WO2004047863A2 - In tumoren differentiell exprimierte genprodukte und deren verwendung - Google Patents

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Definitions

  • cancer growth remains a leading cause of death.
  • More recent therapeutic concepts aim to include the patient's own immune system in the overall therapeutic concept by using recombinant tumor vaccines and other specific measures such as antibody therapy.
  • the prerequisite for the success of such a strategy is the detection of tumor-specific or tumor-associated antigens or epitopes by the patient's immune system, the effector functions of which are to be enhanced by intervention.
  • Tumor cells differ biologically from their non-malignant cells of origin. These differences are due to genetic changes acquired during tumor development and also lead to the formation of qualitatively or quantitatively changed molecular structures in the cancer cells.
  • tumor-associated antigens are recognized by the specific immune system of the tumor-bearing host, one speaks of tumor-associated antigens.
  • tumor-associated antigens arises from the fact that the recognition of antigens on neoplastic cells by the immune system leads to the initiation of cytotoxic effector mechanisms and, in the presence of T helper cells, can cause the cancer cells to be eliminated (Pardoll, Nat. Med. 4: 525 ⁇ 31, 1998). Accordingly, it is a central objective of tumor immunology to define these structures on a molecular basis. The molecular nature of these antigens has long remained enigmatic.
  • cytotoxic T lymphocytes CTL
  • circulating autoantibodies Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997) as probes to systematically screen tumor cDNA expression banks for tumor-associated antigens.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • circulating autoantibodies Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997) as probes to systematically screen tumor cDNA expression banks for tumor-associated antigens.
  • cDNA expression banks were selected fresh tumor tissue produced and recombinantly expressed as proteins in suitable systems.
  • Immune effectors isolated from patients, namely CTL clones with a tumor-specific lysis pattern or circulating autoantibodies, were used to clone the respective antigens.
  • a strategy for identifying and providing tumor-associated expressed antigens and the nucleic acids coding therefor was pursued.
  • This strategy is based on the fact that certain genes that are expressed organ-specifically, for example exclusively in the colon, lung or kidney tissue, are ectopic and unauthorized in tumor organs in the corresponding organs and also in other tissues in tumor cells be reactivated.
  • data mining a complete list of all known organ-specific genes is first drawn up and then evaluated by expression analysis using specific RT-PCR for their aberrant activation in different tumors. Datamining is a well-known method for the identification of tumor-associated genes.
  • transcriptomes from normal tissue banks are usually electronically subtracted from tumor tissue banks on the assumption that the remaining genes are tumor- are specific (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27: 4251-60, 1999; Vasmatzis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95: 300-4, 1998; Scheurle et al., Cancer Res 60: 4037-43, 2000).
  • the concept according to the invention which has proven to be much more successful, is based on using data mining for the electronic extraction of all organ-specific genes and then evaluating them for expression in tumors.
  • the invention relates to a strategy for the identification of tissue-specific and differentially expressed genes in tumors.
  • This strategy combines data mining from public sequence banks ("in silico") with subsequent evaluating laboratory-experimental (“wet bench”) investigations.
  • a combined strategy based on two different bioinformatics scripts enabled the identification of new tumor genes according to the invention. So far, these have been classified as purely organ-specific. The knowledge that these genes are activated aberrantly in tumor cells allows them to be assigned a substantially new quality with functional implications. According to the invention, these tumor-associated genes and the gene products encoded thereby were identified and made available independently of an immunogenic effect.
  • the tumor-associated antigens identified according to the invention have an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid which comprises a nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 -8, 41-44, 51-59, 84, 117 and 119, a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid, which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
  • a tumor-associated antigen identified according to the invention has an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 and 119 is selected.
  • a tumor-associated antigen identified according to the invention comprises an amino acid sequence which consists of the group consisting of SEQ ID NO: 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106 , 111-116, 118, 120, 123, 124 and 135-137, a part or derivative thereof.
  • the present invention relates generally to the use of tumor-associated antigens identified according to the invention or of parts or derivatives thereof, of nucleic acids coding therefor or of nucleic acids which are directed against the coding nucleic acids or of antibodies which are directed against the tumor-associated antigens identified according to the invention or parts or derivatives thereof are directed for therapy and diagnosis.
  • This use can relate to individual, but also combinations of several of these antigens, functional fragments, nucleic acids, antibodies etc., in one embodiment also in combination with other tumor-associated genes and antigens for diagnosis, therapy and follow-up.
  • Preferred diseases for therapy and or diagnosis are those in which there is selective expression or abnormal expression of one or more of the tumor-associated antigens identified according to the invention.
  • the invention also relates to nucleic acids and gene products which are expressed in association with tumor cells.
  • the invention relates to gene products, i.e. Nucleic acids and proteins or peptides that result from altered splicing (splice variants) of known genes or from altered translation using alternative open reading frames.
  • the invention relates to nucleic acids which comprise a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the sequences according to SEQ ID NO: 3-5 of the sequence listing.
  • the invention relates to proteins or peptides which comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequences according to SEQ ID NO: 10 and 12-14 of the sequence listing.
  • the splice variants according to the invention can be used according to the invention as targets for the diagnosis and therapy of tumor diseases.
  • the invention relates to the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 10 of the sequence listing, which is encoded by an alternative open reading frame identified according to the invention and which differs from the previously described protein sequence (SEQ ID NO: 9) by 85 additional amino acids at the N-terminus of the protein different
  • SEQ ID NO: 10 amino acid sequence according to SEQ ID NO: 10 of the sequence listing, which is encoded by an alternative open reading frame identified according to the invention and which differs from the previously described protein sequence (SEQ ID NO: 9) by 85 additional amino acids at the N-terminus of the protein different
  • the changed splicing of a gene leads to a changed transcript sequence (splicing variant). If a splice variant is translated in the area of its changed sequence, a modified protein results, which can differ significantly in structure and function from the original one. With tumor-associated splice variants, tumor-associated transcripts and tumor-associated proteins / antigens can arise. These can be used as molecular markers both for the detection of tumor cells and for the therapeutic targeting of tumors.
  • the detection of tumor cells for example in the blood, serum, bone marrow, sputum, bronchial lavage, body secretions and tissue biopsies can be carried out according to the invention, for example after extraction of nucleic acids by PCR amplification with splice variant-specific oligonucleotides.
  • oligonucleotides are pairs of primers, at least one of which binds under stringent conditions to the region of the splice variant which is associated with the tumor.
  • Suitable according to the invention are the oligonucleotides described in the examples for this purpose, in particular oligonucleotides which have or comprise a sequence selected from SEQ ID NO: 34-36, 39, 40 and 107-110 of the sequence listing.
  • all sequence-dependent detection systems are suitable for detection. In addition to PCR, these are, for example, gene chip Z microarray systems, Northern blot, RNAse protection assays (RDA) and others. All detection systems have in common that the detection is based on a specific hybridization with at least one splice variant-specific nucleic acid sequence. According to the invention, however, tumor cells can also be detected by antibodies which recognize a specific epitope coded by the splice variant.
  • Peptides for immunization that are specific for this splice variant can be used for the production of the antibodies.
  • the invention relates in particular to peptides which have or comprise a sequence selected from SEQ ID NO: 17-19, 111-115, 120 and 137 of the sequence listing and specific antibodies directed against it.
  • the amino acids which have clear epitope differences from the variant (s) of the gene product which are (are) preferably formed in healthy cells are particularly suitable for immunization.
  • the detection of the tumor cells with antibodies can be carried out on a sample isolated from the patient or as imaging with intravenously applied antibodies.
  • splice variants which have new or modified epitopes represent attractive targets for immunotherapy.
  • the epitopes according to the invention can be used for targeting therapeutically effective monoclonal antibodies or T-lymphocytes.
  • antibodies or T-lymphocytes are adopted adoptively that recognize splicing variant-specific epitopes.
  • the generation of antibodies can also take place using standard technologies (immunization of animals, panning strategies for isolating recombinant antibodies) using polypeptides which contain these epitopes.
  • nucleic acids that code for oligo- or polypeptides that contain these epitopes can be used for the immunization.
  • proteins are also described which differ in the type and amount of their secondary modifications in normal and tumor tissue (eg Durand & Seta, 2000; Clin. Chem. 46: 795-805; Hakomori, 1996; Cancer Res. 56: 5309- 18).
  • Protein modifications can be analyzed in a Western blot. Especially glycosylations, which are usually several kDa in size, lead to a larger total mass of the target protein, which can be separated in the SDS-PAGE.
  • protein lysates are incubated with O- or N-glycosylases prior to denaturation by SDS (according to the manufacturer, e.g. PNgase, Endoglycosidase F, Endoglycosidase H, Röche Diagnostics). A Western blot is then carried out.
  • a specific glycosylation can be detected in the target protein and the tumor specificity of a modification can also be analyzed in this way.
  • protein regions that are differently glycosylated in tumor cells and healthy cells are so far been described for a few cell surface proteins (eg Mucl).
  • differential glycosylation in tumors could be detected for claudin-18.
  • Gastrointestinal carcinomas, pancreatic carcinomas, esophageal tumors, prostate tumors as well as lung tumors have a less glycosylated form of Claudin-18.
  • Glycosylation in healthy tissues masks Claudin-18 protein epitopes that are exposed on tumor cells due to lack of glycosylation.
  • ligands and antibodies which bind to these domains can be selected according to the invention. According to the invention, such ligands and antibodies do not bind to the Claudin-18 on healthy cells, since here the epitopes are covered by the glycosylation.
  • the differential glycosylation can thus be used to differentiate between normal and tumor cells with diagnostic and therapeutic intentions.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an agent which recognizes the tumor-associated antigen identified according to the invention and is preferably selective for cells which have expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the agent can induce cell death, reduce cell growth, damage the cell membrane or secrete cytokines and preferably has a tumor-inhibiting activity.
  • the agent is an antisense nucleic acid that selectively hybridizes with the nucleic acid that encodes the tumor-associated antigen.
  • the agent is an antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen, in particular a complement-activated or toxin-conjugated antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen.
  • the agent comprises several agents, each of which selectively recognizes different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the detection does not have to be directly inhibited by Activity or expression of the antigen are associated.
  • the antigen which is selectively limited to tumors, preferably serves as a marker for recruiting effector mechanisms at this specific location.
  • the agent is a cytotoxic T lymphocyte which recognizes the antigen on an HLA molecule and which lyses the cells labeled in this way.
  • the agent is an antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen and thus recruits natural or artificial effector mechanisms for this cell.
  • the agent is a T helper lymphocyte that enhances effector functions of other cells that specifically recognize this antigen.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an agent which inhibits the expression or activity of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the agent is an antisense nucleic acid which selectively hybridizes with the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen.
  • the agent is an antibody that selectively binds to the tumor-associated antigen.
  • the agent comprises several agents, each of which selectively inhibit the expression or activity of different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which comprises an agent which, when administered, selectively increases the amount of complexes between an HLA molecule and a peptide epitope from the tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the agent comprises one or more components selected from the group consisting of (i) the tumor-associated antigen or a part thereof, (ii) a nucleic acid which is for the tumor-associated antigen or a part thereof encodes, (iii) a host cell expressing the tumor associated antigen or a portion thereof, and (iv) isolated complexes between peptide epitopes from the tumor associated antigen and an MHC molecule.
  • the agent comprises several agents, each of which selectively increases the amount of complexes between MHC molecules and peptide epitopes of different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which comprises one or more constituents which are selected from the group consisting of (i) a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof, (ii) a nucleic acid which is suitable for an according to the invention encoded identified tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) an antibody which binds to a tumor-associated antigen or a part thereof identified according to the invention, (iv) an antisense nucleic acid which is specific with a nucleic acid which is suitable for an according to the invention encoded, hybridized, identified, tumor-associated antigen, (v) a host cell expressing a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof, and (vi) isolated complexes between a tumor-associated antigen or a part thereof identified according to the invention and an HLA molecule ,
  • a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof can be present in the pharmaceutical composition in an expression vector and can be functionally linked to a promoter.
  • a host cell contained in a pharmaceutical composition according to the invention can secrete the tumor-associated antigen or the part thereof, or can express it on the surface or can additionally express an HLA molecule which binds to the tumor-associated antigen or the part thereof.
  • the host cell expresses the HLA molecule endogenously.
  • the host cell expresses the HLA molecule and / or the tumor-associated antigen or part thereof recombinantly.
  • the host cell is non-proliferative.
  • the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
  • An antibody contained in a pharmaceutical composition according to the invention can be a monoclonal antibody.
  • the antibody is a chimeric or humanized antibody, a fragment of a natural antibody, or a synthetic antibody, all of which can be produced by combinatorial techniques.
  • the antibody can be coupled to a therapeutically or diagnostically useful agent or substance.
  • An antisense nucleic acid contained in a pharmaceutical composition according to the invention can comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 or 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • a tumor-associated antigen provided by a pharmaceutical composition according to the invention either directly or by the expression of a nucleic acid or a part thereof binds to MHC molecules on the surface of cells, the binding preferably causing a cytolytic reaction and / or a cytokine release induced.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier and / or an adjuvant.
  • the adjuvant can be selected from saponin, GM-CSF, CpG nucleotides, RNA, a cytokine or a chemokine.
  • a pharmaceutical composition according to the invention is preferably used for the treatment of a disease which is characterized by the selective expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen. In a preferred embodiment, the disease is cancer.
  • the invention further relates to methods for the treatment or diagnosis of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of one or more tumor-associated antigens.
  • the treatment comprises the administration of a pharmaceutical composition according to the invention.
  • the invention relates to a method for diagnosing a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the method comprises the detection (i) of a nucleic acid coding for the tumor-associated antigen or a part thereof and / or (ii) the detection of the tumor-associated antigen or a part thereof, and / or (iii) the detection an antibody against the tumor-associated antigen or a part thereof and / or (iv) the detection of cytotoxic or helper T lymphocytes which are specific for the tumor-associated antigen or a part thereof in a biological sample isolated from a patient ,
  • detection (i) involves contacting the biological sample with an agent that is specific to the Nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen or the part thereof, to the tumor-associated antigen or the part thereof, to the antibody or to cytotoxic or helper T-lymphocytes which are for the tumor-associated antigen or parts thereof specific, binds and
  • the disease is characterized by the expression or abnormal expression of several different tumor-associated antigens
  • the detection includes a detection of several nucleic acids coding for the several different tumor-associated antigens, or parts thereof, the detection of the several different Tumor-associated antigens or portions thereof, the detection of multiple antibodies that bind to the multiple different tumor-associated antigens or portions thereof, or the detection of multiple cytotoxic or helper T lymphocytes specific for the multiple different tumor-associated antigens are.
  • the isolated biological sample from the patient is compared with a comparable normal biological sample.
  • the invention relates to a method for determining the regression, the course or the outbreak of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising the monitoring of a sample from a patient who the Disease or is suspected of developing the disease with respect to one or more parameters selected from the group consisting of (i) the amount of nucleic acid encoding the tumor associated antigen or a portion thereof , (ii) the amount of the tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) the amount of antibodies that bind to the tumor-associated antigen or a part thereof, and (iv) the amount of cytolytic T cells or helpers -T cells that are specific for a complex between the tumor-associated antigen or a part thereof and an MHC molecule.
  • the method preferably comprises determining the parameter or parameters at a first point in time in a first sample and at a second point in time in a further sample, the course of the disease being determined by comparing the two samples.
  • the disease is characterized by the expression or abnormal expression of several different tumor-associated antigens and the monitoring comprises monitoring (i) the amount of several nucleic acids, which code for the several different tumor-associated antigens, or of parts thereof and / or (ii) the amount of the several different tumor-associated antigens or of parts thereof and / or (iii) the amount of several antibodies which are attached to the several different Bind tumor-associated antigens or to parts thereof, and / or (iv) the amount of several cytolytic T cells or helper T cells specific for complexes between the several different tumor-associated antigens or parts thereof and MHC molecules are.
  • Detection of a nucleic acid or part thereof or monitoring the amount of a nucleic acid or part thereof can be carried out according to the invention with a polynucleotide probe which hybridizes specifically with the nucleic acid or part thereof, or by selective amplification of the nucleic acid or part thereof respectively.
  • the polynucleotide probe comprises a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 or 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid.
  • the tumor-associated antigen to be detected or the part thereof is present intracellularly or on the cell surface. Detection of a tumor-associated antigen or a part thereof or monitoring the amount of a tumor-associated antigen or a part thereof can be carried out according to the invention with an antibody which specifically binds to the tumor-associated antigen or the part thereof.
  • the tumor-associated antigen to be detected or the part thereof is present in a complex with an MHC molecule, in particular an HLA molecule.
  • Detection of an antibody or monitoring the amount of antibodies can be carried out according to the invention with a protein or peptide that binds specifically to the antibody.
  • Detection of cytolytic T cells or helper T cells or monitoring the amount of cytolytic T cells or helper T cells which are specific for complexes between an antigen or a part thereof and MHC molecules can be carried out according to the invention with a cell presenting the complex between the antigen or part thereof and an MHC molecule.
  • the polynucleotide probe used for detection or monitoring, the antibody, the protein or peptide or the cell are preferably marked in a detectable manner.
  • the detectable marker is a radioactive marker or an enzyme marker.
  • T-lymphocytes can also be detected by detecting their proliferation, their cytokine production and their cytotoxic activity, which is triggered by the specific stimulation with the complex of MHC and tumor-associated antigen or parts thereof.
  • the detection of T lymphocytes can also be carried out by a recombinant MHC molecule or also a complex of several MHC molecules which are loaded with the respective immunogenic fragment from one or more of the tumor-associated antigens and by contacting the specific T cell Receptor, which allows specific T lymphocytes to be identified.
  • the invention relates to a method for the treatment, diagnosis or monitoring of a disease which is characterized by. distinguishes the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising the administration of an antibody which binds to the tumor-associated antigen or a part thereof and is coupled to a therapeutic or diagnostic agent or substance.
  • the antibody can be a monoclonal antibody.
  • the antibody is a chimeric or humanized antibody or a fragment of a natural antibody.
  • the invention also relates to a method for treating a patient with a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising (i) the removal of a sample with immunoreactive cells from the patient, (ii) the Contacting the sample with a host cell expressing the tumor-associated antigen or a part thereof under conditions which favor the production of cytolytic T cells against the tumor-associated antigen or a part thereof, and (iii) introducing the cytolytic T Cells in the patient in an amount suitable for lysing cells expressing the tumor associated antigen or a part thereof.
  • the invention also relates to the cloning of the T cell receptor of cytolytic T cells against the tumor-associated Antigen. This can be transferred to other T cells, which thus obtain the desired specificity and can be introduced into the patient as in (iii).
  • the host cell expresses an HLA molecule endogenously. In a further embodiment, the host cell expresses an HLA molecule and / or the tumor-associated antigen or part thereof recombinantly.
  • the host cell is preferably non-proliferative.
  • the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
  • the invention relates to a method for the treatment of a patient with a disease, which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen, comprising (i) the identification of a nucleic acid coding for a tumor-associated antigen identified according to the invention, which of Cells that are associated with the disease are expressed, (ii) the transfection of a host cell with the nucleic acid or a part thereof, (iii) the cultivation of the transfected host cell for expression of the nucleic acid (this is not mandatory when a high transfection rate is reached) , and (iv) introducing the host cells or an extract thereof into the patient in an amount suitable to increase the immune response against the patient's cells associated with the disease.
  • the method may further include identifying an MHC molecule that presents the tumor-associated antigen or a portion thereof, the host cell expressing the identified MHC molecule and presenting the tumor-associated antigen or a portion thereof.
  • the immune response can include a B cell response or a T cell response.
  • a T cell response may include the production of cytolytic T cells and / or helper T cells that are specific for the host cells that present the tumor-associated antigen or a portion thereof, or specific for the patient's cells which express the tumor-associated antigen or a part thereof.
  • the invention also relates to a method for the treatment of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising (i) the identification of cells from the patient which express abnormal amounts of the tumor-associated antigen, (ii ) isolating a sample of the cells, (iii) culturing the cells and (iv) introducing the Cells in the patient in an amount appropriate to elicit an immune response against the cells.
  • the host cells used according to the invention are preferably non-proliferative or are made non-proliferative.
  • a disease that is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen is cancer in particular.
  • the present invention further relates to a nucleic acid which is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid which comprises a nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3-5, a part or a derivative thereof , (b) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid that is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b), and (d) a nucleic acid, which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
  • the invention further relates to a nucleic acid which codes for a protein or polypeptide which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10 and 12-14, a part or derivative thereof.
  • the invention relates to promoter sequences of nucleic acids according to the invention. These can be functionally linked to another gene, preferably in an expression vector, and thus ensure the selective expression of this gene in corresponding cells.
  • the invention relates to a recombinant nucleic acid molecule, in particular a DNA or RNA molecule, which comprises a nucleic acid according to the invention.
  • the invention also relates to host cells which contain a nucleic acid according to the invention or a recombinant nucleic acid molecule which comprises a nucleic acid according to the invention.
  • the host cell may further comprise a nucleic acid encoding an HLA molecule.
  • the host cell expresses the HLA molecule endogenously.
  • the host cell expresses the HLA molecule and / or the nucleic acid according to the invention or a part thereof recombinantly.
  • the Host cell non-proliferative.
  • the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
  • the invention relates to oligonucleotides that hybridize with a nucleic acid identified according to the invention and can be used as genetic probes or as "antisense" molecules.
  • Nucleic acid molecules in the form of oligonucleotide primers or competent samples which hybridize with a nucleic acid or parts thereof identified according to the invention can be used to find nucleic acids which are homologous to the nucleic acid identified according to the invention.
  • PCR amplification, Southern and Northern hybridization can be used to find homologous nucleic acids.
  • the hybridization can take place under low, better under medium and best under high-stringent conditions.
  • the term “stringent conditions” relates to conditions which allow specific hybridization between polynucleotides.
  • the invention relates to a protein, polypeptide or peptide that is encoded by a nucleic acid that is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid that comprises a nucleic acid sequence that consists of the group consisting of SEQ ID NO : 3-5, a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid which with respect to the nucleic acid under (a) or ( b) is degenerate, and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
  • the invention relates to a protein or polypeptide or peptide which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10 and 12-14, a part or derivative thereof.
  • the invention relates to an immunogenic fragment of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the fragment preferably binds to a human HLA receptor or human antibody.
  • a fragment according to the invention preferably comprises a sequence of at least 6, in particular at least 8, at least 10, at least 12, at least 15, at least 20, at least 30 or at least 50, amino acids.
  • the invention particularly relates to a peptide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124 and 135-137, a part or derivative thereof.
  • the invention relates to an agent that binds to a tumor-associated antigen identified according to the invention or to a part thereof.
  • the agent is an antibody.
  • the antibody is a chimeric, a humanized or combinatorial antibody or a fragment of an antibody.
  • the invention further relates to an antibody which selectively binds to a complex of (i) a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof and (ii) an MHC molecule to which the tumor-associated antigen or the part identified according to the invention binds thereof, the antibody not binding to (i) or (ii) alone.
  • An antibody according to the invention can be a monoclonal antibody.
  • the antibody is a chimeric or humanized antibody or a fragment of a natural antibody.
  • the invention relates to such an agent, in particular an antibody, which specifically binds to a peptide which has a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124 and 135-137, a part or derivative thereof.
  • the invention further relates to a conjugate between an agent according to the invention which binds to a tumor-associated antigen identified according to the invention or to a part thereof, or an antibody according to the invention and a therapeutic or diagnostic agent or substance.
  • the therapeutic or diagnostic agent is a toxin.
  • the invention relates to a kit for detecting the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising means for detecting (i) the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen, or a part thereof, (ii ) the tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) of antibodies which bind to the tumor-associated antigen or a part thereof, and / or (iv) of T cells which are responsible for a complex between the tumor-associated antigen or part of it and an MHC molecule.
  • the means for detecting the nucleic acid or part thereof are nucleic acid molecules for the selective amplification of the nucleic acid, which in particular comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 or 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid.
  • genes are described which are selectively expressed or aberrantly expressed in tumor cells and which represent tumor-associated antigens.
  • these genes and / or their gene products and / or their derivatives and / or parts are preferred target structures for therapeutic approaches.
  • the therapeutic approaches can aim to inhibit the activity of the selectively expressed tumor-associated gene product. This makes sense if the aberrant or selective expression is functionally of tumor-physiological importance and its suppression is accompanied by selective damage to the corresponding cells.
  • Other therapeutic concepts consider tumor-associated antigens as markers that selectively recruit effector mechanisms with cell-damaging potential to tumor cells. The function of the target molecule itself and its role in tumor development are completely irrelevant.
  • “derivative” of a nucleic acid means that single or multiple nucleotide substitutions, deletions and / or additions are present in the nucleic acid. Furthermore, the term “derivative” also includes chemical derivatization of a nucleic acid on a nucleotide base, on sugar or on phosphate. The term “derivative” also includes nucleic acids that contain nucleotides and nucleotide analogues that do not occur in nature.
  • a nucleic acid is preferably deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA).
  • nucleic acids include genomic DNA, cDNA, rnRNA, recombinantly produced and chemically synthesized molecules.
  • a nucleic acid can be present as a single-stranded or double-stranded and linear or covalently circular molecule.
  • the nucleic acids described according to the invention are preferably isolated.
  • isolated nucleic acid means that the nucleic acid (i) was amplified in vitro, for example by polymerase chain reaction (PCR), (ii) was produced recombinantly by cloning, (iii) was purified, for example by cleavage and gel electrophoretic separation, or (iv) synthesized, for example by chemical synthesis.
  • An isolated nucleic acid is a nucleic acid that is available for manipulation by recombinant DNA techniques.
  • a nucleic acid is "complementary" to another nucleic acid if the two sequences hybridize with one another and can form a stable duplex, the
  • Hybridization is preferably carried out under conditions that allow specific hybridization between polynucleotides (stringent conditions). Stringent conditions are described, for example, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Ed., 2.
  • New York described and concern, for example, hybridization at 65 ° C in
  • Hybridization buffer (3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02%
  • Bovine serum albumin 2.5mM NaH 2 PO 4 (pH7), 0.5% SDS, 2mM EDTA).
  • SSC 0.15M
  • the membrane to which the DNA has been transferred is, for example, in 2 ⁇ SSC at room temperature and then in
  • Complementary nucleic acids according to the invention have at least 40%, in particular at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98% or at least 99% identity of the nucleotides.
  • nucleic acids coding for tumor-associated antigens can be present alone or in combination with other nucleic acids, in particular heterologous nucleic acids.
  • a nucleic acid is functionally present in connection with expression control sequences or regulatory sequences, which can be homologous or heterologous in relation to the nucleic acid.
  • a coding sequence and a regulatory sequence are then "functionally" linked to one another if they are covalently linked to one another in such a way that the expression or transcription of the coding sequence is under the control or under the influence of the regulatory sequence. If the coding .
  • a sequence is to be translated into a functional protein, induction of the regulatory sequence leads to a transcription of the coding sequence in the case of a functional connection of a regulatory sequence to the coding sequence, without a reading frame shift in the coding sequence or to an inability of the coding sequence comes to be translated into the desired protein or peptide.
  • control sequence or “regulatory sequence” encompasses promoters, enhancers and other control elements which control the expression of a gene.
  • regulatory sequence encompasses promoters, enhancers and other control elements which control the expression of a gene.
  • Sequences can vary depending on species or cell type, but generally includes 5'-non-transcribed and 5'-non-translated sequences that are involved in the initiation of transcription or translation such as TATA box, capping sequence, CAAT-
  • 5'-non-transcribed regulatory sequences include a promoter region that includes a promoter sequence for transcriptional control of the functionally linked gene.
  • Regulatory sequences can also be enhancer
  • Sequences or upstream activator sequences include.
  • the tumor-associated antigens shown here can be combined with any expression control sequences and promoters.
  • the promoters of the tumor-associated gene products shown here can be combined with any other genes. This allows the selective activity of these promoters to be used.
  • a nucleic acid can be present in connection with another nucleic acid which codes for a polypeptide which controls secretion of the protein or polypeptide encoded by the nucleic acid from a host cell.
  • a nucleic acid can also be present in conjunction with another nucleic acid which codes for a polypeptide which anchors the coded protein or polypeptide on the cell membrane of the host cell or its compartmentalization in certain organelles of this cell.
  • a connection can be made with a nucleic acid which is a reporter gene or any "tag".
  • a recombinant DNA molecule according to the invention is a vector, optionally with a promoter, which controls the expression of a nucleic acid, for example a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen according to the invention.
  • a vector is used in its most general meaning and encompasses any intermediate vehicles for a nucleic acid which, for example, make it possible to introduce the nucleic acid into prokaryotic and or into eukaryotic cells and, if appropriate, to integrate them into a genome.
  • Such vectors are preferably replicated and / or expressed in the cell.
  • An intermediate vehicle can be adapted, for example, for use in electroporation, in microprojectile bombardment, in liposomal administration, in transfer with the aid of agrobacteria or in the insertion via DNA or RNA viruses.
  • Vectors include plasmids, phagemids, or virus genomes.
  • nucleic acids which code for a tumor-associated antigen identified according to the invention can be used for a transfection of host cells.
  • Nucleic acids mean both recombinant DNA and RNA.
  • Recombinant RNA can be produced by in vitro transcription from a DNA template. It can also be modified before application by stabilizing sequences, capping and poly-adenylation.
  • the term “host cell” relates to any cell that has an exogenous one
  • Nucleic acid is transformable or transfectable.
  • the term “host cells” encompasses prokaryotic (for example E. coli) or eukaryotic (for example dendritic cells, B cells, CHO cells, COS cells, K562 cells, yeast cells and insect cells). Mammalian cells such as human cells are particularly preferred , Mouse, hamster, pig, goat, primates.
  • the cells can be derived from a variety of tissue types and include primary cells and cell lines. Specific examples include keratinocytes, peripheral blood leukocytes, bone marrow stem cells and embryonic stem cells.
  • the host cell is one Antigen-presenting cell, especially a dendritic cell, a monocyte or a macrophage
  • a nucleic acid can be present in the host cell in one or more copies and is in one
  • Embodiment expressed in the host cell Embodiment expressed in the host cell.
  • RNA or of RNA and protein are preferred expression systems in mammalian cells. It also includes partial expression of nucleic acids. Furthermore, the expression can be transient or stable.
  • Preferred expression systems in mammalian cells include pcDNA3.1 and pRc / CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) which contain a selectable marker such as a gene which confers resistance to G418 (and thus enables selection of stably transfected cell lines) and the enhancer promoter - Sequences of cytomegalovirus (CMV).
  • CMV cytomegalovirus
  • an expression vector can also comprise a nucleic acid sequence which codes for the HLA molecule.
  • the nucleic acid sequence encoding the HLA molecule can be on the same expression vector as the nucleic acid encoding the tumor-associated antigen or part thereof, or both nucleic acids can be on different expression vectors. In the latter case, the two expression vectors can be cotransfected into one cell. If a host cell does not express the tumor-associated antigen or part of it or the HLA molecule, both nucleic acids encoding it are transfected into the cell either on the same expression vector or on different expression vectors. If the cell already expresses the HLA molecule, only the nucleic acid sequence that codes for the tumor-associated antigen or part thereof can be transfected into the cell.
  • kits for the amplification of a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen include, for example, a pair of amplification primers that hybridize to the nucleic acid encoding the tumor associated antigen.
  • the primers preferably comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 or 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid and are non-overlapping in order to avoid the formation of primer dimers.
  • One of the primers will hybridize to a strand of the nucleic acid encoding the tumor associated antigen and the other primer will hybridize to the complementary strand in an arrangement that allows amplification of the nucleic acid encoding the tumor associated antigen ,
  • Antisense molecules or “antisense” nucleic acids can be used for regulation, in particular the reduction of the expression of a nucleic acid.
  • the term “antisense molecule” or “antisense nucleic acid” relates to a Oligonucleotide which is an oligoribonucleotide, oligodeoxyribonucleotide, modified oligoribonucleotide or modified oligodeoxyribonucleotide and which, under physiological conditions, hybridizes to DNA which comprises a specific gene or RNA of this gene, thereby inhibiting the transcription of this gene and / or the translation of this mRNA.
  • an “antisense molecule” also comprises a construct which contains a nucleic acid or a part thereof in a reverse orientation with respect to its natural promoter.
  • An antisense transcript of a nucleic acid or a portion thereof can duplex with the naturally occurring mRNA that specifies the enzyme, thus preventing accumulation or translation of the mRNA into the active enzyme.
  • Another option is to use ribozymes to inactivate a nucleic acid.
  • Preferred antisense oligonucleotides according to the invention have a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 or 20-30 contiguous nucleotides from the target nucleic acid and are preferably completely complementary to the target nucleic acid or a part thereof.
  • the antisense oligonucleotide hybridizes to an N-terminal or 5 'upstream site such as a translation initiation, transcription initiation or promoter site. In further embodiments, the antisense oligonucleotide hybridizes with a 3 'non-translated region or mRNA splicing site.
  • an oligonucleotide according to the invention consists of ribonucleotides, deoxyribonucleotides or a combination thereof.
  • the 5 'end of one nucleotide and the 3' end of another nucleotide are linked to one another by a phosphodiester bond.
  • These oligonucleotides can be synthesized in a conventional manner or produced recombinantly.
  • an oligonucleotide according to the invention is a "modified" oligonucleotide.
  • the oligonucleotide can be modified in various ways in order to increase its stability or therapeutic effectiveness, for example, without impairing its ability to bind to its target.
  • modified oligonucleotide means an oligonucleotide in which (i) at least two of its nucleotides are linked to one another by a synthetic internucleoside bond (ie an internucleoside bond which is not a phosphodiester bond) and / or (ii) a chemical group is covalently linked to the oligonucleotide that does not normally occur with nucleic acids.
  • Preferred synthetic internucleoside bonds are phosphorothioates, alkylphosphonates, phosphorodithioates, phosphate esters, alkylphosphonothioates, phosphoramidates, carbamates, carbonates, phosphate triesters, acetamidates, carboxymethyl esters and peptides.
  • modified oligonucleotide also includes oligonucleotides with a covalently modified base and / or sugar.
  • Modified oligonucleotides include, for example, oligonucleotides with sugar residues that are covalently bound to low molecular weight organic groups that are not a hydroxyl group at the 3 'position and not a phosphate group at the 5' position.
  • Modified oligonucleotides can include, for example, a 2'-O-alkylated ribose residue or another sugar instead of ribose such as arabinose.
  • isolated protein or isolated polypeptide
  • isolated polypeptide mean that the protein or polypeptide is separated from its natural environment.
  • An isolated protein or polypeptide can be in a substantially purified state.
  • substantially purified means that the protein or polypeptide is essentially free of other substances with which it is present in nature or in vivo.
  • proteins and polypeptides are used, for example, for the production of antibodies and can be used in an immunological or diagnostic assay or as therapeutic agents.
  • Proteins and polypeptides described according to the invention can be isolated from biological samples such as tissue or cell homogen and can also be recombinantly in one
  • “Derivatives” of a protein or polypeptide or an amino acid sequence in the sense of this invention include amino acid insertion variants, amino acid deletion variants and / or amino acid substitution variants.
  • Amino acid insertion variants include amino- and / or carboxy-terminal fusions, as well as insertions of single or several amino acids in a certain amino acid sequence.
  • amino acid sequence variants with an insertion one or several amino acid residues are introduced into a predetermined position in an amino acid sequence, although a random insertion with suitable screening of the resulting product is also possible.
  • Amino acid deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence.
  • Amino acid substitution variants are characterized in that at least one residue in the sequence is removed and another residue is inserted in its place. The modifications are preferably at positions in the amino acid sequence that are not conserved between homologous proteins or polypeptides.
  • amino acids are replaced by others with similar properties, such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, volume of the side chain and the like (conservative substitution).
  • Conservative substitutions relate, for example, to the replacement of an amino acid by another amino acid, listed below in the same group as the substituted amino acid:
  • amino acid variants described above can easily be obtained using known peptide synthesis techniques such as e.g. by “Solid Phase Synthesis” (Merrifield, 1964) and similar methods or by recombinant DNA manipulation.
  • Techniques for introducing substitution mutations at predetermined locations in DNA that have a known or partially known sequence are well known and include, for example, M13 -Mutagenesis: The manipulation of DNA sequences for the production of proteins with
  • “derivatives” of proteins, polypeptides or peptides also include single or multiple substitutions, deletions and / or additions of any molecules which are associated with the enzyme, such as carbohydrates, lipids and / or proteins, polypeptides or peptides.
  • the term also extends "Derivative” also applies to all functional chemical equivalents of proteins, polypeptides or peptides.
  • a part or fragment of a tumor-associated antigen has a functional property of the polypeptide from which it is derived. Such functional properties include the interaction with antibodies, the interaction with other polypeptides or proteins, the selective binding of nucleic acids and an enzymatic activity. An important property is the ability to complex with HLA and possibly to generate an immune response. This immune response can be based on stimulation of cytotoxic or helper T cells.
  • a part or fragment of a tumor-associated antigen according to the invention preferably comprises a sequence of at least 6, in particular at least 8, at least 10, at least 12, at least 15, at least 20, at least 30 or at least 50, consecutive amino acids from the tumor-associated antigen.
  • a part or a fragment of a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen relates to the part of the nucleic acid which codes at least for the tumor-associated antigen and / or codes for a part or a fragment of the tumor-associated antigen as defined above.
  • the isolation and identification of genes coding for tumor-associated antigens also enables the diagnosis of a disease which is characterized by the expression of one or more tumor-associated antigens.
  • These methods include determining one or more nucleic acids encoding a tumor associated antigen and / or determining the encoded tumor associated antigens and / or peptides derived therefrom.
  • the nucleic acid can be determined in a conventional manner, including by polymerase chain reaction or hybridization with a labeled probe.
  • a determination of tumor-associated antigens or peptides derived therefrom can be carried out by screening patient antisera with regard to recognition of the antigen and / or the peptides. It can also be done through a screening of the patient's T cells for specificity for the corresponding tumor-associated antigen.
  • the present invention also enables isolation of proteins that bind to tumor-associated antigens described herein, including antibodies and cellular binding partners of the tumor-associated antigens.
  • a dominant negative polypeptide is an inactive variant of a protein that, by interacting with the cellular machinery, displaces an active protein from its interaction with the cellular machinery or competes with the active protein, thereby reducing the activity of the active protein.
  • a dominant negative receptor that binds a ligand but does not produce a signal in response to ligand binding can reduce the biological activity of the ligand.
  • a dominant negative catalytically inactive kinase that normally interacts with target proteins but does not phosphorylate the target proteins can decrease the phosphorylation of the target proteins in response to a cellular signal.
  • a dominant negative transcription factor that binds to a promoter site in the control region of a gene but does not increase the transcription of the gene can have the effect of a normal one
  • the result of the expression of a dominant negative polypeptide in a cell is a decrease in the function of active proteins.
  • the person skilled in the art can produce dominant negative variants of a protein, for example by conventional mutagenesis methods and evaluating the dominant negative effect of the variant polypeptide.
  • the invention also includes substances such as polypeptides that bind to tumor-associated antigens.
  • binding agents can be used, for example, in screening assays for the detection of tumor-associated antigens and complexes of tumor-associated antigens with their binding partners and for purification of the tumor-associated antigens and of complexes thereof with their binding partners.
  • substances can also for inhibiting the activity of tumor-associated antigens, for example by binding to such antigens.
  • binding agents such as e.g. Antibodies or antibody fragments that have the ability to selectively bind to tumor-associated antigens.
  • Antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies that are made in a conventional manner.
  • Such antibodies can recognize proteins in their native and / or denatured state (Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem et al, Eur. J. Biochem. 208: 1-8, 1992; Spiller et al., J Immunol. Methods 224: 51-60, 1999).
  • Antisera containing specific antibodies that bind specifically to the target protein can be prepared using various standard methods; see. for example
  • Monoclonal antibodies are traditionally produced using hybridoma technology (technical details: see “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach” by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; “Antibodies: A Laboratory Manual” by Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142, “Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447). It is known that only a small part of an antibody molecule, the paratope, is involved in binding the antibody to its epitope (see Clark, WR (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I.
  • the pFc and Fc regions are, for example, effectors of the complement cascade, but are not involved in antigen binding.
  • An antibody from which the pFc 'region has been cleaved enzymatically or which has been produced without the pFc' region, referred to as the F (ab ') fragment carries both antigen binding sites of a complete antibody.
  • an antibody from which the Fc region was cleaved enzymatically or which was produced without the Fc region referred to as a Fab fragment, carries an antigen binding site of an intact antibody molecule.
  • Fab fragments consist of a covalently bound light chain of an antibody and part of the heavy chain of the antibody, referred to as Fd.
  • the Fd fragments are the main determinants of the antibody specificity (a single Fd fragment can contain up to ten different light chains can be associated without changing the specificity of the antibody) and Fd fragments retain the ability to bind to an epitope when isolated.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • FRs framework regions
  • Both the heavy chain Fd fragment and the light chain of IgG immunoglobulins contain four framework regions (FR1 to FR4) which are each separated by three complementarity-determining regions (CDR1 to CDR3).
  • CDRs and in particular the CDR3 regions and even more the CDR3 region of the heavy chain are largely responsible for the antibody specificity.
  • non-CDR regions of a mammalian antibody can be replaced by similar regions of antibodies with the same or a different specificity, while maintaining the specificity for the epitope of the original antibody.
  • variable region of the antibody gene is then analyzed A single cell PCR was amplified and cloned into a suitable vector, thus accelerating the production of monoclonal antibodies (de Wildt et al. J. Immunol. Methods 207: 61-67, 1997).
  • WO 92/04381 describes the production and use of humanized RSV antibodies from mice, in which at least some of the FR regions from mice have been replaced by FR regions of human origin. Such antibodies, including fragments of intact antibodies with antigen binding ability, are often referred to as "chimeric" antibodies.
  • F (ab ') 2 , Fab, Fv and Fd fragments of antibodies are also chimeric antibodies in which the Fc and / or FR and or CDR1 and / or CDR2 and / or light chain CDR3 regions have been replaced by homologous human or non-human sequences, chimeric F (ab ') 2 fragment antibodies in which the FR and / or CDR1 and / or CDR2 and / or light chain CDR3 - Regions were replaced by homologous human or non-human sequences, chimeric Fab fragment antibodies, in which the FR and / or CDR1 and / or CDR2 and / or light chain CDR3 regions by homologous human or non-human Sequences were replaced, and chimeric Fd fragment antibodies, in which the FR and / or CDR1 and / or CDR2 regions were replaced by homologous human or non-human sequences.
  • so-called single-chain antibodies are also included.
  • polypeptides that bind specifically to tumor-associated antigens can be provided by degenerate peptide libraries that can be easily prepared in solution in an immobilized form or as phage display libraries. Combinatorial libraries of peptides with one or more amino acids can also be made. Libraries can also be made from peptoids and non-peptide synthetic residues. Phage display can be particularly effective in identifying binding peptides according to the invention. For example, a phage library (using, for example, the ml 3, fd or lambda phage) is produced which presents inserts with a length of 4 to about 80 amino acid residues.
  • Phages are then selected which carry inserts that bind to the tumor associated antigen. This process can be repeated over several cycles of back-selection of phages that bind to the tumor-associated antigen. Repeated rounds lead to an accumulation of phages that carry certain sequences. DNA sequences can be analyzed to identify the sequences of the expressed polypeptides. The smallest linear portion of the sequence that binds to the tumor associated antigen can be determined. The "yeast two-hybrid system" can also be used to identify polypeptides that bind to a tumor-associated antigen.
  • Tumor-associated antigens or fragments thereof described in accordance with the invention can be used for screening peptide libraries, including phage display libraries, to identify and select peptide binding partners of the tumor-associated antigens.
  • Such molecules can be used, for example, for screening assays, purification protocols, for interference with the function of the tumor-associated antigen and for other purposes which are known to the person skilled in the art.
  • antibodies and other binding molecules can be used, for example, for the identification of tissue which expresses a tumor-associated antigen.
  • Antibodies can also be coupled to specific diagnostic agents for imaging cells and tissues that express tumor-associated antigens. They can also be coupled to therapeutically useful substances.
  • Diagnostic agents include, but are not limited to, barium sulfate, iocetamic acid, iopanoic acid, calcium ipodate, sodium diatrizoate, meglumine diatrizoate, metrizamide, sodium tyropanoate, and radiodiagnostics, including positron emitters such as fluorine-18 and carbon-11, gamma emitters such as Iodine-123, technetium-99m, iodine-131 and indium-111, nuclear magnetic resonance nuclides such as fluorine and gadolinium.
  • positron emitters such as fluorine-18 and carbon-11
  • gamma emitters such as Iodine-123, technetium-99m, iodine-131 and indium-111
  • nuclear magnetic resonance nuclides such as fluorine and gadolinium.
  • therapeutically useful substance means any therapeutic molecule which, if desired, is selectively guided to a cell which expresses one or more tumor-associated antigens, including anti-cancer agents, compounds containing radioactive iodine, toxins, cytostatic or cytolytic drugs, etc.
  • Anti-cancer agents include, for example, aminoglutethimide, azathioprine, bleomycin sulfate, busulfan, carmustine, Chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide, cyclosporin, cytarabidin, dacarbazine, dactinomycin, daunorubin, doxorubicin, taxol, etoposide, fluorouracil, interferon- ⁇ , lomustine, mercaptopurine, methotrexate, mitotane, procarbinsulfin, vinblistine-HCl, vinbloginsulfin, vinblistine-HCl, vinbloginsulfin, vinblistine-HCl, vinbloginsin-HCl, vinbloginsulfin, vinblistine-HCl, vinblistine-HCl, vinblistine-HCl, vinblistine-HCl, vinblistine-HCl, vinbloginsinsin
  • Toxins can be proteins such as Pokeweed antiviral protein, cholera toxin, pertussis toxin, ricin, gelonin, abrin, dipheria exotoxin or Pseudomonas exotoxin.
  • Toxin residues can also be high energy emitting radionuclides such as cobalt 60.
  • the term “patient” means human, not human primacy or another animal, in particular mammal such as cow, horse, pig, sheep, goat, dog, cat or rodent such as mouse and rat.
  • the patient is a human.
  • the term “disease” relates to any pathological condition in which tumor-associated antigens are expressed or expressed abnormally.
  • abnormal expression means that the expression is changed, preferably increased, compared to the condition in a healthy individual.
  • An increase in expression relates to an increase of at least 10%, in particular at least 20%, at least 50% or at least 100%
  • the tumor-associated antigen is only expressed in the tissue of a diseased individual, while the expression is repressed in a healthy individual.
  • cancer An example of such a disease is cancer, the term “cancer” according to the invention being leukemia, seminoma, melanoma, teratoma, glioma, kidney , Adrenal, thyroid, intestinal, liver, colon, stomach, gastrointestinal, lymph nodes, esophagus, colorectal, pancreas, throat, nose, ears (ENT), breast, prostate, Uterine, ovarian, and lung cancer and their metastases.
  • cancer leukemia, seminoma, melanoma, teratoma, glioma, kidney , Adrenal, thyroid, intestinal, liver, colon, stomach, gastrointestinal, lymph nodes, esophagus, colorectal, pancreas, throat, nose, ears (ENT), breast, prostate, Uterine, ovarian, and lung cancer and their metastases.
  • a biological sample may be a tissue and / or cellular sample in accordance with the invention and may be obtained for use in the various methods described herein in a conventional manner, such as by tissue biopsy, including Punch biopsy, and taking blood, bronchial aspirate, sputum, urine, faeces or other body fluids.
  • the term “immunoreactive cell” means a cell that can mature into an immune cell (such as a B cell, T helper cell or cytolytic T cell) with suitable stimulation.
  • Immunoreactive cells include CD34 + hematopoietic stem cells, immature and mature T cells, and immature and mature B cells. If the production of cytolytic or helper T cells recognizing a tumor associated antigen is desired, the immunoreactive cell is contacted with a cell expressing a tumor associated antigen under conditions that allow for production, differentiation and / or selection of cytolytic as well as helper T cells favor. The differentiation of T cell precursors into a cytolytic T cell upon exposure to an antigen is similar to the clonal selection of the immune system.
  • Some therapeutic methods rely on a patient's immune system response that leads to lysis of antigen-presenting cells, such as cancer cells that present one or more tumor-associated antigens.
  • antigen-presenting cells such as cancer cells that present one or more tumor-associated antigens.
  • autologous cytotoxic T lymphocytes which are specific for a complex of a tumor-associated antigen and an MHC molecule, are administered to a patient with a cell abnormality.
  • the production of such cytotoxic T lymphocytes in vitro is known.
  • An example of a method for differentiating T cells can be found in WO-A-9633265.
  • a sample with cells such as blood cells is taken from the patient and the cells are brought into contact with a cell which presents the complex and can trigger an increase in cytotoxic T-lymphocytes (eg dendritic cells).
  • the target cell can be a transfected cell like a COS cell. These transfected cells present the desired complex on their surface and stimulate their proliferation when contacted with cytotoxic T lymphocytes. The clonally expanded autologous cytotoxic T lymphocytes are then administered to the patient.
  • Another method for selecting antigen-specific cytotoxic T lymphocytes uses fluorogenic tetramers of MHC class I molecule / peptide complexes for the detection of specific clones of cytotoxic T lymphocytes (Altman et al., Science 274: 94-96 , 1996; Dunbar et al., Curr. Biol. 8: 413-416, 1998).
  • soluble MHC class I molecules are folded in vitro in the presence of ⁇ -microglobulin and a peptide antigen that binds to the class I molecule. After the MHC peptide complexes have been purified, they are labeled with biotin.
  • Tetramers are formed by mixing the biotinylated peptide-MHC complexes with labeled avidin (eg phycoerythrin) at a molar ratio of 4: 1. Tetramers are then contacted with cytotoxic T lymphocytes such as peripheral blood or lymph nodes. The tetramers bind to cytotoxic T lymphocytes that recognize the peptide antigen / MHC class I complex. Cells that bind to the tetramers can be sorted by fluorescence-controlled cell sorting for isolation of reactive cytotoxic T lymphocytes. The isolated cytotoxic T lymphocytes can then be grown in vitro.
  • cytotoxic T lymphocytes such as peripheral blood or lymph nodes.
  • Cells that bind to the tetramers can be sorted by fluorescence-controlled cell sorting for isolation of reactive cytotoxic T lymphocytes. The isolated cytotoxic T lymphocytes can then be grown in vitro.
  • T-cell against such a specific complex
  • An alternative here can be a transfer of the T cell receptor itself.
  • cells that present the desired complex eg dendritic cells
  • cytotoxic T lymphocytes from healthy people or from another species (eg mouse). This leads to an increase in high-affinity specific cytotoxic T-lymphocytes if the T-lymphocytes come from a donor organism which has so far not been in contact with the specific complex.
  • the high affinity T cell receptor from these increased specific T lymphocytes is cloned.
  • T-cell receptors are then transduced as desired into T-cells of patients by gene transfer, for example with retroviral vectors. Adoptive transfer then takes place with these genetically modified T lymphocytes (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2: 962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol. 2: 957-61, 2001).
  • the above therapeutic aspects assume that at least some of the patient's abnormal cells present a complex of a tumor-associated antigen and an HLA molecule. Such cells can be identified in a manner known per se. Once cells presenting the complex have been identified, they can be combined with a sample from the patient containing cytotoxic T lymphocytes. If the cells presenting the complex are lysed by the cytotoxic T lymphocytes, it can be assumed that a tumor-associated antigen is presented.
  • Cytotoxic T lymphocytes can also be generated in vivo in a manner known per se.
  • One method uses non-proliferative cells that express the complex.
  • the cells used will be those that normally express the complex, such as irradiated tumor cells or cells that have been transfected with one or both of the genes necessary for presentation of the complex (ie, the antigenic peptide and the presenting HLA -Molecule). Different cell types can be used.
  • Vectors can also be used which carry one or both of the genes of interest. Viral or bacterial vectors are particularly preferred.
  • nucleic acids encoding a portion of a tumor-associated antigen can be operably linked to promoter and enhancer sequences that direct expression of the tumor-associated antigen or a fragment thereof in certain tissues or cell types.
  • the nucleic acid can be incorporated into an expression vector.
  • Expression vectors can be unmodified extrachromosomal nucleic acids, plasmids or viral genomes into which an insertion of exogenous nucleic acids is possible.
  • Nucleic acids encoding a tumor associated antigen can also be inserted into a retroviral genome, thereby enabling the nucleic acid to be integrated into the genome of the target tissue or cell.
  • a microorganism such as vaccinia virus, pox virus, He ⁇ es simplex virus, retrovirus or adenovirus carries the gene of interest and "infected" de facto host cells.
  • Another preferred form is the introduction of the tumor-associated antigen in the form of recombinant RNA. This can be introduced into cells, for example, by liposomal transfer or by electroporation. The resulting cells present the complex of interest and are recognized by autologous cytotoxic T lymphocytes, which then multiply.
  • a similar effect can be achieved by combining the tumor-associated antigen or a fragment thereof with an adjuvant in order to enable incorporation into antigen-presenting cells in vivo.
  • the tumor-associated antigen or a fragment thereof can be represented as a protein, as DNA (e.g. within a vector) or as RNA.
  • the tumor associated antigen is processed to give a peptide partner for the HLA molecule, while a fragment thereof can be presented without the need for further processing. The latter is particularly the case if they can bind to HLA molecules.
  • Forms of administration in which the total antigen is processed in vivo by a dendritic cell are preferred, since helper T cell responses can also arise here.
  • an effective amount of the tumor-associated antigen can be administered to a patient e.g. administered by an intradermal injection.
  • the injection can also take place intranodally into a lymph node (Maloy et al., Proc Natl Acad Sei USA 98: 3299-303, 2001). It can also be used in combination with reagents that facilitate absorption into dendritic cells.
  • Preferred tumor associated antigens include those that react with allogeneic cancer antisera or with T cells from many cancer patients. Of particular interest are those against which there are no spontaneous immune responses. Immune responses against these can be demonstrably induced, which can lyse tumors (Keogh et al., J Immunol. 167: 787-96, 2001; Appella et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1: 177-84, 1995; Wentworth et al ., Mol Immunol. 32: 603-12, 1995).
  • compositions described according to the invention can also be used as a pharmaceutical composition.
  • Vaccines can be used for immunization.
  • the terms “immunization” or “vaccination” mean an increase or activation of an immune response to an antigen.
  • Animal models can be used to test an immunizing effect against cancer by using a tumor-associated one Antigen or a nucleic acid coding therefor can be used.
  • human cancer cells can be placed in a mouse to create a tumor, and one or more nucleic acids encoding tumor-associated antigens can be administered.
  • the effect on cancer cells e.g. reduction in tumor size
  • one or more tumor-associated antigens or stimulating fragments thereof with one or more adjuvants for inducing an immune response or increasing an immune response are administered.
  • An adjuvant is a substance that is incorporated into, or co-administered with, the antigen that enhances the immune response.
  • Adjuvants can enhance the immune response by providing an antigen reservoir (extracellular or in macrophages), activating macrophages and / or stimulating certain lymphocytes.
  • Adjuvants include, but are not limited to, monophosphoryl lipid-A (MPL, SmithKline Beecham), saponins such as QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 and QS-Ll ( So et al., Mol.
  • the peptides are preferably administered in a mixture with DQS21 / MPL.
  • the ratio of DQS21 to MPL is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1 and in particular about 1: 1.
  • DQS21 and MPL are typically present in a vaccine formulation in a range from about 1 ug to about 100 ug.
  • cytokines can be used in vaccination due to their regulatory properties on lymphocytes.
  • cytokines include, for example, interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines (see Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF and IX-18.
  • IL-12 interleukin-12
  • GM-CSF GM-CSF
  • IX-18 IX-18
  • co-stimulating molecules that are provided in the form of proteins or nucleic acids.
  • stimulating molecules are, for example, B7-1 and B7-2 (CD80 and CD86), respectively, which are expressed on dendritic cells (DC) and interact with the CD28 molecule expressed on the T cells.
  • This interaction provides co-stimulation (signal 2) for an antigen / MHC / TCR-stimulated (signal 1) T cell, thereby enhancing T cell proliferation and effector function.
  • B7 also interacts with CTLA4 (CD 152) on T cells and studies involving CTLA4 and B7 ligands show that the B7-CTLA4 interaction can enhance anti-tumor immunity and CTL proliferation (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (ll): 6284-6289 (1998)).
  • B7 is typically not expressed on tumor cells, so they are not effective antigen presenting cells (APCs) for T cells. Induction of B7 expression would allow tumor cells to more effectively stimulate cytotoxic T lymphocyte proliferation and effector function. Co-stimulation by a combination of B7 / IL-6 / IL-12 showed an induction of the IF ⁇ -gamma and Thl-cytokine profile in a T-cell population, which leads to a further increased T-cell activity (Gajewski et al., J Immunol. 154: 5637-5648 (1995)).
  • cytotoxic T lymphocytes and full effector function requires participation of T helper cells through the interaction between the CD40 ligand on the T helper cells and the CD40 molecule expressed by dendritic cells (Ridge et al., Nature 393: 474 (1998), Bennett et al., Nature 393: 478 (1998), Schönberger et al., Nature 393: 480 (1998)).
  • the mechanism of this co-stimulating signal is probably related to the increase in B7 and associated IL-6 / IL-12 production by the dendritic cells (antigen presenting cells).
  • the CD40-CD40L interaction thus complements the interactions of signal 1 (antigen / MHC-TCR) and signal 2 (B7-CD28).
  • anti-CD40 antibodies for stimulation of dendritic cells would, as expected, directly increase a response to tumor antigens that are normally outside the range of an inflammatory response or are presented by non-professional antigen presenting cells (tumor cells). In these T helper and B7 co-stimulating signals are not provided in situations. This mechanism could be used in connection with therapies based on antigen-pulsed dendritic cells.
  • nucleic acids are administered by ex vtvo procedure, i.e. by removing cells from a patient, genetically altering the cells to incorporate a tumor-associated antigen, and reintroducing the altered cells into the patient.
  • ex vtvo procedure i.e. by removing cells from a patient, genetically altering the cells to incorporate a tumor-associated antigen, and reintroducing the altered cells into the patient.
  • This generally involves inserting a functional copy of a gene into a patient's cells in vitro and returning the genetically modified cells to the patient.
  • the functional copy of the gene is under the functional control of regulatory elements which allow expression of the gene in the genetically modified cells. Transfection and transduction methods are known to the person skilled in the art.
  • nucleic acids are also administered in vivo through the use of vectors such as viruses and target-controlled liposomes.
  • a viral vector for the administration of a nucleic acid encoding a tumor-associated antigen is selected from the group consisting of adenoviruses, adeno-associated viruses, poxviruses, including vaccinia virus and attenuated poxviruses, Semliki Forest virus, Retroviruses, Sindbis virus and Ty virus-like particles.
  • Adenoviruses and retroviruses are particularly preferred.
  • the retroviruses are usually replication-deficient (i.e. they are unable to produce infectious particles).
  • nucleic acids can be introduced into cells according to the invention in vitro or in vivo.
  • Such techniques include transfection of nucleic acid CaP ⁇ 4 precipitates, transfection of nucleic acids associated with DEAE, transfection or infection with the above viruses carrying the nucleic acids of interest, liposome-mediated transfection and the like.
  • control of the nucleic acid to certain cells is preferred.
  • a carrier capable of delivering a nucleic acid to a cell e.g., a retrovirus or a liposome
  • have a bound targeting molecule e.g., a retrovirus or a liposome
  • a molecule such as an antibody that is specific for a surface membrane protein on the target cell or a ligand for a receptor on the target cell can be incorporated into or bound to the nucleic acid carrier.
  • Preferred antibodies include antibodies that selectively bind a tumor-associated antigen.
  • proteins that bind to a surface membrane protein associated with endocytosis can be incorporated into the liposome formulation to allow targeting and / or uptake.
  • proteins include capsid proteins or fragments thereof that are specific to a particular cell type, antibodies to proteins that are internalized, proteins that target an intracellular site, and the like.
  • compositions according to the invention can be administered in pharmaceutically acceptable preparations.
  • Such preparations can usually contain pharmaceutically acceptable concentrations of salts, buffering agents, preservatives, carriers, complementary immunity-enhancing substances such as adjuvants, CpG and cytokines and optionally other therapeutic agents.
  • the therapeutic agents of the invention can be administered by any conventional route, including by injection or by infusion.
  • the administration can take place, for example, orally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously or transdermally.
  • Therapeutic administration of antibodies is preferably carried out through a pulmonary aerosol.
  • Antisense nucleic acids are preferably administered by slow intravenous administration.
  • compositions of the invention are administered in effective amounts.
  • An "effective amount” refers to the amount that achieves a desired reaction or effect, alone or together with further doses.
  • the desired reaction relates to the inhibition of the course of the disease. This includes slowing the progression of the disease and, in particular, stopping the progression of the disease.
  • the desired response in treating a disease or condition can also be delay the onset or prevent the onset of the disease or condition.
  • compositions according to the invention will depend on the condition to be treated, the severity of the disease, the individual parameters of the patient, including age, physiological condition, height and weight, the duration of the treatment, the type of accompanying therapy (if any), depend on the specific route of administration and similar factors.
  • compositions according to the invention are preferably sterile and contain an effective amount of the therapeutically active substance for producing the desired reaction or the desired effect.
  • the doses of the compositions of the invention to be administered may depend on various parameters such as the mode of administration, the condition of the patient, the desired period of administration, etc. In the event that a patient's response to an initial dose is inadequate, higher doses (or effectively higher doses obtained by another, more localized route of administration) can be used.
  • doses of the tumor-associated antigen from 1 ng to 1 mg, preferably from 10 ng to 100 ⁇ g, are formulated and administered for treatment or for generating or increasing an immune response. If the administration of nucleic acids (DNA and RNA) which code for tumor-associated antigens is desired, doses of 1 ng to 0.1 mg are formulated and administered.
  • nucleic acids DNA and RNA
  • compositions according to the invention are generally administered in pharmaceutically acceptable amounts and in pharmaceutically acceptable compositions.
  • pharmaceutically acceptable refers to a non-toxic material that does not interfere with the action of the active ingredient in the pharmaceutical composition.
  • Such preparations can usually contain salts, buffering agents, preservatives, carriers and optionally other therapeutic agents.
  • the salts should be pharmaceutically acceptable.
  • non-pharmaceutically acceptable salts can be used for the preparation pharmaceutically acceptable salts thereof are used and are included according to the invention.
  • Such pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, those made from the following acids: hydrogen chloride, hydrogen bromide, sulfur, saltpetre, phosphorus, maleic, vinegar, salicyl, lemon, ants , Malonic, succinic acid and the like.
  • Pharmaceutically acceptable salts can also be prepared as alkali metal or alkaline earth metal salts such as sodium, potassium or calcium salts.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier relates to one or more compatible solid or liquid fillers, diluents or capsule substances which are suitable for administration to a human.
  • carrier refers to an organic or inorganic ingredient, natural or synthetic, in which the active ingredient is combined to facilitate application.
  • the constituents of the pharmaceutical composition according to the invention are usually such that there is no interaction which substantially impairs the desired pharmaceutical activity.
  • compositions according to the invention can contain suitable buffer substances such as acetic acid in a salt, citric acid in a salt, boric acid in a salt and phosphoric acid in a salt.
  • compositions can also optionally contain suitable preservatives such as benzalkonium chloride, chlorobutanol, parabens and thimerosal.
  • suitable preservatives such as benzalkonium chloride, chlorobutanol, parabens and thimerosal.
  • compositions are usually presented in a unitary dosage form and can be prepared in a manner known per se.
  • Pharmaceutical compositions according to the invention can be present, for example, in the form of capsules, tablets, lozenges, suspensions, syrups, elixirs or as an emulsion.
  • compositions suitable for parenteral administration usually comprise a sterile aqueous or non-aqueous formulation of the active ingredient which preferably isotonic with the blood of the recipient.
  • Compatible carriers and solvents are, for example, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile, fixed oils are usually used as the solution or suspension medium.
  • Fig. 1 GPR35 mRNA expression in colon carcinoma biopsies
  • RT-PCR studies with DNA-free RNA show GPR35 expression in the majority of colon carcinoma biopsies. In contrast, expression in normal tissues is not detectable. (1-breast, 2-lungs, 3-lymph nodes, 4-thymus, 5-colon, 6-15 colon carcinoma, 16-neg. Control).
  • RT-PCR analysis with gene-specific SCGB3A2 primers shows cDNA amplification only in normal lung (lane 8, 14-15) and in lung carcinoma biopsies (lane 16-24).
  • RT-PCR analysis with claudin-18A2.1 -specific primers showed a pronounced claudin-18A2.1 expression in 8/10 gastric carcinoma biopsies and in 3/6 pancreatic carcinoma biopsies , Significant expression was also demonstrated in stomach and normal esophageal tissue. In contrast, no expression was detected in the ovary and ovarian carcinoma.
  • RT-PCR analysis with SLC13 AI -specific primers showed expression in 7/8 renal cell carcinoma samples. Otherwise, transcripts within normal tissues were only detected in the kidney. (1-2 kidney, 3-10 renal cell carcinoma, 11 breast, 12 lung, 13 liver, 14 colon, 15 lymph nodes, 16 spleen, 17 esophagus, 18 thymus, 19 thyroid, 20 -PBMCs, 21 -Ovary, 22-testis).
  • RT-PCR investigations with FLJ21477-specific primers showed selective expression in the colon, and moreover differently pronounced expression in (7/12) examined colon carcinoma samples.
  • the remaining normal tissues (NG) showed no expression.
  • RT-PCR examinations with FLJ20694-specific primers showed selective expression in the colon and, moreover, different degrees of expression Expression in (5/9) examined colon carcinoma samples. The remaining normal tissues (NG) showed no expression.
  • Fig. 10 of Ebner expression in stomach, lung and lung carcinoma.
  • RT-PCR studies with von Ebner-specific primers showed a selective expression in the stomach, in the lung and in (5 / 10) examined lung carcinoma samples.
  • the remaining normal tissues (NG) showed no expression.
  • Plunc expression in thymus, lung and lung carcinoma RT-PCR studies with Plunc-specific primers (SEQ ID NO: 75, 76) showed selective expression in the thymus, in the lung and in (6/10 ) examined lung carcinoma samples. The other normal tissues showed no expression.
  • Fig. 12 SLC26A9 expression in the lung, lung carcinoma and thyroid.
  • RT-PCR studies with SLC26A9-specific primers showed selective expression in the lung and in all (13/13) examined lungs.
  • the other normal tissues (NG) showed no expression except for the thyroid.
  • RT-PCR studies with a THC1005163-specific primer (SEQ ID O: 79) and an unspecific oligo dT-Tag primer showed expression in the stomach, ovary, lung and in (5/9) lung carcinoma biopsies.
  • the remaining normal tissues (NG) showed no expression.
  • RT-PCR tests with LOC134288-specific primers showed selective expression in the kidney and in (5/8) examined renal cell carcinoma biopsies.
  • RT-PCR studies with FLJ21458 -specific primers showed selective expression in the colon and in (7/10) examined colon carcinoma biopsies. (1- 2 colon, 3 liver, 4 PBMCs, 5 spleen, 6 prostate, 7 kidney, 8 ovary, 9 skin, 10 ileum, 11 lung, 12 testis, 13-22 Colon cancer, 23-neg. Control).
  • Immunofluorescence for the detection of the cellular localization of GPR35 after transfection of a plasmid that expresses a GPR35-GFP fusion protein.
  • the arrows indicate the membrane-bound fluorescence of the fluorescent GFP.
  • Quantitative RT-PCR with GPR35-specific primers show the selective expression in the intestine, in large intestine samples and in matastases from intestinal tumors.
  • the following normal tissues were analyzed: liver, lungs, lymph nodes,
  • Stomach spleen, adrenal gland, kidney, esophagus, ovary, testis, thymus, skin, breast, pancreas, lymphocytes, activated lymphocytes, prostate, thyroid, fallopian tubes, endometrium, cerebellum, brain.
  • GPR35 Prevalence of GPR35 in colon tumors and their metastases. In more than 90% of the cases, GPR35 is expressed in both tumors and metastases.
  • Quantitative RT-PCR with GUCY2C-specific primers show the high and selective expression in normal colon and stomach tissue (A) as well as the GUCY2C-specific expression in colon and stomach tumor samples (B).
  • GUCY2C is detectable in 11/12 colon carcinomas and in 7/10 gastric carcinomas.
  • Quantitative RT-PCR with SCGB3A2-specific primers show the selective expression in lung and lung tumor samples.
  • 19/20 Lung tumor samples are SCGB3A2 positive, in more than 50% of the samples SCGB3A2 is overexpressed by at least a factor of 10.
  • the following normal tissues were analyzed: liver, lungs, lymph nodes, stomach, spleen, adrenal gland, kidney, esophagus, ovary, testis, thymus, skin, breast, pancreas, Lymphocytes, activated lymphocytes, prostate, thyroid, fallopian tubes, endometrium, cerebellum, him.
  • Fig. 21 Immunofluorescence with SCGB3A2-specific antibodies
  • C0S7 cells were transfected with a plasmid which codes for an SCGB3A2-GFP fusion protein.
  • A. Detection of the transfected fusion protein with an SCGB3 A2-specific rabbit antiserum (immunization with SEQ ID NO: 105).
  • B. Detection of the transfected fusion protein by GFP fluorescence.
  • C Superimposition of the two fluorescent areas from A and B. The yellow coloration occurs at the places where both fluorescent areas overlap and thus demonstrates the specificity of the SCGB3 A2 antiserum.
  • Fig. 22 Schematic representation of CIaudin-18 splice variants
  • the two Claudin-18 splice variants AI and A2 differ in the N-terminus and show different potential glycosylation sites.
  • Claudin-Al is strongly activated in a variety of tumor tissues. A particularly strong expression is found in stomach tumors, lung tumors, pancreatic carcinomas and esophageal carcinomas.
  • variant A2 is activated in many tumors.
  • Fig. 25 Use of Claudin-18A2-specific antibodies (extracellular domain) (top) Staining of Claudin-18A2-positive gastric carcinoma cells (SNU-16) with an antibody which was prepared by immunization with a peptide (SEQ ID NO: 17) , Membrane staining occurs particularly strongly in the cell / cell interaction areas.
  • A- Preimmun., MeOH; B-Immune Serum MeOH, 5 ⁇ g / ml Bottom
  • Fig. 29 Detection of CIaudin-18A2 in a Western blot.
  • Fig. 30 Claudin-18A2 Western blot with samples from stomach and stomach tumors
  • Lysates from the stomach and stomach tumors were blotted and tested with a Claudin-18A2-specific antibody against the epitope with SEQ ID NO: 17.
  • Gastric tumors have a lower glycosylated form of Claudin-18A2.
  • PNGase F treatment of gastric lysates leads to the formation of the low glycosylated form, left: 1-stomach No #A; 2-stomach Tu #A; 3-stomach No #B; 4-stomach Tu #B right: 1-stomach No #A; 2-stomach No #B; 3-stomach No #B + PNGase F; 4-stomach Tu #C; 5- stomach Tu #D; 6-stomach Tu # D + PNGase F Fig. 31. Expression of claudin-18 in lung tumors
  • Fig. 30 low-glycosylated claudin-18A2 variants were detected in lung tumors. 1-Magen ⁇ o; 2-stomach Tu; 3-9 lung Tu.
  • Fig. 32 Immunohistochemical analysis of claudin-18 with claudin-18A2-specific antibodies in stomach tumor tissue
  • Fig. 33 Indirect immunofluorescence of stomach-specific Snul6 cells with a CIaudin-18-specific polyclonal antiserum
  • Quantitative RT-PCR with SLC13 AI -specific primers show the high and selective expression in normal kidney tissue (A) and the SLC13A1-specific expression in kidney cell carcinoma (B). SLC 13 AI transcription is detectable in 5/8 kidney cell carcinomas.
  • Fig. 35 Cellular localization of SLC13A1 immunofluorescence to detect the cellular localization of SLC13A1 after transfection of a plasmid which provides an SLC13Al-GFP fusion protein.
  • the membrane-bound fluorescence (as a ring around the transfected cell) of the SLC13A1 fusion protein is clearly visible.
  • Quantitative RT-PCR with CLCAl -specific primers show the high and selective expression in normal colon and stomach tissue (A) as well as the CLCAl -specific expression in colon and stomach tumor samples (B).
  • CLCAl is detectable in 6/12 colon carcinomas and in 7/10 gastric carcinomas.
  • Quantitative RT-PCR with FLJ21477-specific primers show the high and selective expression in normal colon and stomach tissue as well as a weak expression in thymus, esophagus and brain (A) and the FLJ21477-specific one Expression in large intestine tumor samples (B). FLJ21477 is detectable in 11/12 colon carcinomas.
  • Fig. 38 Quantitative expression of FLJ20694 Quantitative RT-PCR with FLJ20694-specific primers (SEQ ID NO: 129, 130) show the high and selective expression in normal colon and stomach tissue (A) as well as the FLJ20694-specific overexpression in colon and gastric tumors (B). FLJ20694 is detectable in 11/12 colon carcinomas and in 7/10 gastric carcinomas.
  • Quantitative RT-PCR with FLJ21458-specific primers show the selective expression in testis, stomach and intestinal tissue.
  • FLJ21458-specific transcripts could be detected in 20/20 colon tumors and in 7/11 colon metastases.
  • the following normal tissues were analyzed: liver, lungs, lymph nodes, spleen, adrenal gland, kidney, esophagus, ovary, testis, thymus, skin, breast, pancreas, lymphocytes, activated lymphocytes, prostate, thyroid, fallopian tubes, endometrium, cerebellum, brain.
  • Fig. 40 Immunofluorescence with FLJ21458-specific antibodies (top) 293 cells were transfected with a plasmid which codes for a FLJ21458-GFP fusion protein.
  • C Superimposition of the two fluorescences from A and B. The yellow color develops at the points where both fluorescences overlap and thus demonstrates the specificity of the FLJ21458 antiserum.
  • the search was limited to part of the total information in these databases by using "homo sapiens” for the organism and "mRNA” for the type of molecule.
  • the list of GOI found was curated by determining different names for the same sequence and eliminating such redundancies. All candidate genes that resulted from the keyword search were again examined by the "electronic Northern” (eNorthern) method with regard to their tissue distribution.
  • the eNorthern is based on the fact that the sequence of a GOI is compared with an EST (expressed sequence tag) database (Adams et al., Science 252: 1651, 1991)
  • pool B All cDNA libraries which were produced from normal tissues with the exception of Colon were assigned to pool B. In general, all cDNA banks were used regardless of the underlying manufacturing process, but only those with a thickness> 1000 were permitted. Pool B was digitally subtracted from pool A using the BUT NOT operator. The set of GOI found in this way was also subjected to eNorthern studies and secured by a literature search.
  • This combined data mining includes all approximately 13,000 full-length genes in the public domain and predicts from these genes with potential organ-specific expression.
  • RNA extraction production of poly-d (T) primed cDNA and conventional RT-PCR analysis
  • RNA from native tissue material was extracted using guanidium isothiocyanate as a chaotrophic agent (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-9, 1987). After extraction with acidic phenol and precipitation with isopropanol, the RNA was dissolved in DEPC-treated water.
  • RNA was converted into a first-strand cDNA synthesis in a 20 ⁇ l reaction mixture using Superscript II (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions carried out.
  • a dT (18) oligonucleotide was used as the primer. Integrity and quality of the cDNA were checked by amplification of p53 in a 30 cycle PCR (sense CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, antisense CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, hybridization temperature 67 ° C.).
  • An archive of first strand cDNAs from a number of normal tissues and tumor entities was created.
  • cDNAs were amplified in a 30 ⁇ l reaction mixture with GOI-specific primers (see below) and 1 U HotStarTaq DNA polymerase (Qiagen).
  • the reaction mixture contained 0.3 mM dNTPs, 0.3 ⁇ M each of each primer and 3 ⁇ l 10 ⁇ reaction buffer.
  • the primers were chosen to be in 2 different exons and the removal of interference by contaminating genomic DNA as the reason for false positive results was confirmed by testing non-reverse transcribed DNA as a template.
  • Sensel 5'-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3 'Antisensel: 5' -CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG-3 'Sense2: 5'- TGTTTTCAACTACCAGGGGC-3' Antisense2: 5'- TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3 '
  • Antisense 5'- CAATGAGAAC ACATGGACATG-3 '
  • Antisense 5'- AGAGATGGCACATATTCTGTC
  • the expression was determined after normalizing the samples against 18s RNA as a so-called housekeeping gene using the ⁇ -Q method (PE Biosystems, USA). The reactions were carried out in duplex batches and determined in triplicates. The QuantiTect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions was used. The cDNA was synthesized using the High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) using hexamer primers according to the manufacturer's instructions.
  • Cells from cell culture (endogenous expression of the target gene or synthesis of the target protein after transfection of an expression vector encoding the target protein) or tissue samples could contain the target protein are lysed in a 1% SDS solution.
  • the SDS denatures the proteins contained in the lysate.
  • the size of the lysates of an experimental approach is separated electrophoretically (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE).
  • the proteins are then transferred to the nitrocellulose membrane (Schleicher & Schüll) by means of the semi-dry electroblot method (Biorad), on which the desired protein can be detected.
  • the membrane is first blocked (eg with milk powder) and then incubated with the specific antibody at a dilution of 1: 20-1: 200 (depending on the specificity of the antibody) for 60 minutes.
  • the membrane is incubated with a second antibody coupled with a marker (eg enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase), which recognizes the first antibody.
  • a marker eg enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • the target protein is then made visible in a staining or chemiluminescence reaction on the membrane by means of an enzyme reaction (eg ECL, Amersham Bioscience). The result is documented by recording with a suitable camera.
  • Protein modifications are usually analyzed in a Western blot. Glycosylations, which are usually several kDa in size, lead to a larger total mass of the target protein, which can be separated in the SDS-PAGE. Protein lysates are used to detect specific O- and N-glycosidic bonds
  • Tissues or cells were incubated with O- or N-glycosidases prior to denaturation by SDS (according to the manufacturer, e.g. PNgase, Endoglycosidase F, Endoglycosidase H, Röche Diagnostics).
  • SDS e.g. PNgase, Endoglycosidase F, Endoglycosidase H, Röche Diagnostics.
  • a Western blot is then carried out as described above. If the size of a target protein is reduced, a specific glycosylation can be detected after incubation with a glycosidase and the tumor specificity of a modification can also be analyzed in this way. The exact position of the glycosylated amino acid can be predicted using algorithms and prediction programs.
  • Cells from established cell lines are used which either endogenously synthesize the target protein (detection of the RNA in the RT-PCR or the protein in the vest blot) or have been transfected with plasmid DNA before the IF.
  • Various methods eg electroporation, liposome-based
  • the transfected plasmid can encode the unmodified protein during immunofluorescence or can also couple different amino acid markers to the target protein.
  • the most important markers are, for example, the fluorescent "green fluorescent protein” (GFP) in its differentially fluorescent forms and short peptide sequences of 6-12 amino acids, for which highly affine and specific antibodies are available.
  • GFP fluorescent "green fluorescent protein”
  • Cells that synthesize the target protein are included Paraformaldehyde, saponin or methanol fixed, then the cells can be permeabilized by incubation with detergents (eg 0.2% Triton X-100) if necessary.
  • the cells are incubated with a primary antibody which is against the target protein or After a washing step, the mixture is incubated with a second antibody, which is coupled to a fluorescent marker (eg fluorescin, Texas Red, Dako) and which binds to the first antibody, and the cells thus labeled are then glycerol-coated overlaid and using a fluorescence microscope according to the Manufacturer's data analyzed. Specific fluorescence emissions are achieved by specific excitation, depending on the substances used.
  • a fluorescent marker eg fluorescin, Texas Red, Dako
  • the analysis generally allows the target protein to be localized reliably, with the coupled amino acid markers or other brand proteins being stained in addition to the target protein in order to confirm the antibody quality and the target protein in double stains, the localization of which has already been described in the literature.
  • a special case is the GFP and its derivatives, which can be excited directly and fluoresce themselves, so that no antibodies are required for detection.
  • Immunohistochemistry The IHC is used in particular to (1) estimate the amount of target protein in tumor and normal tissues, (2) analyze how many cells in tumor and healthy tissue synthesize the target gene, and / or (3) to define the cell type in a tissue (tumor, healthy cells) in which the target protein can be detected.
  • tissue tumor, healthy cells
  • different protocols must be used (eg "Diagnostic Immunohistochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667” or in "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704").
  • Immunohistochemistry (IHC) on specific tissue samples is used for protein detection in the corresponding tissue.
  • the aim of this procedure is to identify the location of a protein in a functionally intact tissue association.
  • the IHC is used in particular to (1) estimate the amount of target protein in tumor and normal tissues, (2) analyze how many cells in tumor and healthy tissue synthesize the target gene, and (3) the cell type in to define a tissue (tumor, healthy cells) in which the target protein can be detected.
  • the protein amounts of a target gene can be quantified by tissue immunofluorescence using a digital camera and suitable software (eg Tillvision, Till-photonics, Germany).
  • tumor tissue and comparable healthy tissue as reference are used in the IHC.
  • Cell lines in which the presence of the target gene is known by RT-PCR analyzes can also serve as positive and negative controls. A background check must always be carried.
  • First animals e.g. rabbits
  • the animal's immune response to the immunogen can be enhanced by a second or third immunization within a defined period (approx. 2-4 weeks after the previous immunization).
  • a defined period approximately 2-4 weeks after the previous immunization.
  • blood is drawn from the animals and an immune serum is obtained therefrom.
  • the animals are usually immunized using one of four well-established methods, although other methods are also available. Immunization can be carried out with peptides that are specific for the target protein, the entire protein or with extracellular partial sequences of a protein that can be identified experimentally or via prediction programs.
  • peptides conjugated to KLH (keyhole limpet hemocyanin) (length: 8-12 amino acids) are synthesized using a standardized in vitro method and these peptides are used for immunization.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • 3 immunizations are carried out with a concentration of 5-1000 ⁇ g / immunization.
  • the immunization can also be carried out as a service by service providers.
  • immunization can be carried out by recombinant proteins.
  • the cloned DNA of the target gene is cloned into an expression vector and that
  • Target protein analogous to the conditions of the respective manufacturer (e.g. Röche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen) e.g. synthesized cell-free in vitro, in bacteria (e.g. E. coli), in yeast (e.g. S. pombe), in insect cells or in mammalian cells.
  • bacteria e.g. E. coli
  • yeast e.g. S. pombe
  • Proteins can also be used for the immunization which have a molecular anchor as an aid for cleaning (eg His-Tag, Qiagen; FLAG-Tag, Röche Diagnostics; Gst fusion proteins).
  • a molecular anchor as an aid for cleaning
  • this cell line can also be used to produce the specific antiserum.
  • the immunization is carried out in 1-3 injections, each with approx.
  • the immunization can also be carried out by injection of DNA (DNA immunization).
  • DNA immunization the target gene is first cloned into an expression vector, so that the target sequence is under the control of a strong eukaryotic promoter (e.g. CMV promoter). Then 5-100 ⁇ g DNA as an immunogen with a strong eukaryotic promoter (e.g. CMV promoter).
  • CMV promoter e.g. CMV promoter
  • Gene gun is transferred to highly perfused, capillary areas of an organism (eg mouse, rabbit).
  • the transferred DNA is taken up by cells of the animal, the target gene is expressed and the animal finally develops an immune response against the target gene (Jung et al., Mol Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk et al., Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).
  • Cell culture-based tests followed by a western blot are best for the detection of specificity (various variations are described, for example, in "Current Protocols in Protein Chemistry", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience).
  • a strong eukaryotic promoter eg cytomegalovirus promoter.
  • electroporation, liposome-based transfection, calcium phosphate precipitation are well established for transfecting cell lines with DNA (eg Lemoine et al. , Methods Mol Biol. 75: 441-7, 1997.
  • cell lines can also be used which express the target gene endogenously (detection by target gene-specific RT-PCR).
  • homologous genes are transfected with the experiment in order to subsequently Westem-Blot to prove the specificity of the analyzed antibody.
  • the membrane is incubated with a second antibody coupled with a marker (eg enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase), which recognizes the first antibody.
  • a marker eg enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • the target protein can then be made visible on the membrane in a staining or chemiluminescent reaction (eg ECL, Amersham Bioscience).
  • An antibody with a high specificity for the target protein should ideally only recognize the desired protein itself.
  • Various methods are used to confirm the membrane localization of the target protein identified in the in silico approach.
  • An important and well-established method using the antibodies described above is immunofluorescence (IF).
  • IF immunofluorescence
  • cells of established cell lines are used which either synthesize the target protein (detection of the RNA in the RT-PCR or the protein in the Western blot) or have been transfected with plasmid DNA.
  • Various methods of transfecting cell lines with DNA eg electroporation, liposome-based transfection, calcium phosphate precipitation
  • DNA eg Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997.
  • the plasmid transfected into the cells can encode the url-modified protein during immunofluorescence or else couple different amino acid markers to the target protein.
  • the most important markers are, for example, the fluorescent "green fluorescent protein” (GFP) in its differentially fluorescent forms, short peptide sequences of 6-12 amino acids, for which highly affine and specific antibodies are available, or the short amino acid sequence Cys-Cys-XX -Cys-Cys, which can bind specific fluorescent substances via its cysteines (Invitrogen).
  • GFP fluorescent "green fluorescent protein”
  • Cells that synthesize the target protein are fixed, for example, with paraformaldehyde or methanol.
  • the cells can be incubated with detergents (eg 0.2% Triton X-100), the cells are then incubated with a primary antibody which is directed against the target protein or against one of the coupled markers, and after a washing step, the mixture is treated with a second, with a fluorescent marker (eg fluorescin, Texas Red , Dako) coupled antibody which binds to the first antibody the cells marked in this way overlaid with glycerin and analyzed using a fluorescence microscope according to the manufacturer's instructions. Specific fluorescence emissions are achieved by specific excitation, depending on the substances used.
  • detergents eg 0.2% Triton X-100
  • a primary antibody which is directed against the target protein or against one of the coupled markers
  • a fluorescent marker eg fluorescin, Texas Red , Dako
  • the analysis generally allows the target protein to be localized reliably, with the coupled amino acid markers or other brand proteins being stained in addition to the target protein in order to confirm the antibody quality and the target protein in double stains, the localization of which has already been described in the literature.
  • a special case is the GFP and its derivatives, which can be excited directly and fluoresce themselves.
  • the membrane permeability which can be controlled by the use of detergents, allows the detection in immunofluorescence whether an immunogenic epitope is located inside or outside the cell. The prediction of the selected proteins can thus be experimentally substantiated. Alternatively, the detection of extracellular domains can be carried out using flow cytometry.
  • cells are fixed under non-permeabilizing conditions (eg with PBS / Na-Azid / 2% FCS / 5 raM EDTA) and analyzed in a flow cytometer according to the manufacturer's instructions.
  • non-permeabilizing conditions eg with PBS / Na-Azid / 2% FCS / 5 raM EDTA
  • a flow cytometer according to the manufacturer's instructions.
  • extracellular epitopes can be recognized by the antibody to be analyzed.
  • the use of eg propidium iodide or trypan blue can be used to distinguish between dead and living cells and thus avoid false positive results.
  • the purification of the polyclonal sera was carried out entirely in the case of the peptide antibodies or partially in the case of the antibodies against recombinant proteins as a service by the contracted companies.
  • the corresponding peptide or recombinant protein was covalently bound to a matrix, this was equilibrated after coupling with a native buffer (PBS: phosphate buffered saline) and then incubated with the raw serum. After a further washing step with PBS, the antibody was eluted with 100 mM glycine, pH 2.7 and the eluate was immediately neutralized in 2 M TRIS, pH 8.
  • the antibodies thus purified could then be used for the specific detection of the target proteins both by west emblotting and by immunofluorescence.
  • Example 1 Identification of GPR35 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • GPR35 (SEQ ID NO: 1) and its translation product (SEQ ID NO: 9) have been described as a putative G protein-coupled receptor.
  • the sequence is in the gene bank under accession no. AF089087 released. This transcript encodes a protein of 309 amino acids with a molecular weight of 34 kDa.
  • GPR35 has been predicted to belong to the super family of G protein-coupled receptors with 7 transmembrane domains (O'Dowd et al., Genomics 47: 310-13, 1998). To confirm the predicted localization of GPR35 in the cell, the protein was fused with eGFP as a reporter molecule and, after transfection of the corresponding plasmid, was heterologously expressed in 293 cells.
  • GPR35 is an integral transmembrane molecule (Fig. 17).
  • Examination to date on human GPR35 see below Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y , Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell GI Nat Genet.
  • GPR35 transcripts in normal colon tissue and in colon carcinoma biopsies (Fig. 1) was previously unknown and can be used according to the invention for molecular diagnostic methods such as RT-PCR for the detection of disseminating tumor cells in serum and bone marrow and used to detect metastases in other tissues.
  • the quantitative RT-PCR with specific primers (SEQ ID NO: 88 and 89) also confirms that GPR35 is a highly selective intestinal-specific and also differentiation antigen obtained in intestinal tumors and intestinal tumor metastases. In some intestinal tumors it is even one log overexpressed compared to the normal intestine (Fig. 18).
  • To detect GPR35 protein antibodies were produced by immunizing rabbits.
  • SEQ ID NO: 90 GSSDLTWPPAIKLGC (AS 9-23)
  • SEQ ID NO: 91 DRYVAVRHPLRARGLR (AS 112-127)
  • SEQ ID NO: 92 VAPRAKAHKSQDSLC (C-terminus)
  • SEQ ID NO: 93 CFRSTRHNFNSMR (extracellular domain 2)
  • GPR35 position of the predicted extracellular domains in the sequence of SEQ ID NO: 9: AS 1-22 (SEQ ID NO: 94); AS 81-94 (SEQ ID NO: 95); AS 156-176 (SEQ ID NO: 96); AS 280-309 (SEQ ID NO: 97)) can be used according to the invention as target structures of monoclonal antibodies. These antibodies bind specifically to the cell surface of tumor cells and can be used for both diagnostic and therapeutic procedures. The overexpression of GPR35 in tumors additionally supports such an application.
  • sequences coding for proteins can be used according to the invention as vaccines (RNA, DNA, peptide, protein) for inducing tumor-specific immune responses (T-cell and B-cell-mediated immune reactions).
  • vaccines RNA, DNA, peptide, protein
  • T-cell and B-cell-mediated immune reactions tumor-specific immune responses
  • GPR35 a protein, GPR35, previously described as ubiquitously expressed, is selectively overexpressed in tumor-associated gastrointestinal tumors, in particular in tumors of the large intestine. GPR35 is therefore particularly suitable as a molecular target structure for the diagnosis and treatment of these tumors.
  • GPR35 is surprisingly not significantly detectable in most normal tissues and, in contrast, is strongly activated in primary and metastatic colon tumors.
  • a new translation variant was found according to the invention which makes use of an alternative start codon (SEQ ID NO: 10).
  • GPR35 is a member of the group of G-coupled receptors (GPCR), a very large protein family that has been structurally and functionally very well studied. GPCR are ideal as target structures for the development of pharmaceutically active substances, since the processes necessary for this (e.g. receptor expression, purification, ligand screening, mutagenization, functional inhibition, selection of agonistic and antagonistic ligands, radioactive labeling of ligands) are very well developed and described in detail, see. eg "G Protein-Coupled Receptors" by Tatsuya Haga, Gabriel Berstein and Gabriel Bernstein ISBN: 0849333849 or in "Identification and Expression of G-Protein Coupled Receptors Receptor Biochemistry and Methodology" by Kevin R.
  • GPCR G-coupled receptors
  • GPR35 is undetectable in most healthy tissues, but is expressed tumor-associated on the cell surface, enables its use as a tumor-associated target structure, for example for pharmaceutically active ligands, in particular in conjugation, for example, with radioactive molecules as pharmaceutical substances.
  • radiolabelled ligands that bind to GPR35 can be used for the detection of tumor cells or for the treatment of colon tumors in vivo.
  • Example 2 Identification of GUCY2C in Liver and Ovarian Tumors and New GUCY2C Splice Variants as Diagnostic and Therapeutic Cancer Targets
  • Guanylate cyclase 2C (SEQ ID NO: 2; translation product: SEQ ID NO: 11) - a type I transmembrane protein - belongs to the family of natriuretic peptide receptors. The sequence is published in the gene bank under the accession number NM_004963. The intracellular cGMP concentration is increased by binding the peptides guanylin or uroguanylin or also heat-stable enterotoxins (STa), which induces signal transduction processes within the cell.
  • STa heat-stable enterotoxins
  • GUCY2C also extends to extraintestinal areas, such as primary and metastatic adenocarcinomas of the stomach and esophagus (Park et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 11: 739-44, 2002).
  • a splice variant of GUCYC which is found in both normal and transformed intestinal tissue, contains a 142 bp deletion in exon 1, which prevents translation of a GUCY2C-like product (Pearlman et al., Dig. Dis. Sci. 45 : 298-05, 2000). The only splicing variant described so far does not lead to any translation product.
  • An aim of the invention was to identify tumor-associated splice variants for GUCY2C that can be used both diagnostically and therapeutically.
  • RT-PCR studies with a GUCY2C-specific Prime ⁇ aar show a pronounced expression of GUCY2C transcripts in the normal colon and stomach as well as a weak expression in the liver, testis, ovary, thymus, Spleen, brain and lungs (Tab. 2, Fig. 19).
  • the expression in the colon and stomach was at least 50 times higher than in all other normal tissues. Pronounced GUCY2C transcript levels were found in colon and gastric carcinoma (Table 2).
  • GUCY2C-118s / GUCY2C-498as SEQ ID NO: 24, 29
  • GUCY2C-621s / GUCY2C-1140as SEQ ID NO: 25, 30
  • GUCY2C-1450s / GUCY2C-1790as SEQ ID NO: 26, 31
  • GUCY2C-1993s / GUCY2C-2366as SEQ ID NO: 27, 32
  • GUCY2C-2717s / GUCY2C-3200as SEQ ID NO: 28, 33
  • GUCY2C-118s / GUCY2C-1140as SEQ ID NO: 24, 30
  • GUCY2C-621s / GUCY2C-1790as SEQ ID NO: 25, 31
  • GUCY2C-1450s / GUCY2C-2366as SEQ ID NO: 26, 32
  • GUCY2C-621s / GUCY2C-1790as SEQ ID NO: 25, 31
  • the splice variants according to the invention with deletions in exon 3 or exon 6 are distinguished above all by the fact that the translation products (SEQ ID NO: 12, 13) have no transmembrane domain.
  • a neoepitope of 13 amino acids is formed at the C-terminal, which has no homology with previously known proteins. As a result, this neoepitope is predestined as a target structure for immunotherapy.
  • the splice variant according to the invention with base deletions at positions 1606-1614 (SEQ ID NO: 5) and its translation product (SEQ ID NO: 14) also contains a neopitope.
  • To detect GUCY2C protein antibodies were produced by immunizing rabbits. The following peptides were used to propagate these antibodies:
  • SEQ ID NO: 100 HNGSYEISVLMMGNS (AS 31 - 45)
  • SEQ ID NO: 101 NLPTPPTVENQQRLA (AS 1009 - 1023)
  • Such antibodies can in principle be used for diagnostic and therapeutic purposes.
  • the extracellular domain of GUCY2C (position of the predicted extracellular domain from the sequence of SEQ ID NO: II: AS 454-1073 (SEQ ID NO. 102)) can be used according to the invention as the target structure of monoclonal antibodies.
  • the structure prediction is not entirely clear and has not yet been experimentally proven, so that an alternative membrane orientation is also conceivable.
  • amino acids 1-431 would be extracellular and would be suitable as a starting point for monoclonal antibodies.
  • These antibodies bind specifically to the cell surface of tumor cells and can be used for both diagnostic and therapeutic procedures.
  • the overexpression of GUCY2C, especially in the colon tumors supports such an operation even more.
  • the sequences coding for proteins can, according to the invention, be used as vaccines (RNA, DNA, peptides, protein) for inducing tumor-specific immune responses (T-cell and B-cell mediated immune reactions).
  • GUCY2C cellular function of the GUCY2C molecule
  • substances in particular small molecules, can be developed according to the invention which modulate the function of the enzyme on tumor cells.
  • the product of the enzyme reaction, cGMP is a well-known cellular signaling molecule with various functions (Tremblay et al. Mol Cell Biochem 230, 31).
  • Example 3 Identification of SCGB3A2 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • SCGB3A2 (SEQ ID NO: 6) (translation product: SEQ ID NO: 15) belongs to the gene family of secretoglobins. The sequence is published in GenBank under accession number NM_054023. SCGB3A2 (UGRP1) is a 17 kDa homodimeric secretory protein that is only expressed in the lungs and tracheae (Niimi et al., Am JHum Genet 70: 718-25, 2002). RT PCR studies with a Prime ⁇ aar (SEQ ID NO: 37, 38) confirmed selective expression in normal lung tissue. Lung and trachea specific genes, e.g.
  • SCGB3A2 is active in primary and metastatic lung tumors.
  • the investigations according to the invention showed that SCGB3A2 is expressed strongly and frequently in bronchial carcinomas (Fig. 4). All other 23 normal tissues tested had no expression except for the lungs and trachea (see Fig. 20).
  • Lung carcinoma biopsies can be used according to the invention for molecular diagnostic methods such as RT-PCR for the detection of disseminating tumor cells in the blood and bone marrow, sputum, bronchial aspirate or lavage and for the detection of metastases in other tissues, for example in local lymph nodes.
  • SCGB3A2 is only released into the bronchi by specialized cells. Accordingly, it is not to be expected that SCGB3 A2 protein can be detected in body fluids outside the airways in healthy individuals. In contrast, metastatic tumor cells in particular secrete their protein products directly into the bloodstream.
  • One aspect of the invention therefore relates to the detection of SCGB3A2 products in the serum or plasma of patients using a specific antibody test as a diagnostic finding for lung tumors.
  • SEQ ID NO: 105 LLNKVPLPVDKLAPL
  • SEQ ID NO-.106 SEAVKKLLEALSHLV
  • FIG. 21 An SCGB3A2-specific reaction could be demonstrated in immunofluorescence (Fig. 21).
  • Fig. 21A As expected for a secreted protein, there was a distribution of SCGB3A2 in the cell that could be assigned to the endoplasmic reticulum and secretion granules (Fig. 21A).
  • the cells were transfected in parallel with a plasmid that synthesizes an SCGB3A2-GFP fusion protein.
  • the protein was detected here using the autofluorescent GFP (green fluorescent protein) (Fig. 21B).
  • Fig. 21 C An overlay of both fluorescence images clearly shows that the immune serum specifically recognizes SCGB3A2 protein.
  • Such antibodies can be used e.g. in the form of immunoassays for diagnostic as well as therapeutic purposes.
  • Example 4 Identification of Claudin-18A1 and Claudin-18A2 splice variants as diagnostic and therapeutic cancer targets
  • the Claudin-18 gene codes for a surface membrane molecule with 4 transmembrane domains and intracellular N- as well as C-terminus.
  • Niimi and colleagues described two splice variants of mouse and human claudin-18, which are expressed as selective in lung tissue (claudin-18A1) and in stomach tissue (claudin-18A2) have been described. These variants differ in the N-terminus (Fig. 22).
  • the extent to which the splice variants Claudin-18A2 (SEQ ID NO: 7) and Claudin-18A1 (SEQ ID NO: 117) and their respective translation products (SEQ ID NO: 16 and 118) are used as markers or therapeutic target structures for tumors was investigated according to the invention can be.
  • a quantitative PCR which can distinguish between the two variants, was established by selecting AI-specific (SEQ ID NO 109 & 110) or A2-specific (SEQ ID NO 107 & 108) primer pairs.
  • the A2 splice variant was also tested with a second Prime ⁇ aar in a conventional PCR (SEQ ID NO: 39 & 40). It is described for variant AI that it is only active in the normal lungs.
  • variant AI is also active in the gastric mucosa.
  • the stomach and lungs are the only normal tissues that show significant activation. All other normal tissues are negative for Claudin-Al.
  • Claudin-Al is strongly activated in a variety of tumor tissues.
  • a particularly strong expression is found in stomach tumors, lung tumors, pancreatic carcinomas, esophageal carcinomas (Fig. 23), tumors of the ENT area and prostate carcinomas.
  • the expression levels of Claudin-Al in ENT, prostate, pancreatic and esophageal tumors are 100-10000 higher than the levels in the corresponding normal tissues.
  • oligonucleotides were used which specifically enable the amplification of this transcript (SEQ ID NO: 39 & 40 or 107 & 108).
  • the investigation showed that the splice variant A2 is not expressed in any of the more than 20 normal tissues examined except in gastric mucosa and to a small extent also testis tissue.
  • variant A2 is also activated in many tumors (shown as an example in Fig. 24). These include gastric rumors (8/10), pancreatic tumors (6/6), esophageal carcinomas (5/10) and liver carcinomas.
  • the splice variants hereby represent, according to the invention, highly specific molecular markers for tumors of the upper gastrointestinal tract as well as lung tumors, ENT tumors, prostate carcinomas and their metastases. According to the invention, these molecular markers can be used for the detection of tumor cells. According to the invention, the tumors can be detected using the oligonucleotides mentioned (SEQ ID NO. 39, 40, 107-110). Particularly suitable oligonucleotides are prime pairs, of which at least one binds under stringent conditions to a 180 base pair long section of the transcript which is specific for one (SEQ ID NO: 8) or other splice variant (SEQ ID NO: 119).
  • Claudin-specific antibodies or immune sera were generated by immunizing animals.
  • Analysis of the transmembrane domains using bioinformatic tools (TMHMM, TMPRED) and immunofluorescence studies of cells expressing Claudin-18 fusion proteins tagged with enhanced GFP confirmed the plasma membrane localization of Claudin-18 and the protein topology.
  • Claudin 18 has two extracellular domains. The sequence of the N-terminal extracellular domain differs for the two splice variants (SEQ ID NO: 111 for AI and SEQ ID NO: 112 for A2). The C-terminal extracellular domain is identical for both variants (SEQ ID NO: 137).
  • extracellularly located peptide epitopes were selected for the immunization which are specific for variant AI or A2 or occur in both variants. Both variants of claudin-18 have no classic glycosylation motifs and glycosylation of the protein was therefore not to be expected. Nevertheless, when selecting the epitopes, it was taken into account that epitopes that contain asparagine, serine and threonine are in rare cases potentially glycosylated even without classic glycosylation sites. The glycosylation of an epitope can prevent the binding of an antibody specific for this epitope.
  • epitopes were selected so that the antibodies generated therewith allow a differentiation of the glycosylation status of the antigen.
  • the following peptides were selected for the production of antibodies for the immunization: SEQ ID NO: 17: DQWSTQDLYN (N-terminal extracellular domain, A2-specific, binding independent of glycosylation)
  • SEQ ID NO: 18 NNPVTAVFNYQ (N-terminal extracellular domain, A2-specific, binding mainly to unglycosylated form, N37)
  • SEQ ID NO: 113 STQDLYNNPVTAVF (N-terminal extracellular domain, A2-specific, binding only to non-glycosylated form, N37)
  • SEQ ID NO: 114 DMWSTQDLYDNP (N-terminal extracellular domain, AI-specific)
  • SEQ ID NO: 115 CRPYFTILGLPA (N-terminal extracellular domain, mainly specific for A 1)
  • SEQ ID NO: 116 TNFWMSTANMYTG (C-terminal extracellular domain, recognizes both AI and A2).
  • the data for the A2-specific antibody which was produced by immunization with SEQ ID NO: 17, is shown as an example.
  • the specific antibody can be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies.
  • the corresponding protein can be detected in a clearly detectable amount specifically in the gastric carcinoma cell lines typified as positive (Fig. 25).
  • the endogenous protein is membrane-localized and forms larger focal aggregates on the membrane.
  • This antibody was also used for protein detection in the Western blot. As expected, protein is only detected in the stomach and no other normal tissue, not even the lungs (Fig. 29).
  • the A2 variant of Claudin-18 is not detected in the normal lung at the protein level either, it can be found in bronchial carcinomas as in quantitative RT-PCR. Here, too, only the deglycosylated variant is available (Fig. 31).
  • antibodies have been produced which recognize the extracellular domain of the Claudin-18-A2 splice variant.
  • Antibodies were also produced that selectively recognize the N-terminal domain of the splice variant Claudin-18-Al (Fig. 28) or antibodies that bind to both variants in the area of the C-terminal extracellular domain (Fig. 27).
  • such antibodies can be used for diagnostic purposes, for example immunohistology (Fig. 32), but also for therapeutic purposes as explained above.
  • Claudin-18 Another important aspect concerns differential glycosylated domains of Claudin-18.
  • antibodies were produced which bind exclusively to non-glycosylated epitopes.
  • Claudin- 18 itself is a highly selective differentiation antigen from gastric tissue (A2) or from the lungs and stomach (AI). Since it is obviously affected by changes in the glycosylation machinery in tumors, a special variant of A2, which is deglycosylated, arises in tumors. This can be used diagnostically as well as therapeutically.
  • Immune sera such as the one described here (against peptide SEQ ID NO: 17) can be used diagnostically, for example, in Western blot.
  • Antibodies that cannot bind to the glycosylated epitope at all can differentiate between tumor and normal tissue in binding.
  • such antibodies can be used therapeutically because they are highly selective.
  • the antibodies produced can also be used directly for the production of chimeric or humanized recombinant antibodies. This can also be done directly with antibodies obtained from rabbits (see J Biol Chem. 2000 May 5; 275 (18): 13668-76 by Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, Cohen LS, Welt S, Old LJ, Barbas CF 3rd.
  • the rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies.
  • lymphocytes were preserved by the immunized animals.
  • immunotherapeutic methods such as vaccines or amino acids 1-47 (SEQ ID NO: 19 and 120) represent particularly good epitopes for the adoptive transfer of antigen-specific T lymphocytes.
  • Example 5 Identification of SLC13A1 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • SLC13A1 belongs to the family of sodium sulfate cotransporters. In contrast to the mouse homolog of this gene, the human gene is selectively expressed in the kidney (Lee et al., Genomics 70: 354-63). SLC13A1 codes for a protein of 595 amino acids and contains 13 putative transmembrane domains. Alternative splicing creates 4 different transcripts (SEQ ID NO: 41-44) and its corresponding translation products (SEQ ID NO: 45-48). It was investigated whether SLC13A1 can be used as a marker for kidney tumors. For this purpose, oligonucleotides (SEQ ID NO: 49, 50) were used which enable a specific amplification of SLC13A1.
  • RT-PCR investigations with an SLC13Al-specific Prime ⁇ aar confirmed an almost selective expression in the kidney, and according to the invention showed a high expression in almost all (7/8) examined renal cell carcinoma biopsies (Tab. 4, Fig. 6).
  • Quantitative RT-PCR with specific primers also confirm this data (Fig. 34).
  • Weak signals were found in the following normal tissues: colon, stomach, testis, breast, liver and brain. The expression in kidney carcinomas was at least 100 times higher than in all other normal tissues.
  • the SLC 13 AI protein has 13 transmembrane domains and 7 extracellular regions. In particular, these extracellular domains of SLC 13 AI can be used according to the invention as target structures of monoclonal antibodies.
  • SLC 13 AI is involved in the transport of ions as a channel protein. The extracellular domains of SLC 13 AI in the healthy kidney are polar towards the urinary tract (luminal).
  • SLC 13 AI can be used as a vaccine (RNA, DNA, protein, peptides) for inducing tumor-specific immune responses (T and B cell-mediated immune reactions). According to the invention, this also includes the development of so-called “small compounds” which modulate the biological activity of SLC 13 AI and can be used for the therapy of renal tumors.
  • Example 6 Identification of CLCAl as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • CLCAl (SEQ ID NO: 51; translation product: SEQ ID NO: 60) belongs to the family of C ⁇ T-activated Cl " channels. The sequence is published in the gene bank under the accession number NM_001285. CLCAl is only in the intestinal crypt epithelium and expressed in the goblet cells (Gruber et al., Genomics 54: 200-14, 1998) It was investigated whether CLCAl can be used as a marker for colon and gastric carcinoma using oligonucleotides (SEQ ID NO: 67, 68) which enable a specific amplification of CLCAl.
  • RT-PCR investigations with this primer set confirmed a selective expression in the colon, and according to the invention showed a high expression in (3/7) examined colon and (1/3) examined gastric carcinoma.
  • Samples (Fig. 7) The remaining normal tissues showed no or only very weak expression, which was additionally confirmed with a specific quantitative RT-PCR (SEQ ID NO: 125, 126), with no Expr ession could be demonstrated (Fig. 36).
  • SEQ ID NO: 125, 126 quantitative quantitative RT-PCR
  • these extracellular domains of CLCAl can be used according to the invention as target structures of monoclonal antibodies.
  • the pronounced expression and the high incidence of CLCAl for gastric and colon carcinomas make this protein an interesting diagnostic and therapeutic marker according to the invention.
  • this includes the detection of disseminated tumor cells in serum, bone marrow, urine, and the detection of metastases in other organs by means of RT-PCR.
  • the extracellular domains of CLCAl can be used according to the invention as a target structure for immunological diagnosis and therapy using monoclonal antibodies.
  • CLCAl can be tumor-specific as a vaccine (RNA, DNA, protein, peptides) for induction
  • Immune responses (T ⁇ and B-cell mediated immune reactions) are used. According to the invention, this also includes the development of so-called "small compounds” which modulate the biological activity as transport protein of CLCAl and can be used for the therapy of gastrointestinal tumors.
  • Example 7 Identification of FLJ21477 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • FLJ21477 (SEQ ID NO: 52) and its predicted translation product (SEQ ID NO: 61) was listed as a hypothetical protein in the library under accession no. NM_025153 released. It is an integral membrane protein with ATPase activity and 4 transmembrane domains, which is suitable for therapy with specific antibodies.
  • RT-PCR investigations with FLJ21477-specific primers (SEQ ID NO: 69, 70) showed selective expression in the colon, and moreover differently pronounced expression in (7/12) examined colon carcinoma samples (Fig. 8) , The other normal tissues showed no expression. This was additionally confirmed with a specific quantitative RT-PCR (SEQ ID NO: 127, 128). FLJ21477-specific expression was detectable in both colon (Fig.
  • FLJ21477 can be used according to the invention as a target structure for immunodiagnostics and therapy using monoclonal antibodies.
  • FLJ21477 can be mediated as a vaccine (RNA, DNA, protein, peptides) for inducing tumor-specific immune responses (T and B cells)
  • Example 8 Identification of FLJ20694 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • FLJ20694 (SEQ ID NO: 53) and its translation product (SEQ ID NO: 62) were hypothesized as proteins in the library under accession no. NM_017928 released.
  • This protein is an integral transmembrane molecule (transmembrane domain AS 33-54), most likely with thioredoxin function.
  • RT-PCR examinations with FLJ20694-specific primers (SEQ ID NO: 71, 72) showed selective expression in the colon, and moreover differently pronounced expression in (5/9) examined colon carcinoma samples (Fig. 9) , The other normal tissues showed no expression. This was additionally confirmed with a specific quantitative RT-PCR (SEQ ID NO: 129, 130) (Fig. 38).
  • FLJ29694 expression was not found in any other normal tissue except the colon and stomach (not analyzed in the first experiment).
  • a transmembrane domain with an extracellular region is predicted for the protein.
  • these extracellular domains of FLJ20694 can be used according to the invention as target structures of monoclonal antibodies.
  • FLJ20694 can be used as a vaccine (RNA, DNA, protein, peptides) for inducing tumor-specific immune responses (T and B cell-mediated immune reactions). According to the invention, this also includes the development of so-called “small compounds” which modulate the biological activity of FLJ20694 and can be used for the therapy of gastrointestinal tumors.
  • Example 9 Identification of the von Ebner protein (c20orfll4) as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • the Ebner Protein (SEQ ID NO: 54) and its translation product (SEQ ID NO: 63) were identified as Plunc-related proteins of the upper airways and nasopharyngeal epithelium in the gene bank under accession no. AF364078 released. According to the invention, it was investigated whether the Ebner protein can be used as a marker of lung cancer.
  • oligonucleotides SEQ ID NO: 73, 74 were used, which enable a specific amplification of the Ebner protein.
  • RT-PCR studies with this primer set showed selective expression in the lungs and in (5/10) examined Lung carcinoma samples (Fig. 10). Within the group of normal tissues there was also expression in the stomach. The other normal tissues showed no expression.
  • Example 10 Identification of Plunc as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • Plunc (SEQ ID NO: 55) and its translation product (SEQ ID NO: 64) were published in the gene bank under accession no. NM_016583 released.
  • the human plunc codes for a protein of 256 amino acids and has a 72% homology with the murine plunc protein (Bingle and Bingle, Biochim Blophys Acta 1493: 363-7, 2000).
  • Plunc's expression is limited to the trachea, upper airways, nasopharyngeal epithelium and salivary gland.
  • Plunc can be used as a marker of lung cancer.
  • oligonucleotides SEQ ID NO: 75, 76
  • Plunc oligonucleotides
  • RT-PCR tests with this primer set showed selective expression in the thymus, in the lungs and in (6/10) examined lung carcinoma samples (Fig. 11). The other normal tissues showed no expression.
  • Example 11 Identification of SLC26A9 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • SLC26A9 (SEQ ID NO: 56) and its translation product (SEQ ID NO: 65) were published in the gene bank under accession no. NM_134325 released.
  • SLC26A9 belongs to the family of anion exchangers. The expression of SLC26A9 is limited to the bronchiolar and alveolar epithelium of the lungs (Lohi et al., J Biol Chem 277: 14246-54, 2002). It was investigated whether SLC26A9 can be used as a marker for lung cancer. For this purpose, oligonucleotides (SEQ ID NO: 77, 78) were used which enable a specific amplification of SLC26A9.
  • RT-PCR studies with SLC26A9-specific primers showed selective expression in the lungs and in all (13/13) examined lung carcinoma samples (Fig. 12). With the exception of the thyroid gland, the other normal tissues showed no expression.
  • SEQ ID NO. On the one hand, 131 and 132 were able to confirm these results and gain additional knowledge.
  • SLC26A9 is a member of a family of transmembrane anion transporters.
  • the protein In the healthy lungs, the protein is directed luminally in the direction of the airways and is therefore not directly accessible to IgG antibodies from the blood. In contrast, the polarity of the protein in tumors is eliminated. According to the invention, the SLC26A9 can therefore be addressed in the defined tumors, inter alia, lung tumors, gastric carcinomas, pancreatic carcinomas as a therapeutic target by monoclonal antibodies. The pronounced, high expression and high incidence of SLC26A9 for lung, stomach, pancreas and esophageal carcinomas make this protein an excellent diagnostic and therapeutic marker according to the invention.
  • this includes the detection of disseminated tumor cells in serum, bone marrow and urine, and the detection of metastases in other organs by means of RT-PCR.
  • the extracellular domains of SLC26A9 can be used according to the invention as a target structure for immunodiagnostics and therapy using monoclonal antibodies.
  • SLC26A9 can be used as a vaccine (RNA, DNA, protein, peptides) for inducing tumor-specific immune responses (T and B cell-mediated immune reactions).
  • T and B cell-mediated immune reactions tumor-specific immune responses
  • this also includes the development of so-called “small compounds” which modulate the biological activity of SLC26A9 and can be used for the therapy of lung tumors and gastrointestinal tumors.
  • Example 12 Identification of THC1005163 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • THC1005163 (SEQ ID NO: 57) is a gene fragment from the TIGR gene index. The gene is only defined in the 3 'region, while an ORF is missing.
  • RT-PCR studies were carried out with a THC1005163-specific primer (SEQ ID NO: 79) and an Oligo dT ⁇ 8 primer, which had a specific tag of 21 specific bases at the 5 'end. This tag was checked for homology with known sequences using database search programs. This special primer was initially used in cDNA synthesis to rule out genomic DNA contamination. RT-PCR studies with this primer set showed expression in the stomach, ovary, lung and in (5/9) lung carcinoma biopsies (Fig. 13). The other normal tissues showed no expression.
  • Example 13 Identification of LOC134288 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • LOC134288 (SEQ ID NO: 58) and its predicted translation product (SEQ ID NO: 66) 5 were obtained in the gene bank under accession no. XM_059703 released.
  • LOC134288 it was investigated whether LOC134288 can be used as a marker for renal cell carcinoma.
  • oligonucleotides SEQ ID NO: 80, 81
  • RT-PCR studies showed selective expression in the kidney and in (5/8) examined renal cell carcinoma biopsies (Fig. 14).
  • Example 14 Identification of THC943866 as a diagnostic and therapeutic cancer target
  • THC943866 (SEQ ID NO: 59) is a gene fragment from the TIGR gene index. It was examined whether THC943866 can be used as a marker for renal cell carcinoma. For this, oligonucleotides (SEQ ID NO: 82, 83) were used, which enable a specific amplification of THC943866. RT-PCR studies with THC943866-specific primers (SEQ ID NO: 82, 83) 0 showed selective expression in the kidney and in (4/8) examined renal cell carcinoma biopsies (Fig. 15).
  • Example 15 Identification of FLJ21458 as a diagnostic and therapeutic cancer target 5
  • FLJ21458 (SEQ ID NO: 84) and its predicted translation product (SEQ ID NO: 85) were published in the gene bank under accession no. NM_034850 released. Sequence analysis showed that the protein is a new member of the butyrophillin family. Structural analysis showed that it was a type 1 transmembrane protein with an extracellular
  • 0 represents immunoglobulin domain.
  • oligonucleotides SEQ ID NO: 86, 87
  • RT-PCR studies with FLJ21458-specific primers SEQ ID NO: 86, 87
  • a quantitative RT-PCR with specific primers SEQID NO: 133, 134) confirmed this selective expression profile (Fig. 39).
  • FLJ21458 was gastrointestinal-specific in the colon, as well as in the stomach, rectum and appendix and in testis. 7/11 colonic metastasis samples were also positive in the quantitative PCR.
  • the FLJ21458-specific expression was extended to other tumors and protein-specific expression could be detected in stomach, pancreatic and liver tumors (Table 5).
  • To detect FLJ21458 protein antibodies were produced by immunizing rabbits. The following peptides were used to propagate these antibodies: SEQ ID NO: 135: QWQVFGPDKPVQAL SEQ ID NO: 136: AKWKGPQGQDLSTDS
  • a FLJ21458-specific reaction could be demonstrated in immunofluorescence (Fig. 40).
  • 293 cells were transfected with a plasmid which codes for a FLJ21458-GFP fusion protein.
  • the specificity was demonstrated on the one hand by colocalization studies with the FLJ21458-specific antibody, and on the other hand via the autofluorescent GFP.
  • An overlay of both fluorescence images clearly showed that the immune serum specifically recognizes FLJ21458 protein (Fig. 40A).
  • the overexpression of the protein resulted in a diffuse cell staining, which did not allow a clear protein localization.
  • another immunofluorescence experiment was carried out with the gastric tumor-specific cell line Snul6, which expresses FLJ21458 endogenously (Fig. 41B).
  • the cells were covered with the
  • FLJ21458-specific antiserum and stained with another antibody that recognizes the membrane protein E-cadherin.
  • the FLJ21458-specific antibody stains the cell membranes at least weakly and is therefore evidence that FLF21458 is localized in the cell membrane protein.
  • FLJ21458 The pronounced expression and high incidence of FLJ21458 for gastric and colon carcinomas make this protein a highly interesting diagnostic and therapeutic marker according to the invention. According to the invention, this includes the detection of disseminated tumor cells in serum, bone marrow and urine, and the detection of Metastases in other organs using RT-PCR. Furthermore, the extracellular domains of FLJ21458 can be used according to the invention as a target structure for immunodiagnostics and therapy using monoclonal antibodies. Furthermore, according to the invention, FLJ21458 can be used as a vaccine (RNA, DNA, protein, peptides) for inducing tumor-specific immune responses (T and B cell mediated immune reactions). According to the invention, this also includes the development of so-called "small compounds" which modulate the biological activity of FLJ21458 and can be used for the therapy of gastrointestinal tumors.

Abstract

Erfindungsgemäss wurden Tumor-assoziiert exprimierte Genprodukte und die dafür kodierenden Nukleinsäuren identifiziert. Die vorliegende Erfindung betrifft die Therapie und Diagnose von Erkrankungen, bei denen diese Tumor-assoziiert exprimierten Genprodukte aberrant exprimiert werden. Des weiteren betrifft die Erfindung Proteine, Polypeptide und Peptide, die Tumor-assoziiert exprimiert werden und die dafür kodierenden Nukleinsäuren.

Description

Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
Trotz interdisziplinärer Ansätze und Ausreizung klassischer Therapiemodalitäten gehören Krebserl rankungen weiterhin zu den fuhrenden Todesursachen. Neuere therapeutische Konzepte zielen darauf ab, das patienteneigene Immunsystem durch Einsatz von rekombinanten Tumorvakzinen und anderen spezifischen Maßnahmen wie Antikörpertherapie in das therapeutische Gesamtkonzept mit einzubeziehen. Voraussetzung für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Erkennung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen bzw. Epitopen durch das Immunsystem des Patienten, dessen Effektorfunktionen interventionell verstärkt werden sollen. Tumorzellen unterscheiden sich biologisch wesentlich von ihren nichtmalignen Ursprungszellen. Diese Differenzen sind durch während der Tumorentwicklung erworbene genetische Veränderungen bedingt und führen u.a. auch zur der Bildung qualitativ oder quantitativ veränderter molekularer Strukturen in den Krebszellen. Werden solche Tumor-assoziierten Strukturen vom spezifischen Immunsystem des tumortragenden Wirtes erkannt, spricht man von Tumor-assoziierten Antigenen. An der spezifischen Erkennung von Tumor-assoziierten Antigenen sind zelluläre und humorale Mechanismen beteiligt, die zwei miteinander funktionell vernetzte Einheiten darstellen: CD4 und CD8+ T-Lymphozyten erkennen prozessierte Antigene, die auf den Molekülen der MHC- (Major Histocompatibility complex = Histokompatibilitätsantigene) Klassen II bzw. I präsentiert werden, während B-Lymphozyten zirkulierende Antikörpermoleküle produzieren, die direkt an unprozessierte Antigene binden. Die potentielle klinisch-therapeutische Bedeutung von Tumor-assoziierten Antigenen ergibt sich aus der Tatsache, dass die Erkennung von Antigenen auf neoplastischen Zellen durch das Immunsystem zur Initiierung von cytotoxischen Effektormechanismen führt und bei Vorhandensein von T-Helferzellen die Elimination der Krebszellen bewirken kann (Pardoll, Nat. Med. 4:525^31, 1998). Entsprechend ist es eine zentrale Zielsetzung der Tumorimmunologie, diese Strukturen molekular zu definieren. Die molekulare Natur dieser Antigene blieb lange enigmatisch. Erst als entsprechende Kloniemngstechniken entwickelt wurden, gelang es, durch Analyse der Zielstrukturen von cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) (van der Bruggen et al., Science 254:1643-7, 1991) bzw. mit zirkulierenden Autoantikörpern (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9:709-16, 1997) als Sonden cDNA-Expressionsbanken von Tumoren systematisch auf Tumor-assoziierte Antigene zu screenen. Hierzu wurden cDNA-Expressionsbanken aus frischem Tumorgewebe hergestellt und in geeigneten Systemen als Proteine rekombinant exprimiert. Aus Patienten isolierte Immuneffektoren, nämlich CTL-Klone mit Tumorspezifischem Lysemuster oder zirkulierende Autoantikörper, wurden genutzt, um die respektiven Antigene zu klonieren.
Durch diese Ansätze sind in den letzten Jahren eine Vielzahl von Antigenen in verschiedenen Neoplasien definiert worden. Allerdings nutzen die oben dargestellten klassischen Verfahren zur Antigenidentifizierung Irnmuneffektoren (zirkulierende Autoantikörper oder CTL-Klone) aus Patienten mit in der Regel bereits fortgeschrittenem Krebs als Sonden. Aus einer Reihe von Daten geht hervor, dass Tumoren z.B. zur Tolerisierung und Anergisierung von T-Zellen führen können und gerade im Verlauf der Erkrankung diejenigen Spezifitäten aus dem Immuneffektorenrepertoire verloren gehen, die eine effektive Immunerkennung bewirken könnten. Aus laufenden Patientenstudien hat sich noch kein gesicherter Beweis für eine tatsächliche Wirkung der bisher entdeckten und genutzten Tumor-assoziierten Antigene ergeben. Entsprechend kann nicht ausgeschlossen werden, dass spontane Immunantworten evozierende Proteine die falschen Zielstrukturen sind.
Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung Zielstrukturen für eine Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.
Erfindungsgemäß wurde eine Strategie für eine Identifizierung und Bereitstellung Tumorassoziiert expri ierter Antigene und der dafür kodierenden Nukleinsäuren verfolgt. Diese Strategie beruht auf der Tatsache, dass bestimmte Gene, die Organ-spezifisch, z.B. ausschließlich im Kolon-, Lungen- oder Nieren-Gewebe, exprimiert werden, in den entsprechenden Organen auch von Tumorzellen und darüber hinaus in anderen Geweben in Tumorzellen ektop und unerlaubt reaktiviert werden. Durch Datamining wird zunächst eine möglichst komplette Liste aller bekannten Organ-spezifischen Gene aufgestellt und diese sodann durch Expressionsanalysen mittels spezifischer RT-PCR auf ihre aberrante Aktivierung in unterschiedlichen Tumoren evaluiert. Datamining ist ein bekanntes Verfahren zur Identifizierung von Tumor-assoziierten Genen. Bei den herkömmlichen Strategien werden allerdings in der Regel Transkriptome von Normalgewebebanken elektronisch von Tumorgewebsbanken subtrahiert unter der Annahme, dass die verbleibenden Gene Tumor- spezifisch sind (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27:4251-60, 1999; Vasmatzis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95:300-4, 1998; Scheurle et al., Cancer Res. 60:4037-43, 2000). Das erfindungsgemäße Konzept, das sich als viel erfolgreicher erwiesen hat, beruht jedoch darauf, Datamining zur elektronischen Extraktion aller Organ-spezifischer Gene zu nutzen und diese sodann auf Expression in Tumoren zu evaluieren.
Somit betrifft die Erfindung in einem Aspekt eine Strategie zur Identifizierung von Gewebespezifischen und differentiell in Tumoren exprimierten Genen. Diese Strategie kombiniert Datamining von öffentlichen Sequenzbanken ("in silico") mit darauf folgenden evaluierenden labor-experimentellen (" wet bench") Untersuchungen.
Eine kombinierte Strategie basierend auf zwei unterschiedlichen bioinformatischen Skripten ermöglichte erfindungsgemäß die Identifizierung neuer Tumor-Gene. Diese sind bisher als rein Organ-spezifisch eingestuft worden. Die Erkenntnis, dass diese Gene aberrant in Tumorzellen aktiviert werden, erlaubt, ihnen eine substantiell neue Qualität mit funktionellen Implikationen zuzuordnen. Die Identifizierung und Bereitstellung dieser Tumor-assoziierten Gene und der dadurch kodierten Genprodukte erfolgte erfindungsgemäß unabhängig von einer immunogenen Wirkung.
Die erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigene weisen eine Aminosäuresequenz auf, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform weist ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen eine Aminosäuresequenz auf, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119 ausgewählt ist. In einer weiteren bevorzugten Aus irungsform umfasst ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumorassoziiertes Antigen eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 und 135-137, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist. Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von erfmdungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen oder von Teilen oder Derivaten davon, von dafür kodierenden Nukleinsäuren oder von Nukleinsäuren, die gegen die kodierenden Nukleinsäuren gerichtet sind, oder von Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigene oder Teile oder Derivate davon gerichtet sind, für die Therapie und Diagnose. Diese Nutzung kann einzelne, aber auch Kombinationen von mehreren dieser Antigene, funktionalen Fragmente, Nukleinsäuren, Antikörper etc. betreffen, in einer Ausfuhrungsform auch in Kombination mit anderen Tumor-assoziierten Genen und Antigenen für eine Diagnose, Therapie und Verlaufskontrolle.
Bevorzugte Erkrankungen für eine Therapie und oder Diagnose sind solche, bei denen eine selektive Expression oder abnormale Expression von einem oder mehreren der erfmdungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen vorliegt.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren und Genprodukte, die tumorzeilassoziiert exprimiert werden.
Desweiteren betrifft die Erfindung Genprodukte, d.h. Nukleinsäuren und Proteine bzw. Peptide, die durch verändertes Spleißen (Spleißvarianten) bekannter Gene bzw. durch veränderte Translation unter Nutzung alternativer offener Leserahmen entstehen. In diesem Aspekt betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 3-5 des Sequenzprotokolls umfassen. Außerdem betrifft die Erfindung in diesem Aspekt Proteine bzw. Peptide, die eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 10 und 12-14 des Sequenzprotokolls umfassen. Die erfindungsgemäßen Spleißvarianten sind erfindungsgemäß als Targets für die Diagnostik und Therapie von Tumorerkrankungen verwendbar.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 des Sequenzprotokolls, die durch einen erfindungsgemäß identifizierten alternativen offenen Leseraster kodiert wird und sich von der vorbeschriebenen Protein-Sequenz (SEQ ID NO: 9) durch 85 zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus des Proteins unterscheidet Für die Entstehung von Spleißvarianten können verschiedenste Mechanismen ursächlich sein, beispielsweise die Nutzung variabler Transkriptionsinitiationsstellen, die Nutzung zusätzlicher Exons, - das vollständige oder unvollständige Ausspleißen von einzelnen oder mehreren Exons, durch Mutation veränderte Spleißregulatorsequenzen (Deletion bzw. Schaffung neuer
Donor/Acceptorsequenzen), die unvollständige Elimination von Intronsequenzen.
Das veränderte Spleißen eines Gens fuhrt zu einer veränderten Transkriptsequenz (Spleißvariante). Wird eine Spleißvariante im Bereich ihrer veränderten Sequenz translatiert, resultiert ein verändertes Protein, welches sich von dem ursprünglichen in Struktur und Funktion deutlich unterscheiden kann. Bei Tumor-assoziierten Spleißvarianten können Tumor-assoziierte Transkripte und Tumor-assoziierte Proteine/Antigene entstehen. Diese können als molekulare Marker sowohl zum Nachweis von Tumorzellen als auch zum therapeutischen Targeting von Tumoren genutzt werden. Die Detektion von Tumorzellen z.B. im Blut, Serum, Knochenmark, Sputum, Bronchial-Lavage, Körpersekreten und Gewebsbiopsien kann erfindungsgemäß z.B. nach Extraktion von Nukleinsäuren durch PCR- Amplifikation mit Spleißvarianten-spezifischen Oligonukleotiden erfolgen. Als Oligonukleotide eignen sich insbesondere Paare von Primern, von denen mindestens einer unter stringenten Bedingungen an die Region der Spleißvariante bindet, die Tumor-assoziiert ist. Erfindungsgemäß geeignet sind die in den Beispielen für diesen Zweck beschriebenen Oligonukleotide, insbesondere Oligonukleotide, die eine Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 34-36, 39, 40 und 107-110 des Sequenzprotokolls aufweisen bzw. umfassen. Zum Nachweis eignen sich erfmdungsgemäß alle Sequenz-abhängigen Detektionssysteme. Neben der PCR sind diese z.B. Genchip-ZMicroarray Systeme, Northern-Blot, RNAse protection assays (RDA) und andere. Allen Detektionssystemen ist gemeinsam, dass die Detektion auf einer spezifischen Hybridisierung mit mindestens einer Spleißvarianten-spezifϊschen Nukleinsäuresequenz basiert. Die Detektion von Tumorzellen kann jedoch auch erfindungsgemäß durch Antikörper erfolgen, die ein durch die Spleißvariante kodiertes spezifisches Epitop erkennen. Für die Herstellung der Antikörper können Peptide zur Immunisierung verwendet werden, die für diese Spleißvariante spezifisch sind. In diesem Aspekt betrifft die Erfindung insbesondere Peptide, die eine Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 17-19, 111-115, 120 und 137 des Sequenzprotokolls aufweisen bzw. umfassen und dagegen gerichtete spezifische Antikörper. Für die Immunisierung eignen sich besonders die Aminosäuren, die deutliche Epitopunterschiede zu der (den) Variante(n) des Genprodukts aufweisen, welche(s) bevorzugt in gesunden Zellen gebildet wird (werden). Der Nachweis der Tumorzellen mit Antikörpern kann dabei an einer vom Patienten isolierten Probe oder als Imaging mit intravenös applizierten Antikörpern erfolgen. Neben der diagnostischen Nutzbarkeit stellen Spleißvarianten, die neue oder veränderte Epitope aufweisen, attraktive Targets für die Immuntherapie dar. Die erfindungsgemäßen Epitope können zum Targeting von therapeutisch wirksamen monoklonalen Antikörpern oder T-Lymphozyten genutzt werden. Bei der passiven Immuntherapie werden hierbei Antikörper oder T-Lymphozyten adoptiv transferriert, die Spleißvarianten-spezifische Epitope erkennen. Die Generierung von Antikörpern kann wie bei anderen Antigenen auch unter Nutzung von Standardtechnologien (Immunisierung von Tieren, Panningstrategien zur Isolation von rekombinanten Antikörpern) unter Nutzung von Polypeptiden, die diese Epitope beinhalten, erfolgen. Alternativ können zur Immuriisierung Nukleinsäuren genutzt werden, die für Oligo- oder Polypeptide kodieren, die diese Epitope beinhalten. Verschiedene Techniken zur in vitro oder in vivo Generierung von epitopspezifischen T-Lymphozyten sind bekannt und ausführlich beschrieben ( vgl. z.B. Kessler JH, et al. 2001, Sahin et al., 1997) und basieren ebenfalls auf der Nutzung von Oligo- oder Polypeptiden, die die Spleißvarianten-spezifischen Epitope beinhalten oder Nukleinsäuren, die für diese kodieren. Oligo- oder Polypeptiden, die die Spleißvarianten- spezifischen Epitope beinhalten, oder Nukleinsäuren, die für diese Polypeptide kodieren, sind auch als pharmazeutisch wirksame Substanzen bei der aktiven Immuntherapie (Vakzinierung, Vakzintherapie) verwendbar.
Erfindungsgemäß werden auch Proteine beschrieben, die sich durch Art und Menge ihrer sekundären Modifikationen in Normal- und Tumorgewebe unterscheiden (z.B. Durand & Seta, 2000; Clin. Chem. 46: 795-805; Hakomori, 1996; Cancer Res. 56: 5309-18).
Die Analyse von Proteinmodifikationen kann im Western-Blot erfolgen. Vor allem Glykosylierungen, die in der Regel eine Größe von mehreren kDa haben, führen zu einer größeren Gesamtmasse des Zielproteins, die sich in der SDS-PAGE auftrennen lässt. Zum Nachweis von spezifischen O- und N-glycosidischen Bindungen werden Proteinlysate vor der Denaturierung durch SDS mit O- oder N-Glykosylasen inkubiert (nach Angaben des jeweiligen Herstellers, z.B. PNgase, Endoglykosidase F, Endoglykosidase H, Röche Diagnostics). Anschließend erfolgt ein Western-Blot. Bei Verringerung der Größe eines Zielproteins kann so nach Inkubation mit einer Glykosidase eine spezifische Glykosylierung nachgewiesen und auf diesem Weg auch die Tumorspezifität einer Modifikation analysiert werden. Von besonderem Interesse sind Proteinbereiche, die in Tumorzellen und gesunden Zellen differe ziell glykosyliert sind. Derartige Glykosylierungsunterschiede sind jedoch bisher für wenige Zeiloberflächenproteine (z.B. Mucl) beschrieben.
Erfindungsgemäß konnte für Claudin-18 eine differentielle Glykosylierung in Tumoren nachgewiesen werden. Gastrointestinale Karzinome, Pankreaskarzinome, Ösophagustumoren, Prostatatumoren als auch Lungentumoren weisen eine weniger glykosylierte Form von Claudin-18 auf. Die Glykosylierung in gesunden Geweben maskiert Proteinepitope von Claudin-18, die auf Tumorzellen aufgrund fehlender Glykosylierung freigelegt sind. Entsprechend lassen sich erfindungsgemäß Liganden und Antikörper selektieren, die an diese Domänen binden. Derartige Liganden und Antikörper binden erfmdungsgemäß nicht an das Claudin-18 auf gesunden Zellen, da hier die Epitope durch die Glykosylierung verdeckt sind.
Ähnlich wie oben für von Tumor-assoziierten Spleiß Varianten abgeleitete Proteinepitope beschrieben kann somit die differenzielle Glycosylierung zur Unterscheidung von Normal- und Tumorzellen mit diagnostischer wie auch therapeutischer Intention genutzt werden.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Mittel, das das erfindungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen erkennt und vorzugsweise selektiv für Zellen ist, die eine Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens aufweisen. Das Mittel kann in bestimmten Ausfuhrungsformen die Induktion des Zelltods, die Reduktion des Zellwachstums, die Schädigung der Zellmembran oder die Sekretion von Zytokinen bewirken und weist vorzugsweise eine tumorhemmende Aktivität auf. In einer Ausfuhrungsform ist das Mittel eine Antisense-Nukleinsäure, die selektiv mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet, insbesondere ein komplementaktivierter oder Toxin-konjugierter Antikörper, der selektiv an das Tumorassoziierte Antigen bindet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Mittel mehrere Mittel, die jeweils selektiv verschiedene Tumor-assoziierte Antigene erkennen, wobei mindestens eines der Tumor-assoziierten Antigene ein erfmdungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen ist. Die Erkennung muss nicht direkt mit einer Hemmung von Aktivität oder Expression des Antigens einhergehen. In diesem Aspekt der Erfindung dient das selektiv auf Tumoren beschränkte Antigen vorzugsweise als Markierung zur Rekrutierung von Effektormechanismen an diesen spezifischen Ort. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist das Mittel ein cytotoxischer T-Lymphozyt, der das Antigen auf einem HLA-Molekül erkennt und die derartig markierte Zellen lysiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet und somit natürliche oder artifizielle Effektormechanismen zu dieser Zelle rekrutiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein T-Helfer-Lymphozyt, der Effektorfunktionen von anderen Zellen, die spezifisch dieses Antigen erkennen, stärkt.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Mittel, das die Expression oder Aktivität eines erfindungsgemäß identifizierten Tumorassoziierten Antigens hemmt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel eine Antisense-Nukleinsäure, die selektiv mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für das Tumor- assoziierte Antigen kodiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Mittel mehrere Mittel, die jeweils selektiv die Expression oder Aktivität verschiedener Tumor-assoziierter Antigene hemmen, wobei mindestens eines der Tumorassoziierten Antigene ein erfmdungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen ist.
Des weiteren betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Mittel umfasst, das bei einer Verabreichung selektiv die Menge an Komplexen zwischen einem HLA-Molekül und einem Peptidepitop aus dem erfindungsgemäß identifizierten Tumorassoziierten Antigen erhöht. Das Mittel umfasst in einer Ausführungsform einen oder mehrere Bestandteile, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus (i) dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon, (ii) einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und (iv) isolierten Komplexen zwischen Peptidepitopen aus dem Tumor-assoziierten Antigen und einem MHC-Molekül. In einer Ausfuhrungsform umfasst das Mittel mehrere Mittel, die jeweils selektiv die Menge an Komplexen zwischen MHC- Molekülen und Peptidepitopen verschiedener Tumor-assoziierter Antigene erhöhen, wobei mindestens eines der Tumor-assoziierten Antigene ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen ist. Des weiteren betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrer Bestandteile umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus (i) einem erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon, (ii) einer Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einem Antikörper, der an ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon bindet, (iv) einer Antisense-Nukleinsäure, die spezifisch mit einer Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumorassoziiertes Antigen kodiert, hybridisiert, (v) einer Wirtszelle, die ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und (vi) isolierten Komplexen zwischen einem erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem HLA-Molekül.
Eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodiert, kann in der pharmazeutische Zusammensetzung in einem Expressionsvektor vorliegen und funktionell mit einem Promotor verbunden sein.
Eine in einer erfmdungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Wirtszelle kann das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon sekretieren, auf der Oberfläche exprimieren oder kann zusätzlich ein HLA-Molekül exprimieren, das an das Tumor- assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet. In einer Ausfuhrungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül endogen. In einer weiteren Ausfuhrungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül und/oder das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht-proliferativ. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.
Ein in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltener Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein. In weiteren Ausfuhrungsformen ist der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper, ein Fragment eines natürlichen Antikörpers, oder ein synthetischer Antikörper, die alle durch kombinatorische Techniken hergestellt werden können. Der Antikörper kann mit einem therapeutisch oder diagnostisch nützlichen Mittel oder Stoff gekoppelt sein. Eine in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Antisense- Nukleinsäure kann eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10-30, 15-30 oder 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das erfindungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfassen.
In weiteren Ausführungsformen bindet ein durch eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung entweder direkt oder durch die Expression einer Nukleinsäure bereitgestelltes Tumor-assoziiertes Antigen oder ein Teil davon an MHC-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen, wobei die Bindung vorzugsweise eine cytolytische Reaktion hervorruft und/oder eine Cytokinausschüttung induziert.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Adjuvans umfassen. Das Adjuvans kann aus Saponin, GM- CSF, CpG-Nukleotiden, RNA, einem Cytokin oder einem Chemokin ausgewählt sein. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise zur Behandlung einer Erkrankung eingesetzt, die sich durch die selektive Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Erkrankung Krebs.
Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung oder Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines oder mehrerer Tumor-assoziierter Antigene auszeichnet. In einer Ausfuhrungsform umfasst die Behandlung die Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet. Das Verfahren umfasst den Nachweis (i) einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon und/oder (ii) den Nachweis des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, und/oder (iii) den Nachweis eines Antikörpers gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon und/oder (iv) den Nachweis von cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon spezifisch sind in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe. In bestimmten Ausfuhrungsformen umfasst der Nachweis (i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an die Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder den Teil davon, an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon, an den Antikörper oder an cytotoxische oder Helfer-T-Lymphozyten, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder Teile davon spezifisch sind, bindet und (ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und der Nukleinsäure oder dem Teil davon, dem Tumor-assoziierten Antigen oder dem Teil davon, dem Antikörper oder den cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten. In einer Ausfuhrungsform zeichnet sich die Erkrankung durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene aus und der Nachweis umfasst einen Nachweis mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumor- assoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon, den Nachweis der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon, den Nachweis mehrerer Antikörper, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden oder den Nachweis mehrerer cytotoxischer oder Helfer-T-Lymphozyten, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene spezifisch sind. In einer weiteren Ausfuhrungsform wird die isolierte biologische Probe aus dem Patienten mit einer vergleichbaren normalen biologischen Probe verglichen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Regression, des Verlaufs oder des Ausbruchs einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Überwachung einer Probe aus einem Patienten, der die Erkrankung aufweist oder in Verdacht steht, an der Erkrankung zu erkranken in Bezug auf einen oder mehrere Parameter, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus (i) der Menge der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teil davon, (ii) der Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, (iii) der Menge an Antikörpern, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und (iv) der Menge an cytolytischen T-Zellen oder Helfer-T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-Molekül spezifisch sind. Vorzugsweise umfasst das Verfahren die Bestimmung des oder der Parameter zu einem ersten Zeitpunkt in einer ersten Probe und zu einem zweiten Zeitpunkt in einer weiteren Probe, wobei durch einen Vergleich der beiden Proben der Verlauf der Erkrankung ermittelt wird. In bestimmten Ausführungsformen zeichnet sich die Erkrankung durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene aus und die Überwachung umfasst eine Überwachung (i) der Menge mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon und/oder (ii) der Menge der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon und/oder (iii) der Menge mehrerer Antikörper, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden, und/oder (iv) der Menge mehrerer cytolytischer T-Zellen oder Helfer-T-Zellen, die für Komplexe zwischen den mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigenen oder von Teilen davon und MHC- Molekülen spezifisch sind.
Ein Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Teils davon oder eine Überwachung der Menge einer Nukleinsäure oder eines Teils davon kann erfindungsgemäß mit einer Polynukleotid- Sonde erfolgen, die spezifisch mit der Nukleinsäure oder dem Teil davon hybridisiert, oder kann durch selektive Amplifikation der Nukleinsäure oder des Teils davon erfolgen. In einer Ausfuhrungsform umfasst die Polynukleotid-Sonde eine .Sequenz von 6-50, insbesondere 10- 30, 15-30 oder 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure.
In bestimmten Ausfuhrungsformen liegt das nachzuweisende Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon intrazellulär oder auf der Zelloberfläche vor. Ein Nachweis eines Tumorassoziierten Antigens oder eines Teils davon oder eine Überwachung der Menge eines Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon kann erfindungsgemäß mit einem Antikörper erfolgen, der spezifisch an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.
In weiteren Ausführungsformen liegt das nachzuweisende Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon in einem Komplex mit einem MHC -Molekül, insbesondere einem HLA- Molekül vor.
Ein Nachweis eines Antikörpers oder die Überwachung der Menge an Antikörpern kann erfindungsgemäß mit einem Protein oder Peptid erfolgen, das spezifisch an den Antikörper bindet.
Ein Nachweis von cytolytischen T-Zellen oder Helfer-T-Zellen oder die Überwachung der Menge an cytolytischen T-Zellen oder Helfer-T-Zellen, die für Komplexe zwischen einem Antigen oder einem Teil davon und MHC-Molekülen spezifisch sind, kann erfindungsgemäß mit einer Zelle erfolgen, die den Komplex zwischen dem Antigen oder dem Teil davon und einem MHC-Molekül präsentiert.
Die für einen Nachweis oder für eine Überwachung verwendete Polynukleotid-Sonde, der Antikörper, das Protein oder Peptid oder die Zelle sind vorzugsweise nachweisbar markiert. In bestimmten Ausfuhrungsformen ist der nachweisbare Marker ein radioaktiver Marker oder ein Enzymmarker. Der Nachweis von T-Lymphozyten kann zusätzlich durch Nachweis ihrer Proliferation, ihrer Zytokinproduktion, sowie ihrer cytotoxischen Aktivität erfolgen, die durch die spezifische Stimulation mit dem Komplex aus MHC und Tumor-assoziiertem Antigen oder Teilen davon ausgelöst wird. Der Nachweis von T-Lymphozyten kann ferner durch ein rekombinantes MHC-Molekül oder auch einen Komplex aus mehreren MHC-Molekülen, die mit dem jeweiligen immunogenen Fragment aus einem oder mehreren der Tumor-assoziierten Antigene beladen sind, und durch Kontaktierung des spezifischen T-Zell-Rezeptors erfolgen, wodurch spezifische T-Lymphozyten identifiziert werden können.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung, Diagnose oder Überwachung einer Erkrankung, die sich durch . die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Verabreichung eines Antikörpers, der an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet und mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel oder Stoff gekoppelt ist. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein. In weiteren Ausfuhrungsformen ist der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper oder ein Fragment eines natürlichen Antikörpers.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend (i) die Entfernung einer Probe mit immunreaktiven Zellen aus dem Patienten, (ii) die Kontaktierung der Probe mit einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, unter Bedingungen, die eine Produktion cytolytischer T-Zellen gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon begünstigen, und (iii) das Einbringen der cytolytischen T- Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, Zellen zu lysieren, die das Tumorassoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Klonierung des T-Zell-Rezeptors von cytolytischen T-Zellen gegen das Tumor-assoziierte Antigen. Dieser kann in andere T-Zellen transferiert werden, die damit die erwünschte Spezifität erhalten und wie unter (iii) in den Patienten eingebracht werden können.
In einer Ausfuhrungsform exprimiert die Wirtszelle ein HLA-Molekül endogen. In einer weiteren Ausf hrungsform exprimiert die Wirtszelle ein HLA-Molekül und/oder das Tumorassoziierte Antigen oder den Teil davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht- proliferativ. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Wirtszelle eine Antigen- präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumorassoziierten Antigens auszeichnet, umfassend (i) die Identifizierung einer für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen kodierenden Nukleinsäure, die von Zellen exprimiert wird, die mit der Erkrankung assoziiert sind, (ii) die Transfektion einer Wirtszelle mit der Nukleinsäure oder einem Teil davon, (iii) die Kultivierung der transfizierten Wirtszelle für eine Expression der Nukleinsäure (dies ist bei Erreichen einer hohen Transfektionsrate nicht obligat), und (iv) das Einbringen der Wirtszellen oder eines Extrakts davon in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, die Immunreaktion gegen die Zellen des Patienten, die mit der Erkrankung assoziiert sind, zu erhöhen. Das Verfahren kann ferner die Identifizierung eines MHC-Moleküls, das das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert, umfassen, wobei die Wirtszelle das identifizierte MHC-Molekül exprimiert und das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert. Die Immunreaktion kann eine B-Zellen-Reaktion oder eine T-Zellen-Reaktion umfassen. Des weiteren kann eine T-Zellen-Reaktion die Produktion von cytolytischen T-Zellen und/oder Helfer-T-Zellen umfassen, die spezifisch für die Wirtszellen sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentieren oder spezifisch für Zellen des Patienten sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumorassoziierten Antigens auszeichnet, umfassend (i) die Identifikation von Zellen aus dem Patienten, die abnormale Mengen des Tumor-assoziierten Antigens exprimieren, (ii) die Isolierung einer Probe der Zellen, (iii) die Kultivierung der Zellen und (iv) das Einbringen der Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, eine Immunreaktion gegen die Zellen auszulösen.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäß verwendeten Wirtszellen nicht-proliferativ oder werden nicht-proliferativ gemacht. Eine Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, ist insbesondere Krebs.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3-5, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, die für ein Protein oder Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 10 und 12-14, einem Teil oder Derivat davon.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Promotorsequenzen von erfmdungsgemäßen Nukleinsäuren. Diese können funktionell mit einem anderen Gen vorzugsweise in einem Expressionsvektor verbunden werden und somit die selektive Expression dieses Gens in entsprechenden Zellen gewährleisten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, insbesondere DNA- oder RNA-Molekül, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst, enthalten.
Die Wirtszelle kann ferner eine Nukleinsäure umfassen, die für ein HLA-Molekül kodiert. In einer Ausfuhrungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül endogen. In einer weiteren Ausfuhrungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül und/oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen Teil davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht-proliferativ. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.
In einer weiteren Ausf hrungsform betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die mit einer erfindungsgemäß identifizierten Nukleinsäure hybridisieren und als genetische Sonden oder als "Antisense"-Moleküle verwendet werden können. Nukleinsäuremoleküle in der Form von Oligonukleotid-Primern oder kompetenten Proben, die mit einer erfindungsgemäß identifizierten Nukleinsäure oder Teilen davon hybridisieren, können zum Auffinden von Nukleinsäuren verwendet werden, die zu der erfmdungsgemäß identifizierten Nukleinsäure homolog sind. PCR-Amplifikation, Southern- und Northern-Hybridisierung können zum Auffinden homologer Nukleinsäuren eingesetzt werden. Die Hybridisierung kann unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch-stringenten Bedingungen erfolgen. Der Begriff „stringente Bedingungen" betrifft erfindungsgemäß Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Protein, Polypeptid oder Peptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3-5, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung ein Protein oder Polypeptid oder Peptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 10 und 12-14, einem Teil oder Derivat davon.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein immunogenes Fragment eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens. Das Fragment bindet vorzugsweise an einen menschlichen HLA-Rezeptor oder menschlichen Antikörper. Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemäßes Fragment eine Sequenz von mindestens 6, insbesondere mindestens 8, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30 oder mindestens 50 Aminosäuren. In diesem Aspekt betrifft die Erfindung insbesondere ein Peptid, das eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111- 116, 120, 123, 124 und 135-137, einem Teil oder Derivat davon aufweist oder umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Mittel, das an ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder an einen Teil davon bindet. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist das Mittel ein Antikörper. In weiteren Ausfuhrungsformen ist der Antikörper ein chimärer, ein humanisierter oder mit kombinatorischen Techniken hergestellter Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers. Des weiteren betrifft die Erfindung einen Antikörper, der selektiv an einen Komplex aus (i) einem erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und (ii) einem MHC- Molekül bindet, an das das erfindungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon bindet, wobei der Antiköper nicht alleine an (i) oder (ii) bindet. Ein erfindungsgemäßer Antiköφer kann ein monoklonaler Antikörper sein. In weiteren Ausführungsformen ist der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper oder ein Fragment eines natürlichen Antikörpers.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein solches Mittel, insbesondere einen Antikörper, das/der spezifisch an ein Peptid bindet, das eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124 und 135-137, einem Teil oder Derivat davon aufweist oder umfasst.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Konjugat zwischen einem erfindungsgemäßen Mittel, das an ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder an einen Teil davon bindet, oder einem erfindungsgemäßen Antiköφer und einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel oder Stoff. In einer Ausfuhrungsform ist das therapeutische oder diagnostische Mittel ein Toxin.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zum Nachweis der Expression oder abnormalen Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens, umfassend Mittel zum Nachweis (i) der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon, (ii) des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, (iii) von Antiköφern, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und/oder (iv) von T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-Molekül spezifisch sind. In einer Ausfuhrungsform sind die Mittel zum Nachweis der Nukleinsäure oder des Teils davon Nukleinsäuremoleküle für die selektive Amplifikation der Nukleinsäure, die insbesondere eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10-30, 15-30 oder 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure umfassen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden Gene beschrieben, die in Tumorzellen selektiv exprimiert oder aberrant exprimiert werden und Tumor-assoziierte Antigene darstellen.
Erfindungsgemäß sind diese Gene und/oder deren Genprodukte und/oder ihre Derivate und/oder Teile bevorzugte Zielstrukturen für therapeutische Ansätze. Konzeptionell können die therapeutischen Ansätze auf eine Hemmung der Aktivität des selektiv exprimierten Tumor-assoziierten Genproduktes zielen. Dies ist dann sinnvoll, wenn die aberrante respektive selektive Expression funktioneil von tumoφathogenetischer Bedeutung ist und ihre Unterbindung mit einer selektiven Schädigung der entsprechenden Zellen einhergeht. Andere therapeutische Konzepte betrachten Tumor-assoziierte Antigene als Markierungen, die Effektormechanismen mit zellschädigendem Potential selektiv zu Tumorzellen rekrutieren. Hierbei ist die Funktion des Zielmoleküls selbst und seine Rolle bei der Tumorentstehung vollkommen unerheblich.
Mit "Derivat" einer Nukleinsäure ist erfindungsgemäß gemeint, dass einzelne oder multiple Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen in der Nukleinsäure vorliegen. Weiterhin umfasst der Begriff „Derivat" auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Nukleotidbase, am Zucker oder am Phosphat. Der Begriff „Derivat" umfasst auch Nukleinsäuren, die nicht in der Natur vorkommende Nukleotide und Nukleotidanaloga enthalten.
Eine Nukleinsäure ist erfindungsgemäß vorzugsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA). Nukleinsäuren umfassen erfindungsgemäß genomische DNA, cDNA, rnRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte Moleküle. Eine Nukleinsäure kann erfindungs gemäß als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen. Die erfindungsgemäß beschriebenen Nukleinsäuren sind vorzugsweise isoliert. Der Begriff "isolierte Nukleinsäure" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifiziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung produziert wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gelelektrophoretische Auftrennung, oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die für eine Manipulierung durch rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung steht.
Eine Nukleinsäure ist dann zu einer anderen Nukleinsäure „komplementär", wenn die beiden Sequenzen miteinander hybridisieren und ein stabiles Duplex eingehen können, wobei die
Hybridisierung vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben (stringente Bedingungen). Stringente Bedingungen sind beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Hrsg., 2.
Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc.,
New York beschrieben und betreffen beispielsweise die Hybridisierung bei 65°C in
Hybridisierungspuffer (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02%
Rinderserumalbumin, 2,5mM NaH2PO4 (pH7), 0,5% SDS, 2mM EDTA). SSC ist 0,15 M
Natriumchlorid/ 0,15 M Natriumeitrat, pH 7. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf die die DNA übertragen wurde beispielsweise in 2 x SSC bei Raumtemperatur und sodann in
0,1 - 0,5 x SSC/ 0,1 x SDS bei Temperaturen bis 68°C gewaschen.
Komplementäre Nukleinsäuren weisen erfindungsgemäß mindestens 40%, insbesondere mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität der Nukleotide auf.
Nukleinsäuren, die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, können erfindungsgemäß alleine oder in Kombination mit anderen Nukleinsäuren, insbesondere heterologen Nukleinsäuren, vorliegen. In bevorzugten Ausführungsformen liegt eine Nukleinsäure funktioneil in Verbindung mit Expressionskontrollsequenzen oder regulatorischen Sequenzen vor, die in Bezug zu der Nukleinsäure homolog oder heterolog sein können. Eine kodierende Sequenz und eine regulatorische Sequenz sind dann "funktionell" miteinander verbunden, falls sie derart kovalent miteinander verknüpft sind, dass die Expression oder Transkription der kodierenden Sequenz unter der Kontrolle oder unter dem Einfluss der regulatorischen Sequenz steht. Falls die kodierende . Sequenz in ein funktionelles Protein translatiert werden soll, führt bei einer funktionellen Verbindung einer regulatorischen Sequenz mit der kodierenden Sequenz eine Induktion der regulatorischen Sequenz zu einer Transkription der kodierenden Sequenz, ohne dass es zu einer Leserasterverschiebung in der kodierenden Sequenz oder zu einem Unvermögen der kodierenden Sequenz kommt, in das gewünschte Protein oder Peptid translatiert zu werden.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" oder „regulatorische Sequenz" umfasst erfindungsgemäß Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente, die die Expression eines Gens steuern. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die
Expressionskontrollsequenzen regulierbar. Die genaue Struktur von regulatorischen
Sequenzen kann speziesabhängig oder zelltypusabhängig variieren, umfasst jedoch im allgemeinen 5'-nicht-transkribierte und 5'-nicht-translatierte Sequenzen, die an der Initiation der Transkription bzw. Translation beteiligt sind wie TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-
Sequenz und ähnliches. Insbesondere umfassen 5'-nicht-transkribierte Regulationssequenzen eine Promotorregion, die eine Promotorsequenz für eine transkriptioneile Kontrolle des funktionell verbundenen Gens einschließt. Regulatorische Sequenzen können auch Enhancer-
Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen umfassen.
Zum einen können also die hier dargestellten Tumor-assoziierten Antigene mit beliebigen Expressionskontrollsequenzen und Promotoren kombiniert werden. Zum anderen aber können erfindungsgemäß die Promotoren der hier dargestellten Tumor-assoziierten Genprodukte mit beliebigen anderen Genen kombiniert werden. Dies erlaubt, die selektive Aktivität dieser Promotoren zu nutzen.
Des weiteren kann eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Sekretion des durch die Nukleinsäure kodierten Proteins oder Polypeptids aus einer Wirtszelle steuert. Auch kann eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Verankerung des kodierten Proteins oder Polypeptids auf der Zellmembran der Wirtszelle oder seine Kompartimentalisierung in bestimmte Organellen dieser Zelle herbeiführt. Gleichermaßen kann eine Verbindung mit einer Nukleinsäure erfolgen, die ein Reportergen oder einen beliebigen „Tag" darstellt. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist ein rekombinantes DNA-Molekül erfindungsgemäß ein Vektor, gegebenenfalls mit einem Promotor, der die Expression einer Nukleinsäure, z.B. einer Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäßes Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, steuert. Der Begriff "Vektor" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst jegliche intermediären Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z.B. ermöglichen, die Nukleinsäure in prokaryotische und oder in eukaryotische Zellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert. Ein intermediäres Vehikel kann z.B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuss, bei der liposomalen Verabreichung, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA- Viren angepasst sein. Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide oder Virusgenome.
Die Nukleinsäuren, die für ein erfmdungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen kodieren, können für eine Transfektion von Wirtszellen eingesetzt werden. Mit Nukleinsäuren ist dabei sowohl rekombinante DNA wie auch RNA gemeint. Rekombinante RNA kann durch in vitro-Transkription von einer DNA-Matritze hergestellt werden. Sie kann des weiteren vor Applikation durch stabilisierende Sequenzen, Capping und Poly-Adenylierung modifiziert werden.
Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede Zelle, die mit einer exogenen
Nukleinsäure transformierbar oder transfizierbar ist. Der Begriff „Wirtszellen" umfasst erfindungsgemäß prokaryontische (z.B. E. coli) oder eukaryontische (z.B. dendritische Zellen, B-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen, K562-Zellen, Hefezellen und Insektenzellen). Besonders bevorzugt sind Säugerzellen wie Zellen aus Mensch, Maus, Hamster, Schwein, Ziege, Primaten. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Gewebetypen abgeleitet sein und umfassen primäre Zellen und Zelllinien. Spezifische Beispiele umfassen Keratinozyten, periphere Blutleukozyten, Stammzellen des Knochenmarks und embryonale Stammzellen. In weiteren Ausfunrungsformen ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage. Eine Nukleinsäure kann in der Wirtszelle in einer einzigen oder in mehreren Kopien vorliegen und wird in einer
Ausfuhrungsform in der Wirtszelle exprimiert.
Der Begriff "Expression" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Protein. Er umfasst auch eine teilweise Expression von Nukleinsäuren. Des weiteren kann die Expression transient oder stabil erfolgen. Bevorzugte Expressionssysteme in Säugerzellen umfassen pcDNA3.1 und pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), die einen selektierbaren Marker enthalten wie ein Gen, das eine Resistenz gegenüber G418 verleiht (und somit eine Selektion stabil transfizierter Zelllinien ermöglicht) und die Enhancer-Promotor-Sequenzen von Cytomegalovirus (CMV).
In den Fällen der Erfindung, in denen ein HLA-Molekül ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon präsentiert, kann ein Expressionsvektor auch eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für das HLA-Molekül kodiert. Die Nukleinsäuresequenz, die für das HLA- Molekül kodiert, kann auf demselben Expressionsvektor wie die Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon kodiert, vorliegen oder beide Nukleinsäuren können auf verschiedenen Expressionsvektoren vorliegen. Im letzteren Fall können die beiden Expressionsvektoren in eine Zelle cotransfiziert werden. Falls eine Wirtszelle weder das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon noch das HLA-Molekül exprimiert, werden beide dafür kodierenden Nukleinsäuren entweder auf demselben Expressionsvektor oder auf verschiedenen Expressionsvektoren in die Zelle transfiziert. Falls die Zelle bereits das HLA- Molekül exprimiert, kann nur die Nukleinsäuresequenz, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon kodiert, in die Zelle transfiziert werden.
Erfindungsgemäß umfasst sind Kits zur Amplifikation einer Nukleinsäure, die für ein Tumorassoziiertes Antigen kodiert. Solche Kits umfassen beispielsweise ein Paar von Amplifikationsprimern, die an die Nukleinsäure hybridisieren, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert. Die Primer umfassen vorzugsweise eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10- 30, 15-30 oder 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure und sind nicht- überlappend, um die Bildung von Primer-Dimeren zu vermeiden. Einer der Primer wird an einen Strang der Nukleinsäure hybridisieren, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, und der andere Primer wird an den komplementären Strang in einer Anordnung hybridisieren, die eine Amplifikation der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, erlaubt.
"Antisense"-Moleküle oder „Antisense"-Nukleinsäuren können zur Regulierung, insbesondere der Reduktion der Expression einer Nukleinsäure verwendet werden. Der Begriff "Antisense-Molekül" oder "Antisense-Nukleinsäure" betrifft erfindungsgemäß ein Oligonukleotid, das ein Oligoribonukleotid, Oligodesoxyribonukleotid, modifiziertes Oligoribonukleotid oder modifiziertes Oligodesoxyribonukleotid ist und das unter physiologischen Bedingungen an DNA, die ein bestimmtes Gen umfasst, oder RNA dieses Gens hybridisiert, wodurch die Transkription dieses Gens und/oder die Translation dieser mRNA gehemmt wird. Ein "Antisense-Molekül" umfasst erfindungsgemäß auch ein Konstrukt, das eine Nukleinsäure oder einen Teil davon in reverser Orientierung in Bezug auf ihren natürlichen Promotor enthält. Ein Antisense-Transkript einer Nukleinsäure oder eines Teils davon kann eine Duplex mit der natürlich vorkommenden mRNA, die das Enzym spezifiziert, eingehen und so eine Akkumulation von oder die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindern. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Ribozymen zur Inaktivierung einer Nukleinsäure. Bevorzugte erfindungsgemäße Antisense-Oligonukleotide weisen eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10-30, 15-30 oder 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Ziel-Nukleinsäure auf und sind vorzugsweise vollständig zu der Ziel- Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär.
In bevorzugten Ausführungsformen hybridisiert das Antisense-Oligonukleotid mit einer N- terminalen oder 5'-stromaufwärts gelegenen Stelle wie einer Translationsinitiations-, Transkriptionsinitiations- oder Promotorstelle. In weiteren Ausfuhrungsformen hybridisiert das Antisense-Oligonukleotid mit einer 3'-nicht-translafierten Region oder mRNA-Splicing- Stelle.
In einer Ausfuhrungsform besteht ein erfindungs gemäßes Oligonukleotid aus Ribonukleotiden, Desoxyribonukleotiden oder einer Kombination davon. Dabei sind das 5'- Ende eines Nukleotids und das 3'-Ende eines anderen Nukleotids durch eine Phosphodiesterbindung miteinander verknüpft. Diese Oligonukleotide können in herkömmlicher Weise synthetisiert oder rekombinant produziert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ein "modifiziertes" Oligonukleotid. Dabei kann das Oligonukleotid, um beispielsweise seine Stabilität oder therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen, auf verschiedenste Art und Weise modifiziert sein ohne dass seine Fähigkeit, an sein Ziel zu binden, beeinträchtigt wird. Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" bedeutet erfindungsgemäß ein Oligonukleotid, bei dem (i) mindestens zwei seiner Nukleotide durch eine synthetische Internukleosidbindung (d.h. eine Internukleosidbindung, die keine Phosphodiesterbindung ist) miteinander verknüpft sind und/oder (ii) eine chemische Gruppe kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden ist, die normalerweise nicht bei Nukleinsäuren auftritt. Bevorzugte synthetische Internukleosidbindungen sind Phosphorothioate, Alkylphosphonate, Phosphorodithioate, Phosphatester, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, Carbamate, Carbonate, Phosphattriester, Acetamidate, Carboxymethylester und Peptide.
Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" umfasst auch Oligonukleotide mit einer kovalent modifizierten Base und/oder Zucker. "Modifizierte Oligonukleotide" umfassen beispielsweise Oligonukleotide mit Zuckerresten, die kovalent an organische Gruppen mit einem geringen Molekulargewicht gebunden sind, die keine Hydroxylgruppe an der 3 '-Position und keine Phosphatgruppe an der 5 '-Position sind. Modifizierte Oligonukleotide können beispielsweise einen 2'-O-aιkyiierten Riboserest oder einen anderen Zucker anstelle von Ribose wie Arabinose umfassen.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Proteine und Polypeptide sind vorzugsweise isoliert. Die Begriffe "isoliertes Protein" oder "isoliertes Polypeptid" bedeuten, dass das Protein oder Polypeptid von seiner natürlichen Umgebung getrennt ist. Ein isoliertes Protein oder Polypeptid kann in einem im Wesentlichen aufgereinigten Zustand vorliegen. Der Begriff "im Wesentlichen aufgereinigt" bedeutet, dass das Protein oder Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Substanzen vorliegt, mit denen es in der Natur oder in vivo vorliegt.
Solche Proteine und Polypeptide dienen beispielsweise der Herstellung von Antiköφern und sind in einem immunologischen oder diagnostischen Assay oder als Therapeutika einsetzbar. Erfindungsgemäß beschriebene Proteine und Polypeptide können aus biologischen Proben wie Gewebe- oder Zellhomo genaten isoliert werden und können auch rekombinant in einer
Vielzahl pro- oder eukaryontischer Expressionssysteme exprimiert werden.
„Derivate" eines Proteins oder Polypeptids oder einer Aminosäuresequenz im Sinne dieser Erfindung umfassen Aminosäure-Insertionsvarianten, Aminosäure-Deletionsvarianten und/oder Aminosäure-Substitutionsvarianten.
Aminosäure-Insertionsvarianten umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in einer bestimmten Aminosäuresequenz. Bei Aminosäure-Sequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einer Aminosäuresequenz eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Aminosäure-Deletionsvarianten sind durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure- Substitutionsvarianten zeichnen sich dadurch aus, dass wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt wird. Vorzugsweise befinden sich die Modifikationen an Positionen in der Aminosäuresequenz, die zwischen homologen Proteinen oder Polypeptiden nicht konserviert sind. Vorzugsweise werden Aminosäuren durch andere mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, Volumen der Seitenkette und ähnliches (konservative Substitution). Konservative Substitutionen betreffen beispielsweise den Austausch einer Aminosäure durch eine andere, nachstehend in derselben Gruppe wie die substituierte Aminosäure aufgeführte Aminosäure:
1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) 2. negativ geladene Reste und ihre A ide: Asn, Asp, Glu, Gin
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys
4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, He, Val (Cys)
5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Tφ.
Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammem gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.
Die oben beschriebenen Aminosäure- Varianten können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch „Solid Phase Synthesis" (Merrifield, 1964) und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulation hergestellt werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA einzubringen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und umfassen z.B. M13-Mutagenese. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit
Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben. „Derivate" von Proteinen, Polypeptiden oder Peptiden umfassen erfindungsgemäß auch einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Enzym assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine, Polypeptide oder Peptide. Femer erstreckt sich der Begriff "Derivat" auch auf alle funktioneilen chemischen Äquivalente der Proteine, Polypeptide oder Peptide.
Ein Teil oder Fragment eines Tumor-assoziierten Antigens weist erfindungsgemäß eine funktionelle Eigenschaft des Polypeptids auf, aus dem es abgeleitet ist. Solche funktionellen Eigenschaften umfassen die Interaktion mit Antiköφern, die Interaktion mit anderen Polypeptiden oder Proteinen, die selektive Bindung von Nukleinsäuren und eine enzymatische Aktivität. Eine bedeutende Eigenschaft ist die Fähigkeit, einen Komplex mit HLA einzugehen und gegebenenfalls eine Immunreaktion zu erzeugen. Diese Immunreaktion kann auf Stimulation von cytotoxischen oder Helfer T-Zellen beruhen. Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemäßer Teil oder Fragment eines Tumor-assoziierten Antigens eine Sequenz von mindestens 6, insbesondere mindestens 8, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30 oder mindestens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus dem Tumor-assoziierten Antigen.
Ein Teil oder ein Fragment einer Nukleinsäure, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, betrifft erfindungsgemäß den Teil der Nukleinsäure, der zumindest für das Tumorassoziierte Antigen kodiert und/oder für einen Teil oder ein Fragment des Tumor-assoziierten Antigens wie vorstehend definiert kodiert.
Die Isolierung und Identifizierung von Genen, die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, ermöglicht auch die Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression von einem oder mehreren Tumor-assoziierten Antigenen auszeichnet. Diese Verfahren umfassen die Bestimmung einer oder mehrerer Nukleinsäuren, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodieren, und/oder die Bestimmung der kodierten Tumor-assoziierten Antigene und/oder von davon abgeleiteten Peptiden. Eine Bestimmung der Nukleinsäure kann in herkömmlicher Weise erfolgen, einschließlich durch Polymerase-Kettenreaktion oder Hybridisierung mit einer markierten Sonde. Eine Bestimmung von Tumor-assoziierten Antigenen oder davon abgeleiteten Peptiden kann durch ein Screening von Patienten- Antiseren in Bezug auf eine Erkennung des Antigens und/oder der Peptide erfolgen. Sie kann auch durch ein Screening von T-Zellen des Patienten auf Spezifität für das entsprechende Tumor-assoziierte Antigen erfolgen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Isolierung von Proteinen, die an hier beschriebene Tumor-assoziierte Antigene binden, einschließlich Antiköφer und zelluläre Bindepartner der Tumor-assoziierten Antigene.
Erfindungsgemäß werden auch in bestimmten Ausfuhrungsformen "dominant negative" Polypeptide bereitgestellt, die von Tumor-assoziierten Antigenen abgeleitet sind. Ein dominant negatives Polypeptid ist eine inaktive Variante eines Proteins, die durch Interaktion mit der zellulären Maschinerie ein aktives Protein von seiner Interaktion mit der zellulären Maschinerie verdrängt oder mit dem aktiven Protein kompetitiert, wodurch die Wirkung des aktiven Proteins verringert wird. Zum Beispiel kann ein dominant negativer Rezeptor, der einen Liganden bindet, jedoch kein Signal in Reaktion auf die Bindung des Liganden erzeugt, die biologische Wirkung des Liganden verringern. In ähnlicher Weise kann eine dominant negative katalytisch-inaktive Kinase, die normalerweise mit Zielproteinen interagiert, jedoch die Zielproteine nicht phosphoryliert, die Phosphorylierung der Zielproteine in Reaktion auf ein zelluläres Signal verringern. In ähnlicher Weise kann ein dominant negativer Transkriptionsfaktor, der an eine Promotorstelle in der Kontrollregion eines Gens bindet, jedoch die Transkription des Gens nicht erhöht, die Wirkung eines normalen
Transkriptionsfaktors durch die Besetzung von Promotorbindestellen ohne eine Erhöhung der Transkription verringern.
Das Ergebnis der Expression eines dominant negativen Polypeptids in einer Zelle ist eine Verringerung der Funktion aktiver Proteine. Der Fachmann kann dominant negative Varianten eines Proteins beispielsweise durch herkömmliche Mutageneseverfahren und Bewerten der dominant negativen Wirkung des Varianten-Polypeptids herstellen.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch Stoffe wie Polypeptide, die an Tumor-assoziierte Antigene binden. Solche Bindestoffe können z.B. in Screening-Assays für einen Nachweis von Tumor-assoziierten Antigenen und Komplexen von Tumor-assoziierten Antigenen mit ihren Bindepartnern sowie bei einer Aufreinigung der Tumor-assoziierten Antigene und von Komplexen davon mit ihren Bindepartnern Verwendung finden. Solche Stoffe können auch für eine Hemmung der Aktivität Tumor-assoziierter Antigene beispielsweise durch Bindung an solche Antigene Verwendung finden.
Erfindungsgemäß umfasst sind daher Bindestoffe wie z.B. Antiköφer oder Antiköφerfragmente, die die Fähigkeit aufweisen, selektiv an Tumor-assoziierte Antigene zu binden. Antiköφer umfassen polyklonale und monoklonale Antiköφer, die in herkömmlicher Weise hergestellt werden.
Solche Antiköφer können Proteine in nativem und/oder denaturiertem Zustand erkennen (Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem et al, Eur. J. Biochem. 208: 1-8, 1992; Spiller et al., J Immunol. Methods 224: 51-60, 1999).
Antiseren, die spezifische Antikörper enthalten, die an das Zielprotein spezifisch binden, können über verschiedene Standardverfahren hergestellt werden; vgl. beispielsweise
„Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" von Philip Shepherd, Christopher Dean
ISBN 0-19-963722-9, „Antibodies: A Laboratory Manual" von Ed Harlow, David Lane
ISBN: 0879693142 und „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" von Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447. Dabei ist auch möglich, affine und spezifische Antiköφer zu generieren, die komplexe Membranproteine in ihrer nativen Form erkennen (Azorsa et al., J Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., . Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J Immunol. Methods. 234: 107-116, 2000).
Dies ist vor allem für die Herstellung von Antiköφern von Bedeutung, die therapeutisch eingesetzt werden sollen, aber auch für viele diagnostische Anwendungen. Dazu kann sowohl mit dem gesamten Protein, mit extrazellulären Teilsequenzen, wie auch mit Zellen, die das
Zielmolekül in physiologisch gefalteter Form exprimieren, immunisiert werden.
Monoklonale Antiköφer werden traditionell mit Hilfe der Hybridoma-Technologie hergestellt (Technische Details: siehe „Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" von Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; „Antibodies: A Laboratory Manual" von Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142, „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" von Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447). Es ist bekannt, dass nur ein kleiner Teil eines Antiköφermoleküls, das Paratop, an der Bindung des Antiköφers an sein Epitop beteiligt ist (vgl. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 1. Auflage, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Die pFc- und Fc-Regionen sind z.B. Effektoren der Komplementkaskade, sind jedoch nicht an der Antigenbindung beteiligt. Ein Antiköφer, von dem die pFc'-Region enzymatisch abgespalten wurde oder der ohne die pFc'-Region hergestellt wurde, bezeichnet als F(ab') -Fragment, trägt beide Antigenbindestellen eines vollständigen Antiköφers. In ähnlicher Weise trägt ein Antiköφer, von dem die Fc-Region enzymatisch abgespalten wurde oder der ohne die Fc- Region hergestellt wurde, bezeichnet als Fab-Fragment, eine Antigenbindestelle eines intakten Antiköφermoleküls. Des weiteren bestehen Fab-Fragmente aus einer kovalent gebundenen leichten Kette eines Antiköφers und einem Teil der schweren Kette des Antiköφers, bezeichnet als Fd. Die Fd-Fragmente sind die Haupt-Determinanten der Antiköφer-Spezifität (ein einzelnes Fd-Fragment kann mit bis zu zehn verschiedenen leichten Ketten assoziiert werden, ohne die Spezifität des Antiköφers zu verändern) und Fd- Fragmente behalten bei einer Isolierung die Fähigkeit, an ein Epitop zu binden.
Innerhalb des Antigen-bindenden Teils eines Antiköφers befinden sich komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), die direkt mit dem Epitop des Antigens wechselwirken, und Gerüstregionen (FRs), die die Tertiärstruktur des Paratops aufrechterhalten. Sowohl in dem Fd-Fragment der schweren Kette als auch in der leichten Kette von IgG-lmmunglobulinen befinden sich vier Gerüstregionen (FR1 bis FR4), die jeweils durch drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1 bis CDR3) getrennt sind. Die CDRs und insbesondere die CDR3 -Regionen und noch mehr die CDR3 -Region der schweren Kette sind größtenteils für die Antiköφer-Spezifität verantwortlich.
Man weiß, dass die Nicht-CDR-Regionen eines Säuger-Antiköφers durch ähnliche Regionen von Antiköφern mit der gleichen oder einer anderen Spezifität ersetzt werden können, wobei die Spezifität für das Epitop des ursprünglichen Antiköφers erhalten bleibt. Dies ermöglichte die Entwicklung sogenannter "humanisierter" Antiköφer, bei denen nicht-menschliche CDRs kovalent mit menschlichen FR- und/oder Fc/pFc' -Regionen für die Herstellung eines funktioneilen Antiköφers verbunden sind. Dies nutzt die sogenannte „SLAM" -Technologie. Hierbei werden B-Zellen aus Vollblut isoliert und die Zellen monoklonalisiert. Anschließend wird der Überstand der vereinzelten B- Zelle auf ihre Antiköφerspezifität hin analysiert. Im Gegensatz zur Hybridomatechnologie wird anschließend die variable Region des Antiköφergens durch eine Einzelzell-PCR amplifiziert und in einen geeigneten Vektor kloniert. Auf diese Art und Weise wird die Gewinnung von monoklonalen Antiköφern beschleunigt (de Wildt et al. J. Immunol. Methods 207:61-67, 1997).
Als anderes Beispiel beschreibt die WO 92/04381 die Herstellung und Verwendung von humanisierten RSV-Antikörpern aus Maus, bei denen mindestens ein Teil der FR-Regionen aus Maus durch FR-Regionen eines menschlichen Ursprungs ersetzt wurden. Solche Antiköφer, einschließlich Fragmente intakter Antiköφer mit einer Antigen-Bindefähigkeit werden oft als "chimäre" Antikörper bezeichnet.
Erfindungsgemäß werden auch F(ab')2-, Fab-, Fv- und Fd-Fragmente von Antiköφern, chimäre Antiköφer, bei denen die Fc- und/oder FR- und oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette-CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, chimäre F(ab')2-Fragment-Antiköφer, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette-CDR3 -Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, chimäre Fab-Fragment- Antiköφer, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette- CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, und chimäre Fd-Fragment- Antiköφer, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, bereitgestellt. Erfindungsgemäß umfasst sind auch sogenannte einzelkettige Antiköφer.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch Polypeptide, die spezifisch an Tumor-assoziierte Antigene binden. Beispielsweise können solche Polypeptid-Bindestoffe durch degenerierte Peptid-Bibliotheken bereitgestellt werden, die einfach in Lösung in einer immobilisierten Form oder als Phagen-Display-Bibliotheken hergestellt werden können. Kombinatorische Bibliotheken aus Peptiden mit einer oder mehreren Aminosäuren können ebenfalls hergestellt werden. Ferner können Bibliotheken aus Peptoiden und nicht-peptidischen synthetischen Resten hergestellt werden. Phagen-Display kann besonders wirksam bei der Identifizierung erfindungsgemäßer Bindepeptide sein. Dabei wird beispielsweise eine Phagen-Bibliofhek (durch Verwendung beispielsweise des ml 3-, fd- oder lambda-Phagen) hergestellt, die Inserts einer Länge von 4 bis etwa 80 Aminosäureresten präsentiert. Es werden sodann Phagen ausgewählt, die Inserts tragen, die an das Tumor-assoziierte Antigen binden. Dieser Prozess kann über mehrere Zyklen einer Rückselektion von Phagen wiederholt werden, die an das Tumor-assoziierte Antigen binden. Wiederholte Runden führen zu einer Anreicherung von Phagen, die bestimmte Sequenzen tragen. Es kann eine Analyse von DNA-Sequenzen erfolgen, um die Sequenzen der exprimierten Polypeptide zu identifizieren. Der kleinste lineare Anteil der Sequenz, der an das Tumor-assoziierte Antigen bindet, kann bestimmt werden. Das "two- hybrid-System" aus Hefe kann auch für die Identifizierung von Polypeptiden eingesetzt werden, die an ein Tumor-assoziiertes Antigen binden. Erfindungsgemäß beschriebene Tumor-assoziierte Antigene oder Fragmente davon können für ein Screening von Peptid- Bibliotheken, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken, eingesetzt werden, um Peptid- Bindepartner der Tumor-assoziierten Antigene zu identifizieren und selektieren. Solche Moleküle können beispielsweise für Screening-Assays, Aufreinigungsprotokolle, für eine Interferenz mit der Funktion des Tumor-assoziierten Antigens und für andere Zwecke, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden.
Die vorstehend beschriebenen Antiköφer und andere Bindemoleküle können beispielsweise für die Identifizierung von Gewebe verwendet werden, das ein Tumor-assoziiertes Antigen exprimiert. Antiköφer können auch an spezifische diagnostische Stoffe für eine Darstellung von Zellen und Geweben gekoppelt werden, die Tumor-assoziierte Antigene exprimieren. Sie können ferner an therapeutisch nützliche Stoffe gekoppelt werden. Diagnostische Stoffe umfassen in nicht begrenzender Weise Bariumsulfat, Iocetaminsäure, Iopansäure, Calcium- Ipodat, Natrium-Diatrizoat, Meglumin-Diatrizoat, Metrizamid, Natrium-Tyropanoat und Radiodiagnostika, einschließlich Positronen-Emitter wie Fluor- 18 und Kohlenstoff-11, gamma-Emitter wie Iod-123, Technetium-99m, Iod-131 und Indium-111, Nuklide für magnetische Kernresonanz wie Fluorin und Gadolinium. Der Begriff "therapeutisch nützlicher Stoff' meint erfindungsgemäß jedes therapeutische Molekül, das wunschgemäß selektiv zu einer Zelle geführt wird, die ein oder mehrere Tumor-assoziierte Antigene exprimiert, einschließlich Antikrebsmittel, mit radioaktivem Iod versehene Verbindungen, Toxine, cytostatische oder cytolytische Arzneistoffe, usw. Antikrebsmittel umfassen beispielsweise Aminoglutethimid, Azathioprin, Bleomycinsulfat, Busulfan, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Cytarabidin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubin, Doxorubicin, Taxol, Etoposid, Fluoruracil, Interferon-α, Lomustin, Mercaptopurin, Methotrexat, Mitotan, Procarbazin-HCl, Thioguanin, Vinblastinsulfat und Vincristinsulfat. Weitere Antikrebsmittel sind beispielsweise in Goodman und Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8. Auflage, 1990, McGraw-Hill, Inc., insbesondere Kapitel 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi und Bruce A. Chabner)) beschrieben. Toxine können Proteine wie Pokeweed-antivirales Protein, Choleratoxin, Pertussistoxin, Ricin, Gelonin, Abrin, Diph herie-Exotoxin oder Pseudomonas- Exotoxin sein. Toxinreste können auch Hochenergie-emittierende Radionuklide wie Kobalt- 60 sein.
Der Begriff "Patient" bedeutet erfindungsgemäß Mensch, nicht menschlicher Primat oder ein anderes Tier, insbesondere Säugetier wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze oder Nagetier wie Maus und Ratte. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Patient ein Mensch.
Der Begriff "Erkrankung" betrifft erfindungsgemäß jeden pathologischen Zustand, bei dem Tumor-assoziierte Antigene exprimiert oder abnormal exprimiert werden. „Abnormale Expression" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Expression gegenüber dem Zustand bei einem gesunden Individuum verändert, vorzugsweise erhöht ist. Eine Erhöhung der Expression betrifft eine Erhöhung um mindestens 10%, insbesondere mindestens 20%, mindestens 50% oder mindestens 100%. In einer Ausfuhrungsform wird das Tumorassoziierte Antigen nur in Gewebe eines erkrankten Individuums exprimiert, während die Expression bei einem gesunden Individuum reprimiert ist. Ein Beispiel einer solchen Erkrankung ist Krebs, wobei der Begriff „Krebs" erfindungsgemäß Leukämien, Seminome, Melanome, Teratome, Gliome, Nieren-, Nebennieren-, Schilddrüsen-, Darm-, Leber-, Colon-, Magen-, Gastrointestinal-, Lymphknoten-, Speiseröhren-, Kolorektal-, Pankreas-, Hals, Nasen, Ohren (HNO)-, Brust-, Prostata-, Gebärmutter-, Ovarial-, und Lungenkrebs und deren Metastasen umfasst.
Eine biologische Probe kann erfindungsgemäß eine Gewebe- und/oder zelluläre Probe sein und kann für eine Verwendung in den verschiedenen, hier beschriebenen Verfahren in herkömmlicher Weise gewonnen werden, wie durch Gewebebiopsie, einschließlich Stanzbiopsie, und Entnahme von Blut, Bronchialaspirat, Sputum, Urin, Fäces oder anderen Köφerflüssigkeiten.
Der Begriff "immunreaktive Zelle" bedeutet erfmdungsgemäß eine Zelle, die in eine Immunzelle (wie B-Zelle, T-Helferzelle oder cytolytische T-Zelle) bei geeigneter Stimulierung reifen kann. Immunreaktive Zellen umfassen CD34+ hämatopoietische Stammzellen, unreife und reife T-Zellen sowie unreife und reife B-Zellen. Falls die Herstellung cytolytischer oder Helfer T-Zellen, die ein Tumor-assoziiertes Antigen erkennen, gewünscht ist, wird die immunreaktive Zelle mit einer Zelle, die ein Tumor-assoziiertes Antigen exprimiert, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Produktion, Differenzierung und/oder Selektion von cytolytischen sowie Helfer T-Zellen begünstigen. Die Differenzierung von T-Zell- Vorläufern in eine cytolytische T-Zelle bei einer Exposition gegenüber einem Antigen ist ähnlich zur klonalen Selektion des Immunsystems.
Manche therapeutische Verfahren beruhen auf einer Reaktion des Immunsystems eines Patienten, die zu einer Lyse Antigen-präsentierender Zellen führt, wie Krebszellen, die ein oder mehrere Tumor-assoziierte Antigene präsentieren. Dabei werden beispielsweise autologe cytotoxische T-Lymphozyten, die für einen Komplex aus einem Tumor-assoziierten Antigen und einem MHC-Molekül spezifisch sind, an einen Patienten mit einer Zellabnormalie verabreicht. Die Produktion solcher cytotoxischer T-Lymphozyten in vitro ist bekannt. Ein Beispiel für ein Verfahren zur Differenzierung von T-Zellen findet sich in der WO-A- 9633265. Im Allgemeinen wird eine Probe mit Zellen wie Blutzellen aus dem Patienten entnommen und die Zellen werden mit einer Zelle in Kontakt gebracht, die den Komplex präsentiert und eine Vermehrung von cytotoxischen T-Lymphozyten auslösen kann (z.B. dendritische Zellen). Die Zielzelle kann eine transfizierte Zelle wie eine COS-Zelle sein. Diese transfϊzierten Zellen präsentieren den gewünschten Komplex auf ihrer Oberfläche und stimulieren bei einer Kontaktierung mit cytotoxischen T-Lymphozyten deren Vermehrung. Die klonal expandierten autologen cytotoxischen T-Lymphozyten werden sodann an den Patienten verabreicht.
Bei einem anderen Verfahren zur Selektion Antigen-spezifischer cytotoxischer T- Lymphozyten werden fluorogene Tetramere von MHC-Klasse I-Molekül/Peptid-Komplexen für einen Nachweis spezifischer Klone von cytotoxischen T-Lymphozyten verwendet (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol. 8:413-416, 1998). Lösliche MHC-Klasse I-Moleküle werden in vitro in Gegenwart von ß -Mikroglobulin und eines Peptid-Antigens, das an das Klasse I-Molekül bindet, gefaltet. Nach Aufreinigung der MHC Peptid-Komplexe werden diese mit Biotin markiert. Tetramere werden durch Mischen der biotinylierten Peptid-MHC-Komplexe mit markiertem Avidin (z.B. Phycoerythrin) bei einem molaren Verhältnis von 4:1 gebildet. Tetramere werden sodann mit cytotoxischen T- Lymphozyten wie peripherem Blut oder Lymphknoten in Kontakt gebracht. Die Tetramere binden an cytotoxische T-Lymphozyten, die den Peptid-Antigen/MHC-Klasse I-Komplex erkennen. Zellen, die an die Tetramere gebunden werden, können durch Fluoreszenzgesteuerte Zellsortierung für eine Isolierung reaktiver cytotoxischer T-Lymphozyten sortiert werden. Die isolierten cytotoxischen T-Lymphozyten können sodann in vitro vermehrt werden.
Bei einem therapeutischen Verfahren, das als adoptiver Transfer bezeichnet wird (Greenberg, J Immunol. 136(5):1917, 1986; Riddel et al, Science 257:238, 1992; Lynch et al, Eur. J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Käst et al., Cell 59:603-614, 1989), werden Zellen, die den gewünschten Komplex präsentieren (z.B. dendritische Zellen) mit cytotoxischen T- Lymphozyten des zu behandelnden Patienten kombiniert, was zu einer Vermehrung spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten führt. Die vermehrten cytotoxischen T- Lymphozyten werden sodann an einen Patienten mit einer zellulären Abnormalie verabreicht, die sich durch bestimmte abnormale Zellen auszeichnet, die den spezifischen Komplex präsentieren. Die cytotoxischen T-Lymphozyten lysieren sodann die abnormalen Zellen, wodurch eine gewünschte therapeutische Wirkung erreicht wird.
Oft lassen sich aus dem T-Zell-Repertoire eines Patienten lediglich niedrig-affine T-Zellen gegen einen solchen spezifischen Komplex vermehren, da die hochaffinen durch Toleranzentwicklung ausgelöscht worden sind. Eine Alternative kann hier ein Transfer des T- Zell-Rezeptors selbst sein. Hierfür werden ebenfalls Zellen, die den gewünschten Komplex präsentieren (z.B. dendritische Zellen) mit cytotoxischen T-Lymphozyten von gesunden Personen oder von einer anderen Spezies (z.B. Maus) kombiniert. Dies führt zu einer Vermehrung hochaffiner spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten, wenn die T- Lymphozyten aus einem Spenderorganismus kommen, der mit dem spezifischen Komplex bisher keinen Kontakt hatte. Der hochaffine T-Zell-Rezeptor aus diesen vermehrten spezifischen T-Lymphozyten wird Moniert. Wurden die hochaffinen T-Zellrezeptoren aus einer anderen Spezies kloniert, können diese in unterschiedlichem Ausmaß humanisiert werden. Durch Gentransfer z.B. mit retroviralen Vektoren werden solche T-Zell-Rezeptoren dann beliebig in T-Zellen von Patienten transduziert. Adoptiver Transfer erfolgt dann mit diesen genetisch veränderten T-Lymphozyten (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2:962-70, 2001 ; Kessels et al., Nat Immunol. 2:957-61, 2001).
Die vorstehenden therapeutischen Aspekte gehen davon aus, dass zumindest manche der abnormalen Zellen des Patienten einen Komplex aus einem Tumor-assoziierten Antigen und einem HLA-Molekül präsentieren. Eine Identifizierung solcher Zellen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Sobald Zellen, die den Komplex präsentieren, identifiziert wurden, können sie mit einer Probe aus dem Patienten, die cytotoxische T-Lymphozyten enthält, kombiniert werden. Falls die Zellen, die den Komplex präsentieren, durch die cytotoxischen T-Lymphozyten lysiert werden, kann angenommen werden, dass ein Tumor-assoziiertes Antigen präsentiert wird.
Der adoptive Transfer ist nicht die einzige Therapieform, die erfindungsgemäß anwendbar ist. Cytotoxische T-Lymphozyten können auch in vivo in an sich bekannter Weise erzeugt werden. Bei einem Verfahren werden nicht-proliferative Zellen verwendet, die den Komplex exprimieren. Die Zellen, die dabei verwendet werden, werden diejenigen sein, die normalerweise den Komplex exprimieren, wie bestrahlte Tumorzellen oder Zellen, die mit einem oder beiden Genen transfiziert wurden, die für eine Präsentation des Komplexes notwendig sind (d.h. das antigene Peptid und das präsentierende HLA-Molekül). Verschiedene Zelltypen köm en eingesetzt werden. Des weiteren können Vektoren verwendet werden, die eines oder beide der interessierenden Gene tragen. Virale oder bakterielle Vektoren sind besonders bevorzugt. Zum Beispiel können Nukleinsäuren, die für ein Tumor- assoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodieren, funktionell mit Promotor- und Enhancersequenzen verknüpft werden, die eine Expression des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Fragments davon in bestimmten Geweben oder Zelltypen steuern. Die Nukleinsäure kann in einen Expressionsvektor eingebaut werden. Expressionsvektoren können nicht-modifizierte extrachromosomale Nukleinsäuren, Plasmide oder virale Genome sein, in die eine Insertion exogener Nukleinsäuren möglich ist. Nukleinsäuren, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodieren, können auch in ein retrovirales Genom inseriert werden, wodurch die Integration der Nukleinsäure in das Genom des Zielgewebes oder der Zielzelle ermöglicht wird. Bei diesen Systemen trägt ein Mikroorganismus wie Vacciniavirus, Poxvirus, Heφes simplex-Virus, Retrovirus oder Adenovirus das interessierende Gen und "infiziert" de facto Wirtszellen. Eine weitere bevorzugte Form ist die Einbringung des Tumorassoziierten Antigenes in Form von rekombinanter RNA. Diese kann z.B. durch liposomalen Transfer oder durch Elektroporation in Zellen eingebracht werden. Die resultierenden Zellen präsentieren den interessierenden Komplex und werden von autologen cytotoxischen T- Lymphozyten erkannt, die sich sodann vermehren.
Eine ähnliche Wirkung kann durch Kombination des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Fragments davon mit einem Adjuvans erreicht werden, um einen Einbau in Antigen- präsentierende Zellen in vivo zu ermöglichen. Das Tumor-assoziierte Antigen oder ein Fragment davon können als Protein, als DNA (z.B. innerhalb eines Vektors) oder als RNA repräsentiert sein. Das Tumor-assoziierte Antigen wird prozessiert, um einen Peptidpartner für das HLA-Molekül zu ergeben, während ein Fragment davon präsentiert werden kann, ohne dass eine weitere Prozessierung erforderlich ist. Letzteres ist insbesondere der Fall, wenn diese an HLA-Moleküle binden können. Verabreichungsformen, bei denen das Gesamt- Antigen in vivo von einer dendritischen Zelle prozessiert wird, sind bevorzugt, da hier auch Helfer T-Zell-Antworten entstehen können. Eine effektive Immunantwort benötigt diese (Ossendoφ et al, Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendoφ et al., J Exp. Med. 187:693-702, 1998). Im Allgemeinen kann eine wirksame Menge des Tumor-assoziierten Antigens an einen Patienten z.B. durch eine intradermale Injektion verabreicht werden. Die Injektion kann aber auch intranodal in einen Lymphknoten erfolgen (Maloy et al., Proc Natl Acad Sei USA 98:3299-303, 2001). Sie kann auch in Kombination mit Reagenzien erfolgen, die eine Aufnahme in dendritische Zellen erleichtem. Bevorzugte Tumor-assoziierte Antigene umfassen diejenigen, die mit allogenen Krebs-Antiseren oder mit T-Zellen vieler Krebs- Patienten reagieren. Von besonderem Interesse sind aber auch solche, gegen die keine spontanen Immunantworten vorbestehen. Gegen diese können nachweislich Immunantworten induziert werden, die Tumoren lysieren können (Keogh et al., J Immunol. 167:787-96, 2001; Appella et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84, 1995; Wentworth et al., Mol Immunol. 32:603-12, 1995).
Die erfindungsgemäß beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch als
Vakzinen für die Immunisierung eingesetzt werden. Die Begriffe "Immunisierung" oder „Vakzinierung" bedeuten erfindungsgemäß eine Erhöhung oder Aktivierung einer Immunreaktion gegenüber einem Antigen. Tiermodelle können zum Testen einer immunisierenden Wirkung gegenüber Krebs durch Verwendung eines Tumor-assoziierten Antigens oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure eingesetzt werden. Zum Beispiel können menschliche Krebszellen in eine Maus für die Schaffung eines Tumors eingebracht werden und eine oder mehrere Nukleinsäuren, die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, können verabreicht werden. Die Wirkung auf die Krebszellen (beispielsweise Verringerung der Tumorgröße) kann als Maß für die Wirksamkeit einer Immunisierung durch die Nukleinsäure gemessen werden.
Als Teil der Zusammensetzung für eine Immunisierung werden eines oder mehrere Tumorassoziierte Antigene oder stimulierende Fragmente davon mit einem oder mehreren Adjuvanzien für eine Induktion einer Immunreaktion oder eine Erhöhung einer Immunreaktion verabreicht. Ein Adjuvans ist eine Substanz, die in das Antigen eingebaut oder gemeinsam mit diesem verabreicht wird und die Immunreaktion verstärkt. Adjuvanzien können die Immunreaktion durch Bereitstellen eines Antigen-Reservoirs (extrazellulär oder in Makrophagen), Aktivierung von Makrophagen und/oder Stimulierung bestimmter -Lymphozyten verstärken. Adjuvanzien sind bekannt und umfassen in nicht begrenzender Weise Monophosphoryl-Lipid-A (MPL, SmithKline Beecham), Saponine wie QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 und QS-Ll (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997), unvollständiges Freundsches Adjuvans, vollständiges Feundsches Adjuvans, Vitamin E, Montanid, Alaun, CpG-Oligonukleotide (vgl. Kreig et al, Nature 374:546-9, 1995) und verschiedene Wasser-in-Öl-Emulsionen, die aus biologisch abbaubaren Ölen wie Squalen und/oder Tocopherol hergestellt werden. Vorzugsweise werden die Peptide in einer Mischung mit DQS21/MPL verabreicht. Das Verhältnis von DQS21 zu MPL beträgt typischerweise etwa 1:10 bis 10:1, vorzugsweise etwa 1:5 bis 5:1 und insbesondere etwa 1 :1. Für eine Verabreichung an den Menschen sind DQS21 und MPL typischerweise in einer Vakzine-Formulierung in einem Bereich von etwa 1 μg bis etwa 100 μg vorhanden.
Andere Stoffe, die eine Immunreaktion des Patienten stimulieren, können auch verabreicht werden. Zum Beispiel sind Cytokine bei einer Vakzinierung aufgrund ihrer regulatorischen Eigenschaften auf Lymphozyten verwendbar. Solche Cytokine umfassen z.B. Interleukin-12 (IL-12), von dem gezeigt wurde, dass es die schützenden Wirkungen von Vakzinen verstärkt (vgl. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF und IX- 18. Es gibt eine Reihe von Verbindungen, die eine Immunreaktion verstärken und die daher bei einer Vakzinierung eingesetzt werden können. Diese umfassen co-stimulierende Moleküle, die in Form von Proteinen oder Nukleinsäuren bereitgestellt werden. Solche co- stimulierenden Moleküle sind beispielsweise B7-1 und B7-2 (CD80 bzw. CD86), die auf dendritischen Zellen (DC) exprimiert werden und mit dem auf den T-Zellen exprimierten CD28-Molekül interagieren. Diese Interaktion stellt eine Co-Stimulierung (Signal 2) für eine Antigen/MHC/TCR-stimulierte (Signal 1) T-Zelle bereit, wodurch die Vermehrung der T- Zelle und die Effektorfunktion verstärkt wird. B7 interagiert auch mit CTLA4 (CD 152) auf T- Zellen und Untersuchungen, die CTLA4- und B7-Liganden einbeziehen, zeigen, dass die B7- CTLA4-Interaktion eine Antitumor-Immunität und CTL- Vermehrung verstärken kann (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(l l):6284-6289 (1998)).
B7 wird typischerweise nicht auf Tumorzellen exprimiert, so dass diese keine wirksamen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) für T-Zellen sind. Eine Induktion der B7-Expression würde ermöglichen, dass Tumorzellen wirksamer eine Nermehrung von cytotoxischen T- Lymphozyten und eine Effektorfunktion stimulieren. Eine Co-Stimulierung durch eine Kombination von B7/IL-6/IL-12 zeigte eine Induktion des IFΝ-gamma- und Thl-Cytokin- Profils in einer T-Zell-Population, was zu einer weiter verstärkten T-Zell-Aktivität führt (Gajewski et al., J Immunol. 154:5637-5648 (1995)).
Eine vollständige Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten und eine vollständige Effektorfunktion erfordert eine Mitwirkung von T-Helferzellen durch die Interaktion zwischen dem CD40-Liganden auf den T-Helferzellen und dem CD40-Molekül, das von dendritischen Zellen exprimiert wird (Ridge et al., Nature 393:474 (1998), Bennett et al., Nature 393 :478 (1998), Schönberger et al., Nature 393 :480 (1998)). Der Mechanismus dieses co-stimulierenden Signals betrifft wahrscheinlich die Steigerung der B7- und assoziierten IL- 6/IL-12-Produktion durch die dendritischen Zellen (Antigen-präsentierenden Zellen). Die CD40-CD40L-Interaktion komplementiert so die Interaktionen des Signals 1 (Antigen/MHC- TCR) und des Signals 2 (B7-CD28).
Die Verwendung von anti-CD40-Antiköφern für eine Stimulierung von dendritischen Zellen würde erwartungsgemäß direkt eine Reaktion gegenüber Tumor-Antigenen verstärken, die normalerweise außerhalb des Bereichs einer entzündlichen Reaktion liegen oder von nichtprofessionellen Antigen-präsentierenden Zellen (Tumorzellen) präsentiert werden. In diesen Situationen werden T-Helfer- und B7-co-stimulierende Signale nicht bereitgestellt. Dieser Mechanismus könnte im Zusammenhang mit Therapien verwendet werden, die auf Antigen- gepulsten dendritischen Zellen basieren.
Erfindungsgemäß vorgesehen ist auch eine Verabreichung von Nukleinsäuren, Polypeptiden oder Peptiden. Eine Verabreichung von Polypeptiden und Peptiden kann in an sich bekannter Weise erfolgen. In einer Ausfuhrungsform erfolgt die Verabreichung von Nukleinsäuren durch ex vtvo-Verfahreu, d.h. durch Entfernung von Zellen aus einem Patienten, genetische Veränderung der Zellen, um ein Tumor-assoziiertes Antigen einzubauen, und Wiedereinbringung der veränderten Zellen in den Patienten. Dies umfasst im Allgemeinen das Einbringen einer funktioneilen Kopie eines Gens in die Zellen eines Patienten in vitro und die Rückführung der genetisch veränderten Zellen in den Patienten. Die funktioneile Kopie des Gens steht unter funktioneller Kontrolle von regulatorischen Elementen, die eine Expression des Gens in den genetisch veränderten Zellen erlauben. Transfek ions- und Transduktionsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Erfindungsgemäß vorgesehen ist auch eine Verabreichung von Nukleinsäuren in vivo durch die Verwendung von Vektoren wie Viren und zielgesteuerten Liposomen.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist ein viraler Vektor für die Verabreichung einer Nukleinsäure, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren, Poxviren, einschließlich Vacciniavirus und attenuierten Poxviren, Semliki-Forest- Virus, Retroviren, Sindbis- Virus und Ty- Virusähnlichen Partikeln. Besonders bevorzugt sind Adenoviren und Retroviren. Die Retroviren sind üblicherweise replikationsdefizient (d.h. sie sind unfähig, infektiöse Partikel zu erzeugen).
Verschiedene Verfahren können eingesetzt werden, um erfmdungsgemäß Nukleinsäuren in Zellen in vitro oder in vivo einzubringen. Solche Verfahren umfassen die Transfektion von Nukleinsäure-CaPθ4-Präzipitaten, die Transfektion von Nukleinsäuren, die mit DEAE assoziiert sind, die Transfektion oder Infektion mit den vorstehenden Viren, die die interessierenden Nukleinsäuren tragen, die Liposomen-vermittelte Transfektion und ähnliches. In bestimmten Ausfuhrungsformen ist eine Steuerung der Nukleinsäure an bestimmte Zellen bevorzugt. In solchen Ausführungsformen kann ein Träger, der für die Verabreichung einer Nukleinsäure an eine Zelle (z.B. ein Retrovirus oder ein Liposom) eingesetzt wird, ein gebundenes Zielsteuerungsmolekül aufweisen. Zum Beispiel kann ein Molekül wie ein Antiköφer, der für ein Oberflächenmembran-Protein auf der Zielzelle spezifisch ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle in den Nukleinsäureträger eingebaut oder daran gebunden werden. Bevorzugte Antiköφer umfassen Antiköφer, die selektiv ein Tumor-assoziiertes Antigen binden. Falls eine Verabreichung einer Nukleinsäure durch Liposomen erwünscht ist, können Proteine, die an ein Oberflächenmembran-Protein binden, das mit der Endozytose assoziiert ist, in die Liposomenformulierung eingebaut werden, um eine Zielsteuerung und/oder Aufnahme zu ermöglichen. Solche Proteine umfassen Kapsid-Proteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antiköφer gegen Proteine, die internalisiert werden, Proteine, die eine intrazelluläre Stelle ansteuern, und ähnliches.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können in pharmazeutisch verträglichen Zubereitungen verabreicht werden. Solche Zubereitungen können gewöhnlich pharmazeutisch verträgliche Konzentrationen von Salzen, Pufferstoffen, Konservierungsstoffen, Trägern, ergänzenden irnmunitätssteigernden Stoffen wie Adjuvanzien, CpG und Cytokinen und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Wirkstoffe können auf jedem herkömmlichen Weg verabreicht werden, einschließlich durch Injektion oder durch Infusion. Die Verabreichung kann beispielsweise oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan oder transdermal erfolgen. Eine therapeutische Verabreichung von Antiköφern erfolgt vorzugsweise durch ein Lungenaerosol. Die Verabreichung von Antisense-Nukleinsäuren erfolgt vorzugsweise durch langsame intravenöse Verabreichung.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine "wirksame Menge" betrifft die Menge, die alleine oder zusammen mit weiteren Dosen eine gewünschte Reaktion oder eine gewünschte Wirkung erzielt. Im Fall einer Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder eines bestimmten Zustands, der sich durch die Expression eines oder mehrerer Tumor-assoziierter Antigene auszeichnet, betrifft die gewünschte Reaktion die Hemmung des Krankheitsverlaufs. Dies umfasst die Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung und insbesondere eine Unterbrechung des Fortschreitens der Erkrankung. Die gewünschte Reaktion bei einer Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands kann auch die Verzögerung des Ausbruchs oder eine Verhinderung des Ausbruchs der Krankheit oder des Zustands sein.
Eine wirksame Menge einer erfindungs gemäßen Zusammensetzung wird von dem zu behandelnden Zustand, der Schwere der Krankheit, den individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, physiologischer Zustand, Größe und Gewicht, der Dauer der Behandlung, der Art einer begleitenden Therapie (falls vorhanden), dem spezifischen Verabreichungsweg und ähnlichen Faktoren abhängen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind vorzugsweise steril und enthalten eine wirksame Menge der therapeutisch wirksamen Substanz für die Erzeugung der gewünschten Reaktion oder der gewünschten Wirkung.
Die Dosen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die verabreicht werden, können von verschiedenen Parametern wie der Verabreichungsart, dem Zustand des Patienten, dem gewünschten Verabreichungszeitraum, usw. abhängen. Für den Fall, dass eine Reaktion bei einem Patienten bei einer anfänglichen Dosis unzureichend ist, können höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen, die durch einen anderen, stärker lokalisierten Verabreichungsweg erzielt werden) eingesetzt werden.
Im Allgemeinen werden für eine Behandlung oder für eine Erzeugung oder Erhöhung einer Immunreaktion Dosen des Tumor-assoziierten Antigens von 1 ng bis 1 mg, vorzugsweise von 10 ng bis 100 μg formuliert und verabreicht. Falls die Verabreichung von Nukleinsäuren (DNA sowie RNA), die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, erwünscht ist, werden Dosen von 1 ng bis 0,1 mg formuliert und verabreicht.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in pharmazeutisch verträglichen Mengen und in pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen verabreicht. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" betrifft ein nicht- toxisches Material, das nicht mit der Wirkung des aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung wechseiwirkt. Solche Zubereitungen können gewöhnlich Salze, Pufferstoffe, Konservierungsstoffe, Träger und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten. Bei einer Verwendung in der Medizin sollten die Salze pharmazeutisch verträglich sein. Nicht-pharmazeutisch verträgliche Salze können jedoch für die Herstellung pharmazeutisch verträglicher Salze davon verwendet werden und sind erfindungsgemäß umfasst. Solche pharmakologisch und pharmazeutisch verträglichen Salze umfassen in nicht begrenzender Weise diejenigen, die aus den nachstehenden Säuren hergestellt werden: Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Phosphor-, Malein-, Essig-, Salicyl-, Citronen-, Ameisen-, Malon-, Bernsteinsäure und ähnliches. Pharmazeutisch verträgliche Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze hergestellt werden.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger" betrifft erfindungsgemäß einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Kapsel Substanzen, die für eine Verabreichung an einen Menschen geeignet sind. Der Begriff "Träger" betrifft einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlicher oder synthetischer Natur, in dem der aktive Bestandteil kombiniert wird, um eine Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind gewöhnlich derart, dass keine Interaktion auftritt, die die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können geeignete Pufferstoffe wie Essigsäure in einem Salz, Citronensäure in einem Salz, Borsäure in einem Salz und Phosphorsäure in einem Salz enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch gegebenenfalls geeignete Konservierungsstoffe wie Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Parabene und Thimerosal enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden gewöhnlich in einer einheitlichen Dosisform dargeboten und können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten, Lutschpastillen, Suspensionen, Sirupen, Elixieren oder als Emulsion vorliegen.
Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen gewöhnlich eine sterile wässrige oder nicht-wässrige Zubereitung des Wirkstoffs, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Verträgliche Träger und Lösungsmittel sind beispielsweise Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden gewöhnlich sterile, fixierte Öle als Lösungs- oder Suspensionsmedium eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Abbildungen und Beispiele ausführlich beschrieben, die ausschließlich der Erläuterung dienen und nicht begrenzend zu verstehen sind. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls erfindungsgemäß umfasst sind.
Abbildungen:
Abb. 1. GPR35 mRNA-Expression in Kolon-Karzinom-Biopsien
RT-PCR-Untersuchungen mit DNA- freier RNA zeigen GPR35-Expression in der Mehrzahl der Kolon-Karzinom-Biopsien. Hingegen ist eine Expression in Normalgeweben nicht nachweisbar. (1-Brust, 2-Lunge, 3-Lymphknoten, 4-Thymus, 5-Kolon, 6-15 Kolonkarzinom, 16-neg. Kontrolle).
Abb. 2. Quantitative PCR-Analyse der GUCY2C mRNA-Expression in Normal- und Tumor-Geweben
Real-Time PCR-Untersuchung mit GUCY2C-spezifischen Primern (SEQ ID NO: 22-23) zeigt eine selektive mRNA-Expression im normalen Ileum, Kolon, sowie in allen Kolon- Karzinom-Biopsien. Deutliche GUCY2C-Transkriptmengen wurden auch in einer Kolonkarzinom-Metastase in der Leber detektiert.
Abb. 3. Identifikation von tumorspezifischen GUCY2C-SpIeißvarianten
PCR-Produkte von normalen Kolongeweben und Kolonkarzinomen wurden kloniert und
Klone aus beiden Gruppen durch Restriktionsanalyse (EcoR I) übeφriift und sequenziert.
Abb. 4. Selektive SCGB3A-Expression in normaler Lunge und Lungenkarzinom
RT-PCR-Analyse mit Gen-spezifischen SCGB3A2-Primern (SEQ ID NO:37, 38) zeigt eine cDNA- Amplifikation ausschließlich in normaler Lunge (Spur 8, 14-15) und in Lungenkarzinom-Biopsien (Spur 16-24). (1-Leber-N, 2-PBMC-N, 3-Lymphknoten-N, 4- Magen-N, 5-Testis-N, 6-Mamma-N, 7-Niere-N, 8-Lunge-N, 9-Thymus-N, 10-Ovar-N, 11- Nebenniere-N, 12-Milz-N, 14-15-Lunge-N, 16-24-Lungen-Karzinom, 25-Negativ-Kontrolle).
Abb. 5. Claudin-18A2.1-Expression im Magen, Ösophagus, Magen- und Pankreaskarzinom
RT-PCR-Analyse mit Claudin-18A2.1 -spezifischen Primern (SEQ ID NO: 39, 40) zeigte erfmdungsgemäß in 8/10 Magenkarzinom-Biopsien, sowie in 3/6 Pankreaskarzinom-Biopsien eine ausgeprägte Claudin-18A2.1 -Expression. In Magen und Ösophagus-Normalgewebe wurde ebenfalls eine deutliche Expression nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde im Ovar und im Ovarkarzinom keine Expression detektiert.
Abb. 6. SLC13Al-Expression in der Niere und Nierenzellkarzinom
RT-PCR-Analyse mit SLC13 AI -spezifischen Primern (SEQ ID NO: 49, 50) zeigte in 7/8 Nierenzellkarzinom-Proben eine Expression. Ansonsten wurden Transkripte innerhalb der Normalgewebe ausschließlich in der Niere detektiert. (1-2-Niere, 3-10-Nierenzellkarzinom, 11 -Brust, 12-Lunge, 13 -Leber, 14-Kolon, 15-Lymphknoten, 16-Milz, 17-Ösophagus, 18- Thymus, 19-Schilddrüse, 20-PBMCs, 21 -Ovar, 22-Hoden).
Abb. 7. CLCAl-Expression im Kolon, Kolon- und Magen-Karzinom RT-PCR-Untersuchungen mit CLCAl -spezifischen Primern (SEQ ID NO: 67, 68) bestätigten eine selektive Expression im Kolon, und zeigten eine hohe Expression in (3/7) untersuchten Kolon- und (1/3) untersuchten Magenkarzinom-Proben. Die übrigen Normalgewebe (NG) zeigten keine oder nur eine sehr schwache Expression.
Abb. 8. FLJ21477-Expression im Kolon und Kolon-Karzinom
RT-PCR-Untersuchungen mit FLJ21477-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 69, 70) zeigten eine selektive Expression im Kolon, und darüber hinaus unterschiedlich stark ausgeprägte Expression in (7/12) untersuchten Kolon-Karzinom-Proben. Die übrigen Normalgewebe (NG) zeigten keine Expression.
Abb. 9. FLJ20694-Expression im Kolon und Kolon-Karzinom
RT-PCR-Untersuchungen mit FLJ20694-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 71, 72) zeigten eine selektive Expression im Kolon, und darüber hinaus unterschiedlich stark ausgeprägte Expression in (5/9) untersuchten Kolon-Karzinom-Proben. Die übrigen Normalgewebe (NG) zeigten keine Expression.
Abb. 10. von Ebner-Expression in Magen, Lunge und Lungen-Karzinom RT-PCR-Untersuchungen mit von Ebner-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 73, 74) zeigten eine selektive Expression im Magen, in der Lunge und in (5/10) untersuchten Lungen- Karzinom-Proben. Die übrigen Normalgewebe (NG) zeigten keine Expression.
Abb. 11. Plunc-Expression in Thymus, Lunge und Lungen-Karzinom RT-PCR-Untersuchungen mit Plunc-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 75, 76) zeigten eine selektive Expression im Thymus, in der Lunge und in (6/10) untersuchten Lungen-Karzinom- Proben. Die übrigen Normalgewebe zeigten keine Expression.
Abb. 12. SLC26A9-Expression in Lunge, Lungenkarzinom und Schilddrüse RT-PCR-Untersuchungen mit SLC26A9-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 77, 78) zeigten eine selektive Expression in der Lunge und in allen (13/13) untersuchten Lungen-Karzinom- Proben. Die übrigen Normalgewebe (NG) zeigten mit Ausnahme der Schilddrüse keine Expression.
Abb. 13. THC1005163-Expression in Magen, Ovar, Lunge und Lungenkarzinom
RT-PCR-Untersuchungen mit einem THC1005163-spezifischen Primer (SEQ ID O: 79) und einem unspezifischen Oligo dT-Tag-Primer zeigten eine Expression in Magen, Ovar, Lunge und in (5/9) Lungenkarzinom-Biopsien. Die übrigen Normalgewebe (NG) zeigten keine Expression.
Abb. 14. LOC134288-Expression in Niere und Nierenzellkarzinom
RT-PCR-Untersuchungen mit LOC134288-spezifιschen Primern (SEQ ID NO: 80, 81) zeigten eine selektive Expression in der Niere und in (5/8) untersuchten Nierenzellkarzinom- Biopsien.
Abb. 15. THC943866-Expression in Niere und Nierenzellkarzinom
RT-PCR-Untersuchungen mit THC943866-spezifischen Primern (SEQ ID NO: 82, 83) zeigten eine selektive Expression in der Niere und in (4/8) untersuchten Nierenzellkarzinom- Biopsien. Abb. 16. FLJ21458-Expression in Kolon und Kolonkarzinom
RT-PCR-Untersuchungen mit FLJ21458 -spezifischen Primem (SEQ ID NO: 86, 87) zeigten eine selektive Expression im Kolon und in (7/10) untersuchten Kolonkarzinom-Biopsien. (1- 2-Kolon, 3-Leber, 4-PBMCs, 5-Milz, 6-Prostata, 7-Niere, 8-Ovar, 9-Haut, 10-Ileum, 11- Lunge, 12-Testis, 13-22 Kolonkarzinom, 23- neg. Kontrolle).
Abb. 17. Zelluläre Lokalisation von GPR35
Immunfluoreszenz zum Nachweis der zellulären Lokalisation von GPR35 nach Transfektion eines Plasmides, dass ein GPR35-GFP Fusionsprotein exprimiert. Die Pfeile kennzeichenen die membranständige Fluoreszenz des fluoreszierenden GFP.
Abb. 18. Quantitative Expression von GPR35
A. Quantitative RT-PCR mit GPR35-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 88, 89) zeigen die selektive Expression im Darm, in Dickdarmrumoφroben und in Matastasen aus Darmtumoren. Folgende Normalgewebe wurden analysiert: Leber, Lunge, Lymphknoten,
Magen, Milz, Nebenniere, Niere, Ösophagus, Ovar, Testis, Thymus, Haut, Brust, Pankreas, Lymphozyten, aktivierte Lymphozyten, Prostata, Schilddrüse, Eileiter, Endometrium, Kleinhirn, Hirn.
B. Prävalenz von GPR35 in Dickdarmtumoren und deren Metastasen. In über 90%) der Fälle ist GPR35 sowohl in Tumoren als auch in Metastasen exprimiert.
Abb. 19. Quantitative Expression von GUCY2C
Quantitative RT-PCR mit GUCY2C-spezifιschen Primem (SEQ ID NO: 98, 99) zeigen die hohe und selektive Expression im normalen Dickdarm- und Magengewebe (A) sowie die GUCY2C-spezifische Expression in Dickdarm- und Magentumoφroben (B). GUCY2C ist nachweisbar in 11/12 Kolonkarzinomen und in 7/10 Magenkarzinomen.
Abb. 20. Quantitative Expression von SCGB3A2
Quantitative RT-PCR mit SCGB3A2-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 103, 104) zeigen die selektive Expression in Lungen- und Lungentumoφroben. 19/20 Lungentumoφroben sind SCGB3A2-positiv, in mehr als 50% der Proben ist SCGB3A2 um mindestens einen Faktor 10 überexprimiert. Folgende Normalgewebe wurden analysiert: Leber, Lunge, Lymphknoten, Magen, Milz, Nebenniere, Niere, Ösophagus, Ovar, Testis, Thymus, Haut, Brust, Pankreas, Lymphozyten, aktivierte Lymphozyten, Prostata, Schilddrüse, Eileiter, Endometrium, Kleinhirn, Him.
Abb. 21. Immunfluoreszenz mit SCGB3A2-speziiϊschen Antikörpern C0S7-Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das für ein SCGB3A2-GFP- Fusionsprotein kodiert. A. Nachweis des transfϊzierten Fusionsproteins mit einem SCGB3 A2- spezifischen Kaninchen-Antiserum (Immunisierung mit SEQ ID NO: 105). B. Nachweis des transfizierten Fusionsproteins durch GFP-Fluoreszenz. C. Überlagerung der beiden Flureszenzen aus A und B. Die gelbe Färbung entsteht an den Stellen, an denen sich beide Fluoreszenzen überlagern und weist damit die Spezifität des SCGB3 A2-Antiserums nach.
Abb. 22. Schematische Darstellung von CIaudin-18-Spleissvarianten
Die beiden Claudin-18 Spleißvarianten AI und A2 unterscheiden sich im N-Terminus und zeigen unterschiedliche potentielle Glykosylierungsstellen.
Abb. 23. Quantitative Expression von Claudin-18, Variante AI
Claudin-Al ist in einer Vielzahl von Tumorgeweben stark aktiviert. Eine besonders starke Expression findet sich in Magentumoren, Lungentumoren, Pankreaskarzinomen und Speiseröhrenkarzinomen.
Abb. 24. Quantitative Expression von Claudin-18, Variante A2
Wie die Variante AI ist die Variante A2 in vielen Tumoren aktiviert.
Abb. 25. Verwendung Claudin-18A2-spezifischer Antikörper (extrazelluläre Domäne) (oben) Färbung von Claudin-18A2-positiven Magenkarzinomzellen (SNU-16) mit einem Antiköφer, der durch Immunisierung mit einem Peptid (SEQ ID NO: 17) hergestellt wurde. Membranfärbung tritt besonders stark in den Zell/Zell-Interaktionsbereichen auf. A- Präimmun., MeOH; B-Immunserum MeOH, 5 μg/ml (unten) Nachweis der Spezifität des Antiköφes durch Kolokalisationsanalyse in Claudin-18A2-GFP-transfιzierten 293T-Zellen. A-Claudin- 18 A2 GFP; B-anti-Claudin-A2; C-Überlagerung.
Abb. 26. Verwendung CIaudin-18A2-spezifischer Antikörper (extrazelluläre Domäne)
Membranfärbung von Claudin-18A2-positiven Magenkarzinomzellen (SNU-16) mit einem Antiköφer, der durch Immunisierung mit einem Peptid (SEQ ID NO.:113, N-terminal- gelegene extrazelluläre Domäne) hergestellt wurde. Zur Gegenfärbung wurde ein monoklonaler Antiköφer verwendet, der gegen E-Cadherin gerichtet ist. A-Antiköφer; B- Gegenfärbung; C-Überlagerung.
Abb. 27. Verwendung von Antikörpern gegen die C-terminal extrazelluläre Domäne von Claudin-18
(links, oben und unten) Membranfärbung von Claudin~18A2-positiven Magenkarzinomzellen (SNU-16) mit einem Antiköφer, der durch Immunisierung mit einem Peptid (SEQ ID NO.:116, C-terminal-gelegene extrazelluläre Domäne) hergestellt wurde. Zur Gegenfärbung wurde ein monoklonaler Antikörper verwendet, der gegen E-Cadherin gerichtet ist (rechts oben, unten).
Abb. 28. Verwendung Claudin~18Al-spezifischer Antikörper
(oben) schwache bis fehlende Färbung von Magenkarzinomezellen (SNU-16; Claudinl8A2 positiv) mit einem Antikörper, der durch Immunisierung mit einem Claudin-18A1- spezifischen Peptid (SEQ ID NO: 115) hergestellt wurde. A-anti-E-Cadherin; B-anti-Claudin-
18A1; C-Überlagerung.
(unten) Nachweis der Spezifität des Antiköφes durch Kolokalisationsanalyse in Claudin-
18Al-GFP-transfizierten 293T-Zellen. A- GFP-Claudin-18A1; B-anti-Claudin-18Al; C- Überlagerung.
Abb. 29. Nachweis von CIaudin-18A2 im Western-Blot.
Western-Blot mit Lysaten aus verschiedenen gesunden Geweben mit einem Claudin-18A2 spezifischen Antiköφer, gerichtet gegen das Epitop mit SEQ ID NO: 17. 1 -Magen; 2-Testis; 3-Haut; 4-Brust; 5-Leber; 6-Dickdarm; 7-Lunge; 8-Niere; 9-Lymphknoten.
Abb. 30. Claudin-18A2 Western-Blot mit Proben aus Magen und Magentumoren
Lysate aus Magen und Magentumoren wurden geblottet und mit einem Claudin-18A2- spezifischen Antiköφer gegen das Epitop mit SEQ ID NO: 17 getestet. Magentumoren weisen eine geringer glykosylierte Form von Claudin-18A2 auf. PNGase F-Behandlung von Magenlysaten führt zur Bildung der niedrigglykosylierten Form, links: 1-Magen No #A; 2-Magen Tu #A; 3-Magen No #B; 4-Magen Tu #B rechts: 1 -Magen No #A; 2-Magen No #B; 3-Magen No #B + PNGase F; 4-Magen Tu #C; 5- Magen Tu #D; 6-Magen Tu #D+ PNGase F Abb. 31. Expression von Claudin-18 in Lungentumoren
Entsprechend zu Abb. 30 erfolgte ein Nachweis von niedrigglykosylierten, Claudin-18A2- Narianten in Lungentumoren. 1-MagenΝo; 2-Magen Tu; 3-9-Lunge Tu.
Abb. 32. Immunhistochemische Analyse von Claudin-18 mit Claudin-18A2-spezifischen Antikörpern in Magentumorgewebe
Abb. 33. Indirekte Immunfluoreszenz von Magen-spezifischen Snul6-Zellen mit einem CIaudin-18-spezifischen polyklonalen Antiserum A. Färbung mit einem Präimmunserum, generiert vor der Immunisierung; B Färbung mit dem Claudin-18-spezifischen Serum
Abb. 34. Quantitative Expression von SLC13A1
Quantitative RT-PCR mit SLC13 AI -spezifischen Primem (SEQ ID ΝO: 121, 122) zeigen die hohe und selektive Expression in normalem Νierengewebe (A) sowie die SLC13A1- spezifische Expression in Νierenzellkarzinomen (B). SLC 13 AI -Transkription ist in 5/8 Νierenzellkarzinomen nachweisbar.
Abb. 35. Zelluläre Lokalisation von SLC13A1 Immunfluoreszenz zum Nachweis der zellulären Lokalisation von SLC13A1 nach Transfektion eines Plasmides, das ein SLC13Al-GFP-Fusionsprotein bereitstellt. Deutlich zu sehen ist die membranständige Fluoreszenz (als Ring um die transfizierte Zelle) des SLC13A1 -Fusionsproteins.
Abb. 36. Quantitative Expression von CLCAl
Quantitative RT-PCR mit CLCAl -spezifischen Primem (SEQ ID NO: 125, 126) zeigen die hohe und selektive Expression im normalen Dickdarm- und Magengewebe (A) sowie die CLCAl -spezifische Expression in Dickdarm- und Magentumoφroben (B). CLCAl ist nachweisbar in 6/12 Kolonkarzinomen und in 7/10 Magenkarzinomen.
Abb. 37. Quantitative Expression von FLJ21477
Quantitative RT-PCR mit FLJ21477-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 127, 128) zeigen die hohe und selektive Expression im normalen Dickdarm- und Magengewebe sowie eine schwache Expression in Thymus, Ösophagus und Gehirn (A) sowie die FLJ21477-spezifische Expression in Dickdarmtumoφroben (B). FLJ21477 ist nachweisbar in 11/12 Kolonkarzinomen.
Abb. 38. Quantitative Expression von FLJ20694 Quantitative RT-PCR mit FLJ20694-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 129, 130) zeigen die hohe und selektive Expression im normalen Dickdarm- und Magengewebe (A) sowie die FLJ20694-spezifische Überexpression in Dickdarm- und Magentumoφroben (B). FLJ20694 ist nachweisbar in 11/12 Kolonkarzinomen und in 7/10 Magenkarzinomen.
Abb. 39. Quantitative Expression von FLJ21458
Quantitative RT-PCR mit FLJ21458-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 133, 134) zeigen die selektive Expression in Testis, Magen- und Darmgewebe. Außerdem konnten FLJ21458- spezifische Transkripte in 20/20 Dickdarmtumoren und in 7/11 Dickdarmmetastasen nachgewiesen werden. Folgende Normalgewebe wurden analysiert: Leber, Lunge, Lymphknoten, Milz, Nebenniere, Niere, Ösophagus, Ovar, Testis, Thymus, Haut, Brust, Pankreas, Lymphozyten, aktivierte Lymphozyten, Prostata, Schilddrüse, Eileiter, Endometrium, Kleinhirn, Hirn.
Abb. 40. Immunfluoreszenz mit FLJ21458-spezifischen Antikörpern (oben) 293 -Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das für ein FLJ21458-GFP- Fusionsprotein kodiert. A: Nachweis des transfizierten Fusionsproteins mit einem FLJ21458- spezifischen Kannichen-Antiserum (Immunisierung mit SEQ ID NO: 136). B: Nachweis des transfizierten Fusionsproteins durch GFP-Fluoreszenz. C: Überlagerung der beiden Fluoreszenzen aus A und B. Die gelbe Färbung entsteht an den Stellen, an denen sich beide Fluoreszenzen überlagern und weist damit die Spezifität des FLJ21458-Antiserums nach.
(unten) Analyse von Snulό-Zellen, die endogen FLJ21458 synthetisieren. A: Proteinnachweis mit einem FLJ21458-spezifϊschen Kaninchen-Antiserum (Immunisierung mit SEQ ID NO: 136). B: Nachweis des Membranproteins E-Cadherin. C: Überlagerung der beiden Flureszenzen aus A und B. Die gelbe Färbung entsteht an den Stellen, an denen sich beide Fluoreszenzen überlagern, und weist die Membranlokalisation von FLJ21458 nach.
Abb. 41. Sequenzen
Gezeigt sind die Sequenzen, auf die hierin verwiesen wird. Beispiele:
Material und Methoden
Die Begriffe "in silico", "elektronisch" und "virtuell klonieren" beziehen sich rein auf die Nutzung von auf Datenbanken beruhenden Verfahren, mit denen auch Labor-experimentelle Vorgänge simuliert werden können.
Alle anderen Begriffe und Termini werden, falls nicht explizit anders definiert, so verwendet, wie sie der Fachmann versteht. Die genannten Techniken und Methoden erfolgen in an sich bekannter Weise und sind z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y beschrieben. Alle Verfahren, die die Verwendung von Kits und Reagenzien einschließen, sind entsprechend den Angaben der Hersteller durchgeführt.
Datamining-basierte Strategie zur Ermittlung von neuen Tumor-assoziierten Genen Zwei in silico Strategien nämlich GenBank-Schlagwort-Suche und der cDNAxProfiler wurden kombiniert. Es wurde unter Nutzung des ENTREZ Search and Retrieval Systems des NCBI (httpJ/www.ncbi.nlm.nih.gov/Εntrez) eine Suche nach Kandidaten-Genen in der GenBank durchgeführt, die annotiert sind als spezifisch exprimiert in bestimmten Geweben (Wheeler et al., Nucleic Acids Research 28:10-14, 2000). Durch Suchabfragen mit Schlagworten wie beispielsweise "colon-specific gene", " stomach- specific gene", oder "kidney-specific gene" wurden Kandidatengene (GOI, genes of interest) aus den Datenbanken herausextrahiert. Die Suche wurde auf einen Teil der Gesamtinformation dieser Datenbanken eingeschränkt, indem als Limits "homo sapiens" für den Organismus und "mRNA" für die Molekülart eingesetzt wurden. Die Liste der gefundenen GOI wurde kuratiert, indem unterschiedliche Bezeichnungen für dieselbe Sequenz ermittelt und solche Redundanzen behoben wurden. Alle Kandidatengene, die sich durch die Schlagwort-Suche ergaben, wurden wiederum durch das Verfahren des "electronic Northern" (eNorthern) bezüglich ihrer Gewebeverteilung untersucht. Der eNorthern basiert darauf, dass die Sequenz eines GOI gegenüber einer EST- (expressed sequence tag) Datenbank (Adams et al., Science 252: 1651, 1991 ) abgeglichen wird
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Zu jedem EST, das sich als homolog zum eingegebenen GOI ergibt, lässt sich die Gewebeherkunft ermitteln und durch die Summe aller ESTs auf diese Weise eine vorläufige Einschätzung der Gewebeverteilung des GOI erreichen. Nur diejenigen GOI wurden weiteren Untersuchungen zugeführt, die keine Homologien zu EST aus nicht Organ-spezifischen Normalgeweben hatten. Für dies Beurteilung wurde auch berücksichtigt, dass es falsch-anno ierte cDNA-Banken in der öffentlichen Domäne gibt (Scheurle et al., Cancer Res. 60: 4037-4043, 2000)
(www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm). Als zweites Datamining-Verfahren wurde der cDNA xProfiler des Cancer Genome Anatomy Projekts des NCBI (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) genutzt (Hillier et al., Genome Research 6:807- 828, 1996; Pennisi, Science 276:1023-1024, 1997). Dieser erlaubt, Pools von in Datenbanken abgelegten Transkriptomen durch logische Operatoren in Beziehung zueinander zu setzen. Wir haben einen Pool A definiert, dem beispielsweise alle aus Colon hergestellten Expressionsbibliotheken, unter Ausschluss von gemischten Bibliotheken zugeordnet wurden. Dem Pool B wurden alle cDNA-Bibliotheken zugeordnet, die von Normalgeweben mit Ausnahme von Colon hergestellt waren. Generell wurden alle cDNA-Banken unabhängig vom zugrundeliegenden Herstellungsverfahren genutzt, allerdings lediglich solche mit einer Mächtigkeit > 1000 zugelassen. Mittels des BUT NOT Operators wurde Pool B digital von Pool A subtrahiert. Auch das Set der auf diese Weise gefundenen GOI wurde eNorthern- Studien unterzogen, sowie durch eine Literaturrecherche abgesichert.
Dieses kombinierte Datamining schließt alle etwa 13 000 Volllänge-Gene in der öffentlichen Domäne ein und prädiziert aus diesen Gene mit potentieller Organ-spezifischer Expression.
Alle anderen Gene wurden zunächst durch spezifische RT-PCR in Normalgeweben evaluiert. Alle GOI, die sich als in nicht Organ-spezifischen Normalgeweben exprimiert erwiesen, hatten als Falsch-Positive zu gelten und wurden aus weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Die verbliebenen wurden in einem großen Panel an verschiedensten Tumorgeweben untersucht. Die unten dargestellten Antigene erwiesen sich dabei als in Tumorzellen aktiviert.
RNA-Extraktion, Herstellung von poIy-d(T) geprimter cDNA und konventionelle RT- PCR Analyse
Gesamt-RNA aus nativem Gewebematerial wurde unter Verwendung von Guanidium- isothiocyanat als chaotrophem Agens extrahiert (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-9, 1987). Nach Extraktion mit saurem Phenol und Fällung mit Isopropanol wurde die RNA in DEPC-behandeltem Wasser gelöst.
Aus 2-4 μg Gesamt-RNA wurde in einem 20μl Reaktionsansatz mittels Superscript II (Invitrogen) entsprechend den Angaben des Herstellers eine Erststrang-cDNA-Synthese durchgeführt. Als Primer wurde ein dT(18) Oligonukleotid verwendet. Integrität und Qualität der cDNA wurden durch Amplifikation von p53 in einer 30 Zyklen-PCR (sense CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, antisense CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, Hybridisierungstemperatur 67°C) übeφriift. Es wurde ein Archiv aus Erststrang-cDNAs aus einer Reihe von Normalgeweben und Tumorentitäten hergestellt. Für Expressionsstudien wurden 0,5 μl dieser cDNAs in einem 30μl Reaktionsansatz mit GOI-spezifischen Primern (siehe unten) und 1 U HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen) amplifiziert. Der Reaktionsansatz enthielt jeweils 0,3 mM dNTPs, je 0,3 μM jeden Primers und 3 μl 10 x Reaktionspuffer. Die Primer wurden so ausgewählt, dass sie in 2 verschiedenen Exons liegen, und die Beseitigung der Interferenz durch kontaminierende genomische DNA als Grund für falsch positive Resultate wurde durch Testen von nicht revers transkribierter DNA als Matrize bestätigt. Nach 15 Minuten bei 95°C zur Aktivierung der HotStarTaq DNA Polymerase wurden 35 Zyklen PCR durchgeführt (1 min 94°C, 1 min jeweilige Hybridisierungstemperatur, 2 min 72°C und abschließende Elongation bei 72°C für 6 min).
20μl dieser Reaktion wurden auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel aufgetrennt und analysiert.
Folgende Primer wurden für die Expressionsanalyse der entsprechenden Antigene bei der angegebenen Hybridisierungstemperatur verwendet.
GPR35 (65°C)
Sense: 5'-AGGTACATGAGCATCAGCCTG-3' Antisense: 5'-GCAGCAGTTGGC ATCTGAGAG-3 ' GUCY2C (62°C)
Sense: 5'-GCAATAGACATTGCCAAGATG-3 ' Antisense: 5 '-AACGCTGTTGATTCTCCACAG-3 ' SCGB3A2 (66°C) Sense: 5'-CAGCCTTTGTAGTTACTCTGC-3' Antisense: 5 '-TGTCAC ACCAAGTGTGATAGC-3 '
Claudinl8A2 (68°C)
Sensel : 5'-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3 ' Antisensel : 5 '-CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG-3 ' Sense2: 5'- TGTTTTCAACTACCAGGGGC-3 ' Antisense2: 5'- TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3 '
ClaudinlSAl (64°C)
Sense: 5 '-GAGGCAGAGTTCAGGCTTCACCGA-3 '
Antisense: 5'- TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3 ' SLC13A1 (64°C)
Sense: 5'-CAGATGGTTGTGAGGAGTCTG-3 '
Antisense: 5'-CCAGCTTTAACCATGTCAATG-3 '
CLCAl (62°C)
Sense: 5'-ACACGAATGGTAGATACAGTG-3 ' Antisense: 5'-ATACTTGTGAGCTGTTCCATG-3'
FLJ21477 (68°C)
Sense: 5'- ACTGTTACCTTGCATGGACTG-3 '
Antisense: 5'- CAATGAGAAC ACATGGACATG-3 '
FLJ20694 (64°C) Sense: 5'- CCATGAAAGCTCCATGTCTA-3 '
Antisense: 5'- AGAGATGGCACATATTCTGTC
Ebner (70°C)
Sense: 5'-ATCGGCTGAAGTCAAGCATCG-3 '
Antisense: 5'-TGGTCAGTGAGGACTCAGCTG-3 ' Plunc (55°C)
Sense: 5'-TTTCTCTGCTTGATGCACTTG-3 '
Antisense: 5'-GTGAGCACTGGGAAGCAGCTC-3 '
SLC26A9 (67°C)
Sense: 5'-GGCAAATGCTAGAGACGTGA-3 ' Antisense: 5'-AGGTGTCCTTCAGCTGCCAAG-3 '
THC1005163 (60°C)
Sense: 5'- GTTAAGTGCTCTCTGGATTTG-3 '
LOC134288 (64°C)
Sense. 5'-ATCCTGATTGCTGTGTGCAAG-3 ' Antisense: 5'-CTCTTCTAGCTGGTCAACATC-3'
THC943866 (59°C)
Sense: 5'-CCAGCAACAACTTACGTGGTC-3'
Antisense: 5'-CCTTTATTCACCCAATCACTC-3 '
FLJ21458 (62°C) Sense: 5'-ATTCATGGTTCCAGCAGGGAC-3' Antisense: 5'-GGGAGACAAAGTCACGTACTC-3'
Herstellung von Random-Hexamer-geprimter cDNA und quantitative Real-Time-PCR Die Expression mehrere Gene wurde mittels Real-Time-PCR quantifiziert. Dabei wurden die PCR-Produkte mit SYBR-Green als interkaiierendem Reporterfarbstoff detektiert. Die Reporterfluoreszenz von SYBR-Green ist in Lösung supprimiert und erst nach Bindung an dopplesträngige DNA-Fragmente ist der Farbstoff aktiv. Das Ansteigen der SYBR-Green- Fluoreszenz als Folge der spezifischen Amplifikation mittels GOI-spezifischen Primem nach jedem PCR-Zyklus wird zur Quantifizierung genutzt. Die Expressionsquantifizierung des Zielgens erfolgt absolut oder relativ zur Expression eines Kontrollgens mit konstanter Expression in den zu untersuchenden Geweben. Die Expression wurde nach Normalisierung der Proben gegen 18s RNA als sog. Housekeeping-Gen mittels der ΔΔ-Q Methode (PE Biosystems, USA) ermittelt. Die Reaktionen wurden in Duplex-Ansätzen durchgeführt und in Triplikaten bestimmt. Verwendet wurde der QuantiTect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers. Die Synthese der cDNA erfolgte mit dem High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) unter Verwendung von Hexamer- Primem nach Angaben des Herstellers. Jeweils 5 μl der verdünnten cDNA wurden in 25 μl Gesamtvolumen für die PCR eingesetzt: sense-Primer 300nM, antisense-Primer 300nM; initiale Denaturierung 95°C 15 min; 95°C 30 sec; Annealing 30 sec; 72°C 30 sec; 40 Zyklen. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in den jeweiligen Beispielen aufgeführt.
Klonierung und Sequenzanalyse
Klonierung von Vollängen bzw. Genfragmenten erfolgte nach gängigen Methoden. Zur Ermittlung der Sequenz wurden entsprechende Antigene mittels der Proofreading-Polymerase pfu (Stratagene) amplifiziert. Nach Beendigung der PCR wurde Adenosin mittels HotStarTaq DNA Polymerase an die Enden des Amplikons ligiert, um die Fragmente entsprechend den Angaben des Herstellers in den TOPO-TA- Vektor zu klonieren. Die Sequenzierung wurde durch einen kommerziellen Service durchgeführt. Die Sequenzen wurden mittels gängiger Prädiktionsprogramme und Algorithmen analysiert.
Western-Blot
Zellen aus Zellkultur (endogene Expression des Zielgens oder Synthese des Zielproteins nach Transfektion eines Expressionsvektors, der das Zielprotein kodiert) oder Gewebeproben, die das Zielprotein enthalten könnten, werden in einer l%igen SDS Lösung lysiert. Das SDS denaturiert dabei die im Lysat enthaltenen Proteine. Die Lysate eines experimentellen Ansatzes werden abhängig von der erwarteten Proteingröße auf 8-15 %igen denaturierenden Polyacrylamidgelen (enthalten 1% SDS) der Größe nach elektrophoretisch aufgetrennt (SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, SDS-PAGE). Anschließend werden die Proteine durch das semi-dry Elektroblot Verfahren (Biorad) auf Nitrozellulose-Membran (Schleicher & Schüll) transferiert, auf der das gewünschte Protein nachgewiesen werden kann. Dazu wird die Membran zunächst blockiert (z.B. mit Milchpulver) und anschließend mit dem spezifischen Antiköφer in einer Verdünnung von 1:20-1 :200 (je nach Spezifität des Antiköφers) für 60 Minuten inkubiert. Nach einem Waschschritt wird die Membran mit einem zweiten, mit einem Marker (z.B. Enzyme wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase) gekoppelten Antiköφer inkubiert, der den ersten Antiköφer erkennt. Nach einem weiteren Waschschritt wird anschließend das Zielprotein in einer Färb- oder Chemilumineszenz-Reaktion auf der Membran mittels einer Enzymreaktion sichtbar gemacht (z.B. ECL, Amersham Bioscience). Das Ergebnis wird durch Aufnahme mit einer geeigneten Kamera dokumentiert.
Die Analyse von Proteinmodifikationen erfolgt in der Regel im Westem-Blot. Glykosylierungen, die in der Regel eine Größe von mehreren kDa haben, führen zu einer größeren Gesamtmasse des Zielproteins, die sich in der SDS-PAGE auftrennen lässt. Zum Nachweis von spezifischen O- und N-glykosidischen Bindungen werden Proteinlysate aus
Geweben oder Zellen vor der Denaturierung durch SDS mit O- oder N-Glykosidasen inkubiert (nach Angaben des jeweiligen Herstellers, z.B. PNgase, Endoglykosidase F, Endoglykosidase H, Röche Diagnostics). Anschließend erfolgt ein Westem-Blot wie vorstehend beschrieben. Bei Verringerung der Größe eines Zielproteins kann so nach Inkubation mit einer Glykosidase eine spezifische Glykosylierung nachgewiesen und auf diesem Weg auch die Tumorspezifität einer Modifikation analysiert werden. Mit Algorithmen und Prädiktionsprogrammen kann die genaue Position der glykosylierten Aminosäure prädiziert werden.
Immunfluoreszenz
Es werden Zellen etablierter Zelllinien benutzt, die entweder das Zielprotein endogen synthetisieren (Nachweis der RNA in der RT-PCR oder des Proteins im Weste -Blot) oder aber vor der IF mit Plasmid-DNA transfiziert worden sind. Zur Transfektion von Zelllinien mit DNA sind die verschiedensten Methoden (z.B. Elektroporation, Liposomen-basierte Transfektion, Calciumphosphatpräzipitation) gut etabliert (z.B. Lemoine et al. Methods Mol. Biol. 1997; 75: 441-7). Das transfizierte Plasmid kann bei der Immunfluoreszenz das υnmodifizierte Protein kodieren oder aber auch unterschiedliche Aminosäuremarker an das Zielprotein koppeln. Die wichtigsten Marker sind z.B. das fluoreszierende „green fluorescent protein" (GFP) in seinen verschiedenen differentiell fluoreszierenden Formen und kurze Peptidsequenzen von 6-12 Aminosäuren, für die hoch affine und spezifische Antiköφer zur Verfügung stehen. Zellen, die das Zielprotein synthetisieren, werden mit Paraformaldehyd, Saponin oder Methanol fixiert. Anschließend können die Zellen bei Bedarf durch Inkubation mit Detergenzien (z.B. 0,2% Triton X-100) permeabilisiert werden. Nach der Fixierung/Permeabilisierung werden die Zellen mit einem primären Antiköφer inkubiert, der gegen das Zielprotein oder gegen einen der gekoppelten Marker gerichtet ist. Nach einem Waschschritt wird der Ansatz mit einem zweiten, mit einem fluoreszierenden Marker (z.B. Fluorescin, Texas Red, Dako) gekoppelten Antiköφer inkubiert, der an den ersten Antiköφer bindet. Anschließend werden die so markierten Zellen mit Glycerin überschichtet und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops nach den Angaben des Herstellers analysiert. Spezifische Fluoreszenzemissionen werden dabei, abhängig von den eingesetzten Substanzen, durch spezifische Anregung erreicht. Die Analyse erlaubt in der Regel die sichere Lokalisation des Zielproteins, wobei zur Bestätigung der Antiköφerqualität und des Zielproteins in Doppelfärbungen zusätzlich zum Zielprotein auch die gekoppelten Aminosäuremarker oder andere Markeφroteine angefärbt werden, deren Lokalisation bereits in der Literatur beschrieben ist. Ein Sonderfall stellt das GFP und seine Derivate dar, dass direkt angeregt werden kann und selbst fluoresziert, so dass zum Nachweis keine Antiköφer benötigt werden.
Immunhistochemie Die IHC dient im einzelnen dazu, um (1) die Menge an Zielprotein in Tumor- und Normalgeweben abschätzen zu können, (2) zu analysieren, wie viele Zellen in Tumor- und gesundem Gewebe das Zielgen synthetisieren, und/oder (3) den Zelltyp in einem Gewebe (Tumor, gesunde Zellen) zu definieren, in dem das Zielprotein nachweisbar ist. Je nach dem individuellen Antikörper müssen unterschiedliche Protokolle verwendet werden (z.B. „Diagnostic Immunohistochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667" oder in „Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704"). Die Immunhistochemie (IHC) an spezifischen Gewebeproben dient dem Proteinnachweis im entsprechenden Gewebe. Ziel dieses Verfahrens ist es, die Lokalisation eines Proteins in einem funktionell intakten Gewebeverband zu identifizieren. Die IHC dient im einzelnen dazu, um (1) die Menge an Zielprotein in Tumor- und Normalgeweben abschätzen zu können, (2) zu analysieren, wie viele Zellen in Tumor- und gesundem Gewebe das Zielgen synthetisieren, und (3) den Zelltyp in einem Gewebe (Tumor, gesunde Zellen) zu definieren, in dem das Zielprotein nachweisbar ist. Alternativ können die Proteinmengen eines Zielgens durch Gewebsimmunfluoreszenz mittels Digitalkamera und geeigneter Software (z.B. Tillvision, Till-photonics, Deutschland) quantifiziert werden. Die Technologie ist häufig publiziert worden, Details für Färbung und Mikroskopie sind daher z.B. „Diagnostic Immunohistochemistry" von David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667 oder „Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy" ISBN: 0306467704 zu entnehmen. Zu beachten ist, dass aufgrund der Eigenschaften von Antiköφern unterschiedliche Protokolle verwendet werden müssen (nachstehend ist ein Beispiel beschrieben), um zu einem aussagekräftigen Ergebnis zu kommen.
In der Regel werden histologisch definierte Tumorgewebe und als Referenz vergleichbare gesunde Gewebe in der IHC eingesetzt. Als Positiv- und Negativkontrollen können dabei auch Zelllinien dienen, bei denen die Präsenz des Zielgens durch RT-PCR-Analysen bekannt ist. Eine Hintergrundkontrolle ist immer mitzuführen.
Fixierte Gewebe (z.B. Fixation mit aldehydhaltigen Substanzen, Formaldehyd, Paraformaldehyd oder in alkoholischen Lösungen) oder schockgefrorene Gewebestücke mit einer Dicke von 1-1 Oμm werden auf einem Glasträger aufgebracht. Paraffineingebettete Proben werden z.B. mit Xylol deparaffiniert. Die Proben werden mit TBS-T gewaschen und in Serum blockiert. Anschließend erfolgt die Inkubation mit dem ersten Antiköφer (Verdünnung: 1:2 bis 1:2000) für 1-18 Stunden, wobei in der Regel affinitätsgereinigete Antiköφer verwendet werden. Nach einem Waschschritt erfolgt eine ca. 30-60 minütige Inkubation mit einem zweiten Antiköφer, der mit einer Alkalischen Phosphatase (alternativ: z.B. Peroxidase) gekoppelt und gegen den ersten Antiköφer gerichtet ist. Anschließend erfolgt eine Farbreaktion unter Verwendung der von Farbsubstraten, die von dem gebundenen Enyzmen umgesetzt werden (vgl. beispielsweise Shi et al., J Histochem. Cytochem. 39: 741- 748, 1991; Shin et al., Lab. Invest. 64: 693-702, 1991). Zum Nachweis der Antiköφer- Spezifϊtät kann die Reaktion durch vorherige Zugabe des Immunogens kompetitiert werden. Immunisierung
(Siehe auch Monoclonal Antibodies: A Practical Approach by Philip Shepherd, Christopher Dean isbn 0-19-963722-9; Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Im Folgenden wird der Herstellungsprozess von Antiköφern kurz beschrieben, Details sind den zitierten Publikationen zu entnehmen. Zunächst werden Tiere (z.B. Kaninchen) durch eine erste Injektion des gewünschten Zielproteins immunisiert. Durch eine zweite oder dritte Immunisierung innerhalb eines definierten Zeitraums (ca. 2-4 Wochen nach der vorangegangenen Immunisierung) lässt sich die Immunantwort des Tieres gegen das Immunogen verstärken. Wiederum nach verschiedenen definierten Zeitabständen (1. Blutung nach 4 Wochen, anschließend ca. alle 2 Wochen mit insgesamt bis zu 5 Entnahmen) wird den Tieren Blut entnommen und daraus ein Immunserum gewonnen. Die Immunisierung der Tiere erfolgt in der Regel über eines von vier gut etablierten Verfahren, wobei auch andere Verfahren verfügbar sind. Immunisiert werden kann dabei mit Peptiden, die für das Zielprotein spezifisch sind, dem gesamten Protein oder mit extrazellulären Teilsequenzen eines Proteins, das experimentell oder über Prediktionsprogramme identifiziert werden kann.
(1) Im ersten Fall werden an KLH (keyhole limpet hemocyanin) konjugierte-Peptide (Länge: 8-12 Aminosäuren) über ein standardisiertes in vitro- Verfahren synthetisiert und diese Peptide zur Immunisierung verwendet. In der Regel erfolgen 3 Immunisierungen mit einer Konzentration von 5-1000 μg/Immunisierung. Die Durchführung der Immunisierung kann auch als Service von Dienstleistern erfolgen.
(2) Alternativ kann die Immunisierung durch rekombinante Proteine erfolgen. Dazu wird die Monierte DNA des Zielgens in einen Expressionsvektor kloniert und das
Zielprotein analog den Bedingungen des jeweiligen Herstellers (z.B. Röche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen) z.B. zellfrei in vitro, in Bakterien (z.B. E. coli), in Hefe (z.B. S. pombe), in Insektenzellen oder in mammalen Zellen synthetisiert. Nach Synthese in einem der Systeme wird das Zielprotein aufgereinigt, wobei die Aufreinigung dabei in der Regel über standardisierte chromatogralϊsche
Methoden erfolgt. Dabei können auch Proteine für die Immunisierung verwendet werden, die über einen molekularen Anker als Hilfsmittel zur Reinigung verfügen (z.B. His-Tag, Qiagen; FLAG-Tag, Röche Diagnostics; Gst-Fusionsproteine). Eine Vielzahl von Protokollen finden sich z.B. in den „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience.
(3) Falls eine Zelllinie zur Verfügung steht, die das gewünschte Protein endogen synthetisiert, kann auch diese Zelllinie zur Herstellung des spezifischen Antiserums verwendet werden. Die Immunisierung erfolgt dabei in 1-3 Injektionen mit jeweils ca.
1-5 x lO7 Zellen.
(4) Die Immunisierung kann auch durch Injektion von DNA (DNA Immunisierung) erfolgen. Dazu wird das Zielgen zunächst in einen Expressionsvektor kloniert, so dass die Zielsequenz unter der Kontrolle eines starken eukaryontischen Promotors steht (z.B. CMV-Promotor). Anschließend werden 5-100 μg DNA als Immunogen mit einer
„gene gun" in stark durchblutete, kapillare Bereiche eines Organismus transferiert (z.B. Maus, Kaninchen). Die transferierte DNA wird von Zellen des Tieres aufgenommen, das Zielgen wird exprimiert und das Tier entwickelt schließlich eine Immunantwort gegen das Zielgen (Jung et al., Mol Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk et al., Hybrid Hybridomics 21 : 287-293 , 2002).
Qualitätskontrolle des polyklonalen Serums bzw. Antikörpers
Zum Spezifitätsnachweis eignen sich am besten auf Zellkultur-basierende Tests mit anschließendem Westem-Blot (verschiedene Variationen sind z.B. in „Current Protocols in Proteinchemistry", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience, beschrieben). Für den Nachweis werden Zellen mit einer cDNA für das Zielprotein transfiziert, die unter der Kontrolle eines starken eukaryontischen Promotors steht (z.B. Cytomegalovirus-Promotor). Zur Transfektion von Zelllinien mit DNA sind die verschiedensten Verfahren (z.B. Elektroporation, auf Liposomen basierende Transfektion, Kalziumphosphatpräzipitation) gut etabliert (z.B. Lemoine et al., Methods Mol Biol. 75: 441-7, 1997). Alternativ können auch Zelllinien verwendet werden, die das Zielgen endogen exprimieren (Nachweis über Zielgenspezifische RT-PCR). Zur Kontrolle werden im Experiment im Idealfall homologe Gene mit transfiziert, um im folgenden Westem-Blot die Spezifität des analysierten Antiköφers nachweisen zu können.
Im anschließenden Western-Blot werden Zellen aus Zellkultur oder Gewebeproben, die das Zielprotein enthalten könnten, in einer l%igen SDS Lösung lysiert und die Proteine dabei denaturiert. Die Lysate werden auf 8-15%igen denaturierenden Polyacrylamidgelen (enthalten 1% SDS) der Größe nach elekrophoretisch aufgetrennt (SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, SDS-PAGE). Anschließend werden die Proteine durch eines von mehreren Blotting- Verfahren (z.B. semi-dry Elektroblot; Biorad) auf eine spezifische Membran transferiert (z.B. Nitrozellulose, Schleicher & Schüll). Auf dieser Membran kann das gewünschte Protein sichtbar gemacht werden. Dazu wird die Membran zunächst mit dem Antiköφer, der das Zielprotein erkennt (Verdümiung ca. 1 :20-1 :200, je nach Spezifität des Antiköφers), für 60 Minuten inkubiert. Nach einem Waschschritt wird die Membran mit einem zweiten, mit einem Marker (z.B. Enzyme wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase) gekoppelten Antiköφer inkubiert, der den ersten Antiköφer erkennt. In einer Färb- oder chemilumineszenten Reaktion kann anschließend das Zielprotein auf der Membran sichtbar gemacht werden (z.B. ECL, Amersham Bioscience). Ein Antiköφer mit einer hohen Spezifität für das Zielprotein sollte im Idealfall nur das gewünschte Protein selbst erkennen.
Zur Bestätigung der im in silico-Ansatz identifizierten Membranlokalisation des Zielproteins werden verschiedene Verfahren verwendet. Ein wichtiges und gut etabliertes Verfahren unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Antiköφer ist die Immunfluoreszenz (IF). Dazu werden Zellen etablierter Zelllinien benutzt, die entweder das Zielprotein synthetisieren (Nachweis der RNA in der RT-PCR oder des Proteins im Westem-Blot) oder aber mit Plasmid-DNA transfiziert worden sind. Zur Transfektion von Zelllinien mit DNA sind die verschiedensten Vefahren (z.B. Elektroporation, auf Liposomen basierende Transfektion, Kalziumphosphatpräzipitation) gut etabliert (z.B. Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75: 441- 7, 1997). Das in die Zellen transfizierte Plasmid kann bei der Immunfluoreszenz das urlmodifizierte Protein kodieren oder aber auch unterschiedliche Aminosäuremarker an das Zielprotein koppeln. Die wichtigsten Marker sind z.B. das fluoreszierende „green fluorescent protein" (GFP) in seinen verschiedenen differentiell fluoreszierenden Formen, kurze Peptidsequenzen von 6-12 Aminosäuren, für die hoch affine und spezifische Antiköφer zur Verfügung stehen, oder die kurze Aminosäuresequenz Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, die über ihre Cysteine spezifische fluoreszierende Substanzen binden kann (Invitrogen). Zellen, die das Zielprotein synthetisieren, werden z.B. mit Paraformaldehyd oder Methanol fixiert. Anschließend können die Zellen bei Bedarf durch Inkubation mit Detergenzien (z.B. 0,2% Triton X-100) permeabilisiert werden. Anschließend werden die Zellen mit einem primären Antiköφer inkubiert, der gegen das Zielprotein oder gegen einen der gekoppelten Marker gerichtet ist. Nach einem Waschschritt wird der Ansatz mit einem zweiten, mit einem fluoreszierenden Marker (z.B. Fluorescin, Texas Red, Dako) gekoppelten Antiköφer inkubiert, der an den ersten Antiköφer bindet. Anschließend werden die so markierten Zellen mit Glycerin überschichtet und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops nach den Angaben des Herstellers analysiert. Spezifische Fluoreszenzemissionen werden dabei, abhängig von den eingesetzten Substanzen, durch spezifische Anregung erreicht. Die Analyse erlaubt in der Regel die sichere Lokalisation des Zielproteins, wobei zur Bestätigung der Antiköφerqualität und des Zielproteins in Doppelfärbungen zusätzlich zum Zielprotein auch die gekoppelten Aminosäuremarker oder andere Markeφroteine angefärbt werden, deren Lokalisation bereits in der Literatur beschrieben ist. Ein Sonderfall stellt das GFP und seine Derivate dar, die direkt angeregt werden können und selbst fluoreszieren. Die Membranpermeabilität, die durch den Einsatz von Detergenzien gesteuert werden kann, erlaubt in der Immunfluoreszenz den Nachweis, ob ein immunogenes Epitop innerhalb oder außerhalb der Zelle lokalisiert ist. Die Prädiktion der ausgewählten Proteine kann so experimentell untermauert werden. Alternativ kann der Nachweis von extrazellulären Domänen mittels Durchflusszytometrie erfolgen. Dazu werden Zellen unter nicht permeabilisierenden Bedingungen (z.B. mit PBS/Na-Azid/2% FCS/ 5 raM EDTA) fixiert und im Durchflusszytometer nach Angaben des Herstellers analysiert. Nur extrazelluläre Epitope können bei diesem Verfahren von dem zu analysierenden Antiköφer erkannt werden. Im Unterschied zur Immunfluoreszenz kann durch Verwendung von z.B. Propidiumiodid oder Trypanblau zwischen toten und lebenden Zellen unterschieden werden und damit falsch positive Ergebnisse vermieden werden.
Affinitätsreinigung
Die Reinigung der polyklonalen Seren erfolgte im Fall der Peptidantiköφer gänzlich oder im Fall der Antiköφer gegen rekombinante Proteine teilweise als Service durch die beauftragten Firmen. Hierzu wurde in beiden Fällen das entsprechende Peptid bzw. rekombinante Protein kovalent an eine Matrix gebunden, diese nach der Kopplung mit einem nativen Puffer (PBS: phosphate buffered saline) äquilibriert und im Anschluß mit dem Rohserum inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS wurde der Antiköφer mit 100 mM Glycin, pH 2,7 eluiert und das Eluat sogleich in 2 M TRIS, pH 8 neutralisiert. Die so gereinigten Antiköφer konnten dann zur spezifischen Detektion der Zielproteine sowohl durch Westemblotting als auch durch Immunfluoreszenz eingesetzt werden.
Herstellung von EGFP-Transfektanten
Für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von heterolog exprimierten Tumor-assoziierten Antigenen wurde der komplette ORF der Antigene in pEGFP-Cl- und pEGFP-N3 -Vektoren (Clontech) kloniert. Auf Objekträgern kultivierte CHO- und NIH3T3 -Zellen wurden mit den entsprechenden Plasmidkonstrukten unter Verwendung von Fugene-Transfektionsreagenz (Röche) nach Herstellerangaben transfiziert und nach 12-24h mittels Immunfluoreszenz- Mikroskopie analysiert.
Beispiel 1: Identifizierung von GPR35 als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
GPR35 (SEQ ID NO:l) und sein Translationsprodukt (SEQ ID NO: 9) wurden als putativer G-Protein-gekoppelter Rezeptor beschrieben. Die Sequenz ist in der Genbank unter der Zugangs-Nr. AF089087 veröffentlicht. Dieses Transkript kodiert für ein Protein von 309 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 34 kDa. Es wurde prädiziert, dass GPR35 zur Super-Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit 7 Transmembran-Domänen gehört (O'Dowd et al., Genomics 47:310-13, 1998). Um die prädizierte Lokalisation von GPR35 in der Zelle zu bestätigen, wurde das Protein mit eGFP als Reportermolekül fusioniert und nach Transfektion des entsprechenden Plasmids heterolog in 293-Zellen exprimiert. Anschließend wurde die Lokalisation im Fluoreszensmikroskop analysiert. Erfindungsgemäß wurde bestätigt, dass GPR35 ein integrales Transmembranmolekül ist (Abb. 17). Bisherige Untersuchung zu humanem GPR35 (s.u.a. Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell GI Nat Genet. 2000 Oct;26(2): 163-75) legten nahe, dass GPR35 in vielen gesunden Geweben aktiviert ist. Das Leseraster des Gens enthält ein einzelnes Exon. Erfindungsgemäß wurde mit einem Gen- spezifischen Primeφaar (SEQ ID NO: 20, 21) für GPR35 in RT-PCR-Analysen cDNA im Kolon und im Kolonkarzinom (13/26) amplifiziert. Dagegen ist eine signifikante Expression in anderen Normalgeweben nicht nachweisbar. Aufgrund der Besonderheit, dass GPR35 aus einem einzelnen Exon besteht, können genomische DNA- Verunreinigungen nicht mit Intron- überspannenden Primem nachgewiesen werden. Um eine genomische Verunreinigung der RNA-Proben auszuschließen, wurden deshalb alle RNAs mit DNAse behandelt. Erfindungsgemäß wurden mit DNA-freier RNA GPR35 -Transkripte nur im Kolon, im Enddarm, in Testis und in Dickdarmkarzinomen nachgewiesen. Tab. 1. GPR35 -Expression in Normalgeweben
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(nd = nicht bestimmt) Die selektive und hohe Expression von GPR35-Transkripten im normalen Kolon-Gewebe, sowie in Kolon-Karzinom-Biopsien (Abb. 1) war bisher nicht bekannt und kann erfindungsgemäß für molekulare diagnostische Verfahren wie RT-PCR zum Nachweis disseminierender Tumorzellen im Serum und Knochenmark und zum Nachweis von Metastasen in anderen Geweben genutzt werden. Auch die quantitative RT-PCR mit spezifischen Primern (SEQ ID NO:88 und 89) bestätigt, dass GPR35 ein hochselektives darmspezifisches und auch in Darmtumoren und in Darmtumormetastasen erhaltenens Differenzierungsantigen ist. In einigen Darmtumoren ist es im Vergleich zum normalen Darm sogar um ein log überexprimiert (Abb. 18). Zum Nachweis von GPR35-Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide wurden zur Propagierung dieser Antikörper genutzt: SEQ ID NO:90 GSSDLTWPPAIKLGC (AS 9-23) SEQ ID NO:91: DRYVAVRHPLRARGLR (AS 112-127) SEQ ID NO:92 VAPRAKAHKSQDSLC (C-Terminus) SEQ ID NO:93 CFRSTRHNFNSMR (extrazell. Domäne 2)
Färbungen mit diesen Antikörpern z.B. im Westem-Blot bestätigen die Expression in Tumoren. Alle 4 extrazellulären Domänen von GPR35 (Position der prädizierten extrazellulären Domänen in der Sequenz von SEQ ID NO:9: AS 1-22 (SEQ ID NO: 94); AS 81-94 (SEQ ID NO: 95); AS 156-176 (SEQ ID NO: 96); AS 280-309 (SEQ ID NO: 97)) können erfindungs gemäß als Zielstrukturen von monoklonalen Antiköφem genutzt werden. Diese Antiköφer binden spezifisch an die Zelloberfläche von Tumorzellen und können sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Verfahren genutzt werden. Die Überexpression von GPR35 in Tumoren unterstützt einen solchen Einsatz noch zusätzlich. Des weiteren können die für Proteine kodierenden Sequenzen erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Peptid, Protein) zur Induktion von Tumor-spezifischen Immun- Antworten (T- Zell- und B-Zell-vermittelte Immun-Reaktionen) genutzt werden. Darüberhinaus wurde überraschenderweise festgestellt, dass 5' vor dem allgemein bekannten Startcodon ein weiteres Startcodon existiert, welches ein N-terminal verlängertes Protein exprimiert.
Somit wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass ein zuvor als ubiquitär exprimiert beschriebenes Protein, GPR35, selektiv in gastrointestinalen Tumoren, insbesondere in Tumoren des Dickdarms Tumor-assoziiert überexprimiert wird. GPR35 eignet sich daher insbesondere als molekulare Zielstruktur für die Diagnose und Behandlung dieser Tumoren. Bisherige Untersuchung zu humanem GPR35, vgl. z.B. Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque- Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell GI Nat Genet. 2000 Oct;26(2):163-75 legten nahe, dass GPR35 in vielen gesunden Geweben aktiviert ist. Die erfindungsgemäßen Untersuchungen zeigten dagegen, dass GPR35 in den meisten Normalgeweben überraschenderweise nicht signifikant nachweisbar ist und im Gegensatz dazu stark in primären und metastasierenden Dickdarmtumoren aktiviert ist. Femer wurde erfindungsgemäß neben der beschriebenen GPR35-Sequenz eine neue Translationsvariante gefunden, die von einem alternativen Startcodon Gebrauch macht (SEQ ID NO: 10).
GPR35 ist ein Mitglied der Gruppe von G-gekoppelten Rezeptoren (GPCR), eine sehr große Proteinfamilie, die strukturell und funktioneil sehr gut untersucht ist. GPCR eignen sich hervorragend als Zielstrukturen für die Entwicklung pharmazeutisch wirksamer Substanzen, da die dafür notwendigen Verfahren (z.B. Rezeptorexpression, Aufreinigung, Ligandenscreening, Mutagenisierung, funktioneile Inhibition, Auswahl agonistischer und antagonistischer Liganden, radioaktive Markierung von Liganden) sehr gut entwickelt und ausführlich beschrieben sind, vgl. z.B. „G Protein-Coupled Receptors" von Tatsuya Haga, Gabriel Berstein und Gabriel Bernstein ISBN: 0849333849 bzw. in „Identification and Expression of G-Protein Coupled Receptors Receptor Biochemistry and Methodology" von Kevin R. Lynch ASIN: 0471183105. Die erfmdungsgemäße Erkenntnis, dass GPR35 in den meisten gesunden Geweben nicht nachweisbar ist, jedoch Tumor-assoziiert an der Zelloberfläche exprimiert wird, ermöglicht dessen Verwendung als Tumor-assoziierte Zielstruktur z.B. für pharmazeutisch aktive Liganden, insbesondere in Konjugation z.B. mit radioaktiven Molekülen als pharmazeutische Substanzen. In einer besonderen Ausfuhrungsform können radioaktiv markierte Liganden, die an GPR35 binden, zum Nachweis von Tumorzellen oder zur Behandlung von Dickdarmtumoren in vivo verwendet werden. Beispiel 2: Identifizierung von GUCY2C in Leber- und Ovarialtumoren und neuen GUCY2C-Spleißvarianten als diagnostische und therapeutische Krebs-Targets
Die Guanylatcyclase 2C (SEQ ID NO:2; Translationsprodukt: SEQ ID NO: 11) - ein Typ I Transmembranprotein - gehört zur Familie der natriuretischen Peptidrezeptoren. Die Sequenz ist in der Genbank unter der Zugangsnummer NM_004963 veröffentlicht. Durch Bindung der Peptide Guanylin bzw. Uroguanylin oder auch hitzestabiler Enterotoxine (STa) wird die intrazelluläre cGMP-Konzentration erhöht, wodurch Signaltransduktionsprozesse innerhalb der Zelle induziert werden.
Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass sich die Expression von GUCY2C auch auf extraintestinale Bereiche, wie beispielsweise primäre und metastasierende Adenokarzinome des Magens und des Ösophagus erstreckt (Park et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 11 : 739-44, 2002). Eine Spleißvariante des GUCYC, die sowohl in normalem als auch transformiertem Gewebe des Intestinums gefunden wird, beinhaltet eine 142 bp Deletion im Exon 1, wodurch die Translation eines GUCY2C-ähnlichen Produktes verhindert wird (Pearlman et al., Dig. Dis. Sei. 45:298-05, 2000). Die bisher beschriebene einzige Spleißvariante führt zu keinem Translationsprodukt.
Ein erfindungsgemäßes Ziel war, Tumor-assoziierte Spleißvarianten für GUCY2C zu identifizieren, die sowohl diagnostisch als auch therapeutisch nutzbar sind. RT-PCR-Untersuchungen mit einem GUCY2C-spezifischen Primeφaar (SEQ ID NO: 22, 23, 98, 99) zeigen eine ausgeprägte Expression von GUCY2C-Transkripten im normalen Kolon und Magen sowie eine schwache Expression in Leber, Testis, Ovar, Thymus, Milz, Gehirn und Lunge (Tab. 2, Abb. 19). Die Expression in Kolon und Magen war dabei mindestens 50- fach höher als in allen anderen Normalgeweben. Ausgeprägte GUCY2C-Transkript-Spiegel wurden im Kolon- und Magen-Karzinom nachgewiesen (Tab. 2). Diese Ergebnisse wurden durch eine quantitative PCR-Analyse präzisiert und zeigten eine ausgeprägte GUCY2C- Expression im normalen Kolon, Ileum, sowie in fast allen untersuchten Kolon-Karzinom- Proben (Abb. 2, 19B). In manchen Kolonkarzinomproben war eine massive Überexpression nachweisbar. Weiterhin findet sich eine Expression in 7/10 Magentumoren. Darüberhinaus stellten wir überraschenderweise fest, dass das Gen in vielen anderen bisher nicht beschriebenen Tumoren u.a. Ovarial-, Brust-, Leber- und Prostatatumoren aktiviert ist (Abb. 19B, Tab. 2). Tabelle 2: GUC2C-Expression in Normal- und Tumorgeweben
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Für die Detektion von Spleißvarianten in Kolon- und Kolonkarzinomgewebe wurden folgende Primeφaare verwendet: GUCY2C-118s/GUCY2C-498as (SEQ ID NO:24, 29); GUCY2C- 621s/GUCY2C-1140as (SEQ ID NO:25, 30); GUCY2C-1450s/GUCY2C-1790as (SEQ ID NO:26, 31); GUCY2C-1993s/GUCY2C-2366as (SEQ ID NO:27, 32); GUCY2C- 2717s/GUCY2C-3200as (SEQ ID NO:28, 33); GUCY2C-118s/GUCY2C-1140as (SEQ ID NO:24, 30); GUCY2C-621s/GUCY2C-1790as (SEQ ID NO:25, 31); GUCY2C- 1450s/GUCY2C-2366as (SEQ ID NO:26, 32); GUCY2C-1993s/GUCY2C-3200as (SEQ ID NO:27, 33). Bei der Untersuchung von Spleißvarianten im Kolonkarzinomgewebe wurden erfindungsgemäß drei bisher unbekannte Formen identifiziert. a) Eine Deletion von Exon 3 (SEQ ID NO: 3), die zu einer nur 111 Aminosäuren langen Variante der GUCY2C führt, bei der das Asparagin an Position 111 durch ein Prolin ersetzt ist. b) Eine Deletion von Exon 6 (SEQ ID NO: 4), die in einem 258 Aminosäuren langen Expressionprodukt resultiert. C-terminal entstünde hierbei ein 13 Aminosäuren umfassendes Neoepitop. c) Eine Variante . bei der die Nukleotide an den Positionen 1606-1614 bzw. die korespondierenden Aminosäuren L(536), L(537) und Q(538) deletiert sind (SEQ
ID NO: 5). Die erfindungsgemäßen Spleißvarianten mit Deletionen im Exon 3, bzw. Exon 6 (SEQ ID NO: 3, 4) zeichnen sich vor allem dadurch aus, dass die Translationsprodukte (SEQ ID NO: 12, 13) über keine Transmembrandomäne verfugen. Im Fall der Exon 6-Deletion entsteht C- terminal ein Neoepitop von 13 Aminosäuren, welches keinerlei Homologie zu bisher bekannten Proteinen aufweist. Dadurch ist dieses Neoepitop als Zielstruktur für eine Immuntherapie prädestiniert. Die erfindungsgemäße Spleißvariante mit Basendeletionen an den Positionen 1606-1614 (SEQ ID NO: 5) und ihr Translationsprodukt (SEQ ID NO :14) beinhaltet ebenfalls ein Neopitop. Zum Nachweis von GUCY2C-Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt:
SEQ ID NO: 100: HNGSYEISVLMMGNS (AS 31 - 45) SEQ ID NO: 101: NLPTPPTVENQQRLA (AS 1009 - 1023) Solche Antiköφer können prinzipiell für diagnostische wie auch therapeutische Zwecke genutzt werden.
Insbesondere die extrazelluläre Domäne von GUCY2C (Position der prädizierten extrazellulären Domäne aus der Sequenz von SEQ ID NO:ll: AS 454-1073 (SEQ ID NO. 102)) kann erfindungsgemäß als Zielstruktur von monoklonalen Antiköφem genutzt werden. Allerdings ist die Strukturvorhersage nicht ganz eindeutig und experimentell noch nicht belegt, so dass auch eine alternative Membranorientierung denkbar ist. In diesem Fall würden die Aminosäuren 1-431 extrazellulär sein und sich als Ansatzpunkt für monoklonale Antikörper eignen. Diese Antiköφer binden spezifisch an die Zelloberfläche von Tumorzellen und können sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Verfahren genutzt werden. Die Überexpression von GUCY2C, insbesondere in den Kolontumoren unterstützt einen solchen Einsatz noch zusätzlich. Des weiteren können die für Proteine kodierenden Sequenzen erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Peptide, Protein) zur Induktion von Tumor-spezifischen Immun-Antworten (T-Zell- und B-Zell-vermittelte Immun-Reaktionen) genutzt werden.
Des weiteren können entsprechend der zellulären Funktion des GUCY2C-Moleküls erfindungs gemäß Substanzen, insbesondere kleine Moleküle entwickelt werden, die die Funktion des Enzyms auf Tumorzellen modulieren. Das Produkt der Enzymreaktion, cGMP, ist ein bekanntes zelluläres Signalmolekül mit unterschiedlichsten Funktionen (Tremblay et al. Mol Cell Biochem 230, 31).
Beispiel 3: Identifizierung von SCGB3A2 als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
SCGB3A2 (SEQ ID NO: 6) (Translationsprodukt: SEQ ID NO: 15) gehört zur Genfamilie der Sekretoglobine. Die Sequenz ist in der GenBank unter der Zugangsnummer NM_054023 veröffentlicht. SCGB3A2 (UGRP1) ist ein homodimerisches sekretorisches Protein von 17 kDa Größe, das ausschließlich in der Lunge und in den Tracheen exprimiert wird (Niimi et al., Am JHum Genet 70:718-25, 2002). RT PCR-Untersuchungen mit einem Primeφaar (SEQ ID NO: 37, 38) bestätigten eine selektive Expression in normalem Lungen-Gewebe. Lungen- und luftröhrenspezifische Gene, z.B. für Surfactant-Proteine, werden in malignen Tumoren im Rahmen der Dedifferenzierung stark runterreguliert und lassen sich üblicherweise nicht in Lungentumoren nachweisen. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass SCGB3A2 in primären und metastasierenden Lungentumoren aktiv ist. Die erfindungsgemäßen Untersuchungen zeigten, dass SCGB3A2 in Bronchialkarzinomen stark und frequent exprimiert wird (Abb. 4). Alle anderen getesteten 23 Normalgewebe weisen bis auf Lunge und Trachea keine Expression auf (vgl. Abb. 20).
Dies wurde mit einer spezifischen quantitativen RT-PCR (SEQ ID NO.T03, 104) zusätzlich bestätigt (Abb. 20), die zusätzlich in mehr als 50% der Bronchialkarzinome eine Überexpression von mindestens einem log aufweist. Die selektive und hohe Expression von SCGB3 A2 im normalen Lungen-Gewebe, sowie in
Lungen-Karzinom-Biopsien kann erfindungsgemäß für molekulare diagnostische Verfahren wie RT-PCR zum Nachweis disseminierender Tumorzellen im Blut und Knochenmark, Sputum, Bronchial-Aspirat oder Lavage und zum Nachweis von Metastasen in anderen Geweben z.B. in lokalen Lymphknoten genutzt werden. In der gesunden Lunge wird SCGB3A2 von spezialisierten Zellen ausschliesslich in die Bronchien ausgeschüttet. Dementsprechend ist nicht zu erwarten, dass sich bei gesunden Individuen SCGB3 A2-Protein in Köφerflüssigkeiten ausserhalb der Atemwege nachweisen lässt. Dagegen sekretieren insbesondere metastasierende Tumorzellen ihre Proteinprodukte direkt in die Blutbahn. Ein Aspekt der Erfindung betrifft daher die Detektion von SCGB3A2-Produkten im Serum oder Plasma von Patienten über einen spezifischen Antiköφertest als diagnostischer Befund für Lungentumoren.
Zum Nachweis von SCGB3A2-Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt: SEQ ID NO: 105: LLNKVPLPVDKLAPL SEQ ID NO-.106: SEAVKKLLEALSHLV
Eine SCGB3A2-spezifische Reaktion konnte in der Immunfluoreszenz nachgewiesen werden (Abb. 21). Wie für ein sezerniertes Protein erwartet, ergab sich eine Verteilung von SCGB3A2 in der Zelle, die dem endoplasmatischem Retikulum und Sekretionsgranula zugeordnet werden konnte (Abb. 21A). Zur Spezifitätskontrolle wurden die Zellen parallel mit einem Plasmid transfiziert, dass ein SCGB3A2-GFP-Fusionsprotein synthetisiert. Der Proteinnachweis erfolgte hier über das autofluoreszierende GFP (grünes fluoreszierendes Protein) (Abb. 21B). Eine Überlagerung beider Fluoreszenzbilder zeigt eindeutig, dass das Immunserum spezifisch SCGB3A2-Protein erkennt (Abb. 21 C). Solche Antiköφer können erfindungsgemäß z.B. in Form von Immuntests für diagnostische wie auch therapeutische Zwecke genutzt werden.
Beispiel 4: Identifizierung von Claudin-18A1- und Claudin-18A2-Spleißvarianten als diagnostische und therapeutische Krebs-Targets
Das Claudin-18-Gen kodiert für ein Oberflächenmembranmolekül mit 4 Transmembrandomänen und intrazellulärem N- wie auch C-Terminus. Niimi und Kollegen (Mol. Ceϊl. Biol. 21 :7380-90, 2001) beschrieben zwei Spleißvarianten des Maus- und humanen Claudin-18, die als selektiv in Lungengewebe (Claudin-18A1) bzw. in Magengewebe (Claudin-18A2) exprimiert beschrieben wurden. Diese Varianten unterscheiden sich im N-Terminus (Abb. 22).
Erfindungsgemäß wurde untersucht, inwieweit die Spleißvarianten Claudin-18A2 (SEQ ID NO :7) und Claudin-18A1 (SEQ ID NO: 117) sowie ihre jeweiligen Translationsprodukte (SEQ ID NO: 16 und 118) als Marker bzw. therapeutische Zielstrukturen für Tumoren genutzt werden können. Es wurde eine quantitative PCR, die zwischen beiden Varianten unterscheiden kann, etabliert, indem AI -spezifische (SEQ ID NO 109 & 110) bzw. A2- spezifische (SEQ ID NO 107 & 108) Primerpaare ausgewählt wurden. Die Spleißvariante A2 wurde zusätzlich mit einem zweiten Primeφaar in einer konventionellen PCR getestet (SEQ ID NO: 39 & 40). Für die Variante AI ist beschrieben, dass sie nur in der normalen Lunge aktiv ist. Jedoch wurde erfindungsgemäß überraschenderweise festgestellt, dass die Variante AI auch in der Magenschleimhaut aktiv ist. Magen und Lunge sind die einzigen Normalgewebe, die eine signifikante Aktivierung aufweisen. Alle anderen Normalgewebe sind negativ für Claudin-Al. Bei der Untersuchung von Tumoren wurde überraschend festgestellt, dass Claudin-Al in einer Vielzahl von Tumorgeweben stark aktiviert ist. Ein besonders starke Expression findet sich in Magentumoren, Lungentumoren, Pankreaskarzinomen, Speiseröhrenkarzinomen (Abb. 23), Tumoren des HNO-Bereichs und Prostatakarzinomen. Die Expressionslevel von Claudin-Al in HNO-, Prostata-, Pankreas- und Speiseröhrentumoren sind 100-10000 höher als die Level in dem korrespondierenden Normalgeweben. Für die Untersuchung der Claudin-A2-Spleißvariante wurden Oligonukleotide verwendet, die spezifisch die Amplifikation dieses Transkripts ermöglichen (SEQ ID NO: 39 & 40 bzw. 107 & 108). Die Untersuchung ergab, dass die Spleißvariante A2 in keinem der mehr als 20 untersuchten Normalgewebe außer in Magenschleimhaut und in geringem Ausmaß auch Testisgewebe exprimiert wird. Wir stellten fest, dass wie die Variante AI auch die Variante A2 in vielen Tumoren aktiviert ist (beispielhaft dargestellt in Abb. 24). Hierzu zählen Magenrumore (8/10), Bauchspeicheldrüsentumoren (6/6), Speiseröhrenkarzinome (5/10) und Leberkarzinome. Obwohl sich in gesunder Lunge keine Aktivierung von Claudin-18A2 nachweisen lässt, wurde überraschend festgestellt, dass ein Teil der Lungentumoren die Spleiß Variante A2.1 exprimieren.
Tabelle 3A. Expression von Claudin-18A2 in Normal- und Tumor-Geweben
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Tabelle 3B. Expression von Claudin-18A1 in Normal- und Tumor-Geweben
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Auch die konventionelle PCR als unabhängige Kontrolluntersuchung bestätigte die Resultate der quantitativen PCR. Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 39, 40) verwendet, die eine spezifische Amplifikation der Spleißvariante A2 erlauben. Erfindungsgemäß wurde gezeigt, dass 8/10 Magenkarzinome und die Hälfte der getesteten Pankreaskarzinome eine starke Expression dieser Spleißvariante aufweisen (Abb. 5). Dagegen ist eine Expression mit konventioneller PCR in anderen Geweben nicht nachweisbar. Insbesondere findet sich in Lunge, Leber, Blut, Lymphknoten, Brust- und Nierengewebe keine Expression (Tab. 3). Hiermit stellen die Spleißvarianten erfindungsgemäß hochspezifische molekulare Marker für Tumoren des oberen Magendarmtraktes wie auch Lungentumoren, HNO-Tumoren, Prostatakarzinome und ihre Metastasen dar. Diese molekulare Marker können erfindungsgemäß zum Nachweis von Tumorzellen genutzt werden. Die Detektion- der Tumoren kann erfindungsgemäß mit den genannten Oligonukleotiden (SEQ ID NO. 39, 40, 107-110) erfolgen. Als Oligonukleotide eignen sich insbesondere Primeφaare, von denen mindestens einer unter stringenten Bedingungen an einen 180 Basenpaare langen Abschnitt des Transkripts bindet, der spezifisch für die eine (SEQ ID NO: 8) oder andere Spleiß Variante (SEQ ID NO: 119) ist. Um diese Daten auf Proteinebene zu bestätigen, wurden Claudin-spezifische Antiköφer bzw. Immunseren durch Immunisierung von Tieren generiert. Über Analyse der Transmembrandomänen mit bioinformatischen Werkzeugen (TMHMM, TMPRED) und Immunfluoreszensuntersuchungen von Zellen, die mit enhanced GFP getagte Claudin- 18- Fusionsproteine exprimieren, wurde die Plasmamembranlokalisation von Claudin- 18 und die Proteintopologie bestätigt. Claudin 18 besitzt zwei extrazelluläre Domänen. Die N-terminale extrazelluläre Domäne unterscheidet sich in der Sequenz bei den beiden Spleißvarianten (SEQ ID NO: 111 für AI und SEQ ID NO: 112 für A2). Die C-terminale extrazelluläre Domäne ist für beide Varianten identisch (SEQ ID NO: 137). Bisher sind noch keine Antiköφer beschrieben, die an die extrazelluläre Domänen von Claudin- 18 binden. Erfindungsgemäß wurden für die Immunisierung extrazellulär gelegene Peptidepitope ausgewählt, die spezifisch für die Variante AI oder A2 sind bzw. in beiden Varianten vorkommen. Beide Varianten von Claudin- 18 haben keine klassischen Glykosylierungsmotive und eine Glykosylierung des Proteins war daher nicht zu erwarten. Trotzdem wurde bei der Auswahl der Epitope berücksichtigt, dass Epitope, die Asparagin, Serin, Threonin enthalten in seltenen Fällen auch ohne klassische Glykosylierungsstellen potentiell glykosyliert sind. Die Glykosylierung eines Epitops kann die Bindung eines für dieses Epitop-spezifischen Antiköφers verhindern. Erfindungsgemäß wurden u.a. Epitope so ausgewählt, dass die damit generierten Antiköφer eine Unterscheidung des Glykosylierungsstatus des Antigens erlauben. Unter anderem wurden zur Immunisierung folgende Peptide für die Hestellung von Antiköφem ausgewählt: SEQ ID NO: 17: DQWSTQDLYN (N-terminal-extrazelluläre Domäne, A2-spezifιsch, Bindung unabhängig von Glykosylierung)
SEQ ID NO: 18: NNPVTAVFNYQ (N-terminal-extrazelluläre Domäne, A2-spezifιsch, Bindung hauptsächlich an unglykosylierte Form, N37) SEQ ID NO: 113: STQDLYNNPVTAVF (N-terminal-extrazelluläre Domäne, A2-spezifisch, Bindung nur an nicht glykosylierte Form, N37)
SEQ ID NO: 114: DMWSTQDLYDNP (N-terminal-extrazelluläre Domäne, AI -spezifisch) SEQ ID NO: 115: CRPYFTILGLPA (N-terminal-extrazelluläre Domäne, hauptsächlich spezifisch für A 1 )
SEQ ID NO: 116: TNFWMSTANMYTG (C-terminal-extrazelluläre Domäne, erkennt sowohl AI als auch A2).
Beispielhaft werden die Daten für den A2-spezifischen Antiköφer, der durch Immunisierung mit SEQ ID NO: 17 hergestellt wurde, dargestellt. Der spezifische Antiköφer lässt sich unter verschiedenen Fixationsbedigungen für Immunfluoreszenz-Untersuchungen nutzen. Bei vergleichenden Färbungen von RT-PCR-positiven wie auch negativen Zelllinien ist das entsprechende Protein in gut nachweisbarer Menge spezifisch in den als positiv typisierten Magenkarzinom-Zelllinien detektierbar (Abb. 25). Das endogene Protein ist membranlokalisiert und bildet größere fokale Aggregate an der Membran. Dieser Antiköφer wurde des weiteren für einen Proteinnachweis im Westem-Blot eingesetzt. Erwartungsgemäß wird Protein lediglich in Magen und keinem anderen Normalgewebe, auch nicht Lunge detektiert (Abb. 29). Bei der vergleichenden Färbung von Magentumoren und adjazentem normalem Magengewebe aus Patienten fiel überraschend auf, dass in allen Magentumoren, in denen Claudin- 18 A2 detektiert wird, dieses Protein ein kleineres Massengewicht hat (Abb. 30, links). In einer Serie von Experimenten wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass eine Bande auf dieser Höhe sich auch ergibt, wenn man Lysat normalen Magengewebes mit dem deglykosylierenden Agens PNGase F behandelt (Abb. 30, rechts). Während in allen normalen Magengeweben ausschließlich die glykosylierte Form der Variante A2 nachweisbar ist, ist A2 als solches in über 60% der untersuchten Magenkarzinome und zwar ausschließlich in der deglykosylierten Form nachweisbar. Obwohl die A2 -Variante von Claudin- 18 in normaler Lunge auch auf Proteinebene nicht detektiert wird, ist sie wie auch schon in der quantitativen RT-PCR in Bronchialkarzinomen zu finden. Auch hier liegt lediglich die deglykosylierte Variante vor (Abb. 31). Erfindungsgemäß sind Antiköφer hergestellt worden, die die extrazelluläre Domäne der Spleißsvariante Claudin- 18-A2 erkennen. Des weiteren wurden Antiköφer hergestellt, die selektiv die N-terminale Domäne der Spleiß Variante Claudin- 18- Al erkennen (Abb. 28) bzw. Antiköφer, die an beide Varianten im Bereich der C-terminal- extrazellulären Domäne binden (Abb. 27). Erfindungsgemäß können derartige Antiköφer für diagnostische Zwecke z.B. Immunhistologie (Abb. 32) aber auch für therapeutische Zwecke wie oben erläutert verwendet werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt betrifft differentiell glykosylierte Domänen von Claudin-18. Erfindungs gemäß wurden Antiköφer hergestellt, die exklusiv an nicht-glykosylierte Epitope binden. Claudin- 18 selbst ist ein hochselektives Differenzierungsantigen von Magengewebe (A2) bzw. von Lunge und Magen (AI). Da es offensichtlich von Veränderungen der Glykosylierungmaschinerie in Tumoren betroffen ist, entsteht in Tumoren eine besondere Variante von A2, die deglykosyliert ist. Dies kann diagnostisch wie auch therapeutisch genutzt werden. Immunseren, wie das hier beschriebene (gegen Peptid SEQ ID NO: 17) können z.B. im Western-Blot diagnostisch genutzt werden. Antiköφer, die an das glykosylierte Epitop gar nicht binden können, wie z.B. durch Immunisierung mit Peptid SEQ ID NO: 113 (Abbildung 26) erhalten, können in der Bindung Tumor- von Normalgewebe unterscheiden. Insbesondere können solche Antiköφer therapeutisch eingesetzt werden, da sie hochselektiv sind. Die hergestellten Antiköφer können direkt auch zur Herstellung von chimären oder humanisierten rekombinanten Antiköφem verwendet werden. Dies kann auch direkt mit Antiköφern erfolgen, die aus Kaninchen gewonnen wurden (s. dazu J Biol Chem. 2000 May 5;275(18): 13668-76 von Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, Cohen LS, Welt S, Old LJ, Barbas CF 3rd. „The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies"). Hierzu wurden von den immunisierten Tieren Lymphozyten asserviert. Auch für immuntherapeutische Verfahren wie Vakzinen bzw. den adoptiven Transfer von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten stellen die Aminosäuren 1-47 (SEQ ID NO: 19 und 120) besonders gute Epitope dar.
Beispiel 5: Identifizierung von SLC13A1 als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
SLC13A1 gehört zur Familie der Natrium-Sulfat-Cotransporter. Das humane Gen ist im Gegensatz zum Maus-Homolog dieses Gens selektiv in der Niere exprimiert (Lee et al., Genomics 70:354-63). SLC13A1 kodiert für ein Protein von 595 Aminosäuren und enthält 13 putative Transmembran-Domänen. Durch alternatives Spleißen entstehen 4 verschiedene Transkripte (SEQ ID NO: 41-44) und seine entsprechenden Translationsprodukte (SEQ ID NO: 45-48). Es wurde untersucht, ob SLC13A1 als Marker für Nierentumore genutzt werden kann. Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 49, 50) verwendet, die eine spezifische Amplifikation von SLC13A1 ermöglichen.
Tab.4. Expression von SLC13A1 in Normal- und Tumorgeweben
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RT-PCR-Untersuchungen mit einem SLC13Al-spezifischen Primeφaar (SEQ ID NO: 49, 50) bestätigten eine nahezu selektive Expression in der Niere, und zeigten erfindungsgemäß eine hohe Expression in nahezu allen (7/8) untersuchten Nierenzellkarzinom-Biopsien (Tab. 4, Abb. 6). Auch quantitative RT-PCR mit spezifischen Primem (SEQ ID NO: 121, 122) bestätigen diese Daten (Abb. 34). Schwache Signale waren in folgenden Normalgeweben nachweisbar: Kolon, Magen, Testis, Mamma, Leber und Gehim. Die Expression in Nierenkarzinomen war aber mindestens 100-fach höher als in allen anderen Normalgeweben. Um die subzelluläre Lokalisation von SLC13A1 in der Zelle zu analysieren, wurde das Protein mit eGFP als Reportermolekül fusioniert und nach Transfektion des entsprechenden Plasmids heterolog in 293 -Zellen exprimiert. Anschließend wurde die Lokalisation im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Unsere Daten bestätigen nachdrücklich, dass SLC13A1 ein integrales Transmembranmolekül ist (Abb. 35).
Zum Nachweis des SLC 13 AI -Proteins wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Zur Propagierung dieser Antiköφer wurden die Peptide der SEQ ID NO: 123 und 124 genutzt. Solche Antiköφer können prinzipiell für diagnostische wie auch therapeutische Zwecke genutzt werden. Das SLC 13 AI -Protein hat 13 Transmembrandomänen und 7 extrazelluläre Regionen. Insbesondere diese extrazellulären Domänen von SLC 13 AI können erfindungsgemäß als Zielstrukturen von monoklonalen Antiköφem genutzt werden. SLC 13 AI ist als Kanalprotein an dem Transport von Ionen beteiligt. Die extrazellulären Domänen von SLC 13 AI in der gesunden Niere sind polar in Richtung Harnwege (luminal) gerichtet. Therapeutisch eingesetzte hochmolekulare monoklonale Antikörper werden jedoch nicht in die Hamwege ausgeschieden, so dass keine Bindung an SLC 13 AI in der gesunden Niere stattfindet. Dagegen ist die Polarität von SLC 13 AI in Tumorzellen aufgehoben und das Protein direkt über den Blutkreislauf für Antiköφertargeting zugänglich. Die ausgeprägte Expression und hohe Inzidenz von SLC13A1 in Nierenzellkarzinomen machen dieses Protein erfindungsgemäß zu einem hochinteressanten diagnostischen und therapeutischen Marker. Dies umfasst erfindungs gemäß den Nachweis disseminierter Tumorzellen im Serum, Knochenmark, . Urin, sowie die Detektion von Metastasen in anderen Organen mittels RT- PCR. Des weiteren können die extrazellulären Domänen von SLC 13 AI erfindungsgemäß als Zielstruktur zur Immun-Diagnostik und Therapie mittels monoklonaler Antiköφer verwendet werden. Des weiteren kann SLC 13 AI erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Protein, Peptide) zur Induktion Tumor-spezischer Immunantworten (T-und B-Zell vermittelte Immunreaktionen) eingesetzt werden. Dies umfasst erfindungsgemäß auch die Entwicklung von sogenannten „small compunds", die die biologische Aktivität von SLC 13 AI modulieren und zur Therapie von renalen Tumoren eingesetzt werden können. Beispiel 6: Identifizierung von CLCAl als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
CLCAl (SEQ ID NO: 51; Translationsprodukt: SEQ ID NO: 60) gehört zur Familie der CεT- aktivierten Cl"-Kanäle. Die Sequenz ist in der Genbank unter der Zugangs-Nr. NM_001285 veröffentlicht. CLCAl ist ausschließlich im intestinalen Kryptenepithel und in den Becherzellen exprimiert (Gruber et al., Genomics 54:200-14, 1998). Es wurde untersucht, ob CLCAl als Marker für Kolon- und Magenkarzinom genutzt werden kann. Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 67, 68) verwendet, die eine spezifische Amplifikation von CLCAl ermöglichen. RT-PCR-Untersuchungen mit diesem Primer-Set bestätigten eine selektive Expression im Kolon, und zeigten erfindungsgemäß eine hohe Expression in (3/7) untersuchten Kolon- und (1/3) untersuchten Magenkarzinom-Proben (Abb. 7). Die übrigen Normalgewebe zeigten keine oder nur eine sehr schwache Expression. Dies wurde mit einer spezifischen quantitativen RT-PCR (SEQ ID NO: 125, 126) zusätzlich bestätigt, wobei in den analysierten Normalgeweben keine Expression nachgewiesen werden konnte (Abb. 36). Bei den in diesem Experiment untersuchten Tumoφroben waren 6/12 Kolonkarzinomproben und 5/10 Magenkarzinomproben positiv für CLCAl. Insgesamt scheint die Expression des Genes in Tumoren dysreguliert zu sein. Neben sehr stark exprimierenden Proben war CLCAl in anderen Proben deutlich herunterreguliert. Für das Protein sind 4 Transmembrandomänen mit insgesamt 2 extrazellulären Regionen prädiziert. Insbesondere diese extrazellulären Domänen von CLCAl können erfindungsgemäß als Zielstrukturen von monoklonalen Antiköφern genutzt werden. Die ausgeprägte Expression und die hohe Inzidenz von CLCAl für Magen- und Kolonkarzinome machen dieses Protein erfindungsgemäß zu einem interessanten diagnostischen und therapeutischen Marker. Dies umfasst erfindungsgemäß den Nachweis disseminierter Tumorzellen im Serum, Knochenmark, Urin, sowie die Detektion von Metastasen in anderen Organen mittels RT-PCR. Des weiteren können die extrazellulären Domänen von CLCAl erfindungsgemäß als Zielstruktur zur hnmun-Diagnostik und Therapie mittels monoklonaler Antiköφer verwendet werden. Des weiteren kann CLCAl erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Protein, Peptide) zur Induktion Tumor-spezischer
Immunantworten (T~und B-Zell vermittelte Immunreaktionen) eingesetzt werden. Dies umfasst erfindungsgemäß auch die Entwicklung von sogenannten „small compunds", die die biologische Aktivität als Transportprotein von CLCAl modulieren und zur Therapie von gastrointestinalen Tumoren eingesetzt werden können. Beispiel 7: Identifizierung von FLJ21477 als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
FLJ21477 (SEQ ID NO: 52) und sein prädiziertes Translationsprodukt (SEQ ID NO: 61) wurde als hypothetisches Protein in der Genbank unter der Zugangs-Nr. NM_025153 veröffentlicht. Es handelt es sich um ein integrales Membranprotein mit ATPase-Aktivität und 4 Transmembrandomänen, das entsprechend für Therapie mit spezifischen Antiköφem geeignet ist. RT-PCR-Untersuchungen mit FLJ21477-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 69, 70) zeigten eine selektive Expression im Kolon, und darüber hinaus unterschiedlich stark ausgeprägte Expression in (7/12) untersuchten Kolon-Karzinom-Proben (Abb. 8). Die übrigen Normalgewebe zeigten keine Expression. Dies wurde mit einer spezifischen quantitativen RT-PCR (SEQ ID NO: 127, 128) zusätzlich bestätigt. Sowohl in Kolon (Abb. 37A) als auch in 11/12 Kolonkarzinomen war eine FLJ21477-spezifische Expression nachweisbar. Neben der Expression in Kolongewebe konnte zusätzlich eine Expression in Magengewebe nachgewiesen werden. Außerdem war unter den Bedingungen der quantitativen RT-PCR eine im Vergleich mit Kolon und Magen deutlich schwächere Expression in Gehirn, Thymus und Ösophagus nachweisbar (Abb. 37A). Zusätzlich konnte außerdem in den folgenden Tumoφroben eine FLJ21477-spezifische Expression nachgewiesen werden: Magen, Pankreas, Ösophagus und Leber. Für das Protein sind 4 Transmembrandomänen mit insgesamt 2 extrazellulären Regionen prädiziert. Insbesondere diese extrazellulären Domänen von FLJ21477 können erfindungsgemäß als Zielstrukturen von monoklonalen Antiköφem genutzt werden. Die Expression und hohe Inzidenz von FLJ21477 für Magen- und Kolonkarzinome machen dieses Protein erfindungsgemäß zu einem wertvollen diagnostischen und therapeutischen Marker. Dies umfasst erfindungsgemäß den Nachweis disseminierter Tumorzellen im Serum,
Knochenmark, Urin, sowie die Detektion von Metastasen in anderen Organen mittels RT- PCR. Des weiteren können die extrazellulären Domänen von FLJ21477 erfindungsgemäß als Zielstruktur zur Immun-Diagnostik und Therapie mittels monoklonaler Antiköφer verwendet werden. Des weiteren kann FLJ21477 erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Protein, Peptide) zur Induktion Tumor-spezischer Immunantworten (T-und B-Zell vermittelte
Immunreaktionen) eingesetzt werden. Beispiel 8: Identifizierung von FLJ20694 als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
FLJ20694 (SEQ ID NO: 53) und sein Translationsprodukt (SEQ ID NO: 62) wurden als hypothetisches Protein in der Genbank unter der Zugangs-Nr. NM_017928 veröffentlicht. Bei diesem Protein handelt es sich um ein integrales Transmembranmolekül (Transmembrandomäne AS 33-54), höchstwahrscheinlich mit Thioredoxinfunktion. RT-PCR- Untersuchungen mit FLJ20694-spezifischen Primern (SEQ ID NO: 71, 72) zeigten eine selektive Expression im Kolon, und darüber hinaus unterschiedlich stark ausgeprägte Expression in (5/9) untersuchten Kolon-Karzinom-Proben (Abb. 9). Die übrigen Normalgewebe zeigten keine Expression. Dies wurde mit einer spezifischen quantitativen RT-PCR (SEQ ID NO: 129, 130) zusätzlich bestätigt (Abb. 38). In keinem anderen Normalgewebe außer in Kolon und Magen (im ersten Experiment nicht analysiert) konnte eine FLJ29694 Expression nachgewiesen werden. Für das Protein ist eine Transmembrandomäne mit einer extrazellulären Region prädiziert. Insbesondere diese extrazellulären Domänen von FLJ20694 können erfindungsgemäß als Zielstrukturen von monoklonalen Antiköφern genutzt werden.
Des weiteren kann FLJ20694 erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Protein, Peptide) zur Induktion Tumor-spezifischer Immunantworten (T-und B-Zell vermittelte Immunreaktionen) eingesetzt werden. Dies umfasst erfindungsgemäß auch die Entwicklung von sogenannten „small compunds", die die biologische Aktivität von FLJ20694 modulieren und zur Therapie von gastrointestinalen Tumoren eingesetzt werden können.
Beispiel 9: Identifizierung des von Ebner Proteins (c20orfll4) als diagnostisches und therapeutisches Krebs-Target
Das von Ebner Protein (SEQ ID NO: 54) und sein Translationsprodukt (SEQ ID NO: 63) wurden als Plunc-verwandtes Protein der oberen Luftwege und des Nasen-Rachen-Epithels in der Genbank unter der Zugangs-Nr. AF364078 veröffentlicht. Erfindungsgemäß wurde untersucht, ob das von Ebner Protein als Marker von Lungenkarzinom genutzt werden kann.
Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 73, 74) verwendet, die eine spezifische Amplifikation des Ebner Proteins ermöglichen. RT-PCR-Untersuchungen mit diesem Primer- Set zeigten eine selektive Expression in der Lunge und in (5/10) untersuchten Lungenkarzinom-Proben (Abb. 10). Innerhalb der Gruppe der Normalgewebe zeigte sich auch eine Expression im Magen. Die übrigen Normalgewebe zeigten keine Expression.
Beispiel 10: Identifizierung von Plunc als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
Plunc (SEQ ID NO: 55) und sein Translationsprodukt (SEQ ID NO: 64) wurden in der Genbank unter der Zugangs-Nr. NM_016583 veröffentlicht. Das humane Plunc kodiert für ein Protein von 256 Aminosäuren und weist eine 72%ige Homologie mit dem murinen Plunc Protein auf (Bingle und Bingle, Biochim Blophys Acta 1493:363-7, 2000). Die Exression von Plunc beschränkt sich auf die Trachea, die oberen Luftwege, Nasen-Rachen-Epithel und Speicheldrüse.
Erfindungsgemäß wurde untersucht, ob Plunc als Marker von Lungenkarzinom genutzt werden kann. Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 75, 76) verwendet, die eine spezifische Amplifikation von Plunc ermöglichen.
RT-PCR-Untersuchungen mit diesem Primer-Set zeigten eine selektive Expression im Thymus, in der Lunge und in (6/10) untersuchten Lungenkarzinom-Proben (Abb. 11). Die übrigen Normalgewebe zeigten keine Expression.
Beispiel 11: Identifizierung von SLC26A9 als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target
SLC26A9 (SEQ ID NO: 56) und sein Translationsprodukt (SEQ ID NO: 65) wurden in der Genbank unter der Zugangs-Nr. NM_134325 veröffentlicht. SLC26A9 gehört zur Familie der Anionen-Austauscher. Die Expression von SLC26A9 beschränkt sich auf das bronchioläre und alveoläre Epithel der Lunge (Lohi et al., J Biol Chem 277 : 14246-54, 2002). Es wurde untersucht, ob SLC26A9 als Marker von Lungenkarzinom genutzt werden kann. Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 77, 78) verwendet, die eine spezifische Amplifikation von SLC26A9 ermöglichen. RT-PCR-Untersuchungen mit SLC26A9- spezifischen Primern (SEQ ID NO: 77, 78) zeigten eine selektive Expression in der Lunge und in allen (13/13) untersuchten Lungen-Karzinom-Proben (Abb. 12). Die übrigen Normalgewebe zeigten mit Ausnahme der Schilddrüse keine Expression. In quantitativen RT- PCR-Experimenten mit den Primern SEQ ID NO. 131 und 132 konnten diese Ergebnisse zum einen bestätigt sowie zusätzliche Erkenntnisse gewonnen werden. In gepoolten Proben von 4- 5 Tumorgeweben konnten hohe Expressionslevel für.SLC26A9-spezifische RNA in Lungen-, Dickdarm-, Pankreas- und Magentumoren detektiert werden. SLC26A9 ist Mitglied einer Familie von Transmembran-Anionentransportem. In der gesunden Lunge ist das Protein in Richtung Luftwege luminal gerichtet und damit IgG-Antiköφern aus dem Blut nicht direkt zugänglich. Dagegen ist die Polarität des Proteins in Tumoren aufgehoben. Erfindungsgemäß kann daher das SLC26A9 in den definierten Tumoren u.a. Lungenturnore, Magencarcinome, Pankreascarcinome als therapeutisches Target durch monoklonale Antiköφer addressiert werden. Die ausgeprägte, hohe Expression und hohe Inzidenz von SLC26A9 für Lungen-, Magen-, Bauchspeicheldrüsen- und Speiseröhrencarcinome machen dieses Protein erfindungsgemäß zu einem exzellenten diagnostischen und therapeutischen Marker. Dies umfasst erfindungsgemäß den Nachweis disseminierter Tumorzellen im Serum, Knochenmark und Urin, sowie die Detektion von Metastasen in anderen Organen mittels RT- PCR. Des weiteren können die extrazellulären Domänen von SLC26A9 erfindungsgemäß als Zielstruktur zur Immun-Diagnostik und Therapie mittels monoklonaler Antiköφer verwendet werden. Des weiteren kann SLC26A9 erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Protein, Peptide) zur Induktion Tumor-spezischer Immunantworten (T-und B-Zell vermittelte Immunreaktionen) eingesetzt werden. Dies umfasst erfindungsgemäß auch die Entwicklung von sogenannten „small compunds", die die biologische Aktivität von SLC26A9 modulieren und zur Therapie von Lungentumoren und gastrointestinalen Tumoren eingesetzt werden können.
Beispiel 12: Identifizierung von THC1005163 als diagnostisches und therapeutisches Krebs-Target
THC1005163 (SEQ ID NO: 57) ist ein Genfragment aus dem TIGR-Gen Index. Das Gen ist nur im 3 '-Bereich definiert, während ein ORF fehlt. RT-PCR-Untersuchungen erfolgten mit einem THC1005163-spezifischen Primer (SEQ ID NO: 79) und einem Oligo dTϊ8 Primer, der am 5 '-Ende ein spezifisches Tag von 21 spezifischen Basen hatte. Dieses Tag wurde mit Datenbank-Suchprogrammen auf Homologie mit bekannten Sequenzen übeφrüft. Dieser spezielle Primer wurde initial bei der cDNA-Synthese eingesetzt, um genomische DNA- Verunreinigungen auszuschließen. RT-PCR-Untersuchungen mit diesem Primer-Set zeigten eine Expression in Magen, Ovar, Lunge und in (5/9) Lungenkarzinom-Biopsien (Abb. 13). Die übrigen Normalgewebe zeigten keine Expression. Beispiel 13: Identifizierung von LOC134288 als diagnostisches und therapeutisches Krebs-Target
LOC134288 (SEQ ID NO: 58) und sein prädiziertes Translationsprodukt (SEQ ID NO: 66) 5 wurden in der Genbank unter der Zugangs-Nr. XM_059703 veröffentlicht.
Erfindungsgemäß wurde untersucht, ob LOC134288 als Marker von Nierenzellkarzinom genutzt werden kann. Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 80, 81) verwendet, die eine spezifische Amplifikation von LOC 134288 ermöglichen. RT-PCR-Untersuchungen zeigten eine selektive Expression in der Niere und in (5/8) untersuchten Nierenzellkarzinom- 0 Biopsien (Abb. 14).
Beispiel 14: Identifizierung von THC943866 als diagnostisches und therapeutisches Krebs-Target
5 THC943866 (SEQ ID NO: 59) ist ein Genfragment aus dem TIGR-Gen Index. Es wurde untersucht, ob THC943866 als Marker von Nierenzellkarzinom genutzt werden kann. Hierzu wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 82, 83) verwendet, die eine spezifische Amplifikation von THC943866 ermöglichen. RT-PCR-Untersuchungen mit THC943866-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 82, 83) 0 zeigten eine selektive Expression in der Niere und in (4/8) untersuchten Nierenzellkarzinom- Biopsien (Abb. 15).
Beispiel 15: Identifizierung von FLJ21458 als diagnostisches und therapeutisches Krebs- Target 5
FLJ21458 (SEQ ID NO: 84) und sein prädiziertes Translationsprodukt (SEQ ID NO: 85) wurden in der Genbank unter der Zugangs-Nr. NM_034850 veröffentlicht. Sequenzanalysen ergaben, dass das Protein ein neues Mitglied der Butyrophillin-Familie darstellt. Strukturanalysen ergaben, dass es ein Typ- 1 -Transmembranprotein mit einer extrazellulären
) 0 Immunglobulindomäne darstellt. Zur Expressionsuntersuchung wurden Oligonukleotide (SEQ ID NO: 86, 87) verwendet, die eine spezifische Amplifikation von FLJ21458 ermöglichen. RT-PCR-Untersuchungen mit FLJ21458-spezifischen Primem (SEQ ID NO: 86, 87) zeigten eine selektive Expression im Kolon und in (7/10) untersuchten Kolonkarzinom-Biopsien (Abb. 16, Tab. 5). Eine quantitative RT-PCR mit spezifischen Primem (SEQID NO: 133, 134) bestätigte dieses selektive Expressionsprofil (Abb. 39). Darüberbinaus konnte in dem Experiment FLJ21458 gastrointestinal-spezifisch im Kolon, sowie in Magen, im End- und Blinddarmund in Testis nachgewiesen werden. Auch 7/11 Kolonmetastaseproben waren in der quantitativen PCR positiv. Die FLJ21458-spezifische Expression wurde auf andere Tumoren erweitert und eine proteinspezifische Expression konnte in Magen-, Pankreas- und Lebertumoren nachgewiesen werden (Tab. 5). Zum Nachweis von FLJ21458 Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt: SEQ ID NO:135: QWQVFGPDKPVQAL SEQ ID NO: 136: AKWKGPQGQDLSTDS
Eine FLJ21458-spezifische Reaktion konnte in der Immunfluoreszenz nachgewiesen werden (Abb. 40). Zur Spezifitätskontrolle der Antikörper wurden 293-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, dass für ein FLJ21458-GFP-Fusionsprotein kodiert. Der Spezifitätsnachweis erfolgte zum einen durch Kolokalisationsuntersuchungen mit dem FLJ21458-spezifischen Antikörper, zum anderen über das autofluoreszierende GFP. Eine Überlagerung beider Fluoreszenzbilder zeigte eindeutig, dass das Immunserum spezifisch FLJ21458-Protein erkennt (Abb. 40A). Bedingt durch die Überexpression des Proteins ergab sich eine diffuse Zellfärbung, die keine eindeutige Proteinlokalisation zuließ. Aus diesem Grund wurde mit der magentumorspezifischen Zelllinie Snul6, die FLJ21458 endogen exprimiert, ein weiteres Immunfluoreszenzexperiment durchgeführt (Abb. 41B). Die Zellen wurden mit dem
FLJ21458-spezifichen Antiserum sowie mit einem weiteren Antiköφer angefärbt, der das Membranprotein E-Cadherin erkennt. Der FLJ21458-spezifische Antiköφer färbt zumindest schwach die Zellmembranen an und ist somit ein Beleg dafür, dass FLF21458 in der Zellmembranprotein lokalisiert ist.
Bioinformatische Untersuchungen zeigten, dass das von FLJ21458 kodierte Protein ein Zeiloberflächenmolekül darstellt und über eine Immunglobulinsupermolekül-Domäne verfügt. Die selektive Expression dieses Oberflächenmoleküls macht es zu einem guten Target für die Entwicklung von diagnostischen Verfahren zur Detektion von Tumorzellen und therapeutischen Verfahren zur Elimination von Tumorzellen.
Die ausgeprägte Expression und hohe Inzidenz von FLJ21458 für Magen- und Kolonkarzinome machen dieses Protein erfindungsgemäß zu einem hochinteressanten diagnostischen und therapeutischen Marker. Dies umfasst erfindungsgemäß den Nachweis disseminierter Tumorzellen im Serum, Knochenmark und Urin, sowie die Detektion von Metastasen in anderen Organen mittels RT-PCR. Des weiteren können die extrazellulären Domänen von FLJ21458 erfindungsgemäß als Zielstruktur zur Immun-Diagnostik und Therapie mittels monoklonaler Antiköφer verwendet werden. Des weiteren kann FLJ21458 erfindungsgemäß als Vakzine (RNA, DNA, Protein, Peptide) zur Induktion Tumor-spezischer Immunantworten (T-und B-Zell vermittelte Immunreaktionen) eingesetzt werden. Dies umfasst erfindungsgemäß auch die Entwicklung von sogenannten „small compunds", die die biologische Aktivität von FLJ21458 modulieren und zur Therapie von gastrointestinalen Tumoren eingesetzt werden können.
Tab. 5 FLJ2l458-Expression in Normal- und Tumorgewebe
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Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, das die Expression oder Aktivität eines Tumor-assoziierten Antigens hemmt, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel mit tumorhemmender Aktivität, das selektiv ist für Zellen, die eine Expression oder abnormale Expression eines tumorassoziierten Antigens aufweisen, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Mittel die Induktion des Zelltods, die Reduktion des Zellwachstums, eine Schädigung der Zellmembran oder eine Sekretion von Zytokinen bewirkt.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel eine Antisense-Nukleinsäure ist, die selektiv mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für das Tumorassoziierte Antigen kodiert.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel ein Antiköφer ist, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Mittel ein komplementaktivierender Antikörper ist, der selektiv an das Tumor-assoziierter Antigen bindet.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, das bei einer Verabreichung selektiv die Menge an Komplexen zwischen einem HLA-Molekül und einem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon erhöht, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Mittel einen oder mehrere Bestandteile umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus:
(i) dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon,
(ii) einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und
(iv) isolierten Komplexen zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem HLA-Molekül.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 7, wobei das Mittel mehrere Mittel umfasst, die jeweils selektiv die Expression oder Aktivität verschiedener Tumor-assoziierter Antigene hemmen, jeweils selektiv für Zellen sind, die verschiedene Tumor-assoziierte Antigene exprimieren oder die Menge an Komplexen zwischen HLA-
5 Molekülen und verschiedenen Tumor-assoziierten Antigenen oder Teilen davon erhöhen, wobei mindestens eines der Tumor-assoziierten Antigene eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon
10 ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) ι hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
15 (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen oder mehrer Bestandteile, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus:
(i) einem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon,
20 (ii) einer Nukleinsäure, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einem Antiköφer, der an ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon bindet, (iv) einer Antisense-Nukleinsäure, die spezifisch mit einer Nukleinsäure, die für ein Tumorassoziiertes Antigen kodiert, hybridisiert, (v) einer Wirtszelle, die ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und
25 (vi) isolierten Komplexen zwischen einem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem HLA-Molekül, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend 30 aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 10, wobei die Nukleinsäure unter (ii) in einem Expressionsvektor vorliegt.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 10, wobei die Nukleinsäure unter (ii) funktioneil mit einem Promotor verbunden ist.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Ansprach 8 oder 10, wobei die Wirtszelle das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon sekretiert.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 10, wobei die Wirtszelle zusätzlich ein HLA-Molekül exprimiert, das an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle das HLA-Molekül und/oder das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon rekombinant exprimiert.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle das HLA-Molekül endogen exprimiert.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, 10, 14 oder 16, wobei die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle ist.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die Antigen- präsentierende Zelle eine dendritische Zelle oder ein Makrophage ist.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8, 10 und 13-18, wobei die Wirtszelle nicht-proliferativ ist.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 10, wobei der Antiköφer ein monoklonaler Antiköφer ist.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 10, wobei der Antiköφer ein chimärer oder humanisierter Antiköφer ist.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 10, wobei der Antiköφer ein Fragment eines natürlichen Antikörpers ist.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 10, wobei der Antiköφer mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel gekoppelt ist.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 10, wobei die Antisense- Nukleinsäure eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfasst.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 und 10-13, wobei das durch die pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellte Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon an MHC-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen bindet, die eine abnormale Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon exprimieren.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die Bindung eine cytolytische Reaktion hervorruft und/ oder eine Cytokinausschüttung induziert
27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-26, ferner umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Adjuvans.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei das Adjuvans Saponin, GM-CSF, CpG, Zytokin oder ein Chemokin ist.
29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-28, die zur Behandlung einer Erlαankung eingesetzt werden kann, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die Erkrankung Krebs ist.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Ansprach 29, wobei die Erkrankung ein Lungentumor, ein Brusttumor, ein Prostatatumor, ein Melanom, ein Kolontumor, ein
Magentumor, ein Pankreastumor, ein HNO-Tumor, Nierenzellkarzinom oder ein Zervixkarzinom, ein Kolonkarzinom oder ein Mammakarzinom ist.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-31, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 und 135-137, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist.
33. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend
(i) den Nachweis einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon, und/oder
(ii) den Nachweis des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, und/oder (iii) den Nachweis eines Antikörpers gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder eines Teils davon und/oder
(iv) den Nachweis von cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten, die für das Tumorassoziierte Antigen oder einen Teil davon spezifisch sind in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119,einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Nachweis
(i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an die Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder den Teil davon, an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon, an den Antiköφer oder an die cytotoxischen 5 oder Helfer-T-Lymphozyten bindet, und
(ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und der Nukleinsäure oder dem Teil davon, dem Tumor-assoziierten Antigen oder dem Teil davon, dem Antiköφer oder den cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten umfasst.
0 35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei der Nachweis mit dem Nachweis in einer vergleichbaren normalen biologischen Probe verglichen wird.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-35, wobei sich die Erkrankung durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene 5 auszeiclinet und der Nachweis einen Nachweis mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon, den Nachweis der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon, den Nachweis mehrerer Antiköφer, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden, oder den Nachweis mehrerer cytotoxischer oder Helfer- 0 T-Lymphozyten, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene spezifisch sind, umfasst.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei der Nachweis der Nukleinsäure oder des Teils davon mit einer Polynukleotid-Sonde erfolgt, die spezifisch mit der 5 Nukleinsäure oder dem Teil davon hybridisiert.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Polynukleotid-Sonde eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfasst.
S O
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei der Nachweis der Nukleinsäure oder des Teils davon durch selektive Amplifikation der Nukleinsäure oder des Teils davon erfolgt.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei das nachzuweisende Tumorassoziierte Antigen oder der Teil davon in einem Komplex mit einem MHC-Molekül vorliegt.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei das MHC-Molekül ein HLA-Molekül ist.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36 und 40-41, wobei der Nachweis des Tumor-assoziierten Antigens oder des Teils davon mit einem Antiköφer erfolgt, der spezifisch an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei der Nachweis des Antiköφers mit einem Protein oder Peptid erfolgt, das spezifisch an den Antiköφer bindet.
44. Verfahren zur Bestimmung der Regression, des Verlaufs oder des Ausbruchs einer
Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor- assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Überwachung einer Probe aus einem
Patienten, der die Erkrankung aufweist oder in Verdacht steht, an der Erkrankung zu erkranken in Bezug auf einen oder mehrere Parameter, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
(i) der Menge der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teil davon,
(ii) der Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon,
(iii) der Menge an Antikörpern, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und
(iv) der Menge an cytolytischen oder Cytokin-ausschüttenden T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-
Molekül spezifisch sind, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119,einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das Verfahren die Bestimmung des oder der Parameter zu einem ersten Zeitpunkt in einer ersten Probe und zu einem zweiten Zeitpunkt in einer weiteren Probe umfasst und durch einen Vergleich der beiden Proben der Verlauf der Erkrankung ermittelt wird.
46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, wobei die Erkrankung sich durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene auszeichnet und die Überwachung eine Überwachung
(i) der Menge mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumorassoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon,
(ii) der Menge der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon, (iii) der Menge mehrerer Antikörper, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden, und/oder
(iv) der Menge mehrerer cytolytischer oder Cytokine-ausschüttender T-Zellen, die für Komplexe zwischen den mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigenen oder von Teilen davon und MHC-Molekülen spezifisch sind, umfasst.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge der Nukleinsäure oder des Teils davon mit einer Polynukleotid-Sonde erfolgt, die spezifisch mit der Nukleinsäure oder dem Teil davon hybridisiert.
48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei die Polynukleotid-Sonde eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfasst.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge der Nukleinsäure oder des Teils davon durch selektive Amplifikation der Nukleinsäure oder des Teils davon erfolgt.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder des Teils davon mit einem Antiköφer erfolgt, der spezifisch an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge an Antiköφern mit einem Protein oder Peptid erfolgt, das spezifisch an den Antiköφer bindet.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge an cytolytischen oder Cytokin-ausschüttenden T-Zellen mit einer Zelle erfolgt, die den Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder dem Teil davon und einem MHC-Molekül präsentiert.
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 37-38, 42-43, 47-48 und 50-52, wobei die Polynukleotid-Sonde, der Antiköφer, das Protein oder Peptid oder die Zelle nachweisbar markiert sind.
54. Verfahren nach Anspruch 53, wobei der nachweisbare Marker ein radioaktiver Marker oder ein Enzymmarker ist.
55. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-54, wobei die Probe Köφerflüssigkeit und/oder Köφergewebe umfasst.
56. Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-32, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119,einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
57. Verfahren zur Behandlung, Diagnose oder Überwachung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Verabreichung eines Antiköφers, der an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet und mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel gekoppelt ist, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119,einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
58. Verfahren nach Anspruch 42, 50 oder 57, wobei der Antiköφer ein monoklonaler Antikörper ist.
59. Verfahren nach Anspruch 42, 50 oder 57, wobei der Antiköφer ein chimärer oder humanisierter Antiköφer ist.
60. Verfahren nach Anspruch 42, 50 oder 57, wobei der Antiköφer ein Fragment eines natürlichen Antiköφers ist.
61. Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend: (i) die Entfernung einer Probe mit immunreaktiver Zellen aus dem Patienten,
(ii) die Kontaktierung der Probe mit einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, unter Bedingungen, die eine Produktion cytolytischer oder Cytokine-ausschüttender T-Zellen gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon begünstigen, und (iii) das Einbringen der cytolytischen oder Cytokine-ausschüttenden T-Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, Zellen zu lysieren, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119,einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
62. Verfahren nach Anspruch 61, wobei die Wirtszelle ein HLA-Molekül rekombinant exprimiert, das an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet.
63. Verfahren nach Anspruch 62, wobei die Wirtszelle ein HLA-Molekül endogen exprimiert, das an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet.
64. Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die
Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeiclinet, umfassend:
(i) die Identifizierung einer Nukleinsäure, die von Zellen exprimiert wird, die mit der Erkrankung assoziiert sind, wobei die Nukleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119,einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, (ii) die Transfektion einer Wirtszelle mit der Nukleinsäure oder einem Teil davon, (iii) die Kultivierung der transfizierten Wirtszelle für eine Expression der Nukleinsäure, und (iv) das Einbringen der Wirtszellen oder eines Extrakts davon in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, die Immunreaktion gegen die Zellen des Patienten, die mit der Erkrankung assoziiert sind, zu erhöhen.
65. Verfahren nach Anspruch 64, ferner umfassend die Identifizierung eines MHC- Moleküls, das das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert, wobei die Wirtszelle das identifizierte MHC-Molekül exprimiert und das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert.
66. Verfahren nach Anspruch 64 oder 65, wobei die Immunreaktion eine B-Zellen- Reaktion oder eine T-Zellen-Reaktion umfasst.
67. Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Immunreaktion eine T-Zellen-Reaktion ist, umfassend die Produktion cytolytischer oder Cytokine-ausschüttenden T-Zellen, die spezifisch für die Wirtszellen sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentieren oder spezifisch für Zellen des Patienten sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren.
68. Verfahren nach einem der Ansprüche 61-67, wobei die Wirtszellen nicht-proliferativ sind.
69. Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend: (i) die Identifikation von Zellen aus dem Patienten, die abnormale Mengen des Tumorassoziierten Antigens exprimieren, (ii) die Isolierung einer Probe der Zellen, (iii) die Kultivierung der Zellen, und (iv) das Einbringen der Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, eine Immunreaktion gegen die Zellen auszulösen, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119,einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
70. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-69, wobei die Erkrankung Krebs ist.
71. Verfahren zur Hemmung der Entwicklung von Krebs bei einem Patienten, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-32.
72. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-71, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 9-19, 45- 48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 und 135-137, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist.
73. Nukleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 3-5, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
74. Nukleinsäure, die für ein Protein oder Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 10 und 12-14, einem Teil oder Derivat davon.
75. Rekombinantes DNA- oder RNA-Molekül, das eine Nukleinsäure nach Ansprach 73 oder 74 umfasst.
76. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 75, wobei das rekombinante DNA- Molekül ein Vektor ist.
77. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 76, wobei der Vektor ein viraler Vektor oder ein Bakteriophage ist.
78. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 75-77, das femer Expressionskontrollsequenzen umfasst, die die Expression der Nukleinsäure steuern.
79. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 78, wobei die Expressionskontrollsequenzen homo- oder heterolog zu der Nukleinsäure sind.
80. Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 73 oder 74 oder ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 75-79 umfasst.
81. Wirtszelle nach Ansprach 80, die femer eine Nukleinsäure umfasst, die für ein HLA- Molekül kodiert.
82. Protein oder Polypeptid, das von einer Nukleinsäure nach Anspruch 73 kodiert wird.
83. Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 10 und 12-14, einem Teil oder Derivat davon.
84. Immunogenes Fragment des Proteins oder Polypeptids nach Ansprach 82 oder 83.
85. Fragment des Proteins oder Polypeptids nach Anspruch 82 oder 83, das an menschlichen HLA-Rezeptor oder menschlichen Antiköφer bindet.
86. Mittel, das spezifisch an ein Protein oder Polypeptid oder an einen Teil davon bindet, wobei das Protein oder Polypeptid von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Grappe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
87. Mittel nach Anspruch 86, wobei das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NOs: 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 1 1 1-116, 118, 120, 123, 124 und 135-137, einem Teil oder Derivat davon.
88. Mittel nach Anspruch 86 oder 87, wobei das Mittel ein Antiköφer ist.
89. Mittel nach Anspruch 88, wobei der Antiköφer ein monoklonaler, chimärer oder humanisierter Antiköφer oder ein Fragment eines Antiköφers ist.
90. Antiköφer, der selektiv an einen Komplex aus:
(i) einem Protein oder Polypeptid oder einem Teil davon und
(ii) einem MHC-Molekül bindet, an das das Protein oder Polypeptid oder der Teil davon bindet, wobei der Antiköper nicht alleine an (i) oder (ii) bindet und das Protein oder Polypeptid von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
91. Antiköφer nach Anspruch 90, wobei das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NOs: 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 und 135-137, einem Teil oder Derivat davon.
92. Antiköφer nach Anspruch 90 oder 91, wobei der Antiköφer ein monoklonaler, chimärer oder humanisierter Antikörper oder ein Fragment eines Antiköφers ist.
93. Konjugat zwischen einem Mittel nach einem der Ansprüche 86-89 oder einem Antiköφer nach einem der Ansprüche 90-92 und einem therapeutischen oder diagnostischen
Mittel.
94. Konjugat nach Anspruch 93, wobei das therapeutische oder diagnostische Mittel ein Toxin ist.
95. Kit zum Nachweis der Expression oder abnormalen Expression eines Tumorassoziierten Antigens, umfassend Mittel zum Nachweis
(i) der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon, (ii) des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, (iii) von Antiköφem, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und/oder
(iv) von T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-Molekül spezifisch sind, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 und 119, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
96. Kit nach Anspruch 95, wobei die Mittel zum Nachweis der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon Nukleinsäuremoleküle für die selektive Amplifikation der Nukleinsäure sind.
97. Kit nach Ansprach 96, wobei die Nukleinsäuremoleküle für die selektive Amplifikation der Nukleinsäure eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfassen.
98. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Promotorregion, die von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-8, 41- 44, 51-59, 84, 117 und 119 ausgewählt ist.
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