PL189775B1

PL189775B1 - 2,6,9-tripodstawiona pochodna puryny, jej zastosowanie i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL189775B1
Application number: PL97331408A
Authority: PL
Inventors: Robert T. Lum; Cheri Lynn Blum; Richard Mackman; Michael M. Wick; Steven R. Schow
Original assignee: Cv Therapeutics
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2005-09-30
Also published as: KR100403336B1; AU731778B2; CN1231611A; KR20000029781A; PL331408A1; NZ334061A; DE69733674T2; JP2000515550A; EP1021186A1; HK1020884A1; TR199900683T2; CN1161356C; NO323775B1; EP1021186B1; RU2220968C2; CZ33899A3; CZ299381B6; CA2262454C; ATE298572T1; IL128323A0

Abstract

1. 2,6,9-Tripodstawiona pochodna puryny o wzorze (i; w którym R1 oznacza atom chloru, grupe dietanoloaminowa, 4-chlorofenylometyloaminowa, (4-metylofenylo)- metyloaminowa, (2,4-dichlorofenylo)metyloaminowa, (3-metylofenylo)metyloaminowa,(4-trifluorometylofenylo)- -metyloaminowa (3,5-bis-trifluorometylofenylo)metyloaminowa, (3-chlorofenylo)metyloaminowa, (2-trifluoro- metylofenylo)metyloaminowa, (4-chloro-3-trifluorometylofenylo)metyloaminowa, (3-chlorofenylo)metyloami- nowa, (2-chlorofenylo)metyloaminowa, (2,5-difluorofenylo)metyloaminowa, ( 1-naftylo)metyloaminowa, (2-chlo- ro-5-trifluorometylofenylo)metyloaminowa, 4-fluorofenylometyloaminowa, 4-etoksyfenylometyloaminowa, (4-fenylofenylo)-aminowa, (4-fenylofenylo)metyloaminowa, 3-fenoksyfenylo-3-benzyloksyfenylowa, (4-sulfo- namidofenylo)metyloaminowa, benzyloaminowa, 4-metoksybenzyloaminowa, 4-chlorobenzyloksy, etanolo- aminowa, 4-chlorobenzyloaminowa, cykloheksylometyloaminowa, piperonyloaminowa, anilinowa, 4-fenylo- anilinowa, 4-fenylobenzyloaminowa, 4-(2-(tiofenylo)benzyloaminowa, 4-(4-metylofenylo)benzyloaminowa, 4-(4-trifluorometylofenylo)benzyloaminowa, 4-tiometoksyanilinowa, 3-(4-nitrylofenylo)anilinowa, 4-(2-piry- dynylo)benzyloaminowa, 4-bromoanilinowa, 4-(3-metoksyfenylo)benzyloaminowa, 4-(4-metoksyfenylo)- benzyloaminowa; PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest 2,6,9-tripodstawiona pochodna puryny, jej zastosowanie i kompozycja farmaceutyczna. Stwierdzono, że związki według wynalazku są selektywnymi inhibitorami kinazy cyklu komórkowego i, jako takie, związki te są inhibitorami proliferacji komórek. 2,6,9-Tripodstawione puryny są użyteczne, na przykład, w leczeniu autoimmunologicznych chorób, np. reumatoidalnego zapalenia stawów, toczenia, cukrzycy typu I, stwardnienia rozsianego, itp., w leczeniu raka, choroby sercowo-naczyniowej, takiej jak nawrót zwężenia, reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, skazy moczanowej, torbielowatości nerek i innych chorób proliferacyjnych, których patogeneza wywołuje nienormalną proliferację komórkową.

Wynalazek dotyczy także 2,6,9-tripodstawionych puryn, dla których stwierdzono, że są silnymi i specyficznymi inhibitorami kinazy IkB-α, która zapobiega sygnałowi wywołującemu NF-kB aktywację i syntezę cytokiny in vitro i in vivo. Oczekuje się, że takie inhibitory hamować będą syntezę cytokiny i adhezję białek, których synteza jest transkrypcjonalnie regulowana przez NF-kB. Regulujące stany zapalne cytokiny, takie jak IL-1, IL-6, TNF i białka adhezyjne (np. ICAM, VCAM i selekcje) należą do tej klasy cząsteczek i związane są z patogenezą chorób zapalnych. A więc, silny inhibitor kinazy NF-kB jest użyteczny w klinicznym prowadzeniu leczenia chorób, w których jest wymagana aktywacja NF-kB dla wywołania choroby.

W ostatnich kilku latach, postępy w biologii molekularnej i komórkowej przyczyniły się do zrozumienia mechanizmów proliferacji komórkowej i specyficznych procesów, które za4

189 775 chodzą podczas progresji komórek podczas mitozy. Np.„Progress in Cell Cycle Research” tom 1, Wyd. L.Meijer, S. Guidet i H.Y.L. Tung; Plenum Press, Nowy Jork, 1995. Badania te wykazały, że progresja zachodząca w cyklu komórkowym jest regulowana przez rodzinę kinaz seryna/treonina nazywanych kinazami zależnymi od cyklin. Enzymy te zawierają (a) katalityczne białko nazywane kinazą zależną od cyklin (CDK), która stosuje ATP jako substrat i (b) białko regulacyjne nazywane cykliną. Różne kombinacje cyklina-CDK regulują procesy takie jak wzrost, replikacje DNA i podział komórek. Jednym z kluczowych członów enzymów z rodziny CdK jest CDK2. Okazało się, że aktywność CDK2 jest istotna dla progresji cyklu komórkowego na granicy G1/S. Mikroiniekcja przeciwciał skierowanych przeciwko CDK2 blokuje progresję ludzkich fibroblastów diploidalnych w fazie S cyklu komórkowego. Ekspresja ujemnego mutanta dominantowego CDK2 w komórkach ludzkiego kostniakomięsaka ma podobny skutek. Wspólne badania ukazały, że hamowanie aktywności komórkowej CDK2 będzie zapobiegać progresji komórek za pośrednictwem cyklu mitotycznego i wywoływać zatrzymanie wzrostu przed fazą S. Zgodnie z tym poglądem, badania in vitro przeprowadzone z olomoucyną, [2-(hydroksyetyloamina)-6-benzyloamino-9-metylopuryna], wykazały, że jest ona specyficznym inhibitorem CDK2 o IC50 wynoszącym w przybliżeniu 2,1 pg/ml (J. Vesely i wsp.; Eur. J.Biochem 224, 771-786 (1994), L. Meijer „Chemical Iiihibitors of CyclinDependent Kinases” str. 351-356 w „Progress in Cell Cycle Research” tom 1, Wyd. L. Meijer,

S. Guidet i H.Y.L. Tung; Plenum Press, Nowy Jork, 1995. Badania in vivo z zastosowaniem hodowli ludzkich komórek wykazały, że olomoucyna hamuje proliferację komórkową w stężeniu wynoszącym w przybliżeniu 50 pg/ml.

W niniejszym wynalazku opracowano szereg związków, których aktywność biologiczna jest znacząco silniejsza niż olomoucyny. Badania in vivo z zastosowaniem ludzkich komórek wskazują, że niektóre z ujawnionych związków hamują proliferację komórkową w stężeniach, które są znacząco niższe niż olomoucyny.

Ostatnio opisano aktywność kinazy w cytoplazmie pobudzonych ludzkich śródbłonkowych komórek z żyły pępowinowej (Bennett i wsp., (1996) J. Biol.Chem 271, 19680-19688). Niektóre związki według wynalazku zostały zidentyfikowane jako silne i specyficzne inhibitory kinazy IkB-α, która zapobiega indukowanej sygnałem aktywacji NF-kB i syntezie cytokiny in vitro i in vivo. Aktywacja czynnika heterodimerowej transkrypcji NF-kB jest procesem złożonym. W niepobudzonych komórkach, heterodimer NF-kB (p50/p65) jest umieszczony w cytosolu, w którym jest on skompleksowany z hamującą podjednostką IkB-α, IkB-α wiąże się z NF-kB, i w ten sposób maskuje jądrową lokalizację sygnału i zapobiega translokacji do jądra. Po pobudzeniu komórek za pomocą różnych sygnałów (np. lipolisacharyd) IkB-α jest szybko fosforylowana, uwalniana i rozkładana przez proteasom. Rozkład IkB-α dopuszcza przemieszczenia NF-kB do jąder, gdzie aktywuje ona transkrypcję szeregu genów bodźców zapalnych.

Obserwacje te sugerują, że kinaza IkB-α jest atrakcyjnym celem dla identyfikacji inhibitorów, które mogą być użyteczne w leczeniu chorób zapalnych, w którym jest wymagana aktywacja NF-kB dla wywołania choroby.

Celem wynalazku jest zapewnienie 2,6,9-tripodstawionych związków purynowych, które hamują zależną od cykliny kinazę 2.

Innym celem wynalazku jest zapewnienie 2,6,9-tripodstawionych związków purynowych, które są użyteczne w hamowaniu proliferacji komórkowej.

Przedmiotem wynalazku jest 2,6,9-tripodstawiona pochodna puryny o wzorze (I)

r₂ w którym

R1 oznacza atom chloru, grupę dietanoloaminową, 4-chlorofenylometyloaminową, (4-metylofenylo)metyloaminową, (2,4-dichlorofenylo)metyloaminową, (3 -metylofenylo)metyloaminową,

189 775 (4-trifluorometylofenylo)metyloaminową, (3,5-bis-trifluorometylofenylo)metyloaminową (3-chlorofenylo)metyloaminową, (2-trifluorometylofenylo)metyloaminową, (4-chloro-3-trifluorometylofenylo)metyloaminową, O-chlorofenylojmetyloćaminową, (2-chlorofenylo)-metyloammową, (2,5-difluorofeoylo)metyloammową, (1 -naftylo)metyloaminową, (2-chloro-5-trifluorometylofenylo)metyloamioową, 4-fluorofenylomctyloiU'ninową, 4-metoksyfenylometyloaminową, (4-feoylofeoylo)amioową, (4-fenylofenylo)metyloaminową, 3-fenoksyfenylo-3-benzyloksyfenylową, (4-sulfonamidofenylo)metyloaminową, beozyloamioową, 4-metoksybeozyloammową, 4-chlorobenzyloksy, etanoloaminową, 4-chlorobenzyloaminową, cykloheksylometyloaminową, piperonyloaminową, anilinową, 4-fenyloanilinową, 4-fenylobenzyloamino-wą, 4-(2-(tiofenylo)benzyloamioową, 4-(4-metylofenylo)benzyloaminową, 4-(4-trifluorometyiofenylo)benzyloaminową, 4-tiomet.oksyaniHnową, 3-(4-nitrylofenylo)anilinową, 4-(2-pirydynylo)benzyioamjnową, 4-bromoanilinową, 4-(3-metoksyfenylo)beiwyoittmnowią 4-(4-metoksyfenylo)benzyloaminową;

R2 oznacza atom wodoru, izopropyl, perfluoroizopropyl, metyl, trifluorometyl, 2-metylopropyl, izobutyl, benzyl, hydroksyetyl, 3-cyjaoopropyl, 3-chloropropyl, metylo-4-karboksybenzyl, naftaloiloetyl, 2-okso-3-buityl;

R3 oznacza atom chloru, grupę 4-metoksybenzyloaminowią 2-aminoetyloaminową, (4-metylomerkapto)anilinową, 4-feoylobenzyloiamnową, etanoloaminową, dietanoloaminową, 2-(N2-dimetyloamino)-N 1 -benzyloetyloaminową, 1 -hydroksymetylo^-metylopropyloaminową, 1 -hydroksymetylo-etyloaminową, 2-hydroksyetyloaminową, (1 R,2S)-2-hydroksy-11 -metylo-2-fenyloetyloaminową, 1 -hydroksymetylo-2-metyloetyloam^nową, 2-amino-propyioaminową, benzyloamioową, 3-pirolinową, serynolową, 1,3-diamino-2-hydroksypropylową, N-(2-cyjanopropyio)-N-(3-pirydyiometyio)aminową, 2-(hydroksymetylo-3-^etyl(^)but:^ino-2-aminową, 3-hydroksypiperydynową, diizopropanoloaminową, N-benzylo-N2-hydroksyetyloaminową, 3-amino-1,2-propaoodiolową, (S)-2-amino-3-fenylopropyloaminową, 1 -(hydroksymetylo)-2-metylopropyloamioową, 2-hydroksy-2-fenyloetyioaminową, 2-amino-N 1 -(2-h^ydrok^^ye^^^^)e^^^^£^^n^c^w^£,, (S)-2-fenylo-1 -karboksyamidoetyloaminową, Z-amino-NN-U-hhyroosyetyklo-N 1 -hydroksyetylo-ctyloaminową, 3-aminopropyloamioową, 5-aminopeotyioammową, 2-ammo-2-metyloetyloaminową, --(hydroksy^etylo) propyloamioową, 1-(hydroksemctylo)etyloammową, 2-aminopropyloaminową, (2-tetrahydrofuraoyio)metyioamioową, 2-hydroksymetylopropyloaminową.

Korzystnym związkiem wedlug wynalazku jest taki związek jak:

2- { (2-hydookseetyio-[9-(mctyloctyio--6-( {[4-(trifluorometylo)fenylo]metylo} amino)puoyo-2-yio]amioo } etan-1 -ol;

{((2S-oSyolao-2-ylo-metyio] (6- {[(4-f^uooofcoylo)metylo] amino } -9-(metyloctyio)pureo-2-ylo)amioa;

[((2R)oksolao-2-ylo-metylo](6- {[M-fluorofenylojmetylo] amino} -9-(meteloetyio)puryn-2-ylo)amioa;

3- (2-[bis(2-hedrokyyctylo)ammoj-6-{[4-chiorofeoylo)metylo]amino}puryn-9-yl)butao-2-on;

2-[(6-{[(4-chlorofeoylo)metylo]ammo}-9-(metyloetylo-puryn-2-ylo-ammo]-3-mctylobutan-l-ol;

4- [({2-[(2-ammoctyio)ammo]-9-(metyioetyio)puryn-6-ylo}amίno)metyio]beozeoosulfonamid;

2^-[(2-h^ydro^ks^yetylo)(6-{[(4-metoksy^fenylo)metylo]ammo}-9-⁽m^cty^locty^io)ρu^ry^o-2-ylo)amino]etao-1 -ol;

2-((2-hydroksyetylo){9-(metyloetylo)-6-[(4-fenylofenylo)amino]puryn-2-ylo}amino)-etan-l-ol;

{2^-[(2-ammo-2-poop^ylo-ammo]-9-(mc^tyioet^eio)^pur^yo-⁶-yⁱo^}[(4^-c^hiorof^eoy^lo⁾m^ety^- lo]-amina;

{2- [(2-ammoetylo-ammo] -9-(metyioetelo)puryo-6-ylo } - [(4-chlorofeoyio-metylo] amina;

2-[(2-a.mⁱooct^ylo)(⁶-{[(4-c^hioro^feo^ylo^-mctylo]ammo^}-9-(mcty^ioety^lo)p^ury^o-²-yl^o)amioo]etan-1-ol;

2-^{[(4-bromo^feny^lo)<M^mno]-9-(mety^llOty^lo)p^u^oei-2-y^lo}^}2-^-2-hy^l:^Γ·^ok^syety^lo)ί^αnin⁽>^ctan-ⁱ-·^oi;

2-[(6-{{(4-chlorofeoylo)metylo]amino}-9-(mcteloetylo)puryn-2-ylo)(2-hydroksyetyio)-ammojetan-l-ol;

(2-aminoetylo-(6-{[(4-chiorofeoylo)mctylo]amioo}-9-(metyioetylo)puryo-2-yio)amma;

189 775 (2-aminopropylo)(6- {[(4-chlorofenylo)metylo] amino} -9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)amina;

2-[(6-{[(2,5-difluorofenylo)metylo]amino}-9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)(2-hydroksyetylo)-amino]etan-1 -ol.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonej 2,6,9-tripodstawionej puryny o wzorze (I) do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej z proliferacją komórek wybranej z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń, cukrzyca typu I, stwardnienie rozsiane, rak, nawrót zwężenia, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi i skaza moczanowa (dna).

Według wynalazku, korzystnym jest zastosowanie, w którym chorobą proliferacyjną jest nawrót zwężenia.

Według wynalazku, korzystnym jest zastosowanie, w którym chorobą proliferacyjną jest rak.

Według wynalazku, korzystnym jest zastosowanie, w którym chorobą proliferacyjną jest torbielowatość nerek.

Przedmiotem według wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca znany nośnik i/lub substancje pomocnicze oraz substancję czynną która według wynalazku zawiera jako substancję czynną terapeutycznie skuteczną ilość wyżej określonej 2,6,9-tripodstawionej pochodnej puryny o wzorze (I).

Związki według wynalazku znajdują zastosowanie w sposobie hamowania proliferacji komórkowej, który obejmuje podawanie ssakowi potrzebującemu takiego leczenia skutecznej ilości 2,6,9-tripodstawionego związku purynowego.

Związki według wynalazku są użyteczne w leczeniu chorób związanych z proliferacją komórkową takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń, cukrzyca typu I, stwardnienie rozsiane, rak, nawrót zwężenia, reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi i skazy moczanowej.

Wynalazek przedstawiono bliżej na rysunku, na którym fig. 1 jest wykresem średniej neointymalnej powierzchni tętnicy szyjnej szczura poddanego działaniu podłoża solankowego i poddanej działaniu związku 3 wytworzonego zgodnie z przykładem 2, przy czym nie zaciemniony pasek oznacza nie traktowany skrawek tętnicy szyjnej, a zaciemniony pasek oznacza traktowany skrawek tętnicy szyjnej.

„Farmaceutycznie dopuszczalna sól” - sól wytworzona znanymi sposobami i są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. „Farmakologicznie dopuszczalne sole” obejmują zasadowe sole z kwasami nieorganicznymi i organicznymi, w tym, ale bez ograniczenia do nich, takich jak kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas jabłkowy, kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas mlekowy, kwas fumarowy, kwas bursztynowy, kwas maleinowy, kwas salicylowy, kwas benzoesowy, kwas fenylooctowy, kwas migdałowy, itp. Gdy związki o wzorach Ι-ΙΠ zawierają kwasowe grupy funkcyjne, takie jak grupa karboksylowa, to wówczas grupa karboksylowa łączy się z odpowiednim farmaceutycznie dopuszczalnym kationem znanym specjalistom w tej dziedzinie, obejmującym kationy alkaliczne, ziem alkalicznych, kation amonowy, czwartorzędowy kation amoniowy, itp. Dodatkowe przykłady „farmakologicznie dopuszczalnych soli” można znaleźć w publikacji Berge i wsp., J. Pharm. Sci. 66,1 (1977).

Jeżeli finalny 2,6,9-tripodstawiony związek purynowy według wynalazku zawiera grupę zasadową to wówczas można wytwarzać sól addycyjną z kwasem tej kompozycji. Sole addycyjne związków według wynalazku z kwasami wytwarza się standardowymi sposobami w odpowiednim rozpuszczalniku ze związku macierzystego i nadmiaru kwasu, takiego jak, ale bez ograniczenia do nich, kwasu chlorowodorowego, kwasu bromowodorowego, kwasu siarkowego, kwasu fosforowego, kwasu octowego, kwasu maleinowego, kwasu bursztynowego lub kwasu metanosulfonowego. Szczególnie użyteczna jest postać soli chlorowodorkowej.

Jeżeli finalny 2,6,9-tripodstawiony związek purynowy zawiera grupę kwasową to wówczas można wytwarzać kationowe sole kompozycji według wynalazku. Typowy kwasowy związek macierzysty poddaje się działaniu nadmiaru reagenta alkalicznego, takiego jak, ale bez ograniczenia do nich, wodorotlenek, węglan lub alkoholan, zawierający odpowiedni kation, taki jak, ale bez ograniczenia do nich, Na⁺, K⁺, Ca²⁺ i NFL/ś Niektóre ze związków tworzą sole wewnętrzne lub jony dwubiegunowe, które także są akceptowane.

189 775

Związki według wynalazku są użyteczne w hamowaniu proliferacji komórkowej u ssaków, w tym ludzi. 2,6,9-Tripodstawione puryny są użyteczne, na przykład, w leczeniu chorób autoimmunologicznych, np. reumatoidalnym zapaleniu stawów, toczenia, cukrzycy typu I, stwardnieniu rozsianym, itp., w leczeniu raka, choroby sercowo-naczyniowej, takiej jak nawrót zwężenia, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi, skaza moczanowa, torbielowatość nerek i innych chorób proliferacyjnych, których patogeneza wywołuje nienormalną proliferację komórkową.

Związki według wynalazku są użyteczne w sposobie leczenia obejmującym pozajelitowe i doustne podawanie skutecznej ilości wybranego związku według wynalazku, korzystnie, w postaci dyspersji w farmaceutycznym nośniku. Terapeutycznie użyteczna ilość kompozycji według wynalazku będzie na ogół wynosiła od 0,01 do 100 mg/kg, ale specjalista w tej dziedzinie będzie mógł ją z łatwością określić w zależności od drogi podawania oraz wieku i stanu pacjenta. Terapeutycznie użyteczną ilość kompozycji według wynalazku można podawać jeden do dziesięciu razy dziennie albo więcej razy w przypadku stanów ostrych lub chronicznych. Gdy związki według wynalazku będą podawane zgodnie z niniejszym wynalazkiem nie są spodziewane żadne niedopuszczalne skutki toksykologiczne.

Kompozycje farmaceutyczne obejmujące związki według wynalazku i/lub ich pochodne, można sporządzać w postaci roztworów lub liofilizowanych proszków do podawania pozajelitowego. Proszki można przed użyciem rekonstytuować przez dodanie odpowiedniego rozcieńczalnika lub innego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Jeżeli kompozycje według wynalazku stosuje się w postaci ciekłej to korzystnie wprowadza się je do buforowanego, izotonicznego wodnego roztworu. Przykładami odpowiednich rozcieńczalników są normalny, izotoniczny roztwór solanki, standardowa 5% dekstroza w wodzie i buforowany roztwór octanu sodu lub amonu. Takie ciekłe preparaty są odpowiednie do podawania pozajelitowego ale mogą być użyte do podawania doustnego.

Może być pożądane dodawanie środków pomocniczych, takich jak poliwinylopirolidynon, żelatyna, hydroksyceluloza, guma arabska, glikol polietylenowy, mannit, chlorek sodowy, cytrynian sodowy lub dowolne inne środki pomocnicze znane specjalistom w dziedzinie sporządzania kompozycji farmaceutycznych, w tym związków według niniejszego wynalazku. Alternatywnie, związki farmaceutyczne można kapsułkować, tabletkować lub sporządzać w postaci emulsji albo syropu do podawania doustnego. W celu wzmocnienia lub stabilizacji kompozycji, względnie do ułatwienia sporządzania kompozycji dodaje się farmaceutycznie dopuszczalne stałe lub ciekłe nośniki. Ciekłe nośniki obejmują, ale nie są ograniczone do nich, syrop, olej z orzeszków ziemnych, olej z oliwek, gliceryna, solanka, alkohole i woda. Stałe nośniki obejmują, ale nie są ograniczone do nich, skrobię, laktozę, siarczan wapnia, dihydrat, glinka biała (terra alba), stearynian magnezu lub kwas stearynowy, talk, pektyna, guma arabska, agar lub żelatyna. Nośnik może także obejmować materiał o przedłużonym uwalnianiu, taki jak, ale bez ograniczenia do nich, monostearynian lub distearynian gliceryny, sam lub z woskiem. Ilość stałego nośnika różni się, ale korzystnie będzie wynosił od 20 mg do około 1 g na jednostkę dawkową.

Farmaceutyczne dawki sporządza się z zastosowaniem znanych technik, takich jak, ale bez ograniczania do nich, w przypadku tabletek: mielenie, mieszanie, granulowanie i prasowanie, albo w przypadku sporządzania kapsułek: mielenie, mieszanie i wypełnianie twardych żelatynowych kapsułek. Gdy stosuje się ciekły nośnik, preparat będzie w postaci syropu, eliksiru, emulsji i wodnej lub bezwodnej zawiesiny. Taki preparat ciekły można podawać bezpośrednio lub wypełniać nim miękkie żelatynowe kapsułki.

Poniższe przykłady służą do zilustrowania niniejszego wynalazku. Przykłady zapewniają informacje jak wykonać i zastosować związki według wynalazku. W przykładach wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza. RT oznacza temperaturę pokojową.

Przykład 1 ....

Związki według niniejszego wynalazku wytwarza się znanymi z chemii organicznej sposobami. Na poniższym schemacie syntezy przedstawiono sekwencję reakcji stanowiącą ogólny sposób użyteczny w wytwarzaniu związków według wynalazku. 2,6-Dichloropurynę rozpuszczono w butanolu i dodano odpowiednią aminę R|. Po ogrzewaniu przez kilka godzin,

189 775 mieszaninę reakcyjną ochłodzono i otrzymano związek 1. Do związku 1 dodano wodorek sodowy R² i wyodrębniono związek 2. Do związku 2, dodano R3 w roztworze z N-metylopirolidynon. Mieszaninę ogrzewano przez odpowiedni okres, a następnie po oczyszczeniu otrzymano pożądany związek.

Zgodnie z powyższym sposobem wytworzono następujący związek.

Wytwarzanie 2-chloro-6-(4-metoksybenzylooamino)puryny (1)

2,6-Dichloropurynę (4,06 g, 21,5 mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w n-butanolu (150 ml) i dodano 4-metoksybenzyloaminę (3,4 ml, 26 mmol). Roztwór stał się klarowny, a następnie po kilku minutach stał się mętny. Roztwór ogrzewano w 120°C przez 2 godziny i następnie ochłodzono. n-Butanol, po czym pozostałość przeprowadzono w stan zawiesiny w mieszaninie wody i eteru dietylowego. Dodano roztwór 2N NAOH (1,3 ml, 26 mmol) i roztwór mieszano przez 10 minut przed przesączeniem. Przesączony osad przemyto wodą i małą porcją eteru, a następnie wysuszono pod próżnią. Pozostały ług macierzysty pozostawiono przez całą noc i wytworzyła się większa ilość kryształów, którą zebrano następnego dnia i przemyto eterem dietylowym. Wydajność = 71%.

Wytwarzanie 2-chloro-6-(4-metoksybenzyloamino)-9-izopropylopuryny (2)

2-Chloro-6-(4-metoksybenzyloamino)purynę przeprowadzono w stan zawiesiny w bezwodnym DMF (5 ml) i poddano działaniu wodorku sodowego, 60% dyspersja (82 mg, 2,06 mmol). Zawiesinę mieszano przez 30 minut, w którym to czasie stała się ona jasnożółtym/zielonym roztworem. W ciągu 5 minut dodano jodopropan (0,280 ml, 1,7 równoważnik) i wytworzony roztwór mieszano przez 2 dni. Dodano wodę i roztwór wyekstrahowano octanem etylu. Warstwę organiczną odparowano i otrzymano produkt izopropylopurynę (wydajność = 508 mg, 89%).

Wytwarzanie 2-dietanoloamino-6-(4-metoksybenzyloamino)-9-izopropylopuryny (3).

Purynę (1,65 g, 4,98 mmol) rozpuszczono DMSO (12 ml) i dietanoloaminie (4 ml) i następnie ogrzewano w 140°C przez 2-3 dni, a następnie w 160°C przez 1 dzień. Roztwór ogrzewano i dodano butanol nasycony wodą (100 ml). Roztwór następnie przemyto wodą (3 x 50 ml), przed odparowaniem do uzyskania brązowego oleju. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując octanem etylu, a następnie 3% metanolem w octanie etylu i otrzymano produkt (Wydajność = 730 mg, 37%) w postaci jasnożółtego oleju. Wydajność = 37%. ‘H-NMR(8 CDCl·,): 7,29(br s 1H), 7,25(d, 2H), 6,94(br s, 1H), 6,83(d, 2H), 5,43(br s<2H), 4,63(br s, 2H), 4,53(m 1H), 3,86(t, 4H), 3,76(m, 7H), 1,47(d 6H).

189 775

Przykład 2

Przykład ten opisuje sposób wytwarzania związków według wynalazku zgodnie z następującym ogólnym schematem syntezy:

R,'X

Band, refluks

R,H

NtVP,140PC

przy czym ugrupowanie R1 X, w którym X oznacza -NH- lub -O-odpowiada grupie R‘.

Wytwarzanie {2-chloropuryn-6-ylo} [(4-chlorofenylo)-metylo]aminy:

Do zawiesiny 15 g (0,0794 mol) 2,6-dichloropuryny w 250 ml absolutnego etanolu dodano 12,7 ml (0,0873 mol) trietyloaminy i 10,62 ml (0,0873 mol) 4-chlorobenzyloaminy. Mieszaninę ogrzewano w 80°C w warunkach powrotu skroplin przez 16 godzin (zaobserwowano utworzenie się kremowo-białego osadu). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono i strącony produkt usunięto przez przesączanie. Osad przemyto etanolem (3x50 ml) i wysuszono pod wysoką próżnią przez 24 godziny (wydajność = 15,7 g; 67,4%). Produkt scharakteryzowano za pomocą 'H-NMR.

Wytwarzanie {2-chloro-9-(metyloetylo)puryn-6-ylo}[4-chlorofenylo)metylo]aminy:

Do roztworu 6 g (0,020 mol) 2-chloro-6-(4-chlorofenylo)-metyloaminopuryny w 41 ml bezwodnego DMF dodano 5,64 g (0,041 mol) bezwodnego węglanu potasowego i 3,41 ml, (0,035 mol) 2-jodopropanu i mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Do mieszaniny dodano 500 ml wody i mieszano przez 1 godzinę. Osad przesączono, przesączono wodą (3x50 ml) i wysuszono w piecu próżniowym w 50°C przez 16 godzin. Otrzymano produkt w postaci prawie białej substancji stałej (6,5 g, 25 97%) i scharakteryzowano za pomocą ‘H-NMR.

Wytwarzanie {2-[(2-aminoetylo)amino]-9-(metyloetylo)puryn-6-ylo}[(4-chlorofenylo)metylojaminy:

Do roztworu 3,36 g (0,01 mol) {2-chloro-9-(metyloetylo)puryn-6-ylo}[4-chlorofenylo)-metylo]aminy w 13 ml bezwodnego 1-metylo-2-pirolidynonu dodano 4,68 ml (0,70 mol) 2-aminoetyloaminy i mieszaninę ogrzewano w 140°C przez 24 godzin. Związek poddano zróżnicowanej chromatografii gradientowej na żelu krzemionkowym mieszaniną dichlorometanmetanol i otrzymano l-metylo-2-pirolidynon. Mieszaninę rozpuszczono w dichlorometanie i wyekstrahowano wodą (520 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i odparowano do otrzymania prawie białej substancji stałej (2,94 g, 81,7%). Produkt scharakteryzowano za pomocą Ή-NMR, a czystość sprawdzono za pomocąRP-HPLC (kolumna YMC C-18; 50x4,4 mm; S-5 120 A° 0,1% TFA-woda/0,1% TFA-acetonitryl).

Poniższa tabela 1, identyfikuje związki według wynalazku wytworzone zgodnie z ogólnym sposobem przedstawionym w niniejszym przykładzie. W tabeli 1, MS = widmo masowe, a MH+ = masę cząsteczkową macierzystego jonu plus atom wodoru.

189 775

Tabela 1

Związki wytworzone sposobem według przykładu 2

R',X (R.)	R2	R3	MS (MH+)
1	2	3	4
U-metylofenylojmetyloamino	izopropyl	2-aminottyloamino	340
(2,4-dichlorofenylo)metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	439
(2,4-dichlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-aminoetyloamino	394
(3-metylofenylo)metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	385
(3-metylofenylo)metyloamino	izopropyl	2-aminoetyloamino	340
(3-mttylofenylo)metyloamino	izopropyl	2-(N2-dimttyloamino)-N 1 -benzyloetyloamino	458
(4-trifluorometyloftnylo)mttyloamino	izopropyl	2-aminottyloamino	394
(4-trifluorometylfenylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloamino	437
(3,5-bis-trifluoromttylofenylo)mttyloamino	izopropyl	dietanoloamino	507
(3,5-bis-trifluoromttyloftnylo)mttyloamino	izopropyl	2-aminottyloamino	462
(3,5-bis-trifluoromttylofenylo)mttyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylo^Z-metylopropyloamino	505
(3 -chlorofenylo)mttyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetyloetyloamino	375
(2-trifluorometylofenylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetyloetyloamino	409
(4-chloro-3-trifluorometylofenylo)mttylo- amino	izopropyl	1 -hydroksymetylottyloamino	443
(3 -chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-hydroksyetyloamino	361
(2-trifluorometylofenylo)mttyloamino	izopropyl	2-hydroksyetyloamino	395
(4-chloro-3-trifluorometylofenylo)mttylo- amino	izopropyl	2-hydroksyetyloamino	429
(3 -chloroftnylo)metyloamino	izopropyl	(1 R,2S)-2-hydroksy-11 -metylo-2-fenyloetyloamino
(2-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	450
(2,5-difluoroftnylo)mttyloamino	izopropyl	dietanoloamino	407
(1 -naftylo)metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	421
(2-chlorofenylo)mttyloamino	izopropyl	2-aminoetyloamino	360
(2,5-difluorofenylo)metyloamino	izopropyl	2 -aminoetyloamino	362
(1 -na^lo)metyloamino	izopropyl	2-aminoetyloamino	376
(2-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylo-2-metylottyloamino	403
(2,5-difluorofenylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylo-2-metylottyloamino	405
(1 -naftylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylo-2-mttylottyloamino	419
(3-metylofenylo)metyloamino	izopropyl	2-aminopropyloamino	354
(2-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-aminopropyloamino	374
(3-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-aminopropyloamino	374
(2,5-difluoroftnylo)mttyloamino	izopropyl	2-aminopropyloamino	376
(1 -naftylo)mttyloamino	izopropyl	2-aminopropyloam ino	390

189 775

c.d. tabeli 1

1	2	3	4
(2-chloro-5-trifluorometylfenylo)-metylo- amino	izopropyl	dietanoloamino	473
(3-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloamino	403
(2-trifluorometylofenylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloamino	437

Przykład 3

Przykład opisuje sposób wytwarzania związków według wynalazku. Sposób syntezy ujawniony w tym przykładzie jest tylko nieznacznie zmodyfikowany w stosunku do ujawnionego w przykładzie 1.

Zgodnie z powyższym sposobem wytworzono następujący związek.

Wytwarzanie 2,6-dichloro-9-izopropylopuryny (4)

W temperaturze pokojowej, do roztworu 0,67 g 2,6-dichloropuryny w 5 ml bezwodnego DMF dodano 0,16 g (1,1 równoważnik) sproszkowanego 50% wodorku sodowego/olej. Po zaprzestaniu wydzielania się wodoru, do anionowego roztworu dodano duży nadmiar (2 ml) jodku izopropylu. Reakcyjny roztwór mieszano przez trzy dni w temperaturze pokojowej. Reakcje przerwano przy pomocy 300 ml wody i wyekstrahowano octanem etylu (3x50 ml). Ekstrakty organiczne połączono i ponownie przemyto 3x50 ml wody, a następnie 20 ml solanki. Roztwór octanu etylu wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym i odparowano. Związek poddano chromatografii rzutowej z różnym gradientem na żelu krzemionkowym za pomocą mieszaniny heksan/octan etylu i otrzymano wydajność 0,36 g pożądanego produktu N-9 (45%) i 0,08 g izomeru N-7 (10%).

Wytwarzanie 2-chloro-6-anilino-9-izopropylopuryny (5).

2,6-dichloro-9-izopropylopurynę (0,019 g, 0,081 mmol) rozpuszczono w butanolu (0,5 ml) i dodano anilinę (0,044 ml, 0,244 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do 120°Ć przez 10 godzin, ochłodzono, rozcieńczono EtOAc i przemyto 3 razy wodą. Mieszaninę wysuszono nad MgSCń i zatężono do otrzymania prawie białej substancji stałej.

Wytwarzanie 2-dietanoloamino-6-(4-fenyloanilino)-9-izo-propylopuryny (6)

Roztwór 67 mg 2,6-dichloro-N-9-izopropylopuryny i 100 mg 4-fenyloaniliny w 1 ml n-oktanolu ogrzewano do 80°C przez 24 godziny. n-Oktanol usunięto w próżni i następnie zastąpiono 1 ml 40% dietanoloaminy w DMSO. Roztwór ogrzewano w 130°C przez 48 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury otoczenia i następnie rozcieńczono 10 ml wody, po czym wyekstrahowano octanem etylu (3x30 ml). Ekstrakty organiczne połączono i ponow12

189 775 nie przemyto 3x20 ml wody, a następnie 10 ml solanki. Roztwór octanu etylu wysuszono bezwodnym siarczanem magnezowym i przesączono, a rozpuszczalnik odparowano. 65 mg surowego produktu wykrystalizowano z roztworu THF-eter (23%).

Przykład 4

Przykład ten opisuje sposób wytwarzania związków według wynalazku. Sposób syntezy ujawniony w tym przykładzie jest jedynie nieznacznie zmodyfikowany w stosunku do ujawnionego w przykładzie 1.

Zgodnie z powyższym sposobem wytworzono następujący związek.

Wytwarzanie 2,6-dichloro-9-izopropylopuryny (4).

W temperaturze pokojowej, 2,6-dichIoropurynę (5,00 g, 26,46 mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w 55 ml bezwodnego DMF i poddano działaniu wodorku sodowego, 60% dyspersja (1,27 g, 31,75 mmol) dodanego porcjami. Po mieszaniu przez 1 godzinę, dodano 2-jodopropan (4,5 ml, 44,98 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 dni. Mieszaninę reakcyjną wlano do eteru dietylowego i przemyto jeden raz nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego i jeden raz wodą. Mieszaninę wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i zatężono w próżni. Koncentrat chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując roztworem 10% acetonu w dichlorometanie i otrzymano pożądany produkt alkilowania N-9 w postaci białej substancji stałej. Wydajność = 47%

Wytwarzanie 2-chloro-6-(4-metylomerkapto)anilino-9-iso-propylopuryny (5A).

2,6-Dichloro-9-izopropylopurynę (0,15 g, 0,649 mmol) rozpuszczono w n-butanolu (4 ml) i dodano 4-(metylomerkapto)-anilinę (0,089 ml, 0,714 mmol) i trietyloaminę (0,20 ml, 1,43 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 80°C przez całą noc. Ochłodzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu i przemyto 1 χ IM HCl, 1 x nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego i 1 x solanką przed wysuszeniem bezwodnym siarczanem sodowym i zatężono w próżni. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując 2% metanolem w dichlorometanie i otrzymano pożądany produkt w postaci białej substancji stałej. Wydajność = 83%.

Wytwarzanie 2-dietanoloamino-6-(4-metylomerkapto)anilino-9-izopropylopuryny (6A).

Purynę (0,18 g, 539 mmol) rozpuszczono w N-metylopirolidynonie (3 ml) i dietanoloaminie (1 ml) i następnie ogrzewano w 120°C przez całą noc. Ochłodzoną mieszaninę reakcyjną wlano do eteru dietylowego i przemyto trzy razy wodą przed wysuszeniem nad bezwodnym siarczanem sodowym i zatężono w próżni. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując 5% metanolem w dichlorometanie i otrzymano pożądany produkt w postaci prawie białej substancji stałej.

'H-NMR (δ, CDCb): 8,08(s, IH), 7,58(d, 2H), 7,47 (s, IH), 7,18(d, 2H), 4,95(br s, <2H), 4,52(m, IH), 3,94(m, 4H), 3,83(m, 4H), 2,43(s, 3H), l,47(d, 6H).

189 775

Wytwarzanie 4-(2-tienylo)benzonitrylu

Niektóre grupy Rf muszą być syntezowane przed poddaniem reakcji z 2,6-dichloro-9-izopropylopuryną. Grupy te można syntezować różnymi sposobami sprzęgania i innymi syntetycznymi procedurami znanymi specjalistom z syntezy organicznej.

Do ciśnieniowej rury dodano 4-bromobenzonitryl (0,20 g, 1,10 mmol), tetrakis(trifenylofosfmo)palladu (0) (0,127 g, 0,1 równoważnik) i kwas 2-tiofenoboronowy (0,211 g, 1,65 mmol). Reakcję spłukano pod próżnią i przedmuchano bezwodnym azotem trzy razy. Do rury po przedmuchaniu dodano eter dimetylowy glikolu etylenowego (5,5 ml) i wodny roztwór węglanu sodowego (2,53 ml, 1M). Rurę szczelnie zamknięto i ogrzewano w 80°C przez całą noc. Ochłodzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem dietylowym i dwukrotnie przemyto wodą przez wysuszeniem nad siarczanem sodowym i zatężono pod próżnią. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując 10% octanem etylu w heksanie i otrzymano pożądany produkt w postaci białej substancji 20 stałej. Wydajność = 84%.

Wytwarzanie 4-(2-tienylo)benzyloaminy

4-(2-Tienylo)benzonitryl (0,086 g, 0,464 mmol) rozpuszczono w bezwodnym tetrahydrofuranie (1,6 ml), a następnie dodano kroplami wodorek litowo-glinowego (LAH)(0,46 ml, 0,464 mmol, 1M w THF). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez całą noc. TLC (5% metanol w dichlorometanie) nadal wykazywał zawartość substancji wyjściowych. Dodano dodatkowy 1 równoważnik LAH. Po dalszej godzinie, reakcję przerwano metodą Fiesera i stosując zarodek (17,46 pl) i dodając kolejno wodny roztwór wodorotlenku sodowego (17,46 pl, roztwór 15%) i wodę (52,37 pl). Reakcje następnie rozcieńczono eterem dietylowym i wodą dwukrotnie wyekstrahowano eterem dietylowym, a następnie wysuszono nad siarczanem sodowym i zatężono w próżni. Pozostałość pozostawiono bez dalszego oczyszczania. Wydajność = 89%.

Przykład 5

W przykładzie tym opisano sposób wytwarzania związków według wynalazku. Sposób syntezy ujawniony w tym przykładzie jest jedynie nieznacznie zmodyfikowany w stosunku do ujawnionego w przykładzie 1.

Zgodnie z powyższym sposobem wytworzono następujący związek.

Wytwarzanie 2-amino-6-chloro-9-metylopuryny (7).

2-Amino-6-chloropurynę (1,08 g, 6,4 mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w bezwodnym DMF (75 ml) i poddano działaniu wodorku sodowego, 60% dyspersja (0,28 g, 7 mmol). Zawiesinę mieszano przez 15 minut, po czym dodano jodometan (0,44 ml, 7,06 mmol) i wytworzony żółty roztwór mieszano przez 1 godzinę i 45 minut. Substancję przesączono i przesącz odparowano, po czym po 10 minutach dodano wodę. Wytworzoną substancję stałą

189 775 przesączono i wysuszono przez całą noc do otrzymania produktu w postaci mieszaniny produktów alkilowania N-7 i N-9. Pozostały lug macierzysty pozostawiono przez calą noc i większą ilość kryształów zebrano następnego dnia i wysuszono. Wydajność = 77%.

Wytwarzanie 6-chlcrc-2-(2-metcksyacetyloamino)-9-metylopuryny (8).

Mieszaninę izomerów z poprzedniego przykładu rozpuszczono w dichlorometanie i pirydynie (2 równoważniki), po czym poddano działaniu chlorku metoksyacetylu (4 równoważniki). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej aż do zakończenia reakcji. Mieszaninę reakcyjną odparowano i przesączono przez warstwę żelu krzemionkowego eluując 2% metanolem w dichlorometanie, po czym oczyszczono w chomatotronie stosując żel krzemionkowy i eluowanie 2% metanolem w dichlorometanie w celu wyodrębnienia pożądanego produktu. Wydajność 31%.

Przykład 6

W przykładzie tym opisano sposób wytwarzania związków według wynalazku. Sposób syntezy ujawniony w tym sposobie jedynie nieznacznie jest zmodyfikowany w stosunku do sposobu przedstawionego w przykładzie 1.

Ri, Et_?n butanol, A

R,

NaH

N \

R;

R,

Zgodnie z powyższym sposobem wytworzono następujący związek.

Wytwarzanie 2-chlOTc-6-(4-fenylobenzyloamino)puryny (9)

2,6-Dichloropurynę (5,0 g, 26,45 mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w n-butanolu (50 ml) i dodano 4-fenylcbenzylcaminę (6,61 g, 29,1 mmol) i trietylaminę (4,1 ml, 29,1 mmol). Roztwór ogrzewano w 120°C przez całą noc, a następnie ochłodzono. Produkt przesączono z zastosowaniem nadmiaru n-butanolu i osad przemyto 100 ml 1M HC1 i 200 ml wody. Substancję stałą wysuszono w próżni przez całą noc w 70°C i otrzymano pożądany produkt w postaci jasnożółtej substancji stałej. Wydajność = 99%.

Wytwarzanie 2-dietanoloamino-6-(4-fenylcbenzylcaminc)puryny (10)

2-Chlcrc-6-(4-fenylcbenzyloammo)purynę (2,0 g, 5,96 mmol) połączono z dietanoloaminą (11,4 ml, 119,2 mmol) i N-metylopirolidyncnem (10 ml) i ogrzewano w 120°C przez całą noc. Ochłodzoną mieszaninę reakcyjną wlano do dichlorometanu i przemyto dwukrotnie wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym, zatężono w próżni i otrzymano pożądany produkt w postaci jasnozielonej substancji stałej, którą następnie wysuszono w piecu próżniowym w 70°C przez 2 dni.

Wytwarzanie 2-dietancloamino-6-(4-fenylobenzylcaminc)-9-metylcpuryny (11)

2-ί^ietanclcaminc-6-(4-fenylobenzyloamino)purynę (0,050 g, 0,124 mmol) rozpuszczono w bezwodnym DMF i poddano działaniu wodorku sodowego, 60% dyspersja (5,5 mg, 0,136 mmol), po 1 godzinie dodano jodometan (0,009 ml, 0,148 mmol) i wytworzony roztwór

189 775 mieszano w temperaturze pokojowej przez całą noc. Mieszaninę reakcyjną wlano do eteru dietylowego i przemyto dwukrotnie nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego, po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i zatężono w próżni. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując 5% metanolem w dichlorometanie i otrzymano produkt w postaci białej substancji stałej. Wydajność = 63%.

Ή-NMR (δ, CDCls): 7,55 (m, 4H), 7,41 (m, 4H), 7, 35 (m, 4H), 6,41 (br s, <1H), 5,10 (br s, <2H), 4,72 (br s, 2H), 3,86 (m, 4H), 5 3,74 (m, 4H), 3,59 (3, 3H).

Przykład 7

Związki według wynalazku oceniano w następujących próbach.

Próby CDK2

Kompozycje według niniejszego wynalazku zbadano w celu określenia ich hamującej aktywności CDK2. Układ badawczy (całkowita objętość 50 pl) zawierał 50 mM Tris-Cl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 pg histonu H1, 30 pM ATP (1 pCi ATP znaczony gamma ³²P), 10 pg BSA i 1 ng oczyszczonego CDK2. Po inkubacji w 30°C przez 30 minut, reakcję zakończono przez dodanie 10 pl 10% TCA i próbki umieszczono na nitrocelulozowych filtrach w postaci plamek. Filtry obficie przemyto 10% TCA i zbadano radioaktywność. Puste miejsca nie zawierały żadnego enzymu. W celu sprawdzenia siły różnych związków według niniejszego wynalazku, związki te dodano do powyższej próby w stężeniach wynoszących od 100 do 0,02 pg/ml. Po inkubowaniu przez 30 minut, badane rurki poddano obróbce jak wyżej. We wszystkich próbach, dodano olomoucynę w różnych stężeniach i zastosowano jako standardową kontrolną próbkę dodatnią. Wyszczególniony w tabeli 2 IC50 (enzym) zdefiniowano jako stężenia wymagane do zahamowania aktywności CDK2 o 50%.

P rzykład 8

Próby proliferacji komórkowej:

Komórki początkowego odcinka mięśni gładkich aorty szczura (magazyn CV Therapeutics Cell) posiano w naczyniach z 48 dołkami (Falcon, ml/dołek) o gęstości 20000 komórek/ml DMę zawierających 5% inaktywowaną ciepłem surowicę bydlęcą. Komórki inkubowano w inkubatorze z standardową hodowlą tkankową przez 48 godzin. Zassano pożywkę i dołki uzupełniono 0,2 ml świeżej pożywki. Związki według niniejszego wynalazku dodano o stężeniach wynoszących od 100 do 0,37 pg/ml. Po 48 godzinnym inkubowaniu, pożywkę zassano i hodowle poddano działaniu 0,2 ml solanki 0,25 (0,1, roztworu metosiarczanu fenozyny zawierającego MTS (zestaw badawczy do badania proliferacji komórkowej Cell Titer 96® Aqueous Nonradioactive, Katalog # G 5430, Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711-5399). Wartości IC50 komórek wyszczególnionych w tabeli 2 jest zdefiniowana jako stężenie wymagane do hamowania proliferacji komórkowej w 50%. Dodawano olomoucynę o różnych stężeniach i stosowano ją jako standardową dodatnią próbkę kontrolną.

Tabela 2

Aktywność biologiczna, reprezentatywnych związków według wynalazku

Ri'(R.)	R2	R3	IC50 (pg/ml) enzym	IC50 (pl/ml) komórki
1	2	3	4	5
benzyloamino	Me	etanoloamino	7	70
4-metoksybenzyloamino	H	Cl	60	NA
4-metoksybenzyloamino	Me	Cl	6	>70
4-metoksybenzyloamino	Me		4	48
4-chlorobenzyloksy	H	etanoloamino	60	NA
4-chlorobenzyloksy	Me	Cl	60	NA
4-chlorobenzyloksy	trifluorometyl	Cl	>60	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	Cl	4	77
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	etanoloamino	4	43

189 775

c.d. tabeli 2

1	2	3	4	5
4-metoksybenzyloamino	Me	dietanoloamino	4	48
4-metoksybenzyloamino	2-metylopropyl	Cl	60	>70
etanoloamino	Me	etanoloamino	>60	>70
4-metoksybenzyloamino	trifluorometyl	Cl	>60	>70
4-metoksybenzyloamino	benzyl	Cl	>60	>70
etanoloamino	H	benzyloamino	>60	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,2	2,1
4-metoksybenzyloamino	perfluoroizopropyl	Cl	>45	NA
4-metoksybenzyloamino	perfluoroizopropyl	dietanoloamino	40	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	3-pirolina	1	12,5
4-metoksybenzyloamino	hydroksyetyl	dietanoloamino	0,5	62
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	serynol	0,4	15
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	1,3-diamino-2-hydroksypropan	0,6	25
4-metoksybenzyloamino	3-cyjanopropyl	Cl	>60	NA
4-metoksybenzyloamino	3-chloropropyl	Cl	>60	NA
4-metoksybenzyloamino	benzyl	Cl	>60	NA
4-metoksybenzyloamino	metylo-4-karboksy- benzyl	Cl	>60	NA
4-metoksybenzyloamino	naftaloiloetyl	Cl	>60	NA
4-chlorobenzyloamino	trifluorometyl	Cl	1	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	N-(2-cyjanopropylo)-N-{3-piry- dylometylo)amino	1	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	2-(hydroksymetylo)-3-metylo- butano-2-amino	1	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	3-hydroksypiperydyno	1	NA
cykloheksylometyloamino	izopropyl	Cl	1	NA
piperonyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,8	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	diizopropanoloamino	0,8	NA
anilino	izopropyl	Cl	1	NA
4-metoksybenzyloamino	izopropyl	N-benzylo-N-2-hydroksyetylo- amino	1	NA
4-fenyloanilino	izopropyl	dietanoloamino	0,6	NA
4-fenylobenzyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,6	NA
4-fenylobenzyloamino	izopropyl	3-ami^i^^ 1,2-propanodiol	0,6	NA
4-(2-(tiofenylo)benzylo- amino	izopropyl	dietanoloamino	0,5	NA
4-(4-metylofenylo)benzylo- amino	izopropyl	dietanoloamino	0,6	NA
4-(4-trifluorometylofenylo)- benzyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,6	NA

189 775

c.d. tabeli 2

1	2	3	4	5
4-tionetoksyanilino	izopropyl	Cl	0,6	NA
3-(4-nitrylofenylo)anilino	izopropyl	dietanoloamino	0,5	NA
3-tionetoksyanilino	izopropyl	dietanoloamino	0,1	NA
4-tiometoksyanilino	izopropyl	dietanoloamino	0,07	NA
3 -metoksybenzyloamino	izopropyl	Cl	0,9	NA
4-(2-pirydynylo)benzylo amino	izopropyl	dietanoloamino	0,16	NA
3 -metoksybenzyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,5	NA

Tabela 3

Ri'(R.)	r₂	r₃	IC₅₀ (pg/ml) enzym	IC50 (μΐ/ml) komórki
1	2	3	4	5
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,12	0,3
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,15	2,2
(4-trifluorometylofenylo)- metyloamino	izobutyl	dietanoloamino	59	NA
(4-trifluorometylofenylo)- metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	0,56	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(S)-2-amino-3 -fenylopropyloamino	1,07	NA
(4-fluorofenylo)etyloamino	izopropyl	2-aminoetyloamino	0,17	1,4
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	(D)-1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloamino	0,06	2,7
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	(L)-1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloamino	0,19	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(D)-1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloamino	0,19	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(L)-1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloamino	0,05	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-hydroksy-2-fenylo-etyloamino	0,08	>5
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-amino-N 1 -2-hydroksyetylo)etyloamino	0,07	0,2
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-amino-N2-(2-hydroksyetylo)- etyloamino	2,02	NA
(4-chlorofenylo)metyIoamino	izopropyl	(S)-2-fenylo-1 -karboksyamidoetyloamino	1,07	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-amino-N2-(2-hydroksyetylo)-N1 -(hydroksyetylo)etyloamino	0,43	NA
(4-sulfonamidofenylo)metylo- amino	izopropyl	2-aminoetyloamino	9	NA
(4-fluorofenylo)metyloamino	2-okso-3-butyl	dietanoloamino	11	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	2-okso-3-butyl	dietanoloamino	37	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-aminoetyloamino	0,35	0,1

189 775

c.d. tabeli 3

1	2	3	4	5
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	3-aminopropyloamino	1,0	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	5-aminopentyloamino	31	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-amino-2-metyloetyloamino	0,05	0,1
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(S)-(+)-1 -(hydroksymetylo)propyloamino	0,17	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(R)-(-)-1 -(hydroksymetylo)propyloamino	0,18	NA
(4-chlorofenylo)-metyloamino	izopropyl	(S)-(+)-1 -(hydroksymetylo)etyloamino	0,26	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(R)-(-)-1 -(hydroksymetylo)etyloamino	0,35	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(S)-(+)-2-hydroksypropyloamino	0,38	NA
(4-chlorofenylo)metyloamino	izopropyl	(R)-(-)-2-hydroksypropyloamino	0,43	NA
(4-fluorofenylo)metyloammo	izopropyl	2-aminopropyioamino	0,48	NA
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	(S)-(2-tetrahydrofiiranylo)mety- loamino	0,63	NA
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	(R)-(2-tetrahydrofuranylo)mety- loamino	0,58	NA
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	2-hydroksy-1 -metyloetyloamino	0,18	NA
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	(S^-hydroksy^-metyloetylo- amino	0,22	NA
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	(R)-2-hydroksy-2-metyloetylo- amino	0,23	>5
(4-fluorofenylo)metyloamino	izopropyl	1 -hydroksymetylopropyloamino	0,11	2,4

Hamowanie właściwości proliferacji komórkowej związków według niniejszego wynalazku wykazano za pomocą ich zdolności do hamowania proliferacji komórkowej w zakresie stężeń od około 0,05 pg/ml do 100 pg/ml, korzystnie mniej niż 0,5 pg/ml.

Podobne testy przeprowadzono stosując linie komórkowe; P388 - mysiego nowotworu limfoidalnego; L1210 - mysiej białaczki limfoblastycznej; Caco2 ludzkiego gruczolaka okrężnicy; MCF7 ludzkiego gruczolaka sutka; PupVSMC - włókna mięśni gładkich aorty noworodka szczura; Ovcar - ludzkiego raka jajnika; Panel - ludzkiego gruczolaka trzustki; i HUVEC - komórki ludzkiego pępkowego pasma śródbłonkowego. Poniżej, w tabeli 3A, przedstawiono inhibitujące działanie kilku kompozycji według wynalazku wobec jednego lub wielu linii komórkowych.

Tabela 3A

IC50 (pg/ml) dla inhibitowania proliferacji komórkowej

R,X	R2	R3	P388	L11210	Caco2	MCF7
(4-metoksyfenylo)metyloamino	izopropyl	dietanoloamino	1,5	2,5	4,5	8,0
(4-fenylofenylo)amino	izopropyl	dietanoloamino	1,0	4,0	0,5	4,0
(4-fenylofenylo)me-yloamino	izopropyl	dietanoloamino	< 1,0	1,0	3,5	1,0
(4-metoksyfenylo)metyloamino	izopropyl	morfolino	>5
3-fenoksyfenylo, 3-benzyloksyfenylo	izopropyl	dietanoloamina	1,5			2,0

189 775

Przykład 9

Związek według niniejszego wynalazku oceniono pod względem ich skuteczności na modelu białaczki mysiej (Murine Leukemia Model). Model białaczki mysiej jest standardowym modelem stosowanym do oceniania środków przeciwnowotworowych. Myszom CDF1 wstrzyknięto dootrzewnowo (ip) komórki L1210 (1x10 komórki/mysz). Dwadzieścia cztery godziny później, myszy te poddano działaniu różnych dawek (ip) związku 3 z przykładu 1 w solance. Reżim dawkowania zastosowany w tej próbie przedstawiono w poniższej tabeli 4. Myszom podawano związek 3 w ciągu dnia lub w alternatywne dni. Myszy kontrolne otrzymały solankę. Po 7 dniach, dozowanie zawieszono i monitorowano jednostki, które przeżyły.

Tabela 4

Leczenie	Dawka	N	Średni czas przeżycia (dni)	T/Cx100
solanka kontrolna		7	10(9-13)	100
związek 3	0,5 mg/kg 2xdziennie	7	11(10-15)	110
	1,0 mg/kg 2xdziennie	7	13(11-13)	130
	2 mg/kg 2xdziennie	7	12(10-14)	120
	4 mg /kg - dni 1,3,5,7	7	13(10-15)	130
	8 mg/kg - dni 1,3,5,7	7	13(12-16)	130

Wyniki wskazują, że szczury, którym podano związek 3 przeżyły dłużej niż szczury kontrolne.

Przykład 10

W przykładzie tym mierzono skutek ostrego miejscowego uwalniania związku 3 z przykładu 1 na zmniejszenie się tworzenia błony wewnętrznej naczyń następującego po balonikowaniu (balloon angioplasty) modelu tętnicy szyjnej szczura. W przykładzie tym, lewe tętnice szyjne dorosłych samców szczurów (n=10 na doświadczalną grupę) chirurgicznie uszkodzono z zastosowaniem cewnika Fogarty'ego do usuwania czopa zatorowego. Natychmiast po uszkodzeniu, tętnicę szyjną rozcięto na dwie części przy pomocy kleszczy naczyniowych, w ten sposób uzyskując część nie poddawaną traktowaniu i traktowaną. Następnie, do dystalnej połowy tętnicy szyjnej wprowadzono cewnik dostarczający lek. Po podaniu leku, cewnik usunięto i nadmiar leku spłukano przez usunięcie kleszczy naczyniowych i przywrócenie przepływu przed zamknięciem naczynia. Zwierzęta pozostawiono do wyzdrowienia przez 14 dni przed zebraniem znanej tętnicy szyjnej. Zebraną tkankę podzielono i naczyniową błonę wewnętrzną oznaczono cyframi i zmierzono w komputerze o układzie planimetrycznym. Dla każdego zwierzęcia, uśredniono 15 pomiarów dla każdego nietraktowanego segmentu i 15 pomiarów dla traktowanego segmentu.

{2-[(2-aminoetylo)amino]-9-(metyloetylo)puryn-6-ylo}['(4-chlorofenylo)metylo]aminę podano w dawce 5 mg/ml zmniejszając neointymalną powierzchnię około 90% w porównaniu z 6% zmniejszeniem za pomocą samej solanki.

Wyniki z tego przykładu znajdują się na fig. 1. Zgodnie z fig. 1, podawanie związku 3 według przykładu 1 do uszkodzonej tętnicy szyjnej zmniejszało powierzchnię nowej błony wewnętrznej naczyń o około 88% w porównaniu z 6% zmniejszeniem uzyskanym w przypadku podania samej solanki jako nośnika

Przykładu. Próby kinazy ΙκΒ-α:

Kompozycje według niniejszego wynalazku badano w celu określenia ich aktywności hamowania kinazy ΙκΒ-α. W badaniach tych zastosowano linie komórkowe śródbłonka ludzkiej żyły pępkowej (HUVEC) zakupionej z firmy Clonetics (San Diego, Kalifornia) i utrzymywano w pożywce wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 2% płodowym osoczem bydlęcym, 10 ng/ml ludzkim rekombinantowym naskórkowym czynnikiem wzrostu, 1 pg/ml hydrokortizonu, 50 pg/ml gentamycyny, 50 ng/ml amfoterycyny E i 12 pg/ml ekstraktu mózgu

189 775 bydlęcego w 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek. Wszystkie pożywki wzrostu i dodatki zakupiono w firmie Clonetics (San Diego, Kalifornia). Serotyp E. coli lipopolisacharyd (LPS)

0111 :B4 zakupiono z firmy Sigma (Saint Louis, M1). Wszystkie inne środki chemiczne miały czystość do analizy.

Wytwarzanie lizatu komórkowego: Warstwę komórek na powierzchni odżywki (75 cm²) HUVEC poddano działaniu LPS (100 ng/ml) przez 5 minut, po czym pożywkę komórkową szybko usunięto i warstwę komórek przemyto trzy razy lodowato zimnym PBS. Warstwę komórek zdrapano do 10 ml PBS i komórki przetworzono w peletkę przez odwirowanie (3000 obrotów/min, 5 min, 4°C). Lizat komórkowy wytworzono przez inkubowanie peletki komórkowej w 0,2 ml bufora (20mM HEPES, pH 7,3, 50mM NaCl, 10mM MgCh, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM ortowanadanu sodowego, 10mM β-glicerofosfatu, 1mM fluorku fenylometylosulfonylu, 1mM ditiotreitolu, 0,5% Nonidet P-40) przez 15 minut w 37°C, często wirując. Resztki komórek usunięto z próbki przez mikrowirowanie (10000 x g, 15 minut, 4°C) i Supernatant „sklarowano” przez dodanie 100 ml zawiesiny sefarozy 4B w buforze i łagodnie zmieszano przez 1 godzinę w 4°C. Kulki sefarozy 4B usunięto przez mikrowirowanie i Supernatant podzielono na próbki i magazynowano w 80°C.

Próba kinazy iKB-a w fazie stałej: 1 pg GST- lKB-α, odpowiadającej ludzkiego pochodzenia IK3-a o pełnej długości, (Santa Cruz Biotechnology) inkubowano z 20 pl 50% zawiesiny glutationu S sefarozy 4B (Pharmacia) w buforze reakcji (20mM HEPES, pH 7,3, 10mM MgCh, 15mM β-glicerofosforanu, 0,5mM ortowanadanu sodowego, 0,5mM EGTA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kompleks GST-hęB-kulki przemyto trzy razy 0,5 ml buforem reakcji przez ponowne przeprowadzone w stan zawiesiny i poddano mikrowirowaniu. Następnie do kompleksu GST-I^B-kulki dodano 10 pg białek lizatu komórkowego HUVEC w 100 pl buforu reakcji i mieszaninę inkubowano podczas łagodnego mieszania w 4°C przez 1 godzinę. Następnie kompleks kulek przemyto trzy razy buforem reakcji zawierającym 0,2 M NaCl i jeden raz samym buforem reakcji. Na zakończenie kompleks kulek ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 20 p buforu reakcyjnego, który zawierał 5 pCi[y-³2P]ATP (>5000 ci/mmol, New England Nuclear Corp. Boston, MA) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Reakcje zakończono przez dodanie 10 pl próbki buforu SDS- PAGE i doprowadzono do wrzenia przez 3 minut przed rozdzieleniem za pomocą SDS-PAGE (10-20% gradient Readygel, BioRad). Po elektroforezie żel utrwalono (50% metanol, 10% kwas octowy) przez 15 minut, przemyto trzy razy przez 5 minut każdy destylowana H2O i poddano działaniu 5% gliceryny przez 15 minut, po czym wysuszono i wystawiono na działanie filmu do autoradiografii (X-ONIAT XAR-5 Kodak).

Próba kinazy w żelu: Badano aktywność izozymów IkB-α stosując modyfikacje wcześniej opublikowanych sposobów (11, 19, 20).

Skrócony duplikat próbek kompleksu IKB-glutation sefaroza 4B-kulki wytworzono w wyżej opisany sposób i rozdzielono drogą elektroforezy przez 12% żel SDS-PAGE, który spolimeryzował w obecności 15 pg/ml GST- IKB-α. Po elektroforezie żel dwukrotnie przemywano łagodnie przez 30 minut, każdorazowo 50mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM β-merkaptoetanol; 20% izopropanol w celu usunięcia SDS. Następnie białka denaturowano w żelu drogą inkubowania przez 45 minut w 100 ml 50mM Tris-HCl pH 8,0; 5mM P-merkaptoetanol; 0,04% Tween 40. Następnie żel wycięto w połowie w celu wyodrębnienia zdublowanych próbek, jedną połowę inkubowano w 10 ml samego buforu reakcyjnego, a drugą w 10 ml buforu reakcji zawierającego 10 pg/ml 2-dietanoloammo-6-(4-fenyloanilino)-9-izopropylopurynY (związek 6 z przykładu 2) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, do której dodano 10 pCi[y- PJATP inkubowanie kontynuowano przez dalszą godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie żele poddano wielokrotnemu minutowemu przemywaniu, 100 ml, każdy składał się z 5% kwasu trichlorooctowego zawierającego 1% pirofosforanu sodowego, aż 1 ml roztworu z przemywania da obraz bardzo bliski radioaktywności tła. Żele następnie wysuszono i poddano autoradiografii.

Wytwarzanie matrycy powinowactwa 2-dietanoloamino-6-(4-fenylobenzyloamino)-9-izopropylopuryny-epoksy-aktywowanej sefarozy 6B

Do reakcji sprzęgania wybrano wysuszoną przez wymrażanie epoksy-aktywowaną sefarozę 6B (Pharmacia Lk.B, Piscataway, NJ) z powodu jej powinowactwa do formy wiązania eterowego między zawierającym hydroksyl ligandem i grupą epoksydową w sefarozie. Zgod189 775 eterowego między zawierającym hydroksyl ligandem i grupą epoksydową w sefarozie. Zgodnie z instrukcją wytwórcy spęczniono żel, (100 mg) związku 6 z przykładu 2 rozpuszczono w 1 ml roztworu sprzęgającego (1,2:1 objętościowo/objętościowo dimetyloformamid : O,1N NAOH) i mieszano z 0,5 ml spęcznionego żelu przy pH 10-11 przez 72 godzin w temperaturze pokojowej podczas łagodnego wstrząsania. Nadmiar grup reaktywnych zablokowano IM etanoloaminą przez 4 godziny w 50°C i zawiesinę żelu wlano do 1 ml zbiornika strzykawki. Żywicę aktywowano w trzech kolejnych cyklach w dwudziestu pojemnych kolumnach każdy, bufory o pH 4,0 (0,lM octan, 0,5M NACI) i pH 8,0 (0,lM Tris-HCl, 0,5M NACI), po czym w dwudziestu kolumnach z buforem reakcji (20mM HEPES, pH 7,3, lOmM MgCl₂, 15mM β-glicerofosforan, 0,5mM ortowanadan sodowy, 0,5mM EGTA). Kolumnę przechowywano w 4°C w buforze reakcyjnym zawierającym 0,5% azydek sodowy i regenerowano przed każdym zastosowaniem kolejnego cyklu z wysokim i niskim pH, jak to wyżej opisano.

Aktywowany lizat komórkowy HUVEC (500 pg białka w 1 ml buforu reakcyjnego) przepuszczono nad matrycą sefarozy CVT-1545 kolejno pięć razy i przepływ zachowano (materiał niezwiązany). Następnie matrycę przemyto trzy razy 1 ml buforu reakcyjnego (przemywanie 1-3), a następnie trzy razy buforem reakcyjnym zawierającym 0,5M NaCl (eluat 1-3). Próbki (20 pl z 1 ml) z każdej próby badano na ich powinowactwo do fosforylanu na kulkach kompleksu GST-IięB-sefaroza i analizowano za pomocą wyżej opisanej SDS-PAGE.

Próba powinowactwa wzbogaconej kinazy ΙκΒ-α

Jako źródło enzymów zastosowano zgromadzone eluaty 0,5M NaCl z matrycy powinowactwa do przeprowadzenia filtracyjnej próby kinazy ΙκΒ-α. Każda mieszanina reakcyjna zawierała kinazę ΙχΒ-α o wzbogaconym powinowactwie (1 pg białka), 10 ng kinazy GST ΙκΒ-α i 0,5 pCi [y-³²P] ATP (>5000 Ci/mmol, New England Nuclear Coip, Boston, MA) w 20 pg buforu reakcyjnego. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zakończono przez dodanie 2 pl 0,5M EDTA. Mieszaniny reakcyjne naniesiono w postaci plamek na krążki fosfocelulozy (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) i filtry przemyto trzy razy 0,15M kwasem fosforowym podczas łagodnego wstrząsania przez 15 minut (aż do dziesięciu filtrów przemyto 300 ml 0,15M kwasu fosforowego). Po trzecim przemyciu filtry wysuszono na powietrzu, dodano do płynu scyntylacyjnego i zbadano za pomocą cieczowej spektroskopii scyntylacyjnej.

Elektroforetyczna próba przesunięcia ruchliwości AsM:

Jądrowe ekstrakty sporządzono z zastosowaniem procedury ekstrakcji buforem o dużej zawartości sob. 10 pmol podwójnie zlanej NF-κΒ zawierającej oligonukleotyd (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') (Promega) znaczono 5 pCi [y- P] ATP na końcówce 5'(>5000 Ci/mmol, New England Nuclear Corp, Boston, MA) drogą inkubowania z kinazą polinukleotydu T4 przez 1 godzinę w 37°C. Nieinkorporowane nukleotydy usunięto przez przepuszczenie mieszaniny reakcyjnej przez 1 ml kolumnę Sephadex G-5-spin. Próby wiązania przeprowadzono w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny i składały się z 10 pg białka ekstraktu jądrowego, 1 pg DN nasienia łososia i 5x10⁴ cpm znaczonego ³²P oligonukleotydu w obecności i przy braku pięćdziesięciofałdowy nieznaczonego oligonukleotydu. Kompleksy DNA-białko rozpuszczono przez 8% niedenaturowany żel poliakrylamidu do elektroforezy, żele wysuszono na filtrze papierowym i zobrazowano drogą autoradiografii.

Claims

1. 2,6,9-Tripodstawiona pochodna puryny o wzorze (i;

w którym

R1 oznacza atom chloru, grupę dietanoloaminową, 4-chlorofenylometyloaminową, (4-metylofenylo)metyloaminową, (2,4-dichlorofenylo)metyloaminową, (3-metylofenylo)metyloaminową,(4-trifluorometylofenylo)metyloaminową, (3,5-bis-trifluorometylofenylo)metyloaminową, (3-chlorofenylo)metyloaminową, (2-trifluorometylofenylo)metyloaminową, (4-chloro-3-trifluorometylofenylojmetyloaminową (3 -chlorofenylo)metyloaminową, (2-chlorofenylo)metyloaminową, (2,5-difluorofenylo)metyloaminową, (l-nafitylo)metyloaminową, (2-chloro-5-trifluorometylofenylo)metyloaminową, 4-fluorofenylometyloaminową, 4-metoksyfenylometyloaminową, (4-fenylofenylo)-aminową, (4-fenylofenylo)metyloaminową, 3-fenoksyfenylo-3-benzyloksyfenylową, (4-sulfonamidofenylo)metyloaminową, benzyloaminową, 4-metoksybenzyloaminową, 4-chlorobenzyloksy, etanoloaminową, 4-chlorobenzyloaminową, cykloheksylometyloaminową, piperonyloaminową, anilinową, 4-fenyloanilinową, 4-fenylobenzyloaminową, 4-(2-(tiofenylo)benzyloaminową, 4-(4-metylofenylo)benzyloaminową, 4-(4-trifluorometylofenylo)benzyloaminową, 4-tiometoksyanilinową, 3-(4-nitrylofenylo)anilinową, 4-(2-pirydynylo)benzyloaminową, 4-bromoanilinową, 4-(3-metoksyfenylo)benzyloaminową, 4-(4-metoksyfenylo) benzyloaminową;

R2 oznacza atom wodoru, izopropyl, perfluoroizopropyl, metyl, trifluorometyl, 2-metylopropyl, izobutyl, benzyl, hydroksyetyl, 3-cyjanopropyl, 3-chloropropyl, metylo-4-karboksybenzyl, naftaloiloetyl, 2-okso-3-butyl;

R3 oznacza atom chloru, grupę 4-metoksybenzyloaminową, 2-aminoetyloaminową, (4-metylomerkapto)anilinową, 4-fenylobenzyloaminową, etanoloaminową, dietanoloaminową, 2-(N2-dimetyloamino)-N 1 -benzyloetyloaminową, 1 -hydroksymetylo-2-metylopropyloaminową, 1 -hydroksymetylo-etyloaminową, 2-hydroksyetyloaminową, (lR,2S)-2-hydroksy-11-metylo-2-fenyloetyloaminową, 1 -hydroksymetylo-2-metyloetyloaminową, 2-amino-propyloaminową, benzyloaminową, 3-pirolinową, serynolową, 1,3-diamino-2-hydroksypropylową, N-(2-cyjanopropylo)-N-(3-pirydylometylo)aminową, 2-(hydroksymetylo-3-metylobutano-2-aminową, 3-hydroksypiperydynową, diizopropanoloaminową, N-benzylo-N2-hydroksyetyloaminową, 3-amino-1,2-propanodiolową, (S)-2-amino-3-fenylopropyloaminową, 1 -(hydroksymetylo)-2-metylopropyloaminową, 2-hydroksy-2-fenyloetyloaminową 2-amino-N 1 -(2-hydroksyetylo)-etyloammową, (S)-2-fenylo-1 -karboksyamidoetyloaminową, 2-amino-N2-(2-hydroksyetylo)-N 1 -hydroksyetylo-etyloaminową, 3-aminopropyloamincwą, 5-amino-pentyloaminową, 2-aminc-2-metyloetyloaminową, 1-(hydroksymetylo)propyloamincwą, 1-(hydroksymetylc)etylcaminową, 2-aminopropyloaminową, (2-tetrahydrcfιu·anylo)metyloammcwą, 2-hydrcksymetylcpropyloamincwą.

2. Związek wedlug zastrz. 1, którym jest

2- {(2-hydroksyetylo) [9-(metylcetylc)-6-( {[4-(trifluorometylo)fenylc]metylc} amino)puryn-2-ylo] amino } etan- 1-ol;

{((2S)oksolan-2-ylo)metylo] (6- {[(4-fluorof enylo)metylo]amino} -9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)amina;

[((2R)oksolan-2-ylo)metylo](6- {[(4-fluorofenylc)metylo]-amino} ^-(metyloetylojpuryn-2-ylo)amina;

189 775

3- (2-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-6-{[4-chlorofenylo)-metylo]amino}puryn-9-yl)butan-2-on;

2-[(6- {[(4-chlorofenylo)metylo] amino} -9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)amino]-3-metylobutan-1-ol;

4- [({2- [(2-aminoetylo)amino] -9-(metyloetylo)puryn-6-ylo } amino)metylo]benzenosulfonamid;

2-[(2-hydroksyetylo)(6-{[(4-metoksyfenylo)metylo]amino}-9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)-amino]etan-1-ol;

2-((2-hydroksyetylo) { 9-(metyloetylo)-6- [(4-fenvlo-f enylo)amino]puryn-2-ylo } amino)-etan-1-ol;

)2-[(2-amino-2-propylo)amino]-9-(metyloetylo)puryn-6-yio}f(4-chlorofenylo)metylo] amina;

{2- [(2-aminoetylo)amino] -9-(metyloetylo)puryn-6-ylo} - [(4-chlorofenylo)metylo] amina;

2-[(2-aminoetylo)(6- {[(4-chlorofenylo)metylo]amino} -9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)amino]-etan-1-ol;

2- {[(4-bromofenylo)amino]-9-(metyloetylo)purin-2-yl} -2-(2-hydroksyetylo)aminoetan-1 -ol;

2-[(6-{{(4-chlorofenyio)metyio]amino}-9-(metyioetyio)puryn-2-ylo)(2-hydroksyetyio)-amino] etan-1-ol;

(2-aminoetylo)(6-{[(4-chlorofenylo)metylo]amino}-9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)amina;

(2-aminopropylo)(6- {[(4-chlorofenylo)metylo]amino} -9-{metyloetylo)puryn-2-ylo)amina; i

2-[(6-{[(2,5-difiuorofenyio)metyio]amino}-9-(metyloetylo)puryn-2-ylo)(2-hydroksyetylo)amino]etan-1 -ol.

3. Zastosowanie 2,6,9-tripodstawionej puryny o wzorze (I) zdefiniowanym w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej z proliferacją komórek wybranej z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń, cukrzyca typu I, stwardnienie rozsiane, rak, nawrót zwężenia, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi i skaza moczanowa (dna).

4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym chorobąproliferacyjnąjest nawrót zwężenia.

5. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym chorobą proliferacyjną jest rak.

6. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym chorobą proliferacyjną jest torbielowatość nerek.

7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca znany nośnik i/lub substancje pomocnicze oraz substancję czynną, znamienna tym, że zawiera jako substancję czynną terapeutycznie skuteczną ilość 2,6,9-tripodstawionej pochodnej puryny o wzorze (I) zdefiniowanym w zastrz. 1.