TWI331532B

TWI331532B - Formulation of human antibodies for treating tnf-alpha associated disorders

Info

Publication number: TWI331532B
Application number: TW092122123A
Authority: TW
Inventors: Krause Hans-Juergen; Baust Lisa; Dickes Michael
Original assignee: Abbott Biotech Ltd
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2003-08-12
Publication date: 2010-10-11
Also published as: US9750808B2; CA2872091A1; CA2882934A1; NZ538030A; CA2872089A1; CA2494756C; US9732152B2; KR101367743B1; CN101721702B; UY27940A1; CA2872089C; CA2494756A1; US20180339046A1; JP4925582B2; PE20040994A1; US20060153846A1; EP2363144A1; CA2882905C; US20150093394A1; AU2003267744A1

Description

1331532 玖、發明說明：【發明所屬之技術領域】 . 本發明揭示一種水溶液醫藥調配物，其具有高蛋白質濃 . 度，pH介於约4及約8之間，及增強的穩定性。【先前技術】腫瘤壞疽因子a (TNFa)是許多種類細胞（包括單細胞及巨嗜細胞）所產生的一種細胞激素，原本是依據其誘發某種老鼠腫瘤壞疽的能力而鑑定出來的（參考，例如，歐得（〇ld)，L (1985)科學2H.630-632)。其後，一種與癌症惡病質有關而 f 名為惡液質素的因子證實與TNFa為相同的分子。丁NFa被認為與媒介休克有關（參考，例如，布特勒（Beutler)，B及瑟瑞米（Cerami)，A. (1988)生物化學年刊红巧仍巧丨8 ;布特勒， B及瑟瑞米，A. (1989)免疫學年刊z:625_655p除此之外， TNFct被認為與許多其他人類疾病及失調症的病理學有關’包括敗血症、感染症、自體免疫疾病、移植物對抗宿主的疾病（參考，例如，莫伊樂（M〇elle〇，A等人（199〇)細胞 - 因子以62_169;莫伊樂等人巾請之美國專利案mu · 莫伊樂，A.等人所申請之歐洲專利公開案施6ι〇 bi;瓦西利（Va砸)，P. (1992)免疫學年刊m:4u_452;纟西加㈣ K. J.及瑟瑞米，A. (I"4)醫學年刊拉:491·5〇3)。因為人類TNFa (hTNFa)在許多人類失調症上扮演有害的作用’因此’咸欲設計抑制或抵消掉咖以活性之治療策略’明確言之，是探索可與hTNFa鍵結或中和之抗體，以作為抑制hTNFd性之方法。此最早期的某些抗體為老氣 86976 1331532 單株抗體（mAbs) ’其係經hTNFa免疫化之老鼠的淋巴細胞所製備的融合瘤所分泌（參考’哈恩（Hahn) T ;等人（1985)美國國家科學院會議記錄雜誌^1:3814-3818;廉恩（Liang), C-M.，等人（1986)生物化學生物物理研究通訊137:847-854 ;西瑞 (Hirai)，M·，等人（1987)免疫學方法雜誌丛:57-62 ;福瑞利 (Fendly)，B.M·，等人（1987)融合瘤包:359-370 ;莫伊樂 (Moeller)，A.，等人（1990)細胞激素 2:162-169 ;莫伊樂

(Moeller)等人申請之美國專利案5,231，〇24 ;瓦勒許 (Wallach)，D.申請之歐洲專利申請公開案186 833 B1 ;歐得等人申请之歐洲專利申請公開案218 8 6 8 A1 ;莫伊樂，a .等人申請之歐洲專利公開案260 610 B1)。雖然這些老鼠抗 -hTNFa抗體與hTNFa常顯示出具有高的親合力（例如 KdSl(r9M) ’且可以中和hTNFa之活性，但是其在活體内的應用卻因人類投用老鼠抗體後所產生有關問題而受到限制’諸如’短暫的血清半衰期、無法驅動某些人類效應子的功能及會誘發人體内對抗老鼠抗體的不想要之免疫反應 ("人類抗-老鼠抗體"（Hama)反應）。為了克服人體使用完全·老鼠抗體後所帶來的問題，因此’業已以遗傳工程方式處理老鼠抗-hTNFa抗體，使其更為"人類化”，例如，已經製備抗體鏈的可變區域衍生自老鼠，而抗體鏈的固定區域則衍生自人類之嵌合性抗體（奈特 (Knight)，D.M，等人（1993)分子免疫學姐：1443-1453;達多那（Daddona)，P.E.等人申請之PCT公開案世界專利w〇 92/165 53)，除此之外’也已經製備出人類化抗體，其中該 86976 1331532

抗體可變區域的超變化區域衍生自老鼠，而可變區域之其餘區域及抗體固定區域則衍生自人類（阿達爾（Adair), J.R.，等人申請之PCT公開案世界專利WO 92/11383)。然而，因為這些嵌合性及人類化抗體仍保有某些老鼠的序列，因此，其仍會引發不想要的免疫反應（人類抗-嵌合抗體（HACA)反應），特別是長期投用時（例如，慢性病用藥），諸如類風濕性關節炎（參考，例如，伊利歐特（Elliott)，M. J.，等人（1 994) 刺肋針雜誌Ml:1125-1127 ;伊利歐特，Μ.J.,等人（1994)刺肋針雜誌 141:1105-1110)。

較老鼠mAbs或其衍生物（例如，嵌合性或人類化抗體）為佳之hTNFa抑制劑是完全地人類抗-hTNFa抗體，因為，此種物質即使在長期使用後也不會引發HAMA反應。利用人類融合瘤技術已製備出抗hTNFa之人類單株自體抗體（波伊爾（Boyle), P.,等人（1993)細胞免疫學1^:556-568;波伊爾， P.，等人（1993)細胞免疫學112:569-581;波伊爾，等人申請之歐洲專利申請公開案614 984 A2)。然而，因為報告指出這些衍生自融合瘤的單株自體抗體對hTNFa親合力太低，難以以慣用方法求出，無法键結至可溶性hTNFa且無法中和 hTNFa-誘發的細胞毒性（參考，波伊爾，等人；上述），另外，人類融合瘤技術成功與否端視能否產生對hTNFa具有專一性自體抗體之人類週邊血液淋巴細胞中存在的自然物質而定。某些研究發現在人類個體血清中可偵測到對抗hTNFa 的自體抗體（福斯格得（Fomsgaard), A.,等人（1989)北歐免疫學雜誌尬:219-223 ;貝茲恩（Bendtzen)，K.，等人（1990)革新白 86976 1331532 中抗體的濃度約50毫克/毫升，在另一個具體實例中，調配物具有高蛋白質濃度，在本發明另一個具體實例中，該調配物非為光敏感。在本發明一個具體實例中，該水溶液醫藥調配物含有— 種k體或其抗原-鍵結部分，其自人類TNFa解離之Kd為 1χ108Μ或更低，而Koff速率常數為ixi〇-3秒-1或更低，兩者係由表面電漿共振所測定’而以標準活體外L929分析法所測之中和人類TNFa細胞毒性之IC5〇為lxl〇-7]y[或更低。在另一個具體實例中，本發明調配物包含一種抗體或其其抗原_ 鍵結部分，其自人類TNFa解離之Κ。^速率常數為5x10_4秒-1 或更低。在另一個具體貫例中’調配物包含一種抗體或其柷原-键結部分，其自人類TNFa解離之KQff速率常數為或更低。在另一個具體實例中，本發明調配物包含一種抗體或其抗原-键結部分’其以標準活體外L929分析所得之中和人類TNFa細胞毒性之ICw為1 X ι〇·8μ或更低，在另一個本發明具體實例中，申請專利範圍之調配物包含一種抗體或其抗原-鍵結部分，其以標準活體外L929分析所得之中和人類TNFa細胞毒性之ICm為1χ1〇_9μ或更低，在另一個具體實例中，調配物中抗體或其抗原-鍵結部分以標準活體外L929分析所得之中和人類TNFa細胞毒性之IC50為 lxlO’M或更低在本發明另一個具體實例中’該水溶液醫藥調配物含有種體或其抗原-键結部为’其為一種重组性抗體或1抗原·鍵結部分。在另一個具體實例中，該水溶液醫藥調配物 86976 -11 - 1331532 含有一種抗體或其抗原-键結部分，其可抑制人類臍靜脈内皮細胞中ELAM-1的人類TNFa-誘發表現作用。在另一個具體實例中’申請專利範圍之調配物包含D2E7抗體。在本發明一個具體實例中，該水溶液醫藥調配物含有一種抗體或其抗原-鍵結部分，其自人類TNFa解離之Kw速率常數為1 X 10·3秒-1或更低，係由表面電漿共振所測定； b) 具有輕鏈CDR3區域，其包括SEQ ID NO : 3胺基酸序列，或在位置1、4、5、7或8經一個丙胺酸取代作用，或在位置1、3、4、6、7、8及/或9經一至五個保守胺基酸取代作用之SEQ ID NO : 3胺基酸序列； c) 具有重鏈CDR3區域’其包括SEQ ID NO : 4胺基酸序列，或在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11經一個丙胺酸取代作用’或在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11及/或12 經一至五個保守胺基酸取代作用之SEQ ID NO : 4胺基酸序列。在另一個具體實例中，本發明調配物包含一種抗體或其其抗原-鍵結部分’其自人類TNFa解離之KQff速率常數為 5χ1(Τ4秒-1或更低。在另一個具體實例中，調配物包含一種抗體或其抗原-鍵結部分，其自人類TNFa解離之Κ。^速率常數為1x1 (Γ4秒-1或更低。在本發明另一個具體實例中，該水溶液醫藥調配物包含一種抗體或其抗原-鍵結部分，該抗體或其抗原-鍵結部分含有CDR3區域（其包括SEQ ID NO : 3之胺基酸序列，或在位置1、4、5、7或8經一個丙胺酸取代作用之SEQ ID N〇：3 胺基酸序列）之輕鏈可變區域（LCVR)，及含有CDR3區域（其 86976 -12· 1331532

包括SEQ ID NO : 4胺基酸序列，或在位置2、3、4、5、6、 8、9、10或11經一個丙胺酸取代作用之SEQ ID NO : 4胺基酸序歹J )之重鏈可變區域（HCVR)。在另一個具體實例中，本發明調配物包含一種抗體，其中該抗體或其抗原-鍵結部分之LCVR另夕卜具有包括SEQ ID NO : 5胺基酸序歹J之CDR2區域，而該抗體或其抗原-键結部分的HCVR另外具有包括SEQ ID NO : 6胺基酸序列之CDR2區域。在另一個具體實例中.，本發明調配物含有一種抗體，其中該抗體或其抗原-键結部分之LCVR另夕卜具有包括SEQ ID NO : 7胺基酸序列之CDR1 區域，而HCVR另外具有包括SEQ ID NO : 8胺基酸序列之 CDR1區域。

在本發明另一個具體實例中，水溶液醫藥調配物中所含有之抗體或其抗原-键結部分含有包括SEQ ID NO : 1胺基酸序列之輕鏈可變區域（LCVR)及包括SEQ ID NO : 2胺基酸序列之重鏈可變區域（HCVR)。在另一個具體實例中，該抗體或抗原-键結部分具有IgGl重鍵固定區域。在另一個具體實例中，該抗體或抗原-键結部分具有IgG4重鏈固定區域。在另一個具體實例中，該抗體或抗原-鍵結部分為Fab片段。在另一個具體實例中，該抗體或抗原-键結部分為單鏈Fv片段。在本發明一個具體實例中，該水溶液醫藥調配物所含有之抗體或抗原-键結部分具有包括CDR3區域（其包括由選自 SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 86976 -13 - 1331532 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、 SEQ ID NO : 20、SEQ ID NO : 21、SEQ ID NO : 22、SEQ ID NO : 23、SEQ ID NO : 24、SEQ ID NO : 25、SEQ ID NO : 26胺基酸序列所組成之群）之輕鏈可變區域（LCVR)或具有 CDR3 區域（其包括由選自 SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 27、 SEQ ID NO : 28、SEQ ID NO : 29、SEQ ID NO : 30、SEQ ID NO : 31、SEQ ID NO : 32、SEQ ID NO : 33及 SEQ ID NO : 34胺基酸序列所組成之群）之重鏈可變區域（HCVR)。在另一個具體實例中，該抗體或其抗原-键結部分可中和人類 TNFa、黑猩猩TNFa及至少一種額外靈長類TNFa(其係選自由狒狒TNFa、小猿TNFa、非洲綠猴TNFa及恆河猴TNFa所組之群）之活性。在另一個具體實例中，本發明調配物包括一種抗體或其抗原-键結部分，其亦可中和老鼠TNFa的活性。本發明調配物中所包含抗體或其抗原-键結部分亦可中和豬TNFa的活性。在另一個具體實例中，本發明提供一種包含抗體或其抗原-鍵結部分之水溶液醫藥調配物，該抗體或其抗原-键結部分可鍵結至人類TNFa，且包括：一輕鏈CDR3區域，其包括SEQ ID NO : 3之胺基酸序列，或在位置1、4、5、7或8經一個丙胺酸取代作用或在位置1、 3、4、6、7、8及/或9經一至五個保守胺基酸取代作用之SEQ ID NO : 3胺基酸序列，及一重鏈CDR3區域，其包括SEQ ID NO : 4胺基酸序列，或在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11經一個丙胺酸取代作 86976 -14 - 1331532 /毫升之抗體、5-20毫克/毫升之甘露醇、o.i-io毫克/毫升之

Tween-80及包括pH為4至8之擰檬酸鹽及/或磷酸鹽之緩衝劑系統所組成。在一個具體實例中，抗體係對抗hTNFa。 · 在另一個具體實例中’該調配物含有約4〇毫克之抗體。本發明另外提供一種水溶液醫藥調配物，其包括約5〇毫克/毫升之抗體、約12毫克/毫升之甘露醇、约丨毫克/毫升之

Tween-80及pH為約4至約8之樟檬酸鹽及/或磷酸鹽組成之缓衝劑系統。在一個具體實例中，調配物pH介於約4.5至約 6.0之間，在另一個具體實例中，調配物pH介於约4 8至约5 5 ^ 足間’在另一個具體實例中’本發明調配物pH介於約5 〇至約5.2之間。在本發明一個具體實例中，該水溶液醫藥調配物亦包括约1.305 ¾克/毫升之檸檬酸、約〇3〇5毫克/毫升之檸檬酸鈉、約1.53¾克/毫升之磷酸氫二鈉二水合物、約〇86毫克/ 笔升之磷酸二氫鈉二水合物及約6 165毫克/毫升之氣化鈉在另—個具體實例中，本發明調配物包括一種對抗 - h™Fa之抗體，在另一個具體實例中，本發明調配物包括響, 隶 2E7，在另一個具體實例中，將本發明調配物投與罹。導因於有害TNFa活性的疾病之個體，如此在該個體中 TNFa活性會受抑制。【實施方式】勹本發明係關於一種PH約4至約8之水溶液醫藥調配物，其 ^门蛋白貝濃度（包括抗體濃度範圍約1至約150毫克/毫升），且JL古合、 “ 向穩足性。本發明亦關於一種水溶液醫藥調配 86976 -16· 1331532 紐約，出版公司（1991)及瓊斯（Jones)，Α·高級藥物傳輸總論 1G:29-90 (1993)。穩定性可在選定的溫度下進行測定一段選 · 定時間，較佳地，本發明調配物係在室溫下（約3〇它）或4〇 -C下至少可穩定1個月及/或在約2-81下至少穩定1年至至少2年。除此之外’該調配物經冷凍（至例如_7〇°c )及解凍後後較佳仍為穩定狀態，後文稱之為”冷凍/解凍週期。在醫藥调配物中抗體”保有其物理穩定性”係指如果以肉眼檢视顏色及/或澄清度，或以UV光散射或分予大小排除層析法測定後顯示醫藥調配物中的抗體並無實質上凝集作用、沉?殿作用及/或變性作用。在醫藥調配物中抗體”保有其化學穩定性”係指於特定時間内，該抗體仍具有其下列所述之生物活性之化學穩定性。以化學方式偵測或定量抗體的改變形式可評估化學穩定性，化學變化與分子大小修飾作用（例如分子減短）有關，其可例如以分子大小排除層析法、SDS_PAGE&/或基質-輔助雷射脫附離予化/飛行時間質譜學（MALDI/T0F Ms)評估 - (。其他形式的化學改變包括電價的改變（例如由於去臨胺鲁作用所導致的），其可例如以離子_交換層析法評估之。醫藥調配物中的抗體，，仍保有其生物活性"係指如果醫藥調配物中的抗體係具有其意欲目的的生物性活性例如，如果醫藥調配物中的抗體之生物活性是醫藥調配物初製時間之生物活性（例如’以抗原鍵結分析法測定）之約30%、約 20%或約10%(介於分析誤差之内），則認為其保有生物活性。 "等張性，，是技藝中所熟識的名詞。例如，等張性意指令 86976 -18- 1331532 ^有興趣的調配物本質上具有與人類血液相同的滲透壓， ^張性調配物-般具有约㈣至別⑹細的滲透壓。例如，可以4氣壓或冰-冷凍類型的滲透壓計測定等張性。"強張劑係指一種可以提供調配物等張性的化合物。多醇”係指一種具有多個幾基的物質’包括醋類（還原酷 =㈣原醣）、_及醣酸。本專利說明書中較佳的多醇為刀子I低於約600千道爾頓者（例如，範圍約12〇至約4〇〇千道爾頓）。還原醣”係指含有半縮醛基團之醣類，其可還原金，離子或與離胺酸及蛋白質上其他的胺基共價反應，而"非返原醣”係指不具有還原醣這些特性之醣類。還原醣的實例包括，糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖队李糖、半扎糖及葡萄糖。非還原糖包括薦糖、萌糖、 ^梨糖4參糖及棉子糖。甘料、木㈣、㈣糖酵、二^糖醇、山梨醇及甘油是料的實例。至於醋酸包括L_ 葡萄庚酸及其金屬性鹽類。咸欲為使該調配物經冷;東_解;東下仍為穩疋性’多醇較佳地是為在冷來溫度（例如_聊）下 :會結晶的多醇類，結晶作用會使調配物中的抗體失去穩疋性。多醇類亦可作為強張劑。在本發明一個具體實例中，調配物中的—種成分為甘露醇，其濃度為5至20毫克/毫 :在本發η月自較佳的具體實例中，甘露醇的濃度為7 $ 至15毫克/毫升，在本發明—個更佳的具體實例中，甘露醇的k度為10-14毫克/毫升。本專利說明書中所用"緩衝劑”係指-種緩衝溶液，直係藉由其酸·驗共_成分的作用以抵抗pH的變化。本發明緩衝 86976 -19· 1331532 本專利說明書中所用，，全身性投藥”、"以全身性地投藥,，、 ”週邊性投藥’’及"以週邊性方式投藥"係指將化合物、藥物或其他物質直接引入至中樞神經系統之投藥法以外方式，讓其可進入至病患系統中，因此可進行代謝作用及其他類似程序，例如，皮下投藥法。醫藥學上可接受載劑”係技藝中所熟識者，及包括醫藥學上可接受物質、組合物或媒劑，其適合作為投與哺乳動物之用載％彳包括液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑、落劑或包囊劑，其與主體藥物從一個器官，或身體的部分帶到或傳輸到另-個器官，或身體的另一部分有關。每種載劑必須是"可接受的"，其意義是必須與調配物中的其他成分相容’且不會傷害病患。本專利說明書中所用，，人類TNFa”（本專利說明書縮寫為 liTNFa或簡單以iiTNF表示)意指—種人類細胞激素其係以 17 kD分泌形式及26 kD膜結合形式存在，其生物活性形式是由三個非共價鍵結的17 kD分子所組成qTNFa結構進一步於，例如，潘尼卡（Penmca)，D，等人（1984)自然 1ΙΧ’724·729 ;戴維斯（Davis), j M，等人（1987)生物化學 21.1322-1326，及瓊恩斯（J〇nes)，Ε γ，等人（1989)自然趣225_228中說明β人類TNFa—詞意欲包括重组性人類 TNFa (rhTNFa)，其可利用標準重組表現方法製備之，或購買取得（R & D系統，目錄編號21()·ΤΑ，明尼阿波里斯市， ΜΝ)。本專利說明書中所用||抗體”意指由四條聚肽鏈（兩條重（Η) 86976 •21- 1331532

鏈及兩條輕（L)鏈，彼此以雙硫鍵鍵結在一起）組成之免疫球蛋白分子。每個重鏈係由重鏈可變區域（本專利說明書所寫為HCVR或VH)及重鏈固定區域所組成。重鏈固定區域係由三個區域（CHI、CH2及CH3)所組成。每個輕鍵係由輕鍵可變區域（本專利說明書所窝為LCVR或VL)及輕鏈固定區域所組成。輕鍵固定區域係由一個區域（CL)所組成。VH及VL

區域可進一步次分為超可變區域（名為互補決定區域 (CDR))，其散置在更為保守而名為架構區域（FR)之間。每個VH及VL係由三個CDR及四個FR所組成，從胺基端至羧基端的#隹列川員序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。在本發明一個具體實例中’調配物包含一種具有如美國專利案6,090,382及6,258,562(該等文獻一併併入本專利說明書參考）中所揭示之CDRJ、CDR2及CDR3序列之抗體。

本專利說明書中所指抗體之"抗原-鍵結部分"（或簡稱為 "抗體部分”）係指一或多個仍具有專一性鍵結至抗原（例如，hTNFa)能力之抗體片段。咸已證明抗體之抗原-鍵結功能係由全長抗體之片段執行的。抗體"抗原-鍵結部分"一詞中所包括之鍵結片段實例包括⑴Fab片段’由VL、VH、CL 及CH1區域所組成之單價片段；（i〇 F(ab')2片段，包括由雙硫鍵橋於樞紐區域連結之兩個Fab片段之雙價片段；（111)由 VH及CH1區域所組成之Fd片段；（iv)由抗體單臂之VL及VH 所組成之Fv片段，（v) dAb片段（瓦德（Ward)等人，（1989)自然 34J_；544-546) >其係由VH區域所組成；及〇i)經分離之互補決定區域（CDR)。除此之外’雖然〜片段兩個區域VL&VH 86976 -22· 1331532 係由個別的基因所編碼，但是利用重組方法，以合成連結子可將其接合在一起，製成其中VL及VH區域配對形成單價分子之單一蛋白鏈（已知為單鏈Fv(scFv);參考，例如，柏德（Bird)等人（1988)科學 211:423-426 ;及哈斯頓（Hust〇n)等人（1988)美國國家科學院會議記錄雜誌仍八仏:5879_ 5883)。此單鏈抗體亦意欲包含於抗體"抗原_鍵結部分"一詞中。其他形式的單鏈抗體’諸如二價抗體亦包括其中。二價抗體為雙價，雙專一性之抗體，其中因為VH及VL區域係表現於單一聚肽鏈上，但是利用連結子太短以致難以讓同一蛋白鏈上的兩個區域間互相配對，因此，強力讓區域與另一蛋白鏈上的互補區域互相配對而產生兩個抗原鍵結位置（參考’例如何力格（Holliger)，P·，等人（1993)美國國家科學院會議記錄雜誌££:6444-6448 ;柏捷克（p〇ljak)，r.j·，等人（1994)結構2_:1121-1123)。在本發明一個具體實例中，調配物包含一種具有如美國專利案6,〇90,382及6,258,562(該等文獻一併併入本專利說明書參考）中所揭示之抗原-键結部分。另外’抗體或其抗原-鍵結部分可為較大免疫黏附分子之部分’該免疫黏附分子係抗體或其抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽以共價或非共價方式結合而成的。此種免疫黏附分子之實例包括利用抗生蛋白鏈菌素核心區域所製備之四體scFv分子（奇利亞諾夫（Klpriyanov)，s m.，等人（1995) 人類抗體及融合瘤包:93-101)，及利用半胱胺酸殘基、標記月太及C-端聚組胺敷標遠所製備之雙價或生物素化scfv分子 86976 •23 - 1331532 (奇利亞諾夫，S.M.,等人（1994)分子免疫學11:1047-1058)。利用抗體慣用的技術（諸如木瓜酵素或胃蛋白酶個別分解完整的抗體）可自完整抗體製備出抗體部分（諸如Fab及F(ab')2 片段）。除此之外，利用本專利說明書中所揭示之標準重組 DNA技術可製備抗體、抗體部分及免疫黏附分子。本專利說明書中所用π人類抗體''意指包括具有源自人類種系免疫球蛋白之可變及固定區域之抗體。本發明人類抗

體包括非人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如，於活體外利用逢機性或位置專一性突變作用或於活體内體細胞突變作用所引入之突變），例如CDRs中，明確言之，係CDR3。然而，本專利說明書中所用”人類抗體”非意指包括其中CDR序列係源自其他已經移植人類架構序列之哺乳類種系（諸如，老鼠）之抗體。

本專利說明書中所用”重組性人類抗體”意指包括所有以重組方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如，利用重組表現载體轉植至宿主細胞（於後文第II節中進一步說明）所表現之抗體、自重組性及組合人類抗體庫所分離之抗體（於後文第III節中進一步說明）、自人類免疫球蛋白基因轉植基因動物（例如，老鼠）中分離之抗體（參考，例如，泰勒（Taylor), L.D.，等人（1992)核酸研究1£:6287-6295)或利用其他將人類免疫球蛋白基因序列切除接合至其他DNA序列之方法所製備、表現、產生或分離之抗體，此種重組性人類抗體具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變及固定區域。然而，在某些具體實例中，此種重組性人類抗體需要 86976 -24- 1331532 經過活體外突變作用（或當使用經人類ig序列基因轉植之動物時，需經活體内體細胞突變作用），因此，當源自及與人類種系VH及VL序列有關時，重組性抗體VH及VL區域之胺基酸序列非自然存於活體内人類抗體種系中。

本專利說明書中所用”經分離抗體"意指一種抗體，其實質上不含其他具有不同抗原性專一性之抗體（例如，專一性键結hTNFa之經分離抗體實質上不含有專一性鍵結hTNFa 以外之抗原之抗體）。然而，專一性键結hTNFa之經分離抗體與其他抗原（諸如，其他物種TNFa分子（於後文進一步說明）之間具有交互反應性，除此之外，經分離抗體實質上不含有其他細胞物質及/或化學物質。

本專利說明書中所用π中和抗體”（或可中和hTNFa活性之抗體"）意指可键結至hTNFa而抑制hTNFa生物活性之抗體。此hTNFa生物活性之抑制作用係測定一或多種hTNFa 生物活性指標而評估定之，諸如hTNFa-誘發細胞毒性作用 (不論是活體外或活體内試驗）、hTNFa-謗發細胞活性作用及hTNFa键結至hTNFa個體之作用。這些hTNFa生物活性指標可根據技藝中所熟知的一或多種標準活體外或活體内分析法評估之（參考，美國專利案6,090,382及6,258,562)較佳地，抗體中和hTNFa活性的能力係以L929細胞中hTNFa-誘發細胞毒性之抑制作用評估定之。當作為其他或另一種 hTNFa活性的參數時，可評估抗體抑制HUVEC中ELAM-1的 hTNFa-誘發表現作用，以測定hTNFa-誘發細胞活化作用。本專利說明書中”表面電漿共振"係指一種光學現象，其 86976 -25 - 特（etanercept)或因夫利馬（infliximab)。調配物中所用較佳的抗體為人類抗體，其可選殖自人類細胞或選殖自呈現人類抗體-庫之基因庫中。人類抗體中特佳者係為對抗抗原 TNFa之抗體，包括人類TNFa(或hTNFa)。在一個具體實例中，本發明調配物包括抗體組合（二或多個）或"雞尾酒M抗體，例如，調配物中可包括抗體D2E7及一或多種額外之抗體。在本發明一個較佳具體實例中，該調配物中含有一種抗體或其抗原-鍵結部分，其自人類TNFa解離之Kd為lx 10_8M 或更低，而KQff速率常數為1χ1 (^秒」或更低，兩者係由表面電漿共振所測定，而以標準活體外L929分析法所測之中和人類TNFa細胞毒性之IC5G為1χ10_7M或更低。在另一個較佳的具體實例中，本發明調配物中包含一種如美國專利案 6,090,382及6,258,562(該等文獻一併併入本專利說明書參考）中所揭示之抗體，或其抗原-鍵結部分。在一方面，本發明調配物中含有D2E7抗體及抗體部分、 D2E7-相關抗體及抗體部分及其他人類抗體及具有與D2E7 等效特性之抗體部分，諸如可以高親合力键結至hTNFa，而具有低解離動力，及高中和能力之抗體。在另一個具體實例中，本發明調配物含有經分離人類抗體，或其抗原-鍵結部分，其自人類TNFa解離之Kd為1χ10·8Μ或更低，而Koff 速率常數為1 X 1〇_3秒_1或更泜，兩者係由表面電漿共振所測定之，且以標準活體外L929分析法所測之中和人類TNFa細胞毒性之IC5G為1 X1 (Γ7Μ或更低。更佳地，經分離人類抗體 86976 -27- 1331532

或其抗原-鍵結部分自人類TNFa解離之Kw為5χ1(Γ4秒-ι或更低，甚至更佳者之〖。^為lxi 〇-4秒·！或更低。更佳者，經分. 離人類抗體或其抗原键結部分以標準活體外L929分析所得. 之中和人類TNFa細胞毒性之IC5〇*lxl〇-8M或更低，甚至更佳者之ICw為1x1〇_9M或更低，而更佳者之1(：5〇為5><1〇_1()]^或更低。在一個較佳具體實例中，該調配物中含有經分離人類重組性抗體或其抗原-鍵結部份之抗體。在另一個較佳的具體實例中，調配物中含有亦可中和1^17〇1_謗發細胞活化作用之抗體，其係以人類臍帶靜脈内皮細胞（HUVEC)上TNFa· ^ 誘發ELAM-1表現作用之標準化活體外分析法評估之。 ΠΙ.製備詷配物本發明調配物的特徵是，其相較於技藝熟識之調配物具有改良特性，例如，相較於技藝熟識調配物，本發明具有較佳的上架期及/或穩定性。一個較佳方面，本發明調配物包括问蛋白質濃度’包含’例如’蛋白質濃度高於約45毫克/毛升，蛋白質濃度高於約5〇毫克/毫升，蛋白質濃度高於 - 約100¾克/毫升或蛋白質濃度高於約15〇毫克/毫升。本發明鲁· 一個較佳的具體實例中’抗體為D2E7。本發明亦提供一種水浴液诀藥組合物，其包括多醇、表面活性劑及一包括pH 约4至8之檸檬酸鹽及/或磷酸鹽之緩衝劑系統，該含量足以調配抗體至治療用途之濃度高於，例如，約45毫克/毫升。 _根據技藝中所熟知的標準方法製備本發明感興趣的抗體。在本發明—個較佳的具體實例中，調配物中所用的抗體係在CHO細胞巾表現，並經u標準的層析法步驟純 86976 -28· 1331532 1) 溶液的密度：1.022公克/毫升 2) 使用的是濃縮物 3) 以1M添加在-個具體實例中，調配物含有上述所列的藥劑（換言之，抗體、緩衝劑、多醇及清潔劑），而基本上不本有一或多種的防腐劑，諸如爷基醇、酚、間_甲苯酴、氯丁醇及氯化苯銨松寧。在另一個具體實例中，調配物中可包含防腐劑，特別是調配物為複劑調配物時。調配物中可包含—或多種其他醫藥上可接受載劑、賦形劑或穩定劑(諸如；明姨氏醫藥科學第16版，歐索爾，Α·編輯（198咐所述者），當其對調配物所要的特徵不會有明顯不良影響時。所採用二接受載劑、賦形劑或穩定劑之劑量及濃度對個體是不具毒性的，其包括額外的緩衝劑；共-溶劑；抗氧化劑（包括㈣血酸及甲硫胺酸）；螯合劑（諸如EDTA)、金屬複合劑（例如 Zn-蛋白複合物）；可生物分解之聚合物（諸如聚酿類）；及/ 或形成相對離子之鹽類（諸如鈉）。本專利說明書調配物亦可與需特性.治療某疾病之一或多種其他治療劑組合使用，較佳者是這些治療劑具有與調配物互補之活性，且不會負面影響調配物中之抗體，組合中所存在之此種治療劑適合含量對所要的目的是有效果的。可與本發明調配物組合使用的額外治療劑進一步揭示於美國專利案6,090,382及6,258,562中，該等文獻一併併入本專利說明書參考。活體投藥所用的調配物必須為無菌狀態，利用過濾法經 •33 · 86976 1331532 無菌過濾膜可於製備調配物前或後輕易地完成。 IV.授用調配物本發明調配物可用於治療美國專利案6,090,382及 · 6,258,562中所述之相似疾病，該等文獻一併併入本專利說明書參考，並詳述如下。調配物的”有效含量"係指足以抑制TNFa活性（例如，預防各種有害TNFa活性相關疾病狀態之型態及病徵）所需的含量。在另一個具體實例中，調配物有效含量是指達到所要結果的所需含量。在一個實例中，調配物的有效含量是足 % 以抑制有害TNFa活性的含量。在另一個實例中，調配物的有效含量為含有40毫克抗體之08毫升之調配物，如表1所示。有效含量可根據個體的身材及體重或疾病的類型等因素而有不同，例如，TNFa活性-抑制調配物的選擇會影響所組成的"有效含量，，，熟識技藝者能夠研究前述的因素，無須過度的實驗即可決定出有關TNFa活性抑制調配物的有效含量。 . 投藥的療私會影響有效含量的組成。可在有害活性修· 發生之前或之後投與個體TNFa活性·抑制調配物，另外，可以母日或連續投藥方式投與數個分開劑量，以及咖吕㈣以 dosages ’或可以連續性灌注或以連續性注射投與劑量。另外，™Fa活性抑制調配物的劑量可根據治療或預防狀態的緊急性依比例增加或減少。治療、"經治泰n t. 療或業已治療"包括減少或舒緩至少一種待/口療疾病、失調症或症症相關十之丨h 巧证戎疾涡相關或引起之症狀，例如 86976 -34- 1331532 療可減少一或多種疾病或症狀或完全消除一種疾病。本發明醫藥調配物中活性成分（抗體）之實際劑量是不同的，因此活性成分含量對特定病患、組合物及投藥途徑可有效達到所要的治療反應，而不會對病患有毒性。選擇劑量含量端視各種的因素而定，包括調配物中存在的抗體活性、投藥途徑、投藥時間、採用特定化合物的排泄速率、治療期間、與採用的特定化合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、待治療病患的年紀、性別、體重、狀況、一般健康及以前的病史及醫藥技藝中所熟知的類似因素。具有技藝中一般技藝的臨床醫師或獸醫師可輕易地決定或開出本發明所需醫藥組合物的有效含量，例如，為達到所要的治療效果’臨床醫師或獸醫師可於開始時採用較所而劑量低之本發明醫藥調配物化合物’而後逐漸地增加劑量直至達到所要的效果。一般而言’本發調配物適當的日劑量為產生治療效果的調配物最低有效劑量，此有效劑量一般係根據上述因素而疋。本發明調配物有效劑量為可以抑制罹患因有害TNFa活性導致疾病個體中之TNFa活性之含量。在一個較佳的具體實例中’每劑調配物提供40毫克之活性成分（抗體）之有效劑里’在另一個具體實例中’調配物提供有效劑量範圍約1至 1毫克之抗體，倘有需要，醫藥調配物的有效曰劑量可於適當的間隔每日分開投用兩、三、四、五、六或更多次的 /欠劑量’可選擇性地以單位劑量形式投藥。 86976 -35- 1331532 本發月個具體貫例中，調配物中的抗體劑量介於約5 至约80毫克之間，在另—個具體實例中，調配物中抗體的劑量介料25至約5G毫克之間，調酉&物特別適合高於_ 克《高抗體劑量。在本發明―個較佳的具體實例中，調配物提供劑#約40毫克之抗體，在$ 一個較佳的具體實例中，琢抗體係對抗TNFa，在最佳的具體實例中，該抗體為 D2E7。 & 在本發明一個具體實例中，調配物中抗體的劑量介於約 M50毫克、約5_145毫克、約1〇14〇毫克約i5i35毫克、約20-130毫克、約25-125亳克、約30_12〇毫克、约35115毫克、約40-110毫克、約45-105毫克、約50-100毫克、約55_95 毫克、約60-90毫克、約65_85毫克、約7〇_8〇毫克或約乃毫克之間。在一個較佳的具體實例中，抗體的劑量為4〇毫克。在另一個較佳的具體實例中，該抗體係對抗丁]^7〇1，在最佳的具體實例中，該抗體為D2E7。上述所列劑量中間範圍（例如約2-149毫克）亦欲為本發明部分，例如，使用任何上列數值之上限值及/或下限值中間範圍之组合亦為本發明包含範圍。要注意的是’劑量數值可根據欲舒緩的病症嚴重性而有所不同，另外咸欲理解的是，對任何特定的個體而言，根據個體所需及投藥人員的專業判斷或投用組合物的監督，一段時間後應予調整專一性劑量療程，而本專利說明書所列的劑量範圍僅是實例’非用以限制申請專利範圍組合物之範疇或實務。 86976 -36- 1331532

本發明提供一種具有延長上架期之醫藥調配物，在一個具體實例中，係用以抑制罹患導因於有害了胸活性之疾病 (個抵中《TNFa活性，包括投與_體本發明抗體或抗體部分’因此個體中的了购活性受到_。較佳地，·α 為人類TNFa，而個體為人類個體。另—種方式是，個體為可表現出與本發明抗體交互反應之TNFa之哺乳動物。另一種個體是引人hTNFa的哺乳動物（例如，投用^胸或表現 hTNFa轉植基因）。本發明調配物為治療目的可投與人類個體（後文進-步討論）。在本發明另—個具體實例中，該液態醫藥調配物可輕易地投藥，纟包括，例如，病患本身可自行投藥。在-個較佳的具體實例中，本發明調配物可以皮下注射方式投藥，較佳者為使用單劑投藥。除此之外，為了獸醫㈣，本發明調配物可投與能表現與抗體交互反應之TNFcx之非人類哺乳動物（例如，靈長類動物、豬或老氣卜

有關後者，此動物模式可作為評估本發明抗體治療效果之用（例如，劑量試驗及投藥的時間點）。本專利說明書中所用|，導因於有害TNFa活性之失調症，，欲包括疾病及其他失調症，其中TNFa存在於罹患該失調症之個體中，或疑似為該疾病的病理學原因，或為該疾病惡化的因素。據此，導因於有害TNFa活性之失調症是指當抑制 TNFa活性後即可舒緩病狀及/或該失調症進展的疾病。此失調症的證明是（例如）罹患該失調症個體中的生物體液中的 TNFa濃度會增加（例如，個體中的血清、血漿、關節液等的 TNFa濃度會增加）’其可利用上述的（例如）抗_TNFa抗體偵 86976 -37- 1331532 測出來。

導因於有害TNFa活性的失調症實例有數個，導因於有害 TNFa活性的失調症實例述於美國申請案60/397275中，該案一併併入本專利說明書參考。有害TNFa活性的實例亦述於美國專利案 6,015,557、6,177,077、6,379,666、6,419,934、 6,419,944、6,423,321 及 6,428,787 ;美國專利申請案 US

2001/0016195、US 2001/0004456 及 US 2001/026801 ; WO 00/50079及WO 01/49321中，該等申請案一併併入本專利說明書參考。本發明抗體及抗體部分用以治療特定失調症之用途進一步討論如下： A.敗血症

腫瘤壞疽因子在敗血症的病理生理學中具有確立的作用，其生物性效應包括高血壓、心肌衰弱、血管滲漏症狀、器官壞疽、刺激釋放出毒性二級媒介物及活化凝血連串的步驟（參考，例如，崔西，K.J.及瑟瑞米，A. (1994)醫學年刊 45:491-503，·羅素（Russel), D 及湯姆森（Thompson), R.C. (1993)生物技術現今觀點生:714-721)。因此，本發明調配物可用以治療任何臨床疾病引起之敗血症，包括敗血性休克、内毒素引起的休克、格蘭氏陰性細菌引起的敗血症及毒素休克症狀。

除此之外，為了治療敗血症，本發明調配物可與一或多種額外能進一步舒缓敗血症之治療藥物同時投用，諸如介白素-1抑制劑（諸如，參考PCT公開案WO 92/16221及WO 86976 -38- 1331532 92/l7583)、細胞激素介白素_6(參考，例如PCT公開案WO 93/1 1 793)或血小板活化因子拮抗劑（參考，例如歐洲專利申請公開案EP 374 510)。另外，在一個較佳的具體實例中，在治療的期間，本發明調配物投與分組敗血症病患之人類個體時，其血清或血漿中IL-6濃度高於500皮克/毫升，更佳者為1000皮克/毫升 (參考，得姆（Daum)，L.,等人所揭示之PCT公開案世界專利

WO 95/20978)。 B.自體免痘疾病腫瘤壞疽因子已被認為在各種自體免疫疾病之病理生理學上扮演某一作用，例如，TNFa已證明會活化類風濕性關

節炎患者之組織發炎並造成關節壞損（參考，例如，崔西及瑟瑞米，前述；阿瑞德（Arend)，W.P.及德爾（Dayer), J-M.(1995) 類風濕性關節炎11:151-160;弗瓦（Fava), R.A.，等人（1993) 臨床實驗免疫學M:261-266)。TNFa亦被認為會促進糖尿病患者島細胞的'死亡，並媒介糖尿病患者對胰島素之抗性（參考，例如崔西及瑟瑞米，前述；PCT公開案世界專利WO 94/08609)。TNFa已被認為會媒介對寡樹突膠質細胞的細胞毒性，並謗發多發性硬化症之發炎斑（參考，例如，崔西及瑟瑞米，前述）。嵌合性及人類化老鼠抗-hTNFa抗體已經進行了治療類風濕性關節炎的臨床試驗（參考，例如，依利歐特，M. J.,等人（1994)刺肋針雜誌Mi.1125-1127 ;依利歐特， M. J.,等人（1994)刺肋針雜誌Mi: 1105-1110;瑞金（Rankin)，Ε· C.,等人（1995)英國風濕學雜誌11:334-342)。 86976 -39- 1331532 本發明調配物可用以治療自體免疫疾病，特別是與發炎相關的疾病，包捂類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎及痛風關節炎、過敏、多發性硬化症、自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎及腎徵候群。典型地，係以系統性方式投用調配物，雖然某些疾病，於發炎位置以局部性投用調配物是較有利的（例如，於類風濕性關節炎關節處局部投藥或糖尿病溃瘍處局部投藥，可單獨投用或與pcT公開案世界專利wo 93/19751所揭示之環己烷_亞^ (cyclohexane-yHdene)衍生物組合投用）。 C.感染疾病腫瘤壞疽因子已被認為與媒介許多感染症中所發現之生物效應有關，例如，TNFa已被認為可媒介腦部發炎及微血官栓塞及瘧疾梗塞（參考，例如，崔西及瑟瑞米，前述> TNFa 已被認為可媒介腦部發炎，包括血液_腦屏障的破壞、驅動敗血症休克症狀及活化腦膜炎中靜脈梗塞（參考，例如，崔西及瑟瑞米，前述）<5 TNFa已被認為會謗發惡病質、刺激病毒增生及媒介後天免疫不全症（AIDS)患者之中樞神經系統破壞（參考，例如，崔西及瑟瑞米，前述）。因此，本發明抗體及抗體部分可用於治療感染疾病，包括細菌性腦膜炎（參考，例如’歐洲專利申請公開案EP 585 705)、腦瘧疾、AIDS 及AIDS相關併發症（arc)(參考，例如，歐洲專利申請公開案EP 230 574)，及移植作用後續發之巨細胞病毒感染（參考’例如’菲茲（Fietze)，E·，等人（1994)移植丛:675_680)。本發明凋配物亦可用以舒緩與感染疾病有關之症狀，包括因 86976 • 40- 1331532 感染（諸如感冒）所引起的發燒及肌肉疼痛及感染後續發的惡病質（例如，AIDS或ARC續發症）。 D.移植

腫瘤壞疽因子已被認為是同種異體移植排斥作用及移植物對抗宿主疾病（GVHD)的重要媒介子，且發現其會媒介當使用老鼠抗體〇KT3(引導對抗T細胞個體CD3複合物）來抑制腎臟移植的排斥作用時所造成的不良反應（參考，例如，崔西及瑟瑞米，上述；依森（Eason), J.D·，等人，（1995)移植作用丛:300-305 ;紹斯瑞恩（Suthanthiran), M.及史多姆 (Strom), T.B. (1994)新英格蘭醫學雜誌 1ϋ:365-375)。因此，本發明調配物可用於治療移植排斥，包括排斥同種異體移植及異種異體移植及抑制GVHD。雖然抗體或抗體部分可單獨使用，更佳者係與一或多種其他可抑制對抗異體移植之免疫反應獲抑制GVHD的藥劑組合使用。例如，在一個具體實例中，本發明調配物是與ΟΚΤ3組合使用，以抑制ΟΚΤ3 所謗發的反應。在另一個具體實例中，本發明調配物是與一或多種引導對抗其他與調控免疫反應有關之標的物（諸如，細胞表面分子CD25(介白素-2個體_a)、CDlla (LFA_1)、 CD54 (ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80 (B7-1) 及/或CD86 (B7-2))之抗體組合使用，在另一個具體實例中，本發明調配物是與一或多種一般免疫抑制劑（諸如環孢素A或FK506)組合使用。 E.惡性腫瘤腫瘤壞疽因子已被認為會謗發惡病質、刺激腫瘤生長、 86976 -41 - 1331532 增進惡性腫瘤移轉可能性及媒介惡性腫瘤之細胞毒性（參考’例如，崔西及瑟瑞米，上述）^因此，本發明調配物可用於治療惡性腫瘤、抑制腫瘤生長或移轉作用及/或舒緩惡性腫瘤續發的惡病質。本發明調配物係以全身性投藥或於局部腫瘤位置投藥。部疾病腫瘤壞疽因子已被認為與成人呼吸窘迫徵候群的病理生理學有關，包括刺激白血球内膜細胞活化作用、引導對抗肺臟細胞的細胞毒性及引發血管沁漏徵候群（參考，例如，崔西及瑟瑞米，上述）。因此，本發明調配物可用於治療各式的肺部疾病’包括成人呼吸窘迫徵候群（參考，例如，pct 公開案W0 91/04054)、休克肺、慢性肺發炎疾病、肺結節病、肺纖維化及矽化。本發明調配物可全身性投藥或以，例如，氣膠局部投藥於肺表面。 G.腸疬病腫瘤壞疽因子已被認為與發炎性腸疾病之病理生理學有關（參考’例如，崔西，K.J.，等人（1986)科學2M.470-474 :桑姆（Sun), Χ-Μ·，等人（1988)臨床研究雜誌81:1328-1331 ;麥當勞（MacDonald), T.T·，等人（1990)臨床試驗免疫學 81:301-305)。嵌合性老鼠抗_hTNFa抗體已在進行治療克隆氏疾病之臨床試驗中（凡得利曼（van Dullemen)，H.M.，等人 (1995)腸胃學U29-135)。本發明調配物亦可用以治療腸疾病’諸如’原發性發炎性腸疾病，其包括兩種症狀，克隆氏疾病及潰瘍性結腸炎。 86976 -42- 1331532 Η.心臟疾病本發明調配物亦可用以治療各式的心臟疾病，包括心臟缺血（參考，例如，歐洲專利申請公開案ΕΡ 453 898)及心臟功能不全（心肌虚弱）（參考，例如，PCT公開案W0 94/20139)。 I.其他本發明醫藥調配物亦可用以治療其他因TNFa有害活性所造成之各種疾病，由於TNFa活性已被認為是其他疾病及症狀病理生生理學之實例者，因此可用本發明抗體或抗體部分治療者包括發炎性骨頭疾病及骨頭再吸收疾病（參考，例如，柏特例尼（Bertolini), D.R.，等人（1986)自然 319:516-518；可尼（Konig), A.，等人（1988)骨頭礦物質研究雜誌 i : 621-627 ;勒納（Lerner), U.H.及歐林（Ohlin)，A. (1993) 骨頭礦物質研究雜誌反:147-155 ;及雪克（Shankar), G.及史特恩（Stern), P.H. (1993)骨骼 11:871-876)、肝炎，包括酒精性肝炎（參考，例如麥克萊恩（McClain), C.J.及可恩（Cohen), D.A.(1989)肝臟學 2:349-351 ;非佛（Felver)，Μ.E.，等人（1990) 酒精臨床實驗研究11:255-259 ;及漢森（Hansen)，J.,等人 (1994)肝臟學2^:461-474)及病毒性肝炎（雪洛恩（Sheron), N.，等人（1991)肝臟學雜誌 11:241-245 ;及何森（Hussain), M.J., 等人（1994)臨床病理學雜誌11:1112-1115)、凝血失調（參考，例如，凡得博爾（van der Poll), T.,等人（1990)新英格蘭醫學雜誌112:1622-1627 ;及凡得博爾，T·,等人（1991)臨床生物學研究進展丛1:55-60)、燒傷（參考，例如，吉洛爾（Giroir), B.P.,等人（1994)美國生理學雜誌2^I:H118-124 :及劉（Liu), 86976 -43 - 1331532 X.S.，等人（1994)燒燙傷雜誌迎：40-44)、再灌注傷害（參考，例如，史卡爾斯（Scales)，W_E.，等人（1994)美國生理學雜誌 21Z:G1 122-1127;瑟利克（serrick)，c·，等人（1994)移植作用 51:1 158-1 162 ;及右（Yao), yw，等人（1995)復活这157_ 168)、疤腫形成作用（參考，例如，麥克古利（McCauiey)，R丄，等人（1992)臨床免疫學雜誌、傷疤組織形成； pyrexia; periodontal疾病；肥胖症及放射性毒性。其他導因於有害TNFa有害活性的失調症包括（但不侷限於）成人史蒂爾氏疾病、阿茲海默症、ankyl〇sing spondylitis、氣喘、癌症及癌症惡體質、動脈粥狀硬化、慢性動脈粥狀硬化、慢性疲勞症狀、肝臟衰竭、慢性肝臟衰竭、阻礙性肺臟疾病、慢性阻礙性肺臟疾病、充血性心臟衰竭、皮膚夕發性肌炎、糖尿病之大血管病變、子宮内膜異位、家族性定期性發燒、纖維化、血液透析、亞里西_賀克莫氏反應、青少年RA、川崎徵候群、骨髓增生異常徵候群、心肌梗塞、 panciaticular vulgaris、齒骨膜疾病、週邊神經病變、多關節型炎、多發性肌炎、前進式腎臟衰竭、牛皮癖、牛皮癖 I1生關節炎、雷特氏徵候群、結節病、硬皮症、脊柱關節病、史蒂爾氏疾病、中風、治療相關徵候群、治療誘發發炎徵候群、投用IL-2後發炎徵候群、胸腹主動脈動脈瘤修復 (TAAA)、威瑟勒-比西特氏疾病、黃熱病疫苗接種、第一型糖尿病、第二型糖尿病、神經疼痛、坐骨神經痛、腦水腫、脊椎内及/或週邊水腫、脈管炎、章格納氏肉芽腫病、暫時性關節炎、風濕性多肌痛、高安動脈炎、結節性多動脈炎、 86976 -44- 1331532 微生物研究進行測試是否該調配物會使微生物生長。這些試驗的結果顯示如果調配物保存在2〇至25tl4天，並不會使微生物生長。此結果是將低量微生物（NMT 100菌落形成單位/毫升）金黃葡萄球菌ATCC編號6538P、白色念球菌ATCC編號 1〇231、黑麴菌ATCCC編號16404 '綠膿桿菌ATCC編號 9027、環境分離株）直接接種至無菌調配物中測試所得的.，而後檢視經接種的調配物中整體微生物生長情形，例如渾濁度的變化。沒有渾濁是沒有微生物生長的指標，並觀察接種容器14天。除此之外，從這些接種容器中無法分離到生物sa，因此，結論是該調配物在此條件下不會使微生物生長。引用參者文獻本專利說明書中所列的所有參考文獻及專利案之全文内容一併併入本專利說明書參考。等同效力熟識技藝者將了解或確定僅利用例行性實驗，許多是和本發明專利說明書所揭示之特定具體實例具有相同效力，下列之申請專利範圍中包括此等同效力者。 86976 -49 - 1331532 序列表 <11〇>百慕達商亞培(百慕達)公司 <120>用於治療TNF-α相關失調症之人類抗體調配物 <130>BBI-185 <140> 092122123 <141〉 2003-08-12 <150> 10/222140 <151>2002-08-16 <160〉34 <170〉Fast SEQ視窗4.0版 <210> 1 <211> 108 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 1

Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn. ;20· 25 30

Tyr Leu Ala Trt) Tyr Gin Gin Lys 35 40 工le Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin 50 55 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 85 Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 100

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 60 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin 75 80 Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro 90 95 Val Glu lie Lys 105 <210〉2 <211> 122 <212>蛋白質 <213>人工序列 86976 1331532 <220> <223>突變人類抗體 <400> 2

Pro Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Glv Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Aso Aso 20 25 30

Tyr Ala Mec His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Val Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly Kis lie Asp Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 '

Val Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 10 <212>蛋白質 <213 >人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <220> : <221>變種 <222> 10 <223〉Xaa = Thr或Ala <400> 3

Pro Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa 1 5 . 10 <210> 4 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 86976 1331532 <220> <221>變種 <222> 13 <223> Xaa = Tyr或Asn <400> 4

Pro Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Aso Xaa 1 5 10

<210> 5 <211> 8 <212>蛋白質 <213>人工异歹丨J <220> <223>突變人類抗體 <400> 5

Pro Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser 1 5

<210> 6 <211> 18 <212>蛋白質 <213>人工箄歹丨J <220> <223>突變人類抗體 <400> 6

Pro Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 1 · '5 10 15

Glu Gly <210> 7 <211> 12 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 7

Pro Arg Ala Ser Gin Gly He Arg Asn Tyr Leu Ala 86976 1331532 1 5 10 <210> 8 <211> 6 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 8

Pro Asp Tyr Ala Met His 1 ' 5 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 ' <210> 11 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序歹 <220> <223>突變人類抗體 — <400> 11

Pro Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala 15 10 <210> 12 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 12 -4 - 86976 1331532

Pro Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212>蛋白g <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 13

Pro Gin Lys Tyr Gin Arg Ala Pro Tyr Thr 15 10 <210> 14 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 14

Pro Gin Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr 15 10 <210> 15 ; <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工居列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 15

Pro Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr 15 10 <210> 16 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 86976 1331532 <220> <223>突變人類抗體 <400> 16

Pro Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr 15 10 <210> 17 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序歹丨J . <220> <2 23>突變人類抗體 <400> 17

Pro Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tvr 15 10 <210> 18 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <2 23>突變人類抗體 <400> 18

Pro Gin Lys' Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn 1 5. 10 <210> 19 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 19

Pro Gin Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr 15 10 <210> 20 -6 - 86976 1331532 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 20

Pro Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn 15 10 <210> 21 <211> 10 <21.2>蛋白質 <213>人工；f列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 21

Pro Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser 15 10

<210> 22 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序歹丨J <220> ; <223>突變人類抗體 <400> 22

Pro Gin Gin Tyr Asn Ser Ala Pro Asd Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212>蛋白質 <213 >人工/^列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 23

Pro Gin Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr 86976 1331532 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 _ <400> 24

Pro Gin Lys Tyr 工le Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5 . 10 <210> 25 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 25

Pro Gin Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 26 <211> 10 ; <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <4'00> 26

Pro Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> -8 - 86976 1331532 <223>突變人類抗體 ' <400> 27

Pro Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn 1 5 10 <2i0> 28 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 28

Pro Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 29

Pro Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr 1 : 5 10 <210> 30 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 _ <400> 30

Pro Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Aso 15 10 <210> 31 <211> 13 86976 1331532 <2f2>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 31

Pro Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser ?he Ser Leu Aso Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人工序歹丨』 <220> <223>突變人類抗體 <400>.32

Pro Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr 15 10

<210> 33 <211> 13 <212> 奎·^質 <213>人工序歹丨J <220> <223>突變人類抗體 <400> 33

Pro Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>突變人類抗體 <400> 34

Pro Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tvr 15 10 86976

Claims

122123號專利申請案請專利範圍替換本(99年6月）拾、申請專利範圍： 1. 一種醫藥調配物，其包含一種液體水洛液醫藥調配物’其包括溶於包含擰檬酸鹽及/或麟酸鹽之緩衝溶液之約15 -15 0毫克/毫升之抗體’該調配物pH介於約4及8之間；其中該抗體為人類抗腫瘤壞疽因子a (TNFa)、或其抗原_ 鍵結片段，其自人類TNFa解離之Kd為1χ1〇·8Μ或更低，而 K〇ff速率常數為1X1 (Τ3秒-1或更低，兩者係以表面電漿共振測定’而以標準活體外L929分析法所測之中和人類TNpa 細胞毒性之IC5G為1χ10·7Μ或更低。 2. —種水溶液醫藥調配物’其包括5-20毫克/毫升之多醇、 0·卜10毫克/毫升之表面活性劑、及包括檸檬酸鹽及/或磷酸鹽之ΡΗ約4至8之緩衝劑系統’其含量足以使所調配治療用途之人類抗腫瘤壞疽因子a (TNFa)抗體之濃度高於約45毫克/毫升，且其中該人類抗TNFa抗體或其抗原_鍵結部分自人類TNFa解離之心為lxl〇_8M或更低，而〖咐速率常數為1 X 1 〇·3秒-1或更低，兩者係以表面電漿共振測定’而以標準活體外L929分析法所測之中和人類TNFa細胞毒性之IC5〇為1χ10·7Μ或更低。 3 ·根據申請專利範圍第1或2項之調配物，其包括一濃度高於約45毫克/毫升之抗體。 4 _根據申請專利範圍第1或2項之調配物，其中該多醇為甘露醇’而該表面活性劑為聚山梨醇酯80。 5.根據申請專利範圍第1或2項之調配物，其中該抗體或其 86976-990611.doc .ι . 1331532 抗原-鍵結部分可與人類TNFa鍵結，且為抗體D2E7或其抗原鍵結部分。 6· 一種液體水溶液醫藥調配物，其包括·· a) 15-150¾克/毫升之人類抗腫瘤壞疽因子a (TNFa)抗體’其中該人類抗TNFc^^體或其抗原鍵結部分自人類 ™Fa解離之κ<«為1χ1〇-8Μ或更低，而Koff速率常數為 1χ1〇·3秒-1或更低，兩者係以表面電漿共振測定，而以標準活體外L929分析法所測之中和人類TNFa細胞毒性之IC5G為1xi〇_7m或更低， b) 5-20毫克/毫升之甘露醇， c) 0.1-10毫克/毫升之聚山梨醇酯8〇，及 d) 包括檸檬酸鹽及/或磷酸鹽、pH為4至8之缓衝劑系統。 7. 根據申請專利範圍第6項之調配物，其中pH介於約4 5至約 6.0。 8. 根據申請專利範圍第6項之調配物，其含有 a) 約50毫克/毫升之抗體， b) 約12毫克/毫升之甘露醇，及 c) 約1毫克/毫升之聚山梨醇酯80。 9. 根據申請專利範圍第6項之調配物，其中該緩衝劑系統包括 a) 約1.3毫克/毫升之檸檬酸， b) 約0.3毫克/毫升之檸檬酸納， c) 約1.5毫克/毫升之磷酸氫二鈉二水合物， d) 約0.9毫克/亳升之磷酸二氫鈉二水合物，及 e) 約6.2毫克/毫升之氯化鈉。 86976-990611.doc 1331532 10. 根據申請專利範圍第8項之調配物，其中該抗體或其抗原-鍵結部分可與人類TNFa鍵結，且其為抗體D2E7或其抗原鍵結部分。 11. 根據申請專利範圍第1、2及6項中任一項之調配物，其中該抗體濃度介於約25及約125毫克/毫升之間。 12. 根據申請專利範圍第1、2及6項中任一項之調配物，其中該抗體濃度約50毫克/毫升。 13. 根據申請專利範圍第1、2及6項中任一項之調配物，其另外適合以單劑皮下注射使用。 14. 根據申請專利範圍第1、2及6項中任一項之調配物，其中該抗體或其抗原-鍵結部分為重組性抗體，或其抗原_鍵結部分。 15. 根據申請專利範圍第1、2及6項中任一項之調配物，其中該抗體或其抗原-鍵結部分，具有下列特徵： a) 以表面電漿共振測定，其自人類TNFa解離之1<：。打速率常數為1x1 〇_3秒-1或更低； b) 具有輕鏈CDR3區域，其包括SEQIDNO:3胺基酸序列’或在位置1、4、5、7或8經一個丙胺酸取代作用，或在位置1 ' 3、4、6、7、8及/或9經一至五個保守胺基酸取代作用之SEQ ID NO : 3胺基酸序列； 0具有重鏈CDR3區域，其包括SEQIDNO:4胺基酸序列，或在位置2、3、4' 5、6、8、9、10或11經一個丙胺&取代作用，或在位置2、3、4、5、ό、8、9、10、11 及/或12經一至五個保守胺基酸取代作用之SE D N〇 : y 86976-990611.doc ^ 胺基酸序列β 16·根據申請專利範圍第i、2及6項中任一項之調配物，其中。玄抗體或其抗原-鍵結部分具有包括Seq ID no : 1胺基酸序列之輕鏈可變區域（LCVR)及包括SEQ m NO : 2胺基酸序列之重鏈可變區域（HCVR)。 17_根據申請專利範圍第丨、2及6項中任一項之調配物，其中該抗體或其抗原-鍵結部分可中和人類TNFa、黑猩獲 TNFa及至少一種額外選自由狒狒TNFa、小猿TNFa、非洲綠猴TNFa及怪河猴TNFa所組之群之靈長類TNFa。 18. 根據申請專利範圍第17項之調配物，其中該抗體或其抗原-鍵結部分亦可中和老鼠TNFa及/或豬TNFa之活性。 19. 根據申請專利範圍第丨或6項之調配物，其中該抗體或其抗原-鍵結部分為抗體D2E7或其抗原鍵結部分。 20. —種根據申請專利範圍第1、2及6項中任一項之調配物之用途’其係用以製備用於治療罹患導因於有害TNFa活性之失調症之個體之藥物。 21. 根據申請專利範圍第丨項之調配物，其中該抗體濃度介於約20及130毫克/毫升之間。 22. 根據申請專利範圍第丨〇項之調配物，其中該抗體濃度介於約2 0及13 0毫克/毫升之間。 23. 根據申請專利範圍第10項之調配物，其中該抗體濃度為約50毫克/毫升。 24·根據申s青專利範圍第21至23項中任一項之調配物，其進一步適於皮下單劑注射用。 86976-990611.doc . .根據申請專利範圍第8或9項之調配物，其中該抗體或其抗原鍵結部分具有下列特徵： a) 自人類TNFa解離之〖。„速率常數由表面電漿共振所測定為lxlO·3秒-1或更低； b) 具有輕鏈CDR3區域，其包括SEQ ID N〇 : 3胺基酸序列，或在位置1、4、5、7或8經一個丙胺酸取代作用，或在位置1、3、4、6、7、8及/或9經一至五個保守胺基酸取代作用之SEQ ID NO : 3胺基酸序列； c) 具有重鏈CDR3區域’其包括SEq ID NO : 4胺基酸序列’或在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11經一個丙胺酸取代作用，或在位置2、3、4' 5、6' 8、9、 10、11及/或12經一至五個保守胺基酸取代作用之seq ID NO : 4胺基酸序列。 •根據申請專利範圍第8或9項之調配物，其中該抗體或其抗原鍵結部分具有包括SEQ ID NO : 1胺基酸序列之輕鏈可變區域（LCVR) ’以及包括SEq ID NO : 2胺基酸序列之重鏈可變區域（HCVR)。 27·根據申請專利範圍第8或9項之調配物，其中該抗體或其抗原鍵結部分可鍵結至人類TNFa，且其為抗體D2E7或其抗原鍵結部分。 28 4 •根據申請專利範圍第6項之調配物，其中pH介於約4·8及約5.5之間。 29·根據申請專利範圍第6項之調配物，其中pH介於約5.0及約5.2之間。 [ 86976-990611 .doc _ c _ 1331532 30.根據申請專利範圍第1項之調配物，其經過至少3次冷凍/ ' 解凍週期後仍能保持調配物之穩定性。

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