CZ200945A3 - Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující - Google Patents

Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující Download PDF

Info

Publication number
CZ200945A3
CZ200945A3 CZ20090045A CZ200945A CZ200945A3 CZ 200945 A3 CZ200945 A3 CZ 200945A3 CZ 20090045 A CZ20090045 A CZ 20090045A CZ 200945 A CZ200945 A CZ 200945A CZ 200945 A3 CZ200945 A3 CZ 200945A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino
purin
isopropyl
methyl
purine
Prior art date
Application number
CZ20090045A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ302122B6 (cs
Inventor
Havlícek@Libor
Kryštof@Vladimír
Zatloukal@Marek
Doležal@Karel
Strnad@Miroslav
Vojtešek@Borivoj
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Bioapex, S. R. O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci, Bioapex, S. R. O. filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ20090045A priority Critical patent/CZ302122B6/cs
Priority to EP10716265.3A priority patent/EP2391626B1/en
Priority to PCT/CZ2010/000004 priority patent/WO2010085924A2/en
Priority to US13/146,339 priority patent/US9023857B2/en
Publication of CZ200945A3 publication Critical patent/CZ200945A3/cs
Publication of CZ302122B6 publication Critical patent/CZ302122B6/cs
Priority to ZA2011/04945A priority patent/ZA201104945B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

Rešení se týká nových substituovaných 6-(2-aminobenzylamino)purinu obecného vzorce I, které se používají pro inhibici CDK, zejména pri ošetrování virových infekcí a onemocnení, která zahrnují bunecnou proliferaci, a farmaceutických prípravku tyto slouceniny obsahující.

Description

Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léčiva a přípravky tyto sloučeniny obsahující
Oblast techniky
Vynález se týká nových purinových derivátů a jejich použití, zejména v léčbě virových a nádorových onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Deregulace mechanizmů kontrolujících průběh buněčného dělení je charakteristickým znakem nádorového bujení. Cyklin-dependentní kinasy (CDK) představují rodinu silně konzervovaných serin/threonin protein kinas, které jsou aktivní v komplexu se svými regulačními jednotkami, cykliny. Lidský genom obsahuje 13 CDK, 48 CDK- příbuzných kinas a 25 cyklinů. Různí členové rodiny CDK zasahují do řady klíčových buněčných procesů: CDK1, 2, 3, 4, 6 a 7 regulují buněčný cyklus, CDK7, 8 a 9 interagují přímo s transkripčními factory, CDK5 a 11 kontrolují funkce nervových buněk, CDK2, 5, 6 a 9 buněčnou diferenciaci a CDK1, 2, 4, 5, 6 a 11 ovlivňují apoptózu (Knockaert a kol.: J. Biol. Chem. 277: 25493-25501, 2002). Funkce CDK jsou regulovány cykliny, CDK-inhibujícími proteiny a subcelulámí lokalizací. Protože mnohé CDK jsou důležitými regulátory buněčného dělení, cílem farmaceutického průmyslu byl a je objev a vývoj farmakologických CDK inhibitorů (CDKI) jako potenciálních protinádorových léčiv. CDKI jsou rozmanitou a nesourodou skupinou malých rovinných heterocyklů - purinů, pyrimidinů, flavonoidů nebo bis-indolů, vážících se do ATP-vazebného místa CDK, kde mohou kompetovat s ATP (de Azevedo a kol., Eur.J.Biochem. 243:518-526,1997).
Klíčové regulátory cyklu jsou reprezentovány třemi skupinami proteinů: cykliny, cyklindependentními kinasami (CDK) a inhibitory cyklin-dependentních kinas (CDKI).
Prvními důležitými CDKI byly CDK oligo-specifícký olomoucin a CDK panspecifický flavopiridol (Losiewicz a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 201(2):589-95, 1994). Olomoucin patří do skupiny C2, N6, N9-substituovaných adeninů které vykazují vysokou aktivitu a specificitu proti některým CDK; olomoucin zejména inhibuje CDK2, CDK2, CDK5, a méně již Erkl (Veselý a kol., Eur. J. Biochem. 224: 771-786, 1994). Za účelem dosažení zvýšené inhibice CDK byla molekula olomoucinu podrobena strukturním modifikacím. Výsledkem klasické studie vztahu mezi strukturou a biologickou aktivitou, směřované na změny postranních řetězců olomoucinu, byl objev dvou výjimečně účinných inhibitorů CDK: roskovitinu (Seliciclib®, CYC202, Cyclacel Pharmaceuticals, Berkeley
Heights, New Jersey) a v poslední době olomoucinu II (Havlíček a koi. 1997. J. Med.Chem. 40: 408-412; Kryštofa koi. Bioorg Med Chem Lett 12: 3283-3286, 2002).
Zvýšená aktivita roskovitinu oproti olomoucinu je způsobena zavedením rozvětvených C2-postranních řetězců a objemnějšího N9-isopropyl substituentu. Tyto změny významně zvýšily komplementaritu inhibitoru v ATP-vazebném místě CDK2, jak bylo dokázáno rentgenovou krystalografií (de Azevedo a kol. Eur.J.Biochem. 243:518-526, 1997). Obě strukturní změny nezměnily selektivitu roskovitinu, ale zvýšily 10-krát aktivitu roskovitinu na CDK1 a CDK2, a 20-krát na CDK5. Olomoucin II se liší od roskovitinu další or/ůo-hydroxy skupinou na benzylovém kruhu, přesto tato jediná modifikace je spojena s 10-krát vyšší inhibiční aktivitou na CDK9 (Kryštof a kol., J. Med. Chem. 49: 6500-6509, 2006). Tato zvýšená afinita olomoucinu II k CDK9 je zodpovědná za jeho zvýšenou intracelulámí aktivitu, ve srovnání s roskovitinem. Například, olomoucin II indukuje jadernou akumulaci a transkripční aktivaci tumorového supresorového proteinu p53 při 2-3 krát nižších koncentracích než roskovitin. Při vyšších koncentracích mohou oba inhibitory inhibovat syntézu RNA zmírněním fosforylace CTD domény RNA polymerázy II (Diwan a kol., J Virol. 78: 9352-65, 2004).
Zjištění, že roskovitin vykazuje také antivirální aktivitu, stimulovalo výzkum cílený na buněčné funkce, doložený příkladem CDK, nutné pro replikaci viru (Bresnahan a kol., J. Gen. Virol. 78:1993-7, 1997; Schang a kol., J Virol. 73:2161-72, 1999). Roskovitin a další inhibitory CDK mají schopnost inhibovat replikaci širokého spektra virů, dokonce i v nedělících se buňkách, včetně činitelů, pro které není nutná progrese buněčného cyklu (Schang a kol., Antivir. Chem. Chemother. 17:293-320, 2006). Lidský cytomegalovirus (HCMV), herpes simplex typu 1 a 2 (HSV-1 & HSV-2), varicella zoster virus (VZV), virus Epstein-Barr (EBV), lidský adenovirus (HAdV), lidský virus imunonedostatečnosti (HIV), and lidský virus leukémie T-buněk (HTLV-1) jsou všechny citlivé k roskovitinu. Antivirové aktivity CDK inhibitorů korelují více s mírou CDK inhibice než se strukturou aktivní části inhibitoru (Schang a kol., Antivir. Chem. Chemother. 17:293-320, 2006).
I když bylo ukázáno, že inhibitory inhibují několik stádií replikace viru, včetně větvení, DNA replikace, reaktivace z latence, aktivace buněčných nebo virových enzymů a vnitrobuněčná kompartmentace, výzkum vedl k poznání že antivirová aktivita inhibitorů CDK je i primárně zprostředkována inhibicí virus-kódované transkripce (Kapasi a Spector, J. Virol. 82(1):394-407, 2008). Zajímavé je, že roskovitin může zamezit iniciaci virové transkripce, která je specifická pro virový genom a nezávislá na promotorech (Diwan a kol., J. Virol. 78: 9352-65, 2004). Zatímco flavopiridol je CDK panspecifický a inhibuje transkripci většiny buněčných a virových genů, roskovitin je CDK oligospecifický a neinhibuje buněčnou transkripci. Selektivita roskovitinu v potlačování exprese virálně a plasmidově kódovaných genů se podobá aktivitě popsané pro interferon alfa (Nicholl a Preston, J. Virol. 70: 6336-9,1996). V tomto kontextu je zajímavé poznamenat, že interferon alfa také inhibuje CDK apodněcuje zastavení buněčného cyklu (Mandal a kol., Oncogene 16(2):217-25, 1998).
Mechanismus, kterým inhibitory CDK potlačují replikaci viru, nebyl doposud plně objasněn a předpokládá se, že nebude pro různé látky zcela shodný. Proto bylo velmi důležité empiricky srovnat antivirové vlastnosti roskovitinu a jeho analog. V naší předcházející studii jsme zjistili, že olomoucin II a mnoho dalších látek bylo účinnějšími inhibitory aktivity CDK než roskovitin (Kryštof a kol,, J. Med. Chem. 49: 6500-6509, 2006).
Podstata vynálezu
V tomto vynálezu popisujeme, že amino analoga olomoucinu II inhibují virověkódovanou transkripci a replikaci viru při podstatně nižších koncentracích než roskovitin. Navíc, tyto sloučeniny vykazují antivirovou aktivitu na široké spektrum lidských virů, včetně orthopoxviru, HAdV, HSV-1 a HCMV. V souladu s předchozími výzkumy roskovitinu (Diwan a kol., J Virol. 78:9352-65, 2004), látky byly účinné na virových promotorech, které nejsou inkorporovány do buněčných genomů. Kromě toho ukazujeme, že naše látky a užití Cidofoviru má synergický efekt na buňkách infikovaných adenovirem.
Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamÍno)purinu podle tohoto vynálezu jsou použitelné jako inhibitory cyklin-dependentní kinasy 9. Tato skupina nových purinových derivátů je charakteristická selektivní CDK9 inhibiční aktivitou doprovázenou silnými protinádorovými vlastnostmi látek, zejména na virově vyvolané nádorové bujení. Proto mohou být tyto látky použity jako antimitotická a apoptotická léčiva, zejména jako protinádorová léčiva. Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout sloučeniny s protinádorovou a antivirovou aktivitou, látky mající vylepšený index selektivity a účinnosti, tedy jsou méně toxické a přitom efektivnější než analoga známá doposud. Navíc, látky zde popsané inhibují virově kódovanou transkripci a replikaci účinněji než jiné látky dosud známé.
Předmětem vynálezu jsou substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny obecného vzorce I (R)n
I kde (R)n znamená 1 až 4 substituenty (n je 1-4), které mohou být stejné nebo rozdílné, přičemž tyto substituenty mohou být vybrané ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, alkoxy, amino, halogen, hydroxy, nitro a merkapto skupinu, a
R2 je R2’-NH-, ve kterém
R2’ znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyl, aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin případně může být substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino, halogen, hydroxy, alkoxy nebo merkapto skupinu, a
R9 znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyl, aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin může být substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino, halogen, hydroxy, alkoxy nebo merkapto skupinu, ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny obecného vzorce I pro použití jako léčiva.
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny obecného vzorce I pro použití jako inhibitory CDK. Sloučeniny obecného vzorce I a jejich farmaceuticky přijatelné soli inhibují selektivně zejména enzym CDK9.
Nové deriváty obecného vzorce I mají velmi vysokou účinnost vůči živočišným a lidským RNA a DNA virům. Nové deriváty vykazují antivirovou aktivitu napříč širokou paletou zejména lidských virů, jakými jsou orthopoxiviry, HAdV, HSV1 a HCMV.
Předmětem vynálezu je proto rovněž poskytnout nové deriváty obecného vzorce I pro použití k léčbě virových infekcí. Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou substituované 6-(2aminobenzylamino)puriny obecného vzorce I pro použití při výrobě léčiva pro léčení virových infekcí.
Kromě toho jsou chirálně obohacené nebo čisté (S)-enantiomery antivirově aktivnější, kdežto (R)-enantiomery byly znatelně méně antivirově aktivní. Důležitým aspektem tohoto vynálezu je použití sloučenin podle vynálezu pro inhibici proliferace DNA virů závislých na jevech spojených s buněčnou proliferací nebo replikaci. DNA viry zahrnují jakýkoliv virus z rodiny herpesvirů, a zvláště lidských cytomegalovirů. Použití zahrnuje podání profylakticky nebo terapeuticky účinného množství inhibitoru CDK pacientům nebo zvířatům. Terapeuticky účinné množství je takové, které je schopné inhibice buněčné aktivity CDK9 v rozsahu zabraňujícím virové replikaci. Ostatní herpesviry, jakými je například herpes simplex, ale i ostatní cytomegaloviry, jsou rovněž vyléčitelné metodami tohoto vynálezu.
Příkladmé virové infekce zahrnují infekce vyvolané DNA nebo RNA viry zahrnujícími herpesviry (herpes simplex virus typ 1 (HSV-1), HSV-2, varicella zoster virus (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), lidský herpesvirus typ 6 (HHV-6), HHV7, HHV-8, bovinní herpesvirus typ 1, koňský herpesvirus typ 1), papillomaviry (HPV typ 1-55, zahrnující karcinogenní HPV), flaviviry (zahrnující virus žluté zimnice. African swine fever virus a Japanese encephalitis virus), togaviry (včetně Venezuelan equine encephalomyelitis virus), chřipkové viry (typ A-C), retroviry (HIV-1, HIV-2, HTLV-I, HTLV-II, SIV, FeLV, FIV, MoMSV), adenoviiy (typ 1-8), poxviry (virus vakcinie), enteroviry (poliovirus typ 1-3, Coxsackie, hepatitis A virus, a ECHO virus), gastroenteritis virus (Norwalk virus, rotaviry), hantaviry (Hantaan virus), polyomavirus, papovaviry, rhinoviry, parainfluenza virus typ 1 -4, viry vztekliny, respiratory synctial virus (RSV), viry hepatitidy A, B, C a E, a podobné.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-(2aminobenzylamino)purinových derivátů obecného vzorce I pro léčbu virových infekcí vyvolaných DNA viry v kombinaci s obvykle používanými virostatiky jakými jsou acyklovir, cidofovir, tamiflu a ribavirin.
Antivirová aktivita jednotlivých sloučenin se může stanovit běžnými testy antivirové (nebo jiné antimikrobiologické) aktivity za použití testů enzymové inhibice, testů na tkáňových kulturách, testů na zvířecích modelech a podobně, jak je známo odborníkům v oboru.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být rovněž (1) aplikovány v systémech tkáňových kultur k eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu při produkci biofarmaceutických nebo jiných produktů (jakými jsou proteiny nebo vakcíny), (2) použity k eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v klinických vzorcích (např. v krvi) a (3) použity k zastavení růstu tkáňových buněčných kultur při zachování schopnosti buněk produkovat proteiny. Význakem vynálezu jsou tedy substituované 6-(2aminobenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I pro použití v eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v systémech tkáňových kultur při produkci biofarmaceutických nebo jiných produktů, jakými jsou proteiny a vakcíny, pro eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v klinických vzorcích, jakými je např. krev, anebo k zastavení růstu tkáňových buněčných kultur při zachování schopnosti buněk produkovat proteiny a sekundární metabolity (antibiotika, sekundární rostlinné produkty, apod.).
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny obecného vzorce I pro použití jako inhibitory buněčné proliferace a/nebo induktory apoptózy.
Předmětem vynálezu je dále použití substituovaných 6-(2-aminobenzylamino)purinů obecného vzorce I pro výrobu léčiv pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferaci, jakými jsou nádory, restenóza, psoriáza, revmatická artritis, lupenka, diabetes I. typu, roztroušená skleróza, Alzheimerova choroba, parazitozy způsobené živočichy, houbami anebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease), dna, anebo proliferační onemocnění kůže.
Předmětem vynálezu je dále způsob inhibice CDK, zejména selektivní inhibice CDK9, inhibice buněčné proliferace anebo indukce apoptózy u savců, která zahrnuje podání terapeuticky účinného množství kompozice obsahující látku obecného vzorce I savcům.
Kromě ostatních CDK-příbuzných kinas, CDK9 kinasa kontroluje určité kroky cyklu buněčného dělení, zejména přechod z Gi fáze do S fáze a dále pak přechod z G2 fáze do M fáze. Sloučeniny obecného vzorce I a jejich farmaceuticky přijatelné soli mohou být použity jako antimitotické látky a pro léčbu proliferativních onemocnění. Při velmi nízkých koncentracích (mikromolámí a nižší) jsou schopné inhibovat přechody buněčného cyklu (Gi/S, G2/M, M-fáze/metafáze), které probíhají v živočišných tělech a v embryích. Kromě toho jsou tyto sloučeniny použitelné při léčbě autoimunitních onemocnění, e.g. revmatoidní artritidy, lupenky, diabetů I. typu, roztroušené sklerózy; při léčení Alzheimerovy choroby, kardiovaskulárních onemocnění jakými jsou restenóza, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease), dny a při léčení nádorů, polycystického onemocnění ledvin a ostatních proliferativních onemocněni, jejichž pathogenese zahrnuje abnormální buněčnou proliferaci.
Substituované 6 -(2-aminobenzylamino)purinové deriváty ob ecného vzorce 1 mohou být použity pro léčení onemocnění, jejichž pathogenese zahrnuje abnormální buněčnou proliferaci, v kombinaci s obvykle používanými cytostatiky, jakými jsou mitoxantron, cisplatina, methotrexát, taxol nebo doxorubicin.
Kromě terapeutických aplikací (pro lidské a veterinární použití) mohou být sloučeniny obecného vzorce I použity jako aditiva ve tkáňových kulturách pro kontrolu stavů proliferace a/nebo diferenciace buněk in vitro, například cestou kontroly hladiny aktivní CDK1/2 a CDK9.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-(2-aminobenzylamino)purinů obecného vzorce I pro inhibici katalytické aktivity cyklin-dependentních kinas, a to prostřednictvím interakce těchto sloučenin s ATP-vazebným místem těchto enzymů. Takovéto sloučeniny jsou zejména žádoucí pro redukci nadměrného buněčného růstu, neboť umožňují inhibici kinasové aktivity bez ohledu na příčinu nadměrné kinasové aktivity vedoucí k hyperproliferaci. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou tedy aktivní v situacích, ve kterých je mutovaná kinasa hyperaktivní, a situacích, ve kterých je kinasa přítomná ve zvýšených hladinách. Sloučeniny podle vynálezu mohou rovněž blokovat nadbytečnou kinasovou aktivitu v situacích, kdy cyklin regulující danou kinasu je přítomen v nadbytečných hladinách, nebo je mutován či je jeho vazba k CDK zvýšená. Konečně, sloučeniny podle tohoto vynálezu, které blokují kinasovou aktivitu prostřednictvím interakce s ATP vazebným místem enzymu, jsou rovněž vhodné pro inhibici kinasové aktivity v situacích, kdy přirozený proteinový inhibitor CDK-cyklin komplexů je mutován.
Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-(2-aminobenzylamino)purinů obecného vzorce I pro aktivaci nádorového supresoru p53, který je vlastní všem savčím buňkám, kde působí jako přirozený supresorický gen zastavující nekontrolované buněčné dělení (nádory) a je schopen vypnout nádorový vývoj buněk. p53 stejně jako retinoblastomový protein (pRb) jsou dobře charakterizované nádorové supresory, jejichž inaktivace může vést k nekontrolované proliferaci a malignitě. Fosforylace těchto dvou proteinů, které jsou zapojeny do regulačních mechanizmů buněčného cyklu, moduluje významně jejich funkci a aktivitu. Z toho vyplývá, že silně aktivní regulátory p53 představují vhodný nástroj pro terapii nádorových onemocnění a to cestou indukce wild typu p53 proteinu ve vybraných typech nádorů.
Studie probíhající s deriváty podle tohoto vynálezu prokázaly, kromě jiného, silný účinek na apoptózu v řadě nádorových buněčných linií. Bylo pozorováno, že apoptóza může být indukována ve fázi Gi nebo G2 a v souvislosti s poškozením DNA; některé buňky zastaví v Gi fázi a p5 3-dependent™ apoptotická dráha je poté indukována. V jiných situacích dochází k tomu, že buňky zastavují v G2/M přechodu jako reakce na poškození DNA a pak je pozorována aktivace p53-nezávislé apoptotické dráhy. Tato dráha je zejména významná v terapii nádorů, u kterých je pozorován nedostatek aktivního p53. Je proto důležitá i aplikace nových derivátů, které stimulují p53-nezávislou apoptózu v buňkách, které se zastavily v G2 fázi vlivem poškození DNA při použití agens jakými jsou mitoxantron nebo cis-platina. CDK inhibitory z tohoto vynálezu tak mohou zvýšit terapeutický potenciál současně používaných protinádorových látek.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek obsahující alespoň jeden substituovaný 6-(2-aminobenzylamino)purin obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič.
Nové sloučeniny mohou být podle tohoto vynálezu použity jako takové a nebo jako intermediáty při přípravě nových sloučenin majících řadu diagnostických, terapeutických a průmyslových použití.
Výše uvedené generické skupiny mají významy uvedené v následující legendě, přičemž:
alkoxy znamená skupinu -O-Ra, kde Ra je alkyl nebo cykloalkyl, amino znamená skupinu -NH2, halogen je vybrán ze skupiny zahrnující atomy fluoru, bromu, chloru a iodu, hydroxy znamená skupinu -OH, merkapto znamená skupinu -SH, alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 uhlíkových atomů, s výhodoi vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl, isopentyl hexyl, isohexyl;
alkenyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 2 až 7 uhlíkových atomů, s výhodoi vybranou ze skupiny zahrnující vinyl, allyl, 1-propenyl, 1-methylethenyl, but-1 až 3-enyl, pent-1 až4-enyl, isopentenyl, hex-1 až 5-enyl, hept-1 až 6-enyl, cykloalkyl znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 15 uhlíkových atomů, přednostně cyklopropyl, cyklohexyl nebo cyklopentyl, cycloalkyl alkyl znamená skupinu -Rb(cykloalkyl), kde cykloalkyl znamená cykloalkylovou skupinu jek definováno výše í Rb je alkylenová můstková skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, aryl znamená aromatickou karbocyklickou skupinu obsahující 6 až 18 uhlíkových atomů a tvořenou alespoň jedním aromatickým kruhem nebo násobně kondenzovanými kruhy, z nichž alespoň jeden kruh je aromatický, s výhodou aryl je fenyl, arylalkyl znamená skupinu -Rc-Ar, kde Ar znamená arylovou skupinu a Re je alkylenová můstková skupiní obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, s výhodou arylalkyl je benzyl.
Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou deriváty obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)butan-lol, 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9íf-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-1 -ol, 2-({6-[(2aminobenzyl)amino]-9-cyclohexy l-9/7-purin-2-yl} aminojbutan-1 -ol, 2-( {6-[(2aminobenzyl)aminoJ-9-benzyl-9H-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, A^-^-aminobenzyljW2-^aminopropyl)-9-methyl-9/f-purine-2,6-diamine, A,6-(2-aminobenzyl)-A,2-(2-aminopropyl)-9ethyl-977-purine-2,6-diamme, M-(2-aminobenzyl)-A'2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9./fpurine-2,6-diamine, Afi-(2-aminobenzyl)-JV2-(2-aminopropyl)-9-cyclohexyl-977-purine-2,6diamine, M-^-aminobenzylj-A2-(2-aminopropyl)-9-benzyl-9/7-purine-2,6-diamine, 2-({6[(2-aminobenzy])amino]-9-methyl-9/7-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2aminobenzy l )am i no] -9-ethy 1 -9/Apurin-2-y 1} amino)-3 -methy l-butan-1 -ol, 2-({6-[(2aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9#-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2aminobenzyljamino] -9-cyclohexy 1-9 H-puri n-2-y 1} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, 2-( {6-((2aminobenzyljamino] -9-benzyl-9Z/-purin-2-yl} amino)-3 -methy l-butan-1 -ol, 1 -({6 - [(2 aminobenzyljamino] -9-methyl-9/f-purin-2-yl} amino )propan-2-ol, 1 -({6-((2aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/f-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2aminobenzyljamino] -9-isopropyl-9/7-purin-2-y 1} amino)propan-2-ol, 1 -({6- [(2aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 Z/-purin-2-yl} amino )propan-2-ol, l-({6-[(2 aminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2'yl}amino)propan-2-ol, N6-(2-aminobenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-methyl-9/f-purine-2,6-diamine, N6-(2-aminobenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-ethyl-97/-purine-2,6-diamine, N6-(2-aminobenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, N -(2-aminobenzyl)-N -(4aminocyclohexyl)-9-cyclohexyl-9 H-purine-2,6-diamine, N6-(2-aminobenzyl)-N2-(410 aminocyclohexyl)-9-benzyl-9H-purine-2,6-diamine,
-({6-[(2-aminobenzy I)amino]-9methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol,
2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-olJ yl} amino)-2-methy l-butan-2-ol, y 1} amino)-2 -methyl-butan-2-ol, yl }amino)-2-methyl-butan-2-ol, yl} amino)-2-methy l-butan-2 -ol, yl} amino)-2-methy l-butan-2-ol, yl} amino)-2-methy l-butan-2-ol, yl) amino)-2-methyl-butan-2-ol, yl} amino)-2-methy l-butan-2-ol, y 1} amino)-2-methy l-butan-2-ol, yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, yl} amino)-2-methy l-pentan-2-ol, yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, l-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-(3-pentyl)-9//3 -({6 - [(2 -aminobenzy l)amino] -9-methy l-9H-purin3-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-23 -({6- [(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-23-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-23-( {6- [(2-aminobenzyl)amino]-9-bcnzyl-9//-purin-24-( {6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-91Z-purin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9íř-purin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/f-purin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /Apurin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purÍn-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-97Apurin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amÍno]-9-ethyl-9//-purin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isoptopyl-9Z/-purin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2y 1} amino)-2-methy l-pentan-2-ol, yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol,
4-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-24-( {6-[(2-aminobenzy])amino]-9-methyl-97/-purin-24-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-24-( {6 - [(2 -aminobenzy l)amino] -9-i sopropy l-9H-puri n-2 yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /7-purin-2yl} amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, y 1} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, yl} amino)’2-methy l-pentan-2-ol, yl} amino)-2-methy l-pentan-2-ol, yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol,
4-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-23 - ({6- [(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin-23-({6-[(2 -aminobenzy l)amino] -9-ethy l-92/-purin-23-({6-[(2-amínobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2
3-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 7/-purin-23-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-23-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-methyl-9/f-purin-2 yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl]amino}pentan-2ol, 3-({6-[(2-aminobenzyl)amÍno]-9-isopropyl-9Z7-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 77-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2aminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(211 aminobenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1-( {6-((2aminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yI}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6-((2amÍnobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino
5-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-1 -ol, chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, chlorobenzyl)amino] -9-cyclohexyl-9//-purin-2-yl} amíno)butan-1 -ol, chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-2-yl}amino)butan-1 -ol, chlorobenzy[)-Af2-(2-aminopropyl)-9-methyl-9/7-purine-2,6-diamine, chlorobenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-ethyl-9W-purinc-2,6-diaminc, chlorobenzyl)-A2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, chlorobenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-cyclohexyl-97:/-purine-2,6-diamine, chlorobenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-benzyl-977-purine-2,6-diamine,
2-({6-[(2-amino-52-({6-[(2-amino-52-({6-[(2-amino-5A'6-(2-amino-5A'6-(2-amino-5A^-fŮ-amino-éA^-P-amino-SA^-p-amino-S2-({6-[(2-amino-5chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)-3-niethyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino5-chlorobenzyl)amino]-9-ethy 1 -9H-puri n-2-yI} amino)-3-methy 1-butan-1 -ol, 2-({6- [(2-amino5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l -ol, 2({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9Z/-purin-2-yl)amino)-3-methyl-butan-l-ol, N^2-amino-5-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-mcthyl-9/Y-purine-2,6-diamine, N6(2-amino-5-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-ethyl-9H-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-5-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-97/-purine-2,6-diamine, N6-(2ammo-5-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-cyclohexyl-9 /7-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-5-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-benzyl-9//-purine-2,6-dianiine, l-({6-[(2 amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9/f-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6[(2-amino-5-chlorobenzyl)aniino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-( {6-[(2-amino-5 -chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl)amino)-2-methyl-butan-2ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-oi, 3-({6-[(2'amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9íir-purin-2-yl}amino)2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purÍn-2yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H12 purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-benzyl· 9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9methyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amíno]9-ethyl-9Z/-purin-2-yl} amino)-2-methyI-pentan-2-ol, 4-( {6- [(2-amino-5-chlorobenzyl)amino] 9-isopropyl-9//-purin-2-yi}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yl}annno)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2amino-5<hlorobenzyl)amino]-9-bcnzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 1 -({6[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)propan-2-ol; l-({6-[(2~ amino-5 -chlorobenzyl)ammo]-9-ethy l-9//-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-5 chlorobenzyl)amino]'94sopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 Z/-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9W-purin-2-y[}amino)propan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9H-puri n-2-yl} amino)-2,3 -dimethyl-butan-2-ol, 4-( {6- [(2 amino-5<hlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}ainino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 4-( {6- [(2 -amino-5 -chlorobenzy l)amino] -9-benzy l-9íf-purin-2-y 1} amino)-2,3 dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2“ yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/fpurin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9cyclohexyl-9 Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5 chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol; 3-({6-[(2-amino5-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-97/-purin-2-yl]amino}pentaii-2-ol, chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl]aniino}pentan-2-ol, chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-97f-purin’2-yl]amino}pentan-2-ol, chlorobenzy l)amino]-9-cyclohexyl-9 //’purin-2’yl]amino}pentan-2-oL chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-olJ
3-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-5’
3-({6-[(2-amino-5· l-({6-[(2-amino-5chlorobenzyl)amino]-9-cyclopropyb9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-oI, 1 -({6-[(2amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 ({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purm-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-methyb9/f-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//“purin’2’y 1} amino)butan-1 -ol, 2-( {64 (2-amino-3 chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9f/-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-313 chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, A^’-(2-ammo-3chlorobenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-methyl-9W-purine-2,6-diamine, A?6-(2-amino-3chk)robenzyl)-A'2-(2-aminopropyl)-9-ethyl-9/ApLinne-2,6-diamine, A'6-(2-amino-3chlorobenzyl)-A/2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9H-purine-2,6-diamine, ,V’-(2-amino-3chlorobenzyl)-Ar2-(2-aminopropyl)-9-cyclohexyl-9//-purine-2,6-diamine, A^-í^-amino-Schlorobenzyl)-?/2-(2-aminopropyl)-9-benzy]-9/f-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-3chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}ammo)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino3-chlorobenzyl)amÍno]-9-ethyl-9íř-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino
3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}ammo)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 J7-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2({6-[(2-ammo-3-chlorobenzyl)arnino]-9-benzyl-9J/-purin-2-yl}ammo)-3-rnethyl-butan-l-ol, N6-(2-amino-3-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-977-purine-2,6-diamine, N6(2-amino-3-chloiObenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-ethyl-9#-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-3-chlorobenzyl)-N -(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9/7-purine-2,6-diamine, N -(2arnino-3-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9/f-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-3-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-cyclohexyl-9 H-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-3-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-benzyl-9//-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9Z/-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino3-chlorobenzy l)amino]-9-ethyl-9Z/-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-3 chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, b({6-[(2-amino-3chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /f-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 1 -({6-[(2-amino-3chlorobenzyl)amino]-9-benzy]-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-3 chlorobenzyi)amino]-9-methyl-9#-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-amino3 -chlorobenzy l)amino] -9-ethy l-9H-purin-2-yl} amino)-2-methy l-propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino
3-chlorobenzyl)amino]-9-i$opropyl-9/f-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propaii-2-ol, 3-({6-[(2amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//Lpurin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2ol, 3-({6-[(2-amino-3-chlorobcnzyl)aminoj-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amÍno]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9#-purin-2-yl}annno)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /f-purin-2 yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9/f-purin2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9//purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyi)amino]-9isopropyl-9£f-purin-2-yl)amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9í/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purm-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-( {6-[(2-amino-3 -chlorobenzyl)amino] -9-ethy l-9//-purin-2-yl} amino)-2,3-dimethyl-butan-2ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yl}amino)-2,3dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3<hlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)2,3-dímethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-methyl-9/f-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9H-purin-2yl} amino )-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//purin-2-yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-( {6-[(2-amino-3 -chlorobenzyl)amino] -9 cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol,
3-({6-[(2-amino-3chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino
3-chlorobenzyl)amin0]-9-methyl-9f/-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, chlorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-97/-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol,
3-({6-[(2-amino-33-({6-[(2-amino-33-({6-[(2-amino-3ch]orobenzyl)amino]-9-cyclohexyi-9 77-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3 chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-3chlorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)“2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-olt 2-({6[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-methyl-9?/-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2 amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl)amino)butan-l-ol, fluorobenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9/7-purin-2-yl}aniino)butan-l-ol, fluorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-977-purin-2-yl}amino)butan-l-ol,
2-({6-[(2-amino-52-({6-[(2-amino-52-({6-[(2-amÍno-52-({6-[(2-amino-5fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-9H'purin-2-yl}amino)butan-l-oI, M-(2-amino-5-fluoiObenzyl)jV2-(2-aminopropyl)-9-methyl-9H-purine-2,6-diamine, A^-(2-amino-5-fluorobenzyl)-íV2-(2amÍnopropyl)-9-ethyl-9//-purine-2,6-diamine, A'6-(2-amino-5-fluorobenzyl)-Y2-(2aminopropyl)-9-isopropyl-9H-purine-2,6-diamine, jV6-(2-amino-5-fluorobenzyl)-Y2-(215 aminopropyl)-9-cyclohexyl-9//-purine-2,6-diamine, A^-(2-amino-5-fluorobenzyl)-jV2-(2aminopropyl)-9-benzyl-9/7-purine-2,6-diamine, 1 -({6-[(2-amÍno-5-fluorobenzyt)amino]-9methyl-9/7-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//purin-2-y!} amino)propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-5-fluorobenzyl)amino] -9-cyclohexyl-9 Hpurin-2-yl}amíno)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-9Z/-purin-2yl}amino)propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-methyl-9jV-purin-2yl} amino)-3 -methyl-butan-l-ol, 2-( {6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino] -9-ethyl-9/7-purin-2yl}amino)-3-methyl-butan-Kol, 2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9cyclohexyl-9 /7-puri n-2 -y 1} amino)- 3 -methyl-butan- l-ol,
2-({6-[(2-amino-5N6-(2-amino-5N6-(2-amino-5N6-(2-amino-5N6-(2-amino-5N6-(2-amino-5fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, fluorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9//-purine-2,6-diamine, lluorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohcxyl)-9-cthyl-9//-purine-2,6-diamine, fluorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-97/-purine-2,6-diamine, fluorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9//-purine-2,6-diamine, η ή fluorobenzyl)-N -(4-aminocyclohexyl)-9-cyclohexyl-9 H-purine-2,6-diamine, N -(2-amino-5fluorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-benzyl-9//-purine-2,6’diamine, l-({6-[(2-amino-5fluorobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-Gl, l-({6-[(2-amino5 -fluoro benzyl )amino]-9-ethyl-9H-puri n-2-yl} amino)-2-methy l-propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino5 -fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6 - [(2 amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-(3-pentyl)-9í/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3 ({6-[(2-amino-5 -fluorobenzyl)amino]-9-methyl-9 J7-purin-2-yl} amino)-2-methyí-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-niethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H -purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6“[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-methyl-977-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl-9J/-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 Hpurin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-9//purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-methyl9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl
9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9isopropyl-9ÁApurin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol,
4-({6-[(2-amino-5fluorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amíno)-2-methyl-pcntan-2-ol, 4-({6-[(2amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-methyl-9Z/-purm-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]’9-ethy]-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethy]-butan-2-ol, 4-( {6’[(2 -amino- 5 -fluorobenzyl)amino] -9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl} amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)ammo]-9-cyclohexyl-9 /7-purin-2-yl}amino)-2,3dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-97/-purin-2-yl}amino)2,3'dimethyl-butan-2-ol,
3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-methyl-9Jř-purin-2 yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-977purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzy[)amino]-9cyclohexyl-9 ZApurin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-9Z7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino
5’fluorobenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, fluorobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol,
3-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-5fluorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /Apurín-2-yl]arnino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5
f]uorobenzyl)amino]-9-benzyl-9/Apurin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5 fluorobenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6-[(2amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 íf-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 ({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-benzyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol,
2-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2 amino-5-iodobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5 iodobenzyt)amino]-9-cyclohexyl-9H-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5iodobenzyl)amino]-9-benzyl-9ř/-purin-2-yl}amino)butan-1 -ol, V’-(2-amino-5-iodobenzyl)-íV2 (2-aminopropyl)-9-methyl-9//-purine-2,6-diamine, aminopropyl)-9-ethyl-9ř/-purine-2,6-diamine, aminopropyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, aminopropyl)-9-cyclohexyl-9//-purine-2,6-diamine,
A^-(2-amino-5-iodobenzyl)-jV2-(2/^-(Z-amino-S-iodobenzylJ-jV2^M-(2-aminO’5-iodobenzyI)-jV2’(2/^-(Ž-amino-S -iodobenzyl)-N2-(2aminopropyl)-9-benzyl-9//-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9 methyl-9#-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9ethyl-9řf-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9 isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-(-(6-[(2-amino-5-iodobenzy[)amino]9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-1 -ol.
iodobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl }amino)-3-methyl-butan-1 -ol, iodobenzy l)amino]-9-mcthyl-9H-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-y]} amino)propan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9H’purin-2-yl}amino)propan-2-oL iodobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)propan-2-ol,
2-({6-[(2-amino-5l-({6-[(2-amino-5l-({6-[(2-amino-5l-({6-[(2-amino-5l-({6-[(2-amino-5l-({6-[(2-amino-5iodobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amÍno)propan-2-ol, N6-(2-amino-5-iodobenzyl)N -(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9f/-purine-2,6-dÍamine, N -(2-amino-5-íodobenzyl)-N -(4aminocyclohexyl)-9-ethyl-9//-purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-5-iodobenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9//-puríne-2,6-diamine; N6-(2-amino-5-iodobenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-cydohexyl-9 //-purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-5-iodobenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-benzyl-9/7-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9methyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9 isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}ainino)-2-methyl-butan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-ethyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol,
3-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-5iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino5-iodobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, amino-5-iodobenzyl)ammo]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, amino-5-iodobenzyl)amino]-9-methyl-9Z7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, amino-5-iodobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol,
3({6-[(24-({6-[(24-({6-[(24-({6-[(2amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 ř/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-benzyl-9/f-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}ainino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5 -iodobenzyl)amino] -9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl} amino)-2-methyl-pentan2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-benzyl-9J/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 4-( {6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino] -9-ethyl-9/f-purin-2-yl} amino)-2,3 dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino*5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2 yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-( {6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 Hpurin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-benzyl9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9 methyl-9f/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-oL 3-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9ethyl-9íf-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]9-cyclohexyl-9
Zf-purin-2-yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol,
3-({6-[(2-amino-5iodobenzyl)amino]-9-benzyl-97f-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5iodobenzyl)amino]-9-methyl-9ZZ-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-ethyl-9H-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-97f-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl] amino }pentan-2-ol, iodobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol,
3-({6-[(2-ammo-53-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-53-({6-[(2-amino-5l-({6-[(2-amino-5iodobenzyl)amino]-9-cyclopropyl-97/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2 amino-5-iodobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1({6-[(2-amino-5-iodobenzy l)amino]-9-benzyl-9/7-purin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol,
2-({6-(2,3-diammobenzyl)amino]-9-methyl-9/Z-purin-2-yl}ammo)butan-l-ol} 2-({6-(2,3diaminobenzyl)amino] -9-ethyl-9H-purin-2-yl} amino)butan-1 -ol, 2-({6-(2,3 diaminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-benzy]-9/7-purin-2-yl}amino)butan-l-ol5 M-(2,3diaminobenzyl)amino]-Ar2-(2-aminopropyl)-9-methyl-9íf-purine-2,6-diamine, M-(2,3diaminobenzyl)amino]-Af2-(2-aminopropyl)-9-ethyl-9//-purine-2,6-diamine, M-(2.3diaminobenzyl)amino]-/V2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9/7-purine-2,6-diamine, ?/-(2.3diaminobenzyl)amino]-7V2-(2-aminopiOpyl)-9-cyclohexyl-9//-purine-2,6-diamine, //-(2,3diaminobenzyl)amino]-A -(2-aminopropyl)-9-benzyl-9//-purine-2,6-diamme, 2-({6-(2,3diaminobenzyl)amÍno]-9-methyl-9?7-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-]-ol, 2-({6-(2,3diaminobenzy í)amino]-9-ethy 1 - 9/Z-p uri n-2 - y 1} amino)-3-methy l-butan-1 -ol, 2-( {6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yí}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 l/-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl} ami no)-3-methyl-butan-1 -ol, N6-(2,3diaminobenzyl)amino]-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9//-purine-2,6-diamine, N6-(2,3diaminobenzyl)amino]-N -(4-aminocyclohexyl)-9-ethyl-9H-purinc-2.6-diamine, N -(2,32 6 diaminobenzyl)amino]-N -(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9/7-purine-2,6-diamine, N -(2,3diaminobenzyl)amino]-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-cyclohexyl-9 27-purine-2,6-diamine, N619
(2,3-diaminobenzyl)amino]-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-benzyl-977-purine-2,6-diamine, 1 -({6(2,3-diaminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6(2,3-diaminobenzyl)amino]-9-ethyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-ethyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/f-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino] -9-cyclohexy 1-9 //-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3 -({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-( {6-(2.3diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-( {6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-9f/-purin-2-yl}ammo)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-methyl-9/f-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-ethyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9íř-purin-2-yl}ainino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-(2,3 diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-ethyl-9f/-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9íApurin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6(2,3-diaminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /7-purin-2-yl} amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4({6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-977-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3({6-(2,3-diaminobenzyl)amino] -9-methyl-9//-purin-2-y 1} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3 -({6(2,3-dÍaminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/f-purín-2-yl}amÍno)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 W-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-(2,3dÍaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-(2,3dÍammobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-(2,3diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-9/f-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-(2,320 diaminobenzyI)amino]-9-cyclopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6(2,3-diaminobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 ({6-[(2,3-diaminobenzyl)amino]amino]-9-benzyl-92/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2ol, 1 -({6-[(2,3-diaminobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6[(2,3 -diaminobenzy l)amino]-9-ethyl-9F/-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6 - [(2,3 diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2,3diaminobenzyl)amino] -9-cyclohexyl-9 ř/-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6- [(2,3 diaminobenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, methylbenzyl)amino]-9-methyl-9/Apurin-2-yl }amino)butan-1 -ol, methylbenzyl)amÍno]-9-ethyl-9f/-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, methylbenzyl)amÍno]-9-cyclohexyl-97/-purin-2-yl} amino)butan-1 -ol, methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-1 -ol, methylbenzyl)-JV2-(2-aminopropyl)-9-methyl-9//'-purine-2,6-diamine, methylbenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-ethyl-977-purine-2,6-diamine, methylbenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, methylbenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-cyclohexyl-9/f-purine-2,6-di amine, methylbenzyl)-yV2-(2-aminopropyl)-9-benzyl-97/-purine-2,6-diamine,
2-({6-[(2-amino-52-({6-[(2-amino-52-({6-[(2-amino-52-({6-[(2-amino-5A'6-(2-amino-5A^-amino-SJ^^-amino-í^-(ž-amino-SM-Q-amino-S2-({6-[(2-amino-5methylbenzy l)amino]-9-methy 1-9 JApurin-2-yl} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, 2-({6- [(2-amino5-methylbenzyl)amino]-9-cthyl-9H-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-oL 2-({6-[(2-amino5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-927-purin-2-yl} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, 2-( {6-[(2 amino-5-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-1 -ol, 2({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino] -9-benzy l-9ZApur i n-2 - y 1} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, N -(2-amino-5-methylbenzyl)-N -(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9H-purine-2,6-diamine, N (2-amino-5-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-ethyl-9H-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-5-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9H-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-5-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyi)-9-methyl-9/f-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-5-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-cyclohexyl-9 //-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-5-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohcxyl)-9-benzyl-9//-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6[(2-amino-5’methylbenzyl)amino]-9’ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1({6-[(2-amino-5-methylbcnzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2ol, 1 -({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 1 ({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]~9-ethyl-977-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6~[(2amino-5-methylbenzyl)amino] -9-isopropy l-9H-purin-2-y 1} amino)propan-2-ol, 1 -({6- [(2 amino-5 -methy lbenzyl)amino]-9-cyclohexyl -9 H-purin-2-y l} amino)propan-2-ol, 1 -({6-[(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3-({6-[(2-amino5-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}ammo)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methy!-butan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 E/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-benzyl·9H-puΓiIl-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9Zf“purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopiOpyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)ammo]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/Z-purin2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-me±ylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9cyclohexyl-9 //-purin-2-yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-( {6- [(2-amino-5methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9íf-purin-2-yl}amino)-2-tnethyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino5-methylbcnzyl)amino]-9-methyl-9H-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/f-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2,3dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purm-2yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9//purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-ethyl9//-purín-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2'amino-5-methylbenzyl)ammo]-9isopropyl9//-purin-2-yl}amino)’2’methyl·pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9/f-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol. 3-({6-[(2-amino-5methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9/f-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5 methylbenzy l)amino] -9-cyclopropyl-9//-purin-2-y 1} amino)-2 -methy l-propan-2-ol, 1 -({6- [(2 amino-5-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 ({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9/Z-purm-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}arnino)butan-l-ol, 2-( {6[(2-amino-4-methylbenzyl)amino] -9-ethyl-9/7-purin-2-yl} amino)butan-1 -ol, 2-( {6-[(2-amino4-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9//-purin-2-yl} amino)butan-1 -ol, 2-( {6- [(2-amino-4methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, A^-(2-amino-4methylbenzyl)-A'2-(2-aminopropyl)-9-methyl-9//-purine-2,6-diamine, A'6-(2-amino-4methylbenzyl)-Ar2-(2-aminopropyl)-9-ethyl-9Z7-purine-2.6-diamine, /A^-amino^methylbenzyl)-7V2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-977-purine-2,6-diamine, 7^-(2-amino-5fluorobenzyl)-7V2-(2-aminopropyl)-9-cyclohexyl-9//-purine-2,6-diamine, A^-^-amino-Sfluorobenzyl)-A2-(2-aminopiOpyl)-9-benzy]-9/f-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-5fluorobenzyl)amino] -9-methyl-9//-purin-2-y 1} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, 2-( {6-[(2-amino5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl-9Z/-purin-2-yl} amino)-3-methy 1-butan-1 -ol, 2-( {6-[(2-amino5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-oi, 2-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 7/-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2 ({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-benzy l-9#-purin-2-yl} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, N6-(2-amino-4-tnethylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9/Z-purine-2,6-diamine, N6(2-amino-4-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-ethyl-9//-purine-2,6-diarnine, N6-(2amino-4-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9#-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-4-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9Z/-purine-2,6-diamine, N6-(2amino-4-methylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-cyclohexyl-9 //-purine-2,6-diamine, N6-(2ammo-4-methylbenzyl)-N -(4-aminocyclohexyl)-9-benzyl-977-purine-2,6-diamine, 1 -({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-piOpan-2ol, l-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 1({6- [(2-amino-4-methylbenzyl)amino] -9-ethyl-9H-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9Z/-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3-({6-[(2-amino4-methylbenzyl)amino] -9-methyl-9//-purin-2-y 1} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3 -({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6
[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexy]-9 H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl)ammo)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9/Z-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9Z7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/Z-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9ř/-purin-2-yl}amino)2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9cyclohexyl-9 /7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-oI, 4-({6-[(2-amino4-methylbenzy|)amino]-9-methyl-9f/-purin-2-yl}ammo)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 ff-purin-2-yl}amino)-2,3dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9/7purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-ethyl9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4-methyIbenzyl)amino]-9isopropyl-9f/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino4-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/f-purin'2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amÍno-4methylbenzyl)amino]'9-isopropyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4methylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /Apurin-2-yI]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4methyIbenzyl)amino]-9-benzyb9Z/-purin-2-yl]amino}pentan-2-oL l-({6-[(2-amino-4methylbenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino] -9-cyclohexyl-9 77-purin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 ({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-benzyl-977-purin-2-yl}amino)-2-niethyl-propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-977-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, 2-({6[(2-amino-3 -methoxy lbenzyl)amino]-9-ethy l-9/7-purin-2-yl} amino)butan-1 -ol, 2-({6 - [(2 24 amino-3 -methoxylbenzyl )amino] -9-cyc lohexyl-9//-purin-2 -yl} amino)butan-1 -ol, 2 -({6- [(2 amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9H-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, methoxylbenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-methyl-9//-purine-2,6-dianiinet methoxylbenzyl)-Af2-(2-aminopropyl)-9-ethyl-9//-purine-2,6-diamine, methoxylbenzyl)-Ar2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, methoxylbenzyl)-Af2-(2-aminopropyl)-9-cyclohexyl-9Z7-purine-2,6-diamine,
A/6-(2-amino-37V6-(2-amino-3/A^-amino-SA^-^-amino-Smethoxylbenzyl)-7V2-(2-aminopropyl)-9-benzyl-97/-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-3methoxy lbenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin~2-y 1} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, 2-({6- [(2 amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl}amino)-3-inethyl-butan-l-ols 2-({6[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9fZ-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 27-purin-2-yl}amino)-3-methylbutan-1 -ol, 2-( {6- [(2-amino-3 -methoxy lbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-y 1} amino)-3 methyl-butan-1 -ol, N6-(2-amino-3-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl-9íA purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-3-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-ethyl-9//purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-3-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl9Zf-purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-3-methoxylbenzyl)-N2-(4-ammocyclohexyl)-9-methyl9//-purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-3-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9cyclohexyl-9 #-purine-2,6-dianiine, N\2-amíno-3-methoxylbenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-benzyl-9/7-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-3methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2ol, 1 -({6-[(2-amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-methyl-977-purin-2-yl}amino)propan-2’Ol, 1 ({6-[(2-amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-ethyl-977-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 1 -({6-[(2amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-isopropyl-97í-purin-2-yl}amino)propan-2-olJ l-({6-[(2amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 7f-purin-2-yl}ammo)propan-2-ol, 1 -({6-[(2amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3-({6-[(2amino-3 -methoxylbenzyl)amino] -9-methyl-97/-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3 -({6[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-olt 3({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z7-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /7-purin-2-yl}ammo)-2methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-ammo-3-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-977purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-( {6-[(2-amino-3 -methoxy lbenzyl)amino]-9-ethyl
9//-purin-2-yl}am!no)-2-methyl’butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3methoxylbenzyl)amino] -9-cyclohexyl-9 íApurin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-( {6- [(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-bcnzyl-9//-punn-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-oL 4-({6((2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amÍno)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cthyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyI-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-punn-2-yl}amino)2-methyl-pentan-2-ol, 4-([6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2yl} amino)-2-methyl*pentan-2-ol, 4-( {6-[(2-amino-3 -methoxylbenzyl)amino] -9-methy 1-9//purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9řf-purin-2-yl}ainÍno)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purín-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2,3dimethyl-butan-2-ol, 3 -({6- [(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/ípurin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9isopropyl-9//-purin-2-yl}ammo)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, l-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-methoxybenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6-[(2-amino-5-methoxybenzyl)amino] -9-ethyl-9//-purin-2yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-methoxybenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2yl)amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzy)ammo]-9-cyclohexyl-9 7/-purin-2yl} amino)propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-5-methoxybenzyl)amino]-9-benzyl-9//'purin-2 yl}amino)propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9Z/-purin-2yl}amino)butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohcxyl-9//-purin-2yl}amino)butan-1 -ol, 2-({ 6- [(2-amino-5-methoxy lbenzyl)amino] -9-benzy l-9ř/-purin-2yl}amino)butan-1 -ol, A^-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-A2-(2-aminopropyl)-9-mcthyl-9/7purine-2,6-diamine, JV6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-V2-(2-aminopropyl)-9-ethyl-9í/-purine2,6-diamine, V6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-V2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9H-purine-2,6diamine, M-(2-amino-5-fluorobenzyl)-jV2-(2-aniinopropyl)-9-cyclohexyl-9//-purine-2,6diamine, A/6-(2-amino-5-fluorobenzyl)-ŤV2-(2-aminopropyl)-9-benzyl-9Z/-purine-2,6-diamine>
2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-mcthyl-9/7-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-ethyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9Zf-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-lol, 2-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yl}amino)-3-methylbutan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9ř/-purin-2-yl}amino)-3methyl-butan-1 -ol, N6-(2-amino-5-methoxy lbenzy l)-N2-(4-am inocydohexy l)-9-methyl-9/7purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-ethyl-9fZpurine-2,6-diamine, N6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl9H-purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-methyl9//-purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9cyclohexyl-9 //-purine-2,6-diamine, N6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-N2-(4aminocyclohexyl)-9-benzyl-9/7-purine-2,6-dianiine, l-({6-[(2-amino-5methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-9/Apurin-2-yl}aniino)-2-niethyl-propan-2-ol, 1 -({6-[(2 amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-Ísopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclopropyl9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9cyclohexyl-9 JY-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2amino-5-methoxyibenzyl)amino]-9-methyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-metliyl-butan-2-olJ 4({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-97/-purin-2-yl}ainino)-2-methyl-butan
2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 l/-purin-2-yl}amino)-2methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-977-purin-2yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-methyl-917purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl9/7-purin-2-yl}ammo)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9isopropyl-9/f-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2amino-5-methoxylbenzyi)amino]-9-benzyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4({6-[(2 -amino-5-methoxylbenzy l)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl} amino)-2,3 -dimethyl-butan2-ol, 4-({64(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9ZZ-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9i/-purin-2-yl}amino)-2,3dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9/7purin-2-yl} amino)-2,3 -dimethyl-butan-2-ol, 3 -({6- [(2-amÍno-5-methoxyibenzyl)amino]-9methyl-9čř-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5methoxylbenzyl)amino]-9-ethyl-9/7-purm-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol( 3-({6-[(2amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 7/-purin-2-yl} amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)aniino]-9-benzyl-9i7-purin-2-yl}amino)-2methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyI)amino]-9-methyl-9Z7-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)aniino]-9-ethyl-927-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mcthoxylbcnzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 /7-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-benzyl-9/7-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9//-purin-2yl} amino)-2-methy l-propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-5-methoxy lbenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 77-purin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-5-methoxy lbenzyl)amino]-9benzyl-9//-purin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amÍno]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-mcthylpentan-2-oI, 3-({64(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-isopropyl-91/-purin-2-yl}amino)-2methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-bcnzyl-9/7purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9 methyl-9Z/-purin-2-yl]amino)pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-ethyl9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-isopropyl9f/-purin-2-yl]amino}pentan-2-oi, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amÍno]-9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl]amÍno}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-benzyl-9/7purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9-cydopropyl-9//purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-mercaptobenzyl)amino]-9cyclohexyl-9 77-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6-[(2-amino-5 mercaptobenzyl)amino]-9-benzyl-9/Z-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-nitrobenzyl)amÍnoJ-9-melhyl-9f/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-nitrobenzyl)amino]-9-ethy l-977-purin-2-yl} amino)-2-mcthyl-pentan-2-ol, 3-( {6- [(2 amino-5-nitrobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6[(2-amino-5-nitrobenzyl)amino]-9-cyclohexyF9 //-purin-2-yl}amino)-2-rnethyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-nitrobenzyl)amino]-9-benzyl-92/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-mtrob€nzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yi]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2amíno-5-nitrobenzyl)amino]-9-ethyl-9í/-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5nitrobenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl]ammo}pentan-2-ol> 3-({6-[(2-amino-5nitrobenzyl)amino] -9-cyclohexyl-9 //-purin-2-yl]amino} pentan-2-ol, 3-( {6- [(2-amino-5nitrobenzyl)amino]-9-benzy l-9H-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 1 -({6-[(2-amino-5 nitrobenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2amino-5-nitrobenzyl)amino]-9-cyclohexyI-9 //-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1({6-[(2-amino-5-nitrobenzyl)amino]-9-benzy!-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyI-propan-2-ol.
Způsoby přípravy
Výchozím materiálem pro přípravu sloučeniny obecného vzorce I je 2,6-dichloropurin připravený z hypoxantinu a hypoxanthin-l-N-oxidu chlorací pomocí POCI3 (Davoll and Blowy, J. Am. Chem. Soc. 1957;73:2936). Tento výchozí materiál je rovněž dostupný z komerčních zdrojů (Sigma, Aldrich, Fluka, atd.).
V jednom přístupu se 2,6-disubstituovaný purin obecného vzorce I se připraví z 2,6dichloropurinu reakcí s příslušným nukleofílem. 2,6-Dichloropurin je rozpuštěn v n-butanolu a poté je přidán příslušný R6-amin (1,5 - 5 eq.) a několikanásobný přebytek triethylaminu. Po zahřátí po dobu několika hodin je reakční směs zchlazena a je tak získán 2-chloro-6substituovaný purin. R9 substituované deriváty jsou připraveny z 2-chloro-6-substituovaných purinů (v DMSO nebo DMF), ke kterým se přidá práškový uhličitan vápenatý (přibližně 3 eq.) a poté R9-halogen. Po několika hodinách až dnech intenzivního míchání je produkt izolován pomocí kapalinové chromatografie. Substituce na C2-C1 je nakonec dovršena reakcí s druhým nukleofílem (5 - 30 ekvivalentů substituovaných aminů, aminoalkanoly; merkapto deriváty za přítomnosti N-methylpyrolidinonu nebo N-ethyl-diisopropylaminu) při teplotě 160-180°C. Tento produkt je nakonec izolován kapalinovou chromatografíí nebo krystalizován z n-BuOH nebo vody.
TERAPEUTICKÁ APLIKACE
Vhodné cesty pro aplikaci jsou orální, rektální, vazální místní (zahrnující okulámí, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (zahrnující subkutánní, intramuskulámí, intravitreózní, nitrožilní, intradermální, intrathekální a epiduráiní). Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.
Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90% aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.
Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.
Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, βkarotenu nebo 3,5-di-terAbutyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafíl M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafíl M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cg až C12 od Húls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sesamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně.
Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.
Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.
Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulosové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinyípyrrolidin, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylový škrob, zesítěný polyvinyípyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát hořečnatý a/nebo vápenatý, polyethylen glykol nebo jeho deriváty.
Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinyípyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulosových preparátů jako acetylcelulosaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulosaftalát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.
Farmaceutické přípravky které mohou být užívány orálně jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát horečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylen glykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.
Další formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10 % nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.
Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafínové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy.
Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofilizátu společně s excipienty kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro infuzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobi cidy kyselina sorbová či benzoová.
Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří zejména uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol, propylen glykol, sorbitol a/nebo polyethylen glykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.
Mastné masti jsou ne vodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafín, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo, s výhodou, hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo olej z podzemnice olejně, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a/nebo distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a/nebo aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.
Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou zejména mastné alkoholy, např, lauryl, cetyl nebo staryl alkoholy, mastné kyseliny, například palmitová nebo stearová kyselina, kapalné a pevné vosky, například isopropyl myristát, lanolin nebo včelí vosk, a/nebo uhlovodíky, například vazelína (petrolatum) nebo parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofílními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. estery polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery (Tween) dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.
Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např, oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.
Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako polyhalogenované alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou používána aditiva tam zmíněná.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.
Tento vynález dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku a mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.
Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0,5 až 2 g.
Přehled výkresů
Obr. 1 ukazuje dávkově závislé antiproliferativní účinky vybraných purinových derivátů na lidských nádorových buněčných liniích MCF7 a K562, s roskovitinem jako standardem.
Obr. 2 ukazuje imunoblotové analýzy MCF7 buněk ošetřených po dobu 24 h indikovanými koncentracemi sloučeniny 105. Byla pozorována redukovaná fosforylace pRb na Ser780, Ser807 a Thr821, což naznačuje pokles aktivity CDK4 a CDK2. Indukce hladin nádorového supresoru p53 a p21WAF1 spolu s redukovanou fosforylaci CTD v RNA polymerase II naznačuje blok transkripce.
Obr. 3 ukazuje dávkově závislý účinek sloučeniny 105 a roskovitinu na p53-závislou transkripci. A, Buňky Am8 stabilně transfekované p53-responzivním β-galaktosidázovým reportérovým konstruktem byly ošetřeny rozdílnými inhibitory CDK po dobu 24 h a pozitivní buňky byly spočteny pomocí světelného mikroskopu pro každou koncentraci v triplikátech. B, indukce proteinů p53 a p21WAH v buňkách Am8 ošetřených indikovanými koncentracemi CDK inhibitorů. C, indukce proteinů p53 a p21wAF1 v huňáci MCF-7 po ošetření sloučeninou 105. Buňky byly sklizeny a proteiny byly separovány na 10% SDS-PAGE gelu a analyzovány na Western biotech specifickými protilátkami.
Obr. 4 ukazuje celkovou váhu myší transplantovaných leukémií P388D1, které byly intraperitoneálně ošetřeny vybraným inhibitorem CDK.
Obr. 5 ukazuje analýzu přežití myší transplantovaných leukémií P388D1, které byly ošetřeny intraperitoneálně vybraným inhibitorem CDK.
Obr. 6 ukazuje celkovou váhu myší transplantovaných lidským plicním adenokarcinomem A549, které byly ošetřeny intraperitoneálně vybraným inhibitorem CDK.
Obr. 7 ukazuje analýzu nádorového objemu myší transplantovaných lidským plicním adenokarcinomem A549, které byly ošetřeny intraperitoneálně vybraným inhibitorem CDK. Obr. 8 ukazuje infekci buněčných linií MCF-7 (wild typ p53) a T47D (mutant p53) SV40. Exprese virálního proteinu - Velký T-antigen. p53 transkripční aktivita je reprezentována p21WAFl transaktivací.
Obr. 9 ukazuje inhibici exprese z extrachromosomálního plasmidu pomocí PCIs. Exprese βgalaktosidasy z transientně transfekovaného plasmidu pCMV-lacZ v buněčných liniích MCF-7 (wild typ p53) a T47D (mutantní p53).
Obr. 10 ukazuje inhibici exprese z virálního promotoru inkorporovaného do buněčného genomu. Indukce SV40 velkého T-antigenu a p53 transkripční aktivity (p21WAF1 transaktivace). CV-1 a MCF-7 jsou kontrolní buněčné linie (žádná exprese velkého T antigenu).
Obr. 11 ukazuje inhibici transkripce z virálního promotoru pomocí PCI závislé na lokalizaci promotoru. Inhibice exprese β-galactosidasy z plasmidu pHIV-lacZ transientně transfekované do H1299-TAT buněčné linie a stimulace exprese β-galaktosidasy z plasmidu pHIV-lacZ inkorporované do buněčného genomu (buněčná linie H1299-HIV) po ošetření PCI. Buněčná linie H1299 transientně transfekovaná plasmidem pHIV-lacZ byla použita jako negativní kontrola. Tato buněčná linie neprodukuje β-galaktosidasu, a to z důvodu virálního proteinu TAT, který je exprimován z plasmidu pCEP4-Tat stabilně transfekovaného do buněčných linií H1299-TAT a H1299-HIV.
Obr. 12A ukazuje fosforylaci CTD RNA polymerasy II v buněčné linii s inkorporovaným SV40. Fosforylace obou serinů, tedy šeřinu 2 a šeřinu 5 je inhibována 12 hodinovém ošetření roskovitinem a sloučeninou 105 ve všech testovaných buněčných liniích.
Obr.l2B ukazuje porovnání fosforylace CTD RNA polymerase II v buněčné linii s inkorporovaným (H1299-HIV) nebo transientně transfekovaným (H1299-TAT) plasmidem HIV-lacZ. Fosforylace ser 2 a ser 5 v obou buněčných liniích je inhibována po PCI po 12 h.
Obr. 13 ukazuje inhibici replikace HAd4. Multistupňová růstová křivka HAd4 v přítomnosti 10 μΜ sloučeniny 105, 100 μΜ Cidofoviru (CID) nebo obou (OCII+CID). Časový bod Oh představuje virové inokulum. A. Celkový výnos viru z kultury (buněčně asociovaný + extracelulámí). B. Extracelulámí virus.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady slouží k objasnění vynálezu, aniž by omezovaly jeho rozsah.
Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 2,6-chlorpurin, dostupný z komerčních zdrojů (Sigma, Aldrich, Fluka, atd.). Body tání byly stanoveny na Kofflerově bloku a nejsou korigovány. Na měření bodu tání byl použit přístroj BÚCHI Melting Point B-540 Apparatus. Elementární analýzy (C,H,N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo Finnigan). Odpařování bylo prováděno na rotační vakuové odparce při teplotách nižších než 80 °C. NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance AV 300 při teplotě 300 K a frekvenci 300,13 MHz (’H), respektive 75,48 MHz (13C). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-dň. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard. El hmotnostní spektra byla měřena pomocí Polaris Q (Finnigan) hmotnostního spektrometru vybaveného sondou pro přímý vstup vzorku (DIP) (70 eV, teplotní gradient 40 - 450 °C, interval m/z 50 - 1000 amu za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy (70 eV. 200 °C, direct inlet). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 - 1500 amu. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 1/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data system. Merck silica gel Kieselgel 60 (230-400 mesh) byl použit pro kolonovou chromatografii. Všechny připravené látky poskytovaly uspokojivé výsledky elementární analýzy (± 0,4 %). Analytická tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silica gel 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHC13:MEOH:konc.NH4OH (8:2:0,2, v/v/v).
Výchozí 9-alkyl-2,6-dichlorpuriny byly připraveny za použití postupů popsaných v literatuře: 9-methyl-2,6-dichlorpurin
1) Parker et al. Phytochemistry 25, 1986: 303 - 310
2) Brik et al. Bioorg. Med. Chem. 13, 2005: 4622 - 4626; 9-ethyl-2,6-dichlorpurin
Pitts et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 14, 2004: 2955 - 2958 9-isopropyl-2,6-dichlorpurin
1) Rypka et al. Xenobiotica 32,2002:1017 - 1032
2) Lu et al. J. Org. Chem. 72, 2007: 5012-5015
9-benzyl-2,6-dichlorpurin
1) Kelley et al. J. Med. Chem. 31; 1988: 2001 -2004
2) Naito et al. Chem. Pharm. Bul. 30, 1982: 2011 - 2019
3) Dalby etal. Angew. Chem. German 105, 1993: 1822 - 1823
4) Brik et al. Bioorg. Med. Chem. 13, 2005; 4622 - 4626
5) Weterings et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 16,2006: 3258 - 3261
6) Toyota et al. Synth. Commun. 23, 1993: 1295 - 1305
7) Gundersenet al. Tetrahedron Let. 36, 1995: 1945 - 1948
8) Lu et al. J. Organ. Chem. 72, 2007: 5012 - 5015
9-cyklopropyl-2,6-dichlorpurin
2,6-Dichlorpurin (1 mmol), práškový uhličitan draselný (4 mmol) a cyklopropyljodid (5 mmol) byly prudce míchány v 5 mL DMSO pres noc. Po odpaření rozpouštědel byl produkt extrahován do směsi voda/diethyléter) a následně přečištěn pomocí kolonové chromatografie (silikagel/1% MeOH v chloroformu). Rekrystalizace z diethyléteru poskytla produkt ve výtěžku 35 %, s bodem tání 121-124 °C.
9-cyklopentyl-2,6-dichlorpurin
1) Shum et al. Nucleos. Nucleot. 20, 2001:1067 - 1078
2) Drezér et al. J. Med. Chem. 44,2001: 524 - 530
9-cyklohexyl-2,6-dichlorpurin
2,6- Dichlorpurin (1 mmol), práškový uhličitan draselný (4 mmol) a cyclohexyljodid (5 mmol) byly prudce míchány v 5 mL DMSO přes noc. Po odpaření rozpouštědel byl produkt extrahován do směsi voda/diethyléter) a následně přečištěn pomocí kolonové chromatografie (silicagel/1% MeOH v chloroformu). Rekrystalizace z diethyléteru poskytla produkt ve výtěžku 41 %, s bodem tání 116-121 °C.
Příklad 1
Příprava prekurzoru 9-alkyl-6-[(2-amino-Rn-benzyl)amino]-2-chlorpurinu
9-Alkyl-2,6-dichlorpurin (2 mmol), 2-aminobenzylamin (2.5 mmol) a triethylamin (0,4 mL) byly zahřívány v 5 mL 1-butanolu (110 °C, 1,5 h). Produkt vykrystaloval z reakční směsi v průběhu zahřívání, případně po ochlazení na 4 °C. Produkt byl zfittrován a promyt 1butanolem. Pouze 9-(pent-3-yl)-2-chloro-6-[(2-amino-Rn-benzyI)amino]puriny byly izolovány pomocí kolonové chromatografie (silikagel, CHCh/MeOH; 99/1). Produkty byly rekrystalizovány ze směsi CHCL-EtiO.
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2<hlor-9-methylpurin: Výtěžek 91%; bt 202-210”C; 'HNMR(300.13 MHz, CDC13, 303K): 4.459(2H, br s), 4.746(2H, br s), 3.650(3H, s), 6.446(1 H, brs), 6.673(1H, dd, >1.2,7.9), 6.717(1H, mt), 7.10(lH,mt), 7.15(1H, dd, >7.7,1.2), 7.682(1H, s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-ethylpurin: Výtěžek 90%; bt 190-198°C; ]HNMR(300.13 MHz, CDCI3, 303K): 1.552(3H, t, >6.8), 4.150(2H, q, >6.8), 4.459(2H, brs), 4.746(2H, br s), 6.446(1H, br s), 6.673(1H, dd, >1.2, >7.9), 6.717(1H, mt), 7.10(1H, mt), 7.15(1H, dd, >7.7,1.2), 7.682(1H, s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-isopropylpunn: Výtěžek 93%; bt 190-192°C; 'HNMR(300.13 MHz, CDC13, 303K): 1.560(6H, d, >6.8), 4.459(2H, br s), 4.746(2H, br s), 4.792(1H, sept, >6.8), 6.446(1H, br s), 6.673(lH,dd, >1.2, >7.9), 6.717(1H, mt), 7.1O(1H, mt), 7.15(1 H, dd, >7.7, 1.2), 7.682(1H, s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-cydopropylpurin: Výtěžek 88%; bt 204-220°C; 'HNMR(300.13 MHz, CDCI3, 303K): 1.68 (4H, mt), 3.61 (1H, mt), 4.22 (2H, br s), 5.90 (2H, br s), 6.61 (2H, mt), 6.75 (1H, d, >7.7), 7.0 (1H, t, 7.7), 7.90 (1H, br s), 7.84 (1H, s). 6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-(pent-3-yl)purin: Výtěžek 90%; mp 172-183°C; 'HNMR(300.13 MHz, CDCI3, 303K): 1.05 (6H, t, >3.4), 1.75 (2H, mt), 1.87 (2H, mt), 4.11 (1H, m), 4.22 (2H, br s), 5.90 (2H, br s), 6.61 (2H, mt), 6,75 (1H, d, >7.7), 7.00 (1H, t, >7.7), 7.91 (1H, brs), 8.89(1H, s).
6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-cyclopentylpurín: Výtěžek 89%; bt 164-176°C; ’HNMR(300.13 MHz, CDC13, 303K): Yield 93%; mp 190-192°C; ’H-NMR(300.13 MHz, CDC13) 3O3K): 1.80-1,90(2H, mt), 1.93-2.10(4H, mt), 2.25-2.40(2H, mt), 4.459(2H, br s), 4.746(2H, br s), 4.99(1 H, pent, >7.0), 6.446(1H, br s), 6.673(1H, dd, >1.2, >7.9), 6.717(1H, mt), 7.1O(1H, mt), 7.15(1 H, dd, J=7.7,1.2), 7.682(1H, s).
6-[(2<umnobenzyl)amino]-2-chlor-9-cyclohexylpurin: Výtěžek 89%; bt 165-174°C; 'HNMR(300.13 MHz, CDC13,3O3K): 1.29 (2H, mt), 1.49 (2H, mt), 1,73 (2H, mt), 1.91 (2H, mt), 2.06 (2H, mt), 4.22 (2H, br s), 5.38 (1H, mt), 5,93 (2H, br s), 6.62 (2H, mt), 6.74 (1H, d, >7.7), 7.02 (1H, t, >7.7), 7.91 (1H, br s), 8.52 (1H, s) 6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-benzylpurin: Výtěžek 94%; bt 200-211°C; *HNMR(300.13 MHz, CDC13, 303K): 4.21 (2H, br s), 5.91 (2H, br s), 6.60 (2H, m), 6.74 (1H, d, >7.7), 7.02 (4H, mt), 7.14 (2H, dd, >7.5,1.2), 7.90 (1H, br s), 8.49 (1H, s) 6-[(2-aminobenzyl)amino]-2-chlor-9-cyclopentylpurin: Výtěžek 89%; bt 164-176°C; 'HNMR(300.13 MHz, CDCI3,303K): Výtěžek 93%; mp 190-192°C; lH-NMR(300.13 MHz, CDCI3, 3O3K): 1.80-1.90(2H, mt), 1.93-2.10(4H, mt), 2.25-2.40(2H, mt), 4.459(2H, br s),
4.746(2H, br s), 4.99(1H, pent, >7.0), 6.446(1 H, br s), 6.673(1H, dd, >1.2, >7.9), 6.717(1H, mt), 7.1O(1H, mt), 7.15(1H, dd, >7.7, 1.2), 7.682(1H, s).
Příklad 2
Příprava 2-alkylamino-9-alkyl-6-[(2-amino-Rn-benzyl)amino]purinů 6-[(2-amino-Rn-benzyl)amino]-2-chlor-9-alkylpurin (1 mmol), odpovídající amin (3 mmol) a diisopropylethylamin (2 mmol) byly zahřívány (teplota a reakční doba je specifikována pro každou níže uvedenou látku) v N-methylpyrolidonu (5 mL, zatavená ampule). Reakční směs byla pak vytřepána do směsi voda:CHCb (1:1, v/v). Kolonová chromatografie (silikagel, chloroform/methanol) následě poskytla čistý produkt.
N-6-(2-aminobenzyl)-N-2-heptyl-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin
Reakční podmínky: 155°C, 2h. Kapalinová chromatografie 1% MeOH v CHCh; krystalizace z abs. Et2O; bt 65-72°C. lH-NMR, δ ppm: 0.90(3H, t, >6.8, C25H), 1.31(4H, m, C20’21H), 1.38(2H, m, C22H), 1.54(6H, d, >6.8, C1718H), 1.64(2H, m, C24H), 2.39(2H, t, >8.2, C23H), 3.44(2H, q, >6.8, C19H), 4.65(1H, sep, >6.8, C16H), 4.70(2H, bs, NnH), 4.78(2H, d, >5.9, C9H), 5.40(lH, bs, N2H), 6.34(1H, bs, N6H), 6.65(1H, dd, >7.7, 1.1, C12H), 6.71(1H, tt, >7.7, 1.3, CI4H), 7.10(lH, tt, >7.7, 1.5, CI3H), 7.14(1 H, dd, >7.7, 1.3, C15H), 7.44(1H, s, C8H). í3C-NMR, δ ppm: 14.74(C25), 23.18(06,17), 23.30(C24), 27.71(C22), 29.78(C21), 30.43(023), 32.47(020), 42.61(09), 42.81(C9), 47.27(016), 114.48(C5), 116.52(02), 118.76(04), 123.11(00), 129.75(03), 131.21(05), 135.63(08), 146.24(01), 151.07(04), 154.58(C6), 158.69(02).
(RS)-l-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purin-2-yl}ammo)propan-2-ol Reakční podmínky: 155°C, 2h. Kapalinová chromatografie 1.5% MeOH v CHCh; rekrystalizace z abs. CHCb; bt 175-179°C. !N-NMR, óppm: 1,26(3H, d, >6.4, C21H), 1.55(6H, d, >6.8, Ci7’18H), 3.41(1H, m, C19Ha), 3.55(1H, m, C19Hb), 4.07(lH, quiqui, >6.8, 2.6, C20H), 4.6O(1H, bs, O20H), 4.64(1H, sep, >6.8, C16H), 4.68(2H, bs, NhH), 4.79(2H, bs, C9H), 6.O8(1H, bs, N2H), 6.6O(1H, bs, N6H), 6.68(1H, dd, >7.8, 1.1, C12H), 6.74(1H, tt, >7.5, 1.1, C14H), 7.12(1H, tt, >7.7, 1.5, C13H), 7.18(1H, dd, >7.7, 1.3, C15H), 7.53(1H, s, C8H). I3C-NMR, δ ppm: 21.54(021), 23.16(017,18), 43.09(09), 47.70(016), 50.57(019), 69.17(20), 114.42(05), 117.00(012), 119.29(014), 122.76(00), 129.93(013), 131.16(05), 136.02(08), 145.79(01), 150.20(04), 154.06(06), 158.68(02).
(R)-l-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purin-2-yl}amino)proparl·-2-ol Reakční podmínky: 155°C, 2h. Kapalinová chromatografie 1.5% MeOH v CHCb; rekrystalizace z abs. CHCh; bt 169-175°C. !N-NMR, Óppm: 1.26(3H, d, >6.7, C21H), 1.55(6H, d, >6.8, C1718H),
3.41(1H, m, Cl9Ha), 3.55(1H, m, Cl9Hb), 4.07(lH, quiqui, >6.8, 2.6, C20H), 4.6O(1H, bs, O20H), 4.64(1H, sep, >6.8, C16H), 4.68(2H, bs, ΝηΗ), 4.79(2H, bs, C9H), 6.08(lH, bs, N2H), 6.60(lH, bs, N6H), 6.68(1H, dd, >7.8, 1.1, CI2H), 6.74(1H, tt, >7.5, 1.1, C14H), 7.12(1H, tt, >7.7, 1.5, C13H), 7.18(1H, dd, >7.7, 1.3, CI5H), 7.53(1H, s, C8H). I3C-NMR, δ ppm: 21.54(021), 23.16(07,18), 43.09(C9), 47.70(016), 50.57(09), 69.17(20), 114.42(05), 117.00(02), 119.29(04), 122.76(010), 129.93(03), 131.16(05), 136.02(08), 145.79(01), 150.20(04), 154.06(06), 158.68(02).
(RS)-2-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purm-2-yl}amino)butan-l-ol Reakční podmínky: 160°C, 6h. Kapalinová chromatografíe 1.5% MeOH v CHCh; rekrystalizace z abs. CHClj/ abs. Et2O; bt 152-156°C. 'H-NMR, δ ppm: 1.04(3H, t, >7.3, C22H), 1.53(6H, d, >6.8, C17J8H), 1.63(2H, m, C2IH), 3.66(1 H, m, C20Ha), 3.83(1H, dd, >11.0, 2.6, C20Hb), 3.96(1H, qui, >6.8, C19H), 4.58(2H, bs, NnH), 4.58(1 H, bs, O20H), 4.59(1H, sep, >6.8, C16H), 4.73(2H, bs, C9H), 5.33(1H, bs, N2H), 6.47(1H, bs, N6H), 6.65(1H, dd, >7.6, 1.1, C12H), 6.71(1H, tt, >7,7, 1.3, CI4H), 7,1O(1H, tt, >7.7, 1.5, CI3H), 7.14(1H, dd, >7.7, 1.3, CI5H), 7.44(1H, s, C8H). 13C-NMR, óppm: 11.55(022), 23.12(07), 23,18(08), 25.57(021), 42.72(C9), 47.40(06), 56.88(09), 68.22(020), 114.91(05), 116.62(02), 118.90(04), 123.04(00), 129.76(03), 131.15(05), 135.66(08), 146.09(01), 150.59(04), 154.87(06), 159.54(02).
(R)-2-({6-[(2-aminobemyl)amino]-94sopropyl-9-H-purin-2-yl}amino)butan-l-ol Reakční podmínky: 160°C, 6h. Kapalinová chromatografíe 1.5% MeOH v CHCh; rekrystalizace z abs. CHC13/ abs. Et2O; bt 149-151°C. 'H-NMR, δ ppm: 1.04(3H, t, >7.3, C22H), 1.53(6H, d, >6.8, C'7’18H), 1.62(2H, m, C21H), 3.66(1H, m, C20Ha), 3.83(1H, dd, >11.0, 2.6, C20Hb), 3.96(1H, qui, >6.8, C19H), 4.56(2H, bs, NhH), 4.58(1H, bs, O20H), 4.59(1H, sep, J=6.8, C16H), 4.73(2H, bs, C9H), 5.33(1H, bs, N2H), 6.46(1H, bs, N6H), 6.65(1H, dd, >7.7, 1.1, C12H), 6.71(1H, tt, J=7.7, 1.3, C14H), 7.10(1H, tt, J=7.7, 1.5, C13H), 7.14(1H, dd, >7.7, 1.3, CI5H), 7.44(1H, s, C8H). I3C-NMR, bppm: 11.55(022), 23.12(07), 23.18(018), 25.57(021), 42.72(09), 47.40(016), 56.88(019), 68.22(020), 114.91(05), 116.62(02), 118.90(04), 123.04(010), 129.76(013), 131.15(05), 135.66(08), 146.09(011), 150.59(04), 154.87(06), 159.54(02).
(E/Z)-N-2-(2-aminocyclohexyl)-N-6-(2<iminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin Reakční podmínky: 160°C, 4h. Kapalinová chromatografíe postupně 1, 2, 3, 4, 5 % MeOH v CHCh, 0,1% koncentrovaného NH4OH.; amorfní látka. !H-NMR, δ ppm: 1.27(3H, m, C22H, C24Ha), 1.51(6H, d, >6.8, C17’18H), 1.70(3H, m, C23H, C2lHb), 2.08(lH, d, >10.8, C24Hb), 2.16(1H, d, >10.0, C2’Hb), 3.7O(1H, m, C20H), 4.27(1H, m, C19H), 4.64(1H, sep, >6.8,
C16H), 4.72(2H, bs, C9H), 4.76(2H, bs, NhH), 4.82(2H, bs, N20H), 5.13(1H, bs, N2H), 6.17(1H, bs, N6H), 6.65(1H, dd, J 7.7, 1.1, C12H), 6.68(1 H, tt, >7.7, 1.3, C14H), 7.06(lH, tt, >7.7, 1.5, C13H), 7.15(1H, dd, >7.7, 1.5, C15H), 7.48(1H, s, C8H). I3C-NMR, δ ppm: 22.74(022), 23.33(017,18), 25.42(C24), 29.72(021), 33.39(023), 42.40(C9), 46.94(016), 52.11(019), 57.14(020), 115.33(05), 116.56(014), 118.76(014), 123.67(010), 129.47(03), 130.99(05), 135.51(08), 145.09(01), 151.62(04), 155.40(06), 159.96(02). (Z)-N-2-(2-aminocyclohexyl)-N-6-(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin Reakční podmínky: 160°C, 4h. Kapalinová chromatografie postupně 1, 2, 3, 4, 5 % MeOH v CHCI3, 0,1% koncentrovaného NH40H.; amorfní látka, ‘H-NMR. δ ppm: 1,27(3H, m, C22H, C24Ha), 1.51(6H, d, >6.7, CI7J8H), 1 70(3H, m, C23H, C21Hb), 2.08(lH, d, >10.6, C24Hb), 2.16(1H, d, >10.1, C21Hb), 3.7O(1H, m, C20H), 4.27(1H, m, C19H), 4.64(1H, sep, >6.8, CI6H), 4.72(2H, bs, C9H), 4.76(2H, bs, NnH), 4.83(2H, bs, N20H), 5.13(1H, bs, N2H), 6.17(1H, bs, N6H), 6.65(1H, dd, >7.7, 1.1, CI2H), 6.68(1H, tt, >7.7, 1.3, C14H), 7.06(lH, tt, >7.7,1.5, CI3H), 7.15(1H, dd, >7.7, 1.5, CI5H), 7.48(1 H, s, C8H).
(E)-N-2-(2-aminocyclohexyl)-N-6-(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin
Reakční podmínky: 160°C, 4h. Kapalinová chromatografie postupně 1, 2, 3,4, 5 % MeOH v CHCI3, 0,1% koncentrovaného NH40H.; amorfní látka. 1 H-NMR, δ ppm: 1.27(3H, m, C22H, C24Ha), 1.51(6H, d, >6.8, C171SH), 1.70(3H, m, C23H, C21Hb), 2.08(lH, d, >10.7, C24Hb), 2.16(1H, d, >10.2, C21Hb), 3.7O(1H, m, C20H), 4.27(1H, m, C19H), 4.64(1H, sep, >6.8, C16H), 4.72(2H, bs, C9H), 4.76(2H, bs, ΝΠΗ), 4.83(2H, bs, N2DH), 5.13(1H, bs, N2H), 6.17(1H, bs, N6H), 6.65(1H, dd, >7.7,1.1, C12H), 6.68(1H, tt, >7.7, 1.3, C14H), 7.06(lH, tt, >7.7, 1.5, C13H), 7.15(1H, dd, >7.7,1.5, C15H), 7.48(1H. s, C8H).
(E)-N-2-(4-aminocyclohexyl)-N-6-(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamin
Reakční podmínky: 160°C, 4h. Kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie postupně 1, 2, 3, 4, 5 % MeOH v CHCI3, 0,1% koncentrovaného NH4OH.; amorfní látka. !HNMR, δ ppm: 0.85(2H, m, C21’23^), 1.27(2H, m, C2l>23Hbb), 1.54(6H, d, >6.8, C17'18H), 2.08(2H, d, >11.0, C20’24Haa), 2.22(2H, d, >11.0, C20’24Hbb), 3.7O(1H, m, Cl9H), 3.84(1H, m, C22H), 4.64(1H, sep, >6.8, C16H), 4.68(2H, bs, NUH), 4.71(2H, s, C9H), 4.72(2H, bs, N22H), 5.85(1H, bs, N2H), 6.3O(1H, bs, N6H), 6.67(1H, dd, >7.7, 1.1, C12H), 6.71(1H, tt, >7.7, 1.3, CI4H), 7.1O(1H, tt, >7.7, 1.5, C13H), 7.15(1H, dd, >7.7, 1.3, C15H), 7.48(1H, s, C8H). I3CNMR, Ó ppm: 23.31(016,17), 30.41(020.24), 33.84(021,23), 42.35(09), 46.93(016), 51.02(022), 64.36(019), 115.10(05), 116.41(012), 118.76(014), 123.63(010), 129.62(013), 131.15(015), 135.31(08), 146.21(011), 151.85(04), 155.48(06), 159.43(02).
N-2-(4-methoxybenzyl)-N-6-(2-aminobenzyl)-9-isopropyl-9H-purin-2,6-diamm Reakční podmínky: 160°C, Ih. Kapalinová chromatografie postupně 1, 2, % MeOH v CHCE; rekrystalizace z abs. Et2O; bt 90-112°C. ’H-NMR, δ ppm- 1.53(6H, d, >6.8, C17J8H), 3.81(3H, s, C25H), 4.61(2H, d, >5.7, NnH), 4.65(1H, sep, >6.8, C16H), 4.74(2H, d, >5.9, C9H), 5.54(1H, bs, N2H), 6.31 (1H, t, >7.1, N6H), 6.62(1H, dd, >7.7, 1.5, C,2H), 6.69(1H, tt, >7.7, 1.5, CI4H), 6.88(2H, dd, >8.6, 2.0, C20’24H), 7.09(lH, tt, >7.7, 1.5, CI3H), 7.11(1H, dd, >7.7, 1.5, C15H), 7.33(2H, dd, >8.4, 1.7, C21'23H), 7.42(1H, s, CSH). 13C-NMR, δ ppm: 23.18(07,18), 42.62(09), 47.24(016), 55.98(025), 114.56(020,24), 114.93(05), 116.41(012), 118.64(014), 123.22(00), 129.54(C21,23), 129.68(013), 131.20(05), 132.62(09), 135.64(08), 146.27(01), 151.25(04), 154.93(06), 158.96(02), 159.43(022). (E)-4-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9-H-purin-2-yl}amino)cyclohexanol Reakční podmínky: 160°C, 20h. Kapalinová chromatografie 1.5% MeOH v CHC13; amorfní látka. 'HNMR, δ ppm: 0.85(2H, m, 021>23Ηά 1.39(2H, m, C21’23Hbb), 1.56(6H, d, >6.8, CI718H), 2.04(2H, m, C20'24Haa), 2.17(2H, m, C20’24Hbb), 3.7O(1H, m, C19H), 3.8O(1H, bs, O22H), 3.85(1H, m, C22H), 4.65(2H, bs, NH), 4.66(1H, sep, >6.8, C16H), 4.82(2H, bs, C9H), 5.76(1H, bs, N2H), 6.56(1H, bs, N6H), 6.67(1H, dd, >7.9, 1.1, C12H), 6.73(1H, tt, >7.5, 1.1, C14H), 7.12(1H, tt, >7.7, 1.5, Cl3H), 7.17(1H, dd, >7.7, 1.5, CI5H), 7.5O(1H, s, C8H). 13CNMR, δ ppm: 23.20(017,18), 31.22(021,23), 34.54(020,24), 43.24(09), 47.65(016), 50.42(022), 70.48(019), 114.12(05), 116.77(012), 119.06(014), 122.64(00), 129.92(03), 131.09(015), 136.00(08), 146.09(01), 151.49(04), 156.63(06), 158.82(02).
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURJNOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)ANALÝZA
C2 C6 C9 [%] [M-Η]' a) [M+H]+ b)
1 2-aminocyklohexylammo (2-aminobenzyl)amino methyl 62.3/7.1/30.6 365.5 367.5
2 4-amÍnocyklohexylamino (2-aminobenzyl)aminc methyl 62.3/7.1/30.6 365.5 367.5
3 4-hydroxycyklohexylamino (2-aminobcnzyl)aminc methyl 62.1/6.9/26.7 366.5 368.5
4 2-hydroxypropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 58,7/6.5/29.9 326,3 328.3
5 (I -hydroxymethyljpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 59.8/6.8/28.7 340.4 342.4
6 heptylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 65.4/7.9/26.7 366.5 368.5
7 (1 -hydroxymethy 1-2melhyljpropylamino (2-aminobenzyl)amina methyl 60.8/7.1/27.6 354.4 356.4
8 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 59.8/6.8/28.7 340.4 342.4
9 2-hydroxy-l ,2-dimethylpropylamino (2-amínobenzyl)aniino methyl 60.8/7.1/27.6 354,4 356.5
10 3-hydroxy-3-methylbutyl amino (2-aminobenzyl)amino methyl 60.8/7.1/27.6 354.4 356.5
11 3-hydroxy-1.3-dimethy 1butylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
12 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
13 2-hydroxy-1 -ethyl -2methylpropylamino (2-aminobcnzyl)amino methyl 61 8/7.4/26.5 368 5 370.5
14 2-hydroxy-1 -ethylpropyl amino (2-aminobenzyl)amino methyl 608/7.1/27.6 354.4 356.4
15 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino methyl 56 9/6 3/27 9 399 9 401.9
16 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino methyl 56.9/6.3/27.9 399.9 401.9
17 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino methyl 54 3/5.9/26.1 374.8 376.8
18 (l-hydroxymethyl-2methyljpropylamino (2-amino-5-chlorabenzyl)amino methyl 55.4/6.2/25.1 388.9 390.9
19 3-hydroxy-1 ,3-dimethylbutylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino methyl 56 5/6 5/24 3 402,9 404.9
20 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino methyl 55.4/6.2/25.1 388.9 390.9
21 2-aminocyklohexylamino (2-antino-5-fluorobenzyl)amino methyl 59.4/6.6/29.1 383.4 385.4
22 4-am inocyklohexylamino (2-amino-5-fluoro benzyl)amino methyl 59.4/6.6/29.1 383.4 385.4
23 (1-hydroxy methyl)propylamino (2-amino-5 -fluoro benzyi)amino methyl 56.8/6.2/27.3 358.4 360.4
24 2-aminocyklohexylamino (2-amino-3-chlorobenzyl)amino methyl 56.9/6.3/27.9 399.9 401.9
25 4-aminocykIohexytamino (2-amino-3-cliloro benzyl )amino methyl 56.9/6.3/27.9 399.9 401.9
26 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2-amino-3-chlorobenzyl)amino methyl 55.4/6.2/25.1 388.9 390.9
27 2-aminocyklohexylamino (2-amino-3-mcthylbenzyl)amino methyl 63.1/7.4/29 4 379.5 381.5
28 4-aminocyklohcxylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino methyl 63.1/7.4/29.4 379.5 381.5
29 2-hydroxypropylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino methyl 59.8/6.8/28.7 340.4 342.4
30 2-hydroxy-l-ethyI-2· methylpropylammo (2-amino-4-methy lbenzyl)amino methyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
31 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-methyIbenzyl)amino methyl 63.1/7.4/29.4 379.5 381.5
32 (1 -hydroxymcthyl)propylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino methyl 60.8/7.1/27.6 354.4 356.4
33 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-amino-5-methylbenzy!)amino methyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
34 2-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyl)amino methyl 59.8/7.1/33.0 380.5 382.5
35 4-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyl)amino methyl 59.8/7.1/33.0 380.5 382.5
36 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,3 -d i am inobenzyl)am ino methyl 57.3/6.8/31.4 355.4 357.4
37 (1 -hydroxymethyl-2methyl)prcpylamino (2,3-diaminobenzyl)amino methyl 58.4/7.1/30.2 369.4 371.4
38 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2,3-diaminobenzyl)amino methyl 58.4/7.1/30.2 369.4 371.4
39 2-aminocyklohexylamino (2,4-diaminobenzyl)amino methyl 59.8/7.1/33.0 380.5 382.5
40 (l-hydroxymethyl)propyl amino (2,4-diaminobenzyl)amino methyl 57.3/6.831.4 355.4 357.4
41 (l-hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2,4-diaminobenzyl)amino methyl 58.4/7.1/30.2 369.4 371.4
42 2-aminocyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino methyl 59.8/7.1/33.0 380.5 382 5
43 4-hydroxycyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino methyl 59.7/6.8/29.3 381.5 383 5
44 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2,5-diaminobenzyl)amino methyl 57.3/6.8/31.4 355.4 357 4
45 2-ammocyklohexy lamino (2-amino-3-tnethoxybenzyl)amino methyl 60.6/7.1/28.3 395.5 397 5
46 4-aminocyklohexylamino (2-arnino-3-methoxybenzyl)amino methyl 60.6/7.1/28,3 395.5 397.5
47 2-hydroxypropyl amino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino methyl 57.1/6.5/27.4 356.4 3584
48 (1-hydro xymethyljpropy lamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino methyl 58.2/6.8/26.4 370.4 372 4
50 2-aminocyklohexylamino (2-amino-4-methoxybenzyl)amino methyl 60.6/7 1/28 3 395.5 397 5
51 4‘hydr0xycyklohexylamíno (2-amino-4-methoxybenzyl)amino methyl 60.4/6.9/24.7 396.5 398.5
52 (1 -hydroxymethy 1 )pro py 1 amino (2-amino4-Tnethoxybenzyl)amino methyl 58.2/6.8/26.4 370.4 372.4
53 (1 -hydroxymcthyl-2methyl)propylamino (2-amino-4-mcthoxybenzyl)amino methyl 59.2/7.1/25.4 384.5 386.5
54 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2-amino^-methoxybenzyl)aniino methyl 59.2/7.1/25.4 384.5 386.5
55 2-am inocy k 1 oh exy 1 am in o (2-amino-5-methoxybenzyl)amino methyl 60 6/7.1/28.2 395.5 397.5
56 4-hydroxycyklohexylamino (2-amino-5-methoxybenzyl)aniino methyl 604/6.8/24.6 396.5 398.5
57 (1 -hydroxymetliyljpropylamino (2-amino-5-methoxybenzyl lamino methyl 58.2/6.8/26.4 370.4 372.4
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Tabulka 2: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD> ANALÝZA
C2 C6 C9 [%] [M-Η]' a) [M+H]+ b)
58 2-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 63.1/7.4/29.4 379.5 381.5
59 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)aminc ethyl 63.1/7.4/29.4 379.5 381.5
60 4*hydroxycyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 63.0/7.1/25.7 380.5 382.5
61 2-hydroxypropyl amino (2-aminobenzyl)amino ethyl 59.8/6.8/28.7 340.4 342.4
62 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 60.8/7.1/27.6 354.4 356,4
63 heptylamino (2-aminobenzyl )amino ethyl 66.1/8.2/25 7 380.5 382.5
64 (1 -hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 61.8/7.4/26 5 368.5 370.5
65 2-hydroxy-2-methylpropyl amino (2-aminobenzyl)amino ethyl 60.8/7.1/27.6 354.5 356.5
66 2-hydroxy-1,2dimethylpropylamino (2-aminobcnzyl)amino ethyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
67 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 61.8/7.4/265 368.5 370 5
68 3-hydroxy-l,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)aminc ethyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
69 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyI)aminc ethyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
70 2-hydroxy-l -ethyl-2methylpropylamino (2-aminobenzyl)aminc ethyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
71 2-hydroxy-l -ethylpropylamino (2-aminobcnzyl)amino ethyl 61.7/7.4/26.5 368.5 370 5
72 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chIorobenzyl)amino ethyl 57.9/6.5/27.0 413.9 415.9
73 4-aminocyklohexyl amino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino ethyl 57.9/6.5/27.0 413 9 4159
74 2-hydroxypropyl amino (2-amino-5-chlorobenzyI)amino ethyl 54.3/5.9/26.1 374.8 376.8
75 (1-hydroxy me thyl)propylamino (2-amino-5-čhlorobenzyl)amino ethyl 55.4/6.2/25.1 388 9 390.9
76 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-fluoro benzyljammo ethyl 60.3/6.8/28.1 397.5 399.5
77 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-fluorobenzyl)amiiio ethyl 57.9/6 5/26.2 372.4 374.4
78 2-am inocy klohexy 1 am i ne (2-amino-3-chlorobenzy! )amino ethyl 57.9/6.6/27.0 413.9 415.9
79 4-aminocyklohexylamine (2-amino-3-chloro benzyl)amino ethyl 57.9/6.6/27.0 413 9 415.9
90 2-hydroxy-l-ethyl propyl amino (2-amino-3-chlorobenzyl lamino ethyl 56.5/6.5/24.3 402.9 404.9
81 2-aminoeyklohexylamitio (2-amino-3-methylbenzyl)amino ethyl 63.9/7.6/28.4 393.5 395.5
82 4-aminocyklohexylaniino (2-amino-3-methylbenzyl)amino ethyl 63.9/7.6/28.4 393.5 395.5
83 2-hydroxy-l -ethyl-2methylprcpylamino (2-amino-4-methylbenzyl)amino ethyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
84 2-aminocyklohexylamino (2-amino-4-methylbenzyl)amino ethyl 63.9/7.6/28.4 393 5 395.5
85 4-aminocyklohexylamino (2-am íno-5-methylbenzyl )amino ethyl 63.9/7.6/28.4 393.5 395.5
86 (1-hydroxy methy1)propylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino ethyl 61.8/7.4/26,5 368 5 370.5
87 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino ethyl 62.6/7.6/25.6 382 5 384.5
88 4-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyl)amino ethyl 60.7/7.4/31.9 394.5 396.5
89 (1 -hydroxymethyl jpropylam ino (2,3-diaminobenzyl)amino ethyl 58.4/7.1/302 369.5 371.5
90 2-aminocyklohexylamino (2,4-diaminobenzy[)amino ethyl 60.7/7.4/31 9 394.5 396.5
91 (1 -hydroxymethy l)propylaminn (2,4-diarmnobenzyl)amino eíhyl 58.4/7.1/302 369.5 371.5
92 2-aminocyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino ethyl 60.7/7.4/31 9 394.5 396.5
93 4-hydroxycykiohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino ethyl 60.6/7.1/28 3 395 5 397.5
94 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,5-diaminobenzyl)amino ethyl 58.4/7.1/30.2 369.5 371.5
95 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino ethyl 61.4/7.4/273 409.5 411.5
96 2-hydroxypropyl amino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino ethyl 58,2/6,8/26,4 370.4 372.4
97 2-aminocyklohexylamino (2-amino-4-methoxybenzyl)amino ethyl 61.4/7.4/27.3 409.5 411.5
98 (l-hydroxymethyl)propylamitio (2-amino-4-methoxybenzyl)amino ethyl 59.2/7.1/25.4 384.5 386.5
99 4-hydroxycyklohexylamino (2-amino-5-methoxybenzyl)amino ethyl 61.3/7.1/23.8 410.5 412.5
100 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-methoxybenzyl)amino ethyl 59.2/7.1/25.4 384.5 386.5
a) roztok: MeOH p a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Tabulka 3: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)ANALÝZA
C2 C6 C9 [%] [M-Hf a) [M+H]+ b)
101 2-aminocyclohexy lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 63.9/7.7/28.4 393.5 395.5
102 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 63.9/7.7/28.4 393.5 395.5
103 4-hydroxycyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 63.8/7.4/24.8 394.5 396.5
104 2-hydroxypropylamino (2-aminobenzyl)atnino isopropyl 60.8/7.1/27.6 354.4 356.4
105 (1 -hydroxymethyl)propy lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
106 heptylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 66.8/8.4/24.8 394.5 396.5
107 (1-hydroxy inethyl-2methyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
108 2-hydroxy-2-melhylpropyl amino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
109 2-hydroxy-l,2dimethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 62,6/7.6/25.6 382.5 384.5
110 3-hydroxy-3-methylbuty lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 62.6/7.6/25.6 382 5 384 5
111 3-hydroxy-l,3dimethyl butylamino (2-aminobcnzy 1 )am ino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398.5
112 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396 5 3985
113 2-hydroxy-l-ethyl-2methylpropylamino (2-atninobenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398.5
114 2-hydrůxy-l-ethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384 5
115 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-ch lorobenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398.5
116 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chloro benzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396’ 398.5
117 2-hydroxypropylamino (2-amino-5-chloro benzyljamino isopropyl 55.5/6.2/25.1 388.9 3909
118 (1 -hydroxy methyljpropylamino (2-amino-5-chloro benzyi)amino isopropyl 56.5/6.5/24.3 402.9 404.9
119 (1 -hydroxy me thy 1-2mcthyljpropylamino (2-amino-5-chloro benzyi)amino isopropyl 57 5/6.8/23.5 416.9 4189
120 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-amino-5-chloro benzyljamino isopropyl 565/6.5/24.3 402.9 404.9
121 2-hydroxy-1,2dimcthylpropyl amino (2-amino-5-ehloro benzyljamino isopropyl 57.5/6.8/23.5 416.9 418.9
122 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-amino-5-chloro bcnzyl jamino isopropyl 57.5/6.8/23.5 416.9 418 9
123 4-hydroxy4-methylpent-2yllamino (2-amino-5-chloro benzyljamino isopropyl 58.4/7.0/22.7 431.0 433.0
124 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2-amino-5-chloro benzyljamino isopropyl 57.5/6.8/23.5 4169 418.9
125 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-fluorobenzyi)amino isopropyl 61.1/7.1/27.2 411.5 413.5
126 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-fluoro benzyljamino isopropyl 61.1/7.1/27.2 411 5 413.5
127 2-hydroxypropyl amino (2-amino-5-fluoro benzyljamino isopropyl 57.9/6.5/26.2 372.4 374.4
128 (1 -hydro xy methyljpropylamino (2-amino-5-fluorobenzyl)amino isopropyl 58.9/6.8/25.3 386.5 388.5
129 2-hydroxy-1 -ethyl -2methylprcpylamino (2-amino-5-íluorobenzyl)amino isopropyl 60.7/7.3/23.6 414.5 416.5
130 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2-amino-5-fluorobenzyi)amino isopropyl 59.8/7.0/24.4 400.5 402.5
131 2-aminocyklohexylamino (2-amino-3-chlorobenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398.5
132 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-chloro benzyljamino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398.5
133 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-3-chlorobenzyl)amino isopropyl 56.5/6 5/243 402.9 404.9
134 (1 -hy droxy methyl-2methyljpropylamino (2-amino-3-chlorobcnzyl)amino isopropyl 57.5/6.8/23.5 416.9 418.9
135 2-hydroxy-2-methy!propyl amino (2-amino-3-chlorobenzy!)amino isopropyl 56.5/6.5/24 3 402.9 404.9
136 2-hydroxy-l -ethylpropylamino (2-amino-3-chlorobenzyl)amino isopropyl 57.5/6.8/23 5 416.9 418.9
137 2-aminocyklohei^,lamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino isopropyl 64.7/7.9/27.4 407.5 409.5
138 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino isopropyl 64.7/7.9/27.4 407.5 4095
139 2-hydroxypropylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino isopropyl 61.7/7.4/26.5 368.5 370.5
140 (1-hydro xymethyljpropy lamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino isopropyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
141 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398 5
142 2-hydrůxy-l-cthyl-2methylpropylamino (2-amino-4-methylbenzyl)aniino isopropyl 64.2/8.1/23.8 410.5 412.5
143 2-hydroxy-l -ethylpropylamino (2-amino-4-methylbenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24,6 396.5 398 5
144 2-aminocyklohexylamino (2-amino-4-methylbenzyljamino isopropyl 64.7/7.9/27.4 407.5 409.5
145 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino isopropyl 64.7/7.9/274 407.5 409.5
146 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-mcthylbenzyl)amino isopropyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
147 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398 5
148 2-hydroxy- l-ethyl-2methylpropyl amino (2-amino-5-methylbenzyl)amino isopropyl 64.2/8.1/23.8 410.5 412.5
149 2-hydroxy-l-ethylpropylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino isopropyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398.5
150 2-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyljamino isopropyl 61.6/7.6/30.8 408.5 410.5
151 4-aminocyklohexylamino (2,3-diammobenzyl)amino isopropyl 61.6/7.6/30.8 408.5 410.5
152 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,3-diaminobcnzyl)amino isopropyl 59.3/7.3/29.1 383.5 385.5
153 (l-hydroxymethyl-2mcthyljpropylamino (2,3-diaminobenzyl)amino isopropyl 60.3/7.6/28.1 397.5 399.5
154 3-hydroxy-l,3dimethylbutylamino (2,3-diaminobenzyl)amino isopropyl 61 1/7 8/27 1 411.5 413.5
155 2-hydroxy-l-ethyl-2methylpropylamino (2,3-diaminobenzy!)amino isopropyl 61 1/7.8/27.1 411.5 413 5
156 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2,3-diaminobenzyl)amino isopropyl 60 3/7.6/28.1 397.5 399 5
157 2-aminocyklohexylamino (2.4-diaminobenzyl)amino isopropyl 61.6/7.6/30.8 408.5 410.5
158 (1 -hydroxy me thyl)propylamino (2,4-diaminobenzyl)amino isopropyl 59.3/7.3/29.1 383.5 385.5
159 (l-hydroxymethyl-2methyljpropylamino (2,4-diaminobenzyl)amino isopropyl 60.3/7.6/28.1 397 5 399.5
160 2-aminocyklohexy lamino (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 61.6/7.6/30.8 408 5 410.5
161 4-hydroxycyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 61.4/7.4/27.3 409.5 411.5
162 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 59.3/7.3/29.1 383.5 385.5
163 (1 -hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 60.3/7.6/28.1 397.5 399.5
164 2-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino isopropyl 62.2/7.6/26 4 423.5 425.5
165 4-aminocyklohexylamino (2-aniino-3-methoxybcnzyl)amino isopropyl 62.2/7.6/264 423.5 425.5
166 2-hydroxypropylamino (2-amino-3-methoxylbenzyl)amino isopropyl 59.2/7.1/25 4 384,5 386.5
167 (1 -hydroxymethyl)propy lamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino isopropyl 60.1/7.3/24.5 398.5 400.5
168 (1 -hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino isopropyl 61.0/7.6/23,7 412,5 414.5
169 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino isopropyl 60.1/7.3/24.5 398.5 400.5
170 2-hydroxy-l,2dimethylpropylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino isopropyl 61.0/7.6/23.7 412.5 414.5
171 3-hydroxy-3-merhylbutylamino (2-arnino-3-methoxy benzyl)amino isopropyl 61 0/7 6/23.7 412 5 414.5
172 3-hydroxy-l,3dimethylbutylaniino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino isopropyl 61.8/7.8/22.9 426.5 428.5
173 2-hydroxy-1-ethylpropylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino isopropyl 61.0/7.6/23.7 412.5 414.5
174 2-aminocyklohexylamino (2-amino-4-methoxybenzyl)amino isopropyl 62.2/7.6/26.4 423.5 425.5
175 4-hydroxycyklohexylamino (2-amino-4-methoxybenzyl)amino isopropyl 62.1/7.3/23.0 424.5 4265
176 (1 -hydroxymethybpropylamino (2-amino-4-methoxyben^l)amino isopropyl 60.1/7.3/24.5 398.5 400.5
177 (l-hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2-amino-4-methoxybenzyl)amino isopropyl 61.0/7.6/23.7 412.5 414.5
178 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-amino-4-methoxybcnzyl)amino isopropyl 60.1/7.3/24.5 398.5 400.5
179 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-methoxybenzyl)amino isopropyl 62.2/7.6/26.4 423.5 425.5
180 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-methoxybenzyl)amino isopropyl 60.1/7.3/24,5 398.5 400.5
181 (1 -hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2-amino-5-mcthoxybenzyl)amino isopropyl 61.0/7.6/23,7 412 5 414.5
182 (I -hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-mercaptobenzyl)amino isopropyl 60.1/7.3/24.5 398.5 400.5
183 (1 -hydroxymethyl)propy lamino (2-aminO‘5-nitrobenzyl)aniino isopropyl 60.1/7.3/24.5 398 5 400.5
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Tabulka 4: Látky připravené způsobem podle přikladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)ANALÝZA
C2 C6 C9 [%] [M-H]’ a) [M+H]+ b)
184 4-aminocyklohexyIamino (2-aminobenzyi)amino propyl 63 9/7 7/28.4 393.5 395.5
185 4-hydroxycyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino průpyl 63.8/7.4/24.8 394.5 396.5
186 2-hydroxy propyl amino (2-aminobenzyl)amino propyl 60.8/7.1/27.6 354.4 356.4
187 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyt)amino propyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
188 heptylamino (2-aminobenzyl)amino propyl 66.8/8.4/24.8 394.5 396.5
189 (l-hydroxymethyl-2methyl)propy lamino (2-aminobenzyl)amino propyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
190 2-hydroxy-2-methyl propyl amino (2-aminobenzyl)amino propyl 61.8/7.4/26.5 368.5 370.5
191 2-hydroxy-1,2dimethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino propyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
192 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-aminobenzyl)amino propyl 62.6/7.6/25.6 382.5 384.5
193 3-hydroxy-l,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino propyl 63.4/7.9/24.6 396.5 398.5
a) roztok; MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Tabulka 5: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)ANALÝZA
C2 C6 C9 [%] [M-H]’ a) [M+H]+ b)
194 2-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 66.3/7.9/258 433.6 435.6
195 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl') amino cyklohexyl 66.3/7.9/258 433.6 435.6
196 4-hydroxycyklohexylamino (2-aminobcnzyl)amino cyklohexyl 66.2/7.6/22 5 434.6 436.6
197 2-hydroxypropylamino (2’aminobenzyl)amino cyklohexyl 63.8/7.4/248 394 5 396.5
198 (1 -hydro xymethyl)propy lamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 64.5/7.6/23 9 408.5 410.5
199 heptylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 68.9/8.6/225 434.6 436.6
200 (l-hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 65.2/7.8/23.1 422.6 424.6
201 2-hydroxy-2-methylpropyl amino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 64.5/7.6/23.9 408.5 410.5
202 2-hydroxy-1,2dimethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 65.2/7.8/23.1 422.6 424,6
203 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 65.2/7.8/23.1 422.6 424.6
204 3-hydroxy-l,3dimethylbutyl amino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 65.9/8.1/22.4 436.6 438.6
205 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 65.9/8.1/22.4 436.6 438.6
206 2-hydroxy-l -ethyl-2methylpropylamino (2-aminobenzyl)anino cyklohexyl 65.9/8.1/22.4 436 6 4386
207 2-hydroxy-l-ethylpropyl amino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 65.2/7.8/23.1 422,6 424.6
208 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chloro benzyljamino cyklohexyl 61.5/7.1/23.9 468.0 470.0
209 (1 -hydroxymethyljpropylamino (2-amino-5-chloro benzyljamino cyklohexyl 59.5/6.8/22.1 443.0 445 0
110 (1 -hydroxymethy 1-2methyllpropylamino (2-amino-5-chloro benzyljamino cyklohexyl 60.3/7.0/21.4 457.0 459.0
211 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-fluorobenzyd)amino cyklohexyl 63.7/7.3/24.8 451.6 453 6
212 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-íluoro benzyljamino cyklohexyl 63.7/7.3/24.8 451.6 453.6
213 (1 -hydroxymethyljpropylamino (2-amino-5-fluorobenzy1)amino cyklohexyl 61.8/7.1/22.9 426.5 428 5
214 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-chlorobenzyl)amino cyklohexyl 61.5/7.1/23.9 468.0 470.0
215 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino Cyklohexyl 669/8 1/25.0 447.6 449.6
216 2-hydrexy-l-ethyl-2methylpropylammo (2-amino-4-mcthylbenzyl)amino cyklohexyl 66 5/8.3/21.7 450.6 452.6
217 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino cyklohexyl 669/8.1/25.0 447.6 449.6
218 (l-hydroxymeihyl)propy lamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino cyklohexyl 65.2/7.8/23.1 422.6 424.6
219 3-hydroxy-3 -methyl butyl ammo (2-amino-5-methylbenzyl}amino cyklohexyl 65 9/8.1/22.4 436.6 438.6
220 2-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyl)amino cyklohexyl 64 1/7.8/28.0 448.6 450.6
221 4-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyl)amino cyklohexyl 64 1/7,8/28.0 448.6 450.6
222 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,4-diaminobenzyl)amino cyklohexyl 62.2/7.6/26.4 423 5 425.5
223 (l-hydroxymcthyl-2methyljpropy lamino (2,4-diaminobenzyl)amino cyklohexyl 63.0/7.8/25.5 437.6 439.6
224 2-aminocyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino cyklohexyl 64.1/7.8/28.0 448 6 450.6
225 2-hydroxypropyl amino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino cyklohexyl 62.1/7.3/23.0 424.5 426.5
226 (1-hydro xy methyl Jpropyl amino (2-amino-3-methoxy benzyljamino cyklohexyl 62.8/7.6/22.3 438.6 440.6
227 2-hydroxy-l -ethylpropyl amino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino cyklohexyl 63.5/7.8/21.6 452.6 454.6
228 2-aminocyklohcxylamino (2-amino-4-mcthoxybenzyl)amino cyklohexyl 64.6/7.8/24.1 463.6 465.6
229 (1 -hydroxy methyl Jpropyl amino (2-amino-5-methoxybenzylJamino cyklohexyl 62.8/7.6/22.3 438.6 440.6
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Tabulka 6: Látky připravené způsobem podle příkladu 2
No PURINOVÝ SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)ANALÝZA
C2 C6 C9 [%] [M-Η]' a) [M+H]+ b)
230 2-aminocyklohexylamino (2-aminobenzy])amino benzyl 67.8/6.8/25.3 441.6 443.6
231 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzylJamino benzyl 67.8/6.8/25 3 441 6 443.6
232 4-hydroxycyklohexylamino (2-aminobcnzyl)amino benzyl 67.7/6.6/22.1 442.6 444,6
233 2-hydroxypropylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 65.5/6.2/24.3 402.5 404.5
234 (1-hydroxymethyljpropylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 66.2/6.5/23.5 416.5 418.5
235 heptylamino (2-aminobenzyl Jamino benzyl 70.4/7.5/22.1 442.6 444.6
236 (1-hydroxymethy 1-2methyljpropylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 66.8/6 8/22 7 430.5 432.5
237 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 66.2/6.5/23.5 416.5 418.5
238 2-hydroxy-l,2dimethylpropylamino (2-aminobcnzylJamino benzyl 66.8/6.8/22 7 430.5 432.5
239 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-aminobcnzyl)amino benzyl 66.8/6 8/22 7 430.5 432.5
240 3-hydroxy-1,3dímethylbuty lamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 67.4/7.0/22.0 444.6 446.6
241 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 67.4/7.0/22.0 444.6 4466
242 2-hydroxy-l-ethyl-2methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 67.4/7.0/22.0 444.6 446.6
243 2-hydroxy-l -ethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 66.8/6.8/22 7 430.5 432.5
244 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)ammo benzyl 62.9/6.1/23.5 476.0 478.0
245 4-aminocykIohe^lamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino benzyl 62.9/6.1/23 5 476.0 478,0
24« 2-hydroxypropylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino benzyl 60.3/5.5/22.4 436.9 438,9
247 (1 -hydro xymethyl)propylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino benzyl 61.1/5.8/217 451.0 453.0
248 (1 -hydroxymethyl-2methyl)propylamíno (2-amino-5-chlorobenzyl)amino benzyl 61.9/6.1/210 465.0 467.0
249 3-hydroxy-l,3* dimethylbutyiamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino benzyl 62.6/6.3/204 479.0 481.0
250 2-hydroxy-l -ethylpropylamino (2-amino-5-chlorobcnzyl)amino benzyl 61.9/6.1/21.0 465.0 467.0
251 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-fluorobenzyi)amino benzyl 65.2/6.3/24.3 459.6 461.6
252 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-fluoro benzyOamino benzyl 65.2/6.3/24.3 459.6 461.6
253 (l-hydroxymeLhyl)propylamino (2-amino-5-fluorobenzyl)amino benzyl 63.4/6.0/22 5 434.5 436.5
254 2-aminocyklohexylammo (2-amino-3-chlorobenzyl)amino benzyl 62.9/6.1/23.5 476.0 478.0
255 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-chloro benzyljamino benzyl 62.9/6.1/23.5 476.0 478.0
256 2-hydroxy-l-ethylpropylamino (2-amino-3-chlorobenzyl)amino benzyl 61.9/6.1/21.0 465.0 467.0
257 2-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino benzyl 68.4/7.1/24.5 455.6 457.6
258 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino benzyl 68.4/7.1/24.5 455.6 457.6
259 2-hydroxy-l -ethyl-2methylpropylamino (2-amino-4-methylbenzyl)amino benzyl 67,9/7.2/21.3 458.6 460.6
260 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino benzyl 68.4/7.1/24.5 455.6 457.6
261 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-methylbenzyl)amino benzyl 68.4/7.1/24.5 455.6 457.6
262 (1 -hydroxymethyl)propyl amino (2-amino-5-methylbenzyl)amino benzyl 66.8/6.8/22.7 430.5 432 5
263 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2’aminO’5’rnethylbcnzyl)aniino benzyl 67.4/7.0/22.0 444,6 446.6
264 2-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyl)amino benzyl 65.6/6.8/27.5 456.6 458.6
265 4-aminocyklohexylamino (2,3-diaminobenzyl)amino benzyl 65.6/6.8/27.5 456.6 458.6
266 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,3-diaminobenzyl)amino benzyl 63,9/6.5/25.9 431.5 433.5
267 (l-hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2,3-diaminobcnzyl)amino benzyl 64,5/6,8/25.1 445.6 447.6
268 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2,3-diaminobenzyl)amino benzyl 64.5/6.8/25.1 445.6 447.6
269 2-aminocyklohexylamino (2,4-diaminobenzyl)amino benzyl 65.6/6.8/27.5 456.6 458.6
270 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,4-diaminobenzyl)amino benzyl 63.9/6.5/25.9 431.5 433.5
271 (1 -hydroxymethyl-2methyl)propylamino (2?4-diaminobenzyl)amino benzyl 64,5/6,8/25,1 445.6 447.6
272 2-aminocyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino benzyl 65.6/6.8/27.5 456.6 458.6
273 4-hydroxycyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino benzyl 65.5/6.6/24.4 457.6 4596
274 (l-hydroxymethyl)propylamino (2,5-diaminobenzyl)amino benzyl 63.9/6.5/25.9 431.5 433.5
275 2-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)aniino benzyl 66.1/6.8/23.7 471.6 473.6
276 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino benzyl 66.1/6.8/23.7 471.6 473.6
277 (1-hydro xymethyl)propy lamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino benzyl 64.4/6.5/21.9 446.5 448.5
278 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2-amino-3-niethoxybenzyl)amino benzyl 65.1/6.8/21,2 460.6 462.6
279 2-aminocyklohexylamino (2-amino-4-methoxybenzyl)amino benzyl 66.1/6.8/23.7 471 6 473.6
280 4-hydroxycyklohcxylamino (2-amino4-methoxybcnzyl)amino benzyl 65 9/6.6/20 7 472.6 474.6
281 (1 -hydroxymethyl Jpropylamino (2-amino-4-methoxy benzyl)amino benzyl 64.4/6.5/2! 9 446.5 448.5
282 (1-hydroxymethyl^· methyl Jpropylamino (2-amino-4-methoxybenzyl)amino benzyl 65 7/6.7/20 6 474.6 476.6
283 2-hydroxy-1 -ethylpropyl amino (2-amino-4-methoxybcnzyl)amino benzyl 65.7/6.7/20 6 474.6 476.6
284 2-aminocyklohexylamino (2-amino-5-methoxybenzyl)amino benzyl 66.1/6.8/23.7 471.6 473.6
285 2-hydroxypropyl amino (2-amino-5-methoxybenzyl)amino benzyl 63 7/6.3/22.6 432.5 434.5
286 4-hydroxycyklohcxylamino (2-amino-5-rnethoxybenzy|)amino benzyl 65 9/6 6/20 7 472.6 474.6
287 (1 -hydroxymethyl)propyl amino (2-amino-5-methoxybcnzyl)amino benzyl 64.4/6.5/21.9 446.5 448 5
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 3
CDK inhibiční testy
Vybrané sloučeniny byly testovány na CDKl/cyklin B, CDK2/cyklin E a CDK9/cyklin T inhibiční aktivitu s cílem zjistit základní vztahy mezi jejich strukturou a inhibiční aktivitou. CDK/cyklin komplexy byly produkovány v Sf9 hmyzích buňkách koinfikovaných příslušným bakulovirovým konstruktem. Buňky byly sebrány 70 h po infekci do lyzačního pufru (50 mM Tris 7,4 pH, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 20 mM NaF, 1% Tween 20, proteasové inhibitory) po dobu 30 min na ledu a rozpustná frakce byla získána centrifugací při 14.000g po dobu 10 min. Proteinový extrakt byl do doby použití skladován při -80 °C. Závěrečný testovací systém pro měření kinasové activity byl použit v souvislosti s experimenty s určením kinetiky s lineárními parametry. Testovací směs obsahovala 1 mg/ml histonu (Sigma Type III-S), 15 μΜ ATP, 0,2 pCi [γ-32Ρ] ATP a testované sloučeniny ve finálním objemu 20 μΐ, vše v reakčním pufru: 50 mM Hepes 7,4 pH, 10 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 10 mM 2-glycerolfosfátu, 1 mM NaF, 1 mM DTT a proteasové inhibitory. Po 10 min byla inkubace zastavena přidáním SDS pufru a proteiny byly separovány pomocí 12,5% SDS-PAGE. Měření kinasové inhibice bylo prováděno na digitálním imaging analyzem BAS 1800. Kinasová aktivita byla vyjádřena jako procento maximální aktivity a hodnota IC5o byla vypočtena pomocí grafické analýzy. Kinasová aktivita je vyjádřena jako procento maximální aktivity a příslušná inhibiční konstanta byla stanovena grafickou analýzou z křivek závislosti odpovědi na dávce.
Tabulka 7: Kinasová inhibiční aktivita vybraných nových sloučenin
r· PURINOVÝ SUBSTITUENT IC50 (μΜ)
C2 C6 C9 CDKI CDK2 CDK9
oc 2-hydroxyethylamino benzyiamino methyl 7 4 5
RO (1-hydroxy me thyl)propylamino benzylamino isopropyl 2.7 0.84 0.72
1 2-aminocyklohexylamino (2-ammobenzyl)amino methyl 1.1 0,8 0.05
2 4-aminocyklohcxylaniino (2-aminobenzyl)amino methyl 0.7 0.4 0.01
S (1-hydroxy me thyljpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 0,09 0.03 0004
7 (1 -hydroxymethyl-2methyllpropylamino (2-aminobenzyl)amir»j methyl 0.04 0.01 0.001
8 2-hydroxy-2-niethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 0.04 0.02 0.001
9 2-hydroxy-l,2dímethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 0.05 0.03 0.002
12 3-hydroxy-2,3dimelhylbutylamino (2-aminobenzyl)amtno methyl 0.6 0.3 0.06
13 2-hydroxy-l-ethyl-2methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 0.2 0.07 0.09
46 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino methyl 0.5 0.3 0.05
59 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 0.6 0.2 0.04
62 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 0.07 0.01 0.0007
64 (1-hydroxy methyl-2methyDpropyl amino (2-aminobenzyl)amino ethyl 003 0.01 0.0009
101 2-aminocyklohexylammo (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.6 0.4 0,02
102 4-aminocyklohexylam ino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.1 0.08 0.004
103 4-hydroxyeyklohexyl amino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.2 0.15 0.003
104 2-hydroxypropylamino (2-aminobcnzyl)amino isopropyl 0.09 0.03 0.006
105 (1 -hydroxymethyl (propyl amino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.09 0.03 0.005
106 heptylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 95 3.3 0.2
107 (1 -hydroxymethyl-2methyl)propyl amino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.05 0.04 0.002
108 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-aminobenzyI)amino isopropyl 0.02 0.008 0.0004
109 2-hydroxy-l,2dimethylpropy lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.03 0.01 0.0009
110 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.9 0.3 0.03
111 3-hydroxy-l,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.8 0.4 0.06
112 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.5 0,3 0.07
113 2-hydroxy- l -ethyl-2methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.09 0.03 0.002
114 2-hydroxy-l-cthylpropylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 0.05 0.01 0.0008
116 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chlorobcnzyl)amino isopropyl 0.08 0.04 0.005
118 (1-hydroxymethyljpropylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino isopropyl 0.08 0.01 0.002
128 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-fluorobenzyl)amino isopropyl 0.07 0.008 0.0009
138 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methylbenzyl)amino isopropyl 01 007 0.0006
161 4-aminocyklohexylamino (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 09 0.6 0.08
166 2-hydroxypropyl amino (2-aniino-3-metllOKylbenzy])arninQ isopropyl 0.4 0.1 0.002
182 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-methoxylbenzylJamino isopropyl 0.2 0.1 0.001
184 4- aminocyklohexy lamino (2-aminůbenzyl Jamino propyl 0.4 0,2 0.0009
187 O-hydroxymethyl Jpmpylatnino (2-aminobenzyl)amino propyl 0.2 0.1 0.0007
195 4-aminoeyklohexy lamino (2-aminobcnzyl|amino cyclohexyl 0.6 0.3 0.05
198 (1 -hydroxymethy IJpropylamino (2-aminobenzyl Jamino cyclohexyl 0.4 0.1 0.03
209 (1 -hydroxymethyl Jpropylamino (2-amino-5 -chlorobenzyl Jamino cyclohexyl 0.5 0.3 0.04
226 2-hydroxy propylamino (2-amino-3-methoxylbenzyl)amino cyclohexyl 0.7 0.3 0.02
231 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 0.8 0.5 0.05
234 (1-hydroxymethyl Jpropylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 0.7 0.4 0.03
247 (1 -hydroxymethyl Jpropylamino (2-amino-5-chlorobenzyl Jamino benzyl 0.8 0.6 0.07
226 4-aminocyklohexylaniino (2-amino-3-metht>xylbenzyl)amino benzyl 1.2 0.7 0.06
OC: olomoucin + RO: roskovitin = sloučeniny známé z dosavadní techniky.
Tabulka 7 ukazuje výsledky inhibiční aktivity nových sloučenin vůči CDK9 v porovnání s CDK1 a CDK2 a daty prototypových sloučenin (trisubstitutované puriny olomoucin a roskovitin). Většina derivátů vykázala zvýšenou inhibiční aktivitu v in vitro kinasových testech. Modifikace benzenového kruhu amino skupinou v or/ůo-poloze vedla k nárůstu CDK9 inhibiční aktivity testovaných sloučenin a proto mohou být tyto látky považovány za specifické inhibitory CDK9.
Příklad 4
In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů
Používali jsme následující buněčné linie: Lidská T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, promyelocytámí HL-60 a monocytámí U937 leukemie, buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, buňky cervikálního karcinomu HELA, myší fibroblasty NIH3T3, lidská erythroleukemie K562, buňky G361 lidského maligního melanomu byly použity pro rutinní screening sloučenin. Buňky byly udržovány v Nunc/Corning 80 cm2 plastikových lahvích a pěstovány v mediu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5g/l glukózy, 2mM glutaminu, 100 U/ml penicilínu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný), sloučeniny byly připraveny podle postupu podle předloženého vynálezu.
Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (104 buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), pipetovalo se 80 μΐ buněčné suspenze na 96-jamkové mikrotitrační destičky. Inokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C v atmosféře CO2. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20 μΐ alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny ředily do šesti koncentrací v čtyřnásobné ředící řadě. Při rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v dubletu. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100 % vlhkosti a v atmosféře CO2. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomoci Labsystem FIA readeru Fluoroskan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (The tumor cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: Gl5o=(FDjamka s derivátem /FDkontroini jamka) x 100 %. Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.
Cytotoxicita nových sloučenin byla testována na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogenetického a druhového původu (Tab. 8). Vyšší aktivity byly nalezeny u všech testovaných nádorových buněčných linií oproti kontrolním (normální buňky). Významně vyšší účinnost nových derivátů byla nalezena u buněčných linií nesoucích různé mutace nebo delece v proteinech zapojených do regulace buněčného cyklu, např HL-60, CEM, K-562, HeLa, HOS, a G-361. To naznačuje, že tyto látky by mohly být adekvátně účinné pro nádory s různými alteracemi nádorových supresorových genů, např. p53, Rb, atd.
Tabulka 8: Cytotoxicita nových sloučenin pro různé nádorové buňky
Látka č. IC30(rM) HeLa
MCF7 K-562 HOS G361 CEM HL60 HeLa BJ
oc 132 >167 142 161 62 123 108 >167
RO 14 52 24 22 14 35 22 >167
1 13 46 22 22 15 31 18 >167
2 10 36 20 14 9 22 12 >167
5 2 6 4 3 3 8 2 >167
7 15 5 0.8 12 09 2.4 1.0 >167
8 18 3.4 1.1 1.7 0.6 2.8 1.3 >167
9 4.3 5.6 1.7 2.3 2,5 4.2 1.7 >167
12 12 38 23 14 16 35 20 >167
13 8 18 12 9 7 26 14 >167
46 13 27 19 13 13 28 18 >167
59 14 31 17 15 10 29 20 >167
62 18 5.4 3.2 2.5 2.4 6.7 1.6 >167
64 13 4.5 0.9 1.0 0.7 2.1 1.2 >167
101 153 27 25 14 7 24 15 >167
102 5 5 20 44 17 9 32 16 >167
103 10 1 29.8 63 33 14 36 18 >167
104 15.4 26 31 19 17 29 15 >167
105 3.4 12.8 11 8 4.5 6.7 2.5 >167
106 25.4 26.3 30 33 15 27 18 >167
107 5.9 15 4 22 11.5 4.3 18 6.5 >167
108 1.2 3.0 10 1.9 0,5 2.2 1.0 >167
109 2.8 4.6 1.2 1.8 1.2 3.4 0.7 >167
110 12 30 15 17 19 35 21 >167
111 14 35 17 16 22 38 24 >167
112 10 32 20 12 16 31 16 >167
113 6 14 10 6 6 21 9 >167
114 11 28 19 15 17 34 17 >167
116 4.5 14 23 10 6.7 22 8.7 >167
118 1.8 8.4 7.6 6 3.2 5.4 1.6 >167
128 2.9 10.2 10.8 12 6.2 8.5 3.2 >167
138 3.8 9.5 25 13 8.7 23 9.2 >167
161 7 18 26 14 9 26 12 >167
166 17 24 32 17 13 31 16 >167
182 3.1 21 11 15 7.3 18 4.2 >167
184 8 24 32 19 11 35 17 >167
187 4.3 16 12 9 7.6 8.3 4.5 >167
195 12 38 22 14 11 24 13 >167
198 9 22 16 11 10 26 14 >167
209 11 25 18 14 12 31 14 >167
226 14 36 16 12 21 33 21 >167
231 15 37 23 15 12 32 16 >167
234 11 25 17 18 16 33 18 >167
247 14 41 22 21 15 34 19 >167
226 16 39 19 20 13 31 21 >167
Příklad 5
Inhibice CDK9 a RNA polymerasy II
Imunobloting. Buňky byly oděleny s pomoci gumového kusu a promyty 3-krát ledově chladným PBS a lyžovány v pufru (50 mM Tris, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM NajVO4, 1% Nonidet P40) obsahujícím směs proteasových a fosfatasových inhibitorů (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA). 20 pg celkových proteinů bylo separováno pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE) v 8% nebo 10% gelu a přeneseny na nitrocelulozóvou membránu. Membrány byly blokovány v 5% mléku a 0.1% Tweenu 20 v PBS a inkubovány přes noc se specifickými monoklonálními protilátkami nebo králičími polyklonálními séry. Primární protilátky specifické pro RNA polymerasu II (od Santa Cruz Biotechnology, California, USA) zahrnovaly: (i) N-20 použita v ředění 1 μg/ml, (ii) Hl4, specifická pro formu fosforylovanou na fosfoserinu 5, ředění 6 pg/ml and (iii) H5, specifická pro formu fosforylovanou na fosfoserinu 2, ředění 4 pg/ml. Další použité primární mAb v imunblotech zahrnují (iv) anti-p53 (DO-1, vlastní) použita v ředění 1 pg/ml, (v) anti-p21WAFI (118, vlastní),) použita v ředění 1 pg/ml), (vi) anti-actin (A-2066, Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA)) použita v ředění 1 pg/ml, (vii) anti-T-antigen (419, in vlastní), použita v ředění 1 μg/ml. Všechny primární protilátky byly naředěny v PBS obsahujícím 5% práškové mléko; 0.1% Tween 20. Peroxidassou konjugovaná králičí antimyšší imunoglobulin nebo prasečí anti-králíčí antiséra (DAKO, Glostrup, Denmark) byly použity jako sekundární protilátky a vizualizovány ECL reagenciemi (Amersham-Pharmacia, Little Chalfont, UK).
Fosforylace C-terminální domény RNA polymerasy II. Modulace exprese z HIV promotoru po ošetření CDKI může být zprostředkováno transkripční regulací. U C-konce velké podjednotky RNA Pol II se nachází důležitá regulační doména, která se nazývá CTD (Cterminální doména). Studovali jsme proto účinek nových CDKI na fosforylaci CTD na šeřinu 2 a šeřinu 5. Hladiny fosforylace setinu 2 a šeřinu 5 v buňkách ošetřených COS-1, CV-1 a MCF-7 sloučeninou 105 byly značně redukovány při všech testovacích podmínkách (Obr. 2). Ačkoliv byly funkce CDK a RNA polymerasy II suprimovány, jejich exprese z inkorporovaných vitálních promotorů byla zvýšená. Tato pozorování podporují tvrzení, že mechanismy působení těchto CDKI na expresi z HIV promotoru souvisí s transkripční kontrolou a vykazují rozdílné efekty v závoslosti na tom, jestli byl targetovaný promotor udržován jako extrachromozomální element nebo integrován do buněčného genomu.
Příklad 6
Indukce nádorového supresoru p53 v nádorových buňkách
Buněčné kultury a ošetření. Buněčné linie odvozené z lidského cervikálního karcinomu (HeLa), lidského karcinomu prsu (MCF-7, BT549 a BR474), lidského osteosarkomu (HOS), lidského karcinomu tlustého střeva (HT29), myších fibroblastů (T221acZ) a lidského melanomu (Am8) byly kultivovány v Dulbecco Modified Eagle Mediu (DMEM) doplněném 10% fetálním bovinním sérem. Testované sloučeniny byly přidány z 50mM zásobního roztoku v dimethylsulfoxidu (DMSO) do kultivačního média ve finální koncentraci 20 μΜ. Kontrolní buňky dostaly pouze ekvivaletní objem DMSO.
Analýza p53-dependentni transkripční aktivity, β-galaktosidasová aktivita v lidské melanomové buněčné linii Am8 a buněčné linii myších fibroblastů T221acZ (obě stabilně trasfekované p53-responsivním reportérovým konstruktem pRGCAfosIacZ) (Frebung et al.,
Cancer Res., 52, 1992-6976) byla stanovena. Pro stanovení celkové β-galaktosidasové aktivity byly buňky lyžovány 3 cykly zmrazení-tání v 0,25 M Tris pH 7,5 a lyzáty byly testovány jak popsáno Sambrookem et al. (Mol.Cloning, New York, 1989). Výsledky jsou uvedeny v Tab. 9.
Protilátky (a) Monoklonální protilátky DO-1, DO-2 a 1801 rozpoznávají N-terminální oblast proteinu p53, monoklonální protilátky DO-11 a DO-12 rozpoznávají rozdílné epitopy v hlavní doméně p53 proteinu, monoklonální protilátky Bp53-10 a Pab421 rozpoznávají Cterminální oblast p53 proteinu.
(b) Monoklonální protilátka 118 rozpoznává p21WAFI.
Polyakrylamidová gelová elektroforéza a imunobloting. Pro přímý imunobloting byly připraveny celkové lyzáty buněčných proteinů sesbíráním proteinů do horkého Laemmli elektroforetického vzorkovacího pufru. Proteiny byly poté rozděleny SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGE) na 10% gelu a přeneseny na nitrocelulózovou membránu do Bio.Rad Mini Trans-Blott Electrophoretic Transfer Cell na 2 h při 4°C a 150 mA v transferovém pufru (240 mM Tris, 190 mM glycin a 20% methanol). Označené markéry molekulární hmotnosti (Bio-Rad) běžely pararelně. Blotované membrány byly zablokovány v 5% mléku a 0.1% Tweenu 20 v PBS po dobu 2 h a inkubovány přes noc s monoklonálními protilátkami. Po 3-násobném promytí v PBS plus 0.1% Tweenu 20, bylo jako sekundární protilátka použito peroxidasou konjugované králičí anti-myší imunoglobulinové antiserum (Dako, Denmark) naředěné 1:1000, K vizualizaci peroxidasové aktivity byly použity ECL reagencie od AMERSHAM podle návodu výrobce.
Transfekční experimenty. Buněčná linie MCF7-DDp53 byla odvozena z parentální buněčné linie MCF-7 stabilní trasfekcí plasmidem pCMVneonDDp53 kódující dominantně negativní zkrácený myší p53 protein obsahující aminokyselinová residua 1-14 a 302-390 pod kontrolou CMV promotoru. Kontrolní buněčná linie MCF-7neo byla odvozena po transfekci buněk MCF-7 pCMVneo vektorem. Transfekce byly prováděny poomocí Effectene transfection reagent (QIAGEN, Germany) podle doporučení dodavatele. Stabilní transfektanty byly selektovány při koncentraci 2 mg/ml G418 sulfátu (Life Technologies). Exprese Ddp53 miniproteinu v MCF-7Ddp53 byla prověřena omočí imunoblotingu s Bp53-10 monoklonální protilátkou. Nezávislé izolované MCF-7Dp53 klony 9, 12 a 14 exprimující vysoké hladiny Ddp53 miniprotein a MCF-7-neo klonů 3,4 a 7 byly dále používány.
Sloučenina 105 indukuje wild typ, ale ne mutantní p53 protein. Za prvé jsme stanovili příslušnou koncentraci sloučenin 103 a 105 pro naše experimenty. Buňky MCF-7 (wt p53) byly ošetřeny po dobu 12 h vzrůstajícími koncentracemi 105 v rozsahu od 1 do 100 μΜ a následně byla analyzována exprese proteinu p53 pomocí monoklonální protilátky DO-1 (Fig. 3A). Bylo prokázáno, že koncentrace 105 2-5 μΜ ovlivňuje hladinu p53 proteinu v těchto buňkách. Jak je ukázáno na Obr. 3C, hladina exprimovaného proteinu 5 μΜ 105 nebyla významně vyšší než hladina indukovaná 50 μΜ koncentrací a proto byla použita pro další experimenty. Za druhé, časové periody 6, 12 a 24 h byly zvoleny, neboť hladina proteinové exprese dosáhla stabilní hladiny.
Analyzovali jsme expresi proteinu p53 v buněčných liniích nádorů prsu MCF-7 (wt p53), BT549 (mut p53) a BT474 (mut p53), v buněčné linii kolorektálního karcinomu HT29 (mut p53) a v buněčné linii osteosarkomu HOS (mut p53). Ošetření buněk MCF-7 po dobu 6,12 a 24 h s 5 μΜ 105 vedlo k signifikantní akumulaci wild-typu p53. Nulová indukce p53 byla pozorována po expozici buněčných linií BT549 a HOS s 5 μΜ 105 po dobu 6, 12 a 24 h, exprimujících mutantní p53. Nebyla pozorována žádná korelace mezi citlivostí buněčných linií k 105 a přítomností wild-typu nebo mutantního typu p53.
^-indukovaný -wt p53 je transkripčně aktivní a zodpovědný za indukci p21WAR
Účinek 105 a příbuzných sloučenin na aktivaci proteinu p53 byl rovněž analyzován pomocí lidské melanomové buněčné linie Am8 a myší fíbroblastové buněčné linie T22LacZ exprimující B-galaktosidasu pod kontrolou p53 responsivního promotoru. Indukce wt p53 v těchto buňkách ošetřených 5μΜ 105 (6, 12 a 24 h) vedly k aktivaci responsivního promotoru a následně k expresi B-galaktosidasy. Arn8 a T221acZ buňky ošetřené 105 byly zafixovány a zkoumány mikroskopicky na B-galaktosidásovou aktivitu za použití X-gal jako substrátu, což vedlo k barvení přibližně 25% buněk modře ve srovnání s méně než 1% modře-zabarvených buněk v DMSO-ošetřených kontrolních liniích (Obr. 3A). Celková B-galaktosidasová aktivita v Am8 buňkách byla stanovena kolorimetrickým testem. Výsledky naznačují silnou aktivitu Bgalaktosidasy 12 a 24 hodin po ošetření potvrzující přítomnost transkripčně aktivního proteinu p53 v porovnání s kontrolními buňkami ošetřenými DMSO.
Tato transkripční aktivita byla potvrzena analýzou exprese p21WAFl v buňkách MCF-7. Indukce proteinu p53 byla průkazná již po 4 h od ošetření, avšak zvýšené hladiny proteinu p21WAn byly stabilně pozorovány až po 12 h od ošetření látkou 105 (Fig. 3B). Pouze buňky exprimující wt p53 odpovídaly na 105 indukcí p21. V zájmu potvrzení indukce exprese p2]WAFi p53.reSpOnsivní byia připravena série stabilně transfekovaných klonů MCF-7 exprimujících vysoké hladiny dominantně-negativního Ddp53 miniproteinu. U tohoto proteinu obsahujícího aminokyseliny 1-14 a 302-390 ze sekvence myšího p53 bylo prokázáno, že se váže k C-terminální části wt p53 a abroguje p53-závislou transkripci. Kontrolní klony MCF
7neo byly připraveny stabilní transfekcí buněk MCF-7 s páteřním vektorem pCMVneo bez insertu. Klony exprímující vysoké hladiny Ddp53 stejně jako kontrolní klony byly ošetřeny sloučeninou 105 a testovány na expresi p21WAFI pomocí immunoblotingu s p21WAFI specifickými monoklonální protilátkou 118. Jako výsledek exprese Ddp53, přerušující p53 transkripční aktivitu, nebyla detekována žádná indukce p21WAF1 v MCF-7Ddp53 klonech.
Další sloučeniny měly efekt srovnatelný se 105, avšak účinné koncentrace testovaných sloučenin indukující maximum β-galaktosidasové aktivity se vzájemně lišily. Výsledky jsou prezentovány v tabulce 9 jako koncentrace indukující maximální β-galaktosidasovou aktivitu. Zdá se, že substituované 6-(2-aminobenzylamino)puriny jsou účinnými induktory exprese wt p53.
Tabulka 9: Vliv vybraných substituovaných 6-(2-aminobenzylamino)purinů na indukci proteinů p53 a p21WAF1 v buňkách MCF-7 exprimujících wild-typ p53.
c. SUBSTITUENTY NA PURINU Max. β-gal. aktivita
C2 C6 C9 Kone. (μΜ)
oc 2-hydroxyethylamino benzylamino methyl 125
RO (l-hydroxymethyl)propylamino benzylamino isopropyl 50
1 2-aminocyklohcxylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 34
2 4-aminocykiohexy lamino (2-aminobenzyl)ammo methyl 37
5 (l-hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 29
7 (1 -hydroxymethy 1-2methyl)prcpylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 25
8 2-hydroxy-2-methyIpropyl amino (2-aminobenzy[)am ino methyl 24
9 2-hydroxy-l,2dimethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 25
12 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyI)amino methyl 33
13 2-hydroxy-l-ethyl-2methyipropylamino (2-aminobenzyl)amino methyl 36
46 4-amínocyklohexy lamino (2-amino-3-methoxybenzyl)amino methyl 32
59 4-aminocyklohexy lamino (2 -am i no be nzyI Jam ino ethyl 33
62 (1-hydro xymethyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino ethyl 7
64 (l -hydroxymethy 1-2methyljpropylamino (2 -aminobenzyPamino ethyl 6
101 2-aminocyklohexy lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 22
102 4-aminocyklchexy lamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 13
103 4-hydroxycyklohexylaminů (2-aminobenzyl)amino isopropyl 14
104 2-hydroxy propyl amino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 12
105 (1 -hydroxymethyl)propy1amino (2-aminobenzyl)armno isopropyl 16
106 heptylamino (2-am inobe nzyl)amino isopropyl 41
107 (1 -hydroxymethyl-2- (2-am inobe nzyl)amino isopropyl 11
methyl Jpropylamino
108 2-hydroxy-2-methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 3
109 2-hydroxy-1,2dimethylpropylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 6
110 3-hydroxy-3-methylbutylamino (2-am i nobenzy 1 )am i n o isopropyl 29
111 3-hydroxy-l,3dimethylbutyl amino (2-aminobenzyl)ammo isopropyl 32
112 3-hydroxy-2,3dimethylbutylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 35
113 2-hydroxy-l -ethyl -2methylpropylamino (2-aminobenzyl)amino isopropyl 16
114 2-hydroxy-1 -ethylpropylamino (2-aminobenzyl)amíno isopropyl 3
116 4-aminocyklohexylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amíno isopropyl 21
118 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-chlorobenzy I)am ino isopropyl 18
128 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-amino-5-íluorobenzyl)amino isopropyl 4
138 4-aminocyklohexylamino (2-ammo-3-methylbenzyl)amino isopropyl 2
161 4-aminocyklohexylaniino (2,5-diaminobenzyl)amino isopropyl 20
166 2-hydroxypropyl amíno (2-amino-3 -methoxylbenzyl)amino isopropyl 14
182 (1 -hydroxy me thyl)propy lamino (2-amino-5-methoxylbenzyl)íiniino isopropyl 12
184 4-aminocyklohcxylamino (2-aminobenzyl)amino propyl 6
187 (1 -hydroxymethyl)propylamino (2-aminobenzyl)amino propyl 3
195 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 22
198 (1-hydro xymethyljpropylamino (2-aminobenzyl)amino cyklohexyl 19
209 (1 -hydroxymethyl Jpropylamino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino cyklohexyl 20
226 2-hydroxypropyl amino (2-amino-3-inethoxylbenzyl)amino cyklohexyl 21
231 4-aminocyklohexylamino (2-aminobenzyl)amino benzyl 18
234 (1 -hydroxymethyl)propylam ino (2-aminobenzyl)amino benzyl 24
247 (1 -hydroxymethyl)propylam ino (2-amino-5-chlorobenzyl)amino benzyl 20
226 4-aminocyklohexylamino (2-amino-3-methoxylbenzyl)amino benzyl 27
Příklad 7
In vivo protinádorová aktivita
Screening biologické aktivity sloučeniny 105 byl proveden na modelu přežití P388D1 leukémie transplantované intraperitoneálně s 2.105 buňkami. DBA-2 myši byly použity jako hostitelské. Jeden den po transplantaci leukémie bylo zahájeno ošetření sloučeninou 105. Léčivo bylo podáno orálně gastrickou výživou v celkovém objemu 200 μΐ/dávku 2-krát denně v dávce 250 mg/kg ve dvou chemoterapeutických cyklech (dny 1-3 a 7-9). Sloučenina 105 byla rozpuštěna v 5% N-methyl-2-pyrolidinu, 30% polyethylenglykolu 400, 65% tartarovém pufru (pH 3.0). Analýza přežití ošetřených zvířat (10 myší/skupina) byl proveden v porovnání s ošetřením myší vehikulem za použití metody Kaplan-Meier a průkaznost byla zhodnocena pomocí log-rank testu. Tělesná váha experimentálních zvířat byl stanovována paralelně za účelem reflexe toxicity a účinnost terapie. Komparativní analýzy tělesné váhy byly zhodnoceny pomocí ne-parametrického t-testu.
Výsledky našich analýz prokázaly, že sloučenina 105 redukuje váhu ošetřených zvířat, která je u modelu intraperitoneálně transplantované leukémie P388D1 indikativní jak pro toxicitu tak pro účinnost léčby (redukce ascitů a tvorby intraperitoneálníhu tumoru). Analýza přežití statisticky významně lepší přežití myší ošetřených 105 (P=0.0409), která byla převedena do delšího průměrného času přežití (15.4 dnů skupinu ošetřenou léčivem versus 13.9 dní skupinu ošetřenou vehikulem).
Detailnější analýza protinádorové aktivity sloučeniny 105 byla provedena na lidském xenograft modelu plicního adenokarcinomu A549 transplantovaného do CD-I SCID myší. Zvířata byla transplantována subkutánně 2.106 A549 buněk do zadní části zad. Přibližně po měsíci se vytvořily u většiny zvířat zřetelné nádory a poté byla zahájena terapie. Léčivo bylo podáno orálně gastrickou výživou v celkovém objemu 200 μΐ/dávku 2-krát denně v dávce 250 mg/kg ve dvou chemoterapeutických cyklech (dny 1-3 a 7-9). Sloučenina 105 byla rozpuštěna v 5% N-methyl-2-pyrolidinu, 30% polyethylenglykolu 400, 65% tartarovéni pufru (pH 3.0). Primární endpoint pro analýzu byla redukce objemu nádoru (10 myší/skupina), která byla kvantifikována posuvných měřítkem. Analýzy ošetřených zvířat byly prováděny v porovnání s myšmi ošetřenými vehikulem. Tělesná váha experimentálních zvířat byl stanovována paralelně za účelem reflexe toxicity a účinnost terapie. Komparativní analýzy tělesné váhy byly zhodnoceny pomocí ne-parametrického t-testu.
Výsledky našich analýz prokázaly, že sloučenina 105 je dobře tolerována zvířaty. Byla prokázána pouze slabá redukce tělesné váhy, která bylou pouze signifikantní v jednom časovém bodu (Den 52).
Analýza objemu nádorů prokázala signifikantně menší nádory u myší ošetřených sloučeninou 105 (P=0.0409), která se projevila i delším průměrným časem přežití (21.7 dnů skupinu ošetřenou léčivem versus 12.4 dní skupinu ošetřenou vehikulem).
Příklad 8
Antivirová aktivita
Buněčné kultury. Buněčná linie z ledvin afrického kočkodana CV-1 (wild-typ p53), COS-1 buňky (vytvořena z CV-1 po transformaci z původně defektního mutanta SV40), buněčná linie lidského malobuněčného karcinomu plic H1299, buněčná linie lidského prsního adenokarcinomu MCF-7 (wild-typ p53) a buněčná linie lidského prsního karcinomu T47D (mutantní p53) byly udržovány v Dulbecco's modified Eagle mediu (DMEM) obsahujícím 10 % fetálního bovinního séra, 300 pg/ml L-glutaminu, 105 lU/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu. Lidské fetální fíbroblasty předkožky (HFFF) (wild-type p53), lidské epitheliální buňky plicního karcinomu A549 (wild-typ p53), lidské B95a B buňky a psí epitheliální buňky Madin-Darby z ledvin (MDCK) byly pěstovány v DMEM doplněném 10% tepelné inaktivovaným fetálním bovinním sérem, 105 IU/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu. Buňky byly pěstovány do 80% konfluence před experimentálním ošetřením. Jestli není jinak stanoveno, tak 20 pM roskovitinu a 10 μΜ 105 bylo přidáno k buňkám na dobu 12 hodin.
Generace stabilních buněčných linií. Plasmidy pCEP4-Tat a pHIV-lacZ byly získány z NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (Chang et al. Gene Ther. 6(5):715-28, 1999). pCEP4-Tat obsahoval HIV-1SF2 tat, kdežto pHIV-lacZ obsahoval všechny U3 regiony, část R regionu (vČetněTAR) a HIV-1 3'LTR řídící lacZ a pCMV-lacZ obsahující lacZ pod kontrolou promotoru z lidského cytomegaloviru. DNA transfekce probíhaly pomocí Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) podle návodu výrobce. Buněčné linie H1299-TAT byly odvozena z buněk H1299 stabilně transfekovaných pCEP4-Tat. Buněčné linie H1299HIV byly připraveny stabilní kotransfekcí s pCEP4-Tat a pHIV-lacZ plasmidy. Dva dny po transfekci byly buňky selektovány na hygromycinu B (250 pg/ml; Merck Biosciences, Nottingham, UK) za účelem generace stabilních klonů s inkorporovanou plasmidovou DNA. Selektované stabilně transfekované (i) H1299-TAT klony byly transientně transfekovány pHIV-lacZ a testovány na β-galaktosidasovou aktivitu (viz níže), kdežto (ii) buňky H1299HIV byly testovány na β-galaktosidasovou aktivitu bezprostředně po stabilní inkorporaci obou plasmidů.
Beta-galaktosidasový test Pro měřeni β-galaktosidasové aktivity byly buňky sbírány 12 h po transfekci a rozrušeny sonikací v 0,25 M Tris-HCl pH7,5. Buněčné lyzáty (100 pg) byly smíchány s 3 pl pufru (0,1 M MgCl2, 4,5 Μ β -merkaptoethanol), 66 pl ONPG (4 mg/ml onitrophenyl-β-D-galaktopyranosid) νΟ,ΙΜ sodno-fosfátovém pufru, pH 7,5. Reakce byla inkubována po dobu 30 minut při 37 °C, zastavena 500 μΐ 1 M Na2COj a absorbance stanovena při 420 nm v mikroplate readeru.
Imunobloting. Buňky byly oděleny s pomocí gumového kusu a promyty 3-krát ledově chladným PBS a lyžovány v pufru (50 mM Tris, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM NajVCU, 1% Nonidet P40) obsahujícím směs proteasových a fosfatasových inhibitorů (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA). 20 pg celkových proteinů bylo separováno pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE) v 8% nebo 10% gelu a přeneseny na nitrocelulozóvou membránu. Membrány byly blokovány v 5% mléku a 0,1% Tweenu 20 v PBS a inkubovány přes noc se specifickými monoklonálními protilátkami nebo králičími polyklonálními séry. Primární protilátky specifické pro RNA polymerasu II (od Santa Cruz Biotechnology, California, USA) zahrnovaly: (i) N-20 použita v ředění 1 pg/ml, (ii) H14, specifická pro formu fosforylovanou na fosfoserinu 5, ředění 6 pg/ml and (iii) H5, specifická pro formu fosforylovanou na fosfoserinu 2, ředění 4 pg/ml. Další použité primární mAb v imunblotech zahrnují (iv) anti-p53 (DO-1, vlastní) použita v ředění 1 pg/ml, (v) anti-p21WAFI (118, vlastní),) použita v ředění 1 pg/ml), (vi) anti-actin (A-2066, Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA)) použita v ředění 1 pg/rnl. (vii) anti-T-antigen (419, in vlastní), použita v ředění 1 pg/ml. Všechny primární protilátky byly naředěny v PBS obsahujícím 5% práškové mléko; 0,1% Tween 20. Peroxidasou konjugovaná králičí anti-myší imunoglobulin nebo prasečí anti-králičí antiséra (DAKO, Glostrup, Denmark) byla použita jako sekundární protilátky a vizualizována s ECL reagenciemi (Amersham-Pharmacia, Little Chalfont, UK).
Infekce a viry. Buněčné linie MCF-7 a T47D byly infikovány SV40 virem po dobu 4 hodin v bezpérovém DMEM. Po infekci byl DMEM doplněn 10% fetálním bovinním sérem a buď 20 μΜ roskovitinu nebo 8 μΜ 105 přidanými bezprostředně nebo 12 h po infekci. Infikované buňky byly sklizeny po 45 h, Herpes simplex virus typ 1 kmen 17 (HSV-1), HSV-1 kmen 17 obsahující GFP v lokusu thymidin kinasy (HSV-1-deltaTK) a HSV-2 kmen HG52 (HSV-2) byly použity. Všechny herpesviry byly množeny a titrovány v HFFF buňkách. Vaccinia virus kmen WR kódující chřipku PB2 v TK lokusu (VV) byl množen a titrován v HFFF buňkách. Lidský adenovirus typ 4 (HAdV-4) kmen RI-6 byl množen a titrován v A549 buňkách. Lidský cytomegalovirus kmen Toledo kódující GFP v 62.7 lokusu (HCMV) (McSharry et al., J. Gen. Virol. 2003, 84:2511-62003) byl množen a titrován v HFFF buňkách. Measles virus (MV) wildtyp kmen Štrb byl dar od J. Schneidera Schaulies, Wuerzbug, Germany. MV byl množen a titrován v B95a buňkách. Measles Virus titr byl stanoven jako syncytium forming units (SFU). Influenza Virus (IV) H1N1 kmen A/PR/8/34, získaný z European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, UK), byl množen v zárodečné kavitě embryonálních kuřecích vajec (kmen 0; Institute for Animal Health, Compton, UK) při 35 °C. Vejce byla infikována 6. den a zárodečná tekutina byla sbírána 10. den. IV titry byly stanoveny jako HA jednotky (HAU; inverse of log2 endpoint dilution titer) pomocí hemaglutinace kuřecích erythrocytů (Fiebig Naehrstofftechnik, Bad Kreuznach, Germany) a jako infectious center forming units (ICFU) na mililitr zárodečné tekutiny. ICFU byly stanoveny v MDCK buňkách rostoucích v 12 jamkových destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark) na 16 mm skleněných krycích sklíčkách za použití koktailu přímých FITCem značených monoklonálních protilátek A typu chřipkového viru (K6105 A reagent, DAKO, Glostrup, Denmark).
• · · · «··* t 1 * « .%··..:: ; .:
Antivirové látky. Kde je naznačeno, tak byla využita následující virostatika: acyclovir (9-[(2Hydroxyethoxy)methyl]guanin) (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), cidofovir ((S)-l[3-Hydroxy-2-(phosphonylmethoxy)propyl]-cytosín) (Moravek, Biochemical s), iododeoxyuridin (l-(2-Deoxy-p-D-ribofuranosyl)-5-iodouracil) (Sigma), Ribavirin (Ι-β-DRibofuranosyl-l,2,4-triazole-3-carboxamid) (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), tamiflu ((3R,4R,5 S)-4-acetylamino-5-amino-3 -(1 -ethylpropoxy)-1 -cyclohexen-1 -carboxylic acid ethyl ester) (Roche), chloroquin (N'-(7-chloroquinolin-4-yl)-N,N-diethyl-pentane-l,4-diamin) (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), roskovitin (2-(R)-(l-ethyl-2-hydroxyethylamino)6-benzylamino-9-isopropylpurin) byl připraven podle publikované metody (Havlíček et aL, 1 Med.Chem. 40: 408-412, 1997). Antivirotika byla použita jak je naznačeno v textu.
Plaque number reduction assays. 50% inhibiční koncentrce (IC5o) byly vypočteny za použití standardního „plaque number reduction essay“. ICso byly definovány jako koncentrace antivirotika, která redukovala počet plaků number o 50 % relativně k ošetření bez antivirotik. Buňky byly pěstovány v 25 cm2 lahvičkách pro tkáňové kultury (Corning) až do konfluence a poté byly infikovány 100 „plaque forming units“ (PFU) příslušného viru (HSV-1 infekce na HFFF, HSV-1-deltaTK na HFFF, HSV-2 na HFFF, VV na HFFF, HAd4 na A549, HCMV na HFFF) po dobu 1 h při 37°C v CO2 inkubátoru na kolébající se platformě. Buňky byly poté převrstveny mediem obsahujícím 1% Avicel RC-591 (Camida Ltd) (Matrosovich et al., Virol. J. 3:63, 2006) a testovanou látkou. Sloučenina 105 a roskovitin byly typicky testovány v koncentračním rozsahu od 0,04 μΜ do 20 μΜ. Kde bylo nezbytné, tak byl acyclovir, cidofovir, iodo-deoxyuridine, chloroquine, tamiflu a ribavirin použity pro srovnání a byly aplikovány v rozmezí, které zahrnuje jejich vrcholovou hodnotu IC5o. Infikované buněčné monovrstvy byly barveny Giemsa barvením (Sigma) po dobu 3 dnů (pro HSV-1, HSV-1 deltaTK, HSV-2 & VV) nebo 5 dnů (HAd4) a plaky byly spočteny. U HCMV byly po 7 denní inkubaci buněčné monovrstvy promyty PBS a zelené fluorescenční foci byly spočteny pod Leica DMIRBE mikroskopem. Počet plaků byly vynesen a analyzován pomocí Cricket Graph softwaru (Computer Associates).
K realizaci „MV syncytium reduction essay“ byly napěstovány buňky B95a ve 24 jamkových destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark) do 80% konfluence. Buňky byly znovu předošetřeny médiem obsahujícím příslušné množství antivirotika po dobu 30 minut před infekcí. Každá jamka byla infikována 100 SFU MV a inkubována v DMEM bez FBS nebo antibiotik a neobsahovala rovněž žádná antivirotika nebo virotika ve zvoleném koncentračním rozsahu po dobu 24 h. Tvorba syncytií byla zhodonocena fázovým kontrastním mikroskopem.
IC$o byla definována jako koncentrace antivirotika, která redukovala počet syncytií na 50 % v porovnání s buňkami infikovanými za nepřítomnosti antivirotika.
„IV infectious center reduction essay“ byly prováděny na buňkách MDCK rostoucích na 16 mm skleněných krycích sklíčkách ve 12 jamkových destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark) do 80% konfluence. BuŇky byly předošetřeny mediem obsahujícím testované antivirotikum po dobu 30 minut před infekcí. Každá jamka byla infikovaná 100 ICFU IV inkubovaného v DMEM bez FBS nebo antibiotik a buď neobsahovala antivirotika nebo obsahovala antivirotika v příslušném koncentračním rozsahu po dobu 24 h. Buňky byly promyty PBS. fixovány 3% paraformaldehydem (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), permeabilizovány 1% Tritonem X 100 (Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA) v PBS a označney cocktailem monoklonálních proti A typu viru chřipky (K6105 A reagent, DAKO, Glostrup, Denmark), Centra tvořící infekční jednotky (zelená fluorescenční cytoplasma anebo fluorescenční jádro) byly kvantifikovány pomocí Axioplan epifluorescenčního mikroskopu s Axiovision softwarem (Carl Zeiss, Jena, Germany). IC50 byla definována jako koncentrace antivirotika redukující počet infekčních center o 50 % v porovnání s buňkami infikovanými v nepřítomnosti antivirotika. Konečné hodnoty IC50 pro všechny viry/antivirotické kombinace jsou vždy průměrem ze 4 nezávislých experimentů,
HAd4 yield reduction assay. Konfluentní monovrstvy buněk A549 v 6 jamkových tkáňových mikrodestičkách byly infikovány 2000 PFU/jamku HAd4 po dobu 1 h v 37 °C v CO2 inkubátoru na kolébající se platformě. Buňky byly poté promyty a pěstovány v médiu obsahujícím 10 μΜ sloučeniny 105 nebo 100 μΜ cidofoviru nebo koktailu 10 μΜ sloučeniny 105 a 100 μΜ cidofoviru. Buňky a media byla posbírána po 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h a 96 h po infekci a poté byl výnos uvolněných virů a celkový výnos virů (uvolněný a intracelulámí) v každém vzorku titrován pomocí buněk A549.
Inhibítce virové replikace sloučeninou 105 a roskovitinem. Vzhledem ke zjištění, že sloučenina 105 byla mnohem účinnějším inhibitorem CDK aktivity než roskovitin, bylo velmi důležité zjistit relativní kapacitu těchto dvou CDKI snižovat virovou replikaci. S použitím “plaque reduction” testů byly porovnány účinky sloučeniny 105 na replikaci panelu DNA (HSV, VV, HAd4, HCMV) a RNA (MV, IV) virů v porovnání s řadou referenčních antivirových látek (Tab. 10). Sloučenina 105 inhibovala replikaci všech testovaných DNA virů mnohem efektivněji než roskovitin. Roskovitin neinhiboval jak HSV-1 či HSV-2, kdežto sloučenina 105 byla účinná, přestože vykazovala vyšší IC50 než acyclovir. Acyclovir je proléčivo, které je aktivováno v buňce fosforylací virově kodovanou TK. HSV-1 deleční mutant thymidin kinasy (TK) zůstával citlivý pro sloučeninu 105 oproti acycloviru, což naznačuje, že sloučenina 105 působí rozdílným mechanismem (Tabulka 10). Přestože se hodnoty IC50 pro HSV-1 a HSV-2 u acycloviru lišily, jejich hodnoty pro sloučeninu 105 byly podobné. Je velmi zajímavé, že všechny DNA viry byly inhibovány v přibližně srovnatelých koncentracích sloučeninou 105, což je konsistentní molekulárním cílem tohoto léčiva, tedy CDK dříve než specifické virově-kódované funkce. Vakcinia virus byl inhibován stejně dobře jak sloučeninou 105 tak iododeoxyuridinem, kdežto roskovitin nevykazoval žádný významný účinek. Existují předpoklady, že replikace VV nevyžaduje fungování CDK, přičemž bylo dokonce předpokládáno, že CDKI nemusí být efektivní vůči takovýmto virům (Schang, J. Antimicrob. Chemother. 50(6):779-92,2002). Naše výsledky však vůbec poprvé naznačují, že i poxvirus je citlivý k CDKI. Sloučenina 105 i roskovitin inhibovaly replikaci HAd4 a, co je ještě zajímavější, jejich hodnoty IC50 byly výrazně nižší než u cidofoviru. Přestože byl HCMV přibližně stejně citlivý k sloučenině 105 a roskovitinu, v tomto případě při vyšších dávkách než cidofovir. Oba CDKI prokázaly nulovou účinnost k testovaným RNA virům, tedy MV a IV.
Tabulka 10. Inhibice virové replikace. IC50 (μΜ) bylo stanoveno pomocí “plaque reduction assay” (n=4)
HSV-1 HSV-1 ΔΤΚ HSV-2 W Had4 HCMV MV IV
sloučenina 105 5.0 ± 0.9 5.3 ± 0.9 4.7 ± 1.0 3.8 ± 1.3 2.4 ± 1.3 3.2 ± 1.6 19.7 ± 1.8 >20
roskovitin >20 >20 >20 >20 3.1 ± 1.6 4.9 ± 2.2 >20 >20
iododeoxyuridin * 3.7 + 1.6
acyclovir 0.5 ± 0.2 73.0 ± 18 2.2 ± 0.5
cidofovir 16.6 ± 2.9 0.2 ± 0.1
ribavirin >40 12.0 ± LI 10.5 ± 1.8
tamiflu 12,5 ± 2.2
chloroquine 5.3 ± 0.9
* hodnoty v vystínovaných buňkách nebyly stanoveny
Inhibice virové exprese sloučeninou 105 a roskovitinem. SV40 large T antigen je pleiotropický, kódující mnohočetné fukce, které regulují virovou infekci a podporují tumorogenesi. Large T-antigen tvoří stabilní komples s p53, a tím, že podporuje defosforylaci pRb inaktivuje členy Rb rodiny (Zalvide et al., Mol. Cell. Biol. 18(3):1408-15, 1998). Inaktivace p53 je kritická pro SV40-zprostředkovanou buněčnou transformaci, zatímco doprovodná destabilizace tohoto inhibičního komplexu mezi defosforylovaným Rb a členy E2F rodiny transkripčních faktorů usnadňuje transkripci cílových genů podporujících vstup do buněčného cyklu (Ali et al., J Virol. 78(6):2749-57, 2004).
Buňky MCF-7 (wild typ p53) a T47D (mutant p53) byly infikovány SV40 za účelem studia účinků sloučeniny 105 a roskovitinu na expresi large T-antigenu, p53 a p21WAF1. Exprese large T antigenu byly detekována nezávisle na statusu p53, kdežto large T antigenzávislá vazba a stabilizace wild-typu p53 vedla k jeho inaktivaci. Ošetření infikovaných buněk sloučeninou 105 nebo roskovitinem vedlo k redukci hladiny large T-antigenu, což naznačuje esenciální úlohu CDK pro virovou genovou expresi (Obr. 8). Vliv těchto CDK.I na buňky MCF-7 byl vyšší, když byly přidány bezprostředně po infekci, zejména u buněk ošetřených roskovitinem. Simultánně jsme pozorovali i inhibici hladiny p53 a obnovu jeho funkce representovanou transaktivací p53 cílového proteinu p21WAFI. Inhibiční účinek sloučeniny 105 na expresi large T-antigenu v T47D buněčné lini byl nezávislý na času ošetření, kdežto roskovitin ovlivnil expresi T-antigenu pouze když byl podán 16 h po infekci. Hladina mutantního p53 zůstala nezměněna a nebyl schopen rovněž trans-aktivovat expresi p21WAF1 (Obr. 8).
Po provedení následných testů bylo prokázáno, že oba CDKI měly inhibiční vliv i na isolovaný virální promotor vplastidovém vektoru. Transíentně jsme transfekovali buněčnou linii MCF-7 a T47D plasmidem pCMV-lacZ, ošetřili transferované buňky roskovitinem nebo sloučeninou 105 a změřili β-galaktosidasovou aktivitu. Jak sloučenina 105 tak i roskovitin inhibovaly expresi z CMV promotoru v transientně transferovaných buňkách, kde sloučenina 105 vykazovala mnohem silnější supresivní účinek (Obr. 9).
Vliv CDKI na expresi SV40 promotoru inkorporovaného do buněčného genomu. Pozorování popsaná výše nás vedla k expanzi analýz účinků sloučeniny 105 a roskovitinu na genovou expresi SV40 v COS-1 buňkách, kde jsou sekvence kódující velký T-antigen integrovány do buněčného geonomu. Buňky COS-1 jsou CV-1 buňkami transformovanými původně-defektivním mutantem SV40, tedy CV-1 a buňky MCF-7 byly použity jako kontroly. Ačkoliv byla exprese z hlavního IE promotoru SV40 a CMV v obou případech inhibována CDKI, když byly introdukovány do extrachromosomálního elementu (Obr. 8 a 9), v buňkách COS-1 ošetřených sloučeninou 105 a roskovitinem stimulovaly expresi velkého T-antigenu, kdežto p53 zůstával konstantní a transkripčně inaktivní (p21WAF1 nebyl transaktivován). V kontrolních CV-1 a MCF-7 buňkách vzrostly hladiny p53 a p21WAFI po ošetření oběma CDKI (Obr. 10). Tyto výsledky naznačují, že CDKI mohou mít jak inhibiční tak stimulační vliv na virové promotory, a to v závoslosti na jejich lokalizaci v buňce.
Inhibice exprese z HIV promotoru. Transkripce z HIV genomu je ciltivá na aktivitu CDK9 a může být proto suprimována ošetřením CDKI v koncentračním rozmezí, které nesnižuje buněčnou transkripci (Chao et al., J Biol Chem. 2000 Sep 15;275(37):28345-8, 2000). Kromě toho interaguje funkčně CDK9 s transaktivační doménou Tat, což je ilustrováno faktem, že CDK9 deplece blokuje Tat-dependentní transaktivaci a aktivitu.
Za účelem vyhnutí se obecné inhibici transkripce z extrachromosomální DNA vlivem CDKI byly zkonstruovány dvě stabilní buněčné linie (H1299-TAT a H1299-HIV). Buňky H1299-TAT byly trasfekovány pomocí pHIV-lacZ a poté ošetřeny roskovitinem a sloučeninou 105. Exprese z pHIV-lacZ (extrachromosomální lokalizace) byla inhibována ošetřením CDKI; β-galaktosidasový (β-gal) výstup byl o něco nižší u sloučeniny 105 v porovnání s roskovitinem (Obr. 11). Je zajímavé, že účinky aplikace CDKI byly opačné při testování na HIV promotoru integrovaném do buněčné DNA (H1299-HIV buňky) s reportérovým výstupem zvýšeným 4násobně po ošetření sloučeninou 105 a 2,5-krát zvýšeným po ošetření roskovitinem (obr. 11). Inhibice replikace adenovirů sloučeninou 105 a cidofovirem Sloučenina 105 měla pronikavý vliv na replikaci HAdV4 s lepšími hodnotami IC50 než dokonce cidofovir v “plaque reduction assay” (Tab. 10). Vzhledem k tomu, že 105 a cidofovir účinkují rozdílnými mechanismy, tak jsme studovali, zda-Ii tato dvě antivirotika by mohla mít aditivní efekt, když budou zkombinována. Mnohostupňová růstová křivka HAd4 byla proto měřena v přítomnosti
μΜ 105, 100 μΜ cidofoviru nebo obou (Obr. 13a). Jak bylo prováděno konvenčně s HAdV, testy měřily celkový výtěžek virů z kultury. Po 24 h od infekce inhibovaly jak sloučenina cidofovir tak sloučenina 105 produkci infekčního viru a redukovaly virový výtěžek o 2 a 5 log stupňů. Žádné infekční viry nebyl detekovány, když byly oba inhibitory použity v kombinaci. 48 h po infekci byla relativní účinnost antivirotik obrácená: Sloučenina 105 a cidofovir redukovaly virový výtěžek o 1 a 2 log stupně, kdežto kombinace obou sloučenin způsobila redukci 5 log stupňů. V tomto a dalších pozdějších časech byl účinek obou léčiv mnohem silnější než aditivní efekt, a tak lze jejich působení v kombinaci považovat za synergické. Nicméně, z výsledků bylo zřejmé, že účinek sloučeniny 105 byl po 96 h po infekci poněkud utlumený; sloučenina 105 nevykazovala žádný celkový vliv na virovou replikaci, kdežto cidofovir inhiboval výtěžek 3 log stupňů. Kombinovaný účinek obou léčiv v tomto časovém bodě vykazoval silný kumulativní vliv 4 log stupňů. Zjevná nesourodost mezi testy “plaque reduction” (Tab. 10) a “yield reduction” (obr. 12a) byla vyřešena, když byly titry buněk asociovaných a extracelulámích virů odděleny a analyzovány nezávisle. Účinek sloučeniny 105 a cidofoviru na výtěžek extracelulámího viru (obr. 12b) byly mnohem konsistentnější v “plaque reduction” testu. Adenoviry jsou uvolňovány spontánní lyží a “plaque reduction” test spočívá v mnohonásobných kolech virové replikace za účelem vytvoření viditelných plaků. Ošetření infikovaných buněk sloučeninou 105 značně zpomalovalo výskyt extracelulámích virů, které v závislosti na tom způsobilo zpožďování každého kola replikace a tak i výskyt plaků. Vliv přidání cidofoviru a sloučeniny 105 v kombinaci na výnos extracelulámího viru byl dramatický (obr. 13). Kombinace velmi časného účinku sloučeniny 105 se zpožděným, ale solidním a dlouhotrvajícím účinkem cidofoviru značně zvýšil jejich kapacitu inhibovat replikaci HAd4. Žádný infekční virus se nepodařilo prokázat v kultivačním médiu až do 72 h po infekci a 96 h po infekci byl ještě výnos virů nižší než vstupní přísun viru (0 h), téměř 5 log stupňů pokles oproti žádnému ošetření léčivy.
Příklad 9
Suché tobolky
5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin vzorce I z tab.l nebo 2, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem: Složení
Aktivní složka
Talek
Pšeničný škrob
1250 g
180 g
120 g
Magnesium stearát 80 g
Laktosa 20 g
Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 10
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek o vzorci I, tab.l - 6, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
Lauroglykol 2 litry
Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 11
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, tab. 1 a 2, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
PEG 400 1 litr
Tween 80 1 litr
Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Substituované 6’(2-aminobenzylamino)puriny obecného vzorce I (R)n
    a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, ve kterých (R)n znamená 1 až 4 substituenty (n je 1-4), které mohou být stejné nebo rozdílné, přičemž tyto substituenty mohou být vybrané ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, alkoxy, amino, halogen, hydroxy, nitro a merkapto skupinu, a
    R2jeR2’-NH-ve kterém
    R2’ znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyl, aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin může být substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino, halogen, hydroxy, alkoxy nebo merkapto, a
    R9 znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyl, aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin může být substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino, halogen, hydroxy, alkoxy nebo merkapto,
  2. 2. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I ve formě (R) nebo (S) isomerů v případě chiraity v pozici R2 ,
  3. 3. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 1 a 2 vybrané ze skupiny 2-({6-[(2-aminobenzyl)amino] -9-isopropyl-9//-purin-2-yl} amino)butan-1 -ol, Μ-(2aminobenzyl)-Ar2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2- aminobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, l-({6-[(26 2 aminobenzyr)amino]-9-isopropyl-9/Apurin-2-yl}amino)propan-2-ol, N -(2-aminobenzyl)-N (4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-díamine, isopropyl-9//-purin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol, isopropyl-9//-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, isopropyl-9/f-purin-2-yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol,
    1 -({6-[(2-aminobenzyl)amino]-93 -({6- [(2-aminobenzy l)amino] -94-( {6-[(2 -aminobenzyl)amino] -94-({6-[(2-aminobenzyl)amino]-94-( {6-[(2-aminobenzy l)amino] -93 -({6-[(2-aminobenzyl)amino] -93-( {6-[(2-aminobenzyí)amino] -9isopropyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, cyclohexyL9//-purin-2-y 1} amino)butan-1 -ol,
    1 - ({6- [(2-aminobenzy l)amino] -9-cy clopropy 12-( {6- [(2-amino-5 -chlorobenzy l)amino] -9jV6-(2-amino-5-chlorobenzyl)-JV2-(2aminopropyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9cthyi-9//-purin-2-yl}amino)-3-inethyl-butan-l-ol, 2-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amÍno]-9isopropyl-9//-purin-2-yl} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, N6-(2-amino-5-chlorobenzyl)-N2-(4arninocyclohexyl)-9-isopropyl-9#-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-5 chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-chIorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9f/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2ol, l-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-917-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9Zf-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-chlorobenzyl)amino]-9-cyclopropyl-9//-purin-2yl} amino)-2-methy l-propan-2-ol, 2-( {6-[(2-amino-3 -chlorobenzy l)amino] -9-isopropyl-9Hpurin-2-yl}amino)butan-1 -ol, A'6-(2-amino-3-chlorobcnzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl9H-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2yl} amino)-3 -methyl-butan-1 -ol, N6-(2-amino-3-chlorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexy l)-9isopropyl-9J7-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9// purin-2-yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-3-chiorobenzyl)amino]-9-isopropyl-977-purin2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyI-9J7purin-2-yl}amino)-2'methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl9H-puri n-2-y 1} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-( {6-[(2-amino-3 -chlorobenzyl)amino]-9isopropyl-9#-purin-2-yl} amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-( {6- [(2-amino-3 chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2amino-3-chlorobenzyl)amÍno]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3({6-[(2-amino-3-chlorobenzyl)amino]-9-isopropyl-97f-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 2-({6[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]’9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, N6-(2-amíno5-fluorobenzyl)W2-(2-aminopropyl)-9-ísopropyl-977-purine-2,6-diainine, l-({6-[(2-amino-5fluorobenzyl)aniino] -9-isopropyl-977-purin-2-y 1} amino)propan-2-ol, 2-( {6- [(2-amino-5fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9#-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, N6-(2-amino-5fluorobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-Ísopropyl-9/7-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9ř/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-fluorobenzyl)amÍno]-9-isopropyl-97f-purm-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-5 -fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2ol, 4-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z7-purin-2-yl}amino)-2methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2yl }amino)butan-1 -ol, ÝV6-(2-amino-5-iodobenzyi)-Ar2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl-9/7-purine2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-3methyl-butan-l-ol, l-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-ethyl-977-purin-2yl}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-977-purin-2yl}amino)propan-2-ol, N6-(2-amino-5-iodobenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9/7purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-Ísopropyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-97/-purin2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl-9J/purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9-isopropyl9//-purin-2-yl} amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3 -({6-[(2-amino-5 -iodobenzyl)amino] -9isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]9-isopropyl-9//-purin-2-yl]aniÍno}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-iodobenzyl)amino]-9 isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 2-({6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, jV6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-(V2-(2amin0propyl)-9-isopropyl-9/Apurine-2,6-diamine, 2-({6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9isopropyÍ-97f-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, N6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-N2-(4aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9/7-purine-2,6-diamine, l-({6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9isopropyl-9H-purin’2-yl}aniino)-2-methyl’propan-2-oL 3-((6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9isopropy l-9H-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-( {6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9ísopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4-({6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-(2,3-diamínobenzyl)amino]94sopropyl-9Jf-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-(2,3-diaminobenzyl)amino]-9isopropyl-9//-purin-2-yl]amino} pentan-2-oi, 1 ( {6- [(2,3 -diaminobenzyl)amino]-9-isopropyl9H-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//purin-2-yl}amino)butan-l-ol, A/6-(2-amino-5-methylbenzyl)-7V2-(2-aminopropyl)-9-isopropyl9/f-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-977-purin-2yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, N6-(2-amino-5-niethylbenzyl)-N2-(4-aminocyclohexyl)-9isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/fpurin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9isopropyl-9/7-purin-2-yl} amino )propan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9isopropyl-9/f-purm-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-5methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl} amino)-2-methyl-butan-2-ol. 4-({ 6- [(2amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 4({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)aminoJ-9-isopropyl-9Ar-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethyl-buLan2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}ammo)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-977-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/Apurin-2yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, AÉ-(2-amino-4-methylbenzyl)-jV2-(2-aminopropyl)-9isopropyl-9Z7-purÍne-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9-isopΓopyl·9/fpurin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, N -(2-amino-4-methylbenzyl)-N -(4aminocyclohexyl)-9-isopropyl-9Z/-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-4methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3-({6-[(2amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4-({6[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-Ísopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2'Ol, 4 ({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-97/-purin-2-yl}amino)-2-methyl-pentan-2ol, 4-({6-[(2-amino-4-methyIbcnzyrjamÍno]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4-mcthylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-ammo-4-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9J/-purin-2yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, ,V6-(2-amino-3-methoxy lbenzyl)-/V2-(2-aminopropyl)-9isopropyl-9H-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, N -(2-amino-3-methoxylbenzyl)-N -(4aminocyclohexyl)-9-isopropyl-977-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-3methoxylbenzyl)amÍno]-9-Ísopropyl-9//-purin-2-yl}ammo)-2-methyl-propan-2-ol, l-({6-[(2amino-3-methoxybenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3-({6-[(2amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan-2-ol, 4({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9Z/-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopiOpyl-97/-purin-2-yl}amino)2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/Apurin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/fpurin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-3-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7purin-2-yl} amino)-2-methyl-propan-2-ol, 1 -({6- [(2-amino-5-methoxybenzyl)amino] -9isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 2-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9cyclohexyl-9//-purin-2-yl} amino) butan-1 -ol, A^-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-jV2-(2aminopropyl)-9-isopropyl-9//-purine-2,6-diamine, 2-({6-[(2-amino-5-fluorobenzyl)amino]-9isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-3-methyl-butan-l-ol, N6-(2-amino-5-methoxylbenzyl)-N2-(4aminocycIohexyl)-9-isopropyl-9H-purine-2,6-diamine, l-({6-[(2-amino-5methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol, 3-({6-[(2amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9J/-purin-2-yl)amino)-2-methyl-butan-2-olí 4({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methyl-butan2-ol, 4-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-arnino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-97/-purin-2-yl}amino)2,3-dimethyl-butan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2yl}amino)-2-methyl-pentan-2-ol, 3-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9žfpurin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-amino-5-methoxylbenzyl)amino]-9-isoopropyl-9/7purin-2-yl}amino)-2-methyl-propan-2-ol.
  4. 4. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jako léčiva.
  5. 5. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároků 1 až 3 pro použití jako inhibitory CDK.
  6. 6. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároků 1 až 3 pro použití při léčbě onemocnění zahrnujících buněčnou proliferaci.
  7. 7. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároků 1 až 3 pro použití při léčbě virových infekcí.
  8. 8. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároku 7 kde je virální infekce vyvolána živočišnými a lidskými DNA viry, zejména lidskými cytomegaloviry (HCMV), herpes simplex viry typu 1 a 2 (HSV-1 a HSV-2), varicella zoster viry (VZV),Epstein Barrove viry (EBV), lidskými herpesviry typu 6, typu 7, typu 8, bovine herpesviry typu 1, equine herpesviry type 1, papillomaviry (HPV typy 1-55, včetně karcinogenních HPV), adenoviry všech typu, poxviry, polyomavirus, papovavirus
  9. 9. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároků 1 až 3 pro použití pro eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v systémech tkáňových kultur při produkci biofarmaceutických nebo jiných produktů, jakými jsou proteiny a vakcíny, pro eliminaci nebo redukci virového šíření nebo růstu v klinických vzorcích, jakými je např. krev, anebo k zastavení růstu tkáňových buněčných kultur při zachování schopnosti buněk produkovat proteiny a sekundární metabolity (antibiotika, sekundární rostlinné produkty, apod.).
  10. 10. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároků 1 až 3 pro použití při léčbě onemocnění, jejichž podstata je založena na buněčné proliferaci, a která zahrnují nádory, restenózu, psoriázu, revmatickou artritis, diabetes I. typu, roztroušenou sklerózu, Alzheimerovu chorobu, parazitozy způsobené živočichy, houbami anebo prvoky, restenózu, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease), dnu a proliferační onemocnění kůže.
  11. 11. Substituované 6-(2-aminobenzylamino)purinové deriváty podle nároků 1 až 3 pro použití k indukci apoptózy v savčích buňkách.
  12. 12. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden substituovaný 6(2-aminobenzylamino)purinový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a farmaceuticky přijatelné nosiče.
  13. 13. Farmaceutický přípravek podle nároku 12, dále obsahující jednu nebo více farmaceutických pomocných látek.
  14. 14. Farmaceutický přípravek podle nároku 12, dále obsahující cytostatikum vybrané ze skupiny zahrnující mitoxantron, cis-platinu, methotrexat, taxol a doxorubicin.
  15. 15. Farmaceutický přípravek podle nároku 12, dále obsahující virostatikum vybrané ze skupiny zahrnující acyclovir, cidofovir. tamiflu a ribavirin.
CZ20090045A 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující CZ302122B6 (cs)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090045A CZ302122B6 (cs) 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující
EP10716265.3A EP2391626B1 (en) 2009-01-28 2010-01-22 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
PCT/CZ2010/000004 WO2010085924A2 (en) 2009-01-28 2010-01-22 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
US13/146,339 US9023857B2 (en) 2009-01-28 2010-01-22 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
ZA2011/04945A ZA201104945B (en) 2009-01-28 2011-07-05 Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090045A CZ302122B6 (cs) 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200945A3 true CZ200945A3 (cs) 2010-08-04
CZ302122B6 CZ302122B6 (cs) 2010-10-20

Family

ID=42269979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20090045A CZ302122B6 (cs) 2009-01-28 2009-01-28 Substituované deriváty 6-(2-aminobenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a prípravky tyto slouceniny obsahující

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9023857B2 (cs)
EP (1) EP2391626B1 (cs)
CZ (1) CZ302122B6 (cs)
WO (1) WO2010085924A2 (cs)
ZA (1) ZA201104945B (cs)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2634190A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-04 Lead Discovery Center GmbH Pyrazolo-triazine derivatives as selective cyclin-dependent kinase inhinitors
CN102743387A (zh) * 2012-03-16 2012-10-24 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 6-(苄基氨基)-2-[[1-(羟甲基)丙基]氨基]-9-异丙基嘌呤的新用途
CZ306894B6 (cs) * 2013-02-08 2017-08-30 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci 2-Substituované-6-biarylmethylamino-9-cyklopentyl-9H-purinové deriváty, jejich použití jako léčiva a farmaceutické přípravky tyto sloučeniny obsahující
CN104936959B (zh) * 2013-03-08 2018-09-18 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 2,6,9-三取代嘌呤衍生物及其制备方法与应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2741881B1 (fr) * 1995-12-01 1999-07-30 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de purine possedant notamment des prorietes anti-proliferatives et leurs applications biologiques
US5866702A (en) * 1996-08-02 1999-02-02 Cv Therapeutics, Incorporation Purine inhibitors of cyclin dependent kinase 2
ES2246829T3 (es) * 1999-02-01 2006-03-01 Cv Therapeutics Inc Inhibidores purinicos de cinasa 2 y de ikb-alfa dependientes de ciclina.
FR2793794B1 (fr) * 1999-05-21 2001-07-27 Hoechst Marion Roussel Inc Nouveaux derives de la purine, leur procede de preparation, leur application a titre de medicaments, compositions pharmaceutiques et nouvelle utilisation
AU3540101A (en) * 2000-01-07 2001-07-16 Universitaire Instelling Antwerpen Purine derivatives, process for their preparation and use thereof
ATE497603T1 (de) * 2001-03-02 2011-02-15 Gpc Biotech Ag Drei-hybrid-assaysystem
GB0219052D0 (en) * 2002-08-15 2002-09-25 Cyclacel Ltd New puring derivatives
GB0219054D0 (en) * 2002-08-15 2002-09-25 Cyclacel Ltd New purine derivatives
FR2876583B1 (fr) * 2004-10-15 2007-04-13 Centre Nat Rech Scient Cnrse Utilisation de derives de purines pour la fabrication de medicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liees a un defaut d'adressage des proteines dans les cellules
CA2633400A1 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Bayer Healthcare Ag Diaryl urea for treating virus infections
CZ302711B6 (cs) * 2009-06-03 2011-09-14 Univerzita Palackého v Olomouci Substituované deriváty 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a farmaceutické prípravky tyto slouceniny obsahující

Also Published As

Publication number Publication date
CZ302122B6 (cs) 2010-10-20
EP2391626A2 (en) 2011-12-07
US9023857B2 (en) 2015-05-05
US20110287111A1 (en) 2011-11-24
WO2010085924A2 (en) 2010-08-05
ZA201104945B (en) 2012-03-28
WO2010085924A3 (en) 2010-09-30
EP2391626B1 (en) 2014-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6316456B1 (en) Purine derivatives having, in particular, antiproliferative properties, and their biological uses
AU2004264419B2 (en) 6-substituted anilino purines as RTK inhibitors
US6303618B1 (en) Cyclin dependent kinase inhibiting purine derivatives
AP91A (en) Dideoxydidehydrocarbocyclic nucleosides.
RU2191777C2 (ru) 6,9-дизамещенные 2-[транс-(-4-аминоциклогексил)амино]пурины
US20060035909A1 (en) Azapurine derivatives
KR0127137B1 (ko) 디데옥시디데히드로카르보시클릭 뉴클레오시드
BRPI0807182A2 (pt) Compostos e composições como inibidores de cinase
CZ20022353A3 (cs) Deriváty purinu, způsob jejich přípravy a jejich použití
KR20080081177A (ko) 야누스 키나아제 억제제인 술폰아미도아닐린 유도체
CZ658390A3 (en) Enantiomeric purine derivatives, process of their preparation, pharmaceutical compositions containing thereof and their use
US9174990B2 (en) 2-amino-9-[(2-hydroxymethyl) cyclopropylidenemethyl] purines as antiviral agents
JPH11139976A (ja) 治療用ヌクレオシド類
EP2391626B1 (en) Substituted 6-(2-aminobenzylamino)purine derivatives, their use as medicaments and preparations containing these compounds
WO2009069132A2 (en) Novel reverse transcriptase inhibitors
US9957273B2 (en) 5-substituted 7- [4-(2-pyridyl)phenylmethylamino] -3-isopropylpyrazolo4,3-D]pyrimidine derivatives, use thereof as medicaments, and pharmaceutical compositions
WO2017040693A1 (en) Broad spectrum antiviral compounds and uses thereof
CZ2009359A3 (cs) Substituované deriváty 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a farmaceutické prípravky tyto slouceniny obsahující
JP2004517930A (ja) サイクリン依存性キナーゼ阻害プリン誘導体類
US11186583B2 (en) 5-alkylthio-7-[(4-arylbenzyl)amino]-1(2)H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidines for treatment of lymphoma
EP0394346A1 (en) Pyrimidine and purine 1,2-butadiene-4-ols as anti-retroviral agents
KR20070017938A (ko) Ｒｔｋ 억제제로서의 6-치환된 아닐리노 퓨린

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180128