentagem do teor total de carboidratos entre cerca de 0 % em p/p e 7 % em p/p, um teor de ramnose como uma porcentagem do teor total de carboidratos entre 0 % em p/p e 4 % em p/p, e um teor de xilose como uma porcentagem do teor total de carboidratos entre 0 % em p/p e 20 % em p/p.

[0059] Em algumas modalidades, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui, quando dissolvidas a uma concentração de 50 mg/mL em água, têm uma viscosidade entrecerca de 4 cP e cerca de 50 cP, entre cerca de 5 cP e cerca de 40 cP, entre cerca de 10 cP e cerca de 30 cP, cerca de 15 cP, cerca de 20 cP e cerca de 25 cP. Em certas modalidades, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui, quando dissolvidas em água de 1 mg/mL a 100 mg/mL, formam uma solução que é transparente e incolor, ou transparente e amarelo claro ou claro e marrom claro.

[0060] Em certas modalidades, os fucanos nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ter um teor de acetila menor do que cerca de 5 % em p/p, menos do que cerca de 2 % em p/p e cerca de 0 % em p/p. Em algumas modalidades, os fucanos nas composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui compreendem substancialmente 0 % em p/p de teor de acetila quando medido por coerência quântica múltipla heteronuclear 1H-13C 2D a 70°C com supressão de sinal de solvente em um espectrômetro de 600 MHz equipado com 5 mm sonda fria, na faixa de 10-30 ppm na dimensão de carbono, em 8 incrementos de 256-512 varreduras cada. Métodos

[0061] Métodos, sistemas, etc., são fornecidos para purificar, despirogenar ou de outra forma reduzir a carga de impurezas em uma composição de fucano de partida, tal como uma composição de fucano matéria-prima. Os métodos e composições, etc., compreendem eliminar, inativar ou de outra forma reduzir uma quantidade indesejada de, ou efeito de, endotoxinas e outros componentes contendo endotoxinas, tais como contaminantes biológicos, componentes celulares, etc. para obter composições de fucano com baixo teor de endotoxina compreendendo, por exemplo, menos de 0,2, 0,18, 0,12, 0,1, 0,09, 0,03, 0,02, 0,01, 0,007, 0,005, 0,002 ou 0,001 unidades de endotoxina (EU) por miligrama (mg) do fucano (EU/mg). Contaminantes biológicos incluem microorganismos como bactérias, vírus, leveduras, fungos e parasitas, alguns dos quais produzem toxinas e alguns dos quais compreendem componentes celulares. Contaminação biológica, componentes celulares, endotoxinas e outros componentes contendo endotoxinas estão incluídos no termo impurezas como aqui utilizado.

[0062] Em algumas modalidades, a descrição atual apresenta composições de fucano com baixo teor de endotoxina que são adequadas para aplicações médicas e cirúrgicas, por exemplo, a prevenção de aderências fibrosas.

[0063] Em alguns dos métodos aqui descritos, a descrição atual discute o uso de filtração de fluxo tangencial (TFF), que a TFF pode remover ou auxiliar na remoção de endotoxinas. O formato do aparelho de filtração de fluxo tangencial usado pode ser, por exemplo, um dentre um sistema de placa e estrutura; um sistema de cartucho enrolado em espiral; um sistema de fibra oca; um sistema de célula de fluxo; e um sistema de filtro centrífugo.

[0064] Os parágrafos a seguir se voltam para uma breve discussão de algumas das metodologias que podem ser usadas para criar as composições de fucano com baixo teor de endotoxina neste documento a partir de composições de fucano de partida por meio de vários métodos que podem ser realizados usando qualquer mistura de reação adequada, como soluções, suspensões, sólidos, géis ou outras modalidades dependendo do (s) método (s) escolhido (s). Floculação fisicamente induzida

[0065] Uma composição de fucano de partida, tal como uma composição de fucano matéria-prima, compreendendo altos níveis de endotoxinas sofre uma floculação de impurezas, que pode ser uma floculação fisicamente induzida. Os métodos podem compreender:

fornecer uma composição de fucano de partida; adicionar um auxiliar de floculação à composição de fucano de partida para produzir uma mistura de reação; flocular as impurezas na composição de fucano de partida por aquecimento da mistura de reação; separar as impurezas floculadas da mistura de reação; e coletar a desejada composição de fucano com baixo teor de endotoxina após a separação.

[0066] A floculação das impurezas por aquecimento da mistura de reação pode compreender o aquecimento da mistura de reação, enquanto a mistura de reação é submetida a uma pressão superior à pressão atmosférica. Auxiliares de floculação adequados incluem, sem limitação, sais e/ou bases, por exemplo, cloretos, brometos, iodetos, fluoretos, sulfatos, sulfitos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos, nitratos, nitritos, acetatos, citratos, silicatos, óxidos, hidróxidos e/ou cianetos de um metal alcalino, metal alcalino-terroso, alumínio e/ou amônio, por exemplo, cloreto de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de cálcio, fosfato de sódio, nitrato de sódio, cloreto de lítio, nitrato de lítio, cloreto de amônio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio . A separação das impurezas floculadas da mistura de reação pode compreender um ou mais dentre centrifugação, filtragem, sedimentação ou separação por fluxo hidrodinâmico da mistura de reação.

[0067] Os métodos, etc., aqui podem compreender ainda a dessalinização da composição de fucano de partida antes de adicionar um auxiliar de floculação. A dessalinização pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida como uma solução em água através de um filtro de filtração de fluxo tangencial de redução de peso molecular (MWCO) (TFF). A diafiltração pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida com água destilada. O filtro de TFF de redução de peso molecular pode ter uma redução de peso molecular menor do que um ponto ou alvo de separação de peso molecular desejado em ou para a composição de fucano, por exemplo, uma redução de peso molecular de 50 kDa, 70 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 500 kDa ou 1000 kDa.

[0068] Os métodos podem ser realizados em ambientes básicos e neutros. A adição de um auxiliar de floculação à composição de fucano de partida pode, portanto, compreender tornar a composição de fucano de partida básica para prevenir ou inibir a degradação do fucano na composição de fucano de partida, porque os fucanos são propensos à degradação em ambientes ácidos. Em outras modalidades, o método pode ser realizado mantendo a mistura de reação em ou próximo a um pH de 7 ou mais.

[0069] Em algumas modalidades, a composição de fucano de partida pode ser fornecida como uma solução. Exemplos de fucanos adequados para tratamento pelo método acima incluem, sem limitação, fucoidano, e a concentração do fucano em solução pode estar entre 0,01 % em p/v e 50 % em p/v. As impurezas que podem ser removidas pelo método acima incluem, sem limitação, particulados, lipídeos, ácidos graxos, florotaninos, laminarinas, alginatos, proteínas, produtos de reação de Maillard, fucoxantina, clorofila, íons livres, bactérias, vírus, leveduras, fungos, parasitas, DNA e endotoxinas. Cromatografia de permeação em gel

[0070] Cromatografia de permeação em gel ("GPC") foi empregada para avaliar as distribuições de peso molecular obtidas para os exemplos experimentais. Há um grande número de diferentes parâmetros, colunas e padrões disponíveis para uso em cromatografia de permeação em gel, resultando em uma variedade de configurações de instrumentação disponíveis para a análise de peso molecular. Para as determinações de peso molecular aqui, a GPC foi conduzida usando os seguintes parâmetros: A fase móvel era de nitrato de sódio

0,1 M conduzida a 0,6 mL/min. O compartimento da coluna e o detector estavam a 30⁰C. Um detector de índice refrativo Waters 2414 foi usado para detecção.

[0071] Colunas de GPC adequadas incluem colunas de GPC compatíveis com solventes aquosos, por exemplo, colunas acondicionadas com pelo menos um dentre estireno-divinilbenzeno sulfonado, rede de copolímero de acrilato funcionalizado com NH, sílica modificada e gel à base de polimetacrilato hidroxilado. Para as análises aqui, três colunas foram usadas em série, compreendendo uma coluna de guarda de 40 mm de comprimento com um diâmetro interno (ID) de 6 mm acondicionada com gel à base de polimetacrilato hidroxilado de tamanho de partícula de 6 μm, seguido por uma primeira coluna analítica de GPC de 300 mm com uma ID de 7,8 mm acondicionada com gel à base de polimetacrilato hidroxilado de tamanho de partícula de 12 μm que tem um limite de exclusão de cerca de 7.000 kDa e uma faixa de peso molecular efetivo entre cerca de 50 kDa e cerca de 5.000 kDa, seguido por uma segunda coluna analítica de GPC de 300 mm com uma ID de 7,8 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado de tamanho de partícula de 10 μm que tem um limite de exclusão de cerca de 7.000 kDa e uma faixa de peso molecular eficaz entre cerca de 1 kDa e cerca de 6.000 kDa. A faixa de peso molecular total efetivo da coluna configurada estava entre cerca de 1 kDa e cerca de 6.000 kDa. Um exemplo dessa configuração de coluna pode ser as colunas Ultrahydrogel® guard- Ultrahydrogel® 2000-Ultrahydrogel® Linear conectadas em série.

[0072] As amostras executadas foram quantificadas contra uma curva padrão que compreende padrões rastreáveis a partir do American Polymer Standards Corporation: DXT3755K (peso molecular máximo = 2164 kDa), DXT820K (peso molecular máximo = 745 kDa), DXT760K (peso molecular máximo = 621 kDa), DXT670K (peso molecular máximo = 401 kDa), DXT530K (peso molecular máximo = 490 kDa), DXT500K (peso molecular máximo = 390 kDa), DXT270K (peso molecular máximo = 196 kDa), DXT225K (peso molecular máximo = 213 kDa), DXT150K (peso molecular máximo = 124 kDa), DXT55K (peso molecular máximo = 50 kDa), DXT50K (peso molecular máximo = 44 kDa) e DXT5K (peso molecular máximo = 4 kDa), os picos de peso molecular destes padrões estão entre cerca de 4 kDa e cerca de 2.200 kDa. A curva padrão usada pode, por exemplo, incluir Dextrano 3755 kDa, pelo menos um dentre Dextrano 50 kDa e Dextrano 55 kDa, e entre 3 a 6 padrões rastreáveis adicionais aqui discutidos, os pontos de calibração sendo os pesos moleculares máximos dos calibrantes usados. Um exemplo de curva de calibração pode consistir em DXT3755K, DXT 820K, DXT530K, DXT500K, DXT225K e DXT55K. As colunas usadas neste documento tinham uma faixa de peso molecular total efetivo que abrangia e se estendia além da faixa de peso molecular máximo dos padrões usados para quantificação dos fucanos.

[0073] Um peso molecular declarado para um polímero de fucano/fucoidano aqui é um valor de peso molecular sobre o qual sempre haverá uma distribuição de moléculas de pesos moleculares maiores e menores, aumentando ou diminuindo em quantidade ou porcentagem conforme o peso molecular aumenta ou diminui longe de o peso molecular especificado. A distribuição pode, mas não é obrigada a, ter uma forma geralmente gaussiana ou gaussiana distorcida.

[0074] Os resultados nas tabelas aqui contidas abreviaturas usadas para certas características de uma distribuição de peso molecular. A cromatografia de permeação em gel é denotada por GPC, o tempo de retenção de pico é denotado por PRT, o peso molecular máximo é denotado por PMW, o peso molecular médio é denotado por WAMW, o peso molecular médio numérico é denotado por NAMW, a distribuição percentual é denotada por % dist., o peso molecular é denotado por MW, o índice de polidispersidade é denotado por PDI e a redução de peso molecular é denotada por MWCO.

[0075] Os parágrafos a seguir se voltam para uma breve discussão geral de algumas metodologias que podem ser usadas para criar a composição de fucano com baixo teor de endotoxina aqui. Filtração de fluxo tangencial modificada

[0076] Uma composição de fucano de partida, que pode ser uma composição de fucano matéria-prima, contendo altos níveis de endotoxina, sofre uma filtração de fluxo tangencial modificada. Os métodos podem compreender: submeter a composição de fucano de partida mais um agente de ruptura que interrompe as células e a agregação de endotoxinas à filtração de fluxo tangencial (TFF) através de um primeiro filtro de filtração de fluxo tangencial para produzir uma primeira composição de fucano retentado. O agente de ruptura pode ser, por exemplo, um ou mais de dodecilsulfato de sódio (SDS), cloreto de benzalcônio, Triton® X 100, Triton® X 114 ou desoxicolato de sódio. A primeira composição de fucano retentado é então submetida à filtração de fluxo tangencial com uma solução de diafiltração secundária através de um segundo filtro de filtração de fluxo tangencial para remover o agente de ruptura residual da composição de fucano retentado, produzindo uma segunda composição de fucano retentado compreendendo a composição desejada de fucano com baixo teor de endotoxina. Se desejado, o mesmo filtro de TFF pode ser empregado tanto no primeiro quanto no segundo processo de diafiltração.

[0077] Os métodos, sistemas, etc., aqui podem compreender a pré-filtragem da composição de fucano de partida em solução através de um pré-filtro para remover a matéria particulada indesejada. O agente de ruptura pode compreender um detergente aniônico, um detergente catiônico e/ou um detergente não iônico, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), cloreto de benzalcônio, Triton® X 100, Triton® X 114 e/ou desoxicolato de sódio.

[0078] Outras modalidades incluem o tratamento da primeira composição de fucano retentado com um agente precipitante para produzir A) um precipitado do agente de ruptura e B) uma composição de fucano retentado-sobrenadante. A composição de fucano sobrenadante pode então ser submetida à filtração de fluxo tangencial adicional para remover o agente de ruptura residual da composição de fucano sobrenadante, produzindo uma segunda composição de fucano retentado compreendendo a composição desejada de fucano com baixo teor de endotoxina. O tratamento da primeira composição de fucano retentado com um agente precipitante pode compreender o tratamento da primeira composição de fucano retentado com um sal e/ou uma base. Em certas modalidades, o sal pode ser um cloreto, brometo, iodeto, fluoreto, sulfato, sulfito, carbonato, bicarbonato, fosfato, nitrato, nitrito, acetato, citrato, silicato e/ou cianeto de um metal alcalino, metal alcalino-terroso, alumínio e/ou amônio. Em certas modalidades, a base pode ser um hidróxido e/ou óxido de um metal alcalino, metal alcalino-terroso, alumínio e/ou amônio. Em certas modalidades, o sal pode ser um de cloreto de potássio, hidróxido de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de bário ou carbonato de cálcio. A composição de fucano sobrenadante também pode ser, se desejado, pré-filtrada para remover material particulado indesejado.

[0079] Os métodos, sistemas, etc., também podem compreender a adição de um agente bacteriostático, por exemplo, à composição de fucano de partida mais o agente de ruptura. O agente bacteriostático pode ser, por exemplo, pelo menos um dentre ácido etilenodiamina- tetraacético (EDTA), 2,3-dimercapto-1-propanol, etilenodiamina,

porfina ou ácido cítrico.

[0080] Em algumas modalidades, a composição de fucano de partida pode ser fornecida como uma solução. A composição de fucano de partida pode ter uma concentração de fucano em solução superior a 0,1 % em p/v e menor do que 30 % em p/v. O agente de ruptura pode ter uma concentração em solução superior a 0,1 % em p/v e menor do que 60 % em p/v. As impurezas que podem ser removidas pelos métodos acima incluem, sem limitação, particulados, lipídeos, ácidos graxos, florotaninos, laminarinas, alginatos, proteínas, produtos de reação de Maillard, fucoxantina, clorofila, íons livres, bactérias, vírus, leveduras, fungos, parasitas, DNA e endotoxinas.

[0081] A FIG. 1 mostra esquematicamente um exemplo de sistema de filtração de fluxo tangencial modificado (TFF) 1000 para obter uma redução no nível de impureza de uma composição de fucano de partida. Uma composição de fucano de partida em solução é fornecida através da linha de alimentação de entrada 1002 para o vaso de fucano 1016. A composição de fucano de partida em um solvente adequado pode ser pré-filtrada através do pré-filtro 1004, por exemplo, para remover matéria particulada indesejada.

[0082] A bomba de entrada de TFF 1014 bombeia a composição de fucano para o filtro de TFF 1010 através da linha de alimentação TFF 1012. O filtro de TFF 1010 pode ser fornecido como um cassete projetado para permitir que um fluido de entrada fornecido a ele passe sobre seu filtro em seu lado retentado, enquanto permite um permeado para sair por meio de uma ou mais linhas de saída e fluido de entrada tratado para sair como retentado por meio de outra linha de saída. A bomba de entrada de TFF 1014 fornece um nível desejado de pressão sobre o filtro de TFF 1010 entre seus lados retentado e permeado. Na FIG. 1, o retentado do filtro de TFF 1010 é retornado ao vaso de fucano 1016 via linha de retorno de retentado TFF 1018 e válvula de retentado TFF 1017, enquanto o permeado é produzido através da linha de saída de permeado de TFF 1019 para uso fora do sistema de TFF modificado 1000 ou para ser descartado.

[0083] Antes ou enquanto a bomba de entrada de TFF 1014 recircula a composição de fucano de partida sobre o filtro de TFF 1010, um agente de ruptura, por exemplo, um dentre dodecil sulfato de sódio (SDS), cloreto de benzalcônio, Triton® X 100, Triton® X 114 ou desoxicolato de sódio, pode ser adicionado à composição de fucano de partida no vaso de fucano 1016 do primeiro recipiente de solução de diafiltração 1020 através da primeira linha de fornecimento de solução de diafiltração 1025. A solução contendo o primeiro agente de ruptura, sendo a primeira solução de diafiltração, é usada para repor o solvente perdido através do permeado na saída de permeado de TFF linha 1019 e/ou para garantir que um número predeterminado de diavolumes de composição de fucano de partida e agente de ruptura circule sobre o filtro de TFF 1010. Ao controlar a primeira válvula de solução de diafiltração 1024, o agente de ruptura pode ser adicionado em um processo de pulso, se desejado. Em outras modalidades, o agente de ruptura pode ser adicionado em um modo contínuo.

[0084] O número de diavolumes de agente de ruptura para processar através do filtro de TFF 1010 pode ser predeterminado. O processo pode ser continuado por um período de tempo predeterminado, por um número predeterminado de diavolumes do agente de ruptura, ou até que um nível de pureza predeterminado seja alcançado, por exemplo, o nível de impureza no vaso de fucano 1016 pode ser medido e o processo de TFF encerrado quando um nível de impureza adequadamente baixo foi atingido. O nível de impureza medido pode ser o nível de endotoxina. A diafiltração da composição de fucano de partida em solução através do filtro de TFF 1010 com a primeira solução de diafiltração fornece uma composição de primeiro retentado de fucano com baixo teor de endotoxina em solução.

[0085] O agente de ruptura residual pode ser removido da composição de fucano de primeiro retentado com baixo teor de endotoxina. Isso pode ser feito fechando a primeira válvula de solução de diafiltração 1024, válvula de saída do sistema de TFF 1006 e permitindo que uma solução de diafiltração secundária adequada do segundo recipiente de solução de diafiltração 1030 entre no vaso de fucano 1016 através da segunda linha de fornecimento de solução de diafiltração 1035 e segunda válvula de solução de diafiltração 1034. A mistura no vaso de fucano 1016 pode então ser submetida a TFF através do filtro de TFF 1010 como antes, por exemplo, via linha de alimentação TFF 1012, bomba de entrada de TFF 1014, linha de retorno de retentado TFF 1018 e válvula de retentado TFF 1017, ou via outra filtração TFF como pode ser desejado.

[0086] A solução de diafiltração secundária pode ser usada, por exemplo, tanto para repor o solvente perdido através do permeado na linha de saída do permeado TFF 1019 e/ou para garantir que um número predeterminado de diavolumes da primeira composição de fucano retentado e solução de diafiltração secundária sejam circulados sobre o filtro de TFF 1010. Ao controlar a segunda válvula de solução de diafiltração 1034, a solução de diafiltração secundária pode ser adicionada, por exemplo, em um processo de pulso e/ou em um modo contínuo. O número de diavolumes de solução de diafiltração secundária para processar sobre o filtro de TFF 1010 pode ser predeterminado. O processo pode ser continuado por um período de tempo predeterminado, por um número predeterminado de diavolumes da solução de diafiltração secundária, ou a concentração residual do agente disruptivo no vaso de fucano 1016 pode ser medida e o processo de TFF terminado quando um agente disruptivo residual adequadamente baixo concentração foi atingida. A segunda compisição de fucano retentado resultante no vaso de fucano 1016 compreende o produto de composição de fucano com baixo teor de endotoxina do sistema de TFF modificado 1000.

[0087] Em algumas modalidades, a primeira composição de retentado de fucano no vaso de fucano 1016 pode ser coletada através da linha de saída do sistema de TFF assistida 1008 controlada pela válvula de saída do sistema de TFF 1006 para outro tratamento intermediário antes de ser devolvida ao vaso de fucano 1016 para o tratamento de solução de diafiltração secundária aqui discutido depois do tratamento intermediário. Em um exemplo de um tratamento intermediário, a primeira composição de fucano retentado do vaso de fucano 1016 pode ser tratada com um agente precipitante e a mistura resultante submetida à centrifugação a fim de separar a composição de fucano sobrenadante desejada do precipitado. A título de exemplo, se o agente de ruptura for dodecilsulfato de sódio, então o agente de precipitação pode ser, por exemplo, cloreto de potássio e hidróxido de potássio. O dodecilsulfato de sódio em particular, embora tenha benefícios significativos, é uma substância difícil de remover da composição de fucano de primeiro retentado com baixo teor de endotoxina no vaso de fucano 1016 e a precipitação em uma etapa intermediária do processo auxilia nesta remoção. Após a etapa intermediária, o sobrenadante da etapa intermediária pode ser devolvido ao vaso de fucano 1016 e submetido à etapa de TFF de solução de diafiltração secundária como já discutido. No caso do agente de ruptura ser dodecil sulfato de sódio, esta segunda etapa de TFF procura remover os restos do dodecil sulfato de sódio que permaneceram na composição de fucano sobrenadante após as etapas intermediárias de precipitação e centrifugação. Extração de fase sólida

[0088] Uma composição de fucano, tal como uma composição de fucano de partida contendo altos níveis de endotoxina, é submetida a uma extração em fase sólida. Os métodos podem compreender: fornecer na forma sólida uma composição de fucano de partida compreendendo endotoxinas entre outras impurezas e um meio de extração incapaz de dissolver fucanos, configurado para dissolver impurezas; misturar a composição de fucano de partida com o meio de extração para formar uma mistura da composição de fucano sólido não dissolvido e o meio de extração, o meio de extração contendo endotoxinas dissolvidas e possivelmente outras impurezas; separar a composição de fucano com baixo teor de endotoxina como uma composição de fucano sólido não dissolvido do meio de extração contendo endotoxinas dissolvidas entre outras impurezas; e coleta da composição de fucano com baixo teor de endotoxina como um sólido após a remoção da composição de fucano com baixo teor de endotoxina do meio de extração. A separação pode compreender um ou mais de, por exemplo, centrifugação, filtração, sedimentação e separação de fluido hidrodinâmico.

[0089] Os meios de extração pode compreender, por exemplo, um ou mais dentre uma base, um detergente e um agente oxidante. Os meios de extração adequados que não dissolvem o fucano incluem solventes orgânicos com uma polaridade relativa menor do que 0,765, por exemplo, etanol, isopropanol, metanol, benzeno, éter dietílico, decametilciclopentassiloxano, acetato de etila, butanol, hexano, heptano, heptanol, octanol e decanol. As bases adequadas incluem, sem limitação, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio e hidróxido de cálcio. Os agentes oxidantes adequados incluem, sem limitação, um ou mais dentre peróxido de hidrogênio, peróxido de ureia e alvejantes oxidantes, incluindo hipoclorito de sódio. Os detergentes adequados incluem, sem limitação, tensoativos não iônicos, por exemplo, as gamas de detergentes Tween®, Brij® e

Triton®; tensoativos aniônicos, por exemplo, dodecilsulfato de sódio (SDS), desoxicolato de sódio; e tensoativos catiônicos, por exemplo, cloreto de benzalcônio (BAC). Fucanos particulares que se prestam aos métodos aqui incluem, mas não estão limitados a fucoidano. O tratamento do original, por exemplo, composição de fucano de partida com o meio de extração pode se estender de um minuto a 120 horas.

[0090] Os métodos podem compreender ainda a dessalinização da composição de fucano de partida antes de fornecer na forma sólida a composição de fucano de partida. A dessalinização pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida como uma solução em água através de um filtro de filtração de fluxo tangencial de redução de peso molecular (MWCO) (TFF). A diafiltração pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida com água destilada. O filtro de TFF de redução de peso molecular pode ter uma redução de peso molecular menor do que um ponto ou alvo de separação de peso molecular desejado em ou para a composição de fucano-endotoxina de baixo teor, por exemplo, redução de peso molecular de 50 kDa, 70 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 500 kDa ou 1000 kDa. A diafiltração pode compreender ainda a pré-filtração da composição de fucano de partida através de um pré-filtro adequado para remover o material particulado. Os métodos podem compreender ainda a liofilização e/ou secagem por vaporização de uma composição de fucano de partida adequada em solução antes de fornecer na forma sólida a composição de fucano de partida. Os métodos podem compreender ainda a precipitação de uma solução, uma composição de fucano de partida adequada antes de fornecer na forma sólida a composição de fucano de partida. Os precipitantes adequados incluem, sem limitação, etanol, isopropanol, propanol, acetona, metanol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, etileno glicol, tetra- hidrofurano, acetonitrila, glima, diglima, dioxano, a solubilidade do fucano diminuindo conforme a polaridade do fluido precipitante diminui. As impurezas que podem ser removidas pelo método acima incluem, sem limitação, particulados, lipídeos, ácidos graxos, florotaninos, laminarinas, alginatos, proteínas, produtos de reação de Maillard, fucoxantina, clorofila, íons livres, bactérias, vírus, leveduras, fungos, parasitas, DNA e endotoxinas. Precipitação quimicamente induzida

[0091] Uma composição de fucano de partida, ou outras composições de fucano adequadas, contendo altos níveis de endotoxinas e outras impurezas, por exemplo, partículas suspensas, sofre uma precipitação de impurezas quimicamente induzida. Em certas modalidades, os métodos podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida em uma solução de partida; precipitar impurezas da solução de partida por meio de um precipitante de impurezas multivalente iônico para fornecer uma mistura de impurezas suspensas, impurezas precipitadas e sobrenadante; separar as impurezas suspensas e as impurezas precipitadas da solução de sobrenadante; e coletar a solução de sobrenadante compreendendo a desejada composição de fucano com baixo teor de endotoxina após separação das impurezas suspensas e impurezas precipitadas do sobrenadante.

[0092] Os precipitantes de impurezas adequados incluem sais multivalentes iônicos e/ou bases de cátions divalentes e trivalentes. Exemplos de tais sais adequados incluem, sem limitação, cloretos, brometos, iodetos, fluoretos, sulfatos, sulfitos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos, nitratos, nitritos, acetatos, citratos, silicatos e/ou cianetos de metais alcalino-terrosos, zinco, alumínio, cobre e ferro. Exemplos de tais bases adequadas incluem, sem limitação, hidróxidos e/ou óxidos de metais alcalino-terrosos, zinco, alumínio, cobre e/ou ferro. Separar as impurezas suspensas e as impurezas precipitadas da solução de sobrenadante pode compreender impurezas floculantes na mistura. Os floculantes adequados incluem, sem limitação, sulfato de alumínio e potássio; sulfato de sódio e alumínio; sulfato de amônio e alumínio; cloreto de cálcio; fosfato de sódio; hidróxido de alumínio; cloreto de alumínio; cloreto férrico; sulfato férrico; sulfato ferroso; silicato de sódio; silicato de cálcio; fosfato de cálcio; cloreto de zinco; carbonato de cálcio; bicarbonato de cálcio; sulfato de potássio; fosfato de magnésio; acrilamidas; ácido acrílico; cloridrato de alumínio; cloreto de polialumínio; taninos; formaldeído; melamina; cloreto de metila de N,N-dimetilaminoetil acrilato; quaternário de cloreto de metila de N,N- dimetilaminoetil metacrilato; e cloreto de polidialildimetil-amônio. Como pode ser visto na lista anterior de floculantes, em algumas modalidades, o floculante pode ser o precipitante de impureza. A separação das impurezas precipitadas, suspensas e/ou floculadas da solução de sobrenadante pode compreender pelo menos um dentre centrifugação, filtragem, sedimentação e separação por fluxo hidrodinâmico da mistura de impurezas e a solução de sobrenadante.

[0093] Os métodos podem compreender ainda a dessalinização da composição de fucano de partida antes de fornecer a composição de fucano de partida. A dessalinização pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida como uma solução aquosa através de um filtro de TFF. A diafiltração pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida com água destilada. A diafiltração pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida através de um filtro de TFF com uma redução de peso molecular (MWCO) de 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 50 kDa, 70 kDa ou 100 kDa. A diafiltração pode compreender ainda a pré-filtração da composição de fucano de partida através de um pré-filtro adequado para remover o material particulado.

[0094] Os métodos podem compreender ainda manter um pH entre cerca de 7 e 14 para inibir ou prevenir a degradação de fucanos em ambientes ácidos. A manutenção do pH entre cerca de 7 e 14 pode compreender a adição de uma base adequada, por exemplo, hidróxido de sódio. Uma base adequada pode ser adicionada à composição de fucano de partida antes de precipitar as impurezas da solução por meio de um precipitante de impureza multivalente iônico. Em outras modalidades, uma base adequada pode ser adicionada à mistura de impurezas precipitadas e solução de sobrenadante após a precipitação de impurezas da solução por meio de um precipitante de impureza multivalente iônico. Em ainda outras modalidades, uma base adequada pode ser adicionada à solução de sobrenadante após a separação das impurezas suspensas e impurezas precipitadas da solução de sobrenadante.

[0095] Exemplos de fucanos adequados para tratamento pelos métodos acima incluem, sem limitação, fucoidano, e a concentração do fucano em solução pode estar entre 0,01 % em p/v e 50 % em p/v. As impurezas que podem ser removidas pelo método acima incluem, sem limitação, particulados, lipídeos, ácidos graxos, florotaninos, laminarinas, alginatos, proteínas, produtos de reação de Maillard, fucoxantina, clorofila, íons livres, bactérias, vírus, leveduras, fungos, parasitas, DNA e endotoxinas. Lise e floculação

[0096] Uma composição de fucano de partida, como uma composição de fucano matéria-prima, contendo altos níveis de endotoxina sofre lise e floculação. Os métodos neste exemplo podem compreender: fornecer uma composição de fucano de partida; tornar a composição de fucano de partida alcalina; adicionar à composição de fucano de partida um agente de ruptura celular para produzir uma mistura de reação, o agente de ruptura celular lisando componentes celulares na composição de fucano de partida e liberando na mistura de reação alcalina lisados compreendendo componentes biomoleculares; remover da mistura de reação o agente de ruptura celular e pelo menos uma porção das impurezas para deixar não degradada a desejada composição de fucano com baixo teor de endotoxina.

[0097] A remoção do agente de ruptura celular pode compreender qualquer um ou mais dentre precipitação, floculação, filtração de fluxo tangencial, separação de fase micelar, adsorção iônica e adsorção hidrofóbica. A remoção de impurezas pode compreender qualquer um ou mais de precipitação, floculação, filtração de fluxo tangencial, separação de fase micelar, adsorção iônica e adsorção hidrofóbica. Qualquer um desses métodos de remoção ou combinações de métodos de remoção pode compreender centrifugação, filtragem, sedimentação ou separação de fluxo hidrodinâmico de qualquer mistura de fases sólidas e líquidas.

[0098] Os agentes desreguladores celulares adequados incluem, sem limitação, detergentes aniônicos, não iônicos e catiônicos, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), cloreto de benzalcônio, Triton X 100®, Triton X 114®, detergentes Brij®, detergentes Tween®, desoxicolato de sódio e alquilbenzenossulfonatos.

[0099] Em uma modalidade dos métodos, o agente de ruptura celular é dodecilsulfato de sódio (SDS) e a remoção do agente de ruptura celular compreende a adição de um precipitante para tornar o agente de ruptura celular insolúvel na mistura de reação alcalina e, desse modo, precipitar o agente de ruptura celular. Nesta modalidade, a remoção do agente de ruptura celular pode ainda compreender adicionar um floculante à mistura de reação para flocular o agente de ruptura celular precipitado e junto com ele pelo menos uma porção das impurezas. A remoção do agente de ruptura celular pode ainda compreender a centrifugação após a floculação.

[00100] Os precipitantes adequados para dodecilsulfato de sódio e alquilbenzenossulfonatos incluem, sem limitação, hidróxido de potássio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio e cloreto de bário. Os floculantes adequados incluem, sem limitação, sulfato de alumínio e potássio; sulfato de sódio e alumínio; sulfato de amônio e alumínio; cloreto de cálcio; fosfato de sódio; hidróxido de alumínio; cloreto de alumínio; cloreto férrico; sulfato férrico; sulfato ferroso; silicato de sódio; silicato de cálcio; fosfato de cálcio; cloreto de zinco; carbonato de cálcio; bicarbonato de cálcio; sulfato de potássio; fosfato de magnésio; acrilamidas; ácido acrílico; cloridrato de alumínio; cloreto de polialumínio; taninos; formaldeído; melamina; cloreto de metila de N,N-dimetilaminoetil acrilato; quaternário de cloreto de metila de N,N-dimetilaminoetil metacrilato; e cloreto de polidialildimetil- amônio.

[00101] Deve ser entendido aqui que o agente de ruptura celular pode sofrer uma mudança no processo de precipitação. Por exemplo, se o agente de ruptura celular é dodecil sulfato de sódio (SDS), o precipitante pode ser hidróxido de potássio (KOH) e o cátion de sódio pode ser substituído como parte do processo de precipitação por potássio, o dodecil sulfato de potássio resultante sendo insolúvel no mistura de reação e, assim, precipitando. O dodecil sulfato de cátion, que funcionalmente é a porção de ruptura celular do SDS, permanece intacto neste processo.

[00102] Em ainda outras modalidades dos métodos, o agente de ruptura celular pode ser um ou mais dentre dodecil sulfato de sódio (SDS) e desoxicolato de sódio e a remoção do agente de ruptura celular compreende adsorção aniônica. A adsorção aniônica pode compreender a adição de um adsorvente carregado positivamente adequado por um período de tempo adequado, seguido pela remoção do adsorvente. A adsorção aniônica pode compreender ainda o fluxo da mistura de reação sobre uma coluna ou filtro acondicionado com um adsorvente carregado positivamente adequado a uma taxa de fluxo adequada.

[00103] Em ainda outras modalidades dos métodos, o agente de ruptura celular pode ser cloreto de benzalcônio e a remoção do agente de ruptura celular compreende a adsorção catiônica. A adsorção catiônica pode compreender a adição de um adsorvente carregado negativamente adequado por um período de tempo adequado, seguido pela remoção do adsorvente. A adsorção catiônica pode ainda compreender fluir a mistura de reação sobre uma coluna ou filtro acondicionado com um adsorvente carregado negativamente adequado em uma taxa de fluxo adequada.

[00104] Em ainda outras modalidades dos métodos, o agente de ruptura celular pode ser um ou mais dentre os detergentes Triton X 100®, Triton X 114®, Brij® e Tween® e a remoção do agente de ruptura celular compreende a separação da fase micelar. A separação de fase micelar pode compreender a alteração da temperatura da mistura de reação de modo que a temperatura da mistura de reação exceda o ponto de turvação do agente de ruptura celular. A separação de fase micelar pode compreender a centrifugação da mistura de reação para obter a separação de fase desejada.

[00105] Em outras modalidades de métodos, o agente de ruptura celular pode ser qualquer um ou mais de dodecil sulfato de sódio (SDS), cloreto de benzalcônio, Triton X 100®, Triton X 114®, detergentes Brij®, detergentes Tween®, desoxicolato de sódio e alquilbenzenossulfonatos , e a remoção do agente de ruptura celular compreendem um ou mais dentre adsorção hidrofóbica e uma combinação de diluição e filtração de fluxo tangencial (TFF). A adsorção hidrofóbica pode compreender a adição de um adsorvente hidrofóbico adequado por um período de tempo adequado, seguido pela remoção do adsorvente. A adsorção hidrofóbica pode compreender fluir a mistura de reação sobre uma coluna ou filtro acondicionado com um adsorvente hidrofóbico adequado a uma taxa de fluxo adequada. A remoção por diluição e TFF pode compreender diluir a mistura de reação de modo que o agente de ruptura celular caia abaixo de sua concentração micelar crítica e, assim, possa ser removido por meio de filtração de fluxo tangencial sobre um filtro de TFF de redução de peso molecular adequada (MWCO) que permite para a permeação do agente de ruptura celular a partir de um retentado contendo fucano. A remoção por diluição e TFF pode envolver a diafiltração da mistura de reação sobre o filtro de TFF com um número adequado de diavolumes.

[00106] Os métodos podem compreender ainda a adição de um agente quelante à mistura de reação para quelar cátions multivalentes livres na mistura de reação. O agente quelante pode ser adicionado após fornecer a composição de fucano de partida e antes da remoção do agente de ruptura celular. Os métodos podem compreender ainda a extinção de oxidantes na mistura de reação. A extinção de oxidantes pode compreender a adição de um agente de extinção de oxidante à mistura de reação antes ou após a remoção do agente de ruptura celular.

[00107] Os métodos podem compreender a adição de um agente bacteriostático à mistura de reação. O agente bacteriostático pode ser adicionado após fornecer a composição de fucano de partida e antes da remoção do agente de ruptura celular. Os agentes bacteriostáticos adequados incluem, sem limitação, sulfito de sódio, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), cloreto de benzalcônio, etanol e tioureia.

[00108] Os agentes quelantes adequados incluem, sem limitação, ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), 2,3-dimercapto-1-propanol,

etilenodiamina, porfina e ácido cítrico. Os agentes de extinção de oxidantes adequados incluem, sem limitação, sais de sulfito, nitrito e fosfito. Como é evidente a partir do acima, vários dos compostos listados podem ter mais de uma função nos métodos.

[00109] Os adsorventes hidrofóbicos adequados incluem, sem limitação, carvão ativado, terra de diatomácea, resinas não iônicas de éster acrílico, resinas não iônicas de poliestireno, resinas não iônicas de estireno-divinilbenzeno (DVB). Os adsorventes aniônicos adequados incluem, sem limitação: resinas de estireno-DVB funcionalizadas com amina, resinas de metacrilato funcionalizadas com amina, resinas de metacrilato de metila funcionalizadas com amina, resinas de metacrilato de butil funcionalizadas com amina, resinas de agarose funcionalizadas com amina, resinas de dextrano funcionalizadas com amina, resinas de cerâmica funcionalizadas com silicato de amina funcionalizadas e agente de remoção de lipídeos (LRA).

[00110] Em algumas modalidades, a composição de fucano de partida pode ser fornecida como uma solução. Exemplos de fucanos adequados para tratamento pelo método acima incluem, sem limitação, fucoidano. A composição de fucano de partida pode ter uma concentração de fucano em solução superior a 0,1 % em p/v e menor do que 30 % em p/v. O agente de ruptura celular pode ter uma concentração em solução superior a 0,1 % em p/v e menor do que 60 % em p/v. As impurezas que podem ser removidas pelo método acima incluem, sem limitação, particulados, lipídeos, ácidos graxos, florotaninos, laminarinas, alginatos, proteínas, produtos de reação de Maillard, fucoxantina, clorofila, íons livres, bactérias, vírus, leveduras, fungos, parasitas, DNA e endotoxinas. Adsorção Aniônica

[00111] Uma composição de fucano de partida ou outra composição de fucano desejada contendo altos níveis de endotoxina sofre adsorção aniônica. Os métodos podem compreender: submeter a composição de fucano de partida a uma permuta aniônica com uma resina macroporosa de permuta aniônica em um sistema de permuta aniônica para produzir uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina com um nível de endotoxina substancialmente mais baixo do que a composição de fucano de partida e coletar a fucano com baixo teor de endotoxina composição como uma saída do sistema de permuta aniônica. Os métodos podem incluir submeter a composição de fucano de partida para permuta aniônica com uma resina macroporosa de permuta aniônica tendo um tamanho de poro maior do que o tamanho hidrodinâmico médio de endotoxinas indesejadas na composição de fucano de partida. Os métodos podem compreender o pré-tratamento da composição de fucano de partida com um agente de ruptura.

[00112] Os métodos podem compreender ainda a dessalinização da composição de fucano de partida antes de submeter a composição de fucano de partida à permuta aniônica. A dessalinização pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida em solução através de um filtro de TFF de redução de peso molecular (MWCO). O filtro MWCO TFF pode ter uma redução de peso molecular menor do que um ponto ou alvo de separação de peso molecular desejado em ou para a composição de fucano com baixo teor de endotoxina, por exemplo, 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 50 kDa, 70 kDa, 100 kDa , Redução de peso molecular de 200 kDa, 300 kDa, 500 kDa ou 1000 kDa. A diafiltração pode compreender ainda a pré- filtração da composição de fucano de partida através de um pré-filtro adequado para remover o material particulado.

[00113] Os métodos podem compreender o ajuste da proporção da composição de fucano de partida para a resina de permuta aniônica macroporosa a uma relação predeterminada. A relação predeterminada pode ser entre 1:100 e 10:1, entre 1:90 e 1:1, 1:80 e 1:5 ou entre 1:70 e 1:10 de composição inicial: resina de permuta aniônica macroporosa. Em algumas modalidades, a relação predeterminada pode ser baseada na massa da composição de fucano de partida e da resina de permuta aniônica macroporosa.

[00114] Os métodos, sistemas, etc., podem compreender submeter a composição de fucano de partida a uma permuta aniônica com a resina por um período de tempo predeterminado. O período de tempo predeterminado pode ser entre cerca de 5 minutos e 300 horas, por exemplo, cerca de 10 minutos, 30 minutos e 1, 2, 3, 5, 10, 30, 100 e 300 horas.

[00115] Os métodos, sistemas, etc., podem compreender submeter a composição de fucano de partida a uma permuta aniônica com uma resina de permuta aniônica macroporosa de base forte, uma resina de permuta aniônica macroporosa de base fraca ou uma resina de carga mista macroporosa. "Base forte" e "base fraca "são usados de acordo com seus significados comuns, por exemplo, uma" base forte "sendo uma resina que não perde carga em quaisquer circunstâncias de troca iônica típicas, por exemplo, uma resina funcionalizada de amina quaternária e uma base fraca sendo uma resina que perde carregue sob condições de pH alto, por exemplo, uma resina funcionalizada com amina primária, secundária ou terciária.

[00116] Os métodos, sistemas, etc., podem compreender submeter a composição de fucano de partida a uma permuta aniônica com uma resina macroporosa compreendendo pelo menos um dentre grupos amino primários, secundários, terciários e quaternários. Os grupos amino primários podem ser grupos amina. Os grupos amino secundários podem ser pelo menos um de, por exemplo, grupos benzilamina e grupos dimetilamino. Os grupos amino terciários podem ser pelo menos um de, por exemplo, grupos dietilaminoetil e grupos dimetilaminoetil. Os grupos amino quaternários podem ser, por exemplo, grupos trimetil amônio e grupos trietil amônio. A resina pode compreender, mas não está limitada a, um ou mais dentre estireno, agarose, dextrano, acrilato, metacrilato, metacrilato de metila, metacrilato de butila, divinilbenzeno, celulose, sílica e cerâmica.

[00117] Os métodos, sistemas, etc., podem compreender o uso de uma resina de troca iônica com um tamanho médio de poro entre cerca de 5 nm e cerca de 1000 nm, por exemplo, cerca de 5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40nm, 50 nm, 60 nm, 80 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 750 nm ou 1000 nm A resina de troca iônica pode ter um limite de exclusão entre cerca de 5 kDa ou 50 kDa e 50.000 kDa, por exemplo, cerca de 50 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 500 kDa, 1.000 kDa, 2.000 kDa, 3.000 kDa, 4.000 kDa, 5.000 kDa, 6.000 kDa, 8.000 kDa, 9.000 kDa 10.000 kDa, 20.000 kDa,

40.000 kDa ou 50.000 kDa. Em algumas modalidades, o limite de exclusão é baseado no tamanho das proteínas globulares.

[00118] O sistema da FIG. 2 representa um aparelho exemplar para um sistema de remoção de endotoxina de adsorção aniônica 1400 para a remoção de endotoxinas de uma composição de fucano de partida. Uma solução contendo a composição de fucano de partida é fornecida através da linha de alimentação de entrada 1401 ao vaso de fucano do subsistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) 1416. A composição de fucano de partida em um solvente adequado pode ser pré-filtrada através do pré-filtro 1406 para remover matéria particulada indesejada. Em um processo de dessalinização, a bomba do subsistema de TFF 1414 bombeia a composição de fucano de partida para o filtro de TFF 1411 do subsistema de TFF 1410 através da linha de alimentação do filtro de TFF 1412.

[00119] O filtro de TFF 1411 pode ser fornecido como um cassete projetado para permitir que um fluido de entrada fornecido a ele passe sobre seu filtro em seu lado retentado, enquanto permite que um permeado saia por meio de uma primeira linha de saída e o fluido de entrada tratado saia como retentado por meio de outra saída linha. Para os presentes métodos exemplares, a MWCO do filtro de TFF 1411 é escolhido para permitir a permeação de componentes de sal, enquanto retém o fucano no retentado para tratamento de adsorção de ânion subsequente no subsistema de permuta de ânion 1420 A bomba de sistema 1414 fornece um nível de pressão sobre o filtro de TFF 1411 entre seus lados retentado e permeado. Na FIG. 2, o retentado do filtro de TFF 1411 é retornado ao contêiner de fucano do subsistema de TFF 1416 via linha de retorno de retentado do subsistema de TFF 1418, enquanto o permeado contendo os componentes de sal indesejados da composição de fucano de partida é produzido através da linha de saída de permeado do subsistema de TFF 1419 para uso fora da adsorção aniônica sistema de remoção de endotoxina 1400 ou para ser descartado.

[00120] Enquanto a bomba do subsistema de TFF 1414 recircula a composição de fucano de partida e o retentado sobre o filtro de TFF 1411, água desionizada ou uma solução de baixa condutividade do recipiente de solução de diafiltração do subsistema de TFF 1417 pode ser fornecida através da linha de fornecimento de solução de diafiltração do subsistema de TFF 1415. A solução de diafiltração é usada para reabastecer solução de retentado perdida através do permeado na linha de saída de permeado do subsistema de TFF 1419 e/ou para garantir que um número predeterminado de diavolumes de fucano de partida de entrada e solução de diafiltração circulem através do filtro de TFF 1411. Ao controlar a válvula de solução de diafiltração 1413, a solução de descarga pode ser adicionada em um pulso e/ou processo contínuo. O número de diavolumes de solução de descarga para processar através do filtro de TFF 1411 pode ser predeterminado. Em algumas modalidades, a solução de descarga pode ser água desionizada.

[00121] A válvula intersubsistema 1402 pode ser fechada durante o processamento acima, e o retentado do filtro de TFF 1411 do subsistema de TFF 1410 coletado em um contêiner (não mostrado) antes de ser fornecido ao recipiente fucano do subsistema de permuta aniônica 1426 do subsistema de permuta aniônica 1420. O retentado coletado pode ser fornecido ao recipiente fucano do subsistema de permuta aniônica 1426 do subsistema de permuta aniônica 1420 por meio de uma linha de saída de retentado do subsistema de TFF 1403. Em outras modalidades, o retentado coletado pode ser transferido em um recipiente (não mostrado) para o recipiente fucano do subsistema de permuta aniônica 1426. Em ainda outras modalidades do sistema, a válvula intersubsistema 1402 pode ser mantida aberta e o retentado do filtro de TFF 1411 pode ser fornecido através da linha de saída de retentado do subsistema de TFF 1403 em uma base contínua para o recipiente fucano do subsistema de permuta aniônica 1426. O retentado fornecido para O subsistema de permuta aniônica 1420 pode ter um teor de sal mais baixo do que a composição de fucano de partida. A redução no teor de sal da composição de fucano de partida pode ser desejada para processamento subsequente no subsistema de permuta aniônica 1420. Em algumas modalidades, a composição de fucano de partida pode ser fornecida como uma composição de fucano de partida dessalinizada e o processamento através do subsistema de TFF 1410 pode ser contornado.

[00122] O vaso de permuta aniônica 1421 do subsistema de permuta aniônica 1420 contém um volume de resina de permuta aniônica macroporosa 1429. O tamanho de poro da resina de permuta aniônica macroporosa 1429 é escolhido para adsorver preferencialmente moléculas de endotoxina enquanto deixa para trás moléculas de fucano. Tal resina pode compreender partículas substancialmente esféricas de estireno reticuladas com divinilbenzeno e tendo poros contendo grupos de amônio quaternário. A endotoxina, seja como moléculas individuais, aglomerados de moléculas ou micelas, pode ser preferencialmente adsorvida nos poros da resina com base no tamanho hidrodinâmico das moléculas de endotoxina, aglomerados ou micelas em solução. Em um processo de permuta aniônica, uma bomba de subsistema de permuta aniônica 1424 bombeia a composição de fucano retentado para o vaso de permuta aniônica 1421 do subsistema de permuta aniônica 1420 através da linha de fornecimento de vaso de permuta aniônica 1422.

[00123] A válvula de saída do subsistema de permuta aniônica 1404 pode ser fechada durante o processamento da composição de fucano retentado do subsistema de TFF 1410 no vaso de permuta aniônica 1421. A solução que flui através do vaso de permuta aniônica 1421 é retornada ao recipiente fucano do subsistema de permuta aniônica 1426 via linha de saída do vaso de permuta aniônica 1428, resultando na recirculação da solução. Durante a recirculação, a resina de permuta aniônica macroporosa 1429 adsorve a endotoxina da composição de fucano retentado.

[00124] O nível de endotoxina no vaso de fucano do subsistema de permuta aniônica 1426 pode ser medido ou monitorado. Quando a solução foi recirculada por um período de tempo adequado, ou quando atingiu um nível de endotoxina desejado predeterminado, a válvula de saída do subsistema de permuta aniônica 1404 pode ser aberta para produzir uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina através da linha de saída do subsistema de permuta aniônica 1405.

[00125] Voltando a romper o recipiente do agente 1427 e romper a linha de fornecimento do agente 1425 da FIG. 2, em tais modalidades,

um agente de ruptura é adicionado a partir do recipiente do agente de ruptura 1427 por meio da linha de fornecimento do agente de ruptura

1425. O agente de ruptura pode romper os clusters ou micelas das endotoxinas, tornando as moléculas resultantes mais prontamente adsorvíveis dentro dos poros da resina de permuta aniônica macroporosa 1429. Em certas modalidades, o retentado do filtro de TFF 1411 pode ser tratado com o agente de ruptura. Os agentes de ruptura adequados incluem, mas não estão limitados a Triton® X100, Triton® X114, Brij® 35, Tween® 20 e cloreto de benzalcônio. Extração líquido-líquido

[00126] Uma composição de fucano de partida, como uma composição de fucano matéria-prima, contendo altos níveis de endotoxina sofre extração líquido-líquido. Os métodos podem compreender: fornecer a composição de fucano de partida em uma solução de partida aquosa; misturar a solução de partida com um solvente orgânico para obter uma mistura de fase orgânica aquosa tendo uma porção aquosa compreendendo uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina e uma porção orgânica compreendendo impurezas hidrofóbicas incluindo endotoxinas; separar a porção aquosa da porção orgânica; e coletar a porção aquosa compreendendo a composição de fucano com baixo teor de endotoxina.

[00127] Os métodos podem compreender ainda a dessalinização da composição de fucano de partida antes de misturar com a solução de partida aquosa um solvente orgânico. A dessalinização pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida como uma solução em água através de um filtro de filtração de fluxo tangencial de redução de peso molecular (MWCO) (TFF). A diafiltração pode compreender a diafiltração da composição de fucano de partida com água destilada. O filtro de TFF de redução de peso molecular pode ter uma redução de peso molecular menor do que um ponto ou alvo de separação de peso molecular desejado em ou para a composição de fucano-endotoxina de baixo valor, por exemplo, uma redução de peso molecular de 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 50 kDa, 70 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 500 kDa ou 1000 kDa. A diafiltração pode compreender ainda a pré-filtração da composição de fucano de partida através de um pré-filtro adequado para remover o material particulado.

[00128] A mistura da solução de partida aquosa com um solvente orgânico pode compreender agitar a mistura da fase orgânica aquosa, agitar a mistura da fase orgânica aquosa, expor a mistura da fase orgânica aquosa a cisalhamento elevado, recirculando a porção aquosa na porção orgânica e recirculando a porção orgânica na porção aquosa.

[00129] A separação da porção aquosa da porção orgânica pode compreender pelo menos um dentre centrifugação, decantação, separação por funil de separação e separação por fluxo hidrodinâmico.

[00130] Os solventes orgânicos adequados para uso com este método incluem solventes orgânicos com uma polaridade relativa menor do que 0,765, por exemplo, etanol, isopropanol, metanol, benzeno, decametilciclopentassiloxano, acetato de etila, hexano, heptanol, octanol, decanol, heptano, acetato de isobutila, anisol, acetato de isopropila, 1-butanol, acetato de butila, metilisobutilcetona, pentano, 1-pentanol, éter etílico e acetato de propila. A fase orgânica pode conter impurezas, por exemplo, lipídeos, ácidos graxos, florotanino, proteínas, fucoxantina, clorofila e/ou endotoxinas. Modificação Estrutural Química

[00131] Os métodos, sistemas, etc. aqui discutidos podem compreender a modificação estrutural química da composição de fucano, particularmente os fucanos na composição de fucano. A modificação estrutural química pode envolver a remoção de grupos funcionais do fucano, por exemplo, grupos funcionais O-acetila, N- acetila, metóxi, hidroxila, carboxílico e/ou sulfato da estrutura do fucano. A modificação estrutural química pode envolver o uso de uma ampla variedade de reagentes químicos, por exemplo, ácidos, bases, detergentes e/ou agentes oxidantes. Doenças e condições Aderências fibrosas

[00132] A aderência fibrosa é um tipo de cicatriz que se forma entre duas partes do corpo, geralmente após a cirurgia (este tipo de aderência fibrosa pode ser referida como uma aderência cirúrgica). As aderências fibrosas podem causar problemas graves. Por exemplo, aderências fibrosas envolvendo os órgãos reprodutivos femininos (ovários, trompas de Falópio) podem causar infertilidade, dispareunia e fortes dores pélvicas. As aderências fibrosas que ocorrem no intestino podem causar obstrução ou bloqueio intestinal, e aderências fibrosas também podem se formar em outros lugares, como ao redor do coração, coluna e na mão. Além da cirurgia, as aderências fibrosas podem ser causadas, por exemplo, por endometriose, infecção, quimioterapia, radiação, trauma e câncer.

[00133] Uma variedade de aderências fibrosas é discutida neste documento. Termos como aderências cirúrgicas, aderências pós- cirúrgicas, aderências pós-operatórias, aderências devido à doença inflamatória pélvica, aderências devido a lesão mecânica, aderências devido à radiação, aderências devido ao tratamento de radiação, aderências devido a trauma e aderências devido à presença de material estranho todos os materiais referem-se à aderência de tecidos uns aos outros devido a um mecanismo semelhante e estão incluídos no termo aderências fibrosas.

[00134] A formação de aderências fibrosas é um processo complexo no qual os tecidos normalmente separados no corpo se transformam uns nos outros. As aderências cirúrgicas (também conhecidas como aderências pós-cirúrgicas) se desenvolvem a partir da resposta normal de cicatrização de feridas dos tecidos ao trauma e foram relatadas como ocorrendo em mais de dois terços de todos os pacientes cirúrgicos abdominais (Ellis, H., Surg. Gynecol. Obstet. 133: 497 (1971)). As consequências dessas aderências fibrosas são variadas e dependem do sítio da cirurgia ou de outro sítio, como o sítio da doença, envolvido. Os problemas podem incluir, dor crônica, obstrução dos intestinos e até mesmo um risco aumentado de morte após cirurgia cardíaca (diZerega, GS, Prog. Clin. Biol. Res. 381:1-18 (1993); diZerega, GS, Fertil. Steril. 61:219-235 (1994); Dobell, AR, Jain, AK, Ann. Thorac. Surg. 37: 273-278 (1984)). Em mulheres em idade reprodutiva, as aderências fibrosas envolvendo o útero, as trompas de falópio ou os ovários são estimados em cerca de 20 % de todos os casos de infertilidade (Holtz, G., Fertil. Steril. 41:497-507 (1984); Weibel, MA e Majno, G. Am. J. Surg. 126: 345-353 (1973)).

[00135] O processo de formação de aderência fibrosa envolve inicialmente o estabelecimento de uma estrutura de fibrina e o reparo do tecido normal. O processo normal de reparo permite a fibrinólise ao lado do reparo mesotelial. No entanto, na formação de aderência fibrosa, a matriz de fibrina amadurece à medida que os fibroblastos proliferam na rede e a angiogênese ocorre resultando no estabelecimento de uma aderência fibrosa organizada em cerca de 3 a 5 dias (Buckman, RF, et al., J. Surg. Res. 21 : 67-76 (1976); Raferty, AT, J. Anat. 129: 659-664 (1979)). Os processos inflamatórios incluem ativação de neutrófilos nos tecidos traumatizados, deposição de fibrina e ligação de tecidos adjacentes, invasão de macrófagos, proliferação de fibroblastos na área, deposição de colágeno, angiogênese e o estabelecimento de tecidos de aderência fibrosa permanente.

[00136] Várias tentativas foram feitas para prevenir aderências cirúrgicas. Estes envolvem abordagens farmacológicas destinadas a influenciar os eventos bioquímicos e celulares que acompanham os traumas cirúrgicos, bem como métodos de barreira para a separação dos tecidos afetados. Por exemplo, o uso de lavagem peritoneal, soluções heparinizadas, pró-coagulantes, modificação de técnicas cirúrgicas como o uso de técnicas cirúrgicas microscópicas ou laparoscópicas, a eliminação de talco de luvas cirúrgicas, o uso de suturas menores e o uso de barreiras físicas (filmes, géis ou soluções) com o objetivo de minimizar a aposição de superfícies serosas, todos foram tentados. Atualmente, as terapias preventivas também incluem a prevenção da deposição de fibrina, redução da inflamação (anti- inflamatórios esteroidais e não esteroidais) e remoção dos depósitos de fibrina.

[00137] As tentativas de intervenção para prevenir a formação de aderências pós-cirúrgicas incluem o uso de técnicas de hidroflotação ou dispositivos de barreira. A hidroflotação envolve a instilação de grandes volumes de soluções de polímero, como dextrano (Adhesion Study Group, Fertil. Steril. 40:612-619 (1983)), ou carboximetilcelulose (Elkins, TE, et al., Fertil. Steril. 41:926-928 (1984)), no espaço cirúrgico na tentativa de manter os órgãos separados. Membranas de barreira sintéticas feitas de celulose regenerada oxidada (por exemplo, Interceed™), politetrafluoroetileno (membrana cirúrgica Gore-tex) e membranas totalmente reabsorvíveis feitas de uma combinação de ácido hialurônico modificado/carboximetilcelulose (HA/CMC) (Seprafilm™) também foram usadas para reduzir a formação de aderência pós-cirúrgica em animais e humanos (Burns, JW, et al., Eur. J. Surg. Suppl. 577: 40-48 (1997); Burns, JW, et al., Fertil. Steril. 66 : 814-821 (1996); Becker, JM, et al., J. Am. Coll. Surg. 183: 297-306 (1996)). O sucesso dessas membranas HA/CMC pode derivar de sua capacidade de fornecer separação de tecidos durante o processo de reparo de feridas peritoneal quando aderências fibrosas se formam. Observou-se que as membranas formavam um revestimento claro e viscoso no tecido lesionado por 3-5 dias após a aplicação, um período de tempo que é compatível com o curso de tempo de formação de aderência pós-cirúrgica (Ellis, H., Br. J. Surg. 50:10-16 (1963)). Infelizmente, o sucesso limitado foi visto com esses métodos.

[00138] A peritonite envolve inflamação do peritônio. A peritonite pode causar problemas graves. Por exemplo, dor abdominal, sensibilidade abdominal e proteção abdominal. A peritonite pode envolver inflamação espontânea, anatômica e/ou relacionada à diálise peritoneal. A peritonite pode envolver uma infecção, por exemplo, perfuração de uma víscera oca, ruptura do peritônio, peritonite bacteriana espontânea e infecções sistêmicas podem resultar em infecção e peritonite. A peritonite também pode não envolver uma infecção, por exemplo, vazamento de fluidos corporais estéreis para o peritônio, e cirurgia abdominal estéril pode resultar em peritonite. Várias tentativas têm sido feitas para prevenir e/ou tratar a peritonite. Por exemplo, medidas gerais de suporte, como reidratação intravenosa, antibióticos e cirurgia. Existe uma necessidade não atendida de compostos, composições, métodos e semelhantes (incluindo abordagens de entrega) para inibir, ou de outra forma tratar e/ou prevenir a peritonite, de preferência de forma mais eficaz com poucos efeitos colaterais.

[00139] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui discutidas podem ser usadas para tratar aderências fibrosas em um paciente e podem ser incluídas como um componente de, ou ser, uma composição médica de fucano com baixo teor de endotoxina, dispositivo médico, combinação ou produto farmacêutico configurado e pode ser composto para tratar aderências fibrosas. Por exemplo, uma composição médica ou dispositivo médico de fucano com baixo teor de endotoxina compreendendo entre cerca de 0,02 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, por exemplo, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1 mg/mL, 2,5 mg/mL, 5 mg/mL 7,5 mg/mL, de uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina aqui dissolvida em uma solução de sal fisiológico. A solução salina fisiológica pode ser, por exemplo, Lactated Ringer’s Injection USP (LRS), soro fisiológico e solução fisiológica de Dextran.

[00140] As composições médicas e dispositivos médicos de fucano com baixo teor de endotoxina, que podem ser composições e dispositivos médicos líquidos, podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como tampões, estabilizadores, conservantes, adjuvantes, etc. Tais composições médicas e dispositivos médicos de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser usados para tratar aderências fibrosas pré-, durante ou pós- cirurgia, administrando entre cerca de 0,01 mL/kg (por quilograma de peso corporal do paciente ou alvo) a cerca de 10 mL/kg ou 15 mL/kg das composições médicas de fucano ou dispositivos em parágrafo anterior. Doses e quantidades do dispositivo incluem, por exemplo, cerca de 0,03 mL/kg, 0,1 mL/kg, 0,2 mL/kg, 0,4 mL/kg, 0,5 mL/kg, 0,6 mL/kg, 1 mL/kg, 1,2 mL/kg, 2 mL/kg, 3 mL/kg, 4 mL/kg, 5 mL/kg, 8 mL/kg, 10 mL/kg e 15 mL/kg da composição médica de fucano com baixo teor de endotoxina ou dispositivo médico para o sítio cirúrgico de o paciente. Em outras modalidades, tais composições médicas de fucano com baixo teor de endotoxina e dispositivos médicos podem ser usados para tratar aderências fibrosas em qualquer sítio alvo selecionado, por exemplo, lesões, abrasões, sítios de lesão, sítios cirúrgicos e sítios pós-cirúrgicos por administração entre cerca de 0,04 mg/kg ou 0,1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg ou 50 mg/kg. Alguns exemplos de tais doses incluem, por exemplo, cerca de 0,04 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,5 mg/kg , 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg e 50 mg/kg dos fucanos aqui, incluindo, por exemplo, as composições de fucanos com baixo teor de endotoxinas aqui, para o sítio cirúrgico do paciente.

A administração pode ser realizada, por exemplo, instilando uma composição médica líquida ou dispositivo médico geralmente em toda a área alvo; direcionar a composição médica líquida ou dispositivo médico em um sítio específico dentro da área alvo; pulverizar a composição médica líquida ou dispositivo médico em geral ou em um sítio específico dentro da área alvo; ou pulverizar ou de outra forma distribuir a composição médica líquida ou dispositivo médico por meio de um aplicador, que pode ser um aplicador de spray através de um trocarte, cateter, endoscópio ou outro dispositivo minimamente invasivo, em um sítio específico (s) que um cirurgião ou outro médico tenha identificados como particularmente suscetíveis ou preocupantes para o desenvolvimento de aderências fibrosas.

Em outro aspecto, a administração pode ser feita após a abertura da ferida cirúrgica, mas antes do procedimento cirúrgico; durante o procedimento cirúrgico ou após o procedimento cirúrgico, mas antes do fechamento da ferida cirúrgica.

Se desejado, a composição médica líquida ou o dispositivo médico também podem ser administrados após a cirurgia ser concluída (por exemplo, através de uma seringa e agulha) e também podem ser administrados em sítios alvo não cirúrgicos.

O sítio cirúrgico do paciente pode ser, por exemplo, pelo menos um dentre a cavidade pélvica, cavidade abdominal, cavidade dorsal, cavidade craniana, cavidade espinhal, cavidade ventral, cavidade torácica, cavidade pleural, cavidade pericárdica, pele, articulações, músculos, tendões ou ligamentos.

A administração da composição médica de fucano com baixo teor de endotoxina ou dispositivo médico no sítio cirúrgico do paciente pode ser realizada em menos de cerca de 15 minutos, 10 minutos, 8 minutos, 6 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos, 1 minuto, 45 segundos, 30 segundos, 20 segundos, 15 segundos, 10 segundos e 5 segundos.

[00141] Exemplos de administração da composição médica de fucano com baixo teor de endotoxina ou dispositivo médico a um sítio cirúrgico incluem, sem limitação, a administração da composição médica de fucano com baixo teor de endotoxina ou dispositivo médico no sítio cirúrgico de um procedimento cirúrgico de seção de Cesariana; um procedimento cirúrgico de reconstrução com retalho livre microvascular, um procedimento cirúrgico de enxerto de pele de espessura total, um procedimento cirúrgico de retalho de avanço V-Y, um procedimento cirúrgico de retalho de rotação fasciocutâneo, um procedimento cirúrgico de artroplastia, um procedimento cirúrgico de mastectomia, um procedimento cirúrgico de sequestrectomia, um procedimento cirúrgico de saucerização um procedimento cirúrgico de osteotomia, um procedimento cirúrgico de osteoplastia, um procedimento cirúrgico de patelectomia, um procedimento cirúrgico de sinovectomia, um procedimento cirúrgico de capsulectomia, um procedimento cirúrgico de reparo de tendão ou ligamento, um procedimento cirúrgico de tenólise, uma cirurgia de tenotomia, um procedimento cirúrgico de fasciotomia, um procedimento cirúrgico de reparo meniscal, um procedimento cirúrgico de vertebrectomia, um procedimento cirúrgico de etmoidectomia, um procedimento cirúrgico de operação de Caldwell Luc, um procedimento cirúrgico de dacriocistorrinostomia, um procedimento cirúrgico de lise nasal sinéquia, um procedimento cirúrgico de timectomia, um procedimento cirúrgico de pneumonólise, um procedimento cirúrgico de pneumectomia, um procedimento cirúrgico de toracoplastia, um procedimento cirúrgico de bilobectomia, um procedimento cirúrgico de cirurgia de hipertensão portal, um procedimento cirúrgico de esplenectomia, uma esofagectomia procedimento cirúrgico, um procedimento cirúrgico de cirurgia de peritonite, um procedimento cirúrgico de cirurgia de gastrectomia, um procedimento cirúrgico de cirurgia de jejunojejunostomia, um procedimento cirúrgico de cirurgia de colecistectomia laparoscópica, um procedimento cirúrgico de exploração laparoscópica do ducto biliar comum, um procedimento cirúrgico de gastroenterostomia, um procedimento cirúrgico de cirurgia bariátrica, um intestino procedimento cirúrgico de ressecção e anastomose, procedimento cirúrgico de hepatectomia segmentar, procedimento cirúrgico de lobectomia, procedimento cirúrgico de pancreatomia, procedimento cirúrgico de pancreaticoduodenectomia, procedimento cirúrgico de ressecção de tumor, procedimento cirúrgico de nefrectomia laparoscópica pr ocedura, um procedimento cirúrgico de cistectomia, um procedimento cirúrgico de lise de aderência abdominal ou pélvica, um procedimento cirúrgico de histerossalpingostomia, um procedimento cirúrgico de salpingoplastia, um procedimento cirúrgico de cirurgia laparoscópica de gravidez ectópica, um procedimento cirúrgico de cirurgia de substituição de articulação, um procedimento cirúrgico de reparo de osso quebrado, uma histerectomia procedimento cirúrgico, um procedimento cirúrgico de remoção da vesícula biliar, um procedimento cirúrgico de ponte de safena, um procedimento cirúrgico de angioplastia, um procedimento cirúrgico de aterectomia, um procedimento cirúrgico de biópsia de mama, um procedimento cirúrgico de endarterectomia carotídea, um procedimento cirúrgico de cirurgia de catarata, um procedimento cirúrgico de desvio da artéria coronária, um procedimento cirúrgico de dilatação e curetagem, um procedimento cirúrgico de correção de hérnia, um procedimento cirúrgico de cirurgia de dor lombar, um procedimento cirúrgico de colectomia parcial, procedimento cirúrgico de prostatectomia e um procedimento cirúrgico de tonsilectomia, após a abertura da ferida cirúrgica, durante a cirurgia, antes de fechar a ferida cirúrgica d e/ou após o fechamento da ferida cirúrgica. Cânceres em geral

[00142] Câncer tem sido a segunda causa de morte nos EUA e é responsável por mais de 20 % de todas as mortalidades. O câncer é uma doença proliferativa caracterizada pela divisão descontrolada de certas células, que pode levar à formação de um ou mais tumores. Uma série de métodos é usada para tratar o câncer, incluindo cirurgia, radiação, quimioterapia e suas combinações. Embora a cirurgia seja um método relativamente comum usado para alguns tumores localizados, ainda há uma chance significativa de recorrência do tumor após a excisão do tumor.

[00143] O tratamento de cânceres e outras doenças proliferativas tem sido limitado pelo potencial de dano ou toxicidade a tecidos saudáveis não cancerosos. Em tratamentos de radiação e cirúrgicos, o procedimento tem sido geralmente confinado e proximal aos sítios do tumor. No entanto, pode haver risco significativo para os pacientes submetidos à remoção cirúrgica de tecidos cancerígenos (por exemplo, na remoção de tumores da próstata ou do cérebro, pode haver um risco significativo de danos não reparáveis aos tecidos vitais circundantes, por exemplo, através da redução potencial da necessidade de ressecção de tecidos não tumorais. Além disso, no tratamento de radiação focalizado, que tem sido administrado como tratamento de primeira linha para o câncer de próstata, existem riscos semelhantes. No tratamento quimioterapêutico do câncer, a fármaco foi administrada sistemicamente, de modo que todo o corpo é expostos ao fármaco. Esses fármacos são projetados para serem tóxicos para as células cancerosas, mas também são (geralmente) tóxicos para as células não cancerosas, de modo que os pacientes ficam bastante doentes durante o tratamento com fármacos para o câncer. Por meio da experiência, os oncologistas podem dar doses desses fármacos que podem ser toleradas por alguns pacientes. No entanto, essas doses geralmente não têm sucesso no tratamento do câncer.

[00144] Um problema com qualquer método de tratamento do câncer é a recorrência do local da doença. Por exemplo, aproximadamente 700.000 americanos são diagnosticados com câncer localizado anualmente (aproximadamente 64 % de todos os pacientes com câncer) e quase meio milhão são tratados com métodos cirúrgicos. Infelizmente, 32 % dos pacientes tratados com cirurgia apresentam recidiva após o tratamento inicial (aproximadamente 21 % recidiva no sítio cirúrgico inicial e 11 % em sítios metastáticos distantes). Quase 100.000 pacientes morrem anualmente devido à recorrência localizada do câncer. Isso tem sido especialmente verdadeiro no câncer de mama, em que 39 % das pacientes submetidas à mastectomia terão recorrência do local da doença.

[00145] O estadiamento é um método de avaliação do progresso do câncer (tumor sólido) em um paciente. Uma abordagem simplificada coloca os pacientes em três grupos ou estágios com base em quão longe o câncer avançou: Estágio 1: O câncer pode ser tratado removendo cirurgicamente parte do órgão. Isso também é conhecido como estágio ressecável. Estágio 2: O câncer já ultrapassou o ponto de ser ressecável, mas ainda está confinado ao próprio órgão. Estágio 3: O tumor se espalhou para outros órgãos.

[00146] Muitos cânceres tratados com agentes antiproliferativos incluindo, por exemplo, 5-fluorouracila (Efudex®), vinca alcaloides (por exemplo, vincristina (Oncovin®)), antraciclinas (por exemplo,

doxorrubicina (Adriamycin®)), cisplatina (Platinol-AQ®), cloridrato de gencitabina (Gemzar®), metotrexato e paclitaxel. Alguns exemplos das toxicidades associadas aos agentes antiproliferativos, metotrexato e paclitaxel, são discutidos em outro lugar neste documento. O metotrexato tem sido usado para tratar vários cânceres, incluindo, por exemplo, câncer de bexiga, mama, cervical, cabeça e pescoço, hepático, pulmão e testicular. O paclitaxel tem sido usado para tratar vários cânceres, incluindo, por exemplo, câncer de ovário, mama e de células não pequenas de pulmão (Compendium of Pharmaceutical and Specialties Trigésima Quinta Edição, 2000).

[00147] As toxicidades devido ao 5-fluorouracila podem incluir toxicidade cardiovascular, como isquemia miocárdica; toxicidades do sistema nervoso central, como euforia, síndrome cerebelar aguda e ataxia; toxicidades dermatológicas, como alopecia e dermatite; toxicidades gastrointestinais, tais como náuseas, vômitos e ulceração oral ou gastrointestinal; toxicidades hematológicas como leucopenia, trombocitopenia e anemia; toxicidades de hipersensibilidade, como anafilaxia e hipersensibilidade de contato; toxicidades oculares como lacrimejamento aumentado, fotofobia e conjuntivite; e outras toxicidades, como febre. 5-Fluorouracila tem sido usada para tratar muitos cânceres, incluindo, por exemplo, câncer de mama, colorretal, gástrico, hepático, bexiga, cabeça e pescoço, pulmão de células não pequenas, ovário, pancreático e câncer de próstata (Compendium of Pharmaceutical and Specialties Trigésima Quinta Edição, 2000).

[00148] As toxicidades devido à vincristina incluem toxicidades do sistema nervoso central, como convulsões em crianças e alucinações; toxicidade dermatológica, como alopecia; toxicidade por extravasamento, como vesicante; toxicidades gastrointestinais, como náuseas, vômitos, constipação e estomatite; toxicidade hematológica, como mielossupressão; toxicidades neurológicas, como neuropatia periférica e neuropatia autonômica; toxicidades oculares, como visão dupla, cegueira transitória e atrofia óptica; toxicidades renais/metabólicas como retenção urinária, hiperuricemia e atonia da bexiga; toxicidade respiratória, como falta de ar; e, outra toxicidade, como febre em crianças. Este agente antiproliferativo tem sido usado para tratar vários cânceres, incluindo, por exemplo, doença de Hodgkin, de pulmão de células pequenas, tumor de Wilm e câncer testicular (Compendium of Pharmaceutical and Specialties Trigésima Quinta Edição, 2000).

[00149] As toxicidades devidas à doxorrubicina incluem toxicidades cardiovasculares, como anormalidades eletrocardiográficas e cardiomiopatia; toxicidades dermatológicas, como alopecia e alterações nas unhas; toxicidade de perigo de extravasamento, como vesicante; toxicidades gastrointestinais, tais como náuseas, vômitos e estomatite; toxicidade geniturinária, como coloração vermelha da urina; toxicidade hematológica, como mielossupressão; toxicidades de hipersensibilidade, como anafilaxia e erupção cutânea; toxicidade ocular, como conjuntivite; toxicidade reprodutiva, como infertilidade; e, outra toxicidade, como hiperuricemia. Este agente antiproliferativo tem sido usado para tratar vários cânceres incluindo, por exemplo, câncer de mama, de pulmão de pequenas células e câncer de ovário (Compendium of Pharmaceutical and Specialties Trigésima Quinta Edição, 2000).

[00150] As toxicidades devidas à cisplatina incluem toxicidade cardiovascular, como alterações eletrocardiográficas; toxicidade dermatológica, como hiperpigmentação; toxicidade de perigo de extravasamento, como irritante; toxicidades gastrointestinais, como náuseas e vômitos; toxicidades hematológicas, como mielossupressão e anemia hemolítica; toxicidade de hipersensibilidade, como anafilática; toxicidade neuromuscular, como neuropatia periférica e encefalopatia aguda; toxicidade ocular, como neurite retrobulbar; toxicidades otológicas, como perda auditiva e zumbido; toxicidades renais/metabólicas, como nefropatia tóxica e hipocalemia; e, outra toxicidade, como infertilidade. Este agente antiproliferativo tem sido usado para tratar vários tipos de câncer, incluindo, por exemplo, câncer de bexiga, de pulmão de pequenas células, de ovário, testicular, de cérebro, de mama, cervical, de cabeça e pescoço, hepatoblastoma e da tireoide (Compendium of Pharmaceutical and Specialties Trigésima Quinta Edição, 2000). As toxicidades devidas ao cloridrato de gencitabina incluem, por exemplo, toxicidades hematológicas, tais como mielossupressão; toxicidades gastrointestinais, como náuseas, vômitos e estomatite; toxicidades hepáticas, como elevações transitórias das transaminases séricas; toxicidades renais tais como proteinúria, hematúria, síndrome hemolítico-urêmica e insuficiência renal; toxicidade dermatológica, como erupção cutânea e alopecia; toxicidades de edema, como edema e edema periférico; e, outra toxicidade, como febre. Este agente antiproliferativo tem sido usado para tratar câncer de pulmão de células não pequenas e pancreático (Compendium of Pharmaceutical and Specialties Trigésimo quinto Edição , 2000).

[00151] A presente discussão compreende a prevenção ou tratamento de cânceres localizados ou tumores sólidos que podem ser tratados incluem os da próstata, mama, pâncreas, fígado, rim, sistema geniturinário, cérebro, sistema gastrointestinal, sistema respiratório e cabeça e pescoço. As composições, etc., aqui podem prevenir ou tratar cânceres, incluindo metástases, permitindo a liberação controlada de uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina em um sítio um tanto distante dos tumores alvo, permitindo que concentrações eficazes da composição de fucano com baixo teor de endotoxina atinjam o tumores e/ou metástases por difusão ou mesmo transporte sistêmico. Alguns desses cânceres são discutidos mais detalhadamente nos parágrafos seguintes. Câncer de Próstata

[00152] Câncer de próstata é um tumor maligno que surge nas células que revestem a glândula da próstata. Nos EUA, estima-se que

200.000 pacientes desenvolverão câncer de próstata este ano, e mais de 30.000 morrerão da doença. O câncer de próstata tem uma proporção de morte para novos casos de ~ 15 %. O câncer pode permanecer na próstata, ou pode se espalhar para os tecidos circundantes ou para sítios distantes (na maioria das vezes nódulos linfáticos e ossos). Normalmente, o câncer de próstata se espalha silenciosamente, produzindo sintomas apenas quando progrediu para além da próstata. Se o câncer de próstata foi diagnosticado e tratado durante os estágios iniciais, em alguns estudos os pacientes tiveram uma taxa de sobrevida de 5 anos de 94 %.

[00153] O câncer de próstata é frequentemente discutido como uma doença em homens com mais de 50 anos. Na verdade, 80 % dos homens com câncer de próstata têm 60 anos ou mais. As chances de um homem ser diagnosticado com câncer de próstata durante sua vida são de cerca de 1 em cada 10, aproximadamente as mesmas chances de uma mulher ter câncer de mama. O número de novos casos relatados aumentou dramaticamente nos últimos anos como resultado de testes melhorados que podem detectar a doença no início de seu desenvolvimento, muitas vezes muito antes do aparecimento dos sintomas. A probabilidade de desenvolver câncer de próstata em qualquer ano aumenta com a idade, mas aumenta drasticamente após os 50 anos.

[00154] As opções atuais de tratamento para o câncer de próstata dependem da extensão da progressão da doença, da idade do paciente e da saúde geral. Pacientes idosos, que têm apenas câncer em estágio inicial ou que sofrem de outras doenças mais graves, podem ser tratados de forma conservadora, enquanto aqueles cujo câncer está avançado podem ser submetidos a um tratamento mais agressivo. O câncer de próstata foi tratado por vários métodos, incluindo radioterapia (radiação de feixe externo ou braquiterapia), retirada de hormônio ou castração (cirúrgica ou química), agentes antiproliferativos, cirurgia e terapia expectante (isto é, "espera vigilante"). Nenhum tratamento garante uma cura absoluta e alguns têm efeitos colaterais consideráveis.

[00155] O câncer de próstata em estágio inicial (isto é, o tumor está localizado na próstata) pode ser tratado com "espera vigilante". A cirurgia para câncer de próstata tem sido recomendada para pacientes cujo estado geral de saúde tem sido bom e o tumor está confinado à próstata. Um tratamento comum para o câncer localizado da próstata em homens com menos de 70 anos é a prostatectomia radical (isto é, a remoção cirúrgica da próstata).

[00156] Pacientes cujo câncer está localizado na área da próstata são comumente tratados com radiação externa (EBR). A radiação mata as células cancerosas e reduz os tumores. EBR é responsável por menos de 20 % do tratamento do câncer de próstata localizado, com aproximadamente 50 % desses pacientes experimentando recorrências pós-radiação da doença. Combinado com a detecção do câncer de próstata em estágio inicial e o aumento da demanda dos pacientes, espera-se que o uso de braquiterapia (ou seja, radioterapia local) cresça. Em 1995, apenas 2,5 % dos pacientes recém- diagnosticados eram tratados com braquiterapia. A braquiterapia envolve a implantação de "sementes" de metal radioativo no tumor da próstata.

[00157] O tratamento do câncer de próstata que se espalhou envolve a remoção dos testículos ou terapia hormonal. Ambos são usados para inibir ou interromper a produção da testosterona que tem impulsionado o crescimento do câncer. Aproximadamente 20% de todos os pacientes com câncer de próstata são submetidos à terapia de abstinência hormonal. As terapias hormonais incluem acetato de gosserrelina (Zoladex®) ou acetato de leuprolida (Lupron®). Os agentes antiproliferativos usados para tratar o câncer de próstata incluem 5-fluorouracila. Câncer de Mama

[00158] Nos EUA, o câncer de mama tem sido o câncer mais comum entre as mulheres, com cerca de 180.000 novos casos diagnosticados a cada ano (o câncer de mama masculino é responsável por cerca de 5 % de todos os cânceres de mama diagnosticados). Foi superado apenas pelo câncer de pulmão como causa de morte em mulheres, sendo responsável por aproximadamente 50.000 mortes anualmente. Uma mulher americana tem uma chance em oito (ou cerca de 13 %) de desenvolver câncer de mama durante sua vida. Durante a última década, a maioria dos cânceres de mama relatados eram tumores pequenos, primários (surgindo independentemente; não causados por metástases). Aproximadamente 70% a 80% dos pacientes recém-diagnosticados exibiram doença em estágio inicial (Estágio 1 ou 2), e a maioria não teve envolvimento dos gânglios linfáticos axilares (axilas).

[00159] A maioria dos cânceres de mama são carcinomas (ou seja, tumores malignos que crescem em tecidos epiteliais). Menos de 1 % dos cânceres de mama são sarcomas ou tumores decorrentes do tecido conjuntivo, osso, músculo ou gordura. Além disso, a maioria dos cânceres de mama (cerca de 75%) são carcinomas ductais, surgindo nos tecidos que revestem os dutos de leite. Um número muito menor de cânceres (cerca de 7%) é encontrado dentro dos lóbulos da mama e são chamados de carcinomas lobulares. A doença de Paget (câncer de aréola e mamilo) e o carcinoma inflamatório são responsáveis por quase todas as outras formas de câncer de mama.

[00160] O tratamento do câncer de mama tem sido complicado e depende de muitos fatores. Dois fatores importantes são o tipo de tumor e o estágio de progressão. As características do tumor, em particular, ajudam a separar os indivíduos em dois grupos: (1) aqueles que apresentam baixo risco de recorrência do câncer e (2) aqueles que apresentam alto risco de recorrência do câncer. Fatores prognósticos específicos colocam os pacientes em qualquer um desses grupos. Esses fatores incluem o tamanho do tumor; presença de receptores de hormônio sexual feminino estrogênio e progesterona (ER/PR); fase do ciclo de crescimento celular (se as células tumorais estão se dividindo ativamente ou estão em "fase S"); presença de uma proteína conhecida como "proteína her-2-neu"; grau do tumor, um indicador de diferenciação ou alteração de células tumorais; e ploidia tumoral, o número de conjuntos de material genético dentro das células tumorais.

[00161] O tratamento da doença primária sem envolvimento significativo dos linfonodos tem sido por mastectomia e radioterapia. O envolvimento mais significativo dos linfonodos pode justificar a mastectomia e a remoção dos linfonodos auxiliares. Nesse estágio, a chance de metástases e recorrência local é alta. O tratamento da doença metastática tem sido paliativo, envolvendo radioterapia e quimioterapia, que são imunossupressoras, citotóxicas e leucopênicas. Agentes antiproliferativos incluindo, por exemplo, 5-fluorouracila, doxorrubicina, metotrexato e paclitaxel, foram aprovados para uso contra câncer de mama. Câncer de Pâncreas

[00162] O pâncreas é um órgão do sistema digestivo localizado próximo ao estômago e ao intestino delgado. Possui duas funções principais: a produção de enzimas e hormônios. Os cânceres do pâncreas podem ocorrer no pâncreas exócrino (isto é, enzimas) (por exemplo, adenocarcinomas pancreáticos clássicos) ou podem ocorrer no pâncreas endócrino (ou seja, hormônios).

[00163] O câncer do pâncreas exócrino é um problema de saúde muito sério. Nos EUA, aproximadamente 28.000 pacientes são diagnosticados com câncer pancreático, enquanto cerca do mesmo número morre anualmente desta doença. O câncer de pâncreas ocorre igualmente em homens e mulheres. Devido às dificuldades no diagnóstico, a natureza agressiva intrínseca dos cânceres pancreáticos e as opções de tratamento sistêmico esparsas disponíveis, apenas aproximadamente 4 % dos pacientes com diagnóstico de adenocarcinoma pancreático vivem 5 anos após o diagnóstico. O câncer de pâncreas tem sido a 5ª causa de morte por câncer, após o câncer de mama, pulmão, cólon e próstata.

[00164] A escolha do tratamento para o câncer de pâncreas depende muito do estágio do tumor. Os possíveis tratamentos incluem cirurgia, agentes antiproliferativos, radiação e terapia biológica. A cirurgia geralmente é reservada para pacientes no Estágio 1 cujo câncer é considerado ressecável. Às vezes, uma combinação de terapias, como radiação e agente antiproliferativo administrados antes ou depois da cirurgia, pode aumentar as chances de sobrevivência do paciente. O câncer de pâncreas considerado irressecável (geralmente estágio II ou posterior) pode ser tratado com agentes antiproliferativos em ensaios clínicos. Os agentes antiproliferativos, tais como, por exemplo, gencitabina ou 5-fluorouracila têm algum efeito contra o câncer pancreático e a gencitabina tem sido usada como agente paliativo. As toxicidades devido a esses agentes antiproliferativos são discutidas em outro lugar neste documento. A radioterapia tem algum efeito contra o câncer pancreático quando usada em combinação com a quimioterapia. A radioterapia por si só pode controlar os sintomas. Essa forma de tratamento também tem sido usada no estágio II ou nos cânceres pancreáticos posteriores. Câncer de Bexiga

[00165] Em 1998, estimou-se que mais de 54.000 novos casos de câncer de bexiga seriam diagnosticados nos EUA e cerca de 15.000 mortes seriam atribuídas à doença. O câncer de bexiga foi o quarto tipo de câncer mais comum entre os homens americanos e o nono câncer mais comum entre as mulheres americanas. Ocorre três vezes mais frequentemente em homens do que em mulheres. Principalmente uma doença de homens mais velhos, o câncer de bexiga tem sido uma causa significativa de doenças e morte. O risco de câncer de bexiga aumenta acentuadamente com a idade (80 % dos casos ocorrem em pessoas com mais de 50 anos), com mais da metade de todas as mortes por câncer de bexiga ocorrendo após os 70 anos. Em homens brancos com mais de 65 anos, a taxa anual de doenças do câncer de bexiga tem ocorreram aproximadamente 2 casos por 1.000 pessoas; isso contrasta com uma taxa de 0,1 caso por 1.000 pessoas com menos de 65 anos. Durante a vida, a probabilidade de desenvolver câncer de bexiga ao longo da vida é superior a 3%; no entanto, a probabilidade de morrer de câncer de bexiga é pequena (<1 %). O câncer de bexiga raramente ocorre em pessoas com menos de 40 anos de idade.

[00166] Estudos recentes sugerem que certos genes e habilidades metabólicas hereditárias podem desempenhar um papel no câncer de bexiga. O carcinoma de células transicionais (TCC) tem sido a forma mais comum de câncer de bexiga. O TCC geralmente ocorre como uma massa superficial (superfície), papilar (semelhante a uma verruga), exofítica (crescendo para fora) sobre uma base semelhante a um pedúnculo. Em alguns casos, porém, o TCC pode ser fixado em uma base ampla ou pode parecer ulcerado (dentro de uma lesão dentada). Os TCCs papilares geralmente começam como áreas de hiperplasia que mais tarde se desdiferenciam ou perdem as características individuais das células. Apenas cerca de 10% a 30% dos TCCs papilares evoluem para cânceres invasivos. Em contraste, as formas não papilares de TCC têm maior probabilidade de se tornarem invasivas. Como observado, esses TCCs podem parecer ulcerados ou planos. O TCC plano, não papilar, constituído por epitélio anaplásico foi classificado como carcinoma in situ (CIS ou TIS). O tecido do CIS contém células grandes, com nucléolos perceptíveis (corpo redondo dentro de uma célula; envolvido na síntese de proteínas) e sem polaridade normal.

[00167] O tratamento do câncer de bexiga depende de muitos fatores. Os mais importantes desses fatores são o tipo de tumor que está presente e seu estágio. Os tratamentos comuns incluem ressecção transuretral (RTU), eletrocirurgia, cirurgia a laser, terapia intravesical, agentes antiproliferativos, terapia cirúrgica, cistectomia e radioterapia. Exemplos de agentes antiproliferativos usados para tratar câncer de bexiga incluem, por exemplo, 5-fluorouracila, cisplatina e metotrexato. Toxicidades devido aos agentes antiproliferativos, 5- fluorouracila, cisplatina e metotrexato, são discutidas em outro lugar neste documento. Cancer Cerebral

[00168] Os tumores cerebrais costumam ser inoperáveis e mais de 80 % dos pacientes morrem em até 12 meses após o diagnóstico. Aproximadamente 18.000 novos casos de câncer primário intracraniano (cérebro) são diagnosticados a cada ano nos EUA. Isso representa cerca de 2 por cento de todos os cânceres em adultos. Mais de 50 por cento destes são gliomas de alto grau (ou seja, glioblastoma multiforme e tumores de astrocitoma anaplásico).

Pacientes com esses tumores geralmente sofrem de deficiências graves, como disfunção motora, convulsões e anormalidades da visão.

[00169] Os tumores que começam no tecido cerebral são conhecidos como tumores cerebrais primários. Os tumores cerebrais primários são classificados pelo tipo de tecido em que começam. Os tumores cerebrais mais comuns são os gliomas, que começam no tecido glial (de suporte). Outros incluem astrocitomas, gliomas do tronco cerebral, ependimomas e oligodendrogliomas.

[00170] A remoção cirúrgica de tumores cerebrais tem sido recomendada para a maioria dos tipos e sítios e deve ser a mais completa possível dentro das restrições de preservação da função neurológica. Uma exceção a essa regra são os tumores profundos, como os gliomas pontinos, que são diagnosticados com base em evidências clínicas e tratados sem cirurgia inicial em aproximadamente 50 % das vezes. Em muitos casos, entretanto, o diagnóstico por biópsia é realizado. A biópsia estereotáxica pode ser usada para lesões de difícil acesso e ressecção. Pacientes com tumores cerebrais que são raramente curáveis ou irressecáveis devem ser considerados candidatos para ensaios clínicos que avaliem radiossensibilizadores, hipertermia ou braquiterapia intersticial usada em conjunto com a radioterapia externa para melhorar o controle local do tumor ou para estudos que avaliem novos fármacos e modificadores da resposta biológica.

[00171] A radioterapia tem um papel importante no tratamento da maioria dos tipos de tumor e pode aumentar a taxa de cura ou prolongar a sobrevida livre de doença. A radioterapia também pode ser útil no tratamento de recorrências em pacientes tratados inicialmente apenas com cirurgia. A quimioterapia pode ser usada antes, durante ou após a cirurgia e a radioterapia. Os tumores recorrentes também são tratados com quimioterapia. Os agentes antiproliferativos usados no tratamento de cânceres cerebrais incluem cisplatina. Exemplos das toxicidades associadas a este agente antiproliferativo são discutidos em outro lugar neste documento. Reestenose

[00172] A reestenose é uma forma de lesão vascular crônica que leva ao espessamento da parede do vaso e perda de fluxo sanguíneo para o tecido fornecido pelo vaso sanguíneo. Esta doença inflamatória pode ocorrer em resposta a procedimentos de reconstrução vascular, incluindo qualquer manipulação que alivie a obstrução dos vasos. Assim, a reestenose tem sido um importante fator restritivo que limita a eficácia desses procedimentos.

[00173] A presente discussão compreende a prevenção ou tratamento da reestenose, por exemplo, pela administração a um vaso sanguíneo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação de um oligonucleotídeo terapêutico e um agente anti-inflamatório. As composições adequadas incluem um carreador polimérico que pode ser implantado cirurgicamente em um sítio de reestenose, ou local de reestenose, ou pode ser injetado por meio de um cateter como uma pasta ou gel polimérico. As composições adequadas podem compreender as composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui discutidas. Artrite

[00174] A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica debilitante caracterizada por dor, edema, proliferação de células sinoviais (formação de pannus) e destruição do tecido articular. No estágio avançado, a doença costuma causar danos a órgãos críticos e pode ser fatal. A doença envolve múltiplos membros do sistema imunológico (macrófagos/monócitos, neutrófilos, células B e células T), interações complexas de citocinas e mau funcionamento e proliferação das células sinoviais. O tratamento agressivo precoce tem sido recomendado com fármacos antirreumáticos modificadores da doença (DMARDs), como o metotrexato, fármaco que é discutido em outro lugar neste documento.

[00175] A artrite induzida por cristais foi caracterizada pela ativação induzida por cristais de macrófagos e neutrófilos nas articulações e é seguida por uma dor terrível por muitos dias. A doença progride de forma que os intervalos entre os episódios sejam menores e a morbidade para o paciente aumente. Esta doença geralmente tem sido tratada sintomaticamente com anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), como diclofenaco de sódio (Voltaren®). Este agente anti- inflamatório tem toxicidades que incluem toxicidades do sistema nervoso central, como tonturas e dor de cabeça; toxicidades dermatológicas, como erupção cutânea e prurido; toxicidades gastrointestinais, como colite ulcerativa exacerbada e doença de Crohn; toxicidades geniturinárias, como insuficiência renal aguda e necrose papilar renal; toxicidades hematológicas, tais como agranulocitose, leucopenia e trombocitopenia; toxicidades hepáticas, como transaminases hepáticas elevadas e hepatite; e outras toxicidades, como asma e anafilaxia.

[00176] A presente discussão compreende a prevenção ou tratamento da artrite reumatoide, por exemplo, através da administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo terapêutico e, opcionalmente, um agente anti-inflamatório. As composições adequadas incluem um veículo polimérico que pode ser injetado em uma articulação como um veículo de liberação controlada do agente anti-inflamatório e microparticulados como veículos de liberação controlada do oligonucleotídeo terapêutico (que por sua vez foi incorporado no veículo polimérico). As composições adequadas podem compreender as composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui discutidas. Esses veículos poliméricos podem assumir a forma de microesferas poliméricas, pastas ou géis. Condições Inflamatórias

[00177] As composições, etc., aqui podem opcionalmente inibir ou tratar condições inflamatórias envolvendo neutrófilos, por exemplo, compreendendo a administração a um paciente de composições contendo um oligonucleotídeo terapêutico e um agente anti- inflamatório. Exemplos de tais condições incluem artrite induzida por cristal; osteoartrite; artrite inflamatória não reumatoide; doença mista do tecido conjuntivo; Síndrome de Sjogren; espondilite anquilosante; Síndrome de Behçet; sarcoidose; psoríase; eczema; doença inflamatória intestinal; doença pulmonar inflamatória crônica; problemas neurológicos; e esclerose múltipla. Algumas dessas doenças são discutidas mais detalhadamente nos parágrafos seguintes. Doenças inflamatórias crônicas da pele (incluindo psoríase e eczema)

[00178] A psoríase é uma doença inflamatória crônica da pele comum, caracterizada por lesões elevadas, espessas e escamosas que coçam, queimam, picam e sangram facilmente. Embora essas doenças tenham proliferação celular e componentes angiogênicos em estágios posteriores da doença, os pacientes frequentemente apresentam condições artríticas associadas. Os sintomas podem ser tratados com agentes anti-inflamatórios esteroides, como prednisona, ou agentes antiproliferativos, como metotrexato, agentes esses que são discutidos em outro lugar neste documento. As composições aqui também podem ser usadas para inibir ou de outra forma tratar e/ou prevenir doenças inflamatórias crônicas da pele, por exemplo, psoríase e/ou eczema.

[00179] O que se segue fornece alguns exemplos representativos adicionais de doenças inflamatórias que podem ser tratadas com composições aqui discutidas, incluem, por exemplo, embolização arterial em malformações arteriovenosas (malformações vasculares); menorragia; sangramento agudo; distúrbios do sistema nervoso central; e, hiperesplenismo; doenças inflamatórias da pele, como psoríase; doença eczematosa (dermatite atópica, dermatite de contato, eczema); doença imunobolhosa; e, artrite inflamatória que inclui uma variedade de condições, incluindo artrite reumatoide, doença mista do tecido conjuntivo, síndrome de Sjögren, espondilite anquilosante, síndrome de Behçet, sarcoidose, artrite induzida por cristal e osteoartrite (todas as quais apresentam articulações inflamadas e doloridas como um sintoma proeminente). Isquemia

[00180] A isquemia ou isquemia envolve uma restrição no fornecimento de sangue, que pode incluir uma falta de fornecimento de oxigênio, glicose e outros componentes necessários para o funcionamento adequado do tecido, resultando em danos e/ou disfunção do tecido. A isquemia pode causar graves problemas. Por exemplo, os tecidos podem se tornar anóxicos, necróticos e podem se formar coágulos. Várias tentativas têm sido feitas para prevenir e/ou tratar a isquemia. Por exemplo, restauração do fluxo sanguíneo ou reperfusão. A restauração do sangue, entretanto, envolve a reintrodução de oxigênio, que pode causar danos adicionais devido à produção de radicais livres, resultando em lesão de reperfusão. Lesões por reperfusão podem causar problemas graves. As composições aqui podem ser usadas para inibir ou de outra forma tratar e/ou prevenir isquemia e/ou lesão de reperfusão. Endotoxemia

[00181] Endotoxemia é a presença de endotoxinas no sangue. A endotoxemia pode causar problemas graves. Por exemplo, a endotoxemia pode levar ao choque séptico. As composições deste documento podem ser usadas para inibir, ou de outra forma tratar e/ou prevenir a endotoxemia. Cicatriz Queloide

[00182] O traço queloide faz com que as feridas cicatrizem com cicatrizes elevadas. As cicatrizes elevadas dos traços queloides envolvem cicatrizes fibrosas anormais. O traço queloide causa problemas graves, por exemplo, dor e desfiguração. As composições aqui podem ser usadas para inibir, ou de outra forma tratar e/ou prevenir, o traço queloide e suas cicatrizes elevadas resultantes.

[00183] Queloide (cicatriz queloide) é um tipo de cicatriz que se expande em crescimentos sobre a pele normal. Queloides envolvem crescimento anormal de colágeno, incluindo crescimento anormal de colagem tipo I e tipo III. Os queloides causam problemas graves, por exemplo, dor, coceira e, se infectados, podem ulcerar. Têm sido feitas tentativas para tratar ou prevenir queloides, incluindo o uso de cirurgia, curativos, injeções de esteroides e terapia a laser. As composições aqui podem ser usadas para inibir, ou de outra forma tratar e/ou prevenir queloides. Dermatite

[00184] Dermatite inclui inflamação da pele, incluindo dermatite atópica e dermatite de contato. Por exemplo, a dermatite de contato envolve erupção cutânea localizada e/ou irritação da pele após o contato da pele com uma substância estranha. Por exemplo, a dermatite atópica é uma doença cutânea pruriginosa com recidiva crônica. A dermatite atópica é às vezes chamada de prurigo de Besnier, neurodermite, eczema endógeno, eczema flexural, eczema infantil, eczema infantil e prurigo diathsique. O eczema é uma doença em forma de dermatite. Outros tipos de dermatite incluem dermatite espongiótica, dermatite seborreica (caspa), dermatite disidrótica

(ponfólige), urticária, dermatite vesicular (dermatite bolhosa) e urticária popular. A dermatite pode causar problemas graves. Por exemplo, pele seca, erupções cutâneas, edema da pele, vermelhidão da pele, coceira na pele, crostas na pele, fissuras, bolhas, secreção e sangramento. Têm sido feitas tentativas para tratar ou prevenir a dermatite, incluindo o uso de corticosteroides e alcatrões de carvão. As composições deste documento podem ser usadas para inibir, ou de outra forma tratar e/ou prevenir, dermatite incluindo dermatite atópica, eczema, dermatite de contato, dermatite espongiótica, dermatite seborreica, dermatite disidrótica, urticária, dermatite vesicular e urticária popular. Rosácea

[00185] Rosácea é uma doença ou condição crônica tipicamente caracterizada por eritema facial. A rosácea pode causar problemas graves. Por exemplo, a rosácea normalmente começa como vermelhidão na testa, nariz ou bochechas e também pode causar vermelhidão no pescoço, orelhas, couro cabeludo e peito. Por exemplo, a rosácea pode causar sintomas adicionais, incluindo telangiectasia, pápulas, pústulas, sensações dolorosas e, em casos avançados, rinofima (nariz lobulado vermelho). Os subtipos de rosácea incluem rosácea eritematotelangiectásica, rosácea papulopustular, rosácea fimatosa e rosácea ocular. Têm sido feitas tentativas para tratar ou prevenir a rosácea, incluindo o uso de anti-inflamatórios e antibióticos. As composições aqui podem ser usadas para inibir, ou de outra forma tratar e/ou prevenir, rosácea incluindo seus subtipos eritematotelangiectásico, papulopustular, rosácea e ocular. Dispositivo Médico, Material Médico, Combinação e Produtos Farmacêuticos

[00186] A discussão aqui também fornece dispositivos médicos, materiais médicos, combinações e produtos farmacêuticos,

compreendendo composições como aqui discutidas em um dispositivo médico, materiais médicos, produto de combinação ou recipiente farmaceuticamente aceitável. Os produtos também podem incluir um aviso associado ao contêiner, normalmente em uma forma prescrita por um órgão regulador que regula a fabricação, uso ou venda de dispositivos médicos, materiais médicos, combinações e produtos farmacêuticos ou biofarmacêuticos, em que o aviso reflete a aprovação pela agência das composições, tal como um aviso de que uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina foi aprovada como um agente antiproliferativo ou agente anti-inflamatório, por exemplo, para administração humana ou veterinária para tratar doenças proliferativas ou doenças inflamatórias (tais como , por exemplo, artrite inflamatória, reestenose, aderências cirúrgicas, psoríase e peritonite). As instruções para o uso da composição de fucano com baixo teor de endotoxina neste documento também podem ser incluídas. Tais instruções podem incluir informações relacionadas à dosagem de um paciente e o modo de administração. Os produtos também podem incluir dispositivos, sistemas, etc., para administrar ou aplicar os materiais médicos, como, por exemplo, uma seringa e/ou um aplicador em spray.

[00187] O presente pedido é ainda direcionado a métodos de preparação dos vários elementos das composições, sistemas de fucano com baixo teor de endotoxina, etc., aqui discutidos, incluindo a fabricação das próprias composições, bem como a métodos de uso das mesmas, incluindo, por exemplo, o tratamento das condições, doenças, etc., aqui.

[00188] O presente pedido compreende ainda dispositivos médicos, materiais médicos, produtos de combinação médica e produtos farmacêuticos para o tratamento de aderências fibrosas, artrite, psoríase ou outras doenças, conforme desejado, compreendendo composições de fucano com baixo teor de endotoxina aqui apresentadas. Os materiais, etc., podem ser usados em um medicamento para o tratamento de aderências fibrosas, tais como aderências cirúrgicas, artrite, psoríase ou outras doenças conforme desejado. Também são fornecidos métodos de fabricação e uso de tais medicamentos capazes de reduzir os sintomas associados a pelo menos uma dentre aderências fibrosas, artrite e psoríase em um paciente, incluindo um paciente humano, compreendendo a combinação de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um fucano, tal como fucoidano, como aqui discutido com um excipiente ou tampão farmaceuticamente aceitável.

[00189] Os exemplos a seguir fornecem discussões exemplares de certas modalidades neste documento, mas a descrição e as reivindicações não se limitam aos mesmos. Exemplo 1: Modificação estrutural química

[00190] Um extrato de exsudato foi obtido de Laminaria hyperborea. O extrato de exsudado foi filtrado e pequenas moléculas foram removidas por filtração de fluxo tangencial (TFF) em um filtro de 100 kDa. Uma amostra do retentado resultante foi liofilizada para se obter a amostra A de outra forma não modificada. O retentado resultante foi levado a NaOH 0,25 M por adição de solução de NaOH 10 M e deixado à temperatura ambiente durante 16 horas. A amostra resultante foi, então, filtrada por centrifugação em um filtro de 50 kDa e o retentado resultante coletado e liofilizado para obter a amostra B tratada com base. Tanto a amostra A não modificada quanto a amostra B tratada com base foram analisadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de próton (1H-NMR) e o espectro de 1 H-NMR resultante é mostrado na FIG. 3A.

[00191] FIG. 3A demonstra a modificação estrutural química do fucano realizada, o pico amplo com um deslocamento químico de cerca de 2,0 ppm que está presente na amostra A não modificada não está presente na amostra B tratada com base.

[00192] A amostra A não modificada e a amostra B tratada com base/modificada foram ainda analisadas por coerência quântica múltipla heteronuclear 2D 1H-13C (HMQC). Os espectros de HMQC, mostrados na FIG. 3B, foram adquiridos a 70°C com supressão de sinal de solvente em um espectrômetro de 600 MHz equipado com sonda fria de 5 mm. Um grande número de varreduras dos espectros de HMQC foi adquirido na faixa de 10-30 ppm na dimensão do carbono em 8 incrementos de 256-512 varreduras cada; tais varreduras foram combinadas para criar os espectros na FIG. 3B.

[00193] Os espectro de HMQC para a amostra A não modificada tem um pico cruzado correspondente a grupos O-acetila, indicado pelo sinal circulado na FIG. 3B. Este pico cruzado não está presente no espectro da amostra B tratada com base. Isso demonstra a remoção de grupos acetila do fucano e, portanto, a modificação estrutural química do fucano na amostra B tratada com base pelo tratamento com NaOH. Exemplo 2: Floculação fisicamente induzida

[00194] Uma composição de fucoidano matéria-prima contendo um alto nível de endotoxina, por exemplo, pelo menos 1000 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) é preparada a cerca de 10 % em p/v em água destilada para obter uma solução de partida. O cloreto de sódio é adicionado à solução de partida, para produzir uma mistura com uma concentração final de cloreto de sódio de cerca de 0,1 M. A mistura é aquecida quase à ebulição durante entre 10-15 minutos. O tratamento da mistura a esta temperatura induz a floculação de impurezas dissolvidas e matéria particulada não fucoidana. A mistura é centrifugada a 2300 gravidades durante 40 minutos para separar a solução contendo fucoidano dos componentes não fucoidanos floculados. A solução contendo fucoidano é liofilizada para obter uma composição com baixo teor de endotoxina em fucoidano contendo um nível significativamente reduzido de unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg), por exemplo cerca de 100 EU/mg. Os níveis de EU podem ser medidos, por exemplo, por ensaio turbidimétrico de lisado do amebócito de Limulus (LAL). Exemplo 3: Filtração de fluxo tangencial modificada

[00195] Uma composição de fucoidano bruta foi primeiro submetida ao método de floculação fisicamente induzida discutido no Exemplo 2 para fornecer uma composição de fucoidano de partida contendo 109 EU/mg como determinado por ensaio turbidimétrico de lisado do amebócito de Limulus (LAL). Esta composição de 109 EU/mg foi, então, dissolvida a 50 mg/ml em água desionizada e filtrada através de um filtro de 0,22 µm para obter uma solução de partida. A solução de partida foi diafiltrada para 2 diavolumes com uma solução de ácido etilenodiamina-tetraacético 0,01 M (EDTA) e 0,5 % em p/v de desoxicolato de sódio para digerir e remover contaminantes biológicos e componentes do lisado biológico, tal como endotoxina. A primeira composição de fucoidano do retentado resultante foi diafiltrada por 10 diavolumes com EDTA 0,01 M para a remoção de desoxicolato de sódio residual e, em seguida, com 5 diavolumes de água destilada a um pH final de 7. A segunda composição de fucoidano do retentado resultante foi analisada quanto à endotoxina pelo método turbidimétrico de LAL e liofilizado para determinação do teor de fucoidano. O nível de endotoxina da composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina em solução foi de 0,158 EU/mg. Exemplo 4. Filtração de fluxo tangencial.

[00196] Uma composição de fucoidano de partida dissolvida em água desionizada foi microfiltrada através de três filtros diferentes com tamanho de poro progressivamente menor, com o último filtro sendo um filtro de 2/1,2 µm. A solução de fucoidano resultante foi analisada para endotoxina por ensaio turbidimétrico de lisado do amebócito de Limulus (LAL), e a concentração de umidade foi analisada com um analisador de umidade para determinar o teor de fucoidano. O nível de endotoxina em unidades de endotoxina por mg de fucoidano (EU/mg) da solução de fucoidano foi de 1,7 EU/mg.

[00197] A solução de fucoidano foi, então, diafiltrada com NaCl 5 mM sobre um único cassete de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) de 100 kDa sob uma operação em modo batelada como segue: A solução de fucoidano foi primeiro concentrada através da redução do volume. Um volume equivalente (1 diavolume) de NaCl 5 mM foi, então, adicionado à solução de fucoidano para iniciar a diafiltração. A concentração e depois a diafiltração foram repetidas até que 6 diavolumes de NaCl 5 mM tenham sido introduzidos na solução de fucoidano. A solução diafiltrada foi concentrada até um volume final. A composição de fucoidano do retentado resultante foi analisada quanto à endotoxina por ensaio turbidimétrico de LAL; e a concentração de umidade analisada com um analisador de umidade para determinar o teor de fucoidano. O nível de endotoxina foi reduzido para 1,2 EU/mg. Exemplo 5. Filtração de fluxo tangencial.

[00198] Uma composição de fucoidano de partida dissolvida em água desionizada foi microfiltrada através de três filtros diferentes com tamanho de poro progressivamente menor, com o último filtro sendo um filtro de 2/1,2 µm. A solução de fucoidano resultante foi analisada para endotoxina por ensaio turbidimétrico de lisado do amebócito de Limulus (LAL), e a concentração de umidade foi analisada com um analisador de umidade para determinar o teor de fucoidano. O nível de endotoxina em unidades de endotoxina por mg de fucoidano (EU/mg) da solução de fucoidano foi de 13.000 EU/mg.

[00199] A solução de fucoidano foi, então, diafiltrada com NaCl 5 mM sobre um único cassete de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) de 100 kDa sob uma operação em modo batelada como segue: A solução de fucoidano foi primeiro concentrada através da redução do volume. Um volume equivalente (1 diavolume) de NaCl 5 mM foi, então, adicionado à solução de fucoidano para iniciar a diafiltração. A concentração e depois a diafiltração foram repetidas até 8 diavolumes de NaCl 5 mM terem sido introduzidos na solução de fucoidano. A solução diafiltrada foi concentrada até um volume final. A composição de fucoidano do retentado resultante foi analisada quanto à endotoxina por ensaio turbidimétrico de LAL; e a concentração de umidade analisada com um analisador de umidade para determinar o teor de fucoidano. O nível de endotoxina foi reduzido para 6.100 EU/mg. Exemplo 6: Filtração de fluxo tangencial modificada

[00200] Uma composição de fucoidano bruta foi primeiro submetida ao método de floculação fisicamente induzida discutido no Exemplo 2 para fornecer uma composição de fucoidano de partida contendo 109 EU/mg como determinado por ensaio turbidimétrico de lisado do amebócito de Limulus (LAL). Esta composição de 109 EU/mg foi, então, dissolvida a 50 mg/ml em água e filtrada através de um filtro de 0,22 µm para se obter uma solução de partida. A solução de partida foi diafiltrada por 7 diavolumes com uma solução de NaOH 0,1 M, ácido etileno-diamina tetra-acético 0,01 M (EDTA) e dodecilsulfato de sódio 0,01 M (SDS) para digerir e remover contaminantes biológicos e componentes do lisado biológico, tal como endotoxina. O SDS foi removido da primeira composição de fucoidano do retentado resultante fora do sistema de filtração de fluxo tangencial assistido por precipitação com cloreto de potássio 3M seguido por uma centrifugação para remover dodecil sulfato de potássio precipitado. A composição de fucoidano do sobrenadante resultante foi novamente diafiltrada com 2 diavolumes de EDTA 0,01 M para a remoção de SDS residual. A composição de fucoidano do retentado secundário resultante foi analisada quanto à endotoxina pelo método turbidimétrico de LAL e liofilizada para determinar o teor de fucoidano. O nível de endotoxina da composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina foi inferior a 0,0006 EU/mg. Exemplo 7: Extração de fase sólida

[00201] Em dois experimentos paralelos, duas composições do fucoidano matéria-prima contendo, respectivamente, cerca de 4.000 e

8.000 unidades de endotoxina por miligrama (EU/mg), conforme medido pelo ensaio de LAL de coágulo de gel, são adicionadas a 40°C misturas de NaOH 0,5 M em 70 % em v/v de etanol/água. As misturas de reação resultantes são agitadas e mantidas a 40°C durante 2 horas. As misturas de reação são, então, centrifugadas para separar as composições sólidas de fucoidano com baixa endotoxina do NaOH 0,5 M em sobrenadante de etanol/água a 70% em v/v contendo as impurezas extraídas.

[00202] Após a conclusão do processo acima, o nível de endotoxina das composições de fucoidano com baixo teor de endotoxina obtidas é medido pelo ensaio de LAL de coágulo de gel e determinado ser 4 EU/mg e 8 EU/mg, respectivamente. Exemplo 8: Precipitação quimicamente induzida

[00203] Uma composição do fucoidano matéria-prima contendo

33.006 EU/mg foi preparada a 15 % em p/v em água destilada para obter uma solução de partida. Verificou-se que a solução de partida continha particulados suspensos por observação. O cloreto de cálcio foi adicionado à solução de partida a um nível de 0,5 M para produzir uma mistura de reação. NaOH 10 M foi adicionado gota a gota à mistura de reação para trazer o pH para entre 7 e 8. Isso foi feito para evitar a degradação do fucoidano na mistura de reação. Uma quantidade mínima de NaOH 10 M foi novamente adicionada à mistura de reação para evitar a acidificação da mistura de reação da adição subsequente de ácido fosfórico. A mistura de reação foi trazida para fosfato 0,5 M através da adição de ácido fosfórico. Isto iniciou a floculação das partículas suspensas e impurezas precipitadas por meio da ação do fosfato de cálcio formado pela reação do cloreto de cálcio com o ácido fosfórico. A mistura de reação foi deixada repousar à temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que a floculação continuasse. A mistura de reação foi centrifugada a 17.568 gravidades por 17 minutos para separar a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina desejada em uma solução de sobrenadante do precipitado floculado. A solução de sobrenadante foi liofilizada para obter o teor de fucoidano e a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina continha 27,7 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 9: Precipitação quimicamente induzida

[00204] Uma composição de fucoidano matéria-prima contendo

33.006 EU/mg foi preparada a 15 % em p/v em água destilada para obter uma solução de partida. Verificou-se que a solução de partida continha particulados suspensos por observação. NaOH 10 M foi adicionado gota a gota à solução de partida para trazer o pH para entre 7 e 8. Isso foi feito para evitar a degradação do fucoidano na solução de partida no caso da adição subsequente de sulfato de alumínio tornar a solução de partida ácida. A solução de partida foi trazida para sulfato de alumínio 0,1 M para produzir uma mistura de reação. Isto iniciou a floculação das partículas suspensas e impurezas precipitadas pelo hidróxido de alumínio formado. A mistura de reação foi deixada repousar à temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir a continuação da floculação. A mistura de reação foi centrifugada a 17.568 gravidades por 17 minutos para separar a composição desejada de fucoidano com baixa endotoxina em uma solução de sobrenadante do precipitado floculado. A solução de sobrenadante foi liofilizada para obter o teor de fucoidano e a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina na solução do sobrenadante continha 36,3 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 10: Lise e floculação

[00205] Uma solução de partida aquosa contendo entre 5 a 10 % em p/v de uma composição de fucoidano de partida com um nível de endotoxina de 25,9 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) foi fornecida. EDTA tetrassódico sólido foi adicionado como agente de quelação a uma concentração de 0,011 M. Solução de dodecil sulfato de sódio 1 M ("SDS") foi adicionada como agente de ruptura celular a uma concentração de 0,011 M. Solução de NaOH 10 M foi adicionada a uma concentração de 0,28 M para tornar a solução de partida básica. A mistura de reação resultante foi agitada durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente para proporcionar uma mistura branca turva.

[00206] Após cerca de 30 minutos, solução de KOH a 45 % em p/v foi adicionada a uma concentração de 0,07 M. A adição de potássio resultou na precipitação de SDS e impurezas indesejadas incluindo endotoxinas junto com o SDS. Solução de sulfato de alumínio a 48% em p/v foi adicionada a uma concentração de 0,11 M. A formação de hidróxido de alumínio floculou impurezas indesejadas incluindo endotoxinas na mistura de reação. Sulfito de sódio sólido foi adicionado a uma concentração de 0,02 M para extinguir os oxidantes potenciais na mistura de reação.

[00207] A mistura de reação resultante foi armazenada em um refrigerador por cerca de 16 horas, seguida por centrifugação a 17.568 gravidades por 17 minutos para separar a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina desejada em uma solução de sobrenadante das impurezas floculadas. A solução de sobrenadante foi liofilizada para obter o teor de fucoidano e a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina na solução de sobrenadante continha 0,02 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 11: Lise e floculação

[00208] Uma solução de partida aquosa contendo 5 a 10 % em p/v de uma composição de fucoidano de partida com nível de endotoxina de 25,9 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) foi fornecida. EDTA tetrassódico sólido foi adicionado como agente de quelação a uma concentração de 0,033 M. Solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) 1 M foi adicionada como agente de ruptura celular a uma concentração de 0,033 M. Solução de NaOH 10 M foi adicionada a uma concentração de 0,12 M para tornar a solução de partida básica. A mistura de reação resultante foi agitada durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente para proporcionar uma mistura branca turva.

[00209] Após cerca de 30 minutos, solução de KOH a 45 % em p/v foi adicionada a uma concentração de 0,07 M. A adição de potássio resultou na precipitação de SDS e outras impurezas incluindo endotoxinas juntamente com o SDS. Solução de sulfato de alumínio a 48% em p/v foi adicionada a uma concentração de 0,11 M. A formação de hidróxido de alumínio floculou impurezas indesejadas incluindo endotoxinas na mistura de reação. Sulfito de sódio sólido foi adicionado a uma concentração de 0,02 M para extinguir quaisquer oxidantes potenciais na mistura de reação.

[00210] A mistura de reação resultante foi armazenada à temperatura ambiente por cerca de 16 horas, seguida por centrifugação a 17.568 gravidades por 17 minutos para separar a composição desejada de baixa endotoxina em fucoidano em uma solução de sobrenadante das impurezas floculadas. A solução de sobrenadante foi liofilizada para obter um sólido branco, e o teor de fucoidano e a composição de fucoidano com baixa endotoxina na solução de sobrenadante foram encontrados para conter menos de 0,0005 unidade de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 12: Lise e floculação

[00211] Um fucoidano matéria-prima com nível de endotoxina em cerca de 33.006 EU/mg foi dissolvido em cerca de 10 % em p/v de fosfato dissódico 0,1 M em ebulição para produzir uma mistura de reação. Após 40 minutos à temperatura de ebulição, a mistura de reação foi centrifugada a 2300 gravidades durante 5 minutos para remover uma porção das impurezas floculadas incluindo endotoxinas. A solução de sobrenadante resultante foi trazida para fosfato trissódico 50 mM com fosfato trissódico sólido e NaOH 0,2 M com solução de NaOH 10 M para tornar a solução de sobrenadante básica. A mistura de reação secundária resultante foi trazida para metabissulfito de sódio 20 mM por adição de metabissulfito de sódio sólido para extinguir quaisquer oxidantes na mistura de reação secundária. A mistura de reação secundária foi ajustada para EtOH a 10% por adição de EtOH a 95% como um agente bacteriostático. A mistura de reação secundária foi trazida para cerca de 0,1 % em p/v de cloreto de benzalcônio por adição de uma solução de cerca de 50 % em p/v de cloreto de benzalcônio. O cloreto de benzalcônio foi adicionado para funcionar como o agente de ruptura celular.

[00212] A mistura de reação secundária foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, após o que foi neutralizada pela adição de HCl 6 M. A mistura de reação secundária foi ajustada para cloreto de zinco 0,15 M por adição de cloreto de zinco sólido. A formação consequente de fosfato de zinco floculou impurezas indesejadas na mistura de reação secundária, incluindo endotoxinas. A mistura de reação secundária de floculantes e solução foi deixada em agitação por mais 15 minutos. A mistura de reação secundária foi centrifugada a 2300 gravidades durante 5 minutos para separar o fucoidano desejado em uma segunda solução de sobrenadante das impurezas floculadas. A composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina desejada resultante na segunda solução de sobrenadante foi neutralizada pela adição de NaOH 10 M. A segunda solução de sobrenadante foi liofilizada para determinar o teor de fucoidano e a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina na segunda solução de sobrenadante apresentou um nível de endotoxina de 2 EU/mg. A segunda solução de sobrenadante resultante foi diluída e submetida à TFF para a remoção de cloreto de benzalcônio. Exemplo 13: Adsorção aniônica

[00213] Uma composição de fucoidano foi dessalinizada em um cassete de TFF de 100 kDa para obter uma composição de fucoidano dessalinizada em uma solução de partida com um nível de endotoxina de 960 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) conforme medido pelo método turbidimétrico de LAL. Uma porção da solução de partida compreendendo cerca de 500 mg da composição de fucoidano dessalinizada foi misturada com cerca de 2,5 g de resina Amberlyst A26 OH durante cerca de 16 horas. A porção líquida da mistura foi, então, separada da resina por decantação. O líquido foi liofilizado para obter uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina que continha 14,9 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 14: Adsorção aniônica

[00214] Uma composição de fucoidano foi dessalinizada em um cassete de TFF de 100 kDa para obter uma composição de fucoidano dessalinizada em uma solução de partida com um nível de endotoxina de 960 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) conforme medido pelo método turbidimétrico de LAL. Uma porção da solução de partida compreendendo cerca de 500 mg da composição de fucoidano dessalinizada foi misturada com cerca de 5,0 g de resina Amberlyst A26 OH durante cerca de 16 horas. A porção líquida da mistura foi, então, separada da resina por decantação. O líquido foi liofilizado para obter uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina que continha 0,06 unidade de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 15: Adsorção aniônica

[00215] Uma composição de fucoidano foi dessalinizada em um cassete de TFF de 100 kDa para obter uma composição de fucoidano dessalinizada em uma solução de partida com um nível de endotoxina de 960 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) conforme medido pelo método turbidimétrico de LAL. Uma porção da solução de partida compreendendo cerca de 500 mg da composição de fucoidano dessalinizada foi misturada com Triton® X100 a uma concentração final de cerca de 0,5 mM. A solução resultante foi misturada com cerca de 2,5 g de resina Amberlyst A26 OH durante cerca de 16 horas. A porção líquida da mistura foi, então, separada da resina por decantação. O líquido foi liofilizado para obter uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina que continha menos de 0,003 unidade de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 16: Adsorção aniônica

[00216] Uma composição de fucoidano foi dessalinizada em um cassete de TFF de 100 kDa para obter uma composição de fucoidano dessalinizada em uma solução de partida com um nível de endotoxina de 960 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) conforme medido pelo método turbidimétrico de LAL. Uma porção da solução de partida compreendendo cerca de 500 mg da composição de fucoidano dessalinizado foi misturada com n-butanol até uma concentração final de cerca de 5 % em v/v. A solução resultante foi misturada com cerca de 2,5 g de resina Amberlyst A26 OH durante cerca de 16 horas. A porção líquida da mistura foi, então, separada da resina por decantação. O líquido foi liofilizado para se obter uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina que continha 6,7 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 17: Adsorção aniônica

[00217] Uma composição de fucoidano foi dessalinizada em um cassete de TFF de 100 kDa para obter uma composição de fucoidano dessalinizada em uma solução de partida com um nível de endotoxina de 960 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) conforme medido pelo método turbidimétrico de LAL. Uma porção da solução de partida compreendendo cerca de 500 mg da composição de fucoidano dessalinizado foi misturada com etanol até uma concentração final de 10 % em v/v. A solução resultante foi misturada com cerca de 2,5 g de resina Amberlyst A26 OH durante cerca de 16 horas. A porção líquida da mistura foi, então, separada da resina por decantação. O líquido foi liofilizado para obter uma composição de baixa endotoxina em fucoidano que continha 6,0 unidades de endotoxina por miligrama de fucoidano (EU/mg) por ensaio turbidimétrico de LAL. Exemplo 18: Extração líquido-líquido

[00218] Uma composição de fucano de partida contendo cerca de

10.000 EU/mg é dissolvida a 10 mg/mL em água destilada para produzir uma solução de partida aquosa. 20 % em v/v de heptano é adicionado à solução de partida aquosa contendo a composição de fucoidano de partida e a mistura orgânica-aquosa é, então, misturada em alto cisalhamento durante 30 minutos. A mistura é terminada, e a mistura orgânica-aquosa é colocada em um funil de separação para a separação da fase orgânica da fase aquosa. A fase aquosa mais densa contendo o componente de fucano desejado deposita-se no fundo do funil de separação, enquanto a fase orgânica menos densa contendo impurezas indesejadas está presente na extremidade superior do funil de separação. A mistura orgânico-aquosa é deixada repousar no funil de separação durante 10 minutos. A fase aquosa é, então, decantada e recolhida como a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina desejada em solução. A composição de fucano com baixo teor de endotoxina em solução pode conter entre cerca de 50 % a cerca de 99,999 % menos endotoxina do que a composição de fucano de partida pelo método turbidimétrico de LAL. Exemplo 19: Extração líquido-líquido

[00219] Uma composição de fucano de partida contendo cerca de

10.000 EU/mg é dissolvida a 10 mg/mL em água destilada para produzir uma solução de partida aquosa. 20 % em v/v de 1-butanol são adicionados à solução de partida aquosa contendo a composição de fucoidano de partida e a mistura orgânica-aquosa é, então, misturada em alto cisalhamento por 30 minutos. A mistura é terminada, e a mistura orgânico-aquosa colocada em um funil de separação para a separação da fase orgânica da fase aquosa. A fase aquosa mais densa contendo o componente de fucano desejado deposita-se no fundo do funil de separação, enquanto a fase orgânica menos densa contendo impurezas indesejadas está presente na extremidade superior do funil de separação. A mistura orgânico- aquosa é deixada assentar no funil de separação durante 10 minutos. A fase aquosa é, então, decantada e recolhida como a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina desejada em solução. A composição de fucano com baixo teor de endotoxina em solução pode conter entre cerca de 50 % a cerca de 99,999 % menos endotoxina do que a composição de fucano de partida pelo método turbidimétrico de LAL. Exemplo 20: Extração líquido-líquido

[00220] Uma composição de função inicial contendo cerca de

10.000 EU/mg é dissolvida a 10 mg/mL em água destilada para produzir uma solução de partida aquosa. 20 % em v/v de acetato de etila são adicionados à solução de partida aquosa contendo a composição de fucoidano de partida e a mistura orgânico-aquosa é, então, misturada em alto cisalhamento durante 30 minutos. A mistura é terminada, e a mistura orgânico-aquosa colocada em um funil de separação para a separação da fase orgânica da fase aquosa. A fase aquosa mais densa contendo o componente de fucano desejado deposita-se no fundo do funil de separação, enquanto a fase orgânica menos densa contendo impurezas indesejadas está presente na extremidade superior do funil de separação. A mistura orgânico- aquosa é deixada assentar no funil de separação durante 10 minutos. A fase aquosa é, então, decantada e recolhida como a composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina desejada em solução. A composição de fucano com baixo teor de endotoxina em solução pode conter entre cerca de 50 % a cerca de 99,999 % menos endotoxina do que a composição de fucano de partida pelo método turbidimétrico de LAL. Exemplo 21: Determinação de endotoxina de fucanos brutos usados para fazer certos fucanos discutidos em alguns dos seguintes Exemplos

[00221] Fucanos brutos usados para fazer certos fucanos discutidos nos exemplos a seguir. Em particular, os fucanos brutos usados para fazer fucano 2, fucano 4 e fucano 7 foram analisados para endotoxina por ensaio de lisado do amebócito de Limulus (LAL). "Fucano 1 bruto"

refere-se ao fucano bruto que foi usado para fazer o fucano 2 e também usado para fazer o fucano 4. "Fucano 2 bruto" e "fucano 3 bruto" referem-se a dois fucanos brutos que foram misturados e, então, usados para fazer o fucano 7. Os resultados de tais análises são mostrados na Tabela 1. Os resultados nas tabelas abaixo contêm abreviaturas usadas para certas características da endotoxina. As unidades de endotoxina por miligrama são indicadas por EU/mg. Resultados da análise de endotoxina (EU/mg) Fucano 1 bruto 6,627 Fucano 2 bruto 31,712 Fucano 3 bruto 33,006 Tabela 1 Exemplo 22: Preparação de composições de baixa endotoxina de fucano

[00222] Os métodos aqui discutidos podem ser usados, combinados, modificados e permutados de qualquer maneira para obter composições de fucano com baixo teor de endotoxina. Dez composições de fucano com baixo teor de endotoxina foram preparadas a partir de composições de fucano com alto teor de endotoxina (por exemplo, matéria-prima) para avaliar a eficácia das composições de fucano com baixo teor de endotoxina em aplicações médicas e cirúrgicas. Mais particularmente, composições de fucano com alto teor de endotoxina com níveis de endotoxina variando de

10.000 EU/mg a 60.000 EU/mg foram modificadas e/ou despirogenadas usando um ou mais dos métodos aqui para obter as dez composições de fucano com baixo teor de endotoxina. As dez composições de fucano com baixo teor de endotoxina são em seguida referidas como fucano 1 a fucano 10. Fucano 1 a fucano 6, fucano 8 e fucano 10 eram sólidos brancos. Fucano 9 era um sólido marrom claro. Fucano 7 foi dissolvido em solução para obter uma solução límpida incolor. A preparação de fucano 1, fucano 3 e fucano 7 envolveu o uso de uma combinação de métodos discutidos no exemplo 8 e exemplo 10 mais diafiltração adicional contra uma solução de baixa força iônica. A preparação de fucano 2 e fucano 4 envolveu o uso de uma combinação dos métodos discutidos no exemplo 7, separação de fase micelar e exemplo 15. A preparação de fucano 9 envolvida usando uma combinação dos métodos discutidos no exemplo 7, separação de fase micelar e filtração de fluxo tangencial contra água desionizada. A preparação de fucano 6, fucano 8 e fucano 10 envolveu o uso de uma combinação dos métodos discutidos no exemplo 9 e exemplo 10, mais diafiltração adicional contra uma solução de baixa força iônica. Os níveis de endotoxinas, pesos moleculares, níveis de sulfato e níveis de carboidratos totais foram determinados como segue. Exemplo 23: Medição de endotoxinas e pesos moleculares de composições de fucano com baixo teor de endotoxina desejadas

[00223] Para fucanos 1 a 8 e fucano 10, o teste de endotoxina turbidimétrico foi realizado usando Associates of Cape Cod Pyrotell®-T lysate de acordo com as instruções do fabricante. As medições de turbidez foram feitas usando um leitor de placas de incubação Biotek Synergy® HTX. Os resultados foram quantificados contra curvas de calibração do fabricante CSE (endotoxina padrão de controle).

[00224] Para fucano 9, o teste de endotoxina cromogênico foi realizado usando um espectrofotômetro Charles River Nexgen®-PTS usando cartuchos Charles River Endosafe®. Os resultados foram quantificados contra curvas de calibração do fabricante CSE (endotoxina padrão de controle).

[00225] Os resultados dos testes de endotoxina de fucano 1 a fucano 10 são mostrados na Tabela 2 abaixo.

Endotoxina (EU/mg) Fucano 1 0,180 Fucano 2 0,044 Fucano 3 0,090 Fucano 4 0,020 Fucano 5 0,007 Fucano 6 0,007 Fucano 7 0,002 Fucano 8 0,030 Fucano 9 0,180 Fucano 10 0,001 Tabela 2: resultados de endotoxina de 10 fucanos diferentes

[00226] A Tabela 2 demonstra que as composições de fucano com baixo teor de endotoxina foram produzidas com níveis de endotoxina variando de 0,001 a 0,18 EU/mg. Exemplo 24: Distribuição de peso molecular, sulfato, carboidrato total e análise de composição de monossacarídeo de composições de fucano com baixo teor de endotoxina

[00227] A cromatografia de permeação em gel (GPC) foi usada para medir as distribuições de peso molecular das composições de fucano com baixo teor de endotoxina, fucano 1, fucano 2, fucano 4, fucano 5, fucano 6, fucano 8 e fucano 10. Há um grande número de parâmetros diferentes, colunas e padrões disponíveis para uso em cromatografia de permeação em gel, resultando em uma variedade de configurações de instrumentação disponíveis para a análise de peso molecular. Para as determinações de peso molecular aqui, a GPC foi conduzida usando os seguintes parâmetros: A fase móvel era de nitrato de sódio 0,1 M executado a 0,6 mL/min. O compartimento da coluna e o detector estavam a 30⁰C. Um detector de índice de refração

Waters 2414 foi usado para detecção.

[00228] Colunas de GPC adequadas incluem colunas de GPC compatíveis com solventes aquosos, por exemplo, colunas acondicionadas com pelo menos um dentre estireno-divinilbenzeno sulfonado, rede de copolímero de acrilato funcionalizado com NH, sílica modificada e gel à base de polimetacrilato hidroxilado. Para as análises aqui, três colunas foram usadas em série, compreendendo uma coluna de guarda de 40 mm de comprimento com um diâmetro interno (ID) de 6 mm acondicionada com gel à base de polimetacrilato hidroxilado de tamanho de partícula de 6 μm, seguido por uma primeira coluna de GPC analítica de 300 mm com um ID de 7,8 mm acondicionada com gel à base de polimetacrilato hidroxilado de tamanho de partícula de 12 μm que tem um limite de exclusão de cerca de 7.000 kDa e uma faixa de peso molecular eficaz entre cerca de 50 kDa e cerca de 5.000 kDa, seguido por uma segunda coluna de GPC analítica de 300 mm com um ID de 7,8 mm acondicionada com gel à base de polimetacrilato hidroxilado de tamanho de partícula de 10 μm que tem um limite de exclusão de cerca de 7.000 kDa e uma faixa de peso molecular eficaz dentre cerca de 1 kDa e cerca de 6.000 kDa. A faixa de peso molecular eficaz total desta configuração de coluna estava entre cerca de 1 kDa e cerca de 6.000 kDa. Um exemplo dessa configuração de coluna pode ser as colunas Ultrahydrogel® guard-Ultrahydrogel® 2000-Ultrahydrogel® Linear conectadas em série.

[00229] As amostras executadas foram quantificadas contra uma curva padrão que compreende padrões rastreáveis de American Polymer Standards Corporation: DXT3755K (peso molecular máximo = 2164 kDa), DXT820K (peso molecular máximo = 745 kDa), DXT760K (peso molecular máximo = 621 kDa), DXT670K (peso molecular máximo = 401 kDa), DXT530K (peso molecular máximo = 490 kDa),

DXT500K (peso molecular máximo = 390 kDa), DXT270K (peso molecular máximo = 196 kDa), DXT225K (peso molecular máximo = 213 kDa), DXT150K (peso molecular máximo = 124 kDa), DXT55K (peso molecular máximo = 50 kDa), DXT50K (peso molecular máximo = 44 kDa) e DXT5K (peso molecular máximo = 4 kDa), os picos de peso molecular destes padrões estão entre cerca de 4 kDa e cerca de 2.200 kDa. A curva padrão usada pode, por exemplo, incluir Dextran 3755 kDa, pelo menos um dentre Dextran 50 kDa e Dextran 55 kDa, e entre 3 a 6 padrões rastreáveis adicionais aqui discutidos, os pontos de calibração sendo os pesos moleculares máximos dos calibrantes usados. Um exemplo de curva de calibração pode consistir em DXT3755K, DXT 820K, DXT530K, DXT500K, DXT225K e DXT55K. As colunas usadas neste documento tinham uma faixa de peso molecular eficaz total que abrangia e se estendia além da faixa de peso molecular máximo dos padrões usados para quantificação dos fucanos.

[00230] Os resultados na Tabela 3 abaixo contêm abreviações usadas para certas características de uma distribuição de peso molecular. A cromatografia de permeação em gel é denotada por GPC, o peso molecular máximo é denotado por PMW, o peso molecular médio ponderado é denotado por WAMW, o peso molecular médio numérico é denotado por NAMW, a distribuição percentual é denotada por % de dist. e o peso molecular é denotado por MW. PMW WAMW NAMW % de % de % de % de (kDa) (kDa) (kDa) dist. dist. dist. dist. >100 >200 >500 >1600 kDa kDa kDa kDa Fucano 1 409,39 772,00 291,78 93,96 81,49 43,51 9,76 Fucano 2 107,12 136,05 79,86 53,43 19,83 1,10 0,00 Fucano 4 612,33 856,96 448,71 98,55 92,43 61,37 12,01 Fucano 5 457,33 592,80 300,92 95,39 82,93 43,84 4,93 Fucano 6 807,23 1233,04 713,99 99,91 98,52 79,66 23,60 Fucano 8 686,21 1876,74 524,89 98,37 92,97 69,90 30,60 Fucano 99,75 97,24 72,32 18,86 686,12 1083,48 604,43 10

Tabela 3: Peso molecular e características de endotoxina de sete composições de fucano com baixo teor de endotoxina

[00231] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina mostradas na Tabela 2 podem ser ainda caracterizadas por sua distribuição de peso molecular, mostrada na Tabela 3. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina com um peso molecular máximo entre cerca de 100 kDa e cerca de 850 kDa, um peso molecular médio ponderado entre cerca de 130 kDa e 2000 kDa, um peso molecular número médio entre cerca de 80 kDa e 750 kDa e pelo menos 50 % da distribuição acima de 100 kDa foram preparadas.

[00232] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina fucano 1, fucano 2, fucano 4, fucano 5, fucano 6, fucano 7, fucano 8 e fucano 10 foram dissolvidos em água desionizada, hidrolisado sob condições ácidas e analisado por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS ) para o % em p/p do teor total de enxofre, realizado pelos laboratórios ALS Environmental em Burnaby, British Columbia. O teor de enxofre foi convertido em teor de sulfato multiplicando o teor de enxofre pela relação molar de sulfato para enxofre para obter o % em p/p do teor de sulfato da composição de fucano. Os teores de sulfato das composições de fucano com baixo teor de endotoxina são mostrados na tabela 4 abaixo.

[00233] As composições de fucano com baixo teor de endotoxina, fucano 1, fucano 2, fucano 4, fucano 5, fucano 6, fucano 7, fucano 8 e fucano 10 também foram analisadas quanto à composição total de carboidratos e monossacarídeos. As composições de fucano com baixo teor de endotoxina foram dissolvidas em 72 % em p/p de ácido sulfúrico a 40 mg/mL e incubadas a 45⁰C em banho-maria por 30 minutos. O hidrolisado ácido foi, então, diluído a 4 % em p/p de ácido sulfúrico em um tubo de alta pressão e incubado a 120⁰C por 60 minutos. O segundo hidrolisado ácido resultante foi diluído em uma concentração de 1/333 com água destilada e executado em cromatografia de coluna de permuta aniônica de alto desempenho configurada com detecção de amperometria pulsada. A separação dos analisados foi realizada em uma coluna analítica Carbopac® PA20 executando o eluente de NaOH 10 mM a 1,0 mL/minuto usando uma bomba isocrática.

[00234] Verificou-se que as composições de fucano com baixo teor de endotoxina contêm fucose e galactose. O teor total de carboidratos foi determinado pela soma total dos analisados medidos. Os teores de fucose das composições de fucano com baixo teor de endotoxina foram determinados por interpolação em uma curva padrão para fucose. O teor de galactose das composições de endotoxina com baixo teor de fucano foi determinado pelo método de adição padrão. O teor de carboidrato total e o teor de fucose e galactose como porcentagens do teor de carboidrato total para as composições de fucano com baixo teor de endotoxina são mostrados na Tabela 4 abaixo. O carboidrato na tabela abaixo é abreviado como "carb". Teor de Teor de carb. Fucose (% em Galactose ( % sulfato (% em total (% em p/p do teor de em p/p do teor p/p do p/p do carb. total) de carb. total) fucano) fucano) Fucano 1 39,8 50,0 56,5 43,5 Fucano 2 32,2 29,9 90,8 9,2 Fucano 4 34,3 35,1 90,5 9,5 Fucano 5 44,9 41,7 89,7 10,3 Fucano 6 51,6 47,8 91,0 9,0 Fucano 7 44,9 53,5 93,9 6,1 Fucano 8 51,3 49,3 92,3 7,7 Fucano 10 44,8 59,0 89,9 10,2 Tabela 4 - Teor de sulfato, teor de carboidrato e composição de monossacarídeo das composições de fucano com baixo teor de endotoxina

Exemplo 25: Tratamento de aderência fibrosa epidural

[00235] Soluções de fucoidano feitas a partir das composições de fucano com baixo teor de endotoxina, fucano 1, fucano 2, fucano 4 e fucano 5 mostradas nas Tabelas 2 a 4 foram preparadas a 100 mg/mL em Injeção de Ringer Lactatada USP (LRS). O fucano 8 foi preparado a 500 mg/mL em Injeção de Ringer Lactatada USP (LRS). A cirurgia de laminectomia foi realizada em ratos Sprague Dawley, os pesos médios dos ratos e a dose em miligramas por quilograma mostrados na Tabela 5 abaixo. Um bloqueio de linha ao longo da coluna lombar foi criado com solução de bupivacaína. O dorso do rato foi limpo e, então, coberto com cortinas esterilizadas. A fáscia lombar foi aberta através de uma incisão na pele na linha média, a fáscia lombossacral foi cortada e os músculos paralombares foram dissecados para expor as lâminas vertebrais subjacentes. O osso no centro das vértebras foi removido. Ao longo do procedimento, a homeostasia foi mantida por irrigação com Injeção de Ringer Lactatada USP (LRS) e pressão com cotonetes. A dura-máter exposta foi tratada diretamente com 15 microlitros de LRS (controle) ou solução de fucoidano. As camadas musculares e cutâneas foram fechadas com suturas e os ratos foram permitidos se recuperar por uma semana antes do sacrifício para quantificação das aderências. A presença e o tamanho das aderências na dura-máter foram anotados. As dimensões das aderências e da dura-máter exposta foram registradas e usadas para calcular a porcentagem de cobertura da aderência, sendo a área da aderência como uma porcentagem da área total exposta da dura-máter: Equação 1: Cobertura da aderência (%) = 100 x área da aderência da dura-máter (mm2) ÷ área total exposta da dura-máter (mm2)

[00236] O grupo controle que recebeu LRS foi determinado ter uma cobertura de aderência de 65 % usando a equação 1. A cobertura de aderência para as composições de fucano com baixo teor de endotoxina, fucano 1, fucano 2, fucano 4 e fucano 5 é mostrada na Tabela 5 abaixo com a redução na cobertura de aderência em relação ao grupo controle. Peso Dose Dose por Número % de Médio do (mg) peso do de Ratos Redução na Rato (kg) animal Classifica Aderência (mg/kg) dos Epidural vs. Controle Fucano 1 0,50 1,5 3,0 2 100 % Fucano 2 0,65 1,5 2,3 4 83 % Fucano 4 0,64 1,5 2,3 4 100 % Fucano 5 0,58 1,5 2,6 2 100 % Fucano 8 0,59 7,5 12,8 3 100 % Tabela 5: Redução na Adesão Epidural do Rato em relação à LRS controle usando cinco fucanos diferentes

[00237] Como pode ser visto na Tabela 5, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser usadas para inibir, prevenir, remover, reduzir ou tratar de outra forma aderências pós- cirúrgicas. Exemplo 26: Aderência fibrosa do corno uterino tratada com fucano 7

[00238] Para determinar a eficácia da composição de fucano 7 com baixo teor de endotoxina na inibição de aderências cirúrgicas, as seguintes cirurgias do corno uterino duplo (DUH) foram realizadas em ambos os cornos de um total de quatro coelhos Brancos da Nova Zelândia. Antes da cirurgia, os coelhos foram pesados e, em seguida, preparados para cirurgia por pré-medicação com cetamina e xilazina.

[00239] A solução de fucoidano foi preparada a 0,33 mg/mL em Injeção de Ringer Lactada USP (LRS), esterilizando por filtração. Todos os instrumentos eram estéreis e um campo estéril foi mantido durante as cirurgias. O abdômen foi limpo e introduzido por meio de uma incisão abdominal na linha média. Os cornos uterinos foram localizados, exteriorizados e raspados para induzir danos. A parede abdominal próxima aos cornos uterinos raspados também foi raspada. Os cornos uterinos danificados e a parede abdominal foram colocados um ao lado do outro e estabilizados com suturas. A solução de 15 mL/kg de fucoidano por peso do coelho foi aplicada na cavidade abdominal, direcionando cerca de metade da solução de fucoidano para o corno esquerdo e cerca de metade da solução de fucoidano para o corno direito, antes que a incisão fosse fechada. A formação da adesão foi avaliada duas semanas após a cirurgia. Chifres com suturas destacadas não foram avaliados. O comprimento da aderência do corno uterino foi medido com uma régua. A porcentagem de cobertura de aderência do corno uterino, sendo o comprimento da aderência como uma porcentagem do comprimento total do corno uterino danificado foi calculada como: Equação 2: Cobertura da aderência (%) = 100 x comprimento da aderência do corno uterino ÷ comprimento total do corno uterino danificado

[00240] O mesmo método cirúrgico foi aplicado a quatro coelhos Brancos da Nova Zelândia, recebendo 15 mL/kg de Ijeção de Ringer Lactada USP (LRS) controle em vez de solução de fucoidano.

[00241] O grupo controle que recebeu LRS foi determinado como tendo uma cobertura de aderência de 63 % usando a equação 2. A Tabela 6 mostra os resultados obtidos usando o método discutido acima para a composição de fucano 7, sendo um exemplo representativo de uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina. Os resultados na Tabela 6 abaixo são mostrados como a redução na cobertura de aderência em relação ao grupo controle.

[00242] A Tabela 6 fornece os resultados do tratamento de seis cornos uterinos com fucano 7.

Dose Número de % de Redução na cobertura da (mg/kg) Cornos aderência do corno uterino vs. Uterinos controle 100 % (isto é, 100,0 % de redução Fucano 7 5 6 em aderências fibrosas em comparação ao controle) Tabela 6: Redução na aderência do corno uterino de coelho usando fucano 7 em relação à LRS controle

[00243] Como pode ser visto a partir dos resultados da Tabela 6, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser usadas para inibir, prevenir, remover, reduzir ou de outra forma tratar aderências do corno uterino pós-cirúrgicas. Exemplo 27: Aderência fibrosa do corno uterino tratada com fucano 8

[00244] Para determinar a eficácia da composição de fucano 8 com baixo teor de endotoxina na inibição de aderências cirúrgicas, as seguintes cirurgias do corno uterino duplo (DUH) foram realizadas em ambos os cornos de um total de quatro coelhos Brancos da Nova Zelândia. Antes da cirurgia, os coelhos foram pesados e, em seguida, preparados para cirurgia por pré-medicação com cetamina e xilazina.

[00245] A solução de fucoidano foi preparada a 3,75 mg/mL em Injeção de Ringer Lactada USP (LRS), esterilizando por filtração. Todos os instrumentos eram estéreis e um campo estéril foi mantido durante as cirurgias. O abdômen foi limpo e introduzido por meio de uma incisão abdominal na linha média. Os cornos uterinos foram localizados, exteriorizados e raspados para induzir danos. A parede abdominal próxima aos cornos uterinos raspados também foi raspada. Um volume de 4 mL de solução de fucoidano foi aplicado diretamente no corno uterino esquerdo lesado e na área da parede lateral e 4 mL de solução de fucoidano foram aplicados diretamente no corno uterino direito lesado e na área da parede lateral. Os cornos uterinos danificados e a parede abdominal foram colocados um ao lado do outro e estabilizados com suturas. Um tubo de drenagem foi posicionado na cavidade peritoneal antes do fechamento da incisão. O tubo de drenagem foi retirado 48h após a cirurgia. A aderência foi avaliada duas semanas após a cirurgia. O comprimento da aderência do corno uterino foi medido com uma régua. A cobertura de aderência do corno uterino foi calculada usando a equação 2.

[00246] O mesmo método cirúrgico foi aplicado a 3 coelhos Brancos da Nova Zelândia, recebendo 4 mL por lado de Injeção de Ringer Lactatada USP (LRS) controle em vez de solução de fucoidano. O grupo controle que recebeu LRS foi determinado como tendo uma cobertura de aderência de 73 % usando a equação 2. A Tabela 7 mostra os resultados obtidos usando o método discutido acima para a composição de fucano 8, sendo um exemplo representativo de uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina. Os resultados na Tabela abaixo são mostrados como a redução na cobertura de aderência em relação ao grupo controle.

[00247] A Tabela 7 fornece o resultado do tratamento de oito cornos uterinos com fucano 8. Dose Número de % de Redução na cobertura de (mg/kg) Cornos aderência do corno uterino vs. Uterinos controle Fucano 8 9,8 8 92,9 % Tabela 7: Redução na aderência do corno uterino de coelho usando fucano 8 em relação à LRS controle

[00248] Como pode ser visto a partir dos resultados da Tabela 7, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser usadas para inibir, prevenir, remover, reduzir ou tratar aderências pós- cirúrgicas do corno uterino. Exemplo 28: Aderência fibrosa do corno uterino tratada com fucano 9

[00249] Para determinar a eficácia da composição de fucano 9 com baixo teor de endotoxina na inibição de aderências cirúrgicas, as seguintes cirurgias do corno uterino duplo (DUH) foram realizadas em ambos os cornos de um total de nove coelhos Brancos da Nova Zelândia. Antes da cirurgia, os coelhos foram pesados e, em seguida, preparados para cirurgia por pré-medicação com cetamina e xilazina.

[00250] A solução de fucoidano foi preparada a 0,17 mg/mL, 0,33 mg/mL e 0,67 mg/mL em Injeção de Ringer Lactata USP (LRS), esterilizando por filtração. Todos os instrumentos eram estéreis e um campo estéril foi mantido durante as cirurgias. O abdômen foi limpo e introduzido por meio de uma incisão abdominal na linha média. Os cornos uterinos foram localizados, exteriorizados e raspados para induzir danos. A parede abdominal próxima aos cornos uterinos raspados também foi raspada. Os cornos uterinos danificados e a parede abdominal foram colocados um ao lado do outro e estabilizados com suturas. 15 mL/kg de solução de fucoidano por peso do coelho foram aplicados na cavidade abdominal antes do fechamento da incisão. A aderência foi avaliada duas semanas após a cirurgia. Três coelhos foram avaliados para cada concentração de fucoidano preparada. O comprimento da aderência do corno uterino foi medido com uma régua. O comprimento da aderência do corno uterino foi calculado usando a equação 2.

[00251] O mesmo método cirúrgico foi aplicado a 3 coelhos Brancos da Nova Zelândia, recebendo cerca de 48 mL (cerca de 15 mL/kg) de Injeção de Ringer Lactatada USP (LRS) controle em vez de solução de fucoidano. O grupo controle que recebeu LRS foi determinado como tendo uma cobertura de aderência de 54 % usando a equação 2. A Tabela 8 mostra os resultados obtidos usando o método discutido acima para a composição de fucano 9 em diferentes doses, sendo um exemplo representativo de uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina. Os resultados na Tabela abaixo são mostrados como a redução na cobertura de aderência em relação ao grupo controle.

[00252] A Tabela 8 fornece o resultado do tratamento de dezoito cornos uterinos com fucano 9. Concentração Dose Número de % de Redução na em Injeção de (mg/kg) Cornos cobertura de Ringer Lactada Uterinos aderência do corno USP (mg/mL) uterino vs. controle Fucano 9 0,17 2,5 6 100 % Fucano 9 0,33 5 6 100 % Fucano 9 0,67 10 6 100 % Tabela 8: Redução na aderência do corno uterino de coelho usando fucano 9 em relação à LRS controle

[00253] Como pode ser visto a partir dos resultados da Tabela 8, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser usadas para inibir, prevenir, remover, reduzir, ou de outra forma tratar aderências pós-cirúrgicas do corno uterino. Exemplo 29: Aderências do corno uterino tratadas com fucano 8

[00254] Para determinar a eficácia da composição de fucano 8 com baixa endotoxina na inibição de aderências cirúrgicas, as seguintes cirurgias do corno uterino duplo (DUH) foram realizadas em ambos os cornos de um total de três coelhos Brancos da Nova Zelândia. Antes da cirurgia, os coelhos foram pesados e, em seguida, preparados para cirurgia por pré-medicação com cetamina e xilazina.

[00255] A solução de fucoidano foi preparada a 5 mg/mL em Injeção de Ringer Lactada USP (LRS), esterilizando por filtração. Todos os instrumentos eram estéreis e um campo estéril foi mantido durante as cirurgias. O abdômen foi limpo e introduzido por meio de uma incisão abdominal na linha média. Os cornos uterinos foram localizados, exteriorizados e raspados para induzir danos. A parede abdominal próxima aos cornos uterinos raspados também foi raspada.

Os cornos uterinos danificados e a parede abdominal foram colocados um ao lado do outro e estabilizados com suturas. O terço superior e o terço inferior da incisão muscular foram fechados e 5 mL/kg de solução de fucoidano por peso do coelho foram aplicados na cavidade abdominal. A incisão muscular foi fechada temporariamente e a solução de fucoidano deixada na cavidade abdominal por 30 minutos. A incisão muscular foi reaberta e a cavidade abdominal foi estimulada com 10 mL/kg de LRS. A maior parte do líquido da cavidade abdominal foi aspirada antes do fechamento da incisão. A formação da adesão foi avaliada duas semanas após a cirurgia. O comprimento da aderência do corno uterino foi medido com uma régua. A porcentagem de cobertura de aderência do corno uterino, sendo o comprimento da aderência como uma porcentagem do comprimento total do corno uterino danificado, foi calculada usando a equação 2.

[00256] A Tabela 9 mostra os resultados obtidos usando o método discutido acima para a composição de fucano 8, sendo um exemplo representativo de uma composição de fucoidano com baixo teor de endotoxina. Os resultados na Tabela abaixo são mostrados como o comprimento de aderência médio ao longo dos 6 cornos uterinos classificados. Dose Número de % do comprimento da (mg/kg) Cornos Uterinos aderência médio 0 % (isto é, nenhuma Fucano 8 25 6 aderência foi encontrada) Tabela 9: Comprimento de aderência usando fucano 8

[00257] Como pode ser visto a partir dos resultados da Tabela 9, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser usadas para inibir, prevenir, remover, reduzir ou tratar de outra forma aderências do corno uterino pós-cirúrgicas. Exemplo 30: Aderência fibrosa do corno uterino tratada com uma composição de fucano com baixp teor de endotoxina

[00258] Para determinar a eficácia de uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreendendo um nível de endotoxina total de 0,003 EU/mg na inibição de aderências cirúrgicas, as seguintes cirurgias do corno uterino duplo (DUH) foram realizadas em ambos os cornos de um total de vinte coelhos Brancos da Nova Zelândia. Antes da cirurgia, os coelhos foram pesados e, em seguida, preparados para a cirurgia por pré-medicação com midazolam e dexmeditomidina.

[00259] A solução de fucoidano foi preparada em cada concentração de 0,02 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL ou 2,5 mg/mL em Injeção de Ringer Lactata USP (LRS), esterilizando por filtração. Todos os instrumentos eram estéreis e um campo estéril foi mantido durante as cirurgias. O abdômen foi limpo e introduzido por meio de uma incisão abdominal na linha média. Os cornos uterinos foram localizados, exteriorizados e raspados para induzir danos. A parede abdominal próxima aos cornos uterinos raspados também foi raspada. Os cornos uterinos danificados e a parede abdominal foram colocados um ao lado do outro e estabilizados com suturas. Cerca de 2 mL/kg de solução de fucoidano por peso do coelho foram aplicados na cavidade abdominal antes do fechamento da incisão. A aderência foi avaliada duas semanas após a cirurgia. Cinco coelhos foram tratados e avaliados para cada concentração de fucoidano preparada. O comprimento da aderência do corno uterino foi medido com uma régua. O comprimento da aderência do corno uterino foi calculado usando a equação 2.

[00260] O mesmo método cirúrgico foi aplicado a 5 coelhos Brancos da Nova Zelândia adicionais para controle, cada um recebendo cerca de 2 mL/kg de Injeção de Ringer Lactada USP (LRS) controle em vez de solução de fucoidano. O grupo controle que recebeu LRS foi determinado como tendo uma cobertura de aderência de 100%

usando a equação 2. A Tabela 10 mostra os resultados obtidos usando o método discutido acima para a composição de fucano com baixo teor de endotoxina em diferentes concentrações e dosagens (no total, quarenta cornos uterinos foram tratados com solução de fucano, 10 para cada concentração da composição de fucano com baixo teor de endotoxina); os resultados são mostrados como a redução da cobertura de aderência em relação ao grupo controle. Concentração Dose Número de % de Redução na cobertura de (mg/mL) (mg/kg) Cornos aderência do corno uterino vs. Uterinos controle 0,02 0,04 10 10 % (isto é, 10 % de diminuição em aderências fibrosas em comparação ao controle) 0,1 0,2 10 30 % (isto é, 30 % de diminuição em aderências fibrosas em comparação ao controle) 0,5 1 10 71 % (isto é, 71 % de diminuição em aderências fibrosas em comparação ao controle) 2,5 5 10 95 % (isto é, 95 % de diminuição em aderências fibrosas em comparação ao controle) Tabela 10: Diminuição da aderência do corno uterino de coelho usando uma composição de fucano com baixo teor de endotoxina em relação ao controle de LRS

[00261] Como pode ser visto a partir dos resultados da Tabela 10, as composições de fucano com baixo teor de endotoxina podem ser usadas para inibir, prevenir, remover, reduzir ou tratar de outra forma aderências do corno uterino pós-cirúrgicas. Lista de Números de Referência: 1000 Sistema de TFF modificado 1002 Linha de fornecimento de entrada

1004 Pré-filtro 1006 Válvula de saída do sistema de TFF 1008 Linha de saída do sistema de TFF assistido 1010 Filtro para filtração de fluxo tangencial (TFF) 1012 Linha de fornecimento de TFF 1014 Bomba de entrada de TFF 1016 Fucano container 1017 Válvula do retentado de TFF 1018 Linha de retorno do retentado de TFF 1019 Linha de saída do permeado de TFF 1020 Primeiro recipiente de solução de diafiltração 1024 Primeira válvula de solução de diafiltração 1025 Primeira linha de fornecimento de solução de diafiltração 1030 Segundo recipiente de solução de diafiltração 1034 Segunda válvula de solução de diafiltração 1035 Segunda linha de fornecimento de solução de diafiltração 1400 Sistema de remoção de endotoxina por adsorção aniônica 1401 Linha de fornecimento de entrada 1402 Válvula Intersubsistema 1403 Linha de saída do retentado do subsistema de TFF 1404 Válvula de saída do subsistema de permuta aniônica 1405 Linha de saída do subsistema de permuta aniônica 1406 Pré-filtro 1410 Subsistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) 1411 Filtro de filtração de fluxo tangencial (TFF) 1412 Linha de fornecimento de filtro de TFF 1413 Válvula de solução de diafiltração 1414 Bomba do subsistema de TFF 1415 Linha de fornecimento de solução de diafiltração do subsistema de TFF

1416 Recipiente de fucano do subsistema de TFF 1417 Recipiente de solução de diafiltração do subsistema de TFF 1418 Linha de retorno do retentado do subsistema de TFF 1419 Linha de saída de permeado do subsistema de TFF 1420 Subsistema de permuta aniônica 1421 Vaso de permuta aniônica 1422 Linha de fornecimento do vaso de permuta aniônica 1424 Bomba do subsistema de permuta aniônica 1425 Linha de fornecimento de agente de ruptura 1426 Recipiente de fucano do subsistema de permuta aniônica 1427 Recipiente do agente de ruptura 1428 Linha de saída do vaso de permuta aniônica 1429 Resina de permuta aniônica macroporosa

[00262] Todos os termos usados neste documento são usados de acordo com seus significados comuns, a menos que o contexto ou definição indique claramente o contrário. Além disso, a menos que expressamente indicado de outra forma, nesta descrição o uso de "ou" inclui "e" e vice-versa. Os termos não limitativos não devem ser interpretados como limitantes, a menos que expressamente declarado, ou o contexto indique claramente, de outra forma (por exemplo, "incluindo", "tendo" e "compreendendo" normalmente indicam "incluindo, sem limitação"). Formas singulares, incluindo nas reivindicações, tais como "um," "uma" e "o/a" incluem a referência no plural, a menos que expressamente declarado, ou o contexto indique claramente o contrário.

[00263] A menos que indicado de outra forma, os adjetivos aqui tal como "substancialmente" e "cerca de" que modificam uma condição ou característica de relação de um recurso ou recursos de uma modalidade, indicam que a condição ou característica é definida dentro de tolerâncias que são aceitáveis para a operação da modalidade para uma aplicação a que se destina.

[00264] O escopo dos presentes métodos, composições, sistemas, etc., inclui os conceitos de meio mais função e etapa mais função. No entanto, as reivindicações não devem ser interpretadas como indicando uma relação "meio mais função", a menos que a palavra "meio" seja especificamente recitada em uma reivindicação, e devem ser interpretadas como indicando uma relação "meio mais função" em que a palavra "meio" é especificamente recitada em uma reivindicação. Da mesma forma, as reivindicações não devem ser interpretadas como indicando uma relação "etapa mais função", a menos que a palavra "etapa" seja especificamente recitada em uma reivindicação, e devem ser interpretadas como indicando uma relação "etapa mais função" em que a palavra "etapa" é especificamente recitada em uma reivindicação.

[00265] Do exposto, será apreciado que, embora modalidades específicas tenham sido discutidas neste documento para fins de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da discussão neste documento. Por conseguinte, os sistemas e métodos, etc., incluem tais modificações, bem como todas as permutações e combinações do assunto aqui estabelecido e não são limitados, exceto pelas reivindicações anexas ou outra reivindicação tendo suporte adequado na discussão e nas figuras aqui.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, caracterizada pelo fato de que compreende menos do que cerca de 0,2 unidades de endotoxina por miligrama de fucano.

2. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,18 unidades de endotoxina por miligrama de fucano.

3. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,16 unidades de endotoxina por miligrama de fucano.

4. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos de cerca de 0,1 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

5. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos de cerca de 0,09 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

6. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos de cerca de 0,06 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

7. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,04 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

8. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,03 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

9. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos de cerca de 0,02 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

10. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos de cerca de 0,01 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

11. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,007 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

12. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,003 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

13. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina,

de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,002 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

14. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,001 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

15. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos de cerca de 0,0006 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

16. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende menos do que cerca de 0,0005 unidade de endotoxina por miligrama de fucano.

17. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que o fucano tem uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 60 % em p/p da distribuição é maior do que 100 kDa quando medido utilizando-se uma cromatografia de permeação em gel aquosa apresentada consistindo essencialmente em: uma coluna de cromatografia de permeação em gel analítica de 300 mm com um diâmetro interno de 7,8 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, tendo uma faixa de peso molecular eficaz entre cerca de 50 kDa e cerca de

5.000 kDa, uma coluna de cromatografia de permeação em gel analítica de 300 mm com um diâmetro interno de 7,8 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, tendo uma faixa de peso molecular eficaz entre cerca de 1 kDa e cerca de

6.000 kDa e uma coluna de guarda de 40 mm com um diâmetro interno de 6 mm acondicionado com gel à base de polimetacrilato hidroxilado, as duas colunas de cromatografia de permeação em gel analítica e a coluna de guarda contida em um compartimento de coluna a cerca de 30°C; um detector de índice refrativo a cerca de 30 °C; fase móvel de nitrato de sódio 1M conduzida a 0,6 mL/min; e quantificação contra uma curva padrão de peso molecular máximo consistindo essencialmente em um primeiro padrão de dextrano com um peso molecular máximo de cerca de 2.200 kDa, um segundo padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 720 kDa e cerca de 760 kDa, um terceiro padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 470 kDa e cerca de 510 kDa, um quarto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 370 kDa e cerca de 410 kDa, um quinto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 180 kDa e cerca de 220 kDa, e um sexto padrão de dextrano com um peso molecular máximo entre cerca de 40 kDa e 55 kDa.

18.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o fucano tem uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 81% em p/p da distribuição é maior do que 200 kDa.

19.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o fucano tem uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 44% em p/p da distribuição é maior do que 500 kDa.

20.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o fucano tem uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 5% em p/p da distribuição é maior do que 1600 kDa.

21.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com as reivindicações 17 a 20, caracterizada pelo fato de que a composição tem um peso molecular médio ponderado maior do que 100 kDa.

22.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o fucano tem um nível de sulfatação entre cerca de 20% em p/p e 60 % em p/p.

23. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o fucano tem um teor total de carboidrato entre 27% em p/p e 80 % em p/p

24.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o fucano tem um teor total de fucose como uma percentagem do teor total de carboidrato de pelo menos cerca de 30 % em p/p.

25.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o fucano tem um teor total de galactose como uma percentagem do teor total de carboidrato abaixo de cerca de 60 % em p/p.

26.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina, quando dissolvida em água, em uma concentração de 50 mg/mL, tem uma viscosidade entre cerca de 4 cP e 50 cP.

27.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina é um sólido branco.

28.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina quando dissolvida em água em uma concentração de 1 mg/mL a 100 mg/mL forma uma solução que é uma dentre clara e incolor.

29.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que o fucano compreende menos do que 5 % em p/p de teor de acetila.

30.Composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que o fucano compreende um teor de acetila de substancialmente 0% em p/p, quando medida por coerência quântica múltipla heteronuclear 1H-13C 2D a 70°C Com supressão de sinal de solvente em um espectrômetro de 600 MHz equipado com sonda fria de 5 mm, na faixa de 10-30 ppm na dimensão de carbono, em 8 incrementos de 256-512 varreduras, cada um.

31.Agente para o tratamento de uma aderência fibrosa em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a composição de fucano com baixo teor de endotoxina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.

32. Composição de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de fucano como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 em um diluente ou tampão medicamente aceitável.

33.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável, como definida na reivindicação 32, em que a dose de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável tem um nível de endotoxina abaixo de 250 EU.

34.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a dose de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável tem um nível de endotoxina abaixo de 50 EU.

35.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a dose de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável tem um nível de endotoxina abaixo de 20 EU.

36.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a dose de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável tem um nível de endotoxina abaixo de 2 EU.

37.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a dose de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável tem um nível de endotoxina abaixo de 0,1 EU.

38.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a dose de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável tem um nível de endotoxina abaixo de 0,01 EU.

39.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 38, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende um fucano com uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 60 % em p/p do fucano tem um peso molecular maior do que 100 kDa, um peso molecular médio ponderado entre 300 kDa e 5.000 kDa, um nível de sulfatação entre 20 % em p/p e 60 % em p/p, um teor de carboidrato entre 30 % em p/p e 80 % em p/p, e um teor de fucose como uma percentagem do teor total de carboidrato dentre 30% em p/p a 100% em p/p.

40.Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 38, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende um fucano com uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 90 % em p/p do fucano têm um peso molecular maior do que 100 kDa, um peso molecular médio ponderado dentre 600 kDa e 1.800 kDa, um nível de sulfatação entre 35% em p/p e 60% em p/p, um teor de carboidrato dentre 40% em p/p e 65% em p/p, e um teor de fucose como uma percentagem do teor de carboidrato total de pelo menos cerca de 80% em p/p.

41. Dosagem de fucano com baixo teor de endotoxina medicamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 38, caracterizada pelo fato de que a composição de fucano com baixo teor de endotoxina compreende um fucano com uma distribuição de peso molecular em que pelo menos 90 % em p/p do fucano têm um peso molecular maior do que 100 kDa, um peso molecular médio ponderado dentre 600 kDa e 1.800 kDa, um nível de sulfatação entre 35% em p/p e 52% em p/p, um teor de carboidrato dentre 40% em p/p e 65% em p/p, e um teor de fucose como uma percentagem do teor de carboidrato total de pelo menos cerca de 80% em p/p.

42.Composição médica, caracterizada pelo fato de que compreende entre cerca de 0,02 mg/mL e 100 mg/mL da composição de fucano com baixo teor de endotoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, em que a composição médica é configurada e composta para tratar uma doença ou condição em um animal.

43.Composição médica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição é uma aderência fibrosa.