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Die
Erfindung betrifft 2,6,9-trisubstituierte Purine, die selektive
Inhibitoren von Zellzyklus-Kinasen und Inhibitoren der Zellproliferation
sind. Die Purine sind zum Beispiel beim Behandeln von Autoimmunerkrankungen,
z.B. rheumatoider Arthritis, Lupus, Typ I-Diabetes, Multipler Sklerose,
etc., beim Behandeln von Krebs, cardiovaskulärer Erkrankung wie Restenose,
Wirt-Transplantat-Erkrankung, Gicht, polyzystischer Nierenerkrankung
und anderen proliferativen Erkrankungen, deren Pathogenese eine
abnormale Zellproliferation beinhaltet, verwendbar.
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Die
Erfindung betrifft auch 2,6,9-trisubstituierte Purine, von denen
festgestellt wurde, dass sie wirksame und spezifische Inhibitoren
der IκB-α-Kinase sind,
die eine Signal-induzierte NF-κB-Aktivierung
und Cytokin-Synthese in vitro und in vivo hemmt. Von solchen Inhibitoren
wird erwartet, dass sie die Synthese von Cytokinen und Adhäsionsproteinen,
deren Synthese transkriptionell durch NF-κB reguliert ist, hemmen. Proinflammatorische
Cytokine wie IL-1, IL-6, TNF und Adhäsionsproteine (z.B. ICAM, VCAM
und Selektine) gehören
zu dieser Klasse von Molekülen
und wurden mit der Pathogenese von inflammatorischen Erkrankungen
in Zusammenhang gebracht. Folglich ist ein wirksamer Inhibitor der
IκB-α-Kinase bei
der klinischen Behandlung von Erkrankungen verwendbar, bei denen
eine NF-κB-Aktivierung
für die
Induktion der Erkrankung benötigt wird.
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In
den letzten Jahren haben Fortschritte in der Molekular- und Zellbiologie
zu unserem Verständnis
der Mechanismen einer Zellproliferation und von spezifischen Vorgängen, die
während
einer Entwicklung von Zellen über
Mitose auftreten, beigetragen. Vergleiche z.B. "Progress in Cell Cycle Research", Band 1, Herausgeber
L. Meijer, S. Guidet und H. Y. L. Tung, Plenum Press, New York,
1995. Diese Untersuchungen zeigten, dass ein Voranschreiten durch
den Zellzyklus durch eine Familie von Serin/Threonin-Kinasen, die
Cyclin-abhängige
Kinasen genannt werden, gesteuert wird. Diese Enzyme enthalten (a)
ein katalytisches Protein, das Cyclin-abhängige
Kinase (CDK) genannt wird, die ATP als ein Substrat verwendet, und
(b) ein Regulatorprotein, das Cyclin genannt wird. Unterschiedliche
Cyclin-CDK- Kombinationen
steuern Vorgänge
wie Wachstum, DNA-Replikation und Zellteilung. Ein Schlüsselmitglied
der CDK-Enzymfamilie ist CDK2. Es wurde gezeigt, dass eine CDK2-Aktivität wesentlich
für das
Voranschreiten im Säugerzellzyklus
an der G1/S-Grenze ist. Eine Mikroinjektion von Antikörpern, die
gegen CDK2 gerichtet sind, blockiert das Voranschreiten von menschlichen diploiden
Fibroblasten in die S-Phase des Zellzyklus. Eine Expression einer
dominant negativen CDK2-Mutanten in humanen Osteosarkomzellen weist
eine ähnliche
Wirkung auf. Zusammen zeigen diese Untersuchungen, dass eine Hemmung
einer zellulären
CDK2-Aktivität
ein Voranschreiten von Zellen durch den mithotischen Zyklus verhindern
und einen Wachstumsstopp vor der S-Phase induzieren wird. Übereinstimmend
mit dieser Ansicht haben in vitro-Untersuchungen mit Olomoucin (2-(Hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurin)
gezeigt, dass diese Verbindung ein spezifischer Inhibitor von CDK2
mit einem IC50-Wert von etwa 2,1 μg/ml ist;
J. Vesely et al., Eur. J. Biochem. 224, 771–786 (1994), L. Meijer "Chemical Inhibitors
of Cyclin-Dependent Kinases" Seiten
351–356
in "Progress in
Cell Cycle Research",
Band 1, Herausgeber L. Meijer, S. Guidet und H. Y. L. Tung, Plenum
Press, New York, 1995. In vivo-Untersuchungen unter Verwendung von
Säugerzellen
in Kultur haben gezeigt, dass Olomoucin eine Zellproliferation bei
einer ungefähren
Konzentration von 50 μg/ml
hemmt.
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Erfindungsgemäß haben
wir mehrere Verbindungen entwickelt, deren biologische Aktivität merklich wirksamer
ist als die von Olomoucin. In vivo-Untersuchungen unter Verwendung
von Säugerzellen
zeigen, dass einige der beschriebenen Verbindungen eine Zellproliferation
bei Konzentrationen hemmen, die signifikant niedriger sind als die
von Olomoucin.
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Kürzlich wurde
eine IκB-α-Kinase-Aktivität in dem
Cytoplasma von stimulierten menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen
beschrieben (Bennett et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 19680–19688).
Einige der erfindungsgemäßen Verbindungen
wurden als wirksame und spezifische Inhibitoren von IκB-α-Kinase identifiziert,
die eine Signal-induzierte NF-κB-Aktivierung
und Cytokin-Synthese in vitro und in vivo verhindert. Die Aktivierung
des heterodimerischen Transkriptionsfaktors NF-κB ist ein komplexer Vorgang.
In nicht stimulierten Zellen befindet sich das NF-κB (p50/p65)-Heterodimer
in dem Cytosol, in dem es mit einer inhibitorischen Untereinheit
IκB-α komplexiert
ist. IκB-α bindet an
NF-κB, was
folglich dessen Kernlokalisationssignal maskiert und eine Translokation
zu dem Kern verhindert. Nach Stimulierung der Zellen mit einer Vielzahl
von Signalen (z.B. Lipopolysaccharid) wird IκB-α schnell phosphoriliert, ubiquitiniert
und durch das Proteasom abgebaut. Ein Abbau von IκB-α ermöglicht die
Translokation von NF-κB
zu dem Kern, wo es eine Transkription einer Reihe von inflammatorischen
Antwort-Genen aktiviert.
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Diese
Feststellungen legen nahe, dass IκB-α-Kinase ein
attraktives Ziel für
die Identifizierung von Inhibitoren ist, die bei der Behandlung
von inflammatorischen Erkrankungen, bei denen eine NF-κB-Aktivierung für die Induktion
der Erkrankung benötigt
wird, verwendbar sein können.
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Veselý et al.,
European Journal of Biochemistry, Band 224, 771–786, beschreiben eine Untersuchung, die
die Hemmung von Cyclin-abhängigen
Kinasen durch Purinanaloga betrifft. Diese Referenz beschreibt unter
anderem 2-(2-Hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurin.
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Die
US-A-5,508,277 betrifft Pyrimidinverbindungen für eine Verwendung als Arzneimittel,
wobei die Verbindungen und physiologisch verträgliche Salze davon in Therapeutika,
insbesondere zum Unterdrücken einer
Tumorzellresistenz gegenüber
antineoplastischen Mitteln, verwendet werden können.
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Die
US-A-5,498,819 betrifft Griseolsäure-Derivate
mit verschiedenen Gruppen, die an den Zuckeranteil anstelle der
Adeningruppe von Griseolsäure
selbst gebunden sind. Diese Gruppen sind alle Purinderivate oder
Ring-geöffnete
Analoga. Diese Verbindungen sind als Inhibitoren von Phosphodiesterasen
verwendbar.
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Die
WO-A-93/17020 betrifft bestimmte Purinnukleosid-Analoga mit einem
carbocyclischen Ring anstelle des Zuckerrests, Salze, Ester und
pharmazeutisch verträgliche
Derivate davon, Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische
Formulierungen, die diese enthalten, und die Verwendung solcher
Verbindungen in der Therapie, insbesondere der Behandlung oder Prophylaxe
von bestimmten Infektionen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Eine
erfindungsgemäße Aufgabe
ist die Bereitstellung von 2,6,9-trisubstituierten Purinverbindungen, die
die Cyclin-abhängige
Kinase 2 hemmen.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Aufgabe
ist die Bereitstellung von 2,6,9-trisubstituierten Purinverbindungen,
die zum Hemmen der Zellproliferation geeignet sind.
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Die
Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
eine 2,6,9-trisubstituierte Purinverbindung und einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger
umfasst und zum Hemmen der Zellproliferation in Säugern geeignet
ist.
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In
einem Aspekt wird erfindungsgemäß eine Verbindung
gemäß Anspruch
1 der allgemeinen Formel:
oder ein pharmazeutisch verträgliches
Salz davon bereitgestellt, worin
R
1 ein
Halogenatom ist,
R
2 eine C
2-
bis C
10-Alkylgruppe ist, gegebenenfalls
substituiert mit einer, zwei oder drei Gruppen, ausgewählt aus
Hydroxygruppe, Halogenatom und -C(O)R-Gruppe, R und R' unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom oder
eine Niederalkylgruppe, gegebenenfalls
substituiert mit einer, zwei oder drei Gruppen, ausgewählt aus
Hydroxy-, -O-Alkylgruppe, Halogenatom, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-,
Mercapto-, Alkylthiol-, -C(O)NH-Alkyl-, -C(O)N-Dialkyl-, -C(O)O-Alkyl-,
Cyan-, Aryloxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, -C(O)Alkylgruppe, oder
Aryl-
oder Heteroarylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit einer, zwei
oder drei Gruppen, ausgewählt
aus Niederalkyl-, Alkoxygruppe, Halogenatom, Mercapto-, Alkylthio-,
Acetylen-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, -C(O)NH-Alkyl-, -C(O)N-Dialkyl-, -C(O)O-Alkyl-,
-C(O)Alkyl-, Hydroxy-, Aryl-, Aryloxy-, Heteroaryl-, Nitro- oder Cyangruppe,
sind und
R
3 ein Halogenatom, eine -NR
4R
5-Gruppe oder eine
Gruppe der allgemeinen Formel:
ist, worin m, n und o unabhängig voneinander
den Wert 1, 2 oder 3 aufweisen,
Y eine -NR
4R
5-, Hydroxy-, Mercapto-, -OR-, Alkylthiolgruppe
ist und
R
4, R
4', R
4'', R
4''',
R
5, R
5'' und R
5''' jeweils
unabhängig
voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe,
Niederalkylgruppe,
gegebenenfalls substituiert mit einer, zwei oder drei Gruppen, ausgewählt aus
Hydroxy-, NRR'-Gruppe
oder
Aryl-, Heteroaryl- oder Arylalkylgruppe sind, oder
Y
und R
4' zusammen
ein einzelnes Sauerstoffatom sein können oder
R
4'' und R
5'' zusammen ein einzelnes Sauerstoffatom
sein können
oder
R
4''' und R
5''' zusammen
ein einzelnes Sauerstoffatom sein können.
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In
einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß eine Verbindung gemäß Anspruch
7 der allgemeinen Formel:
oder ein pharmazeutisch verträgliches
Salz davon bereitgestellt, worin
R
1 eine
-NHR
1'-Gruppe
ist,
R
1' eine Chinolin-3-yl- oder Chinolin-6-ylgruppe
ist oder
R
1' eine Benzylgruppe ist, wobei der Ringanteil
mit einer, zwei oder drei Gruppen substituiert ist, ausgewählt aus
Halogenatom, -OR-, Thienyl-, Nitro-, Pyridyl-, Piperonylgruppe oder
Phenylgruppe,
wobei die Phenylgruppe nicht substituiert oder mit Trifluormethylgruppe,
Halogenatom, Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Hydroxy-, Amino-, Mercapto-,
Alkylthio-, Nitro- oder Cyangruppe substituiert ist, oder
R
1' eine
Phenylgruppe, substituiert mit einer, zwei oder drei Gruppen, ausgewählt aus
Brom-, Iodatom, -OR''-, Thienyl-, Pyridyl-,
Piperonylgruppe oder
Phenylgruppe, wobei die Phenylgruppe nicht
substituiert oder mit Trifluormethylgruppe, Halogenatom, Niederalkyl-,
Niederalkoxy-, Hydroxy-, Amino-, Mercapto-, Alkylthio-, Nitro- oder
Cyangruppe substituiert ist, ist,
R
2 eine
C
2- bis C
10-Alkylgruppe,
gegebenenfalls substituiert mit einer, zwei oder drei Gruppen, ausgewählt aus Hydroxygruppe,
Halogenatom und -C(O)R-Gruppe, ist R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder
eine
Niederalkylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit einer, zwei oder
drei Gruppen, ausgewählt
aus Hydroxy-, -O-Alkylgruppe, Halogenatom, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-,
Mercapto-, Alkylthiol-, -C(O)NH-Alkyl-, -C(O)N-Dialkyl-, -C(O)O-Alkyl-,
Cyan-, Aryloxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, -C(O)Alkylgruppe, oder
Aryl-
oder Heteroarylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit einer, zwei
oder drei Gruppen, ausgewählt
aus Niederalkyl-, Alkoxygruppe, Halogenatom, Mercapto-, Alkylthiol-,
Acetylen-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, -C(O)NH-Alkyl-, -C(O)N-Dialkyl-,
-C(O)O-Alkyl-, -C(O)Alkyl-, Hydroxy-, Aryl-, Aryloxy-, Heteroaryl-,
Nitro- oder Cyangruppe, sind,
R'' ein
Wasserstoffatom oder
eine C
2- bis C
10-Alkylgruppe, gegebenenfalls substituiert
mit einer, zwei oder drei Gruppen, ausgewählt aus Hydroxy-, -O-Alkylgruppe,
Halogenatom, Amino-, Mono- oder
Dialkylamino-, Mercapto-, Alkylthiol-, -C(O)NH-Alkyl-, -C(O)N-Dialkyl-,
-C(O)O-Alkyl-, Cyan-,
Aryloxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, -C(O)Alkylgruppe, oder
Aryl-
oder Heteroarylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit einer, zwei
oder drei Gruppen, ausgewählt
aus Niederalkyl-, Alkoxygruppe, Halogenatom, Mercapto-, Alkylthiol-,
Acetylen-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, -C(O)NH-Alkyl-, -C(O)N-Dialkyl-,
-C(O)O-Alkyl-, -C(O)Alkyl-, Hydroxy-, Aryl-, Aryloxy-, Heteroaryl-,
Nitro- oder Cyangruppe, ist,
R
3 ein
Halogenatom, eine -NR
4R
5-Gruppe
oder eine Gruppe der allgemeinen Formel:
ist, worin m, n und o unabhängig voneinander
den Wert 1, 2 oder 3 aufweisen,
Y eine -NR
4R
5-, Hydroxy-, Mercapto-, -OR-, Alkylthiogruppe
ist und
R
4, R
4', R
4'', R
4''',
R
5, R
5'' und R
5''' unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe,
Niederalkylgruppe,
gegebenenfalls substituiert mit einer, zwei oder drei Gruppen, ausgewählt aus
Hydroxy-, -NRR'-Gruppe,
oder
Aryl-, Heteroaryl- oder Arylalkylgruppe sind, oder
Y
und R
4' zusammen
ein einzelnes Sauerstoffatom sein können oder
R
4'' und R
5'' zusammen ein einzelnes Sauerstoffatom
sein können
oder
R
4''' und R
5''' zusammen
ein einzelnes Sauerstoffatom sein können.
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
der Verbindung gemäß Anspruch
1 sind in den Ansprüchen
2 bis 6 beschrieben. Ferner sind bevorzugte Ausführungsformen der Verbindung
gemäß Anspruch
7 in den Ansprüchen
8 bis 23 beschrieben.
-
In
einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß die Verwendung einer therapeutisch
wirksamen Menge einer Verbindung, wie in einem der Ansprüche 7 bis
25 beansprucht, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
bereitgestellt, die zum Hemmen der Zellproliferation in Säugern geeignet
ist. Zellproliferationserkrankungen sind z.B. rheumatoide Arthritis,
Lupus, Typ I-Diabetes, Multiple Sklerose, Krebs, Restenose, Wirt-Transplantat-Erkrankung
und Gicht.
-
In
einem noch weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß eine pharmazeutische Zusammensetzung
bereitgestellt, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 7 bis
25 in einem Gemisch mit einem oder mehreren pharmazeutischen Exzipienzien
umfasst.
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In
einem noch weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß eine Antipilzzusammensetzung
bereitgestellt, die zum Behandeln von Pilzinfektionen in Menschen,
Tieren und Pflanzen geeignet ist und eine Verbindung nach einem
der Ansprüche
7 bis 25 umfasst.
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BESCHREIBUNG
DER FIGUR
-
1 ist
eine graphische Darstellung der durchschnittlichen neointimalen
Fläche
einer Rattenhalsschlagader, die mit einem Kochsalzträger behandelt
und mit der Verbindung 3 behandelt wurde, die gemäß Beispiel
2 hergestellt worden war, wobei der offene Balken dem nicht behandelten
Abschnitt der Halsschlagader entspricht und der schattierte Balken
dem behandelten Abschnitt der Halsschlagader entspricht.
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Das
Nachstehende sind Definitionen für
bestimmte hierin verwendete Begriffe.
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"Halogenatom" betrifft Fluor-,
Brom-, Chlor- und Iodatome.
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"Hydroxylgruppe" betrifft die Gruppe
-OH.
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"Thiolgruppe" oder "Mercaptogruppe" betrifft die Gruppe
-SH.
-
"Niederalkylgruppe" betrifft eine cyclische,
verzweigte oder geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen.
Dieser Begriff wird weiter durch solche Gruppen wie Methyl-, Ethyl-,
n-Propyl-, i-Propyl-, n-Butyl-, t-Butyl-, i-Butyl- (oder 2-Methylpropyl-),
Cyclopropylmethyl-, i-Amyl-, n-Amyl-, Hexylgruppen und dergleichen
veranschaulicht.
-
"Substituierte Niederalkylgruppe" betrifft eine wie
vorstehend beschriebene Niederalkylgruppe, die eine oder mehrere
Gruppen wie Hydroxyl-, Thiol-, Alkylthiolgruppe, Halogenatom, Alkoxy-,
Amino-, Amido-, Carboxyl-, Cycloalkyl-, substituierte Cycloalkyl-,
Heterocyclus-, Cycloheteroalkyl-, substituierte Cycloheteroalkyl-,
Acyl-, Carboxyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aryloxy-, Hetaryl-,
substituierte Hetaryl-, Aralkyl-, Heteroaralkyl-, Alkylalkenyl-,
Alkylalkinyl-, Alkylcycloalkyl-, Alkylcycloheteroalkyl-, Cyangruppe
beinhaltet. Diese Gruppen können
an ein jegliches Kohlenstoffatom der Niederalkylgruppe gebunden
sein.
-
"Alkylalkenylgruppe" betrifft eine Gruppe
-R-CR'=CR'''R'''', worin R eine Niederalkyl- oder substituierte Niederalkylgruppe
ist, R', R''',
R'''' unabhängig voneinander
ein Wasserstoff-, Halogenatom, eine Niederalkyl-, substituierte
Niederalkyl-, Acyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Hetaryl- oder substituierte
Hetarylgruppe, wie nachstehend definiert, sein können.
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"Alkylalkinylgruppe" betrifft Gruppen
-RC≡CR', worin R eine Niederalkyl-
oder substituierte Niederalkylgruppe ist, R' ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-,
substituierte Niederalkyl-, Acyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Hetaryl-
oder substituierte Hetarylgruppe, wie nachstehend definiert, ist.
-
"Alkoxygruppe" betrifft die Gruppe
-OR, worin R eine Niederalkyl-, substituierte Niederalkyl-, Acyl-, Aryl-,
substituierte Aryl-, Aralkyl-, substituierte Aralkyl-, Heteroalkyl-,
Heteroarylalkyl-, Cycloalkyl-, substituierte Cycloalkyl-, Cycloheteroalkyl-
oder substituierte Cycloheteroalkylgruppe, wie definiert, ist.
-
"Alkylthiogruppe" betrifft die Gruppe
-SR und -S(O)n=1-2-R, worin R eine Niederalkyl-,
substituierte Niederalkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl-
oder substituierte Aralkylgruppe, wie hierin definiert, ist.
-
"Acylgruppe" betrifft die Gruppen
-C(O)R, worin R ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-, substituierte Niederalkyl-,
Aryl-, substituierte Arylgruppe und dergleichen, wie hierin definiert,
ist.
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"Aryloxygruppe" betrifft die Gruppen
-OAr, worin Ar eine Aryl-, substituierte Aryl-, Heteroaryl- oder
substituierte Heteroarylgruppe, wie hierin definiert, ist.
-
"Aminogruppe" betrifft die Gruppe
NRR', worin R und
R' unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-, substituierte Niederalkyl-,
Aryl-, substituierte Aryl-, Hetaryl- oder substituierte Hetarylgruppe,
wie hierin definiert, oder Acylgruppe sein können.
-
"Amidogruppe" betrifft die Gruppe
-C(O)NRR', worin
R und R' unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-, substituierte Niederalkyl-,
Aryl-, substituierte Aryl-, Hetaryl- oder substituierte Hetarylgruppe,
wie hierin definiert, sein können.
-
"Carboxylgruppe" betrifft die Gruppe
-C(O)OR, worin R ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-, substituierte
Niederalkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Hetaryl- oder substituierte
Hetarylgruppe, wie hierin definiert, ist.
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"Arylgruppe" oder "Ar" betrifft eine aromatische
carbocyclische Gruppe mit mindestens einem aromatischen Ring (z.B.
Phenyl- oder Biphenylgruppe) oder mehreren kondensierten Ringen,
bei denen mindestens ein Ring aromatisch ist (z.B. 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl-,
Naphthyl-, Anthryl- oder Phenanthrylgruppe).
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"Substituierte Arylgruppe" betrifft eine Arylgruppe,
die gegebenenfalls mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen,
z.B. einem Halogenatom, einer Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Alkylthio-,
Acetylen-, Amino-, Amido-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Aryl-, Aryloxy-,
Heterocyclus-, Hetaryl-, substituierten Hetaryl-, Nitro-, Cyan-, Thiol-,
Sulfamidogruppe und dergleichen, substituiert ist.
-
"Heterocyclusgruppe" betrifft eine gesättigte,
ungesättigte
oder aromatische carbocyclische Gruppe mit einem einzigen Ring (z.B.
Morpholino-, Pyridyl- oder Furylgruppe) oder mehreren kondensierten
Ringen (z.B. Naphthpyridyl-, Chinoxalyl-, Chinolinyl-, Indolizinyl-
oder Benzo[b]thienylgruppe) und mit mindestens einem Heteroatom
wie N-, O- oder S-Atom innerhalb des Rings, die gegebenenfalls nicht
substituiert oder mit z.B. einem Halogenatom, einer Niederalkyl-,
Niederalkoxy-, Alkylthio-, Acetylen-, Amino-, Amido-, Carboxyl-, Hydroxyl-,
Aryl-, Aryloxy-, Heterocyclus-, Hetaryl-, substituierten Hetaryl-,
Nitro-, Cyan-, Thiol-, Sulfamidogruppe und dergleichen substituiert
sein kann.
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"Heteroarylgruppe" oder "Hetarylgruppe" betrifft einen Heterocyclus,
bei dem mindestens ein heterocyclischer Ring aromatisch ist.
-
"Substituierte Heteroarylgruppe" betrifft eine Heterocyclusgruppe,
die gegebenenfalls mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen,
z.B. einem Halogenatom, einer Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Alkylthio-,
Acetylen-, Amino-, Amido-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Aryl-, Aryloxy-,
Heterocyclus-, substituierten Heterocyclus-, Hetaryl-, substituierten
Hetaryl-, Nitro-, Cyan-, Thiol-, Sulfamidogruppe und dergleichen,
mono- oder polysubstituiert ist.
-
"Aralkylgruppe" betrifft die Gruppe
-R-Ar, worin Ar eine Arylgruppe ist und R eine Niederalkyl- oder
substituierte Niederalkylgruppe ist. Arylgruppen können gegebe nenfalls
nicht substituiert oder mit z.B. einem Halogenatom, einer Niederalkyl-,
Alkoxy-, Alkylthio-, Acetylen-, Amino-, Amido-, Carboxyl-, Hydroxyl-,
Aryl-, Aryloxy-, Heterocyclus-, substituierten Heterocyclus-, Hetaryl-,
substituierten Hetaryl-, Nitro-, Cyan-, Thiol-, Sulfamidogruppe
und dergleichen substituiert sein.
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"Heteroalkylgruppe" betrifft die Gruppe
-R-Het, worin Het eine Heterocyclusgruppe ist und R eine Niederalkylgruppe
ist. Heteroalkylgruppen können
gegebenenfalls nicht substituiert oder mit z.B. einem Halogenatom,
einer Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Alkylthio-, Acetylen-, Amino-,
Amido-, Carboxyl-, Aryl-, Aryloxy-, Heterocyclus-, substituierten
Heterocyclus-, Hetaryl-, substituierten Hetaryl-, Nitro-, Cyan-,
Thiol-, Sulfamidogruppe und dergleichen substituiert sein.
-
"Heteroarylalkylgruppe" betrifft die Gruppe
-R-HetAr, worin HetAr eine Heteroarylgruppe ist und R eine Niederalkyl-
oder substituierte Niederalkylgruppe ist. Heteroarylalkylgruppen
können
gegebenenfalls nicht substituiert oder mit z.B. einem Halogenatom,
einer Niederalkyl-, substituierten Niederalkyl-, Alkoxy-, Alkylthio-,
Acetylen-, Aryl-, Aryloxy-, Heterocyclus-, substituierten Heterocyclus-,
Hetaryl-, substituierten Hetaryl-, Nitro-, Cyan-, Thiol-, Sulfamidogruppe
und dergleichen substituiert sein.
-
"Cycloalkylgruppe" betrifft eine bivalente
cyclische oder polycyclische Alkylgruppe mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen.
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"Substituierte Cycloalkylgruppe" betrifft eine Cycloalkylgruppe,
die einen oder mehrere Substituenten mit z.B. einem Halogenatom,
einer Niederalkyl-, substituierten Niederalkyl-, Alkoxy-, Alkylthio-,
Acetylen-, Aryl-, Aryloxy-, Heterocyclus-, substituierten Heterocyclus-,
Hetaryl-, substituierten Hetaryl-, Nitro-, Cyan-, Thiol-, Sulfamidogruppe
und dergleichen umfasst.
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"Cycloheteroalkylgruppe" betrifft eine Cycloalkylgruppe,
worin ein oder mehrere der Ringkohlenstoffatome durch ein Heteroatom
(z.B. N-, O-, S- oder P-Atom) ersetzt sind.
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"Substituierte Cycloheteroalkylgruppe" betrifft eine wie
hierin definierte Cycloheteroalkylgruppe, die einen oder mehrere
Substituenten wie ein Halogenatom, eine Niederalkyl-, Niederalkoxy-,
Alkylthio-, Acetylen-, Amino-, Amido-, Carboxyl-, Hy droxyl-, Aryl-,
Aryloxy-, Heterocyclus-, substituierte Heterocyclus-, Hetaryl-,
substituierte Hetaryl-, Nitro-, Cyan-, Thiol-, Sulfamidogruppe und
dergleichen enthält.
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"Alkylcycloalkylgruppe" betrifft die Gruppe
-R-Cycloalkyl, worin Cycloalkyl eine Cycloalkylgruppe ist und R
eine Niederalkyl- oder substituierte Niederalkylgruppe ist. Cycloalkylgruppen
können
gegebenenfalls nicht substituiert oder mit z.B. einem Halogenatom,
einer Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Alkylthio-, Acetylen-, Amino-,
Amido-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Aryl-, Aryloxy-, Heterocyclus-, substituierten
Heterocyclus-, Hetaryl-, substituierten Hetaryl-, Nitro-, Cyan-,
Thiol-, Sulfamidogruppe und dergleichen substituiert sein.
-
"Alkylcycloheteroalkylgruppe" betrifft die Gruppe
-R-Cycloheteroalkyl, worin R eine Niederalkyl- oder substituierte
Niederalkylgruppe ist. Cycloheteroalkylgruppen können gegebenenfalls nicht substituiert
oder mit z.B. einem Halogenatom, einer Niederalkyl-, Niederalkoxy-,
Alkylthio-, Amino-, Amido-, Carboxyl-, Acetylen-, Hydroxyl-, Aryl-,
Aryloxy-, Heterocyclus-, substituierten Heterocyclus-, Hetaryl-,
substituierten Hetaryl-, Nitro-, Cyan-, Thiol-, Sulfamidogruppe
und dergleichen substituiert sein.
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Falls
die erfindungsgemäße 2,6,9-trisubstituierte
Purin-Endverbindung eine basische Gruppe enthält, kann sodann ein Säureadditionssalz
der Zusammensetzung hergestellt werden. Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen
werden in einem Standardverfahren in einem geeigneten Lösungsmittel
aus der Stammverbindung und einem Überschuss an Säure, wie
in nicht begrenzender Weise Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-,
Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Malein-, Bernstein- oder Methansulfonsäure, hergestellt.
Die Chlorwasserstoffsalzform ist besonders geeignet.
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Falls
die 2,6,9-trisubstituierte Purin-Endverbindung eine saure Gruppe
enthält,
können
sodann kationische Salze der Zusammensetzung hergestellt werden.
Typischerweise wird die saure Stammverbindung mit einem Überschuss
eines Alkali-Reagenzes,
wie in nicht begrenzender Weise einem Hydroxid, Carbonat oder Alkoxid,
das das geeignete Kation wie in nicht begrenzender Weise Na+, K+, Ca2+ und NH4 + enthält,
behandelt. Bestimmte Verbindungen bilden innere Salze oder Zwitterionen,
die auch annehmbar sind.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind zum Hemmen der Zellproliferation in Säugern, einschließlich Menschen,
geeignet. Die 2,6,9-trisubstituierten Purine sind zum Beispiel beim
Behandeln von Autoimmunerkrankungen, z.B. rheumatoider Arthritis,
Lupus, Typ I-Diabetes, Multipler Sklerose, etc., beim Behandeln von
Krebs, cardiovaskulärer
Erkrankung wie Restenose, Wirt-Transplantat-Erkrankung, Gicht, polyzystischer Nierenerkrankung
und anderen proliferativen Erkrankungen, deren Pathogenese eine
abnormale Zellproliferation beinhaltet, geeignet.
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Die
Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
umfasst die parenterale und orale Verabreichung einer wirksamen
Menge der ausgewählten
erfindungsgemäßen Verbindung,
vorzugsweise dispergiert in einem pharmazeutischen Träger. Therapeutisch
geeignete Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen werden allgemein
0,01 bis 100 mg/kg betragen, aber werden leicht durch den Fachmann
abhängig
von dem Verabreichungsweg und dem Alter und Zustand des Patienten
bestimmt werden. Therapeutisch geeignete Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen
können
einmal bis zehnmal täglich
oder mehr für
eine akute oder chronische Erkrankung verabreicht werden. Keine
nicht annehmbaren toxikologischen Wirkungen werden erwartet, wenn
die erfindungsgemäßen Verbindungen
erfindungsgemäß verabreicht
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind auch als antiinflammatorische und Antipilzmittel verwendbar.
Als solche sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Behandeln
von inflammatorischen und Pilzinfektionen in Menschen, Tieren und
Pilzinfektionen in Pflanzen geeignet.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder Derivate davon
enthalten, können
als Lösungen
oder lyophilisierte Pulver für
eine parenterale Verabreichung formuliert werden. Pulver können durch
Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels
oder eines anderen pharmazeutisch verträglichen Trägers vor einer Verwendung rekonstituiert
werden. Falls die erfindungsgemäßen Verbindungen
in flüssiger
Form verwendet werden, werden sie vorzugsweise in eine gepufferte,
isotonische, wässrige
Lösung
eingebaut. Beispiele für
geeignete Verdünnungsmittel
sind normale isotonische Kochsalzlösung, 5%ige Standard-Dextrose
in Wasser und gepufferte Natrium- oder Ammoniumacetat-Lösung. Solche
flüssigen Formulierungen
sind für
eine parenterale Verabreichung geeignet, können aber auch für eine orale
Verabreichung verwendet werden.
-
Es
kann erwünscht
sein, Exzipienzien wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose,
Gummi arabicum, Polyethylenglykol, Mannitol, Natriumchlorid, Natriumcitrat
oder jegliches andere dem Fachmann bekannte Exzipienz den pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten,
zuzusetzen. Alternativ dazu können
die pharmazeutischen Verbindungen verkapselt, tablettiert oder in
einer Emulsion oder einem Sirup für eine orale Verabreichung
hergestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche feste oder flüssige Träger können zugesetzt
werden, um die Zusammensetzung zu verbessern oder zu stabilisieren
oder die Herstellung der Zusammensetzung zu erleichtern. Flüssige Träger beinhalten
in nicht begrenzender Weise Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Glycerin, Kochsalzlösung, Alkohole
und Wasser. Feste Träger beinhalten
in nicht begrenzender Weise Stärke,
Laktose, Calciumsulfatdihydrat, Teffa alba, Magnesiumstearat oder
Stearinsäure,
Talk, Pectin, Gummi arabicum, Agar oder Gelatine. Der Träger kann
auch ein Material mit verzögerter
Freisetzung wie in nicht begrenzender Weise Glycerinmonostearat
oder Glycerindistearat, allein oder zusammen mit einem Wachs, beinhalten.
Die Menge an festem Träger
variiert, wird aber vorzugsweise etwa 20 mg bis etwa 1 g pro Dosiseinheit
betragen.
-
Die
pharmazeutischen Dosen werden unter Verwendung herkömmlicher
Techniken wie in nicht begrenzender Weise Vermahlen, Mischen, Granulieren
und Verpressen, falls erforderlich, für Tablettenformen oder Vermahlen,
Mischen und Befüllen
für Hartgelatinekapselformen
hergestellt. Wenn ein flüssiger
Träger verwendet
wird, wird die Zubereitung in der Form eines Sirups, Elixiers, einer
Emulsion oder einer wässrigen oder
nicht wässrigen
Suspension vorliegen. Eine solche flüssige Formulierung kann direkt
verabreicht werden oder in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden.
-
Die
nachstehenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.
Die Beispiele sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung begrenzen,
sondern werden bereitgestellt, um zu zeigen, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen
hergestellt und verwendet werden. In den Beispielen sind alle Temperaturen in
Grad Celsius angegeben. RT bedeutet Raumtemperatur.
-
BEISPIEL 1
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
werden durch herkömmliche
Verfahren der organischen Chemie hergestellt. Die Reaktionssequenz,
die in dem nachstehenden Syntheseschema dargestellt ist, ist ein
allgemeines Verfahren, das für
die Synthese von erfindungsgemäßen Verbindungen
geeignet ist. 2,6-Dichlorpurin wird in Butanol gelöst und das
geeignete R1-Amin wird zugesetzt. Nach mehrstündigem Erhitzen
wird das Reaktionsgemisch abgekühlt
und die Verbindung 1 wird erhalten. Zur Verbindung 1 wird Natriumhydrid
zugesetzt, gefolgt von R2, und Verbindung
2 wird isoliert. Zu der Verbindung 2 wird R3 in
Lösung
mit N-Methylpyrrolidinon zugesetzt. Das Gemisch wird für eine geeignete
Zeitspanne erhitzt, gefolgt von einer Aufreinigung, was zu der gewünschten
Verbindung führt.
-
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Die
nachstehende Verbindung wurde gemäß dem vorstehenden Verfahren
hergestellt.
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Herstellung von 2-Chlor-6-(4-methoxybenzylamino)purin
(1).
-
Das
2,6-Dichlorpurin (4,06 g, 21,5 mmol) wurde in n-Butanol (150 ml)
suspendiert und das 4-Methoxybenzylamin wurde zugesetzt (3,4 ml,
26 mmol). Die Lösung
wurde klar und sodann wenige Minuten später trüb. Die Lösung wurde bei 120°C zwei Stunden
erhitzt und sodann abgekühlt.
Das n-Butanol wurde verdampft, gefolgt von Suspendieren des Rückstands
in einem Gemisch aus Wasser und Diethylether. Eine Lösung von
2 N NaOH (1,3 ml, 26 mmol) wurde zugesetzt und die Lösung 10
Minuten vor einer Filtration gerührt. Das
filtrierte Präzipitat
wurde mit Wasser und einem kleinen Anteil an Ether gewaschen und
sodann unter vermindertem Druck getrocknet. Die Restflüssigkeit
wurde über
Nacht stehen gelassen und mehrere Kristalle wurden am nächsten Tag
gesammelt und mit Diethylether gewaschen. Die Ausbeute betrug 71%.
-
Herstellung von 2-Chlor-6-(4-methoxybenzylamino)-9-isopropylpurin
(2).
-
2-Chlor-6-(4-methoxybenzylamino)purin
wurde in trockenem DMF (5 ml) suspendiert und mit Natriumhydrid,
60%ige Dispersion (82 mg, 2,06 mmol), behandelt. Die Suspension
wurde 30 Minuten gerührt,
währenddessen
sie eine klare gelbe/grüne
Lösung
wurde. 2-Iodpropan (0,280 ml, 1,7 Äq.) wurde über 5 Minuten zugesetzt und
die sich ergebende Lösung
zwei Tage gerührt.
Wasser wurde zugesetzt und die Lösung
mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde verdampft,
um das Produkt Isopropylpurin zu ergeben (Ausbeute von 508 mg, 89%).
-
Herstellung von 2-Diethanolamino-6-(4-methoxybenzylamino)-9-isopropylpurin
(3).
-
Das
Purin (1,65 g, 4,98 mmol) wurde in DMSO (12 ml) und Diethanolamin
(4 ml) gelöst
und sodann bei 140°C
zwei bis drei Tage und sodann bei 160°C einen Tag erhitzt. Die Lösung wurde
abgekühlt
und Wasser-gesättigtes
Butanol wurde zugesetzt (100 ml). Die Lösung wurde sodann mit Wasser
(3 × 50
ml) gewaschen, bevor sie verdampft wurde, um ein braunes Öl zu ergeben.
Der Rückstand
wurde über
Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit Ethylacetat,
gefolgt von 3% Methanol in Ethylacetat, eluiert wurde, um das Produkt
(Ausbeute von 730 mg, 37%) als ein blassgelbes Öl zu ergeben. Die Ausbeute
betrug 37%.
1H-NMR (δ CDCl3): 7,29 (br s, 1H), 7,25 (d, 2H), 6,94 (br
s, 1H), 6,83 (d, 2H), 5,43 (br s, < 2H),
4,63 (br s, 2H), 4,53 (m, 1H), 3,86 (t, 4H), 3,76 (m, 7H), 1,47
(d, 6H).
-
Tabelle
1 identifiziert Verbindungen, die gemäß dem in diesem Beispiel beschriebenen
Syntheseverfahren hergestellt wurden. Diejenigen Verbindungen, die
nicht durch die angehängten
Ansprüche
abgedeckt sind, sind lediglich für
Vergleichszwecke angegeben.
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TABELLE
1 Durch
das Verfahren von Beispiel 1 hergestellte Verbindungen
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-
-
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BEISPIEL 2
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Dieses
Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von erfindungsgemäßen Verbindungen.
Das in diesem Beispiel beschriebene Syntheseverfahren ist lediglich
leicht gegenüber
dem in Beispiel 1 beschriebenen modifiziert.
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-
Die
nachstehende Verbindung wurde gemäß dem vorstehenden Verfahren
hergestellt.
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Herstellung von 2,6-Dichlor-9-isopropylpurin
(4).
-
Zu
einer Lösung
von 0,67 g 2,6-Dichlorpurin in 5 ml trockenem DMF bei Raumtemperatur
wurden 0,16 g (1,1 Äq.)
50%iges Natriumhydrid/Ölpulver
gegeben. Nach Ende der Wasserstoffentwicklung wurde ein großer Überschuss
(2 ml) Isopropyliodid zu der anionischen Lösung gegeben. Diese Reaktionslösung wurde
3 Tage bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit
30 ml Wasser abgestoppt und mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert. Die organischen
Extrakte wurden vereinigt und mit 3 × 50 ml Wasser, gefolgt von
20 ml Kochsalzlösung
rückgewaschen.
Die Ethylacetat-Lösung
wurde über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft. Die Verbindung
wurde einer Flash-Chromatographie mit variablem Gradienten auf Silicagel mit
Hexan/Ethylacetat-Gemischen unterzogen und ergab 0,37 g des gewünschten
N-9-Produkts (45%) und 0,08 g des N-7-Isomers (10%).
-
Herstellung von 2-Chlor-6-anilino-9-isopropylpurin
(5).
-
2,6-Dichlor-9-isopropylpurin
(0,019 g, 0,081 mmol) wurde in Butanol (0,5 ml) gelöst und Anilin
(0,044 ml, 0,244 mmol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde
auf 120°C
10 Stunden erhitzt, abgekühlt, mit
EtOAc verdünnt
und dreimal mit Wasser gewaschen. Das Gemisch wurde über MgSO4 getrocknet und zu einem cremefarbenen Feststoff
konzentriert.
-
Herstellung von 2-Diethanolamino-6-(4-phenylanilino)-9-isopropylpurin
(6).
-
Eine
Lösung
von 67 mg 2,6-Dichlor-N-9-isopropylpurin und 100 mg 4-Phenylanilin
in 1 ml n-Octanol wurde auf 80°C
24 Stunden erhitzt. Das n-Octanol wurde unter vermindertem Druck
entfernt und sodann durch 1 ml 40%iges Diethanolamin in DMSO ersetzt.
Die Lösung
wurde bei 130°C
48 Stunden erhitzt. Die Reaktion wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt, sodann
mit 10 ml Wasser verdünnt
und anschließend
mit Ethylacetat (3 × 30
ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und mit
3 × 20
ml Wasser, gefolgt von 10 ml Kochsalzlösung rückgewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet und gefiltert und das Lösungsmittel
wurde verdampft. Die 65 mg an Rohprodukt wurden aus THF-Ether-Lösung kristallisiert,
um 28 mg reines Produkt (23%) zu ergeben.
-
Die
nachstehende Tabelle 2 identifiziert Verbindungen, die gemäß dem in
diesem Beispiel beschrieben allgemeinen Syntheseverfahren hergestellt
wurden. Diejenigen Verbindungen, die nicht durch die angehängten Ansprüche abgedeckt
sind, sind lediglich für
Vergleichszwecke angegeben.
-
TABELLE
2 Durch
das Verfahren von Beispiel 2 hergestellte Verbindungen
-
-
-
BEISPIEL 3
-
Dieses
Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von erfindungsgemäßen Verbindungen.
Das in diesem Beispiel beschriebene Syntheseverfahren ist lediglich
leicht gegenüber
dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren modifiziert.
-
-
Die
nachstehende Verbindung wurde gemäß dem vorstehenden Verfahren
hergestellt.
-
Herstellung von 2,6-Dichlor-9-isopropylpurin
(4).
-
Das
2,6-Dichlorpurin (5,00 g, 26,46 mmol) wurde in 55 ml trockenem DMF
bei Raumtemperatur suspendiert und mit Natriumhydrid, 60%ige Dispersion
(1,27 g, 31,75 mmol), das portionsweise zugegeben wurde, behandelt.
Nach einstündigem
Rühren
wurde 2-Iodpropan (4,5 ml, 44,98 mmol) zugegeben und die Reaktion
zwei Tage gerührt.
Die Reaktion wurde in Diethylether geschüttet und einmal mit gesättigter
Natriumbicarbonat-Lösung
und einmal mit Wasser gewaschen. Das Gemisch wurde über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert.
Das Konzentrat wurde über
Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit einer 10%igen
Aceton-Lösung
in Dichlormethan eluiert wurde, um das gewünschte N-9-Alkylierungsprodukt
als einen weißen
Feststoff zu ergeben. Die Ausbeute betrug 47%.
-
Herstellung von 2-Chlor-6-(4-methylmercapto)anilino-9-isopropylpurin
(5A).
-
2,6-Dichlor-9-isopropylpurin
(0,15 g, 0,649 mmol) wurde in n-Butanol (4 ml) gelöst und 4-(Methylmercapto)anilin
(0,089 ml, 0,714 mmol) und Triethylamin (0,20 ml, 1,43 mmol) wurden
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 80°C über Nacht erhitzt. Die abgekühlte Reaktion
wurde mit Ethylacetat verdünnt
und einmal mit 1 M HCl, einmal mit gesättigtem Natriumbicarbonat und
einmal mit Kochsalzlösung
gewaschen, bevor sie mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und
unter vermindertem Druck konzentriert wurde. Der Rückstand
wurde über
Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit 2% Methanol in
Dichlormethan eluiert wurde, um das gewünschte Produkt als einen weißen Feststoff
zu ergeben. Die Ausbeute betrug 83%.
-
Herstellung von 2-Diethanolamin-6-(4-methylmercapto)anilino-9-isopropylpurin
(6A).
-
Das
Purin (0,18 g, 0,539 mmol) wurde in N-Methylpyrrolidinon (3 ml)
und Diethanolamin (1 ml) gelöst und
sodann bei 120°C über Nacht
erhitzt. Die abgekühlte
Reaktion wurde in Diethylether geschüttet und dreimal mit Wasser
gewaschen, bevor sie über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck
konzentriert wurde. Der Rückstand
wurde über
Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit 5% Methanol in
Dichlormethan eluiert wurde, um das gewünschte Produkt als einen cremefarbenen
Feststoff zu ergeben. Die Ausbeute betrug 82%.
1H-NMR
(δ, CDCl3): 8,08 (s, 1H), 7,58 (d, 2H), 7,47 (s,
1H), 7,18 (d, 2H), 4,95 (br s, < 2H),
4,52 (m, 1H), 3,94 (m, 4H), 3,83 (m, 4H), 2,43 (s, 3H), 1,47 (d,
6H).
-
Herstellung von 4-(2-Thienyl)benzonitril.
-
Einige
R1'-Gruppen
müssen
zunächst
synthetisiert werden, bevor sie mit dem 2,6-Dichlor-9-isopropylpurin umgesetzt werden.
Diese Gruppen können über verschiedene
Kopplungsverfahren und andere synthetische Verfahren, die dem Fachmann
auf dem Gebiet der organischen Synthese bekannt sind, synthetisiert werden.
-
Zu
einem Druckrohr wurden 4-Brombenzonitril (0,20 g, 1,10 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium
(0) (0,127 g, 0,1 Äq.)
und 2-Thiophenboronsäure
(0,211 g, 1,65 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde unter vermindertem
Druck gespült
und mit trockenem Stickstoffgas dreimal gespült. Nach den Spülgängen wur den
Ethylenglykoldimethylether (5,5 ml) und eine wässrige Natriumcarbonat-Lösung (2,53
ml, 1 M) zu dem Rohr gegeben. Das Rohr wurde sodann dicht verschlossen
und bei 80°C über Nacht
erhitzt. Die abgekühlte Reaktion
wurde mit Diethylether verdünnt
und zweimal mit Wasser gewaschen, bevor sie über Natriumsulfat getrocknet
und unter vermindertem Druck konzentriert wurde. Der Rückstand
wurde über
Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit 10% Ethylacetat
in Hexan eluiert wurde, um das gewünschte Produkt als einen weißen Feststoff
zu ergeben. Die Ausbeute betrug 84%.
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Herstellung von 4-(2-Thienyl)benzylamin.
-
Das
4-(2-Thienyl)benzonitril (0,086 g, 0,464 mmol) wurde in trockenem
Tetrahydrofuran (1,6 ml) gelöst,
bevor Lithiumaluminiumhydrid (0,46 ml, 0,464 mmol, 1 M in THF) tropfenweise
zugegeben wurde. Der Reaktion wurde ermöglicht, über Nacht bei Raumtemperatur
zu rühren.
DSC (5% Methanol in Dichlormethan) zeigte noch verbliebenes Ausgangsmaterial
an. Ein weiteres Äq.
LAH wurde zugegeben. Nach einer zusätzlichen Stunde wurde die Reaktion
durch das Fieser- und Fieser-Verfahren unter Verwendung von Wager
(17,46 μl)
abgestoppt, wobei wässrige
Natriumhydroxid-Lösung
(17,46 μl,
15%ige Lsg.) und Wasser (52,37 μl)
nacheinander zu der Reaktion gegeben wurden. Die Reaktion wurde
sodann mit Diethylether und Wasser verdünnt und zweimal mit Diethylether
extrahiert, bevor sie über
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert
wurde. Der Rückstand
wurde ohne eine jegliche weitere Aufreinigung unverarbeitet weiterverarbeitet.
Die Ausbeute betrug 89%.
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Die
nachstehende Tabelle 3 identifiziert Verbindungen, die gemäß dem in
diesem Beispiel beschriebenen allgemeinen Syntheseverfahren hergestellt
wurden. Diejenigen Verbindungen, die nicht durch die angehängten Ansprüche abgedeckt
sind, sind lediglich für
Vergleichszwecke angegeben.
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TABELLE
3 Durch
das Verfahren von Beispiel 3 hergestellte Verbindungen
-
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BEISPIEL 4
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Dieses
Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von erfindungsgemäßen Verbindungen.
Das in diesem Beispiel beschriebene Syntheseverfahren ist lediglich
leicht gegenüber
dem in Beispiel 1 beschriebenen modifiziert.
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Die
nachstehende Verbindung wurde gemäß dem vorstehenden Verfahren
hergestellt.
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Herstellung von 2-Amino-6-chlor-9-methylpurin
(7).
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Das
2-Amino-6-chlorpurin (1,08 g, 6,4 mmol) wurde in trockenem DMF (75
ml) suspendiert und mit Natriumhydrid, 60%ige Dispersion (0,28 g,
7 mmol), behandelt. Die Suspension wurde 15 Minuten gerührt, bevor Iodmethan
(0,44 ml, 7,06 mmol) zugesetzt wurde, und die sich ergebende gelbe
Lösung
eine Stunde 45 Minuten gerührt
wurde. Der Feststoff wurde filtriert und das Filtrat vor einer Zugabe
von Wasser 10 Minuten verdampft. Der sich ergebende Feststoff wurde
filtriert und über
Nacht getrocknet, um das Produkt als ein Gemisch der N-7- und N-9-Alkylierungsprodukte
zu ergeben. Die Restflüssigkeit
wurde über
Nacht stehen gelassen und weitere Kristalle wurden am nächsten Tag
gesammelt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 77%.
-
Herstellung von 6-Chlor-2-(2-methoxyacetylamino)-9-methylpurin
(8).
-
Das
Gemisch von Isomeren aus dem Vorstehenden wurde in Dichlormethan
und Pyridin (2 Äq.)
gelöst, gefolgt
von der Behandlung mit Methoxyacetylchlorid (4 Äq.). Die Reaktion wurde bei
Raumtemperatur bis zum Abschluss gerührt. Die Reaktion wurde verdampft
und durch einen Stopfen von Silicagel filtriert, wobei mit 2% Methanol
in Dichlormethan eluiert wurde, gefolgt von einer Aufreinigung auf
einem Chromatotron unter Verwendung von Silicagel und Elution mit
2% Methanol in Dichlormethan, um das gewünschte Produkt zu isolieren.
Die Ausbeute betrug 31%.
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Die
Tabelle 4 identifiziert Verbindungen, die gemäß dem in diesem Beispiel beschriebenen
Syntheseverfahren hergestellt wurden.
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TABELLE
4 Durch
das Verfahren von Beispiel 4 hergestellte Verbindungen
-
BEISPIEL 5
-
Dieses
Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von erfindungsgemäßen Verbindungen.
Das in diesem Beispiel beschriebene Syntheseverfahren ist lediglich
leicht gegenüber
dem in Beispiel 1 beschriebenen modifiziert.
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Die
nachstehende Verbindung wurde gemäß dem vorstehenden Verfahren
hergestellt.
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Herstellung von 2-Chlor-6-(4-phenylbenzylamino)purin
(9).
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Das
2,6-Dichlorpurin (5,0 g, 26,45 mmol) wurde in n-Butanol (50 ml)
suspendiert und das 4-Phenylbenzylamin (6,61 g, 29,1 mmol) und Triethylamin
(4,1 ml, 29,1 mmol) wurden zugegeben. Die Lösung wurde bei 120°C über Nacht
erhitzt, sodann abgekühlt.
Das Produkt wurde unter Verwendung eines Überschusses von n-Butanol abfiltriert
und das Präzipitat
wurde mit 100 ml 1 M HCl und 200 ml Wasser gewaschen. Der Feststoff
wurde unter vermindertem Druck über
Nacht bei 70°C
getrocknet, um das gewünschte
Produkt als einen leichtgelben Feststoff zu ergeben. Die Ausbeute
betrug 99%.
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Herstellung von 2-Diethanolamino-6-(4-phenylbenzylamino)purin
(10).
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Das
2-Chlor-6-(4-phenylbenzylamino)purin (2,0 g, 5,96 mmol) wurde mit
Diethanolamin (11,4 ml, 119,2 mmol) und N-Methylpyrrolidinon (10
ml) gemischt und bei 120°C über Nacht
erhitzt. Die abgekühlte
Reaktion wurde in Dichlormethan geschüttet und zweimal mit Wasser
gewaschen. Die organische Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert, um das gewünschte Produkt als
einen blassgrünen
Feststoff zu ergeben, der weiter in einem Vakuumofen bei 70°C 2 Tage
getrocknet wurde.
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Herstellung von 2-Diethanolamino-6-(4-phenylbenzylamino)-9-methylpurin
(11).
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Das
2-Diethanolamino-6-(4-phenylbenzylamino)purin (0,050 g, 0,124 mmol)
wurde in trockenem DMF gelöst
und mit Natriumhydrid, 60%ige Dispersion (5,5 mg, 0,136 mmol), eine
Stunde behandelt. Iodmethan (0,009 ml, 0,148 mmol) wurde zugegeben
und die sich ergebende Lösung
wurde bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt.
Die Reaktion wurde in Diethylether geschüttet und zweimal mit gesättigter
Natriumbicarbonat-Lösung
gewaschen, bevor sie über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert
wurde. Der Rückstand
wurde über
Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit 5% Methanol in
Dichlormethan eluiert wurde, um das Produkt als einen weißen Feststoff
zu ergeben. Die Ausbeute betrug 63%.
1H-NMR
(δ, CDCl3): 7,55 (m, 4H), 7,41 (m, 4H), 7,35 (m,
4H), 6,41 (br s, < 1H),
5,10 (br s, < 2H),
4,72 (br s, 2H), 3,86 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 3,59 (s, 3H).
-
Die
Tabelle 5 identifiziert Verbindungen, die gemäß dem in diesem Beispiel beschriebenen
Syntheseverfahren hergestellt wurden. Diejenigen Verbindungen, die
nicht durch die angehängten
Ansprüche
abgedeckt sind, sind lediglich für
Vergleichszwecke angegeben.
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TABELLE
5 Durch
das Verfahren von Beispiel 5 hergestellte Verbindungen
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BEISPIEL 6
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Erfindungsgemäße Verbindungen
wurden in den nachstehenden Tests bewertet.
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CDK2-Tests:
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Erfindungsgemäße Verbindungen
wurden untersucht, um deren CDK2-inhibitorische Aktivität zu bestimmen.
Das Testsystem (Gesamtvolumen von 50 μl) enthielt 50 mM Tris-HCl,
pH-Wert von 7,4, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT,
1 μg Histon
H1, 30 μM
ATP (1 μCi γ32P-markiertes
ATP), 10 μg
BSA und 1 ng aufgereinigte CDK2. Nach 30-minütiger Inkubation bei 30°C wurde die
Reaktion durch die Zugabe von 10 μl
10%iger TCA abgestoppt und die Proben wurden auf Nitrocellulose-Filter
geblottet. Diese Filter wurden ausgiebig in 10% TCA gewaschen und
hinsichtlich Radioaktivität
untersucht. Negativ-Kontrollen enthielten kein Enzym. Um die Wirksamkeit
verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen
zu ermitteln, wurden die Verbindungen zu dem vorstehenden Test bei
Konzentrationen von 100 bis 0,02 μg/ml
gegeben. Nach 30-minütiger
Inkubation wurden die Teströhrchen
wie vorstehend weiter behandelt. In allen Tests wurden verschiedene
Konzentrationen an Olomoucin zugegeben und wurden als eine Standard-Positiv-Kontrolle
verwendet. Der in Tabelle 6 aufgeführte IC50-Wert
(Enzym) ist als die Konzentration definiert, die benötigt wird,
um die CDK2-Aktivität
um 50% zu hemmen.
-
BEISPIEL 7
-
Zellproliferationstests:
-
Glatte
Muskelzellen von Rattenaorta in einer frühen Passage (CV Therapeutics
Zell-Lager) wurden
in 48-Well-Platten (Falcon, ml/Well) bei einer Dichte von 20000
Zellen/ml an DME, das 5% Hitze-inaktiviertes Rinderserum enthielt,
ausgebracht. Die Zellen wurden in einem Standard-Gewebe-Kultur-Inkubator
48 Stunden inkubiert. Das Medium wurde aufgesogen und die Wells
wurden mit 0,2 ml frischem Medium aufgefüllt. Erfindungsgemäße Verbindungen
wurden bei Konzentrationen von 100 bis 0,37 μg/ml zugegeben. Nach 48-stündiger Inkubation
wurde das Medium aufgesaugt und die Kulturen wurden mit 0,2 ml Kochsalzlösung und
0,25 μl
Phenazinmethosulfat-Lösung
mit MTS behandelt (Cell Titer 96®, wässriger
nicht radioaktiver Zellproliferationstest-Kit, Katalog # G 5430,
Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711-5399). Der in
Tabelle 6 aufgeführte
IC50-Wert Zellen ist als die Konzentration
definiert, die benötigt
wird, um die Zellproliferation um 50% zu hemmen. Olomoucin wurde
bei verschiedenen Konzentrationen zugegeben und wurde als eine Standard-Positiv-Kontrolle
verwendet. Die Tabelle 6 gibt die Bioaktivität ausgewählter erfindungsgemäßer Beispiele an,
wobei diejenigen Verbindungen, die nicht durch die angehängten Ansprüche abgedeckt
sind, lediglich zu Vergleichszwecken getestet wurden.
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-
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Die
Zellproliferations-Hemmungseigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen
werden durch deren Fähigkeit,
die Zellproliferation in einem Bereich von etwa 0,05 μg/ml bis
100 μg/ml,
vorzugsweise weniger als 0,5 μg/ml,
zu hemmen, gezeigt.
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BEISPIEL 7
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Eine
erfindungsgemäße Verbindung
wurde hinsichtlich der Wirksamkeit unter Verwendung des Mäuse-Leukämie-Modells
bewertet. Das Mäuse-Leukämie-Modell
ist ein Standardmodell, das bei der Bewertung von Antitumormitteln
verwendet wird. CDF1-Mäusen
wurden ip L1210-Zellen (1 × 103 Zellen/Maus) injiziert. 24 Stunden später wurden
diese Mäuse
mit verschiedenen Dosen (ip) an Verbindung 3 des Beispiels 1 in
Kochsalzlösung
behandelt. Der in dieser Untersuchung verwendete Dosisplan ist in
der nachstehenden Tabelle 7 beschrieben. Mäuse wurden mit der Verbindung
3 täglich
oder an abwechselnden Tagen dosiert. Kontrollmäuse erhielten Kochsalzlösung. Nach
7 Tagen wurde die Dosierung abgestoppt und das Überleben beobachtet.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass Ratten, denen Verbindung 3 verabreicht worden
war, länger überlebten als
die Kontrollratten.
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BEISPIEL 8
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Dieses
Beispiel maß die
Wirkung einer akuten lokalen Zufuhr von Verbindung 3 von Beispiel
1 beim Vermindern einer Neointima-Bildung nach einer Ballon-Angioplastie
in dem Ratten-Karotis-Arterienmodell. In diesem Beispiel wurden
die linken gemeinsamen Karotisarterien von erwachsenen männlichen
Ratten (n = 10 pro Experimentgruppe) chirurgisch unter Verwendung
eines Fogarty-Arterien-Embolektomie-Katheders verletzt. Sofort nach
der Verletzung wurde die gemeinsame Karotis-Arterie mit einer Gefäßklemme
halbiert, wodurch ein nicht behandeltes und ein behandeltes Segment
erzeugt wurden. Ein Arzneimittelzufuhrkatheder wurde sodann in die
distale Hälfte
der gemeinsamen Karotis eingeführt.
Nach einer Arzneimittelzufuhr wurde der Katheder entfernt und ein Überschuss
an Arzneimittel wurde durch Entfernen der Gefäßklemme und Wiederherstellung
des Blutflusses ausgewaschen, bevor die Arterie geschlossen wurde.
Den Tieren wurde ermöglicht,
sich 14 Tage zu erholen, bevor die gemeinsame Karotis-Arterie entnommen
wurde. Das entnommene Gewebe wurde unterteilt und der Neointimal-Bereich
wurde mit einem Computer-Planimetrie-System digitalisiert und vermessen.
Für jedes
Tier wurden 15 Messungen für
das nicht behandelte Segment und 15 für das behandelnde Segment gemittelt.
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Die
Ergebnisse dieses Beispiels sind in 1 dargestellt.
Gemäß 1 verminderte
eine Verabreichung von Verbindung 3 von Beispiel 1 an eine geschädigte Karotis-Arterie
die Neointimal-Fläche
um etwa 88% im Vergleich zu der 6%igen Verminderung, die durch den
Kochsalzträger
allein erzeugt wurde.
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BEISPIEL 9
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IκB-α-Kinase-Tests:
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Erfindungsgemäße Verbindungen
wurden untersucht, um deren inhibitorische Aktivität auf IκB-α-Kinase zu
bestimmen. Die menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzelllinie (HUVEC),
die in diesen Untersuchungen verwendet wurde, wurde von Clonetics
(San Diego, CA) bezogen und wurde in Endothelzellwachstumsmedium,
ergänzt
mit 2% fötalem
Rinderserum, 10 ng/ml menschlichem rekombinantem Epidermis-Wachstumsfaktor,
1 μg/ml
Hydrocortison, 50 μg/ml
Gentamicin, 50 ng/ml Amphotericin B und 12 μg/ml Rinderhirnextrakt, bei
37°C in
einem Gewebekulturinkubator gehalten. Alle Wachstumsmedien und Zusätze wurden
von Clonetics (San Diego, CA) bezogen. E. coli-Lipopolysaccharid
(LPS) Serotyp 0111:B4 wurde von Sigma (Saint Louis, MI) bezogen.
Alle anderen Chemikalien wiesen Reagenzgüte auf.
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Herstellung
von Zell-Lysat: Monoschichten (75 cm2) an
HUVEC-Zellen wurden mit LPS (100 ng/ml) 5 Minuten behandelt, wonach
das Zellmedium schnell entfernt wurde und die Monoschicht dreimal
mit eiskaltem PBS gewaschen wurde. Die Zellschicht wurde in 10 ml
PBS abgeschabt und die Zellen durch Zentrifugation (3000 UpM, 5
Minuten, 4°C)
pelletiert. Ein Zell-Lysat wurde dadurch hergestellt, dass das Zell-Pellet
in 0,2 ml Lyse-Puffer (20 mM HEPES, pH-Wert von 7,3, 50 mM NaCl,
10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Natriumorthovanadat,
10 mM β-Glycerophosphat,
1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Dithiothreitol, 0,5% Nonidet
P-40) 15 Minuten bei 37°C
unter häufigem
Vortexen inkubiert wurde. Zelltrümmer
wurden von der Probe durch Mikrozentrifugation (10000 × g, 15
Minuten, 4°C)
entfernt und der Überstand
wurde durch die Zugabe von 100 ml einer Suspension von Sepharose
4B in Lyse-Puffer und vorsichtiges Mischen für eine Stunde bei 4°C "vorgeklärt". Die Sepharose 4B-Kügelchen
wurden durch Mikrozentrifugation entfernt und der Überstand aliquotiert
und bei –80°C gelagert.
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Festphasen-IκB-α-Kinase-Test:
1 μg GST-IκB-α, das dem
Volllängen-IκB-α von menschlichem
Ursprung entsprach (Santa Cruz Biotechnology), wurde mit 20 μl einer 50%igen
Aufschlemmung von Glutathion S-Sepharose 4B (Pharmacia) in Reak tionspuffer
(20 mM HEPES, pH-Wert von 7,3, 10 mM MgCl2,
15 mM β-Glycerophosphat,
0,5 mM Natriumorthovanadat, 0,5 mM EGTA) 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Der GST-IκB-Kügelchen-Komplex
wurde dreimal mit 0,5 ml Reaktionspuffer durch erneutes Suspendieren
und Mikrozentrifugation gewaschen. 10 μg HUVEC-Zell-Lysat-Protein in
100 μl Reaktionspuffer
wurden sodann zu dem GST-IκB-Kügelchen-Komplex
gegeben und das Gemisch wurde unter leichtem Mischen bei 4°C eine Stunde
inkubiert. Der Kügelchen-Komplex
wurde sodann dreimal mit Reaktionspuffer, der 0,2 M NaCl enthielt, und
einmal mit Reaktionspuffer allein gewaschen. Schließlich wurde
der Kügelchen-Komplex
wieder in 20 μl Reaktionspuffer
mit 5 μCi
[γ-32P]ATP (> 5000
Ci/mmol, New England Nuclear Corp. Boston, MA) suspendiert und bei
Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die
Zugabe von 10 μl
SDS-PAGE-Probenpuffer abgestoppt und vor einer Auftrennung durch
SDS-PAGE (10–20%
Gradient Readygel, BioRad) drei Minuten gekocht. Nach der Elektrophorese
wurde das Gel 15 Minuten fixiert (50% Methanol, 10% Essigsäure), dreimal
jeweils 5 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 5%
Glycerin 15 Minuten behandelt, bevor es getrocknet und einem Film
für eine
Audioradiographie (X-OMAT XAR-5 Kodak) ausgesetzt wurde.
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In-Gel-Kinase-Test:
IκB-α-Isoenzyme
wurden hinsichtlich einer Aktivität unter Verwendung einer Modifikation
von vorveröffentlichten
Verfahren untersucht (11, 19, 20). Kurz gesagt, wurden Duplikat-Proben
des IκB-Glutathion
Sepharose 4B-Kügelchen-Komplexes
wie vorstehend beschrieben hergestellt und durch Elektrophorese
durch ein 12%iges SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, das in Gegenwart von
15 μg/ml
GST-IκB-α polymerisiert
worden war. Nach der Elektrophorese wurde das Gel vorsichtig zweimal
30 Minuten mit jeweils 50 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0,
5 mM β-Mercaptoethanol,
20% Isopropanol gewaschen, um SDS zu entfernen. Die Proteine wurden
sodann innerhalb des Gels durch 45-minütige Inkubation in 100 ml 50
mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,04% Tween
40 denaturiert. Das Gel wurde sodann halbiert, um die Duplikatproben
zu trennen, eine Hälfte
wurde in 10 ml Reaktionspuffer alleine inkubiert und die andere
Hälfte
wurde in 10 ml Reaktionspuffer mit 10 μg/ml 2-Diethanolamino-6-(4-phenylanilino)-9-isopropylpurin
(Verbindung 6 von Beispiel 2) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert,
dem 10 μCi
[γ-32P]ATP zugegeben worden war, und die Inkubationen
wurden eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Gele
wurden sodann mehreren 15-minütigen
Waschgängen
von jeweils 100 ml 5%iger Trichloressigsäure mit 1% Natriumpyrophosphat
unterzogen, bis 1 ml an Waschlö sung
eine Radioaktivität
ergab, die nahe an der Hintergrundsradioaktivität lag. Die Gele wurden sodann
getrocknet und für
eine Audioradiographie einem Film ausgesetzt.
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Herstellung
von 2-Diethanolamino-6-(4-phenylbenzylamino)-9-isopropylpurin-Epoxy-aktivierter
Sepharose 6B-Affinitätsmatrix.
Gefriergetrocknete Epoxy-aktivierte Sepharose 6B (Pharmacia LKB,
Piscataway, NJ) wurde für
die Kopplungsreaktion aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Ether-Bindung
zwischen einem hydroxylhaltigen Liganden und der Epoxidgruppe auf
der Sepharose auszubilden, ausgewählt. Das Gel wurde gemäß den Herstellerangaben
gequollen, (100 mg) Verbindung 6 von Beispiel 2 wurden in 1 ml Kopplungslösung (1,2:1
v/v Dimethylformamid:0,1 N NaOH) gelöst und mit 0,5 ml gequollenem
Gel bei einem pH-Wert von 10–11 72
Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln gemischt. Ein Überschuss
an reaktiven Gruppen wurde mit 1 M Ethanolamin vier Stunden bei
50°C geblockt
und die Gel-Aufschlemmung
wurde in eine 1 ml-Spritzensäule
geschüttet.
Das Harz wurde mit drei abwechselnden Zyklen von jeweils 20 Säulenvolumina an
Puffern mit einem pH-Wert von 4,0 (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl) und
pH-Wert von 8,0 (0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl), gefolgt von 20 Säulenvolumina
Reaktionspuffer (20 mM HEPES, pH-Wert
von 7,3, 10 mM MgCl2, 15 mM β-Glycerophosphat,
0,5 mM Natriumorthovanadat, 0,5 mM EGTA) aktiviert. Die Säule wurde
bei 4°C
in Reaktionspuffer mit 0,5% Natriumazid gelagert und vor jeder Verwendung
mit sich abwechselnden Zyklen bei niedrigem und hohem pH-Wert, wie
vorstehend beschrieben, regeneriert.
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Aktiviertes
HUVEC-Zell-Lysat (500 μg
Protein in 1 ml Reaktionspuffer) wurde über die CVT-1545-Sepharose-Matrix
nacheinander fünfmal
geleitet und der Durchfluss wurde aufgefangen (nicht gebundenes
Material). Die Matrix wurde sodann dreimal mit 1 ml Reaktionspuffer
(Waschgänge
1–3),
sodann dreimal jeweils mit Reaktionspuffer mit 0,5 M NaCl (Eluat
1–3) gewaschen.
Aliquots (20 μl
von 1 ml) jeder Probe wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
an den GST-IκB-Sepharose-Kügelchen-Komplex
zu phosphorylieren, untersucht und durch SDS-PAGE, wie vorstehend
beschrieben, analysiert.
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Test
einer Affinitäts-angereicherten
IκB-α-Kinase.
Die gesammelten 0,5 M NaCl-Eluate
von der Affinitätsmatrix
wurden als die Quelle des Enzyms für die Entwicklung eines IκB-α-Kinase-Filtertests
verwendet. Jede Reaktion enthielt Affinitäts-angereicherte IκB-α-Kinase (1 μg Protein),
10 ng GST-IκB-α-Kinase und
0,5 μCi
[γ32P]ATP (> 5000
Ci/mmol, New England, Nuclear Corp., Boston, MA) in 20 μl Reakti onspuffer.
Die Reaktion wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und durch
die Zugabe von 2 μl
0,5 M EDTA abgestoppt. Reaktionsgemische wurden auf Phosphocellulose-Scheiben
(Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) geblottet und die
Filter wurden dreimal mit 0,15 M Phosphorsäure unter vorsichtigem Schütteln 15
Minuten gewaschen (bis zu zehn Filter wurden mit 300 ml 0,15 M Phosphorsäure gewaschen).
Nach einem dritten Waschgang wurden die Filter luftgetrocknet, zu
einer Szintillationsflüssigkeit
gegeben und durch Flüssigszintillationsspektrometrie
untersucht.
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Elektrophoretischer
Mobilitätsverschiebungs-Test:
Kernextrakte wurden unter Verwendung eines Hochsalzpuffer-Extraktionsverfahrens
hergestellt. 10 pmol doppelsträngiges
NF-κB-Konsensus-Oligonukleotid
(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') (Promega) wurden
mit 5 μCi
[γ-32P]ATP (> 5000
Ci/mmol, New England Nuclear Corp., Boston, MA) durch Inkubation
mit T4-Polynukleotid-Kinase eine Stunde bei 37°C 5'-endmarkiert. Nicht eingebaute Nukleotide
wurden dadurch entfernt, dass das Reaktionsgemisch über 1 ml Sephadex
G-5-Spinsäulen
geleitet wurde. Bindungstests erfolgten bei Raumtemperatur für eine Stunde
und bestanden aus 10 μg
Nuklearextraktprotein, 1 μg
Lachs-Sperma-DNA und 5 × 104 cpm an 32P-markiertem
Konsensus-Oligonukleotid mit und ohne der 50fachen Menge an nicht
markiertem Oligonukleotid. DNA-Protein-Komplexe wurden durch 8%ige
nicht denaturierende Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese aufgetrennt,
die Gele wurden auf einem Filterpapier getrocknet und durch Audioradiographie
sichtbar gemacht. Die Tabelle 8 zeigt die Enzymaktivität ausgewählter erfindungsgemäßer Beispiele
an, wobei diejenigen Verbindungen, die nicht von den angehängten Ansprüchen abgedeckt
sind, lediglich zu Vergleichszwecken getestet wurden.
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