CZ302122B6 - Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující - Google Patents

Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující Download PDF

Info

Publication number
CZ302122B6
CZ302122B6 CZ20090045A CZ200945A CZ302122B6 CZ 302122 B6 CZ302122 B6 CZ 302122B6 CZ 20090045 A CZ20090045 A CZ 20090045A CZ 200945 A CZ200945 A CZ 200945A CZ 302122 B6 CZ302122 B6 CZ 302122B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino
aminobenzyl
purine
isopropyl
purin
Prior art date
Application number
CZ20090045A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ200945A3 (cs
Inventor
Havlícek@Libor
Kryštof@Vladimír
Zatloukal@Marek
Doležal@Karel
Strnad@Miroslav
Vojtešek@Borivoj
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Bioapex, S. R. O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci, Bioapex, S. R. O. filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ20090045A priority Critical patent/CZ302122B6/cs
Priority to PCT/CZ2010/000004 priority patent/WO2010085924A2/en
Priority to US13/146,339 priority patent/US9023857B2/en
Priority to EP10716265.3A priority patent/EP2391626B1/en
Publication of CZ200945A3 publication Critical patent/CZ200945A3/cs
Publication of CZ302122B6 publication Critical patent/CZ302122B6/cs
Priority to ZA2011/04945A priority patent/ZA201104945B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Rešení se týká konkrétních 6-(2-aminobenzylamino)purinu se spolecným obecným vzorcem I, které se používají pro inhibici CDK, zejména pri ošetrování virových infekcí a onemocnení, která zahrnují bunecnou proliferaci, jako jsou nádory, psoriáza, restenóza, revmatická artritida, atd., a farmaceutických prípravku tyto slouceniny obsahující.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových purinových derivátů ajejich použití, zejména v léčbě virových a nádorových onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Deregulace mechanizmů kontrolujících průběh buněčného dělení je charakteristickým znakem nádorového bujení. Cyklin-dependentní kinázy (CDK) představují rodinu silně konzervovaných is senn/threonin proteinkináz, které jsou aktivní v komplexu se svými regulačními jednotkami, cykliny. Lidský genom obsahuje 13 CDK, 48 CDK-příbuzných kináz a 25 cyklinů. Různí členové rodiny CDK zasahují do řady klíčových buněčných procesů: CDK1, 2, 3, 4, 6 a 7 regulují buněčný cyklus, CDK 7, 8 a 9 interagují přímo s transkripčními faktory, CDK5 a 11 kontrolují funkce nervových buněk, CDK2, 5, 6 a 9 buněčnou diferenciaci a CDK1, 2, 4, 5, 6 a 11 ovlivňují apoptózu (Knockaert a kol.: J. Biol. Chem. 277: 25493-25501, 2002). Funkce CDK jsou regulovány cykliny, CDK-inhibujícími proteiny a subcelulámí lokalizací. Protože mnohé CDK jsou důležitými regulátory buněčného dělení, cílem farmaceutického průmyslu byl a je objev a vývoj farmako logických CDK inhibitorů (CDKI) jako potenciálních protinádorových léčiv. CDKI jsou rozmanitou a nesourodou skupinou malých rovinných heterocyklů - purinů, pyrimidinů, flavo25 noidů nebo bis-indolů, vážících se do ATP-vazebného místa CDK, kde mohou kompetovat s ATP (de Azevedo a kol., Eur. J. Biochem. 243:518-526, 1997).
Klíčové regulátory cyklu jsou reprezentovány třemi skupinami proteinů: cykliny, cyklin-dependentními kinázami (CDK) a inhibitory cyklín-dependentních kináz (CDKI).
Prvními důležitými CDKI byly CDK oligo-specifický olomoucin a CDK pan-specifický flavopiridol (Losiewicz a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 201(2):589-95, 1994). Olomoucin patri do skupiny C2, N6, N9-substituovaných adeninů, které vykazují vysokou aktivitu a specifícitu proti některým CDK; olomoucin zejména inhibuje CDK2, CDK5, a méně již Erkl (Veselý a kol., Eur. J. Biochem. 224: 771-786, 1994). Za účelem dosažení zvýšené inhibice CDK byla molekula olomoucinu podrobena strukturním modifikacím. Výsledkem klasické studie vztahu mezi strukturou a biologickou aktivitou, směřované na změny postranních řetězců olomoucinu, byl objev dvou výjimečně účinných inhibitorů CDK: roskovitinu (Seliciclib40, CYC202, Cyclacel Pharmaceuticals, Berkeley Heights, New Jersey) a v poslední době olomoucinu II (Havlíček a kol. 1997. J. Med. Chem. 40: 408-412; Kryštof a kol. Bioorg. Med Chem Lett 12: 3283-3286,
2002).
Zvýšená aktivita roskovitinu oproti olomoucinu je způsobena zavedením rozvětveným C2postranních řetězců a objemnějšího N9-isopropyl substituentu. Tyto změny významně zvýšily komplementaritu inhibitoru v ATP-vazebném místě CDK2, jak bylo dokázáno rentgenovou krystalografií (de Azevedo a kol. Eur. J. Biochem. 243:518-526, 1997), Obě strukturní změny nezměnily selektivitu roskovitinu, ale zvýšily 10-krát aktivitu roskovitinu na CDKI a CDK2, a 20-krát na CDK5. Olomoucin II se liší od roskovitinu další or/Ao-hydroxy skupinou na benzylovém kruhu, přesto tato jediná modifikace je spojena s 10-krát vyšší inhibiční aktivitou na CDK9 (Kryštof a kol., J. Med. Chem. 49: 6500-6509, 2006). Tato zvýšená afinita olomoucinu Π k CDK9 je zodpovědná za jeho zvýšenou intracelulární aktivitu, ve srovnání s roskovitinem. Například, olomoucin II indukuje jadernou akumulaci a transkripční aktivaci tumorového supresorového proteinu p53 pri 2 až 3 nižších koncentracích než roskovitin. Pri vyšších koncentracích mohou oba inhibitory inhibovat syntézu RNA zmírněním fosforylace CTD domény RNA polymerázy II (Diwan a kol., J, Virol. 78: 9352-65, 2004).
- 1 CZ 302122 B6
Zjištění, že roskovitin vykazuje také antiviralní aktivitu, stimulovalo výzkum cílený na buněčné funkce, doložený příkladem CDK, nutné pro replikaci viru (Bresnahan a kok, J. Gen. Virol.
78:1993-7, 1997; Sehang a kok, J. Virol. 73:2161-72, 1999). Roskovitin a další inhibitory CDK mají schopnost inhibovat replikaci širokého spektra virů, dokonce i v nedělících se buňkách, včetně činitelů, pro které není nutná progrese buněčného cyklu (Sehang a kok, Antivir. Chem. Chemother. 17:293-320, 2006). Lidský cytomegalovirus (HCMV), herpes simplex typu 1 a 2 (HSV-1 & 11SV-2), varicella zoster virus (VZV), virus Epstein-Barr (EBV), lidský adenovirus (HAdV), lidský virus imunonedostatečnosti (HIV), a lidský virus leukémie T-buněk (HTLV-1) jsou všechny citlivé k roskovitinu. Antivirové aktivity CDK inhibitorů korelují více s mírou CDK io inhibice než se strukturou aktivní části inhibitoru (Sehang a kok, Antivir. Chem. Chemother.
17:293-320,2006).
když bylo ukázáno, že inhibitory inhibují několik stádií replikace viru, včetně větvení, DNA replikace, reaktivace z latence, aktivace buněčných nebo virových enzymů a vnitrobuněčná komis partmentace, výzkum vedl k poznání že antivirová aktivita inhibitorů CDK je i primárně zprostředkována inhibici virus-kódované transkripce (Kapasi & Spector, J. Virol. 82(1):394-407,
2008). Zajímavé je, že roskovitin může zamezit iniciaci virové transkripce, která je specifická pro virový genom a nezávislá na promotorech (Diwan a kok, J. Virol. 78: 9352-65, 2004). Zatímco flavopiridol je CDK panspecifický a inhibuje transkripci většiny buněčných a virových genů, roskovitin je CDK oligospecifický a neinhibuje buněčnou transkripci. Selektivita roskovitinu v potlačování exprese virálně a plazmidově kódovaných genů se podobá aktivitě popsané pro interferon alfa (Nicholl & Preston, J. Virol. 70: 6336-9, 1996). V tomto kontextu je zajímavé poznamenat, že interferon alfa také inhibuje CDK a podněcuje zastavení buněčného cyklu (Mandal a kok, Oncogene 16(2):217-25, 1998).
Mechanismus, kterým inhibitory CDK potlačují replikaci viru, nebyl doposud plně objasněn a předpokládá se, že nebude pro různé látky zcela shodný. Proto bylo velmi důležité empiricky srovnat antivirové vlastnosti roskovitinu a jeho analog. V naší předcházející studii jsme zjistili, že olomoucin II a mnoho dalších látek bylo účinnějšími inhibitory aktivity CDK než roskovitin (Kryštofa kok, J. Med. Chem. 49: 6500-6509, 2006).
Podstata vynálezu
V tomto vynálezu popisujeme, že amino analoga olomoucinu II inhibují virově-kódovanou transkripci a replikaci viru při podstatně nižších koncentracích než roskovitin. Navíc, tyto sloučeniny vykazují antivirovou aktivitu na široké spektrum lidských virů, včetně orthopoxviru, HAdV, HSV-1 a HCMV. V souladu s předchozími výzkumy roskovitinu (Diwan a kok, J. Virol. 78:9352-65, 2004), látky byly účinné na virových promotorech, které nejsou inkorporovány do to buněčných genomů. Kromě toho ukazujeme, že naše látky a užití Cidofoviru má synergický efekt na buňkách infikovaných adenovirem.
Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu podle tohoto vynálezu jsou použitelné jako inhibitory cyklin-dependentní kinázy 9. Tato skupina nových purinových derivátů je charak45 teristická selektivní CDK9 inhibiční aktivitou doprovázenou silnými proti nádorovými vlastnostmi látek, zejména na virově vyvolané nádorové bujení. Proto mohou být tyto látky použity jako antimitotická a apoptotická léčiva, zejména jako protinádorová léčiva. Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout sloučeniny s protinádorovou a antivirovou aktivitou, látky mající vylepšený index selektivity a účinnosti, tedy jsou méně toxické a přitom efektivnější než analoga známá doposud. Navíc, látky zde popsané inhibují virově kódovanou transkripci a replikací účinněji než jiné látky dosud známé.
Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny, spadající do obecného vzorce I,
-2CZ 302122 B6
(I), vybrané ze skupiny zahrnující
2- ( {6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl~9/7_purin-2-y1} amino)butan- 1 —ol,
2-({6-[(2-anrnnobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-3-methylbutan-1-ol, l-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, N6-(2-amínobenzyI)-N2-(4—aminocyklohexyI}-9-Ísopropyl-9/7-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/ř-purin-2-yl}amino>-2-methylpropan-2-ol,
3- ({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-97/-purin-2-yl}amino)pentan-2-ol, io N6-(2-amino-5-chlorbenzyl)-N2“{4-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6-dÍamin, {{6-[(2-amino-5-fluorbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
1- ({6-[(2-amino-3-methoxybenzyÍ)amino]-9-isopropyi-97/-purÍn-2-yl}amino)propan-2-ol,
2- ({6-[(2~amino-5-chlorbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-oI, 2“C{6-[(2-amino-5-methoxybenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2_yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-1-ok 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-propyl-9/7-purin-2-yl }amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-chlorbenzyl)amino]-9-cyklohexyI-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2-( {6-[(2-aminobenzy l)amíno]-9-benzy l-9//-purin-2-y 1} aminojbutan-1 -ol,
2-({6-[(2-amino-5-chlorbenzyl)amino]-9-benzyl-977-purin-2~yl}amino)butan-l-ol,
N6-(2-aminobenzyl)-N2-(2-aminocykiohexyi)“9-methyl-97/-purin-2,6-diamin,
N6-(2-amino-5-chlorbenzyl)-N2-(2--aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6-diamin.
N6-(2-amino-5-f1uorbenzyl)-N2-{2-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9tf-purin~2,6-diamin,
N6-(2-aminobenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-niethyl-9Jřř-purin-2,6-diamin,
N6-<2-amino-3-methoxybenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)--9-methyl-9/7-purin-216'diamin, Nó-(2-aminobenzyl)-N2—(4—aminocyklohexyl)-9-ethyl-977-purin-2,6-dianriin,
Nó-(2-am ino benzy l)-N2-(4-ani inocyk lohexy lj-9-propy l-9/7-purin-2,6-d iam in, N6-(2-amino-3-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6-diamin,
N6~(2,5-diaminobenzyl)-N2-(4-aminocykIohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6~dÍamin, N6-{2-aminobenzyl)-N2-(4-aminocykIohexyl)-9-cyklohexyl_9//-purin-2,6-diamin,
N 6-{2-ani iuobcnzy l)-N2-(4-am inocyk lohexy l)-9-benz\l-9//--purin-2.6-diamin,
-3CZ 302122 B6
N6-(2-amÍnobenzyl)-N2-(2-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6—diamin,
Nť’-(2-aminobenzyl)-N2-(4-hydroxycyklohexyl)-9—i sopropy l-9//-purin-2,6-diamín,
1- ({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2--methylpropan-2-ol, 2^í6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin~2-yl}amirio)-3-methylbutan--l-ol,
2- ( {6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-3-methylbutan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9//-purin-2-yl}amino)-butan-l-ol.
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-aminobenzylammo)puriny podle předloženého vynálezu pro použití jako léčiva.
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny podle předloženého vynálezu pro použití jako inhibitory CDK. Sloučeniny inhibují selektivně zejména enzym CDK9.
Substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny mají velmi vysokou účinnost vůči živočišným a lidským RNA a DNA virům. Nové deriváty vykazují antivirovou aktivitu napříč širokou paletou zejména lidských virů, jakými jsou orthopoxiviry, HAdV, HSV1 a HCMV. Předmětem vynálezu je proto rovněž poskytnout substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny pro použití k léčbě virových infekcí. Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou substituované 6-{2—aminobenzylamino)puriny pro použití při výrobě léčiva pro léčení virových infekcí.
Kromě toho jsou chirálně obohacené nebo čisté (Sý-enantiomery antivirově aktivnější, zatímco (R)-enantÍomery byly znatelně méně antivirově aktivní. Důležitým aspektem tohoto vynálezu je použití sloučenin podle vynálezu pro inhibici proliferace DNA virů závislých na jevech spojených s buněčnou proliferaci nebo replikací. DNA viry zahrnují jakýkoliv virus z rodiny herpesvirů, a zvláště lidských cytomegalovirů. Použití zahrnuje podání proíylakticky nebo terapeuticky účinného množství inhibitoru CDK pacientům nebo zvířatům. Terapeuticky účinné množství je takové, které je schopné inhibice buněčné aktivity CDK9 v rozsahu zabraňujícím virové replikaci. Ostatní herpesviry, jakými je například herpes simplex, ale i ostatní cytomegaloviry, jsou rovněž vyléčitelné metodami tohoto vynálezu.
Příkladné virové infekce zahrnují infekce vyvolané DNA nebo RNA viry zahrnujícími herpesviry (herpes simplex virus typ 1 (HSV-1), HSV-2, virus varicella zoster (V2V), virus EpsteinBarrové (EBV), cytomegalovirus (CMV), lidský herpesvirus typ 6 (HHV-6), HHV-7, HHV-8, bovinní herpesvirus typ 1, koňský herpesvirus typ I), papillomaviry (HPV typ 1 až 55, zahrnující karcinogenní HPV), flaviviry (zahrnující virus žluté zimnice, virus africké prasečí horečky a virus japonské encefalitidy), togaviry (včetně viru venezuelské koňské encefalomyelitidy), chřipkové viry (typ A až C), retroviry (HIV-I, H1V-2, HTLV-1, HTLV-Π, SIV, FeLV, F1V, MoMSV), adenoviry (typ 1 až 8), poxviry (virus vakcinie), enteroviry (poliovirus typ 1 až 3, Coxsacie, hepatitis A virus, a ECHO virus), gastroenteritické viry (Norwalk virus, rotaviry), hantaviry (Hantaan virus), polyomavirus, papovaviry, rhinoviry, parainfluenza virus typ 1 až 4, viry vztekliny, respirační syncyciální virus (RSV), viry hepatitidy A, B, C a E, a podobné.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaný 6-(2-aminobenzyIamino)purinových derivátů pro léčbu virových infekcí vyvolaných DNA viry v kombinaci s obvykle používanými virostatiky jakými jsou acyklovirus, cidoflovir, tamiflu a ribavirin.
Antivirová aktivita jednotlivých sloučenin se může stanovit běžnými testy antivirové (nebo jiné antimikrobiologické) aktivity za použití testů enzymové inhibice, testů na tkáňových kulturách, testů na zvířecích modelech a podobně, jakje známo odborníkům v oboru.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být rovněž (1) aplikovány v systémech tkáňových kultur k eliminaci nebo redukci virového Šíření nebo růstu při produkci biofarmaceutických nebo jiných produktů (jakými jsou proteiny nebo vakcíny), (2) použity k eliminaci nebo redukci viro-4CZ 302122 B6 vého šíření nebo růstu v klinických vzorcích (např v krvi) a (3) použity k zastavení růstu tkáňových buněčných kultur při zachování schopnosti buněk produkovat proteiny. Význakem vynálezu jsou tedy substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I pro použití v eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v systémech tkáňových kultur pri produkci biofarmaceutických nebo jiných produktů, jakými jsou proteiny a vakcíny, pro eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v klinických vzorcích, jakými je např. krev, anebo k zastavení růstu tkáňových buněčných kultur při zachování schopnosti buněk produkovat proteiny a sekundární metabolity (antibiotika, sekundární rostlinné produkty, apod.).
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6~(2-aminobenzylamino)puriny podle předloženého vynálezu pro použití jako inhibitory buněčné proliferace a/nebo induktoiy apoptózy.
Předmětem vynálezu je dále použití substituovaných 6-(2-aminobenzylamino)purinů pro výrobu léčiv pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferací, jakými jsou nádory, restenóza, psoriáza, revmatická artritis, lupenka, diabetes I. typu, roztroušená skleróza, Alzheimerova choroba, parazitózy způsobené živočichy, houbami anebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu (onemocnění štěp versus hostitel), dna, anebo proliferativní onemocnění kůže.
Předmětem vynálezu je dále způsob inhibice CDK, zejména selektivní inhibice CDK9, inhibice buněčné proliferace anebo indukce apoptózy u savců, která zahrnuje podání terapeuticky účinného množství kompozice obsahující látku obecného vzorce 1 savcům.
Kromě ostatních CDK-příbuzných kináz, CDK9 kináza kontroluje určité kroky cyklu buněčného dělení, zejména přechod z Gi fáze do S fáze a dále pak přechod z G2 fáze do M fáze. Sloučeniny obecného vzorce I a jejich farmaceuticky přijatelné soli mohou být použity jako antimitotické látky a pro léčbu proliferativních onemocnění. Při velmi nízkých koncentracích (mikromolární a nižší) jsou schopné inhibovat přechody buněčného cyklu (Gt/S, G2/M, M-fáze/metafáze), které probíhají v živočišných tělech a v embryích. Kromě toho jsou tyto sloučeniny použitelné při léčbě auto imunitních onemocnění, např revmatoidní artritidy, lupenky, diabetů I. typu, roztroušené sklerózy; pri léčení Alzheimerovy choroby, kardiovaskulárních onemocnění jakými jsou restenóza, odmítnutí transplantátu (onemocnění štěp versus hostitel), dny a pri léčení nádorů, polycystického onemocnění ledvin a ostatních proliferativních onemocnění, jejichž patogeneze zahrnuje abnormální buněčnou proliferací.
Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty mohou být použity pro léčení onemocnění, jejichž patogeneze zahrnuje abnormální buněčnou proliferací, v kombinaci s obvykle používanými cytostatiky, jakými jsou mitoxantron, cis-platina, methotrexat, taxol nebo doxorubicin.
Kromě terapeutických aplikací (pro lidské a veterinární použití) mohou být substituované 6-(2aminobenzylamino)puriny použity jako aditiva ve tkáňových kulturách pro kontrolu stavů proliferace a/nebo diferenciace buněk in vitro, například cestou kontroly hladiny aktivní CDK 1/2 a CDK9.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-(2-amÍnobenzylamino)purinů pro inhibici katalytické aktivity cyklin-dependentních kináz, a to prostřednictvím interakce těchto sloučenin s ATP-vazebným místem těchto enzymů. Takovéto sloučeniny jsou zejména žádoucí pro redukci nadměrného buněčného růstu, neboť umožňují inhibici kinázové aktivity bez ohledu na příčinu nadměrné kinázové aktivity vedoucí k hyperproliferaci. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou tedy aktivní v situacích, ve kterých je mutovaná kináza hyperaktivní, a situacích, ve kterých je kináza přítomná ve zvýšených hladinách. Sloučeniny podle vynálezu mohou rovněž blokovat nadbytečnou kinázovou aktivitu v situacích, kdy cyklin regulující danou kinázu je přítomen v nadbytečných hladinách, nebo je mutován či je jeho vazba k CDK zvýšená. Konečně, sloučeniny podle tohoto vynálezu, které blokují kinázovou aktivitu prostřednictvím interakce
-5CZ 302122 Β6 s ATP vazebným místem enzymu, jsou rovněž vhodné pro inhibici kinázové aktivity v situacích, kdy přirozený proteinový inhibitor CDK-cyklin komplexů je mutován.
Předmětem vynálezu jc rovněž použití substituovaných 6—(2-aminobenzylamino)purinů pro aktivaci nádorového supresoru p53, který je vlastní všem savčím buňkám, kde působí jako přirozený supresorický gen zastavující nekontrolované buněčné dělení (nádory) a je schopen vypnout nádorový vývoj buněk. p53 stejně jako retinoblastomový protein (pRb) jsou dobře charakterizované nádorové supresory, jejichž inaktivace může vést k nekontrolované proliferaci a malignitě- Fosfory láce těchto dvou proteinů, které jsou zapojeny do regulačních mechanizmů buněčného cyklu, moduluje významně jejich funkci a aktivitu. Z toho vyplývá, že silně aktivní regulátory p53 představují vhodný nástroj pro terapii nádorových onemocnění, a to cestou indukce wild typu p53 proteinu ve vybraných typech nádorů.
Studie probíhající s deriváty podle tohoto vynálezu prokázaly, kromě jiného, silný účinek na apoptózu v řadě nádorových buněčných linií. Bylo pozorováno, že apoptóza může být indukována ve fázi Gj nebo G? a v souvislosti s poškozením DNA; některé buňky zastaví v G] fázi a p53dependentní apoptotická dráha je poté indukována. V jiných situacích dochází ktomu, že buňky zastavují v G?/M přechodu jako reakce na poškození DNA a pak je pozorována aktivace p53— nezávislé apoptotické dráhy. Tato dráha je zejména významná v terapií nádorů, u kterých je pozorován nedostatek aktivního p53. Je proto důležitá i aplikace nových derivátů, které stimulují p53-nezávislou apoptózu v buňkách, které se zastavily v G? fázi vlivem poškození DNA při použití agens jakými jsou mitoxantron nebo cis—platina. CDK inhibitory z tohoto vynálezu tak mohou zvýšit terapeutický potenciál současně používaných proti nádorových látek.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek obsahující alespoň jeden substituovaný 6-{2-amÍnobenzylamino)purin a farmaceuticky přijatelný nosič.
Nové sloučeniny mohou být podle tohoto vynálezu použity jako takové a nebo jako intermediáty při přípravě nových sloučenin majících řadu diagnostických, terapeutických a průmyslových použití.
Způsoby přípravy
Výchozím materiálem pro přípravu sloučeniny obecného vzorce I je 2,6-dichIorpurin připravený z hypoxantínu a hypoxanthin-l-N-oxidu chtorací pomocí POCf (Davoll a Blowy, J. Am. Chem. Soc. 1957;73:2936). Tento výchozí materiál je rovněž dostupný z komerčních zdrojů (Sigma, Aldrich, Fluka, atd.).
V jednom přístupu se 2,6-disubstituovaný purin obecného vzorce I připraví z 2,6-dichlorpurinu reakcí s příslušným nukleofilem. 2,6-Dichlorpurin je rozpuštěn v n-butanolu a poté je přidán příslušný Ró-amin (1,5 až 5 ekv.) a několikanásobný přebytek triethylaminu. Po zahřátí po dobu několika hodin je reakční směs zchlazena a je tak získán 2—chlor-6—substituovaný purin. R9 substituované deriváty jsou připraveny z 2-chlor-ó-substituovaných purinů (v DMSO nebo DMF), ke kterým se přidá práškový uhličitan vápenatý (přibližně 3 ekv.) a poté R9-halogen. Po několika hodinách až dnech intenzivního míchání je produkt izolován pomocí kapalinové chromatografie. Substituce na C2-C1 je nakonec dovršena reakcí s druhým nukleofilem (5 až 30 ekvivalentů substituovaných aminů, aminoalkanoly; merkapto deriváty za přítomnosti N-methylpyrrolidinonu nebo N-ethyldiisopropylaminu) při teplotě 160 až 180 °C. Tento produkt je nakonec izolován kapalinovou chromatografií nebo krystalizován z n-BuOH nebo vody.
-6CZ 302122 Bó
TERAPEUTICKÁ APLIKACE
Vhodné cesty pro aplikaci jsou orální, rektální, vazální místní (zahrnující okulární, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (zahrnující subkutánní, intramuskulární, intravitreózní, nitrožilní, intradermální, intrathekální a epidurální). Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.
Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsaio hují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky, i?
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulaci, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.
Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště
2(> izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např.
běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspenze mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.
Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo sem i syntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8 až 22, s výhodou pak 12 až 22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, braši do vou a li no lenovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo
3,5-di-terř-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů aje mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako methanol, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyloleát, isopropylmyristát, i sopropy 1 pal mitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylenglycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolů; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolů; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasy45 cených mastných kyselin s délkou řetězce C8 až C12 od Hůls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně.
Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např.
plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.
Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulaci výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrál55 nich látek.
-7CZ 302122 B6
Vhodné nosíce jsou obzvláště plnídla jako cukry, např. laktóza, sacharóza, mannitol nebo sorbitol, celulózové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo, pokud je to požadováno, des integrátory jako výše zmíněné škroby a dáte karboxymethylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát horečnatý io a/nebo vápenatý, polyethylenglykol nebo jeho deriváty.
Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylenglykol a/nebo oxid tita15 ničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celu lóžových preparátů jako acetylcelulózaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulózaftalát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.
Farmaceutické přípravky které mohou být užívány orálně jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátory. V měk25 kých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylenglykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylenglykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.
Další formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10% nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.
Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafínové uhlovodíky, polyethylenglykoly nebo vyšší alkoholy.
Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofilizátu společně s exci45 pienty, kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro ínfúzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbová či benzoová.
Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří zejména uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxyslouěeniny jako mastné alkoholy ajejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi
-8 CZ 302122 B6 jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol, propylenglykol, sorbitol a/nebo polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.
Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafin, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo sem i syntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo, s výhodou, hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo olej z podzemnice olejné, a dále částečné glycerové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a/nebo distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a/nebo aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, které zvyšují příjem vody.
Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou zejména mastné alkoholy, např. lauryl, cetyl nebo stearyl alkoholy, mastné kyseliny, například palmitová nebo stearová kyselina, kapalné a pevné vosky, například isopropyl myristát, lanolin nebo včelí vosk, a/nebo uhlovodíky, například vazelína (petrolátum) nebo parafínový olej.
Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. estery polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbítanové estery (Tween), dále póly oxy ethy lenové estery mastných alkoholů nebo polyoxy ethy lenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných
2o alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylenglykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.
Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.
Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako polyhalogenované alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fázejsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou používána aditiva tam zmíněná.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylenglykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylenglykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodě směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.
Tento vynález dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku a mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.
Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceuticko kých přípravků, přednostně v množství které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takového ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0,5 až 2 g.
-9CZ 302122 B6
Přehled obrázku na výkresech
Obr. 1 ukazuje dávkově závislé antiproliferativní účinky vybraných purinových derivátů na lidských nádorových buněčných liniích MCF7 a K562, s roskovitinem jako standardem.
Obr. 2 ukazuje imunoblotové analýzy MCF7 buněk ošetřených po dobu 24 h indikovanými koncentracemi sloučeniny 105. Byla pozorována redukovaná fosforylace pRb na Ser780, Ser807 a Thr821, což naznačuje pokles aktivity CDK4 a CDK2. Indukce hladin nádorového supresoru p53 a p21WAI'1 spolu s redukovanou fosforylací CTD v RNA polymeráze II naznačuje blok transkripce.
Obr. 3 ukazuje dávkově závislý účinek sloučeniny 105 a roskovitinu na p53-závislou transkripci. 4, Buňky Arn8 stabilně transfekované p53-responzivním β-galaktosidázovým reportérovým konstruktem byly ošetřeny rozdílnými inhibitory CDK po dobu 24 h a pozitivní buňky byly spočteny pomocí světelného mikroskopu pro každou koncentraci v tripl i kátech. B, indukce proteinů p53 a p21WAH v buňkách Arn8 ošetřených indikovanými koncentracemi CDK inhibitorů. C, indukce proteinů p53 a p21WAh 1 v huňáci MCF-7 po ošetření sloučeninou 105. Buňky byly sklizeny a proteiny byly separovány na 10% SDS-PAGE gelu a analyzovány na Western blotech specifickými protilátkami.
Obr. 4 ukazuje celkovou váhu myší transplantovaných leukémií P388D1, které byly intraperitoneálně ošetřeny vybraným inhibitorem CDK.
Obr. 5 ukazuje analýzu přežití myší transplantovaných leukémií P388D1, které byly ošetřeny intraperitoneálně vybraným inhibitorem CDK.
Obr. 6 ukazuje celkovou váhu myší transplantovaných lidským plicním adenokarcinomem A549, které byly ošetřeny intraperitoneálně vybraným inhibitorem CDK.
Obr. 7 ukazuje analýzu nádorového objemu myší transplantovaných lidským plicním adenokarcinomem A549, které byly ošetřeny intraperitoneálně vybraným inhibitorem CDK.
Obr. 8 ukazuje infekci buněčných linií MCF-7 (wild typ p53) a T47D (mutant p53) SV40, Exprese virálního proteinu - Velký T-antigen. p53 transkripční aktivita je reprezentována p21WAF1 transaktivací.
Obr. 9 ukazuje inhibici exprese z extrachromosomálního plazmidu pomocí PCIs. Exprese βgalaktosidázy ztransientně transfekovaného plazmidu pCMV-lacZ v buněčných liniích MCF-7 (wild typ p53) a T47D (mutantní p53).
Obr. 10 ukazuje inhibici exprese z virálního promotoru inkorporováného do buněčného genomu. Indukce SV40 velkého T-antigenu a p53 transkripční aktivity (p21WAF’ transaktivace). CV-1 a MCF-7 jsou kontrolní buněčné linie (žádná exprese velkého T antigenu).
Obr. 11 ukazuje inhibici transkripce z virálního promotoru pomocí PCI závislé na lokalizaci promotoru. Inhibice exprese β-galaktosidázy z plazmidu pHIV-lacZ transientně transfekované do H1299-TAT buněčné linie a stimulace exprese β-galaktosidázy z plazmidu pHIV-lacZ inkorporované do buněčného genomu (buněčná linie H1299-HIV) po ošetření PCI. Buněčná linie H1299 transientně transfekovaná plazmidem pHIV-lacZ byla použita jako negativní kontrola. Tato buněčná linie neprodukuje β-galaktosidázu, a to z důvodu virálního proteinu TAT, který je exprimován z plazmidu pCEP4-Tat stabilně transfekovaného do buněčných linií H1299-TAT a H1299-HIV.
- 10 CZ 302122 B6
Obr. 12A ukazuje fosforylaci CTD RNA polymerázy II v buněčné linii s inkorporovaným
SV40. Fosforylace obou serinů, tedy šeřinu 2 a šeřinu 5 je inhibována 12 hodinovém ošetření roskovitinem a sloučeninou 105 ve všech testovaných buněčných liniích.
Obr. 12B ukazuje porovnání fosforylace CTD RNA polymeráze II v buněčné linii s inkorporovaným (H1299-HIV) nebo transientně transfekovaným (H1299-TAT) plazmidem HlV-lacZ. Fosforylace sér 2 a sér 5 v obou buněčných liniích je inhibována po PCI po 12 h.
Obr. 13 ukazuje inhibici replikace HAd4. Multistupňová růstová křivka HAd4 v přítomnosti 10 μΜ sloučeniny 105, 100 μΜ Cidofoviru (CID) nebo obou (OCII+CID). Časový bod 0 h představuje virové inokulum. A. Celkový výnos viru z kultury (buněčně asociovaný + extracelulární). B. Extracelulární virus.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady slouží k objasnění vynálezu, aniž by omezovaly jeho rozsah.
Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 2,6-chlorpurin, dostupný z komerčních zdrojů (Sigma, Aldrich, Fluka, atd.). Teploty tání byly stanoveny na Kofflerově bloku a nejsou korigovány. Na měření teploty tání byl použit přístroj BIJCHI Melting Point B540 Apparatus. Elementární analýzy (C,H,N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo Finnigan). Odpařování bylo prováděno na rotační vakuové odparce při teplotách nižších než 80 °C. NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance A V 300 při teplotě 26 °C a frekvenci 300,13 MHz (’H), respektive 75,48 MHz (BC). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-dó. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard. El hmotnostní spektra byla měřena pomocí Polaris Q (Finnigan) hmotnostního spektrometru vybaveného sondou pro přímý vstup vzorku (DIP) (70 eV, teplotní gradient 40 až 450 °C, interval m/z 50 až 1000 u za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy (70 eV, 200 °C, direct inlet). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 až 1500 u. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 l/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data systém. Merck silica gel Kieselgel 60 (230 až 400 mesh) byl použit pro kolonovou chromatografíi. Všechny připravené látky poskytovaly uspokojivé výsledky elementární analýzy (± 0,4 %). Analytická tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silica gel 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHCI3:MEOH:konc.NH4OH (8:2:0,2, v/v/v).
Výchozí 9-alkyl-2,6-dích1orpuriny byly připraveny za použití postupů popsaných v literatuře:
9-methyl-2,6-dichlorpurin
1) Parker et al. Phytochemistry 25, 1986: 303 - 310
2) Brik et al. Bioorg. Med. Chem. 13, 2005: 4622 - 4626;
9-ethyl-2,6-dichlorpurin
Pitts et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 14, 2004: 2955 - 2958
9-isopropyt-2,6-dichlorpurin
1) Rypka et al. Xenobiotica 32, 2002: 1017 - 1032
2) Lu et al. J. Org. Chem. 72, 2007: 5012-5015
9-benzyl-2,6-dichlorpurin
1) Kelley et al. J. Med. Chem. 31; 1988: 2001 - 2004
2) Naitoet al. Chem. Pharm. Bul. 30, 1982: 2011 -2019
3) Dalby et al. Angew. Chem. German 105, 1993: 1822- 1823
4) Brik et al. Bioorg. Med. Chem. 13, 2005; 4622 - 4626
5) Weterings et al, Bioorg. Med. Chem. Let. 16, 2006: 3258 - 3261
6) Toyota et al. Synth. Commun. 23, 1993: 1295 - 1305
-11CZ 302122 B6
7) Gundersenet al. Tetrahedron Let. 36, 1995: 1945 - 1948
8) Lu et al. J. Organ. Chem. 72, 2007: 5012-5015 9-cyklopropyl-2.6-dichlorpurin
2,6-Dichlorpurin (I mmol), práškový uhličitan draselný (4 mmol) a cyklopropy Ijodid (5 mmol) s byly prudce míchány v 5 ml DMSO přes noc. Po odpaření rozpouštědel byl produkt extrahován do směsi voda/diethylether) a následně přečištěn pomocí kolonové chromatografie (silikagel/1%MeOH v chloroformu). Rekrystalizace z diethyletheru poskytla produkt ve výtěžku %, s teplotou tání 121 až 124 °C.
9-cyklopentyl--2,6-dichlorpurin to I) Shum et al. Nucleos. Nucleot. 20, 2001: 1067 - 1078 2) Drezér et al. J. Med. Chem. 44, 2001: 524 - 530 9-cyklohexyI-2,6-dichlorpurin
2,6-Dichlorpurin (1 mmol), práškový uhličitan draselný (4 mmol) a cyklohexyljodid (5 mmol) byly prudce míchány v 5 ml DMSO přes noc. Po odpaření rozpouštědel byl produkt extrahován is do směsi voda/diethy lether) a následně přečištěn pomocí kolonové chromatografie (siiikagel/l%MeOH v chloroformu). Rekrystalizace z diethyletheru poskytla produkt ve výtěžku %, s teplotou tání 116 až 121 °C.
Příklad 1
Příprava prekurzoru 9-alkyl-6-[(2-amino-R11-benzyl)amino]-2-chlorpurinu
9-Alkyl-2,6-dichlorpurin (2 mmol), 2-am i n obenzy lamin (2,5 mmol) a triethylamin (0,4 ml) byly zahřívány v 5 ml 1-butanolu (110 °C, 1,5 h). Produkt vykrystaloval z reakční směsi v průběhu zahřívání, případně po ochlazení na 4 °C. Produkt byl zfiltrován a promyt 1-butanolem. Pouze 9-{pent-3-yl)-2-chlor~6-[(2-amino-Rn-benzyl)amino]puriny byly izolovány pomocí kolonové chromatografie (silikagel, CHCh/MeOH: 99/1). Produkty byly rekrystalizovány ze směsi CHCIi-Et2O.
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-methylpurin; Výtěžek 91 %; tt 202 až 210 °C; 'H-NMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): 4,459 (2H, br s), 4,746 (2H, br s), 3,650 (3H, s), 6,446 (IH, br s), 6,673 (IH, dd, J = 1,2,7,9), 6,717 (IH, mt), 7,10 (IH, mt), 7,15 (IH, dd, J = 7,7,1,2), 7,682 (IH, s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-elhylpuritr. Výtěžek 90%; tt 190 až 198°C; 'H-NMR (3 00,13 MHz, CDCb, 30 °C): 1,552 (3H, t, J- 6,8), 4,150 (2H, q, J = 6,8), 4,459 (2H, brs),
4,746 (2H, br s), 6,446 (1H, br s), 6,673 (1H, dd, J = 1,2, J = 7,9), 6,717 (IH, mt), 7,10 (1H, mt), 7,15 (1H, dd, J = 7,7, 1,2), 7,682 (1H, s).
6-[(2--aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-isopropylpurin: Výtěžek 93 %; tt 190 až 192 °C; 'HNMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): 1,560 (6H, d, J= 6,8), 4,459 (2H, brs), 4,746 (2H,brs),
4,792 (IH, sept, J = 6,8), 6,446 (IH, br s), 6,673 (1 H, dd, J = 1,2, J = 7,9), 6,717 (IH, mt), 7,10 (1H, mt), 7,15 (1H? dd, J = 7,7, 1,2), 7,682 (1H, s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-cyclopropylpurin: Výtěžek 88 %; tt 204 až 220 °C; lHNMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): 1,68 (4H, mt), 3,61 (IH, mt), 4,22 (2H, brs), 5,90 (2H, brs), 6,61 (2H, mt), 6,75 (1H, d, J = 7,7), 7,0 (1H, t, 7,7), 7,90 (1H, brs), 7,84 (1H, s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-(pent-3-yl)purin: Výtěžek 90 %; tt 172 až 183 °C; lHNMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): 1,05 (6H, t, J = 3,4), 1,75 (2H, mt), 1,87 (2H, mt), 4,11 (1H, m), 4,22 (2H, br s), 5,90 (2H, br s), 6,61 (2H, mt), 6,75 (1H, d, J = 7,7), 7,00 (1H, t, J = 7,7), 7,91 (IH, brs), 8,89 (lH,s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-cyclopentylpurm: Výtěžek 89 %; tt 164 až 176 °C; 'H50 NMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): výtěžek 93 %; tt 190 až 192 °C; 'H-NMR (300,13 MHz, CDCb, 303K): 1,80-1,90 (2H, mt), 1,93-2,10 (4H, mt), 2,25-2,40 (2H, mt), 4,459 (2H, br s), 4,746 (2H, br s), 4,99 (IH, pent, J = 7,0), 6,446 (IH, br s), 6,673 (IH, dd, J = 1,2, J = 7,9), 6,717 (IH, mt), 7,10 (1H, mt), 7,15 (1H, dd, J = 7,7, 1,2), 7,682 (1H, s).
- 12CZ 302122 B6
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-cyclohexylpurin: Výtěžek 89 %; tt 165 až 174°C; !HNMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): 1,29 (2H, mt), 1,49 (2H, mt), 1,73 (2H, mt), 1,91 (2H, mt),
2,06 (2H, mt), 4,22 (2H, br s), 5,38 (iH, mt), 5,93 (2H, br s), 6,62 (2H, mt), 6,74 (IH, d, J = 7,7),
7,02 (1H, t, J = 7,7),7,91 (1H, br s), 8,52 (1H, s)
6-[(2-ammobenzyl)amino]-2—chlor-9-benzylpurin: Výtěžek 94 %; tt 200 až 211 °C; *H-NMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): 4,21 (2H, br s), 5,91 (2H, br s), 6,60 (2H, m), 6,74 (IH, d, J - 7,7),
7,02 (4H, mt), 7,14 (2H, dd, J = 7,5, 1,2), 7,90 (IH, brs), 8,49 (IH, s)
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-cyclopentylpurin: Výtěžek 89 %; tt 164 až 176°C; 'HNMR (300,13 MHz, CDCb, 30 °C): Výtěžek 93 %; tt 190 až 192 °C; *H-NMR (300,13 MHz, io CDCb, 303K): 1,80-1,90 (2H, mt), 1,93-2,10 (4H, mt), 2,25-2,40 (2H, mt), 4,459 (2H, brs),
4,746 (2H, br s), 4,99 (1H, pent, J = 7,0), 6,446 (1H, br s), 6,673 (1H, dd, J = 1,2, J = 7,9), 6,717 (1H, mt), 7,10 (IH, mt), 7,15 (IH, dd, J - 7,7, 1,2), 7,682 (IH, s).
Příklad 2
Příprava 2-alkylamino-9-alkyl-6-[(2-amino-Rn-benzyl)amino]purinů
6-[(2~amino-Rn-benzyl)amino]-2-chlor-9-alkylpurin (1 mmol), odpovídající amin (3 mmol) a díisopropylethylamin (2 mmol) byly zahřívány (teplota a reakční doba je specifikována pro každou níže uvedenou látku) v N-methylpyrrolidonu (5 ml, zatavená ampule). Reakční směs byla pak vytřepána do směsi voda:CHCb (1:1, v/v). Kolonová chromatografie (silikagel, chloroform/methanol) následně poskytla čistý produkt.
N-6-(2-aminobenzyl-N-2-heptyl-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diwnin
Reakční podmínky: 155 °C, 2 h. Kapalinová chromatografie 1% MeOH vCHCb: krystalizace z abs. Et2O; tt 65 až 72 °C. ‘H-NMR, δ ppm: 0,90 (3H, t, J = 6,8, C2SH), 1,31 (4H, m, C2O’2IH), 1,38 (2H, m, C22H), 1,54 (6H, d, J = 6,8, C,718H), 1,64 (2H, m, C24H), 2,39 (2H, t, J = 8,2, C23H), 3,44 (2H, q, J- 6,8, Cl9H), 4,65 (IH, sep, J= 6,8, C16H), 4,70 (2H, bs, NUH), 4,78 (2H, d, J = 5,9, C9H), 5,40 (IH, bs, N2H), 6,34 (IH, bs,NóH), 6,65 (IH, dd,J = 7,7, U,CI2H), 6,71 (IH, tt, J = 7,7, 1,3, C14H), 7,10 (IH, tt, J = 7,7, 1,5, CnH), 7,14 (IH, dd, J = 7,7, 1,3, C15C), 7,44 (IH, s, CSH), >3C-NMR, δρρ/η: 14,74 (C25), 23,18 (C16, 17), 23,30 (C24), 27,71 (C22), 29,78 (C21), 30,43 (C23), 32,47 (C20), 42,61 (C19), 42,81 (C9), 47,27 (C16), 114,48 (C5), 116,52 (Cl2), 118,76 (Cl4), 123,11 (CIO), 129,75 (Cl3), 131,21 (C15), 135,63 (C8), 146,24 (Cil), 151,07 (C4), 154,58 (C6), 158,69 (C2).
(RS)-l-({6—[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purin-2-yl}amino)propan-2-ol Reakční podmínky: 155 °C, 2 h. Kapalinová chromatografie 1,5% MeOH vCHCb; rekrystaiizace zabs. CHCb; tt 175 až 179 °C. lH-NMR, δ ppm: 1,26 (3H, d, J= 6,4, C2IH), 1,55 (6H, d, J -6,8, CI718H), 3,41 (IH, m, Cl9Ha), 3,55 (IH, m, Cl9Hb), 4,07 (IH, quiqui, J = 6,8, 2,6, C20H), 4,60 (IH, bs, O20H), 4,64 (IH, sep, J = 6,8, C1ÓH), 4,68 (2H, bs, NUH), 4,79 (2H, bs, C9H), 6,08 (IH, bs, N2H), 6,60 (IH, bs, N6H), 6,68 (IH, dd, J= 7,8, 1,1, CI2H), 6,74 (IH, tt, J - 7,5, 1,1, CI4H), 7,12 (IH, tt, J = 7,7, 1,5, C13H), 7,18 (IH, dd, J = 7,7, 1,3, CI5H), 7,53 (IH, s, CSH), 13CNMR, δρρ/η: 21,54 (C21), 23,16 (C17,18), 43,09 (C9), 47,70 (C16), 50,57 (C19), 69,17 (20), 114,42 (C5), 117,00 (C12), 119,29 (C14), 122,76 (CIO), 129,93 (Cl3), 131,16 (Cl5), 136,02 (C8), 145,79 (Cil), 150,20 (C4), 154,06 (C6), 158,68 (C2).
(R)-l-({6—[(2—aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purin-2-yl} amino)propcm-2-ol Reakč η í podmínky: 155 °C, 2 h. Kapalinová chromatografie 1,5% MeOH v CHCb: rekrystalizace zabs. CHCI,; tt 169 až 175 °C. 'H-NMR, δ ppm: 1,26 (3H, d, J = 6,7, C2IH), 1,55 (6H, d, J = 6,8, CI7I8H), 3,41 (IH, m, C19Ha), 3,55 (IH, m, CI9H„), 4,07 (IH, quiqui, J = 6,8, 2,6, C?0H), 4,60 (IH, bs, O2°H), 4,64 (IH, sep, J = 6,8, CI6H), 4,68 (2H, bs, NnH), 4,79 (2H, bs, C9H), 6,08 (IH, bs, N2H), 6,60 (IH, bs, N6H), 6,68 (IH, dd, J = 7,8, 1,1, CI2H), 6,74 (IH, tt, J = 7,5, 1,1, C14H), 7,12 (lH,tt,J = 7,7, 1,5, CI3H), 7,18 (IH, dd,J = 7,7, 1,3,CI5H), 7,53 (IH, s, CSH), t3C-NMR, δ ppm: 21,54 (C21), 23,16 (C17.18), 43,09 (C9), 47,70 (C16), 50,57 (C19), 69,17 (20), 114,42
-13 CZ 302122 B6 (C5), 117,00 (Cl2), 119,29 (Cl4), 122,76 (CIO), 129,93 (Cl3), 131,16 (Cl5), 136,02 (C8),
145,79 (Cil), 150,20 (C4), 154,06 (C6), 158,68 (C2).
(RS)-2-( 16-[(2-amin()benzyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purin-2-ylj amino)butan-/-ol Reakční podmínky: 160°C, 6 h. Kapalinová chromatografie 1,5% MeOH v CHCI3; rekrystalizace z abs.
CHCI,/ abs. ELO; tt 152 až 156°C. 1 H-NMR, δ ppm: 1,04 (3H, t, J - 7,3, C“H), 1,53 (6H, d, J = 6,8, CI7J*H), 1,63 (2H, tn, C2IH), 3,66 (IH, m, C2t)Ha), 3,83 (IH, dd, J = 11,0, 2,6, C20Hb), 3,96 (IH, qui, J = 6,8, CI9H), 4,58 (2H, bs, NllH), 4,58 (IH, bs, Ο2θΗ), 4,59 (IH, sep. J = 6,8, C'f’H), 4,73 (2H, bs, C9H), 5,33 (IH, bs, N2H), 6,47 (IH, bs, N6H), 6,65 (IH, dd, J = 7,6, 1,1, Ci2H), 6,71 (1H, tt, J = 7,7, l,3,Ci4H), 7,10 (IH, tt, J - 7,7, l,5,Cl3H), 7,14 (IH, dd, J = 7,7, 1,3, io Ci5H), 7,44 (IH, s, C8H), t3C-NMR, δ ppm: 11,55 (C22), 23,12 (Cl 7), 23,18 (C18), 25,57 (C21), 42,72 (C9), 47,40 (Cl6), 56,88 (Cl9), 68,22 (C20), 114,91 (C5), 116,62 (Cl2), 118,90 (Cl4), 123,04 (CIO), 129,76(03), 131,15 (05), 135,66 (C8), 146,09 (Cil), 150,59 (C4), 154,87 (C6),
159,54 (C2).
(R)-2-( j6-[(2-aminohenzyl)aminoJ-9-isopropyl-9-H-purin-2-yl} amino) butan-l-ol
Reakční podmínky: 160 °C, 6 h. Kapalinová chromatografie 1,5% MeOH v CHCI3; rekrystalizace z abs. CHC1V abs. Et2O; tt 149 až 151 °C. 1 H-NMR, δ ppm: 1,04 (3H, t, J = 7,3, C22H), 1,53 (6H,d, J = 6,8, C'7I8H), 1,62 (2H, m, C2ÍH), 3,66 (IH, m, C2()H), 3,83 (IH, dd, J= 11,0, 2,6, C20Hb), 3,96 (IH, qui, J = 6,8, C,9H), 4,56 (2H, bs, NllH), 4,58 (IH, bs, O20H), 4,59 (IH, sep, J = 6,8, C'6H), 4,73 (2H, bs, C9H), 5,33 (IH, bs, N2H), 6,46 (IH, bs, NÓH), 6,65 (IH, dd, J = 7,7,
1,1, C'2H), 6,71 (IH, tt, J = 7,7, 1,3, CI4H), 7,10 (IH, tt, J = 7,7, 1,5, C,3H), 7,14 (IH, dd, J = 7,7,
1,3, CI5H), 7,44 (IH, s, C8H), i3C-NMR, δ ppm: 1 1,55 (C22), 23,12 (07), 23,18 (08), 25,57 (C2I), 42,72 (C9), 47,40 (06), 56,88 (09), 68,22 (C20), 114,91 (C5), 116,62 (02), 118,90 (04), 123,04 (CIO), 129,76 (03), 131,15 (05), 135,66 (C8), 146,09 (Ol), 150,59 (C4), 154,87 (C6), 159,54 (C2).
(E/Z)-N-2-(2-aminocyklohexyl)-N-6-(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin
Reakční podmínky: 160 °C, 4 h. Kapalinová chromatografie postupně 1, 2, 3, 4, 5% MeOH v CHCI-,, 0,1% koncentrovaného NH4OH.; amorfní látka. ‘H-NMR, δ ppm: 1,27 (3H, m, C22H, C24Ha), 1,51 (6H, d, J = 6,8, C17’8H), 1,70 (3H, m, C23H, C2lHb), 2,O8(1H, d, J = 10,8, C24Hb),
2,16 (IH, d, J= 10,0, C21Hb), 3,70 (IH, m, C20H), 4,27 (IH, m, CI9H), 4,64 (IH, sep. J = 6,8,
CI6H), 4,72 (2H, bs, C9H), 4,76 (2H, bs, NllH), 4,82 (2H, bs, N20H), 5,13 (IH, bs, N2H), 6,17 (IH., bs, N6H), 6,65 (IH, dd, J = 7,7, 1,1, C12H), 6,68 (IH, tt, J = 7,7, 1,3, C14H), i3C-NMR, δ ppm: 22,74 (C22), 23,33 (07,18), 25,42 (C24), 29,72 (C21), 33,39 (C23), 42,40 (C9), 46,94 (06), 52,11 (09), 57,14 (C20), 115,33 (C5), 116,56(04), 118,76(04), 123,67(00), 129,47 (03), 130,99 (05), 135,51 (C8), 145,09 (01), 151,62 (C4), 155,40 (C6), 159,96 (C2).
(Z)-N-2-(2-aminocyklohexyl)-N-6-(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin
Reakční podmínky: 160 °C, 4 h. Kapalinová chromatografie postupně 1, 2, 3, 4, 5% MeOH v CHCI3, 0,1% koncentrovaného NH4OH.; amorfní látka. 1 H-NMR, δ ppm: 1,27 (3H, m, C22H, C24Ha), 1,51 (6H, d, J = 6,7, CI7J8H), 1,70 (3H, m, C23H, C2lHb), 2,08 (IH, d, J = 10,6, C24Hb),
2,16 (IH, d, J= 10,1, C2lHb), 3,70 (IH, m, C20H), 4,27 (IH, m, Ci9H), 4,64 (IH, sep. J = 6,8,
CI6H), 4,72 (2H, bs, C9H), 4,76 (2H, bs, NnH), 4,83 (2H, bs, N20H), 5,13 (IH, bs, N2H), 6,17 (IH., bs, NĎH), 6,65 (IH, dd, J - 7,7, 1,1, C,2H), 6,68 (IH, tt, J 2 7,7, 1,3, C14H), 7,06 (IH, tt, J = 7,7, 1,5, CI3H), 7,15 (IH, dd, J = 7,7, 1,5 C15H), 7,48 (IH, s, C8H).
(E)-N-2-(2-aminocyklohexyl)-N-6-(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin Reakční podmínky: 160 °C, 4 h. Kapalinová chromatografie postupně 1, 2, 3, 4, 5% MeOH v CHCI3, 0,1% koncentrovaného NH4OH.; amorfní látka. 1 H-NMR, δ ppm: 1,27 (3H, m, C22H, C24H„), 1,51 (6H, d, J - 6,8, CI7I8H), 1,70 (3H, m, CaH, C2,Hb), 2,08 (IH, d, J = 10,6, C24Hb),
2,16 (IH, d, J= 10,2, C2lHb), 3,70 (IH, m, C2°H), 4,27 (IH, m, C'’H), 4,64 (IH, sep. J = 6,8, CI6H), 4,72 (2H, bs, C’H), 4,76 (2H, bs, NH), 4,83 (2H, bs, N20H), 5,13 (IH, bs, N2H), 6,17 (IH, bs, N6H), 6,65 (IH, dd, J = 7,7, 1,1, CI2H), 6,68 (IH, tt, J = 7,7, 1,3, CI4H), 7,06 (IH, tt,
3 = 7,7, 1,5, CI3H), 7,15 (IH, dd, J = 7,7, 1,5 CI5H), 7,48 (IH, s, C8H).
(E)—N-2-(4-aminocyklohexyl)-N-6~(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin
- 14CZ 302122 B6
Reakční podmínky: 160°C, 4 h. Kapalinová chromatografie postupně l, 2, 3, 4, 5% MeOH v CHC13, 0,1% koncentrovaného NH4OH.; amorfní látka. 1 H-NMR, 6 ppm: 0,85 (2H, m,
C2I23HJ, 1,27 (2H, m, C2L23Hbb), 1,54 (6H, d, J = 6,8, C17 I8H), 2,08 (2H, d, J = 11,0, C20·24^),
2,22 (2H, d, J = 11,0, ε20 24Η«,), 3,70 (IH, m, CI9H), 3,84 (IH, m, C22H), 4„64 (1H, sep. J = 6,8,
CI6H), 4,68 (2H, bs,NUH), 4,71 (2H, s, C9H), 4,72 (2H, bs, N22H), 5,85 (IH, bs, N2H), 6,30 (IH, bs, N6H), 6,67 (IH, dd, J - 7,7, 1,1, C12H), 6,71 (IH, tt, J = 7,7, 1,3, C14H), 7,10 (IH, tt, J = 7,7, 1,5, C”H), 7,15 (1H, dd, J = 7,7, 1,5 CI5H), 7,48 (IH, s, C8H), ISC-NMR, Sppm: 23,31 (C16.17),
30.41 (C20.24), 33,84 (C21,23), 42,35 (C9), 46,93 (C16), 51,02 (C22), 64,36 (C19), 115,10 (C5),
116.41 (C12), 118,76 (C14), 123,63 (CIO), 129,62 (C13), 131,15 (C15), 135,31 (C8), 146,21 (Cil), 151,85 (C4), 155,48 (C6), 159,43 (C2).
N-2-(4-me thoxybenzyl)-N-6-~(2-aminobenzyl)- 9-isopropyl-9H-purin~2,6-diamin Reakční podmínky: 160 °C, 1 h. Kapalinová chromatografie postupně 1, 2% MeOH vCHCb; rekrystalizace z abs. Et,O; tt 90 až 112 °C. ‘H-NMR, Sppm: 1,53 (6H, d, J = 6,8, CI7'8H), 3,81 (3H, s, C25H), 4,61 (2H, d, J = 5,7, NnH), 4,65 (IH, sep, J = 6,8, C^H), 4,74 (2H, d, J = 5,9, 15 C’H), 5,54 (IH, bs, N2H), 6,31 (IH, t, J = 7,1, N‘H), 6,62 (IH, dd, J = 7,7, 1,5, CI2H), 6,69 (IH, tt, J=7,7, 1,5, C'4H), 6,88 (2H, dd, J= 8,6, 2,0, C20·24!!), 7,09 (IH, tt, J = 7,7, 1,5, CI3H), 7,11 (IH, dd, J = 7,7, 1,5, CI5H), 7,33 (2H, dd, J = 8,4, 1,7, C2I'23H), 7,42 (IH, s, C*H), l3C-NMR. S ppm: 23,18 (C17.18), 42,62 (C9), 47,24 (06), 55,98 (C25), 114,56 (C20.24), 114,93 (C5),
116,41 (02), 118,64 (C14), 123,22 (CIO), 129,54 (C21,23), 129,68(C13), 131,20(05), 132,62 20 (09), 135,64 (C8), 146,27 (Cl 1), 151,25 (C4), 154,93 (C6), 158,96 (C2), 159,43 (C22).
(EyA-(j6-[(2-aminobemyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purm~2-yl}amino)cytíohexanol Reakční podmínky: 160 °C, 20 h. Kapalinová chromatografie 1,5% MeOH v CHCIj; amorfní látka. 'HNMR, Sppm: 0,85 (2H, m, C2123Hm), 1,39 (2H, m, C!l'23Hbb), 1,56 (6H, d, J = 6,8, CI7 I8H), 2,04 (2H, m, ϋ20·24^), 2,17 (2H, m, ε2°·24Η«,), 3,70(IH, m, CI9H), 3,80 (IH, bs, O“H), 3,85 (IH, m, C22H), 4,65 (2H, bs, NH), 4,66 (1H, sep, J = 6,8, CI6H), 4,82 (2H, bs, C’H), 5,76 (IH, bs, N2H), 6,56 (IH, bs, N‘H), 6,67 (IH, dd, J = 7,9, 1,1, CI2H), 6,73 (IH, tt, J = 7,5, 1,1, CIJH), 7,12 (IH, tt, J = 7,7, 1,5, CI3H), 7,17 (IH, dd, J = 7,7, 1,5, CISH), 7,50 (IH, s, C8H), l3C-NMR, Sppm: 23,20 (07,18), 31,22 (C21.23), 34,54 (C20,24), 43,24 (C9), 47,65 (06), 50,42 (C22), 70,48 (09), 114,12 (C5), 116,77 (02), 119,06 (04), 122,64 (OO), 129,92 (03), 131,09 (05), 30 136,00(C8), 146,09 (01), 151,49(C4), 156,63 (C6), 158,82 (C2).
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)- ANALÝZA
C2 C6 C9 [%} [M-H]' a) [M+Hf b)
1 2-aminocyktohexy lamino (2-aminobenzy! lamino methyl 62,3/7.1/30,6 365,5 367,5
2 4-aminocyktohexylamino (2-aminobenzy! lamino methyl 62.3/7.1/30,6 365.5 367,5
5 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyl lamino methyl 59.8/6.8/28,7 340,4 342,4
7 (l'hydiOxymcthyl-2- methyDpropy lamino (2-aminobenzyl)amino methyl 60,8/7,1/27,6 354,4 356.4
8 2-hydroxy-2-methy)propy lamino (2-aminobenzyl lamino methyl 59,8/6,8/28,7 340,4 342,4
46 4-am inocy k lohexy 1 amino (2-amino-3-methoxy benzyl lamino methyl 60.6/7,1/28.3 395,5 397.5
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
-15 CZ 302122 B6
Tabulka 2: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)- ANALÝZA
C2 C6 C9 l%] [M-HJ- a) [M+H]4 b)
59 4-amínocy klohexy 1 aminu í2-aminobenzyl)amíno ethyl 63,1/7.4/29.4 379,5 381,5
62 (l-hydroxymethyl)prnpylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 60,8/7,1/27,6 354,4 356,4
64 (1-hydroxy methy 1-2- rrtelhyl) propy lamino (2-am ino benzyl )amino ethyl 61,8/7.4/26.5 .368,5 370,5
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3 io Tabulka 3: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)- ANALÝZA
C2 C6 C9 [%1 [M-H]' a) [M+Hf b)
101 2-aminocyklohexylammo <2-aminobenzyl)amino isopropyl 63,9/7,7/28,4 393,5 395,5
102 4-am i π ocy klohexy lamino (2-am in obenzy 1) ami no isopropyl 63,9/7,7/28,4 393,5 395,5
103 4-hydroxycyklohexylamitH> (2-aminobenzyl)amino isopropyl 63,8/7,4/24,8 394,5 396,5
104 2-hydroxy propyl amino {2-aminobenzyl)amino isopropyl ÓU,8/7,1/27,6 354,4 356,4
105 (1 -hydroxy methyl) propylamino (2-aminobcnzyl)amino isopropyl 61.8/7,4/26,5 368,5 370.5
107 (l-hydroxymcthyl-2m ethy l)propyl amino (2-aminobcnzyl)amino isopropyl 62,6/7,6/25.6 382,5 384.5
108 2-hydroxy-2-methylpropyl amino (2-amin obenzy i)amino isopropyl 61,8/7,4/26,5 368,5 370,5
114 2-hydroxy-l -cthylpropyl amino (2 -amino benzy Damino isopropyl 62,6/7,6/25,6 382,5 384,5
115 2-aminocy klohexy lamino (2-Ltmino-5-cniorbenzy))amino isopropyl 63,4/7,9/24,6 396,5 398,5
116 4-aminocyklohexylamino (2-am i no-5 -ch 1 orbenzy l)ami no isopropyl 63,4/7,9/24,6 396,5 398,5
118 (l-hydroxymelhyi)propy lamino l2-amino-5-chlorbcnzyl)amino isopropyl 56,5/6,5/24.3 402,9 404,9
125 2-ammocy klohexy lamino (2 - am i η o-5 - Π uorbe nzy 1 )am ino isopropyl 61,1/7,1/27,2 411,5 413,5
128 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amÍno-5-fluor benzy l)amino isopropyl 58,9/6,8/25,3 386,5 388,5
138 4-aminocy klohexy lamino (2-amino-3-methylbenzyl)amjno isopropyl 64,7/7.9/27,4 407,5 409,5
161 4-aminocy klohexy lamino (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 61,6/7,6/30,8 408,5 410,5
166 2-hydroxy propyl amino (2-amino-3-methoxylbcnzyl)amino isopropyl 59.2/7.1/25,4 384,5 386,5
182 (1-hydroxy methy l)propylamino (2-am ino-5-methoxybenzy Damino isopropyl 60,1/7.3/24,5 398,5 400,5
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH 15 b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
- 16CZ 302122 B6
Tabulka 4: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)- ANALÝZA
C2 CÓ C9 [%] [M-Hf a) [M-Hf b)
184 4-aminocyklohcxy lamino (2-aminobenzyl)amino propyl 63.9/7,7/28.4 393,5 395,5
187 (1 -hydroxymethy I)propy lamino (2-aminobenzyl)ammo propyl 61,8/7,4/26.5 368,5 370,5
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Tabulka 5: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)- ANALÝZA
C2 CÓ C9 [%] [M-HJ- a) [M+Hf b)
195 4-aminocy klohexy lamino (2-aminobenzyhamino cyklohexyl 66,3/7,9/25,8 433.6 435,6
198 (I -hydroxymethyl)propy lamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexy) 64,5/7,6/23,9 408,5 4)0,5
209 (1 -hydroxymethy l)propy lamino (2-amino-5-chIorbenzyl)annno cyklohexyl 59.5/6.8/22,1 443,0 445.0
226 (1 -hydroxymethybpropylamino {2-am ino-3 - me thoxy benzy 1 )am i n o cyklohexyl 62.8/7,6/22,3 438,6 440.6
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Tabulka 6: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD> ANALÝZA
C2 C6 C9 [%1 [M-Hf a) [M+Hf b)
231 4-aminocy klohexy lam ino (2-aminobenzyl lamino benzyl 67.8/6,8/25,3 441,6 443,6
234 (1 -hydroxymethyl)propy lamino (2-amínobenzyl lamino benzyl 66,2/6,5/23,5 416,5 418.5
247 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-chlor benzy t)ami no benzyl 61,1/5,8/21,7 451,0 453,0
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 3
CDK inhibiční testy
Vybrané sloučeniny byly testovány na CDKl/cyklin B, CDK2/cyklin E a CDK9/cyklin T inhibiční aktivitu s cílem zjistit základní vztahy mezi jejích strukturou a inhibiční aktivitou. CDK/cyklin komplexy byly produkovány v Sf9 hmyzích buňkách koinfikovaných příslušným bakulovirovým konstruktem. Buňky byly sebrány 70 h po infekci do lyzačního pufru (50 mM Tris, 7,4 pH, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 20 mM NaF, 1% Tween 20, proteázové inhibitory) po
-17CZ 302122 B6 dobu 30 min na ledu a rozpustná frakce by ta získána centrifugací při 14 000 g po dobu 10 min.
Proteinový extrakt byl do doby použití skladován při -80 °C. Závěrečný testovací systém pro měření kinázové aktivity byl použit v souvislosti s experimenty s určením kínetíky s lineárními parametry. Testovací směs obsahovala 1 mg/ml histonu (Sigma Type III-S), 15μΜ ATP,
0,2 gCi [γ-12Ρ] ATP a testované sloučeniny ve finálním objemu 20 μί, vše v reakčním pufru:
mM Hepes 7,4 pH, 10 mM MgCl·, 5 mM EGTA, 10 mM 2-g lyce rol fosfátu, I mM NaF, 1 mM DTT a proteázové inhibitory. Po 10 min byla inkubace zastavena přidáním SDS pufru a proteiny byly separovány pomocí 12,5% SDS-PAGE. Měření kinázové inhibice bylo prováděno na digitálním imaging analyzeru BAS 1800. Kinázová aktivita byla vyjádřena jako procento io maximální aktivity a hodnota IC5o byla vypočtena pomocí grafické analýzy. Kinázová aktivita je vyjádřena jako procento maximální aktivity a příslušná inhibiční konstanta byla stanovena grafickou analýzou z křivek závislosti odpovědi na dávce.
- 18 CZ 302122 B6
Tabulka 7: Kinázová inhibiční aktivita vybraných nových sloučenin
č. PURINOVÝ SUBSTITUENT
C2 C6 C9 CDK1 CDK2 CDK9
OC 2-hydroxyethyl amino benzylamino methyl 7 4 5
RO (1 -hy droxy methy l)propy lamino benzylamino isopropy 1 2,7 0.84 0,72
1 2-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino methyl U 0,8 0,05
2 4-aminocy klohexy lamino (2-am inobenzyl)am ino methyl 07 0,4 0,01
5 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 0,09 0,03 0,004
7 (I-hydroxymethy 1-2- methyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 0,04 0,01 0,001
8 2-hy droxy-2-methylpropylam ino (2-aminobenzyl)amino methyl 0,04 0,02 0,001
46 4-am inocyklohexy lamino (2-amino-3-metfioxybenzyl)amino methyl 0,5 0,3 0,05
59 4-aminocy klohexy lamino (2-aminobenzy 1 lamino ethyl 0,6 0,2 0,04
62 (1-hydroxy methy l)propy lamino (2-aminobenzyl lamino ethyl 0.07 0,01 0,0007
64 (1 -hydroxymethyl-2- methyl)propy lamino (2-aminobenzy l)am ino ethyl 0,03 0,01 0,0009
101 2-aminocyklohexy lamino (2-aminobenzy l)amino tsopropyl 0,6 0,4 0,02
102 4-aminocy klohexy lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0,1 0,08 0,004
103 4-hyďroxycy klohexy lam ino (2-aminobenzyllamino isopropyl 0,2 0,15 0,003
104 2-hydroxy propylamino (2-aminobenzy l)amino isopropyl 0,09 0,03 0,006
105 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzy 1 lamino isopropyl 0,09 0,03 0,005
107 (I -hydroxymethy 1-2- methyl)propy lamino (2-amínobenzyl)amino isopropyl 0,05 0,04 0,002
108 2-hydroxy-2-methy Ipropyl amino (2-aminobenzy l)am ino isopropyl 0,02 0,008 0,0004
114 2-hydroxy-l-ethyl propylamino (2-aminobenzy I)am ino isopropyl 0,05 0,01 0,0008
116 4-aminocy klohexy lamino (2-amino-5-chlorbenzy 1 )antino isopropyl 0,08 0,04 0,005
118 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-chlorbenzyl)ainino isopropyl 0,08 0,01 0,002
128 (1 -hydroxymethy Opropylamino (2-amino-5-fluorbenzyl)ainino isopropyl 0,07 0,008 0,0009
138 4-aminocyklohcxy lamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino isopropyl 0,1 0,07 0,0006
161 4-aminocy klohexy lamí no (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 0,9 0,6 0,08
166 2-hydroxy propylamino (2-amino-3-methoxyl benzy l)amino isopropyl 0,4 0,1 0,002
182 (l-hy dro xy methy bpropy lamino (2-amino-5-methoxyI benzy l)am ino isopropyl 0,2 0,1 0,001
184 4-am inocyklohexy lamino (2-aminobenzy l)amino propy1 0,4 0,2 0,0009
187 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzy 1 )amino propyl 0,2 o,l 0,0007
195 4-am inocyklohexy lamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 0,6 0,3 0,05
198 (l -hydroxymethy !)propy lamino (2-am ino benzy l)amino cyklohexyl 0,4 0,1 0,03
209 (1 -hydroxymethybpropylamino (2-amino-5-chl orbenzy l)amino cyklohexyl 0,5 0,3 0,04
226 (1 -hy droxy methy l)propy lam ino (2-am ino-3-methoxy] benzyl)amino cyklohexyl 0,7 0,3 , 0,02
231 4-am inocyklohexy lamino (2-aminobenzyljamino benzyl 0,8 0,5 0,05
234 (1 -hydroxymethyDpropylamino (2-aminobenzy l)am ino benzyl 0.7 0,4 0,03
247 (1 -hy droxy methy l)propy lamino (2-amino-5 -chlor benzy 1 lamino benzyl 0,8 0.6 0,07
OC: olomoucin + RO: roskovitin = sloučeniny známé z dosavadní techniky.
- 19CZ 302122 B6
Tabulka 7 ukazuje výsledky inhibiční aktivity nových sloučenin vůči CDK9 v porovnání s CDKI a CDK2 a daty prototypových sloučenin (trisubstituované puriny olomoucin a roskovitin). Většina derivátů vykázala zvýšenou inhibiční aktivitu v in vitro kinázových testech. Modifikace benzenového kruhu amino skupinou v or/Ao-poloze vedla k nárůstu CDK9 inhibiční aktivity testo5 váných sloučenin a proto mohou být tyto látky považovány za specifické inhibitory CDK9.
Příklad 4 io ln vitro eyklotoxická aktivita nových derivátů
Používali jsme následující buněčné linie: Lidská T—lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, promyelocytární HL60 a monocytámí L937 leukemie, buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, buňky cervikálního karcinomu HELA, myší fibroblasty NIH3T3, lidská erythroleukemie
K562, buňky G361 lidského maligního melanomu byly použity pro rutinní screening sloučenin.
Buňky byly udržovány v Nunc/Coming 80 cm2 plastikových lahvích a pěstovány v médiu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/l glukózy, 2mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný), sloučeniny byly připraveny podle postupu podle předloženého vynálezu.
Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (104 buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), pipetovalo se 80 μί buněčné suspenze na 96-jamkové mikrotitrační destičky, lnokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C v atmosféře CO?. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20μ1 alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny ředily do šesti koncentrací v čtyřnásobné ředicí řadě. Při rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v dubletu. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře CO?. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluoroskan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (The tumor cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: <jl^o-(FDiainka Sdenv;,tcm/FDkl,nirolnijaiTlka) x 100 %. Hodnota GI5o, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.
Cytotoxicita nových sloučenin byla testována na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného hístogenetického a druhového původu (Tab. 8). Vyšší aktivity byly nalezeny u všech testovaných nádorových buněčných linií oproti kontrolním (normální buňky). Významně vyšší účinnost nových derivátů byla nalezena u buněčných linií nesoucích různé mutace nebo delece v proteinech zapojených do regulace buněčného cyklu, např. HL-60, CEM, K-562, HeLa, HOS, a G-36L To naznačuje, že tyto látky by mohly být adekvátně účinné pro nádory s různými alteracemi nádorových supresorových genů, např. p53, Rb, atd.
-20CZ 302122 B6
Tabulka 8: Cytotoxita nových sloučenin pro různé nádorové buňky
Látka Č. !C50(gM) HeLa
MCF7 K-562 HOS G361 CEM HL60 HeLa BJ
OC 132 >167 142 161 62 123 108 >167
RO 14 52 24 22 14 35 22 >167
1 13 46 22 22 15 31 18 >167
2 10 36 20 14 9 22 12 >167
5 2 6 4 3 3 8 2 >167
7 1,5 5 0.8 1,2 0.9 2,4 1.0 >167
8 1.8 3.4 1.1 1.7 0.6 2.8 1,3 >167
46 13 27 19 13 13 28 18 >167
59 14 31 17 15 10 29 20 >167
62 1,8 5.4 3,2 2,5 2,4 6.7 1.6 >167
64 1,3 4.5 0,9 1,0 0.7 2.1 1,2 >167
101 15,3 27 25 14 7 24 15 >167
102 5.5 20 44 17 9 32 16 >167
103 10,1 29.8 63 33 14 36 18 >167
104 15,4 26 31 19 17 29 15 >167
105 3,4 12.8 11 8 4,5 6.7 2,5 >167
107 5,9 15,4 22 11,5 4,3 18 6.5 >167
108 1,2 3,0 1,0 1,9 0,5 2.2 1.0 >167
114 11 28 19 15 17 34 17 >167
116 4.5 14 23 10 6.7 22 8.7 >167
118 18 8,4 7,6 6 3,2 5.4 1.6 >167
128 2.9 10.2 10,8 12 6,2 8.5 3,2 >167
138 3,8 9.5 25 13 8,7 23 9,2 >167
161 7 18 26 14 9 26 12 >167
166 17 24 32 17 13 31 16 >167
182 33 21 11 15 7.3 18 4.2 >167
184 S 24 32 19 11 35 17 >167
187 4,3 16 12 9 7,6 8,3 4,5 >167
195 12 38 22 14 11 24 13 >167
198 9 22 16 11 10 26 14 >167
209 11 25 18 14 12 31 14 >167
226 14 36 16 12 21 33 21 >167
231 15 37 23 15 12 32 16 >167
234 11 25 17 18 16 33 18 >167
247 14 41 22 21 15 34 19 >167
-21 CZ 302122 B6
Příklad 5
Inhibice CDK9 a RNA polymerázy II
Imunobloting. Buňky byly odděleny s pomocí gumového kusu a promyty 3-krát ledově chladným PBS a lyžovány v pufru (50 mM Tris, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1% Nonidet P40) obsahujícím směs proteázových a fosfatázových inhibitorů (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA). 20 pg celkových proteinů bylo separováno pomocí io SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE) v 8 nebo 10% gelu a přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Membrány byly blokovány v 5% mléku a 0,1% Tweenu 20 v PBS a inkubovány přes noc se specifickými monoklonálními protilátkami nebo králičími polyklonálními séry. Primární protilátky specifické pro RNA polymerázu II (od Santa Cruz Biotechnology,
California, USA) zahrnovaly: (i) N-20 použita v ředění 1 pg/ml, (ii) H14, specifická pro formu fosforylovanou na fosfoserinu 5, ředění 6 pg/ml a (iii) H5, specifická pro formu fosforylovanou na fosfoserinu 2, ředění 4 pg/ml. Další použité primární mAb v imunoblotech zahrnují (iv) antip53 (DO-1, vlastní) použita v ředění 1 pg/ml, (v) anti-p21WAH (118, vlastní),) použita v ředění 1 pg/ml), (vi) anti-actin (A-2066, Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA) použita v ředění 1 pg/ml, (vii) anti-T-antigen (419, vlastní), použita v ředění 1 pg/ml. Všechny primární protilátky zo byly naředěny v PBS obsahujícím 5% práškové mléko; 0,1% Tween 20. Peroxidázou konjugovaná králičí anti-myší imunoglobulin nebo prasečí anti—králičí antiséra (DAKO, Glostrup, Denmark) byly použity jako sekundární protilátky a vizualizovány EC1 reagenciemi (AmershamPharmacia, Littíe Chalfont, UK).
Fosfory láce C-terminální domény RNA polymerázy II. Modulace exprese z HIV promotoru po ošetření CDKI může být zprostředkováno transkripční regulací. U C-konce velké podjednotky RNA Pol II se nachází důležitá regulační doména, která se nazývá CTD (C-terminální doména). Studovali jsme proto účinek nových CDKI na fosforylaci CTD na šeřinu 2 a šeřinu 5. Hladiny fosforylace šeřinu 2 a šeřinu 5 v buňkách ošetřených COS-1, CV-1 a MCF-7 sloučeninou 105
3o byly značně redukovány při všech testovacích podmínkách (Obr. 2). Ačkoliv byly funkce CDK a RNA polymerázy II suprimovány, jejich exprese z inkorporováných vitálních promotorů byla zvýšená. Tato pozorování podporují tvrzení, že mechanismy působení těchto CDKI na expresi z HIV promotoru souvisí s transkripční kontrolou a vykazují rozdílné efekty v závislosti na tom, jestli byl targetovaný promotor udržován jako extrachromozomální element nebo integrován do buněčného genomu.
Příklad 6
4o Indukce nádorového supresoru p53 v nádorových buňkách
Buněčné kultury a ošetření. Buněčné linie odvozené z lidského cervikálního karcinomu (HeLa), lidského karcinomu prsu (MCF-7, BT549 a BR474), lidského osteosarkomu (HOS), lidského karcinomu tlustého střeva (HT29), myších fíbroblastů (T221acZ) a lidského melanomu (Arn8) byly kultivovány v Dulbecco Modified Eagle Mediu (DMEM) doplněném 10% fetálním bovinníi i sérem. Testované sloučeniny byly přidány z 50mM zásobního roztoku v dimethylsulfoxidu (DMSO) do kultivačního média ve finální koncentraci 20 pM. Kontrolní buňky dostaly pouze ekvivalentní objem DMSO.
Analýza p53—dependentni transkripční aktivity, β-galaktosidázová aktivita v lidské melanomové buněčné linie Am8 a buněčné linii myších fíbroblastů T221acZ (obě stabilně transfekované p53responzivním reportérovým konstruktem pRGCAfoslacZ) (Frebung et al., Cancer Res., 52, 19926976) byla stanovena. Pro stanovení celkové β-galaktosidázové aktivity byly buňky lyžovány 3
-22 CZ 302122 B6 cykly zmrazení-tání v 0,25 M Tris pH 7,5 a lyzáty byly testovány jak popsáno Sambrookem et ak (Mok Clon ing, New York, 1989). Výsledky jsou uvedeny v Tab. 9.
Protilátky (a) Monoklonální protilátky DO-Í, DO-2 a 1801 rozpoznávají N-terminální oblast proteinu p53, monoklonální protilátky DO-11 a DO-12 rozpoznávají rozdílné epitopy v hlavní doméně p53 proteinu, monoklonální protilátky Bp53-10 a Pba421 rozpoznávají C-terminální oblast p53 proteinu.
(b) Monoklonální protilátka 118 rozpoznává p21WAF1.
Polyakrylamidová gelová elektroforéza a imunobloting. Pro přímý imunobloting byly připraveny celkové lyzáty buněčných proteinů sesbíráním proteinů do horkého Laemmli elektroforet ického vzorkovacího pufru. Proteiny byly poté rozděleny SDS-poíyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGE) na 10% gelu a přeneseny na nitrocelulózovou membránu do Bio.Rad Mini Trans-Blott Electrophoretic Transfer Cell na 2 h při 4 °C a 150 mA v transferovém pufru (240 mM Tris, 190 mM glycin a 20% methanol). Označené markéry molekulární hmotnosti (Bio-Rad) běžely paralelně. Blotované membrány byly zablokovány v 5% mléku a 0,1% Tweenu 20 v PBS po dobu 2 h a inkubovány přes noc s monoklonálními protilátkami. Po 3-násobném promytí v PBS plus 0,1% Tweenu 20, bylo jako sekundární protilátka použito peroxidázou konjugované králičí anti-myší imunoglobulinové antiserum (Dako, Denmark) naředěné 1:1000. K vizualizaci peroxídázové aktivity byly použity ECL reagencie od AMERSHAM podle návodu výrobce.
TransfekČni experimenty. Buněčná linie MCF7~DDp53 byla odvozena z parenterální buněčné linie MCF-7 stabilní transfekcí plazmidem pCMVneonDDp53 kódující dominantně negativní zkrácený myší p53 protein obsahující aminokyselinová residua 1-14 a 302-390 pod kontrolou CM V promotoru. Kontrolní buněčná linie MCF-7neo byla odvozena po transfekci buněk MCF-7 pCMVneo vektorem. Transfekce byly prováděny pomocí Effectene transfection reagent (Q1AGEN, Germany) podle doporučení dodavatele. Stabilní transfektanty byly selektovány při koncentraci 2 mg/ml G418 sulfátu (Life Technologies). Exprese Ddp53 miniproteinu v MCF7Ddp53 byla prověřena pomocí imunoblotingu s Bp53-10 monoklonální protilátkou. Nezávislé izolované MCF-7Dp53 klony 9, 12 a 14 exprimuj ící vysoké hladiny Ddp53 miniprotein a MCF7-neo klonů 3, 4 a 7 byly dále používány.
Sloučenina 105 indukuje wild typ, ale ne mutantníp53 protein. Za prvé jsme stanovili příslušnou koncentraci sloučenin 103 a 105 pro naše experimenty. Buňky MCF-7 (wt p53) byly ošetřeny po dobu 12 h vzrůstajícími koncentracemi 105 v rozsahu od 1 do 100 μΜ a následně byla analyzována exprese proteinu p53 pomocí monoklonální protilátky DO-1 (Obr. 3A). Bylo prokázáno, že koncentrace 105 2 až 5 μΜ ovlivňuje hladinu p53 proteinu v těchto buňkách. Jak je ukázáno na Obr. 3C, hladina exprimovaného proteinu 5 μΜ 105 nebyla významně vyšší než hladina indukovaná 50 μΜ koncentrací a proto byla použita pro další experimenty. Za druhé, časové periody 6, 12 a 24 h byly zvoleny, neboť hladina proteinové exprese dosáhla stabilní hladiny.
Analyzovali jsme expresi proteinu p53 v buněčných liniích nádorů prsu MCF-7 (wt p53), BT549 (mut p53) a BT474 (mut p53), v buněčné linií kolorektální ho karcinomu HT29 (mut p53) a v buněčné linii osteosarkomu HOS (mut p53). Ošetření buněk MCF-7 po dobu 6, 12 a 24 h s 5 μΜ 105 vedlo k signifikantní akumulaci wild—typu p53. Nulová indukce p53 byla pozorována po expozici buněčných linií BT549 a HOS s 5 μΜ 105 po dobu 6, 12 a 24 h, exprimujících mutantní p53. Nebyla pozorována žádná korelace mezi citlivostí buněčných linií k 105 a přítomností wild-typu nebo mutantního typu p53.
\B^-indukovaný wt p53 je transkripčně aktivní a zodpovědný za indukci ρ21^ΑΗ
-23CZ 302122 B6
Účinek 105 a příbuzných sloučenin na aktivaci proteinu p53 byl rovněž analyzován pomocí lidské melanomové buněčné linie Am8 a myší fíbroblastové buněčné linie T22LacZ exprimující βgalaktosidázu pod kontrolou p53 responzivního promotoru. Indukce wt p53 v těchto buňkách ošetřených 5μΜ 105 (6, 12 a 24 h) vedly k aktivaci responzivního promotoru a následně k expresi β-galaktosidázy. Arn8 a T221acZ buňky ošetřené 105 byly zafixovány a zkoumány mikroskopicky na β-galaktosidázovou aktivitu za použití X-gal jako substrátu, což vedlo k barvení přibližně 25 % buněk modře ve srovnání s méně než 1 % modře-zabarvených buněk v DMSO-ošetřených kontrolních liniích (Obr. 3A). Celková β-galaktosidázová aktivita v Am8 io buňkách byla stanovena kolorimetrickým testem. Výsledky naznačují silnou aktivitu βgalaktosidázy 12 a 24 hodin po ošetření potvrzující přítomnost transkripčně aktivního proteinu p53 v porovnání s kontrolními buňkami ošetřenými DMSO.
Tato transkripční aktivita byla potvrzena analýzou exprese p21WAF1 v buňkách MCF-7. Indukce proteinu p53 byla průkazná již po 4 h od ošetření, avšak zvýšené hladiny proteinu p21WAF1 byly stabilně pozorovány až po 12 h od ošetření látkou 105 (Obr, 3B). Pouze buňky exprimující wt p53 odpovídaly na 105 indukcí p21. V zájmu potvrzení indukce exprese p21WAF’ jako p53responzivní byla připravena série stabilně transfekovaných klonů MCF-7 exprimujících vysoké hladiny dominantně-negativního Ddp53 miniproteinu. U tohoto proteinu obsahujícího amino20 kyseliny 1-14 a 302-390 ze sekvence myšího p53 bylo prokázáno, že se váže k C-terminální části wt p53 a abroguje p53-závislou transkripci. Kontrolní klony MCF-7neo byly připraveny stabilní transfekci buněk MCF-7 s páteřním vektorem pCMVneo bez insertu. Klony exprimující vysoké hladiny Ddp53 stejně jako kontrolní klony byly ošetřeny sloučeninou 105 a testovány na expresi p2IWAFI pomocí imunoblotingu s p21WAFI specifickými monoklonální protilátkou 118.
Jako výsledek exprese Ddp53, přerušující p53 transkripční aktivitu, nebyla detekována žádná indukce p21WAFI v MCF-7Ddp53 klonech.
Další sloučeniny měly efekt srovnatelný se 105, avšak účinné koncentrace testovaných sloučenin indukující maximum β-galaktosidázové aktivity se vzájemně lišily. Výsledky jsou prezentovány w v tabulce 9 jako koncentrace indukující maximální β-galaktosidázovou aktivitu. Zdá se, že substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny jsou účinnými induktory exprese wt p53.
Tabulka 9: Vliv vybraných substituovaných 6-(2-aminobenzyIamino)purinů na indukci proteinů 35 p53 a p21WAF1 v buňkách MCF-7 exprimujících wild-typ p53.
č. SUBSTITUENTY NA PURINU Max β-gal, aktivita
C2 C6 C9 Konc. (μΜ)
oc 2-hydroxy ethy lamino benzy 1 amino methyl 125
RO (l-hydroxymcthyl)propylamino benzylamino isopropyl 50
t 2 -am inocy klohexy lamino (2-aminobenzyl)amino methyl 34
2 4-aminocyklohexy lamino (2 -aminobenzy Γ) amino methyl 37
5 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 29
7 (l-hydroxymethy!-2- mcthyl)propy lamino (2-aminobenzyl)amino methyl 25
8 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 24
46 4-aminocyklohexy lamino (2-amino-3-niethoxybenzyl)amino methyl 32
59 4-aminocyklohexylamíno (2-aminobenzyl)amino ethyl 33
62 (1 -hydroxymethyDpropylajnino (2-aminobenzyl)amino ethyl 7
-24CZ 302122 B6
64 (l-hydroxymethyl-2- methyl)propy lamino (2-am inobenzyl)am ino ethyl 6
101 2-aminocyklohexylamino (2-aminobenzy l)amino isopropyl 22
102 4-aminocy klohexy lamino (2-aminobenzy l)amtno isopropyl 13
103 4-hydroxycyklohexylamino (2-aminobenzy l)am ino isopropyl 14
104 2-hydroxy propyl amino (2-ami nobenzy 1 )am ino isopropyl 12
105 (1-hydroxymethy l)propylamino (2-ami nobenzy 1 )ami no isopropyl 16
107 (1 -hydroxymelhyl-2- methyl)propy lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 11
108 2-hydroxy-2-methyl propyl amino (2-ami nobenzy l)ami no isopropyl 3
114 2-hydroxy-l-cthylpropylamino (2-aminobenzy l)amino isopropyl 3
116 4-aminocy klohcxy lamino (2-amino-5 -chlorbenzyl)amino isopropyl 21
118 {l-hydroxymethyl)propyiamino (2-amino-5-chlotbenzyi)amino isopropyl 18
128 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-fl uorbenzyi)amino isopropyl 4
138 4-aminocyklohexy lamino (2-am ino-3 -methy lbenzy 1 )amino isopropyl 2
161 4-aminocyklohexy lami no (2r5-diaminobenzyi)amino isopropyl 20
166 2-hydroxy propyl am ino (2-amino-3 -methoxylbenzy 1 )amíno isopropyl 14
182 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5 -methoxylbenzy 1 )am i no isopropyl 12
184 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino propyl 6
187 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-amínobenzyl)amino propyl 3
195 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzy Oamino cyklohcxyl 22
198 (1-hy droxy methyOpropylamino (2-aminobenzyI)amino cyklohexyi 19
209 (l -hydroxy methy l)propy lamino (2-amino-5-chlorbenzyl)amino cyklohexyl 20
226 (1 -hy droxy methy l)propy lamino (2-amino-3-methoxylbenzyl)ainino cyklohexyi 21
231 4-aminocyklohexy lamino (2-amínobenzyl)amino benzyl 18
234 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzy l)amino benzyl 24
247 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amíno-5-chlo rbcnzy l)amino benzyl 20
Příklad 7
In vivo proti nádorová aktivita
Screening biologické aktivity sloučeniny 105 byl proveden na modelu přežití P388D1 leukémie transplantované intraperitoneálně s 2.105 buňkami. DBA-2 myši byly použity jako hostitelské, ío Jeden den po transplantaci leukémie bylo zahájeno ošetření sloučeninou 105. Léčivo bylo podáno orálně gastrickou výživou v celkovém objemu 200 μΙ/dávku 2-krát denně v dávce 250 mg/kg ve dvou chemoterapeutických cyklech (dny 1 až 3 a 7 až 9). Sloučenina 105 byla rozpuštěna v 5%
N-methyl-2-pyrrolidinu, 30% polyethylenglykolu 400, 65% tartarovém pufru (pH 3,0). Analýza přežití ošetřených zvířat (10 myší/skupina) byl proveden v porovnání s ošetřením myší vehiku15 lem za použití metody Kaplan-Meier a průkaznost byla zhodnocena pomocí log-rank testu. Tělesná váha experimentálních zvířat byl stanovována paralelně za účelem reflexe toxicity a účinnost terapie. Komparativní analýzy tělesné váhy byly zhodnoceny pomocí ne-parametrickéhot-testu.
Výsledky našich analýz prokázaly, že sloučenina 105 redukuje váhu ošetřených zvířat, která je u modelu intraperitoneálně transplantované leukémie P388D1 indikativní jak pro toxicitu, tak pro účinnost léčby (redukce ascitů a tvorby intraperitoneálního tumoru). Analýza přežití ukázala statisticky významně lepší přežití myší ošetřených 105 (P=0,0409), které bylo převedeno do delšího
-25CZ 302122 B6 průměrného času přežití (15,4 dnů skupinu ošetřenou léčivem versus 13,9 dní skupinu ošetřenou vehikulem).
Detailnější analýza protinádorové aktivity 105 byla provedena na lidském xenograft modelu pl ιοί ního adenokarcinomu A549 transplantovaného do CD-I SCID myší. Zvířata byla transplantována subkutánně 2.106 A549 buněk do zadní části zad. Přibližně po měsíci se vytvořily u většiny zvířat zřetelné nádory a poté byla zahájena terapie. Léčivo bylo podáno orálně gastrickou výživou v celkovém objemu 200 μΙ/dávku 2-krát denně v dávce 250 mg/kg ve dvou chemoterapeutických cyklech (dny 1 až 3 a 7 až 9). Sloučenina 105 byla rozpuštěna v 5% N-methyl-2—pyrroio lidinu, 30% polyethylenglykolu 400, 65% tartarovém pufru (pH 3,0). Primární endpoint pro analýzu byla redukce objemu nádoru (10 myší/skupina), která byla kvantifikována posuvných měřítkem. Analýzy ošetřených zvířat byly prováděny v porovnání s myšmi ošetřenými vehikulem,
Tělesná váha experimentálních zvířat byla stanovována paralelně za účelem reflexe toxicity a účinnost terapie. Komparativní analýzy tělesné váhy byly zhodnoceny pomocí ne-parametrické15 hot-testu.
Výsledky našich analýz prokázaly, že sloučenina 105 je dobře tolerována zvířaty. Byla prokázána pouze slabá redukce tělesné váhy, která byla pouze signifikantní v jednom časovém bodu (Den 52).
Analýza objemu nádorů prokázala signifikantně menší nádory u myší ošetřených sloučeninou 105 (P=0,0409), která se projevila i delším průměrným časem přežití (21,7 dnů skupinu ošetřenou léčivem versus 12,4 dní skupinu ošetřenou vehikulem).
Příklad 8
Antivirová aktivita
3o Buněčné kultury. Buněčná linie z ledvin afrického kočkodana CV—I (wild-typ p53), COS-I buňky (vytvořeny zCV-1 po transformaci z původně defektního mutanta SV40), buněčná linie lidského malobuněčného karcinomu plic H1299, buněčná linie lidského prsního adenokarcinomu MCF-7 (wild-typ p53) a buněčná linie lidského prsního karcinomu T47D (mutantní p53) byly udržovány v Dulbecco s modified Eagle médiu (DMEM) obsahujícím 10% fetálního bovinního séra, 300 pg/ml L-glutaminu, 105 HJ/ml penicilinu a 100pg/ml streptomycinu. Lidské fetální fibroblasty předkožky (HFFF) (wild-type p53), lidské epitheliální buňky plicního karcinomu A549 (wild-typ p53), lidské B95a B buňky a psí epitheliální buňky Madin-Darby z ledvin (MDCK) byly pěstovány v DMEM doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem, 105 HJ/ml penicilinu a 100pg/ml streptomycinu. Buňky byly pěstovány do 80% kon40 fluence před experimentálním ošetřením. Jestli není jinak stanoveno, tak 20 μΜ roskovitinu a 10 μΜ 105 bylo přidáno k buňkám na dobu 12 hodin.
Generace stabilních buněčných linií. Plazmidy pCEP4-Tat a pHIV-lacZ byly získány zNIH AIDS Research & Reference Reagent Program (Chang et al. Gene Ther. 6(5): 715-28, 1999).
pCEP4-Tat obsahoval HIV-1SF2 tat, kdežto pHIV-lacZ obsahoval všechny U3 regiony, část R regionu (včetně TAR) a HIV-1,3'LTR řídící lacZ a pCMV-lacZ obsahující lacZ pod kontrolou promotoru z lidského cytomegaloviru. DNA transfekce probíhaly pomocí Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) podle návodu výrobce. Buněčná linie H1299-TAT byly odvozeny z buněk HI299 stabilně transfekováných pCEP4-Tat. Buněčná linie H1299-HIV byly připraveny stabilní kotransfekcí s pCEP4—Tat a pHIV-lacZ plazmidy. Dva dny po transfekci byly buňky selektovány na hygromycinu B (250pg/ml; Merck Biosciences, Nottingham, UK) za účelem generace stabilních klonů s inkorporovanou plazmidovou DNA. Selektované stabilně transfekované (i) H1299-TAT klony byly transientně transfekovány pHIV-lacZ a testovány na
-26CZ 302122 Bó β-galaktosidázovou aktivitu (viz níže), zatímco (ii) buňky H1299-HIV byly testovány na βgalaktosidázovou aktivitu bezprostředně po stabilní inkorporaci obou plazmidů,
Beta-galaktosidázový test. Pro měření β-galaktosidázové aktivity byly buňky sbírány 12 h po transfekci a rozrušeny sonikací v 0,25 M Tris-HCl pH 7,5. Buněčné lyzáty (100 pg) byly smíchány s 3 pl pufru (0,1 M MgCL, 4,5 M β-merkaptoethanol), 66 μί ONPG (4 mg/ml o-nítrofenyH3-D-galaktopyranosid) v 0,1 M sodno-fosfátovém pufru, pH 7,5. Reakce byla inkubována po dobu 30 minut při 37 °C, zastavena 500 μί 1 M Na2CO3 a absorbance stanovena pri 420 nm v mikroplate readeru.
Imunobloting. Buňky byly odděleny pomocí gumového kusu a promyty 3-krát ledově chladným PBS a lyžovány v pufru (50 mM Tris, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1% Nonidet P40) obsahujícím směs proteázových a fosfatázových inhibitorů (SigmaAldrich St Louis, Missouri, USA). 20 pg celkových proteinů bylo separováno pomocí SDS15 polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE) v 8 nebo 10% gelu a přeneseny na nítrocelulózovou membránu. Membrány byly blokovány v 5% mléku a 0,1% Tweenu 20 v PBS a inkubovány polyklonálními séry. Primární protilátky specifické pro RNA polymerázu II (od Santa Cruz Biotechnology, Califomía, USA) zahrnovaly: (i) N-20 použita v ředění l pg/ml, (ii) H14, specifická pro formu fosforylovanou na fosfoserinu 5, ředění 6 pg/ml a (iii) H5, specifická pro formu fosfory lovanou na fosfoserinu 2, ředění 4 pg/ml. Další použité primární mAb v imunoblotech zahrnují (iv) anti-p53 (DO-1, vlastní) použita v ředění 1 pg/ml, (v) anti-p21WAFl (118, vlastní),) použita v ředění 1 pg/ml), (vi) anti-actin (A-2066, Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA)) použita v ředění 1 pg/ml, (vii) anti-T-antigen (419, vlastní), použita v ředění 1 pg/ml. Všechny primární protilátky byly naředěny v PBS obsahujícím 5% práškové mléko;
0,1% Tween 20. Peroxidázou konjugovaná králičí anti-myší imunoglobulin nebo prasečí antikráličí antiséra (DAKO, Glostrup, Denmark) byla použita jako sekundární protilátky a vizualizována s ECL reagenciemi (Amersham-Pharmacia, Little Chalfont, UK),
Infekce a viry. Buněčné linie MCF-7 a T47D byly infikovány SV40 virem po dobu 4 hodin v bezpérovém DMEM. Po infekci byl DMEM doplněn 10% fetálním bovinním sérem a buď 20 pM roskovitinu nebo 8 pM 105 přidanými bezprostředně nebo 12 h po infekci. Infikované buňky byly sklizeny po 45 h. Byly použity herpes simplex virus typ 1 kmen 17 (HSV-1), HSV-1 kmen 17 obsahující GFP v lokusu thymidin kinázy (HSV-l-deltaTK) a HSV-2 kmen HG52 (HSV-2). Všechny herpesviry byly množeny a titrovány v HFFF buňkách. Virus vakciníe kmen
WR kódující chřipku PB2 vTK lokusu (VV) byl množen a titrován v HFFF buňkách. Lidský adenovirus typ 4 (HAdV-4) kmen RI-6 byl množen a titrován v A549 buňkách. Lidský cytomegalovirus kmen Toledo kódující GFP v β2.7 lokusu (HCMV) (McSharry et al., J. Gen. Virol. 2003, 84:2511-62003) byl množen a titrován v FFF buňkách. Virus spalniček (MV) wildtyp kmen Štrb byl dar od J. Schneidera Schaulies,, Wuezburg, Germany. MV byl množen a titrován v B95a buňkách. Titr viru spalniček byl stanoven jako jednotky tvořící syncytium (SFU). Chřipkový virus (IV) H1N1 kmen A/PR/8/34, získaný z European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, UK), byl množen v zárodečné kavitě embryonálních kuřecích vajec (kmen 0; Institute for Animal Health, Compton, UK) pri 35 °C. Vejce byla infikována 6. den a zárodečná tekutina byla sbírána 10. den. IV titry byly stanoveny jako HA jednotky (HAU; inverzní hodnota
Iog2 konečného ředicího titru) pomocí hemaglutinace kuřecích erythrocytů (Fiebig Naehrstofftechnik, Bad Kreuznach, Germany) a jako jednotky tvořící infekční centra (ICFU) na mililitr zárodečné tekutiny. ICFU byly stanoveny v MDCK buňkách rostoucích v 12 jamkových destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark) na 16 mm skleněných krycích sklíčkách za použití koktailu přímých FITCem značených monoklonálních protilátek A typu chřipkového viru (K6105 A reagent, DAKO, Glostrup, Denmark).
Antivirové látky. Kde je naznačeno, tak byla využita následující virostatika: acyklovir (9-[(2hydroxyethoxy)methyl]guanin) (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), cidofovir (S)-1-[3hydroxy-2-(fosfonylmethoxy)propyl]-cytosÍn) (Moravek, Biochemicals), jod-deoxyuridin (1-27 CZ 302122 B6 (2-deoxy-|3-D-ribofuranosyl)-5~joduracil) (Sigma), ribavirin (l-3-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid) (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), tamiflu (ethylester (3R,4R,5S)4-acetylamino-5-amino-3-( 1 -ethy I propoxy)- 1-cyklohexen-l -kar boxy lové kyseliny) (Roche), chloroquin (N'-(7-ehlorehinolin^4—yl)-N,N-<Jiethy]pentan-L4-diamin) (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), roskovitin (2-(R)-(l-ethyl-2-hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9isopropylpurin) byl připraven podle publikované metody (Havlíček et al., J. Med. Chem. 40: 408-412, 1997). Antivirotika byla použita jak je naznačeno v textu.
Test snížení počtu plakú (plaque number reduction assay). 50% inhibiční koncentrace (lC5o) byly vypočteny za použití standardního testu snížení počtu plaků. 1C5O byly definovány jako koncentrace antivirotika, která redukovala počet plaků o 50 % relativně k ošetření bez antivirotik. Buňky byly pěstovány v 25 cm2 lahvičkách pro tkáňové kultury (Corning) až do konfluence a poté byly infikovány 100 jednotkami tvořícími plaky (PFU) příslušného viru (HSV-1 infekce na HFFF, HSV-l-deltaTK na HFFF, HSV-2 na HFFF, VV na HFFF, HAd4 na A549, HCMV na HFFF) po dobu 1 h při 37 °C v CO2 inkubátoru na kolébající se platformě. Buňky byly poté převrstveny médiem obsahujícím 1% Avicel RC-591 (Camida Ltd) (Matrosovich et al., Virol. J. 3:63, 2006) a testovanou látkou. Sloučenina 105 a roskovitin byly typicky testovány v koncentračním rozsahu od 0,04 do 20 μΜ. Kde bylo nezbytné, tak byl acyklovir, cidofovir, jod-deoxyuridin, chloroquin, tamiflu a ribavirin použity pro srovnání a byly aplikovány v rozmezí, které zahrnuje jejich vrcholovou hodnotu IC50- Infikované buněčné monovrstvy byly barveny Giemsa barvením (Sigma) po dobu 3 dnů (pro HSV-1, HSV-l-deltaTK, HSV-2 & VV) nebo 5 dnů (HAd4) a plaky byly spočteny. U HCMV byly po 7 denní inkubaci buněčné monovrstvy promyty PBS a zelené fluorescenční foci byly spočteny pod Leica DMIRBE mikroskopem. Počet plaků byl vynesen a analyzován pomocí Cricket Graph softwaru (Computer Associates).
K realizaci testu snížení MV syncytií (MV syncytium reduction assay) byly napěstovány buňky B95a ve 24 jamkových destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark) do 80% konfluence. Buňky byly znovu předošetřeny médiem obsahujícím příslušné množství antivirotika po dobu 30 minut před infekcí. Každá jamka byla infikována 100 SFU MV a inkubována v DMEM bez FBS nebo antibiotik a neobsahovala rovněž žádná antivirotika nebo virotika ve zvoleném koncentračním rozsahu po dobu 24 h. Tvorba syncytií byla zhodnocena fázovým kontrastním mikroskopem. 1C5O byla definována jako koncentrace antivirotika, která redukovala počet syncytií na 50 % v porovnání s buňkami infikovanými za nepřítomnosti antivirotika.
Testy snížení IV infekčních center (IV infectious center reduction assay) byly prováděny na buňkách MDCK rostoucích na 16 mm skleněných krycích sklíčkách ve 12 jamkových destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark) do 80% konfluence. Buňky byly předošetřeny médiem obsahujícím testované antivirotikum po dobu 30 minut před infekcí. Každá jamka byla infikovaná 100 ÍCFU IV inkubovaného v DMEM bez FBS nebo antibiotik a buď neobsahovala antivirotika, nebo obsahovala antivirotika v příslušném koncentračním rozsahu po dobu 24 h. Buňky byly promyty PBS, fixovány 3% paraform aldehydem (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), permeabilizovány 1% Tritonem X 100 (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA) v PBS a označeny koktejlem monoklonálních protilátek proti A typu viru chřipky (K6105 A reagent, DAKO, Glostrup, Denmark). Centra tvořící infekční jednotky (zelená fluorescenční cytoplasma anebo fluorescenční jádro) byla kvantifikována pomocí Axioplan epifluorescenčního mikroskopu s Axiovision softwarem (Caři Zeiss, Jena, Germany). IC50 byla definována jako koncentrace antivirotika redukující počet infekčních center o 50 % v porovnání s buňkami infikovanými v nepřítomnosti antivirotika. Konečné hodnoty IC5o pro všechny viry/antivirotické kombinace jsou vždy průměrem ze 4 nezávislých experimentů.
Test snížení produkce Had4 (HAd4 yield reduction assay). Konfluentní monovrstvy buněk A549 v 6 jamkových tkáňových mikrodestičkách byly infikovány 2000 PFU/jamku HAd4 po dobu 1 h v 37 °C v CO? inkubátoru na kolébající se platformě. Buňky byly poté promyty a pěstovány v médiu obsahujícím 10 μΜ sloučeniny 105 nebo 100 μΜ cidofoviru nebo koktejlu 10 μΜ sloučeniny 105 a 100 μΜ cidofoviru. Buňky a media byla posbírána po 6, 12, 24,48, 72 a 96 h
-28CZ 302122 B6 po infekci a poté byl výnos uvolněných viru a celkový výnos virů (uvolněný a intracelulámí) v každém vzorku titrován pomocí buněk A549.
Inhibice virové replikace sloučeninou 105 a roskovitinem. Vzhledem ke zjištění, že sloučenina
105 byla mnohem účinnějším inhibitorem CDK aktivity než roskovitin, bylo velmi důležité zjistit relativní kapacitu těchto dvou CDKI snižovat virovou replikaci, S použitím testů redukce plaků byly porovnány účinky sloučeniny 105 na replikaci panelu DNA (HSV, VV, HAd4, HCMV) a RNA (MV, IV) virů v porovnání s řadou referenčních antivirových látek (Tab. 10). Sloučenina 105 inhibovala replikaci všech testovaných DNA virů mnohem efektivněji než roskovitin. Rosin kovitin neinhiboval jak HSV-1 či HSV-2, zatímco sloučenina 105 byla účinná, přestože vykazovala vyšší ICSo než acyklovir. Acyklovir je proléčivo, které je aktivováno v buňce fosforylací virově kodovanou TK. HSV-1 deleční mutant thymidin kinázy (TK) zůstával citlivý pro sloučeninu 105 oproti acykloviru, což naznačuje, že sloučenina 105 působí rozdílným mechanismem (Tabulka 10). Přestože se hodnoty IC50 pro HSV-1 a HSV-2 u acykloviru lišily, jejich hodnoty pro sloučeninu 105 byly podobné. Je velmi zajímavé, že všechny DNA viry byly inhibovány v přibližně srovnatelných koncentracích sloučeninou 105, což je konsistentní s molekulárním cílem tohoto léčiva, tedy CDK dříve než specifické virově-kódované funkce. Virus vakcinie byl inhibován stejně dobře jak sloučeninou 105, tak joddeoxyurídinem, zatímco roskovitin nevykazoval žádný významný účinek. Existují předpoklady, že replikace V V nevyžaduje fungování
CDK, přičemž bylo dokonce předpokládáno, že CDKI nemusí být efektivní vůči takovýmto virům (Schang, J. Antimicrob. Chemother. 50(6):779-92, 2002). Naše výsledky však vůbec poprvé naznačují, že i poxvirusje citlivý k CDKI. Sloučenina 105 i roskovitin inhibovaly replikaci HAd4 a, co je ještě zajímavější, jejich hodnoty IC50 byly výrazně nižší než u cidofoviru. Přestože byl HCMV přibližně stejně citlivý k sloučenině 105 a roskovitinu, v tomto případě při vyšších dávkách než cidofovir. Oba CDKI prokázaly nulovou účinnost k testovaným RNA virům, tedy MV a IV.
Tabulka 10: Inhibice virové replikace, 1C5O (μΜ) bylo stanoveno pomocí testu redukce plaků 30 (n=4)
HSV-1 HSV-1 ΔΤΚ HSV-2 W Had4 HCMV MV IV
sloučenina 105 5,0 ± 0,9 5,3 ± 0,9 4,7 ± 1,0 3,8 ± 1,3 2,4 ± 1,3 3,2 + 1,6 19,7 ± 1,8 >20
roskovitin >20 >20 >20 >20 3,1 ± 1,6 4,9 ± 2,2 >20 >20
joddeoxyuridin k 3,7 ± 1,6
acyklovir 0,5 ± 0,2 73,0 + 18 2,2 ± 0,5
-29CZ 302122 B6
cidofovir 16,6 ± 2,9 0,2 ± 0,1
ribavirin >40 12,0 ± 1,1 10,5 ± 1,8
tamifiu 12,S ± 2,2
chloroquin 5,3 ± 0,9
* hodnoty ve vystínovaných buňkách nebyly stanoveny
Inhibice virové exprese sloučeninou 105 a roskovitinem. SV40 large T antigen je pleiotropický, kódující mnohočetné funkce, které regulují virovou infekci a podporují tumorogenezi. Large
T-antigen tvoří stabilní komplex s p53, a tím, že podporuje defosforylaci pRb, inaktivuje členy Rb rodiny (Zalvide et ak, Mok Cel.. Biok 18(3):1408-15, 1998). Inaktivace p53 je kritická pro SV40-zprostředkovanou buněčnou transformaci, zatímco doprovodná destabilizace tohoto inhibiční ho komplexu mezi defosforylováným Rb a členy E2F rodiny transkripčních faktorů usnadňuje transkripci cílových genů podporujících vstup do buněčného cyklu (Ali et ak, J. Virok 78(6):
2749-57,2004).
Buňky MCF-7 (wild typ p53) a T47D (mutant p53) byly infikovány SV40 za účelem studia účinků sloučeniny 105 a roskovitinu na expresi large T-antigenu, p53 a p21WAFt. Exprese large T antigenu byla detekována nezávisle na statusu p53, zatímco large T antigen-závislá vazba a sta15 bil izace wild-^typu p53 vedla kjeho inaktivaci. Ošetření infikovaných buněk sloučeninou 105 nebo roskovitinem vedlo k redukci hladiny large T-antigenu, což naznačuje esenciální úlohu CDK pro virovou genovou expresi (Obr. 8). Vliv těchto CDKI na buňky MCF-7 byl vyšší, když byly přidány bezprostředně po infekci, zejména u buněk ošetřených roskovitinem. Simultánně jsme pozorovali i inhibici hladiny p53 a obnovu jeho funkce representovanou transaktivací p53 cílového proteinu p21WAFI. Inhibiční účinek sloučeniny 105 na expresi large T-antigenu v T47D buněčné linii byl nezávislý na času ošetření, zatímco roskovitin ovlivnil expresi T-antigenu pouze když byl podán 16 h po infekci. Hladina nutantního p53 zůstala nezměněna a nebyl schopen rovněž trans-aktivovat expresi p21WAFI (Obr. 8).
Po provedení následných testů bylo prokázáno, že oba CDKI měly inhibiční vliv i na isolovaný virální promotor v plastidovém vektoru. Transientně jsme transfekovali buněčnou linii MCF-7 a T47D plazmidem pCMV-lacZ, ošetřili transferované buňky roskovitinem nebo sloučeninou 105 a změřili (3-galaktosidázovou aktivitu. Jak sloučenina 105, tak i roskovitin inhibovaly expresi z CMV promotoru v transientně transferovaných buňkách, kde sloučenina 105 vykazovala mno30 hem silnější supresivní účinek (Obr. 9).
Vliv CDKI na expresi SV40 promotoru inkorporovaného do buněčného genomu. Pozorování popsaná výše nás vedla k expanzi analýz účinků sloučeniny 105 a roskovitinu na genovou expresi SV40 v COS-l buňkách, kde jsou sekvence kódující velký T-antigen integrovány do buněčného genomu. Buňky COS-l jsou CV-1 buňkami transformovanými původně-defektivním
-30CZ 302122 B6 mutantem SV40, tedy CV-1 a buňky MCF-7 byly použity jako kontroly. Ačkoliv byla exprese z hlavního IE promotoru SV40 a CMV v obou případech inhibována CDKI, když byly introdukovány do extrachromosomálního elementu (Obr. 8 a 9), v buňkách COS-1 ošetřených sloučeninou 105 a roskovitinem stimulovaly expresi velkého T-antigenu, zatímco p53 zůstával konstantní a transkripčně inaktivní (p21WAF1 nebyl transaktivován). V kontrolních CV-1 a MCF-7 buňkách vzrostly hladiny p53 a p21WAF1 po ošetření oběma CDKI (Obr. 10). Tyto výsledky naznačují, že CDKI mohou mít jak inhibicní, tak stimulační vliv na virové promotory, a to v závislosti na jejich lokalizaci v buňce.
io Inhibice exprese z HIV promotoru. Transkripce z HIV genomu je citlivá na aktivitu CDK9 a může být proto suprimována ošetřením CDKI v koncentračním rozmezí, které nesnižuje buněčnou transkripci (Chao et al., J. Biol. Chem. 2000 Sep 15;275(37): 28345-8, 2000). Kromě toho interaguje funkčně CDK9 s transaktivační doménou Tat, což je ilustrováno faktem, že CDK9 deplece blokuje Tat-dependentní transaktivaci a aktivitu.
Za účelem vyhnutí se obecné inhibici transkripce z extrachromosomální DNA vlivem CDKI byly zkonstruovány dvě stabilní buněčné linie (H1299-TAT a H1299-HIV). Buňky H1299-TAT byly transfekovány pomocí pHIV-lacZ a poté ošetřeny roskovitinem a sloučeninou 105. Exprese z pHIV-lacZ (extrachromosální lokalizace) byla inhibována ošetřením CDKI; β-galaktosidázový (β—gal) výstup byl o něco nižší u sloučeniny 105 v porovnání s roskovitinem (Obr. 11). Je zajímavé, že účinky aplikace CDKI byly opačné při testování na HIV promotoru integrovaném do buněčné DNA (H1299-HIV buňky) s reportérovým výstupem zvýšeným 4-násobně po ošetření sloučeninou 105 a 2,5-krát zvýšeným po ošetření roskovitinem (obr. 11).
Inhibice replikace adenovirů sloučeninou 105 a cidofovirem. Sloučenina 105 mela pronikavý vliv na replikaci HAdV4 s lepšími hodnotami IC50 než dokonce cidofovir v testu snížení plaků (Tab. 10). Vzhledem ktomu, že 105 a cidofovir účinkují rozdílnými mechanismy, tak jsme studovali, zda-li tato dvě antivirotika by mohla mít aditivní efekt, když budou zkombinována. Mnohostupňová růstová křivka HAd4 byla proto měřena v přítomnosti 10 μΜ 105, 100 μΜ cidofo30 viru nebo obou (Obr. 13a). Jak bylo prováděno konvenčně s HAdV, testy měřily celkový výtěžek virů z kultury. Po 24 h od infekce inhibovaly jak sloučenina cidofovir, tak sloučenina 105 produkci infekčního viru a redukovaly virový výtěžek o 2 a 5 log stupňů. Žádné infekční viry nebyly detekovány, když byly oba inhibitory použity v kombinaci. 48 h po infekci byla relativní účinnost antivirotik obrácená: Sloučenina 105 a cidofovir redukovaly virový výtěžek o 1 a 2 log stupně, zatímco kombinace obou sloučenin způsobila redukci o 5 log stupňů. V tomto a dalších pozdějších časech byl účinek obou léčiv mnohem silnější než aditivní efekt, a tak lze jejich působení v kombinaci považovat za synergické. Nicméně, z výsledků bylo zřejmé, že účinek sloučeniny 105 byl po 96 h po infekci poněkud utlumený; sloučenina 105 nevykazovala žádný celkový vliv na virovou replikaci, zatímco cidofovir inhiboval výtěžek 3 log stupňů. Kombinovaný účinek obou léčiv v tomto časovém bodě vykazoval silný kumulativní vliv 4 log stupňů. Zjevná nesourodost mezi testy redukce plaků (Tab. 10) a redukce tvorby (obr. 12a) byla vyřešena, když byly titry buněk asociovaných a extracelulámích virů odděleny a analyzovány nezávisle. Účinek sloučeniny 105 a cidofoviru na výtěžek extracelulámího viru (obr. 12b) byly mnohem konzistentnější v testu redukce plaků. Adenoviry jsou uvolňovány spontánní lyží a test redukce plaků spočívá v mnohonásobných kolech virové replikace za účelem vytvoření viditelných plaků. Ošetření infikovaných buněk sloučeninou 105 značně zpomalovalo výskyt extracelulámích virů, které v závislosti na tom způsobilo zpožďování každého kola replikace a tak i výskyt plaků. Vliv přidání cidofoviru a sloučeniny 105 v kombinaci na výnos extracelulámího viru byl dramatický (obr. 13). Kombinace velmi časného účinku sloučeniny 105 se zpožděným, ale solidním a dlou50 hotrvajícím účinkem cidofoviru značně zvýšil jejich kapacitu inhibovat replikaci HAd4. Žádný infekční virus se nepodařilo prokázat v kultivačním médiu až do 72 h po infekci a 96 h po infekci byl ještě výnos virů nižší než vstupní přísun viru (0 h), téměř 5 log stupňů pokles oproti žádnému ošetření léčivy.
-31 CZ 302122 B6
Příklad 9
Suché tobolky
5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin vzorce 1 ztab. 1 nebo 2, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 1250 g
Talek l80g
Pšeničný škrob 120 g
Magnézium stearát 80 g
Laktóza 20 g
Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 10
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek o vzorci I, tab. 1 až 6, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
Lauroglykol 2 litry
Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi I až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 11
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek o vzorci I, tab. 1 a 2, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
PEG 400 I litr
Tween 80 1 litr
Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (13)

PATENTOVÉ NÁROKY
1- {{6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol,
1- ({6-[(2-amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol,
1- ({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//~purin-2-yl}amino)propan-2-ol,
N6-(2-aminobenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6-diamín, l~({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol,
1. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty vybrané ze skupiny zahrnující 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/í-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2. Substituované 6-{2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 1 pro použití jako léčiva.
2-( {6-[(2-amino-3-methoxybenzy l)amino]-9-cy klohexy l~9tf-purin-2-y 1} amino)-butan-1 -ol.
2- ( {6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl} amino)-3-methy lbutan-1-oi, 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/í-purin-2-yl}amíno)-3-methylbutan-Í-oI,
2-({6-[(2-amino-5-chlorbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
N6-(2-aminobenzyl)-N2-(2-aminocyklohexyl)-9-methyl-97/-purin-2,6-diamin,
Nó-(2_amino-5-chlorbenzyl)-N2-{2-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6-d iamin,
N6-(2-amino-5-fluorbenzyl)-N:i-(2-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6~dÍamÍn,
N6-<2-aminobenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-methyl-9//-purin-2,6-diamin,
Nó-(2-amint>-3-methoxybenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-methyl-9//-purÍn-2,6-diamín,
N6-(2-aminobenzyt)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-ethyl-9/Y-purin-2,6-diamin,
N6-(2-aminobenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-propyl-9//-purin-2,6-diamin,
N6-(2-amino-3-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl}~9-isopropyl-9Zř~purÍn-2,6-diamin,
N6-(2,5-diaminobenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-isopropyl-9//-purin-2,6-diamin,
N6-{2-aminobenzyl)-N2-(4-aminocyklohexyl)-9-cyklohexyl-9//~purin-2,6-diamin,
N6-(2-aminobenzyl)-N2-(4-aminocykIohexyl)-9-benzyl-9/í-purin-2,6-diamin,
N6-(2-aminobenzyl)-N2-(2-amÍnocyklohexyl}_9-ísopropyl-9//-purin-2,6-diamin,
N6-(2-amÍnobenzyl)-N2~(4-hydroxycyklohexyl)-9-isopropyl“9//-purin-2,6-diamin,
2~{{6-[(2—aminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2-< {6-[(2-amino-5-chlorbenzy l)amino]-9-cyklohexyl-9H-purin-2-y 1} amino)butan-1 -of,
2-( {6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9//-purin-2-y I} amino)butan-l-ol,
2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-propyI-9/7-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2-( {6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethy l-977-purin-2-y 1} amino)butan-1 -ol,
2- ({6-[(2-amino-5-chlorbenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)butan-t-ol, 2-({6-[(2-amino-5-methoxy benzy l)amino]-9-Ísopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2- ({6-[(2-amino-5_fluorbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2- ({6_[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/ř-purin-2-yl}amino)-3-methylbutan-l-ol,
3. Substituované 6-(2-aminobenzyIamino)purinové deriváty podle nároku 1 pro použití jako inhibitory CDK.
-33CZ 302122 B6
3- ({6-[(2-aminobenzyl)amino]_9-isopropyl-9//-purin-2-yI}amino)pentan-2-ol,
Nó-(2-amino-5-chtorbenzyl)~N2-(4-aminocyklohexyl)-9-Ísopropyl-9/ř-purin-2,6-diamin,
4. Substituované 6(2-ami nobenzy lamí no)puri nové deriváty podle nároku 1 pro použití při léčbě onemocnění zahrnujících buněčnou proliferaci.
5. Substituované 6-{2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 1 pro použití při s léčbě virových infekcí,
6. Substituované 6-(2-aniinobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 5, kde je virová infekce vyvolána živočišnými a lidskými DNA viry, zejména lidskými cytomegaloviry (HCMV), herpes simplex viry typu 1 a 2 (HSV-1 a HSV-2), varicella zoster viry (VZV), viry Epsteinio Barrové (EBV), lidskými herpesviry typu 6, typu 7, typu 8, bovinními herpesviry typu I, koňskými herpesviry typu 1, papillomaviry (HPV typy 1-55, včetně karcinogenních HP V), adenoviry všech typů, poxviry, polyomaviry nebo papovaviry.
7. Substituované 6-(2-aminobenzylamíno)purinové deriváty podle nároku 1 pro použití pro t5 eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v systémech tkáňových kultur při produkci biofarmaceutických nebo jiných produktů, pro eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v klinických vzorcích, anebo k zastavení růstu tkáňových buněčných kultur při zachování schopnosti buněk produkovat proteiny a sekundární metabolity.
2o
8. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 1 pro použití při léčbě onemocnění, jejichž podstata je založena na buněčné proliferaci, a která zahrnují nádory, restenózu, psoriázu, revmatickou artritidu, diabetes 1. typu, roztroušenou sklerózu, Alzheimerovu chorobu, parazitozy způsobené živočichy, houbami anebo prvoky, restenózu, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu, dnu a proliferativní onemocnění kůže.
9. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 1 pro použití k indukci apoptózy v savčích buňkách.
10. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden substi3o tuovaný 6-(2-aminobenzylamino)purinový derivát podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné nosiče.
11. Farmaceutický přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje jednu nebo více farmaceutických pomocných látek.
12. Farmaceutický přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje cytostatikum vybrané ze skupiny zahrnující mitoxantron, cis-platinu, methotrexát, taxol a doxorubicin.
4o
13. Farmaceutický přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje virostatikum vybrané ze skupiny zahrnující acyklovir, cidofovir, tamiflu a ribavirin.
CZ20090045A 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující CZ302122B6 (cs)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090045A CZ302122B6 (cs) 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující
PCT/CZ2010/000004 WO2010085924A2 (en) 2009-01-28 2010-01-22 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
US13/146,339 US9023857B2 (en) 2009-01-28 2010-01-22 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
EP10716265.3A EP2391626B1 (en) 2009-01-28 2010-01-22 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
ZA2011/04945A ZA201104945B (en) 2009-01-28 2011-07-05 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090045A CZ302122B6 (cs) 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200945A3 CZ200945A3 (cs) 2010-08-04
CZ302122B6 true CZ302122B6 (cs) 2010-10-20

Family

ID=42269979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20090045A CZ302122B6 (cs) 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9023857B2 (cs)
EP (1) EP2391626B1 (cs)
CZ (1) CZ302122B6 (cs)
WO (1) WO2010085924A2 (cs)
ZA (1) ZA201104945B (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2634190A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-04 Lead Discovery Center GmbH Pyrazolo-triazine derivatives as selective cyclin-dependent kinase inhinitors
CN102743387A (zh) * 2012-03-16 2012-10-24 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 6-(苄基氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤的新用途
CZ306894B6 (cs) * 2013-02-08 2017-08-30 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci 2-Substituované-6-biarylmethylamino-9-cyklopentyl-9H-purinové deriváty, jejich použití jako léčiva a farmaceutické přípravky tyto sloučeniny obsahující
CN104936959B (zh) * 2013-03-08 2018-09-18 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 2,6,9-三取代嘌呤衍生物及其制备方法与应用
CN116813621A (zh) * 2023-06-08 2023-09-29 江南大学 9h嘌呤类化合物及其药物组合物和用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998005335A1 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 Cv Therapeutics, Inc. PURINE INHIBITORS OF CYCLIN DEPENDENT KINASE 2 AND IλB-$g(a)
CZ20012765A3 (cs) * 1999-02-01 2002-08-14 Cv Therapeutics, Inc. Purinové inhibitory kinasy 2 a Ikappa - Aalfa dependentní na cyklinu
CZ20014163A3 (cs) * 1999-05-21 2002-10-16 Aventis Pharma S. A. Deriváty purinu, způsob jejich přípravy a farmaceutické kompozice tyto deriváty obsahující
WO2004016612A2 (en) * 2002-08-15 2004-02-26 Cyclacel Limited New purine derivatives
WO2004016613A2 (en) * 2002-08-15 2004-02-26 Cyclacel Limited Purine derivatives and their use as antiproliferative agents
US20040235868A1 (en) * 1995-12-01 2004-11-25 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Purine derivatives having, in particular, anti-proliferative properties and their biological uses
FR2876583A1 (fr) * 2004-10-15 2006-04-21 Centre Nat Rech Scient Utilisation de derives de purines pour la fabrication de medicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liees a un defaut d'adressage des proteines dans les cellules

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60118521T2 (de) * 2000-01-07 2006-10-12 Universitaire Instelling Antwerpen Purin derivate, ihre herstellung und verwendung
CA2439263C (en) * 2001-03-02 2012-10-23 Frank Becker Three hybrid assay system
US20100129321A1 (en) * 2005-12-15 2010-05-27 Bayer Healthcare Llc Diaryl urea for treating virus infections
CZ302711B6 (cs) * 2009-06-03 2011-09-14 Univerzita Palackého v Olomouci Substituované deriváty 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a farmaceutické prípravky tyto slouceniny obsahující

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040235868A1 (en) * 1995-12-01 2004-11-25 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Purine derivatives having, in particular, anti-proliferative properties and their biological uses
WO1998005335A1 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 Cv Therapeutics, Inc. PURINE INHIBITORS OF CYCLIN DEPENDENT KINASE 2 AND IλB-$g(a)
CZ20012765A3 (cs) * 1999-02-01 2002-08-14 Cv Therapeutics, Inc. Purinové inhibitory kinasy 2 a Ikappa - Aalfa dependentní na cyklinu
CZ20014163A3 (cs) * 1999-05-21 2002-10-16 Aventis Pharma S. A. Deriváty purinu, způsob jejich přípravy a farmaceutické kompozice tyto deriváty obsahující
WO2004016612A2 (en) * 2002-08-15 2004-02-26 Cyclacel Limited New purine derivatives
WO2004016613A2 (en) * 2002-08-15 2004-02-26 Cyclacel Limited Purine derivatives and their use as antiproliferative agents
FR2876583A1 (fr) * 2004-10-15 2006-04-21 Centre Nat Rech Scient Utilisation de derives de purines pour la fabrication de medicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liees a un defaut d'adressage des proteines dans les cellules

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201104945B (en) 2012-03-28
US20110287111A1 (en) 2011-11-24
EP2391626A2 (en) 2011-12-07
US9023857B2 (en) 2015-05-05
EP2391626B1 (en) 2014-10-01
CZ200945A3 (cs) 2010-08-04
WO2010085924A2 (en) 2010-08-05
WO2010085924A3 (en) 2010-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6316456B1 (en) Purine derivatives having, in particular, antiproliferative properties, and their biological uses
US6413974B1 (en) 6,9,-disubstituted 2-[trans-(4-aminocyclohexyl) amino] purines
RU2191777C2 (ru) 6,9-дизамещенные 2-[транс-(-4-аминоциклогексил)амино]пурины
EP0349242B1 (en) Therapeutic nucleosides
BRPI0807182A2 (pt) Compostos e composições como inibidores de cinase
CZ27399A3 (cs) Substituované dusíkaté heterocyklické deriváty, způsob jejich přípravy, tyto deriváty pro použití jako léčiva, farmaceutická kompozice a kombinovaný farmaceutický přípravek tyto deriváty obsahující a použití těchto derivátů pro výrobu léčiv
WO2014124430A1 (en) Nucleotide and nucleoside therapeutic compositions and uses related thereto
CZ20022353A3 (cs) Deriváty purinu, způsob jejich přípravy a jejich použití
HUE034591T2 (en) Selective pi3k delta inhibitors
JP2006511458A (ja) アザプリン誘導体
JP2012180361A (ja) 抗ウイルス薬としての新規２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）シクロプロピリデンメチル］プリン
EP3298015A1 (en) Compounds
CZ302122B6 (cs) Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující
JP2020534346A (ja) ＣＤＫ阻害剤としての４−［［（７−アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）アミノ］メチル］ピペリジン−３−オール化合物
US20060122203A1 (en) 2-Hydroxymethylcyclopropylidenemethylpurines and - pyrimidines as antiviral agents
JP4545434B2 (ja) 抗ウイルス活性を有する６−‘２−（ホスホノメトキシ）アルコキシピリミジン誘導体
WO2017040693A1 (en) Broad spectrum antiviral compounds and uses thereof
CZ2009359A3 (cs) Substituované deriváty 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a farmaceutické prípravky tyto slouceniny obsahující
EP3294741A1 (en) 5-substituted 7-[4-(2-pyridyl)phenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo4,3-d]pyrimidine derivatives, use thereof as medicaments, and pharmaceutical compositions
JP2024512451A (ja) エンテカビル（ｅｔｖ）の抗ウイルス性プロドラッグおよびその製剤
WO1991000282A1 (en) Therapeutic nucleosides
EP0394346A1 (en) Pyrimidine and purine 1,2-butadiene-4-ols as anti-retroviral agents
CN119948032A (zh) 呋喃并嘧啶衍生物
KR20070017938A (ko) Ｒｔｋ 억제제로서의 6-치환된 아닐리노 퓨린

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180128