KR101635268B1 - 후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물 - Google Patents

후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101635268B1
KR101635268B1 KR1020140093298A KR20140093298A KR101635268B1 KR 101635268 B1 KR101635268 B1 KR 101635268B1 KR 1020140093298 A KR1020140093298 A KR 1020140093298A KR 20140093298 A KR20140093298 A KR 20140093298A KR 101635268 B1 KR101635268 B1 KR 101635268B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fucoidan
composition
cells
hmf
present
Prior art date
Application number
KR1020140093298A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160011952A (ko
Inventor
주홍구
장지영
Original Assignee
제주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제주대학교 산학협력단 filed Critical 제주대학교 산학협력단
Priority to KR1020140093298A priority Critical patent/KR101635268B1/ko
Publication of KR20160011952A publication Critical patent/KR20160011952A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101635268B1 publication Critical patent/KR101635268B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

분자량이 서로 다른 후코이단은 면역세포의 생존율과 면역기능에 차별된 효과를 나타내며, 특히 본 발명에 따른 고분자 후코이단은 비장세포의 생존율, 세포활성 자극, CD19, CD25 또는 CD69 발현, 세포 내 미토콘드리아의 막전위 수준, IFN-γ 및 NO의 생산을 증대함으로써 비장세포에 대한 강력한 면역자극활성을 나타냄을 확인하였으므로 면역증강용 식품, 동물 사료 첨가 조성물로 사용할 수 있다.

Description

후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물 {Composition for immune boosting having viability and function of spleen cells comprising Fucoidane}
본 발명은 후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
후코이단은 갈조류에서 추출한 물질로써 식용이 가능한 황화다당체이다 (비특허문헌 1). 조혈 촉진작용과 면역조절 작용 등 다양한 생리활성을 나타내며 (비특허문헌 2), 특히 B 림프구와 대식세포 등 주요 면역세포에 대한 면역자극 효과가 알려져 있다.
기존의 연구에서 면역반응의 중요한 부분인 항원제시를 담당하는 골수유래 수지상세포에 대한 후코이단의 강한 면역자극 효과가 밝혀진 바 있다 (비특허문헌 3). 또한 후코이단은 내독소혈증 모델에서 마우스의 생존율을 증가시키고, 방사선 조사 시 골수세포를 보호하는 사실을 확인하였다 (비특허문헌 4).
분자량이 서로 다른 후코이단의 효과에 대한 연구는 시작단계에 있다. 최근의 연구에 따르면 고분자와 저분자 후코이단은 콜라겐에 유도된 마우스 관절염 모델에서 서로 다른 효과를 나타낸다 (비특허문헌 5). 또한 동맥의 이형성 및 자가이식에 대한 연구와 관상동맥성 심장병에서의 심장 자가이식에 대한 연구에서는 저분자 후코이단이 neointimal의 증식을 억제한다는 사실을 확인하였다 (비특허문헌 6). 하지만 분자량이 서로 다른 후코이단 들의 면역세포에 대한 효과는 연구가 매우 부족한 실정이다.
국내 공개 제10-2011-0059394호
Li et al., Molecules 13, 2008 Fitton, Marine drugs 9, 2011. Kim and Joo, 2008 Ko and Joo, Immunology Letters 115, 2011 Park et al., Phytotherapy Research 24, 2010 Hlawaty et al., Biochemical Pharmacology 81, 2011
본 발명의 목적은 분자량이 100 내지 160 kDa인 고분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 동물 사료 첨가 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 분자량이 100 내지 160 kDa인 고분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 면역증강용 조성물이란, 면역 활성을 증가시키는 조성물을 의미한다. 상기 면역 활성이란, 체내의 면역 시스템을 작동시킬 수 있는 능력 또는 암 세포의 발생, 성장, 전이 등을 억제할 수 있는 모든 활성을 의미하며, 바람직하게 면역 시스템의 작동이란 비장 내 면역 세포를 증가시켜 외부 항원에 대한 면역력을 증강시키는 행위 및 항체 형성능을 의미한다. 또한 면역활성이란, 암 세포의 발생, 성장, 전이 억제 활성은 암 세포의 생장을 예방하거나 억제하는 모든 행위를 포함하며, 특히 암 세포의 사멸을 촉진하는 행위를 의미한다.
따라서 본 발명의 면역증강용 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과가 있다. 구체적으로, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 기술자에게 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명에 따른 분자량이 100 내지 160 kDa인 고분자 후코이단은 분자량이 10 내지 50 kDa인 저분자 후코이단에 비하여 비장세포의 생존율, 세포활성 자극, CD19, CD25 또는 CD69 발현, 세포 내 미토콘드리아의 막전위 수준, IFN-γ 및 NO의 생산을 증대하는 효과가 현저하였다. 상기 고분자 후코이단의 분자량은 100 내지 160 kDa인 것이 바람직하며 130 kDa인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
후코이단 (Fucoidane)은 갈조류에서 추출한 물질로써 식용이 가능한 황화다당체로, 조혈 촉진작용과 면역조절 작용 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명에 따른 고분자 후코이단은 미역귀 (Undaria pinnatifida sporophylls)로부터 추출되었으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 면역증강용 조성물은 비장세포의 생존율, 세포활성 자극, CD19, CD25 또는 CD69 발현, 세포 내 미토콘드리아의 막전위 수준, IFN-γ 및 NO의 생산을 증대하는 효과를 발휘함을 확인하였으며, 이에 따라 비장세포에 대하여 강력한 면역자극활성이 나타난다.
생체 내에서는 비장세포를 보호하고 분열을 촉진하는 싸이토카인이 분비되나, 싸이토카인이 점차 부족하게 되면 세포자멸사가 진행된다.
미토콘드리아는 세포사에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 rhodamine123으로 세포를 염색하여 관찰하였다. 세포괴사 또는 세포자멸사가 진행되고 있는 세포의 미토콘드리아 막의 전위는 생존세포보다 낮게 유지된다.
면역체계에서 인터페론-감마(IFN-γ)의 중요성은 면역자극 및 면역조절효과에 기인한다. IFN-γ 항원특이면역이 발달한 후 자연살해세포, CD4+ 보조 T세포, CD8+ 세포독성 T세포에서 생성된다.
산화질소 (Nitric oxide, NO)는 대식세포와 수지상세포와 같은 항원제시세포에서 내부에 있는 병원체를 사멸시키는 등 세포성면역과 밀접한 관련이 있다. IFN-γ와 같은 면역자극은 항원제시세포의 NO생성을 증가시킨다.
본 발명에 따른 일실시예에서 고분자 후코이단에 대하여 Endosafe®(Charles River, Charleston, SC, USA)를 이용한 내독소(endotoxin ) 검사를 실시한 결과, 최대농도(50 μg/ml)에서 내독소가 0.1 EU/ml이하로 검출되었다. 상기 내독소란 그람음성균의 표피에 존재하는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 지칭하는 것으로, 후코이단처럼 다당체를 분리할 때 오염물질로 포함될 가능성이 있어 통상적으로 품질관리(quality control) 측면에서 내독소 검사를 실시한다. 이로써 본 발명에 따른 유효성분인 고분자 후코이단은 낮은 내독소에 따라 안전성이 입증되어 식품 또는 의약품에 이용할 수 있다.
본 발명은 고분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함할 수 있다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 유효성분인 고분자 후코이단을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 고분자 후코이단을 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 고분자 후코이단을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 고분자 후코이단의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명의 고분자 후코이단을 유효성분으로서 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명은 고분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 동물 사료첨가 조성물을 제공한다.
상기 동물 사료 첨가 조성물은 20 내지 90%의 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.
본 발명의 동물 사료 첨가 조성물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물을 함유하는 동물 사료 첨가 조성물 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.
상기 동물 사료 첨가 조성물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.
또한, 상기 동물 사료 첨가 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.
상기 동물 사료 첨가 조성물은 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 조성물의 투여 형태는 이들 조성물-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 유효성분인 고분자 후코이단이 동물 사료 첨가 조성물로 포함되는 동물 사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.
상기의 동물 사료 첨가 조성물은 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물(예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물(예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축 (예, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.
본 발명의 동물 사료 첨가 조성물 중 상기 본 발명의 고분자 후코이단의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 사료 중 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 0.1~80 중량%일 수 있다.
본 발명에 따른 고분자 후코이단은 저분자 후코이단에 비하여 비장세포의 생존율, 세포활성 자극, CD19, CD25 또는 CD69 발현, 미토콘드리아의 막전위 수준, IFN-γ 및 NO의 생산을 증가시키는 효과가 있다.
도 1은 후코이단 처리에 따른 비장세포의 세포활성 자극효과를 MTT assay로 분석한 도이다; PC: 양성대조군, LMF: 저분자 후코이단, HMF: 고분자 후코이단.
도 2는 후코이단 처리에 따른 비장세포의 CD19(A), CD25 및 CD69(B)의 발현 증가를 분석한 도이다; NC: 음성대조군, PC: 양성대조군, LMF: 저분자 후코이단, HMF: 고분자 후코이단.
도 3은 후코이단 처리에 따른 비장세포의 염색질을 분석한 도이다; A: 음성대조군, B: 양성대조군, C: 저분자 후코이단, D: 고분자 후코이단.
도 4는 후코이단 처리에 따른 세포 보호 효과를 분석한 도이다; NC: 음성대조군. PC: 양성대조군, LMF: 저분자 후코이단, HMF: 고분자 후코이단.
도 5는 후코이단 처리에 따른 IFN-γ(A) 및 NO(B)의 생산량을 분석한 도이다; NC: 음성대조군. PC: 양성대조군, LMF: 저분자 후코이단, HMF: 고분자 후코이단.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
하기 실시예에 기재된 실험데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈으며 일원분산분석 (one-way ANOVA)과 Dunnett 다중 비교 시험 (Dunnett multiple comparisons test)(InStat, GraphPad Software Inc., La Jolla, 미국)를 이용하여 통계분석을 실시하였다. p 값이 0.05 미만인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였으며, 도면의 *, **, *** 는 대조군에 대한 p 값이 각각 0.05, 0.01, 0.001 미만임을 의미한다.
< 실시예 1> 후코이단 준비
분자량이 서로 다른 후코이단인 LMF (Low Molecule Fucoidan) 와 HMF (High Molecule Fucoidan)는 해림후코이단 (완도, 대한민국)에서 제공받아 사용하였다. 후코이단은 미역귀 (Undaria pinnatifida sporophylls)로부터 추출하였으며 젤 투과 크로마토그래피 방법으로 분리하였다. 제조사에 따르면 LMF과 HMF의 평균 분자량은 각각 30 kDa과 130 kDa이다. LMF와 HMF의 성분은 21 ± 3% 푸코오스 (fucose), 20 ± 5% 갈락토오스 (galactose), 2 ± 2% 만노오스 (mannose), 30 ± 3% 황산염 (sulfate)으로 서로 유사하다. 푸쿠스 베지쿨로수스 (Fucus vesiculosus)에서 추출한 후코이단은 Sigma (세인트루이스, 미국)에서 구매하였으며 양성대조군 (positive control, PC)으로 사용하였다. Sigma 후코이단의 분자량®은 20 내지 200 kDa이다.
모든 후코이단은 Endosafe®(Charles River, Charleston, SC, USA)를 이용한 내독소 검사를 실시하였다. 내독소는 실험에 사용한 후코이단의 최대농도(50 μg/ml)에서 0.1 EU/ml이하로 검출되었다.
< 실시예 2> 비장세포의 생존능 측정
모든 실험은 제주대학교 약리학 실험실에서 유지된 7~12주령의 Balb/c 또는 C57BL/6 마우스(오리엔트바이오, 성남, 대한민국)로부터 유래한 비장세포를 사용하였다. 마우스의 비장세포를 이용한 실험은 이미 확립된 방법에 따라 실시했다 (Joo et al., 2001). 간략히 설명하면, 마우스 비장을 떼어내 물리적으로 분쇄시켜 세포를 얻은 후 저삼투압성 용액을 이용하여 적혈구를 용혈시켰다. T75플라스크에서 30분 동안 배양한 후 40 ㎛ 셀 스트레이너 (cell strainer)에 통과시켜 단일세포를 분리하였다. 배양하는 동안 대식세포, 수지상세포, 일부 B림프구와 같은 부착세포들은 T75 플라스크의 바닥면에 부착하였다. 따라서 단일세포는 주로 림프구와 자연살해세포가 대부분이다. 비장세포를 배양하기 위해 10% 우태아혈청, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM 비필수 아미노산 (non-essential amino acids), 1 mM 소디움 피루빈산 (sodium pyruvate), 100 IU/ml 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin), 50 μM 2-mercaptoethanol 등이 첨가된 RPMI 1640배지를 사용하였다.
비장세포의 생존능력에 대한 후코이단의 효과를 알아보기 위하여, 비장세포를 2 × 106 cells/ml의 농도로 96 웰 플레이트에 넣은 후 분자량이 서로 다른 후코이단(LMF 및 HMF)을 처리하여 3일간 배양하였다. 생존능력을 평가하기 위해 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma)를 0.5 mg/ml농도로 처리한 후 4시간 동안 배양하였다. 이후 생존세포가 생산하는 불용성의 바이올렛 크리스탈(violet crystal)을 용해시키기 위하여 10% SDS 용액을 100 μl/well 농도로 처리하였다. 2시간 후 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)(Multiskan FC, Thermo Scientific, Waltham, 미국)를 사용하여, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 모든 후코이단이 농도의존적으로 비장세포의 활성을 증가시켰다 (도 1). 특히, HMF는 후코이단과 비교하여 보다 높은 수준의 세포활성 자극효과를 나타내었다. 따라서 HMF는 세포자멸사로부터 비장세포를 보호하고 효과적으로 세포분열을 증가시킬 수 있을 것으로 보였다.
< 실시예 3> 유세포분석
유세포분석을 위하여, 비장세포를 6 웰 배양 플레이트에 2 × 106 cells/ml의 농도로 넣은 후 50 μg/ml PC, LMF, HMF 후코이단을 처치한 후 2일간 배양하였다. 세포들은 실험실에 확립된 방식으로 염색하였다 (Kim et al., 2007). 세포들을 비오틴 (biotin)이 표지된 항 CD4, CD8a, CD19, CD25 또는 CD69 항체로 염색한 후, 스트렙타아비딘-피코에리트린 (streptavidin-phycoerythrin, PE)과 PE로 표지된 항 CD69 항체 (BD Biosciences, 산호세, 미국)로 2차 염색하였다. 세포 자멸사와 괴사를 모두 포함하는 세포사를 분석하기 위하여 세포들은 아넥신 V-플루오레세인 이소티오시아네이트/프로피디움 요오드화물 (annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI)) 키트 (Life Technologies, 미국)로 염색하였으며 제조사의 사용법을 따랐다. 아넥신 V는 자멸세포표면의 포스파티딜세린 (phosphatidylserine)와 특이적으로 결합한다 (Martin et al., 1995). 미토콘드리아의 세포막전위를 측정하기 위하여 10 μg/ml 로다민 (rhodamine) 123 (Sigma)을 처리한 후 30분간 실온에서 배양한 후 FACSCaliber 유세포분석기와 CellQuest software (BD biosciences)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, HMF가 비장세포의 CD19 발현을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 2A). 또한, HMF는 림프구의 활성을 증가시키는 면역싸이토카인 인터루킨-2 (IL-2)에 대해 민감하게 반응할 수 있도록 해주는 CD25 및 CD69의 발현을 현저히 증가시켰다 (도 2B). LMF와 PC도 마찬가지로 림프구표면 활성마커의 발현을 증가시켰으나 HMF의 수준에 미치지 못하였다. 따라서 HMF는 B 림프구에 대한 강력한 자극인자로 작용할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 4> 자멸사세포 ( apoptotic cells ) 분석
자멸사세포에 대한 후코이단의 효과를 알아보기 위하여, 2.5 μg/ml농도의 Hoechst 33342 형광색소와 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)를 이용하여 핵을 염색하였다. 그 후 형광현미경 (Olympus Optical, 도쿄, 일본)을 이용하여 분석하였다. 염색된 세포에서 핵의 색 변화를 관찰할 수 있으며, 온전한 형태의 푸른색, 흰색, 핑크색의 핵은 각각 생존한 세포, 자멸사한 세포, 괴사된 세포를 나타낸다.
그 결과, LMF와 HMF는 비장세포의 생존능력에 대해 서로 다른 효과를 나타냈다 (도 3). 대조군에서는 세포자멸사 또는 세포괴사를 의미하는 핑크색의 핵을 포함한 비장세포가 다수 관찰되었다. PC와 LMF의 처리는 핑크색의 핵을 갖는 비장세포의 수를 감소시켰다. 그러나, HMF를 처리한 비장세포에서는 생존세포를 의미하는 푸른색을 띄는 핵을 포함한 세포가 다수 관찰되었다.
또한, 도 4A와 같이 후코이단을 처리한 비장세포에서는 대조군에 비해 괴사된 세포 수가 감소하였으며 (AnnexinV-/PI+), 생존세포의 수가 증가하였다 (Annexin V-/PI-). PC로 처리 된 비장세포에서는 후기 세포자멸사가 증가한 반면, LMF가 처리 된 경우 괴사 세포 수가 증가하였다. 하지만 HMF가 처리 된 비장세포에서는 생존세포의 비율이 매우 높게 관찰되었다. 따라서, 후코이단은 분자량에 따라 서로 다른 세포보호효과를 가지며, 특히 HMF가 가장 강력한 보호 작용을 일으킨다는 것을 알 수 있다. 도 4B에서는 HMF가 처리된 세포에서 미토콘드리아 막전위가 현저히 증가하여 가장 효과적인 세포 보호효과를 나타남을 알 수 있었다.
< 실시예 5> 인터페론 감마 ( IFN -γ) 생산량 측정
인터페론-감마(IFN-γ)는 선천 및 후천면역에 있어 중요한 싸이토카인으로, 그 생산량을 측정하기 위해 세포배양 상층액을 사용하였다. 세포배양 상층액은 부착세포가 포함된 비장세포를 96-well culture plates에 4 × 106 cells/ml농도로 넣고 LMF, HMF을 각각 50 μg/ml 농도로 처리한 후 4일간 배양함으로써 제조하였다. CytoSet™ antibody pairs (Life Technologies)를 이용한 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 통하여 상층액의 싸이토카인 농도를 측정하였다. 측정 방법은 제조사의 실험법에 따라 수행하였다.
그 결과, 도 5A와 같이 서로 다른 분자량의 후코이단 처리는 IFN-γ 생성에 있어 서로 다른 효과를 나타냈다. PC와 HMF는 IFN-γ 수준을 증가시켰으며, 특히 HMF는 PC에 비해 2배가 넘는 효과를 나타냈다. 따라서, 후코이단은 분자량에 따라 비장세포의 필수 면역싸이토카인 생성을 증가시키는데 있어 차별화된 효과를 나타내었다.
< 실시예 6> 산화질소 ( Nitric oxide ) 생산량 측정
세포배양 상층액의 NO 농도를 측정하기 위해 Griess reagent (Sigma)를 사용하였다. 비장세포는 4 × 106 cells/ml의 농도로 배양하였으며, 각각 50 μg/ml농도의 PC, LMF, HMF 을 처리하였다. 4일 동안 배양한 후 상층액을 NO 생산량 측정에 사용하였다. 각 시료는 동량의 그리스시약 (Griess reagent)를 처리한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 표준곡선은 아질산나트륨 (sodium nitrite) 용액을 이용하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 측정하였다.
그 결과, HMF는 NO생성을 높은 수준으로 증가시켰다 (그림 5B). 따라서, HMF는 비장세포에서 세포성면역에서 중요한 역할을 하는 NO의 생성을 촉진하는 강력한 면역자극물질로 작용하는 사실을 확인하였다.
제제예 1. 기능성 음료
표 1에 개시된 조성에 따라 실시예 1의 HMF 후코이단을 함유하는 기능성 음료를 통상적인 방법으로 제조하였다. 하기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
구성성분 함량 (중량%)
HMF 후코이단 0.4 (4g/L)
니코틴산아마이드 5
엽산 5
아스파라긴산 5
구연산 칼슘 1
덱스트린 3
인삼엑기스 3
프락토올리고당 10
구연산 5
폴리소르베이트 1
안식향산 10
사과 5
사과향 3
벌꿀 1
정제수 to 100
제제예 2. 기능성 동물 사료
표 2에 개시된 조성에 따라 실시예 1의 HMF 후코이단을 함유하는 기능성 동물 사료를 통상적인 방법으로 제조하였다. 하기 조성비는 비교적 동물 사료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
구성성분 함량 (중량%)
HMF 후코이단 0.5
옥수수 70.1
대두박 19.75
맥강 2.2
대두유 2.5
당밀 1.4
석회석 0.8
인산칼슘 1.4
소금 0.3
라이신 0.28
비타민+미네랄 프리믹스 0.69
항생제 0.08

Claims (4)

  1. 미역귀 (Undaria pinnatifida sporophylls)로부터 추출한, 분자량이 100 내지 130 kDa인 고분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물로,
    상기 면역증강용 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선을 위한 것으로, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환은 감염성 질환, 염증성 질환, 알러지 질환 또는 만성피로로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역증강용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항의 면역증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 조성물.
  4. 제1항의 면역증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 동물 사료 첨가 조성물.
KR1020140093298A 2014-07-23 2014-07-23 후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물 KR101635268B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140093298A KR101635268B1 (ko) 2014-07-23 2014-07-23 후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140093298A KR101635268B1 (ko) 2014-07-23 2014-07-23 후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160011952A KR20160011952A (ko) 2016-02-02
KR101635268B1 true KR101635268B1 (ko) 2016-06-30

Family

ID=55354460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140093298A KR101635268B1 (ko) 2014-07-23 2014-07-23 후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101635268B1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3829600A4 (en) * 2018-07-27 2022-06-15 Arc Medical Devices, Inc. LOW ENDOTOXIN FUCCO COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS
KR102523207B1 (ko) * 2021-04-30 2023-04-21 대한민국 후코이단을 함유하는 어류의 연쇄구균병 예방용 사료첨가제 및 이의 용도
KR102608023B1 (ko) * 2021-06-08 2023-12-01 (주)해원바이오테크 미역 포자엽 유래 푸코이단을 포함하는 알러지성 기도 염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR102337884B1 (ko) * 2021-07-15 2021-12-10 주식회사 여섯발자국 반려동물용 면역강화 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5377484B2 (ja) 2008-07-02 2013-12-25 帝人株式会社 ポリカーボネート樹脂シートの製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Frontiers in Nutrition 제1권, 제9논문, 1~10쪽, 2014년 7월 10일. (doi: 10.3389/fnut.2014.00009)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160011952A (ko) 2016-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hoseinifar et al. Can dietary jujube (Ziziphus jujuba Mill.) fruit extract alter cutaneous mucosal immunity, immune related genes expression in skin and growth performance of common carp (Cyprinus carpio)?
US10751357B2 (en) Compositions and methods using a polyphenol for musculoskeletal health
JPWO2006093267A1 (ja) 免疫調節作用を有する発酵組成物
KR101635268B1 (ko) 후코이단을 함유하는 비장세포의 생존 및 기능 증진 효과를 가진 면역증강용 조성물
Hossain et al. Dietary supplementation of green tea by-products on growth performance, meat quality, blood parameters and immunity in finishing pigs
US20200390793A1 (en) Compositions and methods using oleuropein or curcumin for muscle quality and/or muscle mass
Kumar et al. Impact of Hygrophila auriculata supplementary diets on the growth, survival, biochemical and haematological parameters in fingerlings of freshwater fish Cirrhinus mrigala (Hamilton, 1822)
KR101669362B1 (ko) 발효 태반 조성물을 유효성분으로 하는 면역 증강 또는 항피로 조성물과 그의 용도
CN111838442A (zh) 一种宠物犬猫溶菌酶功能粮及其制备方法
JP6443804B2 (ja) ナチュラルキラー細胞活性促進剤
KR101832357B1 (ko) 콩나물 유래 면역증강용 추출물 및 그 제조방법
KR101574536B1 (ko) 쿠마린산을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물
US10744100B2 (en) Compositions and methods using a polyphenol for musculoskeletal health
EP3181135A1 (en) Adiponectin secretion regulator
KR20110122961A (ko) 헴프 종자 추출물을 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물
KR20210085627A (ko) 쌍별귀뚜라미 및 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물
JP4873605B2 (ja) 穀類由来の成分を有効成分とする血管新生阻害の作用を有する組成物
KR101949557B1 (ko) 땅두릅 추출물을 포함하는 면역증강용조성물
JP2005255574A (ja) ＩｇＡ産生恒常化剤及びそれを含有するストレス性疾患予防用及び／又は治療用組成物
JP2017002009A (ja) 免疫賦活剤
Elnaggar et al. EFFECT OF DIETARY INCLUSION OF ‌POMERGRANATE PEEL POWDER (Punica grantum) ON GROWTH PERFORMANCE AND SOME PHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF BROILER CHICKS
KR101728386B1 (ko) 유기태화 아연 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법
JP7206623B2 (ja) 糖代謝異常の予防および改善用組成物
RU2385660C2 (ru) Концентрат растительный для функционального напитка &#34;казан-бионан-2&#34;
Erukainure et al. Nutritional evaluations of clerodendrum volubile, a tropical non-conventional vegetable as sole dietary protein source in rats

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190618

Year of fee payment: 4