NO323775B1

NO323775B1 - Purininhibitorer av cyklinavhengig kinase 2 og IkB-alfa

Info

Publication number: NO323775B1
Application number: NO19990466A
Authority: NO
Inventors: Robert T Lum; Cheri Lynn Blum; Richard Mackman; Steven R Schow; Michael M Wick
Original assignee: Cv Therapeutics Inc
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1999-02-01
Publication date: 2007-07-02
Also published as: CA2262454C; US5866702A; AU3900097A; NO990466D0; ATE298572T1; TR199900683T2; DE69733674D1; PT1021186E; CZ33899A3; BR9710801A; EP1021186A1; WO1998005335A1; EP1021186A4; EP1021186B1; CZ299381B6; HUP9902414A2; NO990466L; RU2220968C2; CA2262454A1; ES2242981T3

Description

Denne oppfinnelsen angår 2,6,9-trisubstituerte puriner som har vist seg å være selektive inhibitorer for cellecykluskinaser og som sådan er forbindelsene inhibitorer for celleproliferasjon. De 2,6,9-trisubstituerte purinene er anvendelige ved f.eks. autoimmune sykdommer som f.eks. rheumatoid arthritis, lupus, type I diabetes, multippel sklerose etc, for behandling av kreft, kardiovaskulær sykdom, slik som restenose, vert versus graft sykdom, gikt, polycystisk nyresykdom og andre proliferative sykdommer hvis patogenese involverer abnormal celleproliferasjon.

Denne oppfinnelsen angår også 2,6,9-trisubstituerte puriner som har vist seg å være potente og spesifikke inhibitorer av IkB-<g>c, kinase som hindrer signalindusert NF-kB aktivering og cytokinsyntese in vitro og in vivo. Slike inhibitorer forventes å inhibere syntesen av cytokiner og adhesjonsproteiner hvis synteser blir transkripsjonen regulert av NF-kB. Proinflammatoriske cytokiner slike som IL-1, IL-6, TNF og adhesjonsproteiner (f.eks. ICAM, VCAM og seleksjoner) tilhører denne klassen av molekyler og har blitt implisert ved patogenese av inflammatoriske sykdommer. En slik potent inhibitor av MB-a kinase er anvendelig i den kliniske behandlingen av sykdommer hvor NF-kB aktivering er nødvendig for sykdomsinduksjon.

I de siste årene har fremskritt i molekylær og cellulær biologi bidratt til forståelsen av mekanismene for celleproliferasjon og av spesielle hendelser som skjer i løpet av progresjon av celler gjennom mitose. F.eks. "Progress in Cell Cycle Research", vol. 1, utg. L. Meijer, S.Guidet og H.Y.L. Tung; Plenum Press, New York, 1995. Disse studier har vist at progresjon gjennom cellecyklusen blir kontrollert av en familie av serin/threoninkinaser som kalles cyklinavhengige kinaser. Disse enzymene inneholder (a) et katalytisk protein kalt cyklinavhengig kinase (CDK) som anvender ATP som et substrat og (b) et reguleringsprotein som kalles cyklin. Forskjellige cyklin-CDK-kombinasjoner kontrollerer hendelser slik som vekst, DNA-replikasjon og celledeling. Et nøkkelmedlem av CDK-familien av enzymer er CDK2.CDK2-aktivitet har vist seg å være essentiell for cellecyklisk progresjon hos pattedyr ved Gl/S-grensen. Mikroinjeksjon av antistoffer direkte mot CDK2 blokkerer progresjonen av menneskelig diploidfibroblaster inn i S-fasen av cellecyklusen. Fremstilling av en CDK2-dominant negativ mutant hos menneskelig osteosarkoma-celler har en lignende effekt. Sammen indikerer disse studiene at inhibering av cellulær CDK2-aktivitet vil hemme progresjonen av celler gjennom mitosecyklusen og induserer vekststans før S-fasen. I overensstemmelse med dette synet har in vivo-studier med olomoucin (2-(hydroksyetylamino)-6-benzylamino-9-metylpurin) vist at det er en spesifikk inhibitor av CDK2 med en IC50 på ca. 2,1 ug/ml, J. Vesely et al., Eur. J. Biochem. 224,771-786

(1994), L. Meijer "Chemical Inhibitors of Cyclin-Dependent Kinases", s. 351-356 i "Progress in Cell Cycle Research" vol. 1, utg. L. Meijer, S. Guidet og H.Y.L. Tung, Plenum Press, New York, 1995. In vivo-studier som anvender pattedyrceller i kulturer har vist at olomoucin inhiberer celleproliferasjon ved en konsentrasjon på ca. 50 ug/ml.

Eur. J. Biochem. (1994) vol. 224,771, omhandler purinforbindelser som kan være inhibitorer for cyklinavhengige kinaseproteiner. US 5508277 beskriver bicykliske pyrimidinforbindelser som kan benyttes ved kreftbehandling. US 5498819 omhandler purinderivater som kan brukes som inhibitorer for fosfodiesteraser og kan også benyttes ved kreftbehandling. WO 9720842 Al omhandler biologisk aktive 2,6,9-substituerte purinderivater som blant annet kan benyttes mot sopp. Ingen av disse angitte publikasjonene er imidlertid foregripende i forhold til det som foreliggende søknad beskriver.

I denne oppfinnelsen har vi utviklet flere forbindelser hvis biologiske aktivitet er betydelig mer potent enn olomoucin. In vivo-studier som anvender pattedyrceller indikerer at noen av de fremlagte forbindelsene inhiberer celleproliferasjon ved konsentrasjoner som er signifikant lavere enn olomoucin.

Nylig ble en IkB-oc kinaseaktivitet beskrevet i cytoplasmaet på stimulerte menneskelige umbilikalvene endotelialceller (Bennett et al. (1996) J. Biol. Chem 271,196080-19688). Noen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen har blitt identifisert som potente og spesifikke inhibitorer av hcB-a kinase som hemmer signalindusert NF-icB-aktivering og cytokinsyntese in vitro og in vivo. Aktiveringen av den heterodimere transkripsjonsfaktor NF-kB er en sammensatt prosess. Hos ikke-stimulerte celler er NF-kB (p50/p65) heterodimeren plassert i cytosolen hvor den er kompleksert med en hemmende underenhet LcB-a, IkB-cc, bånd til NF-kB og således maskere dets nukleære lokaliseirngssignal og hemme translasjonen til kjernen. Ved stimulering av celler med et stort antall signaler (f.eks. lipopolysakkarid) blir IkB-cc raskt fosforylert, uniquitinert og degradert ved proteasomet. Degradering av IicB-a tillater translokeringen av NF-kB til

kjernen hvor den aktiverer transkripsjon av et antall inflammasjonsresponsgener.

Disse observasjoner antyder at IkB-oc kinase er en attraktivt mål for identifikasjonen av inhibitorer som kan anvendes ved behandlingen av inflammasjonssykdommer hvor NF-kB aktivering er nødvendig for sykdomsinduksjon.

I en utførelsesform angår denne oppfinnelsen en forbindelse kjennetegnet ved den generelle formelen

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvori

Ri er halogen,

R2 er C2 til Cio alkyl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, halogen og-C(0)R;

R og R' representerer uavhengig hydrogen, eller

lavere alkyl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, -O-alkyl, halogen, amino, mono- eller dialkylamino, merkapto, alkyltriol, -C(0)NH-alkyl, C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, cyano, aryloksy, alkenyl, alkynyl, -C(0)alkyl, eller

aryl eller heteroaryl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra lavere alkyl, alkoksy, halogen, merkapto, alkyltio, acetylen, amino, mono- eller dialkylamino,

-C(0)NH-alkyl, -C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, -C(0)alkyl, hydroksy, aryl, aryloksy, heteroaryl, nitro eller cyano, og

R3 er halogen, -NR4R5 eller en bestanddel som har den generelle formelen:

hvori

m, n og o uavhengig representerer 1,2 eller 3;

Y er -NR4R5, hydroksy, merkapto, -OR, alkyltiol, og

R4, RV, R4", R4"', R3, R5" og R5"' er hver uavhengig hydrogen, hydroksy, lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, NRR' eller aryl, heteroaryl eller arylalkyl; eller

Y og R4' sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller

R4" og Rs" sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller

RV" og Rs"' sammen kan være et enkelt oksygenatom.

I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen en forbindelse kjennetegnet ved at den har den generelle formelen

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvori:

Ri er-NHRi';

R]> er quinolin-S-yl eller quinolin-6-yl; eller

Ri' er benzyl, hvor ringdelen er subsituert med en, to eller tre grupper valgt fra halogen,

-OR, tienyl, nitro, pyridyl, piperonyl, eller

fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, merkapto, alkyltio, nitro eller cyano; eller Ri * er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra brom, jod, -OR", tienyl, pyridyl, piperonyl, eller

fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, merkapto, alkyltio, nitro eller cyano;

R2 er C2 til Cio alkyl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valg fra hydroksy, halogen og - C( 0) K;

R og R' representerer uavhengig hydrogen, eller

lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, -O-alkyl, halogen, amino, mono- eller dialkylamino, merkapto, alkyltio, -C(0)NH-alkyl,

-C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, cyano, aryloksy, alkenyl, alkynyl, -C(0)alkyl, eller

aryl eller heteroaryl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra lavere alkyl, alkoksy, halogen, merkapto, alkyltio, acetylen, amino, mono- eller dialkylamino, -C(0)NH-alkyl, -C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, -C(0)alkyl, hydroksy, aryl, aryloksy, heteroaryl, nitro eller cyano,

R" representerer hydrogen, eller

C2 til Cio alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, -O-alkyl, halogen, amino, mono- eller dialkylamino, merkapto, alkyltriol, -C(0)NH-alkyl, C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, cyano, aryloksy, alkenyl, alkynyl, -C(0)alkyl, eller aryl eller heteroaryl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra lavere alkyl, alkoksy, halogen, merkapto, alkyltio, acetylen, amino, mono- eller dialkylamino, -C(0)NH-alkyl, -C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, -C(0)alkyl, hydroksy, aryl, aryloksy, heteroaryl, nitro eller cyano;

R3 er halogen, -NR4R5 eller en bestanddel som har den generelle formelen:

hvori

m, n og o uavhengig representerer 1,2 eller 3;

Y er -NR4R3, hydroksy, merkapto, -OR, alkyltiol, og

R4, R*<*>, RV*, RV", Rs, R5" og R5"<*> uavhengig er hydrogen, hydroksy, lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, NRR' eller aryl, heteroaryl eller arylalkyl; eller

Y og Rt' sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller

R4" og Rs" sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller

R4'" og Rs'" sammen kan være et enkelt oksygenatom.

Oppfinnelsen angår videre et kationsalt og et syreaddisjonssalt av en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Det blir også tilveiebrakt ifølge oppfinnelsen anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for inhibering av celleproliferasjon hos et pattedyr.

I tillegg tilveiebrakt er en farmasøytisk sammensetning kjennetegnet ved at den innbefatter en forbindelse ifølge oppfinnelsen og en eller flere farmasøytiske eksipienter.

Til slutt angår oppfinnelsen et antifungalt middel anvendelig for behandling av fungale infeksjoner hos mennesker, dyr og planter, kjennetegnet ved at den innbefatter en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Fig. 1 er et plott av gjennomsnittlig neointimalarealet av en rottehalspulsåre behandlet meden saltholdig vehikel og behandlet med forbindelse 3 fremstilt i henhold til eksempel 2 hvori den ikke-skraverte søylen fremstiller den ikke-behandlede delen av halspulsåren og den skraverte søylen fremstiller den behandlede delen av halspulsåren.

Følgende definisjoner er visse begreper som anvendes heri.

"Halogen" refererer til fluor, brom, klor og jodatomer. "Hydroksyl" refererer til OH-gruppen. "TioP<*> eller "merkapto" refererer til SH-gruppen.

"Lavere alkyl" refererer til en cyklisk, forgrenet eller rettkjedet alkylgruppe med en til t karbonatomer. Denne termen er videre eksemplifisert av slike grupper som metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, i-butyl (eller 2-metylpropyl), cyklopropylmetyl, i-amyl, n-amyl, heksyl og lignende.

"Substituert lavere alkyl" refererer til lavere alkyl som akkurat beskrevet inkluderende en eller flere grupper slik som hydroksyl, tiol, alkyltiol, halogen, alkoksy, amino, amido, karboksyl, cykloalkyl, substituert cykloalkyl, heterocyklus, cykloheteroalkyl, substituert cykloheteroalkyl, acyl, karboksyl, aryl, substituert aryl, aryloksy, hetaryl, substituert hetaryl, aralkyl, heteroaralkyl, alkylalkenyl, alkylalkynyl, alkylcykloalkyl, alkylcykloheteroalkyl, cyano. Disse gruppene kan være bundet til et hvilket som helst karbonatom i den lavere alkylhalvdelen.

"Alkylalkenyl" refererer til en gruppe -R-CR<*>=CR"'R"", hvor R er et lavere alkyl, eller substituert lavere alkyl, R', R'", R"" kan hver for seg være hydrogen, halogen, lavere

alkyl, substituert lavere alkyl, acyl, aryl, substituert aryl, hetaryl eller substituert hetaryl som definert nedenfor.

"Alkylalkynyl" refererer til en gruppe -RC=CR' hvor R er laverealkyl eller substituert laverealkyl, R' er hydrogen, laverealkyl, substituert laverealkyl, acyl, aryl, substituert aryl, hetaryl eller substituert hetaryl som definert nedenfor.

"Alkoksy" betegner gruppen -OR, hvor R er laverealkyl, substituert laverealkyl, acyl, aryl, substituert aryl, aralkyl, substituert aralkyl, heteroalkyl, heteroarylalkyl, cykloalkyl, substituert cykloalkyl, cykloheteroalkyl eller substituert cykloheteroalkyl som definert.

"Alkyltio" betegner gruppen -SR, -S(0)n=i-2-R, hvor R er lavere alkyl, substituert laverealkyl, aryl, substituert aryl, aralkyl eller substituert aralkyl som definert heri.

"Acyl" betegner grupper -C(0)R, hvor R er hydrogen, laverealkyl substituert laverealkyl, aryl, substituert aryl og lignende som definert heri.

"Aryloksy" betegner grupper -OAr, hvor Ar er en aryl, substituert aryl, heteroaryl eller substituert heteroarylgruppe som definert heri.

"Amino" betegner gruppen NRR', hvor R og R<*> hver for seg kan være hydrogen, laverealkyl, substituert laverealkyl, aryl, substituert aryl, hetaryl eller substituert hetaryl som definert heri eller acyl.

"Amido" betegner gruppen -C(0)NRR', hvor R og R' hver for seg kan være hydrogen, laverealkyl, substituert laverealkyl, aryl, substituert aryl, hetaryl, substituert hetaryl som definert heri.

"Karboksyl" betegner gruppen -C(0)OR, hvor R er hydrogen, laverealkyl, substituert laverealkyl, aryl, substituert aryl, hetaryl og substituert hetaryl som definert heri.

"Aryl" eller "Ar" refererer til en aromatisk karboksyklisk gruppe som har minst en aromatisk ring (f. eks. fenyl eller bifenyl) eller flerkondenserte ringer hvori minst en ring er aromatisk (f. eks. 1,2,3,4-tetrahydronaftyl, naftyl, antryl eller fenantryl).

"Substituert aryl" refererer til aryl valgfritt substituert med en eller flere funksjonelle grupper, f. eks. halogen, laverealkyl, lavere alkoksy, alkyltio, acetylen, amino, amido,

karboksyl, hydroksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Heterocykel" refererer til en mettet, umettet eller aromatisk karbocyklisk gruppe som har en enkelt ring (f. eks. morfolino, pyridyl eller furyl) eller flerkondenserte ringer (f. eks. naftpyridyl, kinoksalyl, kinolinyl, indolizinyl eller benzo[b]tienyl) og som har minst et heteroatom, slik som N, O eller S i ringen, som valgfritt kan værre usubstituert eller substituert med, f. eks. halogen, laverealkyl, laveralkoksy, alkyltio, acetylen, amino, amido, karboksyl, hydroksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Heteroaryl" eller "hetar" refererer til en heterocykel hvori minst en heterocyklisk ring er aromatisk.

"Substituert heteroaryl" refererer til en heterocykel valgfritt mono- eller polysubstituert med en eller flere funksjonelle grupper, som f. eks. halogen, laverealkyl, laverealkoksy, alkyltio, acetylen, amino, amido, karboksyl, hydroksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Aralkyl" refererer til gruppen -R-Ar hvor Ar er en arylgruppe og R er laverealkyl eller substituert laveralkylgruppe. Arylgrupper kan valgfritt være usubstituert eller substituert med f eks. halogen, laverealkyl, alkoksy, alkyltio, acetylen, amino, amido, karboksyl, hydroksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Heteroalkyl" refererer til gruppen -R-Het hvor Het er en heterocyklisk gruppe og R er en laverealkylgruppe. Heteroalkylgrupper kan valgfritt være usubstituert eller substituert med f. eks. halogen, laverealkyl, laverealkoksy, alkyltio, acetylen, amino, amido, karboksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Heteroarylalkyl" refererer til gruppen -R-HetAr hvor HetAr er en heteroarylgruppe og R laverealkyl eller substituert laverealkyl. Heteroarylalkylgrupper kan valgfritt være usubstituert eller substituert med f. eks. halogen, laverealkyl, substituert laverealkyl, alkoksy, alkyltio, acetylen, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Cykloalkyl" refererer til en divalent cyklisk eller polycyklisk alkylgruppe inneholdende 3 til 15 karbonatomer.

"Substituert cykloalkyl" refererer til en cykloalkylgruppe innbefattende en eller flere substituenter med f. eks. halogen, laverealkyl, substituert laverealkyl, alkoksy, alkyltio, acetylen, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Cykloheteroalkyl" refererer til en cykloalkylgruppe hvori en eller flere av ringkarbonatomene er erstattet med et heteroatom (f. eks. N, O, S eller P).

"Substituert cykloheteroalkyl" refererer til en cykloheteroalkylgruppe som definert heri som inneholder en eller flere substituenter slik som halogen, laverealkyl, laverealkoksy, alkyltio, acetylen, amino, amido, karboksyl, hydroksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Alkylcykloalkyl" betegner gruppen -R-cykloalkyl hvor cykloalkyl er en cykloalkylgruppe og R er en laverealkyl eller substituert laverealkyl. Cykloalkylgrupper kan valgfritt være usubstituert eller substituert med f. eks. halogen, laverealkyl, laverealkoksy, alkyltio, acetylen, amino, amido, karboksyl, hydroksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

"Alkylcykloheteroalkyi" betegner gruppen -R-cykloheteroalkyl hvor R er en laverealkyl eller substituert laverealkyl. Cykloheteroalkylgrupper kan valgfritt være usubstituert eller substituert med f. eks. halogen, laverealkyl, laverealkoksy, alkyltio, amino, amido, karboksyl, acetylen, hydroksyl, aryl, aryloksy, heterocykel, substituert heterocykel, hetaryl, substituert hetaryl, nitro, cyano, tiol, sulfamido og lignende.

Hvis den endelige 2,6,9-trisubstituerte purinforbindelsen ifølge oppfinnelsen inneholder en basisk gruppe, kan et syreaddisjonssalt av blandingen bli fremstilt. Syreaddisjonssalter av forbindelser ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved standard fremgangsmåter i et egnet løsemiddel fra morforbindelsen og et overskudd av syre, slik som, men ikke begrenset til, saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, maleinsyre, ravsyre eller metansulfonsyre. Saltsyresaltformen er særlig anvendelig. Hvis den endelige 2,6,9-trisubstituerte purinforbindelsen inneholder en syregruppe, kan kationiske salter av sammensetningen bli fremstilt. Typisk blir den sure morforbindelsen behandlet med et overskudd av en alkalisk reagens, slik som, men ikke begrenset til, hydroksid, karbonat eller alkoksid, inneholdende det hensiktsmessige kationet slik som, men ikke begrenset til, Na<+>, K<*>, Ca2<+> og NH4<+.> Visse forbindelser danner indre salter eller zwitterioner som også er akseptable.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er anvendelige ved inhibering av celleproliferasjon hos pattedyr inkluderende mennesker. 2,6,9-trisubstituerte puriner er anvendelige ved for eksempel behandling av autoimmune sykdommer, f. eks. reumatoid arthritis, lupus, type I diabetes, multippel sklerose, etc, ved behandling av kreft, kardiovaskulær sykdom slik som restenosis, "host vs graft disease", gikt, polycystisk nyresykdom og andre proliferative sykdommer hvis patogenese involverer abnormal celleproliferasjon.

Administrasjon kan skje parenteralt, og oralt, av en effektiv mengde av den valgte forbindelsen ifølge oppfinnelsen, foretrukket dispergert i en farmasøytisk bærer. Terapeutisk anvendelige mengder av sammensetningen ifølge oppfinnelsen vil generelt variere fra ca. 0,01 til ca. 100 mg/kg, men vil enkelt bli bestemt av fagfolk avhengig av administrasjonsmåle og alderen og tilstanden til pasienten. Terapeutisk anvendelige mengder av sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan administreres fra en til ti ganger daglig eller mer for akutte eller kroniske sykdommer. Ingen uakseptable toksikologiske effekter er forventet når forbindelser ifølge oppfinnelsen blir administrert i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er også anvendelige som antiinflammatoriske og antifungale midler. Som sådan er sammensetningene ifølge opprinnelsen anvendelige for behandling av antiinflammatoriske og fungale infeksjoner hos mennesker, dyr, og fungale infeksjoner hos planter.

Farmasøytiske sammensetninger inkluderende forbindelsene ifølge oppfinnelsen, og/eller derivater derav, kan formuleres som løsninger eller lyofiliserte pulvere for parenteral administrasjon. Pulvere kan bli rekonstituert ved tilsetning av et egnet fortynningsmiddel eller andre farmasøytisk akseptable bærere forut for anvendelse. Hvis sammensetningene ifølge oppfinnelsen blir anvendt i flytende form, er det foretrukket at de inkorporeres i en bufret, isotonisk, vandig løsning. Eksempler på egnede fortynningsmidler er normal isotonisk saltløsning, standard 5% dekstrose i vann og bufret natrium- eller ammoniumacetatløsning. Slike flytende formuleringer er egnede for parenteral administrasjon, men kan også bli anvendt for oral administrasjon.

Det kan være ønskelig å tilsette eksipienter slik som polyvinylpyrrolidinon, gelatin, hydroksycellulose, acaia, polyetylenglykol, mannitol, natriumklorid, natriumcitrat eller andre eksipienter som er kjente for fagfolk til farmasøytiske sammensetninger inkluderende forbindelser ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan de farmasøytiske sammensetningene bli innkapslet, tablettert eller fremstilt i en emulsjon eller sirup for oral administrasjon. Farmasøytisk akseptabelt fast stoff eller væskeformige bærere kan tilsettes for å øke eller stabilisere sammensetningen, eller for å lette fremstillingen av sammensetningen. Flytende bærere inkluderer, men er ikke begrenset til, sirup, peanøttalje, olivenolje, glycerin, saltvann, alkoholer og vann. Faststoffbærere inkluderer, men er ikke begrenset til, stivelse, laktose, kalsiumsulfat, dihydrat, teffa alba, magnesiumstearat eller stearinsyre, talkum, pektin, acacia, agar eller gelatin. Bæreren kan også inkludere et vedvarende avgivelsesmateriale slik som, men ikke begrenset til, glycerytmonostearat eller glyceryldistearat, alene eller med en voks. Mengden av faststoffbærer varierer, men vil foretrukket være mellom ca. 20 mg og ca. 1 g per doseringsenhet.

De farmasøytiske doseringene er fremstilt ved anvendelse av konvensjonelle teknikker slik som, men ikke begrenset til, maling, blanding, granulering og sammenpressing, når nødvendig, for tablettformer; eller maling, blanding og fylling for harde gelatinkapselformer. Når en flytende bærer blir anvendt, vil fremstillingen være i form av en sirup, eliksir, emulsjon eller en vandig eller ikke-vandig suspensjon. En slik flytende formulering kan administreres direkte eller fylles i en myk gelatinkapsel.

Eksemplene som følger tjener til å illustrere denne oppfinnelsen. Eksemplene er ikke ment på noen måte å begrense omfanget av oppfinnelsen, men er gitt for å vise hvordan forbindelsene ifølge oppfinnelsen lages og anvendes. I eksemplene er alle temperaturer i grader Celsius. RT indikerer romtemperatur.

Eksempel 1

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen blir fremstilt ved vanlige fremgangsmåter i organisk kjemi. Reaksjonsskjemaet gitt i synteseskjemaet under er en generell metode anvendelig for syntese av forbindelsen ifølge oppfinnelsen. 2,6-dikloropurin blir oppløst i butanol og et egnet amin R] blir tilsatt. Etter oppvarming i flere timer blir reaksjonsblandingen avkjølt og forbindelse 1 oppnås. Til forbindelse 1 blir det tilsatt natriumhydrid fulgt av R2, og forbindelse 2 blir isolert. Til forbindelse 2 blir R3 tilsatt i løsning med N-metylpyrrolidinon. Denne blandingen blir varmet for en hensiktsmessig periode fulgt av rensing, som leder til den ønskede forbindelsen.

Følgende forbindelse ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten ovenfor.

Fremstilling av 2-kloro-6-(4-metoksybenzylamino)purin (1)

2,6-dikloropurinet (4,06 g, 21,5 mmol) ble suspendert i n-butanol (150 ml) og 4-metoksybenzylamin ble tilsatt (3,4 ml, 26 mmol). Løsningen ble klar og deretter tåkete etter fl minutter. Løsningen ble varmet til 120"C i 2 timer og deretter avkjølt n-butanolen ble fordampet fulgt av suspensjon av residuet i vann og dietyleterblanding. En løsning av 2N NaOH (1,3 ml, 26 mmol) ble tilsatt og løsningen rørt i 10 minutter før filtrering. Det filtrerte presipitatet ble vasket med vann og en liten porsjon eter og tørket under vakuum. Den gjenværende væsken ble værende over natten og flere krystaller ble samlet opp neste dag og vasket med dietyleter. Utbytte = 71%.

Fremstilling av 2-kloro-6-(4-metoksybenzylamino)-9-isopropylpurin (2)

2-kloro-6-(4-metoksybenzylamino)purin ble suspendert i tørr DMF (5 ml) og behandlet med natriumhydrid, 60% dispersjon (82 mg, 2,06 mmol). Suspensjonen ble rørt i 30 minutter hvorved løsningen ble en klar gul/grønn løsning. 2-jodopropan (0,280 ml, 1,7 eq.) ble tilsatt i løpet av 5 minutter og den resulterende løsningen ble rørt i 2 dager.

Vann ble tilsatt og løsningen ekstrahert med etylacetat. Det organiske sjiktet ble fordampet som ga produktet isopropylpurin (utbytte = 508 mg, 89%).

Fremstilling av 2-dietanolamino-6-(4-metoksybenzylamino)-9-isopropylpurin (3)

Purinet (1,65 g, 4,98 mmol) ble oppløst i DMSO (12 ml) og dietanolamin (4 ml) og deretter varmet ved 140°C i 2-3 dager og deretter ved 160°C i 1 dag. Løsningen ble avkjølt og vann mettet butanol ble tilsatt (100 ml). Løsningen ble deretter vasket med vann (3 x 50 ml), før fordampning som ga en brun olje. Residuet ble kromatografeit over silikagel eluert med etylacetat, fulgt av 3% metanol i etylacetat som ga produktet (utbytte = 730 mg, 37%) som en matt gul olje. Utbytte = 37%.

'H-NMR (8 CDCL3): 7,29 (br s 1H), 7,25 (d, 2H), 6,94 (br s 1H), 6,83 (d, 2H), 5,43 (br s, <2H), 4,63 (br s, 2H), 4,53 (m, 1H), 3,86 (t, 4H), 3,76 (m, 7H), 1,47 (d, 6H).

Tabell 1 viser forbindelser ifølge oppfinnelsen som ble fremstilt i henhold til syntesefremgangsmåten fremsatt i dette eksemplet.

Eksempel 2

Dette eksemplet beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen. Syntesefremgangsmåten fremlagt i dette eksemplet er bare svakt modifisert i forhold til det som ble fremlagt i Eksempel 1.

Følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåten ovenfor.

Fremstilling av 2,6-dikloro-9-isopropylpurin (4)

Til en løsning av 0,67 g 2,6-dikloropurin i 5 ml tørr DMF ved romtemperatur ble det tilsatt 0,16 g (1,1 eq.) 50% natriumhydrid/oljepulver. Ved opphør av hydrogenutvikling, ble et stort overskudd (2 ml) av isopropyljodid tilsatt til den anioniske løsningen. Denne reaksjonsløsningen ble rørt i tre dager ved omgivelsestemperatur. Reaksjonen ble stoppet med 30 ml vann og ekstrahert med etylacetat (3 x 50 ml). De organiske ekstraktene bte kombinert og bakvasket med 3 x 50 ml vann fulgt av 20 ml saltvann. Etylacetatløsningen ble tørket over vannfri magnesiumsulfat og fordampet. Løsningen ble gjenstand for fiash-kromatografi med variabel gradient på silikagel med heksan/etylacetatblandinger som ga 0,37 g av ønsket N-9 produkt (45%) og 0,08 g av N-7 isomer (10%).

Fremstilling av 2-kloro-6-anilino-9-isopropylpuyrin (5)

2,6-dikloro-9-isopropylpurin (0,019 g, 0,081 mmol) ble oppløst i butanol (0,5 ml) og anilin (0,044 ml, 0,244 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble varmet til 120°C i 10 timer, avkjølt, fortynnet med EtOAc og vasket 3 ganger med vann. Blandingen ble tørket over MgSO<t og konsentrert til et off-white faststoff.

Fremstilling av 2-dietanolamino-6-(4-fenylanilino)-9-isopropylpurin (6)

En løsning av 67 mg 2,6-dikloro-N-9-isopropylpurin og 100 mg 4-fenylanilin i 1 ml n-oktanol ble varmet til 80°C i 24 timer, n-oktanolet ble fjernet under vakuum og erstattet med 1 ml 40% dietanolamin i DMSO. Løsningen ble varmet ved 130°C i 48 timer. Reaksjonen ble avkjølt til romtemperatur og fortynnet med 10 ml vann og deretter ekstrahert med etylacetat (3 x 30 ml). De organiske ekstraktene ble kombinert og bakvasket med 3 x 20 ml vann fulgt av 10 ml saltvann. Etylacetatløsningen ble tørket over vannfri magnesiumsulfat og filtrert og løsemidlet ble fordampet. 65 mg av urent produkt ble krystallisert fra THF-eterløsning som ga 28 mg av rent produkt (23%).

Tabell 2 nedenfor viser forbindelser ifølge oppfinnelsen som har blitt fremstilt ifølge den generelle syntesefremgangsmåten fremsatt i dette eksemplet Tabell 2

Forbindelser fremstilt ved fremgangsmåten i Eksempel 2

Eksempel 3

Følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåten ovenfor.

Fremstilling av 2,6-dikloro-9-isopropylpurin (4)

2,6-dikloropurin (5,00 g, 26,46 mmol) ble suspendert i 55 ml tørr DMF ved romtemperatur og behandlet med natriumhydrid, 60% dispersjon (1,27 g, 31,75 mmol) tilsatt i porsjoner. Etter røring i 1 time, ble 2-jodopropan (4,5 ml, 44,98 mmol) tilsatt og reaksjonen rørt i 2 dager. Reaksjonen ble helt over i dietyleter og vasket en gang med mettet natriumbikarbonatløsning og en gang med vann. Blandingen ble tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert i vakuum. Konsentratet ble kromatografert over silikagel eluert med 10% aceton i diklorometanløsning som ga det ønskede N-9 alkyleringsprodukt som et hvitt fast stoff. Utbytte = 47%.

Fremstilling av 2-kIoro-6-(4-metylmerkapto)anilino-9-isopropylpurin (5A)

2,6-dikloro-9-isopropylpurin (0,15 g, 0,649 mmol) ble oppløst i n-butanol (4 ml) og 4-(metylmerkapto)anilin (0,089 ml, 0,714 mmol) og trietylamin (0,20 ml, 1,43 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble varmet ved 80°C over natten. Den avkjølte reaksjonen ble fortynnet med etylacetat og vasket 1 gang IM HC1,1 gang mettet natriumbikarbonat og 1 gang saltvann før den ble tørket med vannfri natriumsulfat og konsentrert i vakuum. Residuet ble kromatografert over silikagel og eluert med 2% metanol i diklormetan som ga det ønskede produktet som et hvitt fast stoff. Utbytte = 83%.

Fremstilling av 2-dietanolamin-6-(4-metylmerkapto)anilino-9-isopropylpurin (6A)

Purinet (0,18 g, 539 mmol) ble oppløst i N-metylpyrrolidinon (3 ml) og dietanolamin (1 ml) og deretter varmet ved 120°C over natten. Den avkjølte reaksjonen ble helt over i dietyleter og vassket tre ganger med vann før tørking over vannfri natriumsulfat og konsentrering i vakuum. Residuet ble kromatografert over silikagel eluert med 5% metanol i diklormetan som ga det ønskede produktet som et off-white fast stoff. Utbytte = 82%. <l>H-NMR (8, CDC13): 8,08 (s, 1H), 7,58 (d, 2H), 7,47 (s, 1H), 7,18 (d, 2H), 4,95 (br s, <2H), 4,52 (m, 1H), 3,94 (m, 4H), 3,83 (m, 4H), 2,43 (s, 3H), 1,47 (d, 6H).

Fremstilling av 4-(2-tienyl)benzonitril

Noen Ri-grupper må først bli syntetisert før reagering med 2,6-dikloro-9-isopropylpurin. Disse gruppene kan syntetiseres ved forskjellige koblingsfremgangsmåter og andre syntesefremgangsmåter kjente av fagfolk i organisk syntese.

Til et trykkrør ble det tilsatt 4-bromobenzonitril (0,20 g, 1,10 mmol), tetrakis(trifenylfosfin) palladium (0) (0,127 g, 0,1 eq.) og 2-tiofenborsyre (0,211 g, 1,65 mmol). Reaksjonen ble overstrømmet under vakuum og overstrømmet med tørr nitrogen tre ganger. Etter overstrømningene ble etylenglykoldimetyleter (5,5 ml) og en vandig løsning av natriumkarbonat (2,53 ml, IM) tilsatt til røret. Røret ble deretter forseglet og varmet ved 80°C over natten. Den avkjølte reaksjonen ble fortynnet med dietyleter og vasket to ganger med vann før tørking over natriumsulfat og konsentrering i vakuum. Residuet ble kromatografert over silikagel eluert med 10% etylacetat i heksan som ga det ønskede produktet som et hvitt fast stoff. Utbytte = 84%.

Fremstilling av 4-(2-tienyl)benzylamin

4-(2-tienyl)benzonitrilet (0,086 g, 0,464 mmol) ble oppløst i tørr tetrahydrofuran (1,6 ml) før Utiiimaluminiumhydrid (0,46 ml, 0,464 mmol, 1 M i THF) ble tilsatt dråpevis. Reaksjonen ble rørt ved romtemperatur over natten. TLC (5% metanol i diklormetan) viste at det fremdeles var utgangsstoff igjen. Ytterligere 1 eq av LAH ble tilsatt. Etter ytterligere en time, ble reaksjonen stoppet med Fieser og Fieser metoden ved anvendelse av "wager" (17,46 vandig natriumhydroksidløsning (17,46 ul, 15% løsning) og vann (52,37 ul) tilsatt sekvensielt til reaksjonen. Reaksjonen ble deretter fortynnet med dietyleter og vann og ekstrahert to ganger med dietyleter før tørking over natriumsulfat og konsentrering i vakuum. Residuet ble videreført urent uten noen ytterligere rensning. Utbytte = 89%.

Tabell 3 nedenfor viser forbindelser ifølge oppfinnelsen som ble fremstilt ifølge den generelle syntesefremgangsmåten framsatt i dette eksempel.

Tabell 3

Forbindelser fremstilt ved fremgangsmåten i Eksempel 3

Eksempel 4

Dette eksemplet beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen. Syntesefremgangsmåten fremsatt i dette eksemplet er bare lett modifisert i forhold til den som ble fremsatt i Eksempel 1.

Følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåten ovenfor.

Fremstilling av 2-amino-6-kloro-9-metylpurin (7)

2-amino-6-kloropurinet (1,08 g, 6,4 mmol) ble suspendert i tørr DMF (75 ml) og behandlet med natriumhydrid, 60% dispersjon (0,28 g, 7 mmol). Suspensjonen ble rørt i 15 minutter før jodometan (0,44 ml, 7,06 mmol) ble tilsatt og den resulterende gule løsningen ble rørt i 1 time og 45 minutter. Det faste stoffet ble filtrert og filtratet fordampet før tilsetning av vann i 10 minutter. Det resulterende faste stoffet ble filtrert og tørket over natten som ga produktet som en blanding av N-7 og N-9 alkyleringsprodukter. Den resterende væsken sto natten over og flere krystaller ble samlet opp neste dag og tørket. Utbytte = 77%.

Fremstilling av 6-kloro-2-(2-metoksyacetylamino)-9-metyIpurin (8)

Blandingen av ovenfomevnte isomerer ble oppløst i diklorometan og pyridin (2 eq) fulgt av behandling med metoksyacetylklorid (4 eq). Reaksjonen ble rørt ved romtemperatur til fullstendig reaksjon. Reaksjonen ble fordampet og filtrert gjennom en plugg av silikagel eluert med 2% metanol i diklorometan fulgt av rensing på en kromatotron ved anvendelse av silikagel og eluert med 2% metanol i diklorometan for å isolere det ønskede produktet. Utbytte = 31%.

Tabell 4 viser forbindelser ifølge oppfinnelsen som ble fremstilt ifølge syntesefremgangsmåten fremsatt i dette eksemplet.

Tabell 4

Forbindelser fremstilt ved fremgangsmåten i Eksempel 4

Eksempel 5

Dette eksemplet beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen. Syntesemetoden fremsatt i dette eksemplet er bare lett modifisert i forhold til den som ble fremsatt i Eksempel 1.

Følgende forbindelse ble fremstilt ifølge fremgangsmåten ovenfor.

Fremstilling av 2-kloro-6-(4-fenylbenzylamino)purin (9)

2,6-dikloropurinet (5,0 g, 26,45 mmol) ble suspendert i n-butanol (50 ml) og 4-fenylbenzylamin (6,61 g, 29,1 mmol) og trietylamin (4,1 ml, 29,1 mmol) ble tilsatt. Løsningen ble varmet til 120*C over natten og deretter avkjølt. Frafiltrert produkt ble vasket med overskudd n-butanol, 100 ml IM HC1 og 200 ml vann. Det faste stoffet ble tørket under vakuum over natten ved 70°C som ga det ønskede produktet som et matt gult faststoff. Utbytte = 99%.

Fremstilling av 2-dietanolamino-6-(4-fenylbenzylamino)purin (10)

2-kloro-6-(4-fenylbenzylamino)purinet (2,0 g, 5,96 mmol) ble tilsatt sammen med dietanolamin (11,4 ml, 119,2 mmol) og N-metylpyrrolidinon (10 ml) og varmet til 120°C over natten. Den avkjølte reaksjonen ble helt over i diklorometan og vasket to

ganger med vann. Det organaiske sjiktet ble tørket med vannfri natriumsulfat og konsentrert i vakuum som ga det ønskede produktet som et matt grønt faststoff som ble videre tørket under vakuum ved 70°C i 2 dager.

Fremstilling av 2-dietanolamino-6-(4-fenylbenzylamino)-9-metylpurin (11)

2-dietanolamino-6-(4-fenylbenzylamino)purinet (0,050 g, 0,124 mmol) ble oppløst i tørr DMF og behandlet med natriumhydrid, 60% dispersjon (5,5 mg, 0,136 mmol) i 1 time. Jodometan (0,009 ml, 0,148 mmol) ble tilsatt og den resulterende løsningen rørt ved romtemperatur over natten. Reaksjonen ble helt over i dietyleter og vasket to ganger med mettet natriumbikarbonatløsning før tørking over vannfri natriumsulfat og konsentrering i vakuum. Residuet ble kromatografert over silikagel eluert med 5% metanol i diklorometan som ga produktet som et hvitt fast stoff. Utbytte = 63%.

'H-NMR (6, CDC13): 7,55 (m, 4H), 7,41 (m, 4H), 7,35 (m, 4H), 6,41 (br s, < 1H), 5,10 (br s, < 2H), 4,72 (br s, 2H), 3,86 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 3,59 (s, 3H).

Tabell 5 viser forbindelser ifølge oppfinnelsen som ble fremstilt ifølge syntesefremgangsmåten fremsatt i dette eksemplet.

Tabell 5

Forbindelser fremstilt ved fremgangsmåten i Eksempel 5

Eksempel 6

Sammensetning ifølge oppfinnelsen ble evaluert i følgende undersøkelser.

CDK2 undersøkelse:

Sammensetninger ifølge oppfinnelsen ble undersøkt for å bestemme deres CDK2 inhibitoraktivitet. Undersøkelsessystemet (totalvolum på 50 ul) inneholdt 50 mM Tris-Cl, pH 7,4,10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 ug av histon Hl, 30 uM ATP (1 uCi av gamma<32>P merket ATP), 10 ug av BSA og 1 ng av renset CDK2. Etter inkubering ved 30°C i 30 minutter, ble reaksjonen terminert ved tilsetning av 10 ul 10% TCA og prøvene ble plassert over på nitrocellulosefiltere. Disse filtrene ble vasket inngående i 10% TCA og undersøkt for radioaktivitet. Blindprøver inneholdt ikke enzymer. For å forsikre potensialet til forskjellige forbindelser ifølge oppfinnelsen, ble forbindelser tilsatt til undersøkelsen ovenfor ved konsentrasjoner varierende fra 100 til 0,02 ug/ml. Etter inkubering i 30 minutter, ble undersøkelsesrørene behandlet som ovenfor. Ved alle undersøkelsene ble forskjellige konsentrasjoner av olomoucin tilsatt og ble anvendt som en standard positiv kontroll. IC5o (enzym) som er listet opp i Tabell 6 ble identifisert som konsentrasjonen som kreves for å inhibere CDK2 aktivitet med 50%.

Eksempel 7

Celle<p>roliferasionsundersøkelse;

Tidlig passasje rotte aortisk glattmuskulaturceller (CV Therapeutics Cell repository) ble sådd i 48 brønntallerkner (Falcon, ml/brønn) med en tetthet på 20.000 celler/ml av DME som inneholder 5% varmeinaktivert bovinserum. Cellene ble inkubert i en standard vevskulturinkubator i 48 timer. Mediet ble aspirert og brønnene ble etterfylt med 0,2 ml friskt medium. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble tilsatt ved konsentrasjoner på mellom 100 og 0,37 ug/ml. Etter 48 timers inkubering, ble mediet aspirert og kulturene ble behandlet med 0,2 ml saltvann 0,25 fil fenozinmetosulfatløsning inneholdende MTS ("Cell Titer 96" vandig ikke-radioaktiv celleproliferasjonsundersøkelsesutstyr, katalog # G 5430, Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl 53711-5399). IC5o-cellene som er listet i Tabell 6 er definert som konsentrasjonen som kreves for å inhibere celleproliferasjon med 50%. Olomoucin i forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt og ble anvendt som en standard positiv kontroll.

Inhiberingen av celleproliferasjonsegenskapene av forbindelsene ifølge oppfinnelsen blir vist ved deres evne til å inhibere celleproliferasjon i området fra ca. 0,05 ug/ml til 100 ug/ml, foretrukket mindre enn 0,5 ug/ml.

Eksempel 7

En forbindelse ifølge oppfinnelsen ble evaluert med hensyn til effektivitet ved anvendelse av Murine Leukemia modell. Munne Leukemia modellen er en standard modell anvendt ved evaluering av antitumormidler. CDF1 mus ble injisert ip med L1210 celler (1 x IO3 celler/mus). 24 timer senere ble disse musene behandlet med forskjellige doser (ip) av forbindelse 3 i Eksempel 1 i saltvann. Doseringsregimet anvendt ved denne studien er fremsatt i Tabell 7 nedenfor. Musene ble dosert med forbindelse 3 daglig eller på annenhver dag. Kontrollmus mottok saltvann. Etter 7 dager ble doseringen avsluttet og det ble kontrollert hvor mange som hadde overlevd.

Resultatene viser at rotter som administreres forbindelse 3 overlevde lenger enn kontrollrottene.

Eksempel 8

Dette eksemplet undersøkte effekten av en akutt lokal levering av forbindelse 3 i Eksempel 1 for å redusere neointimadannelse fulgt av ballong angioplast hos rotte carotid artery modellen. I dette eksemplet ble den venstre felles carotid arterien av voksne hannrotter (n=10 per eksperimentell gruppe) kirurgisk skadet ved anvendelse av et Fogarty arterial embolectomy kateter. Med en gang etter skade, ble den felles carotid arterien delt i to med en vaskulær klemme og etablerer dermed et ubehandlet og behandlet segment. Et legemiddelleveringskateter ble deretter satt inn i den fjerne halvdelen av felles-carotiden. Etter legemiddelavlevering, ble kateteret fjernet og overskudd legemiddel ble vasket ut ved fjerning av den vaskulære klemmen og blodstrømmen ble reetablert før arterien ble lukket. Dyrene fikk 14 dager på å komme seg før høsting av felles carotid-arterie. Det høstede vevet ble seksjonert og det neointimale arealet ble kvantifisert og bestemt med et computer-plammetrisystem. For hvert dyr ble det gjort 15 målinger for den ubehandlede gruppen og 15 for den behandlede.

Resultatene av dette eksemplet finnes i Figur 1.1 henhold til Figur 1 vil administrering av forbindelse 3 i Eksempel 1 til en skadet carotid arterie redusere det neointimale arealet ca. 88% sammenlignet med 6% reduksjonen som fremkom ved saltvehikkelen alene.

Eksempel 9

IkBhx kinase undersøkelse:

Sammensetninger ifølge oppfinnelsen ble undersøkt for å bestemme deres IkB-o: kinase inhibitoraktivitet. Den menneskelige umbilikale vene endoteliale cellelinje (HUVEC) anvendt ved disse studiene ble kjøpt hos Clonetks (San Diego, CA) og ble oppbevart i endotelial cellevekstmedium supplement med 2% fosterbovinserum, 10 ng/ml menneskelig rekombinant epidermal vekstfaktor, 1 ug/ml hydrokortison, 50 ug/ml gentamicin, 50 ng/ml amfotericin B og 12 ug/ml bovin hjemeekstrakt ved 37°C i en vevskultuirnkubator. Alle vekstmedia og supplementer ble kjøpt hos Clonetics (San Diego, CA). E. coli lipopolysakkarid (LPS) serotype 0111 :B4 ble kjøpt hos Sigma (Saint Louis, MI). Alle andre kjemikalier hadde reagensrenhet.

Fremstilling av cellelvsat:

Enkeltsjikt (75 cm<2>) av HUVEC celler ble behandlet med LPS (100 ng/ml) i 5 minutter hvoretter cellemediet raskt ble fjernet og enkeltsjiktet vasket tre ganger med iskald PBS. Cellesjiktet ble skrapt over i 10 ml PBS og cellene pelletisert ved sentrifugering (3000 rpm, 5 min, 4°C). Cellelysatet ble fremstilt ved inkubering av cellepelleten i 0,2 ml lysisbuffer (20 mM HEPES, pH 7,3,50 mM NaCl, 10 mM MgCl2,1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM natriumortovanadat, 10 mM B-glycerofosfat, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM ditiotreitol, 0,5% Nonidet P-40) i 15 minutter ved 37°C med hyppig rotering. Cellebiter ble fjernet fira prøven ved mikrosentirfugering (10.000 x g, 15 minutter, 4°C) og supernatanten ble "forklargjort" ved tilsetning av 100 ml av en suspensjon av sepharose 4B i lysisbuffer og sammenblanding forsiktig i 1 time ved 4°C. Sepharose 4B dråpene ble fjernet ved mikrosentrifugering og supernatanten tatt opp og lagret ved 80"C.

Faststoff IkB-cc kinase undersøkelse:

1 fig GST- IkB-cc, korresponderende til full lengde IkB-cc av menneskelig opprinnelse (Santa Cruz Biotechnology), ble inkubert med 20 fil av en 50% slurry av glutation S sepharose 4B (Pharmacia) i reaksjonsbuffer (20 mM HEPES, pH 7,3,10 mM MgCl2,15 mM fl-glycerofosfat, 0,5 mM natriumortovanadat, 0,5 mM EGTA) i 30 minutter ved romtemperatur. GST-IicB-perlekomplekset ble vasket tre ganger med 0,5 ml reaksjonsbuffer ved resuspensjon og mikrosentirfugering. 10 ug HUVEC celle lysatprotein i 100 fil reaksjonsbuffer ble deretter tilsatt til GST-IicB-perlekomplekset og blandingen inkubert med forsiktig sammenblanding ved 4°C i 1 time. Perlekomplekset ble deretter vasket tre ganger med reaksjonsbuffer inneholdende 0,2 M NaCl og en gang med rreaksjonsbuffer alene. Til slutt ble perlekomplekset resuspendert i 20 ul reaksjonsbuffer inneholdende 5 uCi [y-<32>P]ATP (> 5000 ci/mmol, New England Nuclear Corp. Boston, MA) og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. Reaksjonen ble terminert ved tilsetning av 10 fil SDS-PAGE prøvebuffer og kokt i 3 minutter før separasjon med SDS-PAGE (10-20% gradient Readygel, BioRad). Ved etterfølgende elektroforese ble gelen fiksert (50% metanol 10% eddiksyre) i 15 minutter, vasket tre ganger i 5 minutter hver med destillert H20 og behandlet med 5% glycerol i 15 minutter før tørking og anbringelse på film for autoradiografi (X-OMAT XAR-5 Kodak).

I gel kinase undersøkelse:

iKB-a isozymer ble undersøkt for aktivitet ved anvendelse av en modifisert tidligere publisert fremgangsmåte (11,19,20). I korthet ble duplikatprøver av iKB-glutation sepharose 4B perlekomplekser fremstilt som beskrevet ovenfor og ble separert ved elektroforese gjennom en 12% SDS-PAGE gel som hadde blitt polymerisert under nærvær av 15 fig/ml GST- IicB-a. Ved etterfølgende forese ble gelen vasket forsiktig to ganger i 30 minutter hver med 50 mM Tris-HCl pH 8,0,5 mM B-merkaptoetanol; 20% isopropanol for å fjerne SDS. Proteiner ble deretter denaturert i gelen ved inkubering i 45 minutter i 100 ml 50 mM Tris-HCl pH 8,0; 5 mM B-merkaptoetanol; 0,04% Tween 40. Gelen ble deretter kuttet i to for å separere duplikatprøvene, en halvdel ble inkubert i 10 ml reaksjonsbuffer alene og den andre i 10 ml reaksjonsbuffer inneholdende 10 u<g>/ml 2-dietanolamino-6-(4-fenylanilino)-9-isopropylpurin (forbindelse 6 i Eksempel 2) i 1 time ved romtemperatur hvor 10 uCi [y-<32>P]ATP ble tilsatt og inkuberingene fortsatte for ytterligere en time ved romtemperatur. Gelene ble deretter gjenstand for multiple 15 minutters vasker med 100 ml hver 5% trikloreddiksyre inneholdende 1% natriumpyrofosfat inntil 1 ml av vaskeløsning ga nær opp til bakgrunnsradioaktivitet. Gelene ble tørket og gjort gjenstand for autoradiografi.

Fremstillin<g> av 2- dietanolamino- 6- f4- fenvlbenzvlaminoV94sopropvlpurin epoksvaktivert sepharose 6B affinitetsmatriks

Frysetørket epoksyaktivert sepharose 6B (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) ble valgt til koblingsreaksjonen på grunn av dets evne til å danne en eterbinding mellom en hydroksylinneholdende ligand og epoksidgruppen til sepharosen. Gelen ble svellet i henhold til produsentens anvisninger, (100 mg) av forbindelse 6 i Eksempel 2 ble oppløst i 1 ml koblingsløsning (1,2 : 1 v/v dimetylformamid: 0,1N NaOH) og blandet med 0,5 ml av svellet gel ved pH 10-11 i 72 timer ved romtemperatur med forsiktig røring. Overskytende reaktive grupper ble blokkert med IM etanolamin i 4 timer ved 50°C og gel-slurryen ble helt over i 1 ml sprøytekolonne. Harpiksen ble aktivert med tre alternerende cykler av tyve kolonnevolumer hver med pH 4,0 (0,1 M acetat, 0,5 M NaCl) og pH 8,0 (0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl) buffere fulgt av tyve kolonnevolumer av reaksjonsbuffer (20 mM HEPES, pH 7,3, 10 mM MgCl2,15 mM 8-glycerofosfat, 0,5 mM natriumortovanadat, 0,5 mM EGTA). Kolonnen ble lagret ved 4°C i reaksjonsbuffer inneholdende 0,5% natriumazid og regenerert forut for hver anvendelse ved alternerende cykler av lav og høy pH som beskrevet ovenfor.

Aktivert HUVEC cellelysat (500 fig protein i 1 ml reaksjonsbuffer) ble sekvensielt ført over CVT-1545 sepharose matriksen fem ganger og strømmen gjennom ble lagret (ubundet materiale). Matriksen ble deretter vasket tre ganger med 1 ml reaksjonsbuffer (vask 1-3), deretter tre ganger hver med reaksjonsbuffer inneholdende 0,5 M NaCl (eluat 1-3). Aliquoter (20 fil fra 1 ml) av hver prøve ble undersøkt for deres evne til å fosforylere på GST- IicB-sepharose perlekompleks og analysert av SDS-PAGE som beskrevet ovenfor.

Undersøkelse av affinitetsanriket IkB-cx kinase.

Bulk 0,5 M NaCl eluatene fra affinitetsmatriksen ble anvendt som enzymkilde for utvikling av en IkB-cc kinase filter undersøkelse. Hver reaksjon inneholdt affinitetsanriket IkB-o; kinase (1 ug protein), 10 ng GST IkB-cc kinase og 0,5 uCi [y-<32>P]ATP (>5000 Ci/mmol, New England Nuclear Corp, Boston, MA) i 20 ul reaksjonsbuffer. Reaksjonen ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur og ble terminert ved tilsetning av 2 ul 0,5 M EDTA. Reaksjonsblandingen ble overført til fosfocellulosetallerkner (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) og filtrene ble vasket tre ganger med 0,15 M fosforsyre og forsiktig ristet i 15 minutter (opp til ti filtere ble vasket med 300 ml 0,15 M fosforsyre). Deretter fulgte en tredje vask og filtrene bie tørket, tilsatt til scintillasjonsbed og undersøkt ved hjelp av flytende scintillasjonsspektrometri.

Elektroforetiskmobilitetskiftundersøkelse:

Nukleære ekstrakter ble fremstilt ved anvendelse av en høysaltbuffer-ekstraksjonsfremgangsmåte. 10 pmol av dobbeltstrandet NF-kB konsensus oligonukleotid (S-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-S')) Promega) ble 5' sluttmerket med 5 uCi [y-<32>P]ATP (> 5000 Ci/mmol, New England Nuclear Corp, Boston, MA) ved inkubering med T4 polynukleotidkinase i 1 time ved 37°C. Bcke-inkorporerte nukleotider ble fjernet ved passering av reaksjonsblandingen over 1 ml Sephadex G-5-spinnkolonne. Bindingsundersøkelser ble utført ved romtemperatur i 1 time og besto av 10 fig nukleær ekstraksjonsprotein, 1 fig laksesperm-DNA og 5 x 10 cpm av P merket konsensus av oligonukleotid under nærvær og fravær av femti ganger umerket oligonukleotid. DNA-protein komplekser ble oppløst ved 8% ikke-denarurerende polyakrylamidgel-elektroforese, gelen ble tørket på filterpapir og visualisert ved autoradiografi.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved den generelle formel eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvori Ri er halogen, R2 er C2 til Cio alkyl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, halogen og-C(0)R; R og R<*> representerer uavhengig hydrogen, eller lavere alkyl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, -O-alkyl, halogen, amino, mono- eller dialkylamino, merkapto, alkyltriol, -C(0)NH-alkyl, C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, cyano, aryloksy, alkenyl, alkynyl, -C(0)alkyl, eller aryl eller heteroaryl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra lavere alkyl, alkoksy, halogen, merkapto, alkyltio, acetylen, amino, mono- eller dialkylamino, -C(0)NH-alkyl, -C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, -C(0)alkyl, hydroksy, aryl, aryloksy, heteroaryl, nitro eller cyano, og R3 er halogen, -NR4R5 eller en bestanddel som har den generelle formelen: hvori m, n og o uavhengig representerer 1,2 eller 3; Y er -NR4R5, hydroksy, merkapto, -OR, alkyltiol, og R4, R*', R4", R*'". Rs, Rs" og Rsm er hver uavhengig hydrogen, hydroksy, lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, NRR' eller aryl, heteroaryl eller arylalkyl; eller Y og R4' sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller R4" og R5" sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller R4" og R5'" sammen kan være et enkelt oksygenatom.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri er klor.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved atR2er C2 til Cio alkyl eventuelt substituert med en, to eller tre hydroksygrupper.

4. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R3 er halogen eller -NR4R5.

5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved atRser klor.

6. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved atRaer -NR+Rs-

7. Forbindelse, karakterisert ved at den har den generelle formelen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvori: Ri er-NHRi'; Ri- er quinolin-S-yl eller quinolin-6-yl; eller Ri' er benzyl, hvor ringdelen er subsituert med en, to eller tre grupper valgt fra halogen, -OR, tienyl, nitro, pyridyl, piperonyl, eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, merkapto, alkyltio, nitro eller cyano; eller Ri' er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra brom, jod, -OR", tienyl, pyridyl, piperonyl, eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, merkapto, alkyltio, nitro eller cyano; R2 er C2 til Cio alkyl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valg fra hydroksy, halogen og -C(0)R; R og R' representerer uavhengig hydrogen, eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, -O-alkyl, halogen, amino, mono- eller dialkylamino, merkapto, alkyltio, -C(0)NH-alkyl, -C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, cyano, aryloksy, alkenyl, alkynyl, -C(0)alkyl, eller aryl eller heteroaryl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra lavere alkyl, alkoksy, halogen, merkapto, alkyltio, acetylen, amino, mono- eller dialkylamino, -C(0)NH-alkyl, -C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyi, -C(0)alkyl, hydroksy, aryl, aryloksy, heteroaryl, nitro eller cyano, R" representerer hydrogen, eller C2 til Cio alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, -O-alkyl, halogen, amino, mono- eller dialkylamino, merkapto, alkyltriol, -C(0)NH-alkyl, C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyl, cyano, aryloksy, alkenyl, alkynyl, -C(0)alkyl, eller aryl eller heteroaryl eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra lavere alkyl, alkoksy, halogen, merkapto, alkyltio, acetylen, amino, mono- elter dialkylamino, -C(0)NH-alkyl, -C(0)N-dialkyl, -C(0)0-alkyI, -C(0)alkyl, hydroksy, aryl, aryloksy, heteroaryl, nitro eller cyano;

R.3 er halogen, -NR4R5 eller en bestanddel som har den generelle formelen: hvori m, n og o uavhengig representerer 1,2 eller 3; Y er -NR4R5, hydroksy, merkapto, -OR, alkyltiol, og R4, RV, R4"» R4'", Rs, R5" og R5'" uavhengig er hydrogen, hydroksy, lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, NRR<*> eller aryl, heteroaryl eller arylalkyl; eller Y og R4' sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller R4" og Rs" sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller R4<*>" og Rs'" sammen kan være et enkelt oksygenatom.

8. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at Ri erNHAr, og Ar er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra brom, jod, -OR", tienyl, pyridyl, piperoyl eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, merkapto, alkyltio, nitro eller cyano.

9. Forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved at R2er C2 til Cio alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy og halogen; R og R<5> representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R" representerer hydrogen eller C2 til Cio alkyl; R3 er halogen, -NR4R5 eller en bestanddel som har den generelle formelen: hvori m, n og o uavhengig representerer 1,2 eller 3; Y er -NR4R5, hydroksy, merkapto, -OR, alkyltiol, og R4, R*', RT, RT\ Rs, Rs" og R5'" uavhengig er hydrogen, lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, NRR' eller aryl, heteroaryl eller arylalkyl; Y og R*' sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller R4" og Rs" sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller RV" og Rs"<*> sammen kan være et enkelt oksygenatom.

10. Forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved at R2er C2 til Cio alkyl; R og R' representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R" representerer hydrogen eller C2 til Cio alkyl; R3 er halogen eller -NR4R5, hvor R4 og Rs uavhengig er hydrogen, eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy, -NRR<*> eller aryl, heteroaryl eller arylakyl.

11. Forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved at R2erC2til Ct0 alkyl; R og R' representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R" representerer hydrogen eller C2 til Cio alkyl; R3 er halogen eller -NR4R5, hvor R4 og R5 uavhengig er hydrogen, eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy, -NRR' eller heteroaryl eller arylakyl og Ar er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra brom, jod,-OR", tienyl, pyridyl, piperoyl eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, nitro eller cyano.

12. Forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved at R2erC2til Cio alkyl; R og R<*> representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R" representerer hydrogen eller C2 til Cio alkyl; R3 er halogen eller -NR4R5, hvor R4 og R5 uavhengig er hydrogen, eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy, -NRR' eller arylakyl og Ar er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra brom, jod, -OR", tienyl, pyridyl, piperoyl eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, nitro eller cyano.

13. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at Ri er NHCH2 Ar; R2 er C2 til Cio alkyl; R og R' representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R" representerer hydrogen eller C2 til Cio alkyl; R3 er halogen eller -NR4R5, hvor R4 og R5 uavhengig er hydrogen, eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy, -NRR' eller heteroaryl eller arylakyl og Ar er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra halogen, -OR", tienyl, nitro pyridyl, piperoyl eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, merkapto, alkyltio, nitro eller cyano.

14. Forbindelse ifølge krav 13, karakterisert ved at R2 er C; til Cio alkyl eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy eller halogen; R og R' representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R3 er halogen, -NR4R5 eller en bestanddel som har den generelle formelen: hvori m, n og o uavhengig representerer 1,2 eller 3; Y er -NR4R5, hydroksy, merkapto, -OR, alkyltiol, og R*, R4', R4", RV", Rj, Rs" og R5"' uavhengig er hydrogen eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en, to eller tre grupper valgt fra hydroksy, NRR' eller aryl, heteroaryl eller arylalkyl; eller Y og RV sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller RV' og R5" sammen kan være et enkelt oksygenatom; eller RV" og Rs"' sammen kan være et enkelt oksygenatom; og Ar er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra halogen, -OR", tienyl, nitro, pyridyl, piperoyl eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, merkapto, alkyltio, nitro eller cyano.

15. Forbindelse ifølge krav 13, karakterisert ved at R2er C2 til Cio alkyl; R og R<9> representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R3 er halogen eller -NR4R5 hvor R4 og R; uavhengig er hydrogen eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy, NRR<*> eller aryl, heteroaryl eller arylalkyl.

16. Forbindelse ifølge krav 13, karakterisert ved at R2 er C2 til Cio alkyl; R og R' representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R3 er halogen eller -NR4R5 hvor R4 og Rs uavhengig er hydrogen eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy, NRR' eller heteroaryl eller arylalkyl; Ar er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra halogen, -OR", tienyl, pyridyl, piperoyl eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, nitro eller cyano.

17. Forbindelse ifølge krav 13, karakterisert ved at R2 er C2 til Cio alkyl; R og R<*> representerer uavhengig hydrogen eller lavere alkyl; R3 er halogen eller -NR4R5 hvor R4 og Rs uavhengig representerer hydrogen eller lavere alkyl, eventuelt substituert med en eller to grupper valgt fra hydroksy, NRR' eller arylalkyl; og Ar er fenyl substituert med en, to eller tre grupper valgt fra halogen, -OR", tienyl, pyridyl, piperoyl eller fenyl, hvor fenylet er usubstituert eller substituert med trifluormetyl, halogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, hydroksy, amino, nitro eller cyano.

18. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at Ri er NHR]' og Ri' er quinolin-3-yl.

19. Forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved at Ar er 3-jodfenyl, 4-bromfenyl eller 4-bifenyl.

20. Forbindelse ifølge krav 13, karakterisert ved at CH2Ar er 4-fenylbenzyl, 4-fenylbenzyl, 4-metoksybenzyl, 3-metoksybenzyl, 4-(2-tienyl)benzyl, 4-(4-metyl)fenylbenzyl, 4-(4-trifluorometyl)fenylbenzyl, 3(4cyano-fenylbenzyl), 4-(4-cyanofenylbenzyl), 4-(2-pyridyl)benzyl, 3-metoksybenzyl, 2-klorobenzyl, 3-klorbenzyl, 4-klorbenzyl, 2,5-difluorbenzyl, 4- og 4-nitrobenzyl.

21. Forbindelse ifølge krav 11, karakterisert ved atRjer klor, dietanolamino, disopropanolamino, 2-aminoetylamino, 2-aminopropylarnino, 2-(metylamino)etylamino, l-hydroksymetyl-2-metylpropylamin eller 3-amino-l,2-propandiol og R2 er isopropyl.

22. Forbindelse ifølge krav 21, karakterisert ved atR3er klor, dietanolamino, disopropanolamino, 2-aminoetylamino, 2-aminopropylamino, 1-hydroksymetyl-2-metylpropylamin eller 3-amino-l,2-propandipl og R2 er isopropyl.

23. Forbindelse ifølge krav 7 karakterisert ved at den er 2-{(2-hydorksyetyl)-[9-isopropyl-6-(4-m^ etanol eller 2-t[6-(4-brombenzylamino)-9-isopropyl-9-H-purin-2-yl]-(2-hydrok etanol].

24. Kationsalt, karakterisert ved at det er av en forbindelse ifølge krav 1 til 7.

25. Syreaddisjonssalt, karakterisert ved at det er av en forbindelse ifølge krav 1 til 7.

26. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 25 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for inhibering av celleproliferasjon hos et pattedyr.

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvori den terapeutisk effektive mengden av forbindelsen varierer fra 0,001 til 100 mg/kg kroppsvekt av pattedyret.

28. Anvendelse ifølge krav 26 eller 27, hvori sammensetningen er egnet for administrering til et pattedyr som lider av en celleproliferasjonsforstyrrelse valgt fra gruppen som består av reumatoid artritt, lupus, type 1 diabetes, multippel sklerose, kreft, restenose, vert versus graft sykdom, gikt og polycystisk nyresykdom.

29. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 26 til 28, hvori pattedyret er et menneske.

30. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den innbefatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 25 og en eller flere farmasøytiske eksipienter.

31. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 30, karakterisert v e d at den er i form av en løsning.

32. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 30, karakterisert v e d at den er i form av en tablett.

33. Antifungalt middel anvendelig for behandling av fungale infeksjoner hos mennesker, dyr og planter, karakterisert ved at det innbefatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 25.