PT2238985E

PT2238985E - Formulação líquida contendo anticorpo de elevada concentração

Info

Publication number: PT2238985E
Application number: PT08866971T
Authority: PT
Inventors: Toshiyuki Morichika; Daisuke Kameoka; Yoshimi Imaeda; Terutoshi Maeda; Oliver Boris Stauch
Original assignee: Hoffmann La Roche; Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2012-11-28
Also published as: SG2013049325A; JP2023055780A; DK2238985T3; RU2010131179A; CA2708627A1; ECSP10010370A; MY159450A; KR20100095474A; US11767363B2; EP2238985B1; CN101883588B; EP2238985A1; RU2497544C2; CA2708627C; JP6259436B2; US20140005367A1; EP2238985B2; CY1113616T1; AU2008344292B2; BRPI0818903B1

Description

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO LÍQUIDA CONTENDO ANTICORPO DE ELEVADA CONCENTRAÇÃO"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a uma formulação contendo anticorpo e, particularmente, a uma formulação liquida estável contendo uma elevada concentração de um anticorpo.

TÉCNICA ANTECEDENTE

Nos últimos anos, foram desenvolvidas e utilizadas na prática diversas formulações de anticorpo. Muitas dessas formulações de anticorpo são utilizadas em injecção intravenosa. Contudo, devido a necessidades de um local clinico, existe uma procura crescente para o desenvolvimento de uma formulação contendo anticorpo que possa ser administrada como uma injecção subcutânea auto-injectável.

Na concepção de uma formulação contendo anticorpo para injecção subcutânea, visto que uma dose de um anticorpo por administração é grande (cerca de 100 mg a 200 mg) e uma quantidade de uma solução de injecção, em injecção subcutânea, é, em geral, limitada, é necessário aumentar uma concentração de um anticorpo num liquido a ser administrado. Em vista disto, em muitos casos, são utilizadas formulações de elevada concentração, que são preparadas pela técnica de liofilização-concentração, na qual uma formulação liofilizada é 1 reconstituída em água tendo um volume mais pequeno do que aquele antes da liofilização. Contudo, existe uma forte procura para uma formulação líquida que não requeira reconstituição e que seja fácil de manusear. Embora um aumento numa viscosidade de uma formulação devido à adição de um agente crioprotector, tal como um açúcar, no processo de produção da formulação liofilizada não seja preferido para formulações para injecção subcutânea, supõe-se que este problema poderia ser evitado se a formulação fosse uma formulação líquida.

As soluções contendo uma elevada concentração de um anticorpo tendem a formar soluções que têm uma elevada viscosidade, devido às propriedades macromoleculares das proteínas e devido às interacções intermoleculares das proteínas. Além disso, nos casos em que uma proteína é armazenada numa forma de uma solução que tem uma elevada concentração, ocorre degradação problemática, que inclui uma geração de agregados insolúveis e/ou solúveis; e é necessário prevenir essa degradação. Especialmente, em formulações de anticorpo, num estado líquido, são susceptíveis de serem formadas associações e são susceptíveis de serem gerados agregados insolúveis. Nos casos em que uma formulação líquida é armazenada durante muito tempo, existe um problema em que a bioactividade das moléculas de anticorpo é perdida devido à desamidação de resíduos de aminoácidos, tal como resíduos de asparagina. Têm sido propostas diversas ideias para proporcionar uma formulação estabilizada, na qual a perda de um componente activo seja pequena, mesmo após a formulação ser armazenada durante um longo período de tempo. Essas formulações são produzidas pela dissolução de um componente activo e diversos aditivos numa 2 solução tampão. Contudo, para formulações líquidas contendo uma elevada concentração de um anticorpo, não existe ainda uma tecnologia que seja suficiente para prevenir a dimerização e desamidação.

Os documentos WO 2004/091658 e US 2004/0191243 divulgam formulações de anticorpo estáveis, altamente concentradas, compreendendo, e. g., arginina. 0 documento WO 2007/074880 (ver também o documento EP 1977763) divulga formulações liofilizadas contendo anticorpo compreendendo, e. g. , arginina, para inibir a formação de dímeros.

Existe uma necessidade para proporcionar uma formulação contendo anticorpo de elevada concentração, na qual a dimerização e desamidação durante o armazenamento de longo prazo sejam inibidas e que seja estável e adequada para utilização em administração subcutânea.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMA A SER RESOLVIDO PELA INVENÇÃO

Um objectivo da presente invenção é proporcionar uma formulação liquida contendo anticorpo de elevada concentração, na qual a dimerização e desamidação durante o armazenamento de longo prazo sejam inibidas e que seja estável e adequada para utilização em administração subcutânea. 3

MEIOS PARA A RESOLUÇÃO DO PROBLEMA

As presentes requerentes conduziram um estudo intensivo com a intenção de alcançar o objectivo acima e, como resultado, verificaram que uma formulação liquida contendo anticorpo de elevada concentração estável pode ser proporcionada pela adição de um aminoácido, arginina ou um seu sal, como um estabilizante para, desse modo, completar a presente invenção.

Isto é, a presente invenção proporciona o seguinte: (1) Uma formulação líquida contendo anticorpo estável, caracterizada por compreender arginina a 40 a 1000 mM e metionina a 10 a 200 mM. (2) Um método para a inibição da dimerização de moléculas de um anticorpo numa formulação líquida contendo o anticorpo, compreendendo a adição de arginina e metionina à formulação líquida.

VANTAGENS DA INVENÇÃO

Pela presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida contendo uma elevada concentração de um anticorpo, com a qual a reformulação por concentração por liofilização não é necessária e, por este motivo, não requer reconstituição. A formulação líquida contendo anticorpo, de acordo com a presente invenção, pode ser armazenada num estado liquido durante muito tempo. Visto que a formulação líquida contendo anticorpo, de acordo com a presente invenção, pode ser produzida por um processo não incluindo uma etapa de liofilização, a adição de um 4 açúcar ou semelhante, como um agente crioprotector, não é necessária.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra um cromatograma típico do Exemplo 1. A Fig. 2 mostra resultados de avaliação da cromatografia de permeação em gel (SEC) no Exemplo 1. A Fig. 3 mostra resultados de avaliação da cromatografia de permeação em gel (SEC) no Exemplo 1. A Fig. 4 mostra um cromatograma típico do Exemplo 2. A Fig. 5 mostra resultados de avaliação da cromatografia de permuta iónica (IEC) no Exemplo 2. A Fig. 6 mostra resultados de avaliação da cromatografia de permuta iónica (IEC) no Exemplo 2. A Fig. 7 mostra resultados de avaliação da cromatografia de permeação em gel (SEC) no Exemplo 3. A Fig. 8 mostra resultados de avaliação da cromatografia de permuta iónica (IEC) no Exemplo 3. MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO A presente invenção será agora descrita em detalhe. 5 "formulação líquida contendo

Na presente invenção, anticorpo" significa uma formulação líquida contendo um anticorpo como um componente activo, que é preparada de modo a que possa ser administrada a um animal, tal como humano, e que seja produzida, de um modo preferido, por um processo não incluindo uma etapa de liofilização. A formulação líquida contendo anticorpo de acordo com a presente invenção é uma formulação farmacêutica líquida contendo um anticorpo a uma elevada concentração que, de um modo preferido, tem uma concentração de anticorpo não inferior a 50 mg/mL, de um modo mais preferido, não inferior a 100 mg/mL, de um modo ainda mais preferido, não inferior a 120 mg/mL e, de um modo ainda mais preferido, não inferior a 150 mg/mL. Deve notar-se que uma formulação líquida contendo anticorpo a uma concentração de 120 mg/mL ou superior ou, de um modo preferido, 150 mg/mL ou superior, não foi desenvolvida para utilização comercial. Nomeadamente, a presente invenção permite, pela primeira vez, disponibilizar para utilização uma formulação líquida contendo anticorpo a esta elevada concentração.

Além disso, considerando o processo de preparação, a concentração mais elevada de anticorpo na formulação líquida de acordo com a presente invenção pode ser, tipicamente, 300 mg/mL, de um modo preferido, 250 mg/mL e, de um modo mais preferido, 200 mg/mL. Por conseguinte, a formulação liquida contendo anticorpo de acordo com a presente invenção tem, de um modo preferido, uma concentração de anticorpo de 50 a 300 mg/mL, de um modo mais preferido, de 100 a 300 mg/mL, de um modo ainda mais preferido, de 120 a 250 mg/mL e, de um modo ainda mais preferido, de 150 a 200 mg/mL. 6 0 anticorpo a ser utilizado na presente invenção não está restringido, desde que se ligue a um antigénio desejado. 0 anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal, embora um anticorpo monoclonal seja preferido, porque um anticorpo que tem propriedades uniformes pode ser produzido de um modo estável.

Um anticorpo monoclonal que pode ser utilizado na presente invenção inclui, não apenas anticorpos monoclonais originados de um animal, tais como humano, murganho, rato, hámster, coelho, ovelha, camelo ou macaco, mas também inclui anticorpos recombinantes artificialmente modificados, tais como anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo biespecifico. A classe de imunoglobulina do anticorpo não está restringida e pode ser qualquer das classes incluindo IgG, tais como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM. Entre estas classes, são preferidas as IgG e IgM. 0 anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção inclui, não apenas anticorpos intactos, mas também fragmentos de anticorpo, tais como Fv, Fab e F(ab)2; e anticorpos de baixo peso molecular, tal como Fv de cadeia simples (scFv, sc(Fv)2, diacorpos, tal como dímero de scFv), que têm uma ou mais especificidades, preparados pela ligação das regiões variáveis de um anticorpo através de um ligante, tal como um ligante peptidico.

Os anticorpos descritos acima que podem ser utilizados na presente invenção podem ser preparados por métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica. 7

Um hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal pode ser preparado como se segue, basicamente utilizando uma técnica conhecida. Isto é, o hibridoma pode ser preparado pela imunização de um animal com um antigénio desejado, ou células expressando o antigénio desejado, como um antigénio de sensibilização por um método padrão; fusão dos imunócitos obtidos com células parentais conhecidas por um método de fusão celular padrão; e rastreio de uma célula produzindo anticorpo monoclonal (hibridoma) por um método de rastreio padrão. A preparação de um hibridoma pode ser efectuada, por exemplo, pelo método de acordo com o método de Milstein et al. (Kohler. G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). Nos casos em que a imunogenicidade do antigénio é baixa, o antigénio pode ser ligado a uma macromolécula antigénica, tal como albumina, e o conjugado resultante pode ser utilizado como um imunogénio.

Podem ser empregues anticorpos recombinantes, que são preparados pela técnica de recombinação genética, na qual um gene de antigénio é clonado a partir de um hibridoma, incorporando o gene num vector apropriado, introduzindo o vector dentro de um hospedeiro e fazendo com que o hospedeiro produza o anticorpo (ver, por exemplo, Cari, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990) . Mais especificamente, um ADNc codificando a região variável (região V) no anticorpo é sintetizado a partir do ARNm de um hibridoma utilizando uma transcritase reversa. Se um ADN codificando a região V do anticorpo desejado for obtido, o ADN é, depois, ligado a um ADN codificando a região constante (região C) de um anticorpo desejado e o ADN ligado resultante é introduzido num vector de expressão. Alternativamente, um ADN codificando a região V do anticorpo pode ser incorporado num vector de expressão contendo o ADN codificando a região C do anticorpo. 0 ADN é incorporado no vector de expressão, de modo a que o ADN seja expresso sob o controlo de uma região controlando a expressão, tais como estimulador ou promotor. As células hospedeiras são, depois, transformadas com o vector de expressão resultante e o anticorpo pode ser expresso pelas células hospedeiras.

Na presente invenção, podem ser utilizados anticorpos recombinantes artificialmente modificados para efeitos de redução da heteroantigenicidade para humano, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Estes anticorpos modificados podem ser produzidos por métodos conhecidos. Um anticorpo quimérico é um anticorpo compreendendo regiões variáveis na cadeia pesada e cadeia leve num anticorpo de um animal diferente de humano, tal como murganho, e regiões constantes na cadeia pesada e cadeia leve num anticorpo de humano, e pode ser obtido pela ligação de um ADN codificando a região variável no anticorpo de murganho com um ADN codificando a região constante no anticorpo humano, incorporando o ADN obtido num vector de expressão, introduzindo o vector de expressão dentro de um hospedeiro e fazendo com que o hospedeiro produza o anticorpo. 0 anticorpo humanizado também é denominado anticorpo humano remodelado e é obtido pela transplantação da CDR (região determinante de complementaridade) de, por exemplo, um anticorpo de murganho, para a região determinante de complementaridade de um anticorpo humano. Também se conhece uma técnica de recombinação genética padrão para a preparação do anticorpo humanizado. Especificamente, um ADN, concebido de modo a que a CDR do anticorpo de murganho e a região de estrutura (FR) do 9 anticorpo humano sejam ligadas, é sintetizado pelo método de PCR a partir de vários oligonucleótidos, preparados de modo a terem regiões de sobreposição nas suas terminações. 0 ADN obtido é ligado a um ADN codificando a região constante de um anticorpo humano e o ADN resultante é introduzido num vector de expressão. 0 vector de expressão é introduzido num hospedeiro e o hospedeiro é preparado para produzir o anticorpo humanizado (ver documentos EP 239400 A e WO 96/02576). Quanto à FR do anticorpo humano a ser ligado através de CDR, é seleccionada uma de cuja região determinante de complementaridade forma um bom sitio de ligação do antigénio. Como requerido, um (os) aminoácido(s) na região determinante de complementaridade pode(m) ser substituído(s), de modo que a região determinante de complementaridade do anticorpo humano remodelado forme um sítio de ligação do antigénio apropriado (Sato, K. et al., Câncer Res. (1993) 53, 851-856) .

Os métodos para a obtenção de um anticorpo humano são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humano desejado, tendo uma actividade de ligação a um antigénio desejado, pode ser obtido pela sensibilização, in vitro, de linfócitos humanos com o antigénio desejado ou com as células expressando o antigénio desejado; fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma humano, por exemplo, células U266; e obtenção do anticorpo a partir das células (ver documento JP 1-59878 B) . O anticorpo humano desejado também pode ser obtido pela imunização de um animal transgénico tendo todos os repertórios de genes de anticorpos humanos com o antigénio (ver documentos WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 e WO 96/33735). Além disso, também é conhecida uma técnica pela qual um anticorpo humano é obtido por enriquecimento utilizando uma biblioteca de anticorpos humanos. 10

Por exemplo, uma região variável de um corpo humano é expressa na forma de um anticorpo de cadeia simples (scFv) na superfície de um fago, por utilização de um método de apresentação fágica e o fago que se liga ao antigénio pode ser seleccionado. Pela análise do gene do fago seleccionado, a sequência de ADN codificando a região variável do anticorpo humano que se liga ao antigénio pode ser determinada. Se a sequência de ADN do scFv que se liga ao antigénio for determinada, é construído um vector de expressão apropriado contendo a sequência e pode ser obtido o anticorpo humanizado. Estes métodos são bem conhecidos e podem ser referidos os documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 e WO 95/15388.

Nos casos em que um gene de anticorpo é uma vez isolado, e o gene é introduzido dentro de um hospedeiro apropriado de modo a preparar o anticorpo, podem ser utilizadas combinações apropriadas do hospedeiro e vector de expressão. Nos casos em que células eucarióticas são utilizadas como o hospedeiro, podem ser utilizadas células animais, células vegetais e células fúngicas. Células animais conhecidas incluem (1) células de mamífero, por exemplo, CHO, COS, mieloma, BHK (rim de hámster bebé), Hela e Vero; (2) células de anfíbio, por exemplo, oócitos de Xenopus e (3) células de insecto, por exemplo, sf9, sf21 e Tn5. Células vegetais conhecidas incluem células originadas de plantas pertencendo ao género Nicotiana, por exemplo, Nicotiana tabacum e as células podem ser submetidas a cultura de callus. Células fúngicas conhecidas incluem células originadas de leveduras, por exemplo, as pertencendo ao género Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae; e bactérias filamentosas, por exemplo as pertencendo ao género Aspergillus, tal como 11

Aspergillus niger. Nos casos em que sejam utilizadas células procarióticas, há sistemas de produção utilizando células bacterianas. Células bacterianas conhecidas incluem células de E. coli e células de Bacillus subtilis. 0 anticorpo é obtido pela introdução de um gene de anticorpo desejado dentro destas células por transformação e cultivo das células transformadas in vitro.

Anticorpos na forma de fragmentos de anticorpo, anticorpos de baixo peso molecular e anticorpos modificados também podem ser empregues como o anticorpo na presente invenção. Exemplos dos fragmentos de anticorpo e anticorpos de baixo peso molecular incluem Fab, F(ab')2r Fv e Fv de cadeia simples (scFv, sc(Fv)2 e semelhantes), tendo uma ou mais especificidades, preparados pela ligação das Fv na cadeia H e cadeia L através de um ligante apropriado (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). Especificamente, um anticorpo é tratado com papaína ou pepsina para gerar fragmentos de anticorpo, ou é construído um gene codificando estes fragmentos de anticorpo e o gene é expresso em células hospedeiras apropriadas após a introdução do gene dentro de um vector de expressão (ver, por exemplo, Co, M. S. et al., T. Immunol. (1994) 152, 2968-2976;

Better, M. e Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. e Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol, (1986) 121, 652-663;

Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669;

Bird, R. E. e Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137.

Os anticorpos ligados a diversas moléculas, tal como polietilenoglicol (PEG), também podem ser utilizados como anticorpos modificados. 0 termo "anticorpo", utilizado na 12 presente invenção, também inclui estes anticorpos modificado. Estes anticorpos modificados podem ser obtidos pela modificação química de um anticorpo obtido. Os métodos para efectuar as modificações estão estabelecidos na técnica.

Exemplos do anticorpo contido na formulação de acordo com a presente invenção incluem mas não estão limitados a anticorpos anti-factor tecidular, anticorpos anti-receptor de IL-6, anticorpos anti-IL-6, anticorpos monoclonais de antigénio HM1.24, anticorpos anti-péptido relacionado com a hormona paratiróide (anticorpos anti-PTHrP), anticorpos anti-glipicano 3, anticorpos anti-gangliósido GM3, anticorpos anti-antagonista do receptor de TPO, anticorpos substituindo o factor VIII, anticorpos anti-CD3, anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-GPIIb/IIIa, anticorpos anti-TNF, anticorpos anti-CD25, anticorpos anti-EGFR, anticorpos anti-Her2/neu, anticorpos anti-RSV, anticorpos anti-CD33, anticorpos anti-CD52, anticorpos anti-IgE, anticorpos anti-CDlla, anticorpos anti-VEGF, anticorpos anti-VLA4, anticorpos anti-AXL e etc.

Exemplos preferidos dos anticorpos humanos remodelados utilizados na presente invenção incluem anticorpos anti-receptor de interleucina (IL-6) humanizados (hPM-1 ou MRA) (ver o documento WO 92-19759), anticorpos monoclonais anti-antigénio HM1.24 humanizados (ver documento WO 98-14580), anticorpos anti-péptido relacionado com a hormona paratiróide humanizados (anticorpos anti-PTHrP) (ver documento WO 98-13388), anticorpos anti-factor tecidular humanizados (ver documento WO 99-51743) e anticorpos IgGlx anti-glipicano 3 humanizados (ver documento PCT/JP05/013103) . Os anticorpos humanizados especialmente preferidos na presente invenção são anticorpos anti-receptor de IL-6 humanizados. 13

Como anticorpos IgM humanos, são preferidos os anticorpos IgM anti-gangliósido GM3 recombinante humano (ver documento WO 05-05636) e semelhantes.

Como anticorpos de baixo peso molecular, são preferidos os diacorpos anti-antagonistas do receptor de TPO (ver documento WO 02-33072), diacorpos anti-agonista de CD47 (ver documento WO 01-66737) e semelhantes.

Para avaliar a estabilidade em armazenamento da formulação liquida contendo anticorpo de elevada concentração, as presentes requerentes estudaram os efeitos de diversos aditivos pela condução de testes de aceleração de calor e testes de aceleração de luz. Como resultado, verificou-se que em soluções nas quais uma elevada concentração de anticorpo foi dissolvida numa solução tampão contendo o aminoácido arginina, a quantidade de dimero gerada foi mais pequena do que em soluções às quais não foi adicionada arginina. A partir destes resultados, verificou-se que a arginina é eficaz como um estabilizante para inibição da dimerização. Além disso, em soluções nas quais uma elevada concentração de anticorpo foi dissolvida numa solução tampão contendo arginina e metionina, o efeito inibidor contra a dimerização foi observado a uma concentração total de arginina e metionina que é inferior à concentração de arginina isoladamente necessária para se alcançar o mesmo efeito inibidor. A partir destes resultados, verificou-se que é obtido um efeito sinérgico pela adição de arginina e metionina em combinação. Além disso, verificou-se que a desamidação das moléculas de anticorpo é inibida pela adição de arginina. Estes resultados são exemplificados como resultados de teste obtidos para uma amostra 14 contendo um anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado, a uma concentração de 180 mg/mL.

Deste modo, pela adição de arginina como um estabilizante, pode ser proporcionada uma formulação de anticorpo estável, na qual a dimerização do anticorpo é reduzida e a desamidação do anticorpo é prevenida.

Além disso, como descrito acima, uma formulação líquida contendo anticorpo da presente invenção contém, ainda, metionina na solução, com um efeito sinérgico sendo obtido por utilização de arginina e metionina em combinação. Por conseguinte, um aspecto da presente invenção é caracterizado pela adição de arginina e metionina a uma solução, pelo que, em particular, a dimerização das moléculas de anticorpo, é inibida na formulação líquida contendo anticorpo resultante. Consequentemente, uma forma de realização, como uma formulação líquida contendo anticorpo, é caracterizada por conter um anticorpo, arginina e metionina numa solução tampão.

Como arginina utilizada na presente invenção, qualquer do composto de arginina per se, seus derivados e seus sais podem ser utilizados. São preferidos L-arginina e seus sais. Como metionina utilizada na presente invenção, qualquer do composto de metionina per se, seus derivados e seus sais podem ser utilizados. São preferidos L-metionina e seus sais.

Nos casos em que a formulação liquida contendo anticorpo de acordo com a presente invenção contém arginina e metionina, a concentração total de arginina e metionina é, de um modo preferido, 50 a 1200 mM; de um modo mais preferido, a concentração de arginina é 50 a 700 mM e a concentração de 15 metionina é 10 a 100 mM; e, de um modo ainda mais preferido, a concentração de arginina é 100 a 300 mM e a concentração de metionina é 10 a 50 mM. A solução tampão é preparada utilizando um agente de tamponização que é uma substância para a manutenção de um pH da solução. Numa formulação líquida contendo anticorpo de elevada concentração de acordo com a presente invenção, um pH da formulação é, de um modo preferido, 4 a 8, de um modo mais preferido 5, 0 a 7,5, de um modo ainda mais preferido 5,5 a 7,2 e, de um modo ainda mais preferido, 6,0 a 6,5. Um agente de tamponização que pode ser utilizado na presente invenção é um que possa ajustar o pH nesta gama e que seja farmaceuticamente aceitável. Esse agente de tamponização é conhecido pelos especialistas na técnica e os seus exemplos incluem sais inorgânicos, tais como sais de ácido fosfórico (sódio ou potássio) e hidrogenocarbonato de sódio; sais de ácido orgânico, tais como sais de ácido cítrico (sódio ou potássio), acetato de sódio e succinato de sódio; e ácidos, tais como ácido fosfórico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico e ácido glucónico. Além disso, também podem ser utilizados tampões de TRIS, tampões de Good, tais como MES, MOPS e HEPES, histidina (e. g. , sal de ácido clorídrico de histidina) e glicina. Na formulação líquida contendo anticorpo de elevada concentração de acordo com a presente invenção, o tampão é, de um modo preferido, um tampão de histidina ou tampão de glicina e um tampão de histidina é especialmente preferido. A concentração da solução tampão é, em geral, 1 a 500 mM, de um modo preferido, 5 a 100 mM, de um modo ainda mais preferido, 10 a 20 mM. Nos casos em que é utilizado um tampão de histidina, a solução tampão contém histidina a uma concentração de, de um modo preferido, 5 a 25 mM, de um modo mais preferido, 10 a 20 mM. 16

Para a formulação líquida contendo anticorpo de elevada concentração "estável" de acordo com presente invenção, não é observada alteração significativa quando é armazenada a uma temperatura de refrigeração (2 a 8 °C) durante, pelo menos, 12 meses, de um modo preferido durante 2 anos e, de um modo mais preferido, durante 3 anos; ou quando é armazenada à temperatura ambiente (22 a 28 °C) durante, pelo menos, 3 meses, de um modo preferido 6 meses e, de um modo mais preferido, 1 ano. Por exemplo, a soma da quantidade de dímeros e produtos de degradação na formulação, quando é armazenada a 5 °C, durante 2 anos, é 5, 0% ou inferior, de um modo preferido, 2% ou inferior e, de um modo mais preferido, 1,5% ou inferior; ou a soma da quantidade de dímeros e produtos de degradação na formulação, quando é armazenada a 25 °C, durante 6 meses é 5,0% ou inferior, de um modo preferido, 2% ou inferior e, de um modo mais preferido, 1,5% ou inferior. A formulação de acordo com a presente invenção pode ainda conter um tensioactivo.

Exemplos típicos do tensioactivo incluem tensioactivos não iónicos, por exemplo, ésteres de ácidos gordos de sorbitano, tais como monocaprilato de sorbitano, monolaurato de sorbitano e monopalmitato de sorbitano; ésteres de ácidos gordos de glicerina, tais como monocaprilato de glicerol, monomiristato de glicerol e monoestearato de glicerol; ésteres de ácidos gordos de poliglicerol, tais como monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo e monolinoleato de decaglicerilo; ésteres de ácidos gordos de polioxietileno e sorbitano, tais como monolaurato de polioxietileno e sorbitano, monooleato de polioxietileno e sorbitano, monoestearato de polioxietileno e 17 sorbitano, monopalmitato de polioxietileno e sorbitano, trioleato de polioxietileno e sorbitano e triestearato de polioxietileno e sorbitano; ésteres de ácidos gordos de polioxietileno e sorbitol, tais como tetraestearato de polioxietileno e sorbitol e tetraoleato de polioxietileno e sorbitol; ésteres de ácidos gordos de polioxietileno e glicerina, tal como monoestearato de polioxietileno e glicerilo; ésteres de ácidos gordos de polietilenoglicol, tal como diestearato de polietilenoglicol; éteres alquílicos de polioxietileno, tal como éter laurilico de polioxietileno; éteres alquilicos de polioxietileno e polioxipropileno, tais como éter de polioxietileno e polioxipropilenoglicol, éter propilico de polioxietileno e poloxipropileno e éter cetilico de polioxietileno polioxipropileno; éteres alquilfenilicos de polioxietileno, tal como éter nonilfenilico de polioxietileno; óleos de rícino endurecidos de polioxietileno, tais como óleo de rícino de polioxietileno e óleo de rícino endurecido de polioxietileno (óleo de rícino de polioxietileno hidrogenado); derivados de polioxietileno de cera de abelhas, tal como polioxietileno e sorbitol de cera de abelhas; derivados de polioxietileno de lanolina, tal como polioxietileno de lanolina; tensioactivos tendo um HLB de 6 a 18, tal como amidas de ácidos gordos de polioxietileno, por exemplo, octadecanamida de polioxietileno; tensioactivos aniónicos, por exemplo, sais de sulfato de alquilo tendo um grupo alquilo (Cio-Cis) , tal como cetilssulfato de sódio, laurilssulfato de sódio e oleilssulfato de sódio; sais de sulfato de éter alquílico de polioxietileno, nos quais o número médio de moles das unidades de óxido de etileno adicionadas é 2 a 4 e o número de átomos de carbono do grupo alquilo é 10 a 18, tal como laurilssulf ato de sódio de polioxietileno; sais de alquilssulfosuccinato tendo um grupo alquilo(C8-C18), tal como laurilssulfosuccinato de sódio; 18 tensioactivos naturais, tais como lecitina e glicerofosfolípidos; esfingofosfolipidos, tal como esfingomielina; e ésteres de sacarose de ácidos gordos C12-C18. Estes tensioactivos podem ser adicionados à formulação da presente invenção individualmente, ou dois ou mais destes tensioactivos podem ser adicionados em combinação. São tensioactivos preferidos os ésteres de ácidos gordos de polioxietileno e sorbitano e éteres alquílicos de polioxietileno polioxipropileno e são especialmente preferidos os polissorbatos 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 e 85 e tensioactivos de tipo Pluronic e são muito preferidos os polissorbatos 20 e 80 e Pluronic F-68 (Poloxâmero 188). A quantidade do(s) tensioactivo(s) a ser adicionada à formulação de anticorpo de acordo com a presente invenção é, em geral, 0,0001 a 10% (p/v), de um modo preferido, 0,001 a 5%, de um modo mais preferido 0,005 a 3%.

Noutro aspecto da presente invenção, a formulação de acordo com a presente invenção é, de um modo preferido, substancialmente composta pelos seguintes componentes: A) anticorpo anti-receptor de IL-6; B) arginina e metionina e outro(s) aminoácido(s) adicional(is) (e. g., triptofano) como componente(s) opcional(is) adicional(is); C) agente(s) de tamponização; e D) tensioactivo(s). O termo "substancialmente composto por" significa, aqui, que um componente diferente dos componentes habitualmente 19 adicionados a formulações não está contido, os componentes habitualmente adicionados a formulações sendo os componentes aditivos opcionais descritos abaixo, tais como agentes de suspensão, agentes solubilizantes, agentes isotónicos, conservantes, inibidores de adsorção, diluentes, veículos, ajustadores de pH, agentes balsâmicos, agentes de redução contendo enxofre e antioxidantes. 0 descrito acima "B) arginina e metionina e outro(s) aminoácido(s) adicional(is) (e. g., triptofano) como componente(s) opcional(is) adicional(is)" tenciona incluir os casos em que a formulação contém arginina e metionina e ainda inclui os casos em que a formulação contém, ainda, outro(s) aminoácido(s). 0 exemplo preferido do(s) outro(s) aminoácido(s) é triptofano. Como triptofano, qualquer do composto de triptofano per se, seus derivados e seus sais podem ser utilizados. São preferidos L-triptofano e seus sais.

Como requerido, um agente de suspensão, agente solubilizante, agente isotónico, conservante, inibidor de adsorção, diluente, veículo, ajustador de pH, agente balsâmico, agente redutor contendo enxofre, antioxidante e semelhantes podem ser adicionados à formulação de acordo com a presente invenção.

Exemplos do agente de suspensão incluem metilcelulose, polissorbato 80, hidroxietilcelulose, goma-arábica, tragacanto em pó, carboximetilcelulose de sódio e monolaurato de polioxietileno e sorbitano.

Exemplos do agente solubilizante incluem, óleo de rícino de polioxietileno hidrogenado, polissorbato 80, nicotinamida, 20 monolaurato de polioxietileno e sorbitano, macrogol e éster etílico de ácido gordo de óleo de rícino.

Exemplos do agente isotónico incluem cloreto de sódio, cloreto de potássio e cloreto de cálcio.

Exemplos do conservante incluem p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de etilo, ácido sórbico, fenol, cresol e clorocresol.

Exemplos do inibidor de adsorção incluem albumina sérica humana, lecitina, dextrano, copolímero de óxido de etileno-óxido de propileno, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, óleo de rícino de polioxietileno hidrogenado e polietilenoglicol.

Exemplos do agente redutor contendo enxofre incluem os compostos tendo grupo(s) sulfidrilo, tais como N-acetilcisteína, N-acetil-homocisteína, ácido tióctico, tiodiglicol, tioetanolamina, tioglicerol, tiossorbitol, ácido tioglicólico e seus sais, tiossulfato de sódio, glutationo e tioalcanos(C1-C7) .

Exemplos do antioxidante incluem ácido eritórbico, dibutil-hidroxitolueno, hidroxianisole butilado, a-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido L-ascórbico e seus sais, palmitato de L-ascorbilo, estearato de L-ascorbilo, hidrogenossulfito de sódio, sulfito de sódio, gaiato de triamilo, gaiato de propilo e agentes quelantes, tais como etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA), pirofosfato de sódio e metafosfato de sódio. A formulação liquida contendo anticorpo de acordo com a presente invenção é habitualmente administrada através de uma via parentérica, por exemplo, por injecção (subcutânea, 21 intravenosa, injecções intramusculares ou semelhantes), administração percutânea, transmucosal, transnasal ou pulmonar, mas também pode ser administrada oralmente. Na injecção subcutânea, a dose de anticorpo por administração é grande (cerca de 100 a 200 mg) , enquanto a quantidade da solução de injecção é limitada, de modo que a formulação de acordo com a presente invenção é especialmente adequada para injecção subcutânea. A razão de pressão osmótica da formulação liquida contendo anticorpo de acordo com a presente invenção é, de um modo preferido, cerca de 0,5 a 4, de um modo mais preferido cerca de 0,7 a 2 e, de um modo ainda mais preferido, cerca de 1. A viscosidade da formulação liquida contendo anticorpo de acordo com a presente invenção é, de um modo preferido, cerca de 2 a 15 mPa*s, de um modo mais preferido, cerca de 4 a 10 mPa·s. Deve notar-se que a viscosidade aqui descrita é medida por um método de viscómetro de rotação utilizando um viscómetro de tipo cone-placa, de acordo com 2.53 Viscosity Determination/General Tests, a Farmacopeia Japonesa, 15a edição.

Como pode ser verificado a partir dos resultados dos exemplos descritos abaixo, pode ser obtida uma formulação liquida estável, na qual a dimerização e desamidação do anticorpo durante o armazenamento a longo prazo são pequenas, pela adição à formulação de arginina isoladamente, ou arginina e metionina ou metionina isoladamente.

Como ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para a inibição da dimerização do anticorpo em formulações liquidas contendo anticorpo, 22 compreendendo o método a adição de arginina e metionina à formulação.

Nos dois métodos descritos acima, o anticorpo é, de um modo preferido, um anticorpo anti-receptor de IL-6, que é um anticorpo humanizado ou anticorpo humano. A presente invenção será, agora, descrita em maior detalhe por meio dos exemplos dados abaixo. Contudo, o âmbito da presente invenção não está a eles restringido.

[Exemplos]

Amostra de Anticorpo 0 anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado foi o anticorpo humanizado, preparado de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 no documento JP 8-99902 A, utilizando o promotor do factor Ia de elongamento humano descrito no Exemplo 10 no documento WO 92/19759. Este anticorpo será, ocasionalmente, referido como " MRA" nas tabelas nos Exemplos. EXEMPLO 1

Efeitos Estabilizantes por Combinação de Arginina Metionina

As formulações liquidas contendo anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado foram avaliadas para uma influência na 23 estabilizaçao das formulações, obtidas por utilização de uma combinação de arginina e metionina.

Neste estudo, para avaliar os efeitos pela combinação de arginina e metionina, foram preparadas amostras de avaliação, numeradas AI a A9. As prescrições para as amostras de avaliação foram como se segue: [Tabela 1-1] [Prescrições]

Amostra N° Anticorpo mg/mL Arg mM Met mM Polissorbato 80 mg/mL Tampão de histidina mM PH AI 180 - - 0,5 20 6, 0 A2 180 50 - 0,5 20 6, 0 A3 180 100 - 0,5 20 6, 0 A4 180 150 - 0,5 20 6, 0 A5 180 200 - 0,5 20 6, 0 A6 180 300 - 0,5 20 6, 0 A7 180 100 10 0,5 20 6, 0 A8 180 100 30 0,5 20 6, 0 A9 190 100 50 0,5 20 6, 0

As amostras AI a A6 sao exemplos comparativos.

Para avaliar a estabilidade das formulações liquidas, cada amostra foi submetida a um teste de aceleração de calor (armazenada a 40 °C, durante 3 meses e a 25 °C, durante 6 meses, 24 respectivamente). A pureza do anticorpo antes e após o teste de aceleração de calor foi avaliada por cromatografia de permeação em gel (SEC). As condições analíticas foram como se segue.

[Cromatografia de Permeação em Gel] A amostra foi utilizada como a solução a ser medida tal como estava.

Um microlitro da solução a ser medida foi submetido a cromatografia líquida e as áreas de pico dos picos do dímero, monómero e produtos de degradação de baixo peso molecular (LMW) foram medidas por um método analítico automático e as suas quantidades (%) foram determinadas.

[Tabela 1-2]

Condições Analíticas

Coluna: TSKgel G3000SWxl7,8 mm I. D. x 30 cm (TOSOH)

Fase Móvel: tampão de fosfatos, pH 7,0 (tampão de fosfatos a 50 mmol/L, pH 7,0, contendo 300 mmol/L de cloreto de sódio e azida de sódio a 0,05%)

Quantidade de Amostra Injectada: cerca de 180 pg, em termos de anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado Caudal: 1 mL/min

Comprimento de Onda de Detecção: 280 nm 25 [Fórmula 1]

Equação de Cálculo Área Total de Todos os Picos = Área de Pico de Monómero + Área de Pico de Dimero + Área de Pico de Produtos de Degradação de Baixo Peso Molecular (LMW)

Quantidade de Dimero (%) = (Área de Pico de Dímero/Área

Total de Todos os Picos) x 100

Quantidade de Produtos de Degradação de Baixo Peso Molecular (LMW) (%) = Área de Pico de Produtos de Degradação de Baixo Peso Molecular/Área Total de Todos os Picos) x 100

Uma cromatografia típica é mostrada na Fig. 1.

Os resultados de avaliaçao obtidos pela cromatografia de permeaçao em gel (SEC) são mostrados na Tabela 1 e Fig. 2 e 3 . Como mostrado, a quantidade de dimero nas amostras (Amostras N° A2 a A6) às quais foi adicionada arginina, após a aceleração a 40 °C, durante 3 meses, e a 25 °C, durante 6 meses, respectivamente, foi mais pequena do que aquela na amostra (Amostra N° Al) à qual não foi adicionada arginina; e, consequentemente, o efeito inibidor de arginina contra a dimerização foi confirmado. Também foi confirmado que a quantidade de dimero foi reduzida proporcionalmente à quantidade da arginina adicionada. Por outro lado, a quantidade de dimero nas amostras (Amostra N° A7 a A9) às quais foram adicionadas arginina (100 mM) e metionina, após a aceleração a 40 °C, durante 3 meses e a 25 °C, durante 6 meses, respectivamente, foi mais pequena do 26 que aquela nas amostras (Amostra N° A3 e A4) contendo 150 mM de arginina, cuja concentração foi sensivelmente a mesma que a concentração total dos estabilizantes; e a quantidade de dimero foi sensivelmente a mesma que na amostra (Amostra N° A6) tendo uma concentração de arginina de 300 mM. Considera-se que estes resultados indicam que é obtido um efeito sinérgico na inibição da dimerização, pela combinação de arginina e metionina. A influência de arginina e metionina na quantidade de produtos de degradação de baixo peso molecular não foi observada.

[Tabela 1-3]

Tabela 1 40 °C - 3 meses 25 °C - 6 meses Dimero (%) LMW (%) Dimero (%) LMW (%) AI 2, 70 1,25 1,88 0,48 42 2,19 1,24 1, 41 0,47 A3 2,00 1,34 1,33 0,49 A4 1,85 1,38 1, 19 0,49 A5 1,62 1,37 1,09 0,49 Αβ 1,53 1,46 0,99 0,50 A7 1,58 1,29 1, 11 0,45 A8 1,52 1,21 1,07 0,47 A9 1,48 1,32 1,03 0,47 27 EXEMPLO 2 (nao de acordo com a invenção)

Efeito Inibidor por Arginina Contra Desamidaçao

As formulações liquidas contendo anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado foram avaliadas para influência na desamidaçao por arginina.

Neste estudo, foram preparadas amostras de avaliação, numeradas AIO a A15 e numeradas A16 a A18, contendo diferentes quantidades de arginina e metionina, respectivamente. As prescrições para as amostras de avaliação foram como se segue: [Tabela 2-1] [Prescrições]

Amostra N° Anticorpo mg/mL Arg mM Met mM Polissorbato 80 mg/mL Tampão de histidina mM PH AIO 180 - - 0,5 20 6,0 AI 1 180 50 - 0,5 20 6,0 A12 180 100 - 0,5 20 6,0 A13 180 150 - 0,5 20 6,0 A14 180 200 - 0,5 20 6,0 AI 5 180 300 - 0,5 20 6,0 AI 6 180 - 10 0,5 20 6,0 AI 7 180 - 30 0,5 20 6,0 AI 8 180 - 50 0,5 20 6,0 28

Para avaliar a estabilidade das formulações liquidas, cada amostra foi submetida a um teste de aceleração de calor (armazenada a 40 °C, durante 3 meses e a 25 °C, durante 6 meses, respectivamente) . As purezas do anticorpo, antes e após o teste de aceleração de calor, foram avaliadas por cromatografia de permuta iónica (IEC). As condições analíticas foram como se segue.

[Cromatografia de Permuta Iónica] A cada amostra, foi adicionada água purificada, para ajustar a quantidade do anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado para cerca de 1 mg em 1 mL da amostra, e a amostra resultante foi utilizada como a amostra a ser medida.

Trinta microlitros da solução de amostra foram submetidos a cromatograf ia líquida e as áreas de pico dos picos de MRA Pre, MRA Main, MRA Sub-1, MRA Sub-2, MRA R-l, 1Q(H)-MRA, 2Q(H)-MRA e outras substâncias relacionadas (Outras) foram medidas por um método analítico automático e as suas quantidades (%) foram determinadas por um método de percentagem de área. MRA Pre indica o total dos picos das substâncias, cada eluída após um tempo de retenção mais curto do que o do componente principal, e foi incluída uma pluralidade de produtos de degradação, principalmente produtos de desamidação, de anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado. Quando a quantidade de produção deste pico de Pre for pequena, a inibição da desamidação do anticorpo está indicada. 29 [Tabela 2-2]

Condições Analíticas

Coluna: ProPac WCX-10 4 x 250 mm (DIONEX)

Fase Móvel: Solução A : solução tampão de MES a 25 mmol/L, i—1 Fase Móvel: Solução B : solução tampão de MES a 25 mmol/L, pH 6,1 (contendo 250 mmol/L de cloreto de sódio) Quantidade de Amostra Injectada: : cerca de 30 pg, em . termos de anticorpo anti-receptor de IL -6 humanizado Caudal: 0,5 mL/min Comprimento de Onda de Detecção: 280 nm [Fórmula 2]

Equação de Cálculo Área Total de Todos os Picos = Total Geral da Área Total de Picos de MRA Pre + Área de Pico de MRA Main + Área de Pico de MRA Sub-1 + Área de Pico de MRA Sub-2 + Área de Pico de MRA Sub-3 + Área de Pico de MRA R-l + Área Total de Picos de 1Q (H) -MRA + Área Total de Picos de 2Q(H)-MRA + Área de Pico de Outros

Quantidade de MRA Pre (%) = Área Total de Picos de MRA

Pre/Área Total de Todos os Picos) x 100

Uma cromatograf ia típica é mostrada na Fig. 4. MRA Pre indica o total dos picos das substâncias que surge mais cedo do que as do componente principal. 30

Os resultados de avaliação da cromatografia de permuta iónica são mostrados na Tabela 2 e Fig. 5 e 6. Como mostrado, a quantidade de picos de Pre nas amostras (Amostra N° All a A15) às quais foi adicionada arginina, após a aceleração a 40 °C, durante 3 meses e a 25 °C, durante 6 meses, respectivamente, foi mais pequena do que aquela na amostra (Amostra N° AIO) à qual não foi adicionada arginina; e, consequentemente, o efeito inibidor de arginina contra a geração de picos de Pre foi confirmado. Também foi confirmado que a quantidade de picos de Pre foi reduzida proporcionalmente a uma quantidade de arginina adicionada. Por outro lado, a quantidade de picos de Pre nas amostras (Amostra N° A16 a A18) às quais foi adicionada metionina, após a aceleração a 40 °C, durante 3 meses e a 25 °C, durante 6 meses, respectivamente, foi semelhante à amostra (Amostra N° AIO) à qual não foi adicionada arginina; e, consequentemente, a influência da adição de metionina não foi observada.

[Tabela 2-3]

Tabela 2

Pico de Pre (%) 40 °C -3 meses 25 °C - 6 meses AIO 56,2 32,3 All 51,3 30,3 AI 2 50, 7 29,3 A13 49, 0 28, 7 AI 4 47, 8 28,5 AI 5 47, 0 27, 9 31 (continuação)

Pico de Pre (%) AI 6 55, 7 31,2 AI 7 55, 0 31,2 AI 8 55,3 31,4 EXEMPLO 3

Efeitos Estabilizantes por Combinação de Arginina e Metionina (2)

Como no Exemplo 1, as formulações liquidas contendo anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado foram avaliadas para influência na estabilização das formulações, obtidas por utilização de uma combinação de arginina e metionina.

Neste estudo, para avaliar os efeitos da combinação de arginina e metionina, foram preparadas amostras de avaliação, numeradas A19 a A27. As prescrições para as amostras de avaliação foram como se segue: 32 [Tabela 3-1] [Prescrições]

Amostra N° Anticorpo mg/mL Arg mM Met mM Polissorbato 80 mg/mL Tampão de histidina mM PH AI 9 180 - - 0,5 20 6, 0 A2 0 180 50 - 0,5 20 6, 0 A21 180 100 - 0,5 20 6,0 A22 180 150 - 0,5 20 6,0 A23 180 200 - LO O 20 6, 0 A2 4 180 300 - 0,5 20 6, 0 A25 180 100 10 0,5 20 6,0 A26 180 100 30 0,5 20 6,0 A2 7 180 100 50 0,5 20 6,0

As amostras A19 a A24 sao exemplos comparativos.

Para avaliar a estabilidade das formulações liquidas, cada amostra foi submetida a um teste de aceleração de luz (iluminância total 1200000 lux e energia de radiação ultravioleta próximo total: 200 W-h/m2) . As purezas do anticorpo, antes e após o teste de aceleração de luz, foram avaliadas por cromatografia de permeação em gel (SEC) e cromatografia de permuta iónica (IEC), como nos Exemplos 1 e 2.

Os resultados de avaliação pela cromatografia de permeação em gel (SEC) são mostrados na Tabela 3 e Fig 7. Como mostrado, a quantidade de dimero nas amostras (Amostra N° A20 a A24) às 33 quais foi adicionada arginina, após o teste de aceleração de luz, foi mais pequena do que aquela na amostra (Amostra N° A19) à qual não foi adicionada arginina; e, consequentemente, o efeito inibidor de arginina contra a dimerização foi confirmado. Também foi confirmado que a quantidade de dímero foi reduzida proporcionalmente a uma quantidade da arginina adicionada. Por outro lado, a quantidade de dímero nas amostras (Amostra N° A25 a A27) às quais foram adicionadas arginina (100 mM) e metionina, após o teste de aceleração de luz, foi mais pequena do que aquela nas amostras (Amostra N° A22) contendo 150 mM de arginina, cuja concentração foi sensivelmente a mesma que a concentração total dos estabilizantes; e a quantidade de dímero foi mais pequena do que nas amostras (Amostra N° A23 e A24) tendo concentrações de arginina de 200 mM e 300 mM, respectivamente. Pensa-se que estes resultados indicam que é obtido um efeito sinérgico na inibição da dimerização, pela combinação de arginina e metionina. A influência de arginina e metionina na quantidade de produtos de degradação de baixo peso molecular não foi observada. 34 [Tabela 3-2]

Tabela 3 1200000 lux + 200 W -h/m2 Dimero (%) LMW (%) AI 9 6, 95 0,22 A2 0 6, 75 0,24 A21 5, 78 0,21 A22 5, 08 0, 19 A23 4, 73 0, 18 A24 4, 13 0, 18 A25 5,27 0, 19 A2 6 4,05 0, 17 A2 7 3,84 0, 16

Em seguida, os resultados de avaliaçao pela cromatografia de permuta iónica (IEC) são mostrados na Tabela 4 e Fig 8.

Como mostrado, a quantidade de pico de Pre nas amostras (Amostra N° A20 a A24) às quais foi adicionada arginina, após o teste de aceleração de luz, foi mais pequena do que aquela na amostra (Amostra N° A19) à qual não foi adicionada arginina; e, consequentemente, o efeito inibidor de arginina contra a formação de picos de Pre foi confirmado. Além disso, foi confirmado que à medida que a quantidade de arginina aumenta, a quantidade de produção de pico de Pre diminui proporcionalmente. Por outro lado, a quantidade de dimero após o teste de aceleração de luz nas amostras (Amostra N° A25 a A27) , às quais a metionina foi ainda adicionada à arginina (100 mM) , foi mais pequena do que aquela na amostra (Amostra N° A22) contendo 35 150 mM de arginina, cuja concentração foi sensivelmente a mesma que a concentração total dos estabilizantes; e foi mais pequena do que nas amostras (Amostra N° A23 e A24) tendo concentrações de arginina de 200 mM e 300 mM, respectivamente. Pensa-se que estes resultados indicam um efeito sinérgico na inibição da formação do pico de Pre pela combinação de arginina e metionina.

[Tabela 4]

Pico de Pre (%) 1200000 lux + 200 W-h/m2 A19 39,2 A2 0 38,6 A21 36, 7 A22 35, 7 A23 34, 9 A2 4 34, 9 A25 36, 8 A26 35, 0 A2 7 33,8

Lisboa, 12 de Novembro de 2012 36

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Formulação líquida contendo anticorpo estável, compreendendo arginina a 40 a 1000 mM e metionina a 10 a 200 mM.
2. Formulação da reivindicação 1 compreendendo, ainda, um agente de tamponização de histidina.
3. Formulação da reivindicação 2 compreendendo, ainda, um tensioactivo.
4 . Formulação de acordo com a reivindicação 3, contendo o anticorpo numa quantidade de, pelo menos, 50 mg/mL.
5. Formulação de acordo com a reivindicação 3, contendo o anticorpo numa quantidade de, pelo menos, 100 mg/mL.
6. Formulação de acordo com a reivindicação 3, contendo o anticorpo numa quantidade de, pelo menos, 120 mg/mL.
7 . Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o anticorpo é um anticorpo anti-receptor de H f 1
8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, tendo o pH na gama de 4 : a 8.
9. Formulação de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou anticorpo humano. 1
10. Formulação de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo é um anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado, a quantidade de tensioactivo é 0,0001 a 10% (p/v), a concentração da solução tampão de histidina é 1 a 500 mM e a concentração do anticorpo é 50 a 300 mg/mL.
11. Formulação de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo é o anticorpo MRA anti-receptor de IL-6 humanizado, a concentração de arginina é 50 a 700 mM, a concentração de metionina é 10 a 100 mM, a quantidade de polissorbato 80, como o tensioactivo, é 0,005 a 3% (p/v), a concentração da solução tampão de histidina é 5 a 100 mM e a concentração do anticorpo é 100 a 300 mg/mL.
12. Formulação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, compreendendo, ainda, triptofano.
13. Formulação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, tendo uma viscosidade de 2 a 15 mPa·s.
14. Formulação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, que é estável a 22-28 °C durante, pelo menos, 6 meses.
15. Formulação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que a dimerização das moléculas de anticorpo é inibida.
16. Formulação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que a desamidação das moléculas de anticorpo é inibida.
17. Formulação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, que é para administração subcutânea. 2
18. Formulação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, que não foi submetida a liofilização durante a preparação da formulação.
19. Método para a inibição da dimerização de moléculas de um anticorpo numa formulação líquida contendo o anticorpo, compreendendo a adição de arginina e metionina à formulação líquida.
20. Método da reivindicação 19, em que o anticorpo é um anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado e a formulação compreende 50 a 300 mg/mL do anticorpo, 1 a 500 mM de um agente de tamponização de histidina e 0,0001 a 10% (p/v) de um tensioactivo, e tem um pH de 4 a 8, e em que a arginina é adicionada à formulação na quantidade de 40 a 1000 mM e a metionina na quantidade de 10 a 200 mM.
21. Método da reivindicação 19, em que o anticorpo é o anticorpo MRA anti-receptor de IL-6 humanizado e a formulação compreende 100 a 300 mg/mL do anticorpo, 5 a 100 mM de um agente de tamponização de histidina e 0,005 a 3% (p/v) de polissorbato 80, e tem um pH de 4 a 8, e em que a arginina é adicionada à formulação na quantidade de 50 a 700 mM e a metionina na quantidade de 10 a 100 mM. Lisboa, 12 de Novemebro de 2012 3