CZ302711B6

CZ302711B6 - Substituované deriváty 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a farmaceutické prípravky tyto slouceniny obsahující

Info

Publication number: CZ302711B6
Application number: CZ20090359A
Authority: CZ
Inventors: Zatloukal@Marek; Kryštof@Vladimír; Havlícek@Libor; Popa@Igor; Doležal@Karel; Strnad@Miroslav; Jorda@Radek
Original assignee: Univerzita Palackého v Olomouci; Biopatterns, S. R. O.
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2011-09-14
Also published as: US20120070512A1; CZ2009359A3; ZA201107883B; EP2438068B1; WO2010139289A1; EP2438068A1; US8492391B2

Abstract

Rešení se týká nových substituovaných 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu obecného vzorce I, ve kterém mají obecné symboly(R).sub.n.n., R2, R9 specifický význam, jako polyspecifických inhibitoru cyklin-dependentních kinas 2, 5, 7 a 9 a jejich použití jako léciv pri lécbe onemocnení, zejména takových, která kombinují bunecnou hyperproliferaci se zánetlivými onemocneními. Rešení dále zahrnuje farmaceutické prípravky obsahující tyto substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)puriny.

Description

Substituované deriváty 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu, jejich použití jako léčiva a farmaceutické přípravky tyto sloučeniny obsahující

Oblast techniky

Tento vynález se týká nových substituovaných 6-(2-hydroxybenzylamino)purinů, majících účinky polyspecifických inhibitorů cyklin-dependentních kinas 2, 5, 7 a 9 ajejich použití jako léčiv.

Dosavadní stav techniky

Cyklin-dependentní kinasy jsou heterodimerické komplexy skládající se z katalytické kinasové subjednotky a regulační cyklinové subjednotky, a zahrnují rodinu kinas rozdělených do dvou skupin podle jejich role v progresi buněčného cyklu a transkripční regulaci (Meyerson M. et aL: EMBOJ. 11: 2909-2917, 1992). Členové první skupiny obsahují klíčové komponenty buněčného cyklu a zahrnují cyklin D-dependentní kinasy 4 a 6 společně scyklin E-CDK2 komplexem, který sekvenčně fosforyluje retinoblastomový protein (Rb) a napomáhá tak Gl-S přechodu (Sherr, C. J.: Cell 79: 551-555, 1994). Cyklin A-dependentní kinasa 2 a 1 a cyklin B-CDK1 komplexy jsou potřebné pro řádnou progresi S-fází a pro G2-M přechod CDKs jsou regulovány pozitivní fosforylací řízenou CDK-aktivační kinasou (CAK; cyclin H/cdk7/MATl, Harper, J. W. et al.: Genes Dev. 12: 285-289, 1998), stejně jako negativními fosforylačními kroky (Morgan, D. O.: Nátuře 3Ί4: 131-134, 1995), a rovněž jejich asociací s cykliny a endogenními Cip/Kip nebo INK4 inhibitory (Sherr, C. J. and Roberts, J. M.: Genes Dev. 9: 1149-1163, 1995).

V maligních buňkách je pozměněna exprese cdk ajejich modulátorů, včetně overexprese cyklinů a ztráty exprese CDK inhibitorů, což vede k deregulaci cdk aktivity, která dává buňkám selektivní růstové výhody. Na rozdíl od cdk zodpovědných za přechody mezi jednotlivými fázemi buněčného cyklu existují transkripční cdk zahrnující cyklin H-CDK7 a cyklin T-CDK9 (pTEFb), které podporují iniciaci a elongaci tvořících se RNA transkriptů, a to fosforylací terminální karboxydomény (CTD) RNA polymerasy II (Meinhart, A. et al.: Gens. Dev. 19: 1401-1415, 2005). Vzhledem ke kritické úloze v progresi buněčného cyklu a buněčné transkripci a díky asociaci jejich aktivit s apoptotickými drahami tvoří tyto cdk atraktivní cíle pro vývoj nových protinádorových látek.

První popsané farmakologické inhibitory CDK (6-dimethylaminopurin a isopentenyladenin) nebyly ani účinné, ani selektivní. Nicméně daly základ inhibičním strukturám a zahájily epizodu screeningu mnohem účinnějších a selektivnějších inhibitorů. Dnes je známo více než 50 inhibitorů, z nichž některé jsou aktivní v nanomolámích koncentracích. Jejich struktury byly nedávno shrnuty v přehledném článku (Fischer, Ρ. M., Gianella-Borradori, A.: Expert Opin. Investig. Drugs 14: 457-469, 2005). Navzdory značné chemické diversitě vykazují všechny inhibitory určitě společné vlastnosti: (1) mají malou molekulovou hmotnost (<600); (2) jsou to ploché, hydrofóbní heterocykly; (3) fungují jako kompetitory ATP pro vazbu v kinasovém ATPvazebném místě; (4) jsou vázány především hydrofobními interakcemi a vodíkovými můstky ke kinase; a (5) páteřní karbonyl a amino postranní řetězec Leu83 funguje jako akceptor H-vazby a inhibitory jako donor H-vazby, kdežto páteřní karbonyl Glu81 většinou funguje jako akceptor H-vazby. Atomární interakce mezi inhibitory a CDK je extenzivně popsána (Harcasstle, I. R. et al.: Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 325-348, 2002). Inhibitory CDK, které fungují jinými mechanismy než vazbou ATP, nebyly dosud popsány, navzdory intenzivnímu screeningu a navzdory dalším zřejmým možnostem inhibice kinas (např. kompetice se substrátem, interference vazbou cyklinu a simulace přirozených proteinových inhibitorů).

V rámci skupiny CDK kinas se dají CDK inhibitory rozdělit do tří CDK kategorií, pan-cdk inhibitory (např. deschlorflavopiridol, flavopiridol, oxindol 16 a oxindol 91) a ty, které inhibují CDK1/2/5 (a pravděpodobně CDK9) (např. olomoucin, (R)-roskovitin, purvalanol B, aminoCZ 302711 B6 purvalanol (NG97), hymenialdisine, indirubin-3'-monoxim, indirubin-5-sulfonát, SU9516 a alsterpaufon) a dále ty, které jsou selektivní pro CDK4/6 (např. fascaplysin, PD0183812 a CINK4). Existuje pouze velmi limitovaný soubor inhibitorů specifických pro jednotlivé CDK. To je zřejmě způsobeno zachováním aminokyselin lemujících CDK ATP-vazebné místo (Sharipo,

G. 1.7 Clin. Oncol. 24: 1770-1783,2006).

Terminál ní karboxy’-domé na (CTD) RNA polymerasy II je regulována fosfory Iací zprostředkovanou cdk. CTD lidské RNA polymerasy II obsahuje 52 tandemových opakujících se souhlasných heptapeptidových sekvencí. Cyklin I -CDK9 (rovněž nazývaný P-TEFP) přednostně fosfoio ryluje Ser2 místo teto sekvence za účelem podpory transkrípční elongace. Je pravděpodobné, že cyklin T-CDK9 může fosforylovat rovněž posici Ser5 (Palancade, B„ Bensaude, O.: Eur. J. Biochem. 270: 3858-3870, 2003). Cyklin H-CDK7/MATI, v komplexu s transkripčním faktorem

TF1IH, přednostně fosforyluje Ser5, která napomáhá aktivaci promotoru a iniciaci transkripce (Meinhart, A. et al.: Cens. Dev. 19: 1401-1415, 2005). Cyklin H-CDK7 proto hraje dvojí úlohu, is a to jako CDK buněčného cyklu i transkripční; funguje tedy jako CAK i CTD kinasa.

Flavopiridol je nejúčinnější známý inhibitor CDK9 (Chao, S. H., Price, D. H.: J. Biol. Chem. 276: 31793-31799, 2001). Zatímco hodnoty IC₅o pro ostatní cdks se pohybují v rozmezí 100 až 400 nmol/1 s hodnotami Kj mezi 40 a 70 nmol/l, vazba flavopiridolu do ATP vazebného místa

2o CDK9 je významně těsnější (Kj = 3 nmol/1). Z těchto důvodů má inhibice CDK9 flavopiridolem, stejně jako CDK7, významný vliv na buněčnou transkripci (Lu, X. et al. Mol. Cancer Ther. 3: 861-872, 2004). Seliciclib'** (/ř-roskovitin) rovněž inhibuje cyklin T-CDK9 a cyklin H—CDK7 vedle inhibice cyklin E-CDK2 (McClue, S. J. et al. Int. J. Cancer 102: 463-468, 2002) a ovlivňuje fosfory láci RNA polymerasy II CTD, která je asociována s poklesem Mcl-1 spolu s dalšími antiapoptotickými proteiny v CCL buňkách (Alvi, A. J. et al. Blood 105: 4484-4491, 2005). Proapoptotická aktivita flavopiridolu i seliciclibu v buněčné linii mnohočetného myelomu funguje podobným mechanismem (Raje, N. et al. Blood 106: 1042-1047, 2005).

Naše současná práce je zaměřena na vývoj nové třídy sloučenin zacílených s vysokou účinností ío do buněčného cyklu a s rozdílnými účinky na transkripční CDK7 a 9. Některé tyto inhibitory již byly popsány a pochází z rozdílných skupin sloučenin, např. puriny (Olomoucin II, Kryštof V. et al. Cell Mol. Life Sci. 62, 1763-1771, 2005) a arylazopyrazoiy (Kryštof, V. et al. J. Med. Chem.

49: 6500-6509, 2006). Na základě našich znalostí interakcí inhibitor/CDK7/9 jsme vyvinuli další řadu inhibitorů, která je účinná při koncentracích blízkých buněčným koncentracím kinas.

Série substituovaných derivátů 6—(2-hydroxybenzylamino)purinu podle tohoto vynálezu je použitelná jako inhibitory cyklin-dependentní kinasy 2, 5, 7 a 9. Tato skupina nových purinových derivátů je charakteristická nejen neobvyklou CDK inhibiční aktivitou doprovázenou silnými proti nádorovým i vlastnostmi, ale i velmi silnými protizánětlivými účinky. Proto mohou být tyto to látky použity jako antimitotická, apoptotická a protizánětlivá léčiva, s výhodou zejména u nádorů doprovázených záněty. Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout sloučeniny s proti nádorovou a protizánětlivoLi (antiinflamatomí) aktivitou, látky mající vysoký index selektivity a účinnosti, tedy jsou méně toxické a přitom efektivnější než doposud známá analoga.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou substituované 6—(2-hydroxybenzylamino)purÍny obecného vzorce I

ίΐλ kde (R)_n znamená l až 4 substituenty (n je 14), které mohou být stejné nebo rozdílné, přičemž tyto substituenty jsou vybrané ze skupiny zahrnující alkyl, alkoxy, amino, halogen, merkapto a nitro skupinu, a

R2 je R2-NH-, ve kterém tu

R2' znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyl, aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin případně může být substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino, hydroxy, merkapto, a alkoxy skupinu, a

R9 znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyl, aryl a arylalkyl skupinu, ve formě raeemátu nebo opticky aktivních isomerů, ajejich farmaceuticky přijatelné soli s alka20 lickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adičních solí s kyselinami.

Předmětem vynálezu jsou substituované 6~(24iydroxybenzylamÍno)puriny obecného vzorce I pro použití jako léčiva.

Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)puriny obecného vzorce 1 pro použití jako inhibitory cyklin-dependentních kinas (CDK), s výhodou CDK 2, 5, 7 a/nebo 9.

Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)puriny obecného vzorce 1 pro použití pro inhibicí buněčné proliferace a/nebo indukci apoptózy.

Předmětem vynálezu jsou dále substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)puriny obecného vzorce I pro použití pro výrobu léčiv pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferaci, jakými jsou nádory, restenóza, revmatická artritis, psoriáza, diabetes I. typu, roztroušená skleróza,

Alzheimerova choroba, parazitózy způsobené živočichy houbami a/nebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease) a dna.

Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I pro použití při léčbě onemocnění vybraných ze skupiny zahrnující nádory, astma, kardiovaskulární, neurodegenerativní a zánětlivá onemocnění.

-3 CZ 302711 B6

Předmětem vynálezu je dále způsob inhibice CDK, zejména selektivní inhibice CDK 2. 5, 7 a/nebo 9, inhibice buněčné proliferace a/nebo indukce apoptózy u savců, která zahrnuje podání terapeuticky účinného množství kompozice obsahující látku obecného vzorce 1 savcům. Tyto CDK inhibiční molekuly jsou vhodné pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferaci, jakými jsou nádory, restenóza, revmatická artritis, lupenka, diabetes I. typu, roztroušená skleróza, Alzheimerova choroba, parazítózy způsobené živočichy, houbami nebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease) a dna, a při léčení onemocnění, která kombinují buněčnou hyperproliferaci se zánětlivými onemocněními.

ío Kromě ostatních CDK-příbuzných kinas, CDK 2, 5, 7 a 9 kinasy kontrolují určité kroky cyklu buněčného dělení, zejména přechod z Gi fáze do S fáze a dále pak přechod z G? fáze do M fáze. V rámci tohoto zjištění lze předpokládat, že sloučeniny obecného vzorce I ajejich farmaceuticky přijatelné soli mohou být použity jako antimitotické látky a pro léčbu proliferativních onemocnění. Při velmi nízkých koncentracích (mikromolární a nižší) jsou schopné inhibovat přechody t5 buněčného cyklu (G₍/S, G₂/M, M-fáze/metafáze), které probíhají v živočišných tělech a v embryích. Kromě toho jsou tyto sloučeniny použitelné při léčbě autoimunitních onemocnění, např. revmatoidní artritidy, lupenky, diabetů I. typu, roztroušené sklerózy; při léčení Alzheimerovy a Parkinsonovy choroby, kardiovaskulárních onemocnění, jakými jsou restenóza, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease), dny a při léčení nádorů, polycystického onemocnění

2o ledvin a ostatních proliferativních onemocnění, jejichž pathogenese zahrnuje abnormální buněčnou proliferaci.

Kromě terapeutických aplikací (pro lidské a veterinární použití) mohou být sloučeniny obecného vzorce I použity jako aditiva ve tkáňových kulturách pro kontrolu stavů proliferace anebo dífe25 renciace buněk in vitro, například cestou kontroly hladin aktivace CDK 2, 5, 7 a/nebo 9.

Látky podle vynálezu inhibují katalytickou aktivitu cyklin—dependentních kinas prostřednictvím interakce těchto sloučenin s ATP-vazebným místem těchto enzymů. Takovéto sloučeniny jsou zejména žádoucí pro redukci nadměrného buněčného růstu, neboť umožňují inhibici kinasové

3(i aktivity bez ohledu na příčinu nadměrné kinasové aktivity vedoucí k hyperproliferaci. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou tedy aktivní v situacích, ve kterých je mutovaná kinasa hyperaktivní, a situacích, ve kterých je kinasa přítomná ve zvýšených hladinách. Sloučeniny podle vynálezu mohou rovněž blokovat nadbytečnou kinasovou aktivitu v situacích, kdy cyklin regulující danou kinasu je přítomen v nadbytečných hladinách, neboje mutován či je jeho vazba k CDK zvýšená.

Konečně, sloučeniny podle tohoto vynálezu, které blokují kinasovou aktivitu prostřednictvím interakce s ATP vazebným místem enzymu, jsou rovněž vhodné pro inhibici kinasové aktivity v situacích, kdy přirozený proteinový inhibitor CDK-cyklín komplexů je mutován.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-(2-hydroxybenzylamino)purínů obec4o ného vzorce I pro léčení onemocnění zahrnující zapojení CDK5. Angiostatinem-indukovaná inhibice proliferace/apoptózy endotheliálních buněk je asociovaná s down—regulací regulačními proteiny buněčného cyklu - CDK5. CDK5, p35, a p25 proteiny byly všechny exprimovány v invazivních nádorových buňkách, ale rovněž se ukázalo, že exprese CDK5 reguluje proliferaci nádorových buněk. Kromě toho, účinný mitogen pFGF up-reguluje expresi CDK5. Nové deri4? váty specificky inhibují dávkově-závislou expresi/aktivitu CDK5 s doprovodnou inhibici proliterace v invazivních nádorových buňkách a indukcí apoptózy.

Cyklin dependentní kinasa-5 (CDK5) je rovněž exprimována v neuronálních buňkách a hraje důležitou úlohu v růstu neuronů, migraci neuronů a neurogenezi, její frakce v neneuronalních so buňkách je nejasná. CDK5 je exprimována ve vysokých hladinách v bovinních aortálních buňkách (BAE), na rozdíl od nevýznamně nízkých hladin exprese CDK5 v klidových BAE buňkách.

Kromě toho, pFGF up-reguluje expresi CDK5 v dávkově-závislém modelu. Angiostatin (AS) inhibuje proliferaci EC v dávkově-závislém modelu s doprovodnou down-regulací exprese

CDK5. Úloha CDK5 v proliferaci a apoptóze EC byla potvrzena selektivní inhibici CDK5 nový-4 CZ 3027 Π B6 mi purinovými deriváty, které inhibují pFGF-stimulovanou proliferaci BAE buněk a indukují dávkově-závislou apoptosu.

Předmětem vynálezu jsou rovněž substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)puriny obecného vzorce I pro použití pro aktivaci nádorového supresoru p53, který je vlastní všem savčím buňkám, kde působí jako přirození supresorický gen zastavující nekontrolované buněčné dělení (nádory) a je schopen vypnout nádorový vývoj buněk. p53 stejně jako retinoblastový protein (pRb) jsou dobře charakterizované nádorové supresory, jejichž inaktivace může vést k nekontrolované proliferaci a malignitě. Fosfory láce těchto dvou proteinů, kteréjsou zapojeny do regulační nich mechanizmů buněčného cyklu, moduluje významně jejich funkci a aktivitu. Z toho vyplývá, že silně aktivní regulátory p53 představují vhodný nástroj pro terapii nádorových onemocnění a to cestou indukce wild typu p53 proteinu ve vybraných typech nádorů.

Studie probíhající s deriváty podle tohoto vynálezu prokázaly, kromě jiného, silný účinek na is apoptózu v řadě nádorových buněčných linií. Bylo pozorováno, že apoptóza může být indukována ve fázi Gi nebo G₂ a v souvislosti s poškozením DNA; některé buňky zastaví v G₍ fázi a p53dependentní apoptotická dráha je poté indukována. V jiných situacích dochází k tomu, že buňky zastavují v G₂/M přechodu jako reakce na poškození DNA a pak je pozorována aktivace p53— nezávislé apoptotické dráhy. Tato dráha je zejména významná v terapii nádorů, u kterých je zo pozorován nedostatek aktivního p53. Je proto důležitá i aplikace nových derivátů, které stimulují p5 3-nezávis lou apoptózu v buňkách, které se zastavily v G₂ fázi vlivem poškození DNA při použití léčiv, jakými jsou mitoxantron nebo cis-platina. CDK inhibitory z tohoto vynálezu tak mohou zvýšit terapeutický potenciál současně používaných protinádorových látek.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden substituovaný 6-(2~hydroxybenzylamino)purin obecného vzorce 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

Nové sloučeniny mohou být podle tohoto vynálezu použity jako takové a nebojako intermediáty při přípravě nových sloučenin majících řadu diagnostických, terapeutických a průmyslových io použití.

Výše uvedené generické skupiny mají významy uvedené v následující legendě: alkoxy znamená skupinu -O-R_a, kde R_a je alkyl nebo cykloalkyl, amino znamená skupinu -NH₂, halogen je vybrán ze skupiny zahrnující atomy fluoru, bromu, chloru a jodu, hydroxy znamená skupinu -OH, merkapto znamená skupinu -SH, alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 uhlíkových atomů, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, i sopropy 1, butyl, isobutyl, pen40 tyl, ísopentyl, hexyl, isohexyl;

alkenyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 7 uhlíkových atomů, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující vinyl, allyl, 1-propenyI, 1-methylethenyl, but1 až 3-enyl, pent-1 až 4-enyl, isopentenyl, 3,3-dimethylallyl, hex-1 až 5-enyl, hept-1 až 6enyl, cykloalkyl znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 15 uhlíkových atomů, přednostně cyklopropyl, cyklohexyl nebo cyklopentyl, cykloalkyl alkyl znamená skupinu -R_D(cykloalkyl), kde cykloalkyl znamená cykloalkylovou skupinu, jak definováno výše, a R_b je alky lenová můstková skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, aryl znamená aromatickou karbocyklíckou skupinu obsahující 6 až 18 uhlíkových atomů a tvořenou alespoň jedním aromatickým kruhem nebo násobně kondenzovanými kruhy, z nichž alespoň jeden kruh je aromatický, s výhodou aryl je fenyl,

CZ 302711 Bó arylalkyl znamená skupinu -R_c-Ar, kde Ar znamená arylovou skupinu a R_c je alkylenová můstková skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, s výhodu methylen.

Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I mohou být ve formě (A) nebo (.7) isomerů v případě chirality v pozici R2.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou deriváty obecného vzorce 1 ze skupiny zahrnující: 2-{[6 [(2-hydro\y -5 chlorbenzyl)amino]-9-{methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylj-9//-purin-2-yi}amino)butan-l-ol, V-(2-hYdro\y-5—chlorbenzyl)-/V -{2aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6—diamin,

2- <{6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyljamino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3 -pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl }amino)-3-methylbutan-l-ol, A^2-hydroxy-5—chlorbenzyl)-;Y‘^? -(4aminocyklohexyl}-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6— diamin, [(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-ýmethyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl. cyklohexyl, benzy l)-9/ř-purin-2-y 1} amino)~2-methy i pro pa n-2-ol, 3—({6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-{methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-{{6-[(2-~hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4—({6[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9H— purin—2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, I—({6—[(2— hydroxy—5-chlorbenzyl)amino]—9— (methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 4({6 -[(2--hydroxy-5-chIorbenzyljamino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl}amino}-2,3-dimethylbutan—2-ol, 3-({6—[(2—hydroxy—5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylj-9//_purÍn-2-yl}amino)-2methvlpentan-2—ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, [(2—hydroxy—5—chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 2-( {6-[( 2-h ydroxy-3-c h 1 orbenzyl jam i no]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylj-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, V-(2-hydroxy-3chlorbenzyl)-A^f-(2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylý9//-purin-2,6-diamin, 2-{ {6-[( 2-hy droxy-3-ch i orbenzyl jam i no]-9-{methyl, ethyl, isopropyl,

3- pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-3-methylbutan—l-ol, .V^<1-(2-hydroxy-3chlorbenzyl)-2V²-(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3—pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-dÍamin, _;V-(2-hydroxy-3-ch]orbenzyl>íY'(4-aminocyklohexyl)-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy lj-9//-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2hy d roxy-3 -ch I orbenzyl jam i no]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9 Zipu r i n—2yl} amin o)propan-2-ol, I -{{6-[( 2-h y d roxy-3 -ch 1 orbenzyl jam i no]-9-{ methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin—2—yl}amino)—2—methylpropan—2—ol, 3-({6— [(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-y 1} am ino)-2-methy I butan-2-ol, 4-( {6-[(2-hydroxy-3-chlorbenzy I jam i no]-9(methyl. ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy 1)-9//- purin—2-yl}amino)-2—methy 1butan-2-ol, 4 ({6 [(2 hvdroxy-3 chlorbenzyl)aminoJ-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-metliylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3chlorbenzyi)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl} amtno)-2,3—dimethyl butan-2-ol, 3-( {6-[(2-hydroxy-3 -ch 1 orbenzyl jam ί π o]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylj-9/7-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin--2-yl]amino}pentan-2--ol, l-({6-[(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}am!no)-2-methylpropan-2-ol, 2-({6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl jam inoj-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)butan~l-ol, ,Y^ťl-(2-hydroxy-5-fIuorbenzyl)-A^r2-(2aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino]-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 2-({6-[(2-hydroxy-5-fhiorbenzyl)aminoJ(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy 1)—9/Y—purin—2—yIJamino)-3-methyl-6CZ 302711 Β6 butan-1-ο 1, A^,,(>-(2-hydroxy-5--fluorbenzyl)-A^r'⁷-(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-W-punn-2,6-diamin, 1 -< {6-[(2-hydroxy-5- fluorbenzyl)amino]-{methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//~purin~2-yl}amino)2- methylpropan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino]-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan—2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy5-fluorbenz\l)amino]-(rnethvb ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purtn-2yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purÍn-2-yl}amino)-2-methylpentan~2-ol, 4-({6[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yí}amino)-2,3-dimethylbutan-2-o1, 3-( {6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-oí, l-({6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 2-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)butan-l—ol, A^/6-(2-hydroxy-5-jodobenzyl)-A^r2-(2-amÍnopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purÍn-2,6-diamin, 2-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2-yl)amino}-3~methylbutan-l-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]~9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, bV^ó-(2-hydroxy-5jodobenzyl)~A^r2-(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan~2--ol, 3-({6[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)aminol-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9H-purin_2-yl}amÍno)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl. 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9,ř/-purin-2~yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/7-purin-2-yl}amino)~2,3-dimethylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-y1 }amino)-2-methylpentan-2-ol, 3—({6— [(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino)pentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-jodoben2yl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2—methylpropan-2-ol, 2-({6— [(2-hy d roxy-5~methylbenzyl)am ino J-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/f-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, A^-(2-hydroxy-5-methylbenzyl)-A^r2-(2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl>-9H purin-2.6-diamin, 2({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/ř-purin-2-yl }amino)-3-methylbutan- l-ol, V’-(2-hydroxy-5-rrtethylbenzyl)-.Y’-(4 ·aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9íř-purin-2,6diamin, A*—(2-hydroxy-5-methy lbenzyl)-A-(4-aminocyklohexy 1)-9-( methyl, ethyl, isopropyl,

3- pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, 1 —({6—[(2-hyd roxy-5-methyl benzyl )amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2methylpropan-2-ol, 1 -({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-{methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9Z/~purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl)amino)-2-methylpentan-2-ol. 4-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino}-2,3-dimethylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino}-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl|amino}pentan-2-ol, 1 -({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino)-2methylpropan-2-ol, 2-((6- [(2CZ 302711 B6 hydroxy-3-methylbenzyl)aminoJ-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-punn--2-yl }amino)butan-l-ol, V'-(2-hvdroxy-3-methy lbenzy (2-aminopropy l)-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9ř/-purin-2,6-diamin, 2—(f6—[(2— hydro\\-5-11 uorbcn/yl)amiπο] 9· (methyL ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//“ purin-2-yl} amino )-3-niethylbutan-l-ol, .V' (2-hydro.\y--3 methylbenzyl) A -(4 aminoeyklohexyl)-9-(methyl. ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl}-9/Y-purin-2,6-diamin. hydro.\y--3-inethylbenzyl)A'“(4aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6--diamin, l-{ {6-[(2-hyd roxy-3-m ethy lbenzy l)am i no]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-ylíamino)-2-methylpropan-2-ol, 1-({6-[(2-hy d roxy-3-m et hyl benzy l)am i no]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-ylíamino)propan—2-ol, 3-({6—[(2-hydroxy-3-methylbenzy 1)amino]-9—(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl}amino)butan-2-ok 4-{ {6-[( 2-hydroxy-3-methyl benzy l)am i no |-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3—pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)“2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-methyIbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-punn-2-yl}aiTiino)-2,3-dimethylbutan-2—ol, 3({6-[(2-hydroxy-3-methy lbenzy l)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-3-methy lbenzy I)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)pentan—2—ol, l-( (6-[(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino]-9—(methyl, ethyl, isopropyl, 3—pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 2-({6-[(2-hydroxy-3methoxybenzyl)amino]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl ] amíno)butan-l-ol, .V--(2-hydroxy--3methoxybenzyl)--.'V²-(2-aminopropyl)—9—(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, 2-( {6-[(2-hydroxy-3methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purÍn-2— yl}amino)-3-methylbutan-l-ol, A/⁶-(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)-A^f2-(4-aminocyklohexyl)9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, AČ-(2hydroxy-3-methoxybenzy!)-jV²-(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amÉno]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9H-purin-2-yl }amino)-2-methyIpropan-2-ol, l-({6-[(2-liydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2-yl}amino)propan-2-ol1 3-{{6-[(2-hydroxy-3methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-{methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purÍn-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-{methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4~({6-[( 2-hy droxy-3-methoxybenzyl)aminoJ-9—(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2,3dimethylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-{methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-punn-2-yl}annino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 3-({6-[(2hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3 -Gó--[( 2-hy droxy-3-methoxy benzy l)am i no] 9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, !-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyÍ, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9Á/-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 1 -{{6-[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)propan-2—ol, 2-( J6-[(2 hydroxy -5-mcthoxybenzyl)aniino|-9-(methyk ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, A^<,(2hydroxy5-methoxybcn/y!)-,V² (2 -arninopropyl> 9-<methyi, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy 1)-9//purin-2,6-dÍamín, 2-( J6-[(2-hydroxy-5 -fluorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-3-methylbutan-l-ol, ý’-(2-hydroxy-5methoxvbenzyl)-JV-(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/7-purin-2,6-dÍamin. A/^řl-(2-hydroxy-5-i'nethoxybenzyl)-jV²-(4-aminocyklohexyl)-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, btmzyl) 9/7-purin-2,6—diamin, t—({6—[(2-8CZ 302711 B6 hydroxy- 5- methoxybenzvl)amino]-9-(niethyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9tf-purin-2~yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-methoxy benzy l)amino|9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//~purin-2-yl}amÍno)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy~5-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyi, cyklohexyl, benzyl)-9H-purin-2-yl}amino}-2-methylbutan-2-ol, 4-({6~[(2-hydroxy5-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin2~yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4~({ó-[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino]-9-(methy 1, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2ol, 3-({6“[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino]—9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/ř-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl]amino}pentan-2~ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ok 3-({6[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl}amino>-2-methylpentan-2“ ol, 3 ({6'[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-ethyl-9/A purin-2--yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl}amÍno)-2~methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-cyklohexyl9//-purin-2-yl }amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-( {6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)aminoJ9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-{{6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzy l)amino]--9methyl-9/Y-purin-2-yl]amino} pentan-2-ol, 3-( {6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-ethyl-9í/-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5merkaptobenzyl)amino]-9-cykIohexyl-9//-purin-2-yl]amino} pentan-2-ol, 3-( {6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9~benzyl-9//-purÍn-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-cyklopropyl-9//-purin-2-yl}amino)~2~methylpropan~2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9//-purin-2-yl}amino)-2methylpropan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9//~ purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-ethyl9//-purin-2-yl)amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6~[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino}-9~ isopropyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-{{6-[(2-hydroxy-5~nitrobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9/Y-purin-2-yl}amino)-2methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5nitrobenzyl)amino]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-methyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3—({6[(2 hydroxy-5-nitrobenzy l)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2 -vIjamino} pentan-2-ol, 3-( {6-[(2hydroxy-5-nitrobenzyl)aminoj-9-cykíohexyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3—({6—[(2— hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-benzy]-9//-purin-2-y]]amino}pentan-2ol, l({6—[(2hydroxy--5--nitrobenzyl)arnino]-9-cyklopropyl-9//-purin-2yl}arnino>-2-methylpropan-2-ol.

-({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9í/-purin-2-yl }amino)-2methylpropan-2-ol, l({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-benzyl9/Y-purin-2-yl}amino)-2-methyIpropan-2-ol, 2-({6~[(2-hydroxy-5-nitrobenzy])amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9íř-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, ?V⁶-(2-hydroxy-5aminobenzyl)-/V²-(2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2,6-diamin, 2-({6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyI)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)~9íf-purin-2-y]}amino)-3-methyl-butan-l-ol, M-(2-hydroxy5-aminobenzyl)-A^r2-(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9tf-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-l-ol, 3—<{6— [(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2~hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyI)~9/ř-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl>-9//-purin-2-9 CZ 302711 B6 yIi amino)propan-2-ol, 4—({6—[(2-hydroxy--5 aminobenzyl)amino|-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3 pentyl, cyklohexyl benzyl)-9//-purin-2-yl)amin0)-2,3-dimethylbutan-2-ol 3—({6—[(2— hydroxy-5-aminobenzyl)amino)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl cyklohexyl, benzy l)9//—purin—2—y I }amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-( )6-(( 2-hydroxy-5-aminobenzyl)am ino]-9s (methyl ethyl isopropyl 3-pentyl cyklohexyl benzyl)-9//-purin-2-yl|amino}pentan-2—ol 1({6-| (2-hy droxy-5-am i nobenzyl)amino|-9-( methyl, ethyl isopropyl 3-pentyl cyklohexyl benzy l)-9//-purin-2-yl}amin0)-2-methylpropan-2-ol.

Farmaceutické přípravky io

Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, iš pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od

0,05 g do 1,0 g aktivní látky.

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.

Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případe lyotllizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem, jako je mannitol Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují exeipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyoťi I izací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylceiulosy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.

Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8 až 22, s výhodou pak 12 až 22 uhlíkových atomů, např. kyselinou laurovou, tridekano55 vou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo .3,5 di /crc butyl-4-hydroxytoliienii. Alkoholová sloka těchto esterů mastných kyselin nemá než 6 uhlíkových atomů a je mono— nebo polyhydrická, např. mono—, di— nebo trihydrické alkoholy to jako methanol ethanol propanol, butanol nebo pentanol ajejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Grattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C_s až C,₂ od Hiils AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejné.

Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.

Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky sjedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno.

- 10CZ 302711 B6 zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.

Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulosové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát horečnatý a/nebo vápenatý, polyethylen glykol nebo jeho deriváty.

Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celu losových preparátů jako acetylcelulosaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulosaftalát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s pinidly, jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk. parafínový olej nebo kapalný polyethylen glykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.

Další formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10% nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.

Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafínové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy.

Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam, kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofílizátu společně s excipienty, kde je to vhodné, a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro i n fúzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbováči benzoová.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování, jako jsou póly alkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolů, tj. lipofilCZ 302711 B6 ní látky rozpuštěné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud jc to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.

Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství, které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0.5 až 2 g.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje inhibici CDK2/cyklin E kinasové aktivity purinovým derivátem 128 a roskovitinem.

Obr. 2 ukazuje dávkově závislou antiproliferativní aktivitu purinového derivátu 128 pro lidskou nádorovou buněčnou MCF7, s roskovitinem použitým jako standardem. Buňky byly ošetřeny po dobu 72 h vzrůstajícími koncentracemi sloučenin a poté byl počet živých buněk stanoven Calcein AM testem. Výsledky představují průměr ± SD (směrodatných odchylek) ze tri nezávislých experimentů. Sloučenina 128 významně redukuje počet živých buněk.

Obr. 3 ukazuje jak sloučenina 128 a roskovitin modulují expresi R.NA polymerasy II a její fosfory lační status. Buňky byly inkubovány s testovanými sloučeninami ve vyznačených časových bodech, poté sklizeny a celkový buněčný lyzát byl analyzován imunoglobulinem. Fosforylace šeřinu 2 a šeřinu 5 na C-terminální doméně RNA polymerasy II je po ošetření testovanými sloučeninami inhibována.

Obr. 4 ukazuje aktivaci p53-závislé transkripce v Arn8 buňkách (buněčná linie transfekovaná stabilně β—galaktosidasovým reportérovým genem). Buňky byly inkubovány se sloučeninou 128 a roskovitinem a transkripční aktivita p53 byla detekována fluorimetricky jako [3-galaktosidasová reporterová aktivita na fluorogenní substrát (a). Formaldehydem-fixované Arn8 buňky ošetřené sloučeninou 128 vykazují modrý signál díky štěpení X-gal, jakje ukázáno na mikrofotografii (b), kdežto neošetřené buňky zůstaly neoznačené (c). Obě sloučeniny prokázaly aktivaci p53-závislé transkripce v Am8 reportérové buněčné linii.

Obr. 5 ukazuje akumulaci nádorového supresorového proteinu p53, expresi p53-regulovaného inhibitoru CDK p21^WaM a downreguiaci antiapoptotického proteinu Mcl-1 v buněčné linii prvního karcinomu MCF7 po ošetření sloučeninou 128 a roskovitinem. Buňky byly ošetřeny po dobu 24 h testovanými sloučeninami v koncentračně závislé Škále, sklizeny a byl připraven celkový buněčný lyzát. Exprese regulátorů buněčného cyklu a proteinů zapojených v apoptóze byla detekována imunoblotingem.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je dále popsán v následujících příkladech, aniž by příklady jakkoliv omezovaly jako rozsah.

Výchozí suroviny pro sloučeniny obecného vzorce I jsou dostupné z komerčních zdrojů (SigmaAldrich, Fluka, atd.). Body tání byly stanoveny na Kofflerově bloku a nebyly korigovány. Odpařování rozpouštědel bylo prováděno na rotační vakuové odparce při teplotách pod 80 °C. IH NMR spektra (σ, ppm: J, Hz) byla měřena na přístroji Varian VXR-400 (400 MHz) nebo na přístroji Varian Unity 300 (300 MHz). Všechna spektra byla změřena při 25 °C za použití tetramethylsilanu coby vnitřního standardu. ES+MS spektra m/z (rel. %, složení, odchylka) byla

- 12 CZ 302711 B6 měřena na VG 7070E spektrometru (70 eV, 200 °C, přímý nástřik). Quad MS spektra byla měřena na přístroji Micromass ZMD detektoru s ionizací elektrosprayem. Merck silikagel Kieselgel 60 (zrnitost 230 až 400) byl použit na sloupcovou chromatografii. Všechny sloučeniny vykázaly uspokojivé elementární analýzy (± 0,4 %). Výchozí 9—hydrokarbyl—2,6—dichlorpuriny byly připraveny podle postupů popsaných v literatuře.

2.6- dichlor-9methylpurin

1) Parker et ai Phytoche mistry 25, 1986: 303 - 310

2) Brik et al. Bioorg. Med. Chem. 13, 2005: 4622 - 4626;

2.6- dichlor—9—ethylpurin

Pitts et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 14, 2004: 2955 - 2958

2.6- dichlor-9-isopropylpurin

1) Rypka et al. Xenobiotica 32. 2002: 1017-1032

2) Lu et al. J. Org. Chem. 72, 2007: 5012-5015

2.6- dichlor—9—benzylpurin

1) Kelley et al. J. Med. Chem. 31; 1988: 2001 - 2004

2) Naito et ai Chem. Pharm. Bul. 30, 1982: 2011 - 2019

3) Dalby et ai Angew. Chem. German 105, 1993: 1822 - 1823

4) Brik et ai Bioorg. Med. Chem. 13, 2005; 4622 - 4626

5) Weterings et ai Bioorg. Med. Chem. Let. 16, 2006: 3258 - 3261

6) Toyota et al. Synth. Commun. 23, 1993: 1295 - 1305

7) Gundersen et ai Tetrahedron Let. 36, 1995: 1945- 1948

8) Lu et ai J. Organ. Chem. 72, 2007: 5012-5015

2.6- -dichlor-9—cyklopropylpurin

2.6- Dichlorpurin (1 mmol), trifenylfosfín (1,3 mmol), tetrahydrofuran (5 ml) a cyklopropanol (5 mmol) byly míchány v dusíkové atmosféře při pokojové teplotě za vzniku čirého žlutého roztoku, který byl poté ochlazen na 0 °C a byl přidán stříkačkou diisopropyldíazadikarboxylát (DIAD, 1,3 mmol). Reakční směs pak byla míchána po dobu 12 h. Po odpaření rozpouštědel byl produkt extrahován diethyletherem a vyčištěn sloupcovou chromatografii (silikagel, 1 % MeOH v chloroformu). Rekrystalizace z methanolu poskytla výtěžek 35 %, b.t. 121 až 124 °C.

2.6- dichlor-9-cyklopentylpurin

1) Shum et al. Nucleos. Nucleot. 20, 2001: 1067 - 1078

2) Drezér et ai J. Med. Chem. 44, 2001: 524 - 530

2.6~ dichlor-9-cyklohexylpurin

2.6- Dichlorpurin (1 mmol), práškový uhličitan draselný (1 mmol) a cyklohexyljodid (4 mmol) byly přes noc prudce míchány v 5 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). Po odpaření rozpouštědla byl produkt extrahován (mezi vodu a diethylether) a čištěn kolonovou chromatografii (silikagel, 1 % MeOH vCHCfl). Rekrystalizace z methanolu poskytla produkt ve výtěžku 41 %, b.t. 116 až 121 °C.

- 13 Příklad 1

Obecná metoda přípravy prekurzoru 2-chlor—6-[(2-hydroxy-(R)„-benzyl) amino]-9-hydrokarbyl-purinu

2,6—dichlor—9—hydrokarbylpurin (2 mmol), 2-hydroxy-R_n-benzylamin (2,5 mmol) a triethylamín (0,4 ml) byly zahřívány v 5 ml 1-butanolu (110 °C, 1,5 h). Produkt krystaloval během reakce /reakční směsi a tato krystalízace pokračovala při chlazení v lednici. Produkt byl zfiltrován a promyt I-butanolem.

j (2 hydroxy 3 n)ethoxybenzyi)aminol~2- chlor-9-methylpurin: Výtěžek 91 %; b.t. 202 až 5 205 °C;

'H NMR (CDCh): 3,14 <311, s), 3,28 (3H, s), 4,79 <2H, s(br)), 6,49 (IH, d, J - 7,5 Hz), 6.65 6,72(211, m), 7.86(111, s), 8,25 (1H, s(br)), 10,15 (I H, s(br))

6/(2 hvdroxv 3 methoxvbenzvbamino/-2 -chlor-9-ethvlpurin: Výtěžek 90 %: b.t. 195 až 10 198 °C;

'H-NMR (CDCh): 1,24 (311, t, J = 6,0), 3,23 (2H, q, J = 6,0), 3,65 (311, s), 4,80 (2H, s(br)), 6,49 (1H, d, J = 7,5), 6,65 - 6,72 (2H, m), 7,95 (1H, s), 8,05 (1 H, s(br)), 10,40 (1 H, s( br)) /(2 hydroxy-3- methoxybenzvj)ciinÍnol-2-chlor—9—Ísopropylpurin: Výtěžek 93 %; b.t. 190 až is 192 °C;

' H-NMR (CDCI;): 1,38 (6H, d, J - 6,0), 3,25 (IH, sept, J - 6,0), 3,62 (3H, s), 4,75 (2H, s(br)), 6,49 (I H, d, .1 - 7,5), 6,65 - 6,72 (2H, in), 8,05 (1H, s). 8,25 (1H, s(br)), 10,25 (1 H, s(br))

6- [(2 hydroxy 3 me(hoxybenzyl)aminoJ-2-chlor-9-cyklopropyfpurin: Výtěžek 88 %; b.t. 217 2o až220°C:

'H-NMR (CDCh): 0,63 (2H, q, J = 4,5), 0,69 (2H, q, J ' 4,5), 3,59 (IH, m), 3,65 (3H, s), 4,80 (2H, s(br)), 6,49 (IH, d, J ’ 7,5), 6,65-6,72 (2H, m), 7,94 (IH, s), 8,25 (IH, s(br)), 10.25 (IH, s(br))

6 l(2-hydroxy-3-methoxybenzyi)aminoJ-2-chlor-9-cyklopentylpurin: Výtěžek 89 %; b.t. 174 až I76°C:

'll-NMR (CDCh): 1,38 - 1,67 (4H, m), 1,74 - 1,82 (411, m), 2,03 (IH, qui, J7,5), 3,62 (3H, s), 4,75 (2H, s(b)), 6,49 (IH, d, J - 7,5), 6.65 - 6,72 (2H, m), 8,05 (IH. s), 8,25 (IH, s(br)), 10,25 (llhs(br))

6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-2-chlor-9-cyklohexyipurÍn: Výtěžek 89 %; b.t. 169 až 172 °C;

'H-NMR (CDCh): 1,33 - 1,42 (4H, m), 1,53 - 1,58 (IH, m), 1,70 - 1,80 (4H, m), 1,92 - 1,99 (IH, m), 3,62 (3H, s), 4,62 (2H, s(br)), 4,96 (IH, qui, J “ 5,7), 6,49 (IH, d, J = 7,5), 6,65 - 6,72 (2H, m), 8.05 (1 H, s), 8,25 (1 H, s(br)), 10,25 (1H, s(br))

6-( (2-h\droxy-3-methoxybenzyl)amino/-2-chlor-9-benzylpurin: Výtěžek 94 %; b.t. 208 až 21I°C;’ 'H-NMR (CDCh): 3,63 (3H, s), 4,43 (2H, s), 4,63 (2H, s(br)), 6,45 (IH, d, J = 7.5), 6,65 - 6,80 40 (211, m), 7,14 (IH. t, J “ 7,50), 7,26 (2H, b J 7,5), 7,39(211, d, J = 7,5), 7,89 (IH, s), 8,25 (IH, s(br)), 10,25 (IH, s(br))

- 14 Příklad 2 45

Obecná metoda přípravy (substituovaných) 2-hydrokarbonylumino-6-[(2-hydroxy-R„-benzyl)amino]-9-hydrokarhyl purinu

2-Chlor-6-[(2-hydroxy-R_rl-benzyl)ammol-9-hydrokarbylpurin (1 mmol), odpovídající amin (3 mmol) a diisopropylethylamin (2 mmol) byly zahřívány (teplota a reakční doba jsou specifikovány pro každou z níže uvedených substancí) v N-methylpyrrolidonu (5 ml, zatavená ampule).

Reakční směs byla poté vy třepána mezi vodu a chloroform. Kolonová chromatografie (silikagel, chloroform/methanol) poskytla čistý produkt.

CZ 302711 Β6 {6-[ (2-hydroxy-3-meihoxybenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl) amino)propan2-ol Reakční podmínky: 160 °C, 3 h. Kapalinová chromatografíe 1,5% MeOH v CHCB; krystalizace z absolutního CHCb; b.t. 100 až 103 °C.

¹ H-NMR (CDCb): 0,86 (3H, t, J = 9,0), 1,46 (6H, dd, J = 12,0, )' - 3,0), 1,63 (1H, sep, J = 12,0),

2,54 (IH, s), 3,38-3,56 (2H, m), 3,76 (3H, s), 3,82 (IH, m), 4,58 (2H, qui, J - 9,0), 4,62 (2H, s(br)), 5,85 (IH, d, J = 15,0), 6,67 (IH, t,m J = 12,0), 6,76-6,87 (2H, tn), 7,50 (IH, s(br)), 7,78 (IH, s), 9,32 (IH, s(br)).

ⁿCNMR (CDCb): 10,56, 21,95, 23,82, 54,01, 55,75, 62,92, 64,83, 110,73, 113,55, 118,43,

120,65, 126,78, 135,21, 144,01, 147,57, 150,55, 154,42, 158,74 l 6-[ (2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin—2-vl}amino)propan2-ol

Reakční podmínky: 160 °C, 3 h. Kapalinová chromatografíe 1,5 % MeOH in CHCb; krystalizace z abs. CHCb: b.t. 100 až 102 °C.

'H NMR (CDCb): 0,86 (3H, t, J = 9,0), 1,46 (6H, dd, J = 12,0, J' = 3,0), 1,63 (IH, sep, J = 12,0),

2,54 (IH, s), 3,38- 3,56 (2H, m), 3,76 (3H, s), 3,82 (IH, m), 4,58 (2H, qui, J = 9,0), 4,62 (2H, s(br)), 5,85 (IH, d, J - 15,0), 6,67 (IH, t, J = 12,0), 6,76- 6,87 (2H, m), 7,50 (IH, s(br)), 7,78 (IH, s), 9,32 (IH, s(br)).

^,3CNMR (CDCb): 10,56, 21,95, 23,82, 54,01, 55,75, 62,92, 64,83, 110,73, 113,55, 118,43,

120,65, 126,78, 135,21, 144,01, 147,57, 150,55, 154,42, 158,74 (RS) -2-f/6—[(2—hydroxy-3-methoxy benzyl) amino]--9-isopropyl- 9H--purin-2--yl} amino) b utanl-ol Reakční podmínky: 160 °C, 6 h. Kapalinová chromatografíe 1,5 % MeOH v CHCb; krystalizace z abs. CHCb/ abs. Et?O; b.t. 120 až 122 °C.

'HNMR (CDCb): 0,86 (3H, t, J = 9,0), 1,46 (6H, dd, J = 12,0, J' = 3,0), 1,63 (IH, sep, J - 12,0),

2,54 (IH, s). 3,3á- 3,56 (2H, m), 3.76 (3H, s), 3,82 (IH, m), 4,58 (2H, qui. J - 9.0), 4.62 (2H, s(br)), 5,85 (1H, d, J 15,0), 6,67 (IH, t, J ’ 12,0), 6,76- 6,87 (2H, m), 7,50 (IH, s(br)), 7,78 (IH, s), 9,32 (IH, s(br)).

^I3C NMR (CDCb): 10,56, 21,95, 23,82, 54,01, 55,75, 62,92, 64,83, 110,73, 113,55, 118,43,

120,65, 126,78, 135,21, 144,01, 147,57, 150,55, 154,42, 158,74 (R)-l-({6-[(2-hydroxy-4-methoxy benzyl) amino]-9-isopropyl-9H-purin-2--yl}amino)propan— 2-ol Reakční podmínky: 160 °C, 3 h. Kapalinová chromatografíe 1,5 % MeOH v CHCb; krystalizace z abs. CHCb; b.t. 106 až 108 °C.

'H NMR (CDCb): 0,88 (3H, t, J - 9,0), 1,45 (6H, dd, J ‘ 12,0, J' - 3,0), 1,66 (IH, sep, J = 12,0), 3,38 - 3,56 (2H, m), 3,64 (3H, s), 3,82 (IH, m, J - 9,0), 4,57 (2H, qui, J - 9,0), 4,64 (2H, s(br)), 5,80 (IH, d, J = 15,0), 6,34 (1H, s), 6,41 (1H, d, J = 7,5), 6,92 (1H, d, J = 7,5), 7,50 (l H, s(br)), 7,79 (IH, s), 8,95 (IH, s(br)).

'HNMR(CDCb): 10,9,22,5,25,0,42,6,46,4,55,6, 56,3,68,5, 100,7, 103,9, 114,7, 120,0, 130,3, 134,6, 152,0, 155,8, 158,9, 160,0 (R)-l-( 16[(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino]- 9-isopropyl-9H-pwin-2-yllamino)propan21-ol Reakční podmínky: 160 °C, 3 h. Kapalinová chromatografíe 1,5 % MeOH v CHCb; krystalizace z abs. diethyletheru; b.t. 145 až 147 °C.

'H NMR (CDCb): 0,89 (3H, t, J = 9,0), 1,46 (6H, dd, J = 12,0, Γ = 3,0), 1,63 (IH, sep, J = 12,0), 2,32 (3H, s), 2,54 (1 H, s), 3,38 - 3,56 (2H, m), 3,76 (3H, s), 3,82 (IH, m), 4.58 (2H, qui, J - 9,0), 4E,62 (2H, s(br)), 6,76 - 6,83 (3H, m), 7,50 (1H, s(br)), 7,78 (1H, s), 9,32 (1H, s(br)).

'HNMR(CDCb): 10,9, 16,6,22,5,25,0,38,3,46,4, 56,3,68,5, 114,7, 119,2, 125,1, 125,8, 126,4, 129,4, 134,6, 152,0, 154,1, 155,8

- 15 (R)-l-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-isopropyl-9H-purin-2-yl}amino)propan-2ol Reakční podmínky: 160 °C, 3 h. Kapalinová chromatografíe 1,5 % MeOH v CHCb; krystalizace z abs. diethyletheru; b.t. 160,0 až 161,3 °C.

'H NMR (CDCb): 0,89 (3H, t, J - 9,0), 1,46 (6H, dd, J - 12,0, J' ‘ 3,0), 1,63 (IH, sep, J = 12,0),

2,32 (3H, s), 2,54 (1H, s), 3,38 - 3,56 (2H, m), 3,76 (3H, s), 3,82 (I H, m), 4,58 (2H, qui, J - 9,0),

C/ 302711 B6

4,62 (211, s(br)), 6,72 (III, d, J 7,50), 6,77 - 6,80 (211, ni), 7,50 (IH, s(br)), 7,78 (Hl. s), 9,50 (111, s(br)).

'11 NMR (CDCfi): 10,9,20,5.22,5,25,0,39,4,46,4,56,3,68,5, 114,7, 118.3, 124,1, 127,4, 129,1, 133.2, 134,6, 152,0, 152,3, 155,8, 160,0 (E/7.)- V /4- ummocvkJohexyl)-N⁶ -(2 - hvdroxv -3-methoxy benzyl) - 9 isopropyl- 91 f purin 2,6 íliomin

Reakční podmínky 160°C, 4 h. Kapalinová chromatografie gradient I, 2, 3, 4, 5% MeOH v CHCfi se stopou koncentrovaného NH₍OH.: b.t. 136,2 až 137,5 C.

ιο 'H NMR (CDCfi): 1,42 (611, d, J “ 6,0), 1,57- 1,62 (4H, m), 1,65 (IH, sep, J = 6,0), 1,82 - 1,87 (4H, m), 2,25 (2H, s(br)), 3.71 (3H, s), 4,68 (2H, s(br)), 6,54 (1 H, d, J = 7.5), 6,69 (IH, d, ,1 - 7.5), 6,84 (I H. t. J = 7,5), 7,50 (I H, s(br)), 7,72 (1 H, s), 10,2 (111, s(br)).

'HNMR (CDCfi): 22,5, 30,8, 33,6, 38,3, 46,4, 48,9, 55,9, 109,5, 114,7, 119,0, 123,1, 127,0, 134,6, 146,6, 148,9. 152,0, 153,2, 155,8

NN-piperazinyl)-?/ - (2-hydroxy-3-methoxybenzyl)-9 isopropyl - 9H purin 2,6 diumin Reakční podmínky 160 °C, 4 h. Kapalinová chromatografie gradient 1, 2, 3, 4, 5% MeOH v CHCfi se stopami koncentrovaného NH₄OH.; b.t. 157,7 až 160,6 °C.

'11 NMR (CDCfi): 1,49 (61-1, d, J “ 9,0), 2,75 (4H, m), 3,65 (4H, m), 3,78 (3H, s), 4,55 (1 H, sep,

J =9,0),4,70(211, s(br)), 6,66 (IH, t, J = 6,5), 6,73 - 6,88 (2H, m), 7,59 (IH, s(br)), 7,82 (1 H, s), 9.52 (1 H. s(br)).

ⁿC NMR (CDCfi): 13,98,21,93,45,41.55,69, 59,69, 110,41, 113,47, 118,31, 118,31, 120,56, 126.77, 135,71, 143,99, 147,41, 150,54, 154,23, 158,40, 170,24

- 16CZ 302711 B6

Tabulka 1: Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

	SUBSTITUENTY NA PURINU	CHN ANALÝZA	MS (ZMD)- I ANALÝZA
	R2	R6	R9	[%}	[M-H]· a)	[M+H]* b)
¹	2-aminocyklohexylamino	(2 -hy droxy-5-ch lorbenzy l)am i no	methyl	56,8/6,0/24,4	400,9	402,9
2	4-aminoey klohexy 1 am ino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	methyl	56,8/6,0/24,4	400,9	402,9
3	(1 -hydroxy methy Opropyl amino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	methy!	54,2/5,6/22,3	375,8	377,8
4	(i -hydroxymethyl-2- -methyDpropylamino	(2-hydroxy-5-chlorbcnzyl)amino	methyl	55,3/5,9/21,5	389.9	391.9
5	4-hydroxy-4-methylpent-2- -y lam i no	(2-hydroxy-5-chtorbenzyl)amíno	methyl	56,4/6,2/20,8	403.9	405,9
6	2-hydroxypent-3-y lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	methyl	55,3/5,9/21,5	389,9	391,9
7	2-aminocy klohexy lamino	(2-hydroxy-5-tluorbenzyl)amino	methyl	59,2/6,3/25,4	384,4	386,4
8	4-aminocyklohexylamino	(2-hydruxy-5-fluorbenzyl)amino	methyl	59,2/6,3/25,4	384,4	386,4
9	(1-hydroxymethyOpropylamino	(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino	methyl	56,6/5,9/23,3	359.4	361,4
10	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-ch lorbenzy l)ami no	methyl	56,8/6,0/24,4	400,9	402,9
H	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino	methy!	56,8/6,0/24.4	400,9	402,9
12	2-hy droxy pent-3-y lamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzyt)amino	methyl	55,3/5,9/21,5	389,9	391,9
13	2-aminocy klohexy lamino	(2-hy droxy-3 -methyl benzy 1 )am i no	methyl	63,0/7.1/25,7	380,5	382.5
14	4-aminocyklohcxy lamino	(2-hydroxy-3 -methyl benzy 1 )ami no	methyl	63,0/7,1/25,7	380,5	382.5
15	2-hydroxy propy 1 amtno	(2-hy droxy-3 -methyl benzy 1 )amino	methyl	59,6/6,5/24.5	341,4	343,4
16	2-hydroxy-2-methyl pent-3- -ylamino	(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino	methyl	62,5/7.3/21.9	383.5	385,5
17	4-aminoeyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-methylbenzyl)aniino	methyl	63,0/7,1/25,7	380,5	382,5
18	(l -hydroxymethyDpropylamino	(2-hydroxy-5-methylbenzyDamíno	methyl	60,6/6,8/23.6	355,4	357.4
19	3 -h y droxy-3-methy 1 buty lam ino	(2-hy droxy-5-methyl benzy l)ami no	methyl	61.6/7,1/22,7	369,4	371,4
31	2-aminocyklohexy lami no	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino	methyl	60,4/6,9/24,7	396,5	398,5
32	4-aminocykíohexy 1 am i no	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino	methyl	60,4/6,9/24,7	396,5	398,5
33	2-hydroxypropylamino	(2-hydroxy-3-methoxybcnzyl)ammo	methyl	57,0/6,2/23,5	357,4	359,4
34	(l-hydroxymethyl)propy lamino	(2-hy droxy-3 -methoxy be nzy 1 )am i no	methyl	58,1/6,5/22,6	371,4	373,4
35	2-aminocyklohexy lamino	(2-hy droxy-4-methoxy benzy l)amíno	methyl	60,4/6,9/24,7	396.5	398,5
36	4-hy dra xycy klohexy 1 amino	(2-hydroxy-4-methoxy benzyl)amino	methyl	60,3/6,6/21.1	397.5	399,5
37	(l-hydroxymethyl)propylamino	(2-hy droxy-4-methoxy benzy Dam i no	methyl	58,1/6,5/22.6	371.4	373.4
38	(l-hydroxymcthyl-2- - methy 1 )propy 1 am i no	(2-hydroxy-4-mcthoxy benzy l)amino	methyl	59.1/6,8/21,8	385,4	387,5
39	2-hydroxypcnt-3-ylamino	(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)amino	methy!	59^6,8/21,8	385,4	387,4
40	2-aminocyklohexy lam i no	(2-hy droxy-5-methoxy benzyl lamino	methy!	60,4/6,9/24.7	396,5	398,5
41	4-hydroxycyklohcxylamino	(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)am i no	methyl	60,3/6,6/21.1	397,5	399,5
42	(1 -hydroxymethyDpropylamino	(2-hydroxy-5-methoxybenzyI)amino	methyl	58,1/6,5/22,6	371.4	373.4

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H?O + NH₃

- 17 CZ 302711 B6

Tabulka 2: Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

	SUBSTITUENTY NA PURINU	CHN ANALÝZA	MS(ZMD)- ANALÝZA
	R2	R6	R9	[%]	[M-H]’ a)	[M+H]' b)
47	2-annnocykloliexy lamino	{2-liydroxy-5-chiorbenzyl)ammo	ethyl	57.8/6,3/23,6	414,9	416.9
48	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	ethyl	57.8/6,3/23,6	414,9	416.9
49	2-hydroxy propyl ani i no	(2-hydr0xy-5-chlorbenzyDamino	ethyl	54.2/5.6/22.3	375,8	377,8
50	(1-hydroxymethyDpropy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	ethyl	55.3/5,9/21.5	389,9	391,9
51	4-aminocyklohexy lamino	(2-liydroxy-5-fluorbenzyl)amino	ethyl	60,1/6,6/24.5	398.5	400.5
52	(1 -hydroxy methyl) propy lamí no	(2-hydroxy-5-fl uorbenzy Dam i no	ethyl	57,7/6.2/22,5	373.4	375.4
53	2-aminocyklohexy lamino	(2-liydroxy-3-chlorbenzyl)amino	ethyl	57,8/6.3/23.6	414,9	416.9
54	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzy])amino	ethyl	57.8/6,3/23.6	414,9	416,9
55	2-hydroxypent-3-ylamino	(2-hy droxy-3-chlorbenzy Ijamino	ethyl	56.4/6,2/20.8	403.9	405.9
56	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino	ethyl	63,8/7.4/24,8	394,5	396,5
57	4-aminocyklohexy lamí no	(2-hydroxy-3-methylbenzyDamino	ethyl	63,8/7,4/24,8	394,5	396,5
58	2-hydroxy-2-methyIpent-3- -yl amino	(2-hy droxy-3-methyl benzy Dam i no	ethyl	63,3/7,6/21,1	397,5	399.5
59	2-amtnocyklohexy lamino	(2-hy droxy-5-methy I benzy l)amino	ethyl	63,8/7,4/24,8	394,5	396,5
60	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino	ethyl	63,8/7,4/24.8	394.5	396.5
61	(1 -hydroxy methyl) propyl amino	(2-hydroxy-5-methylbenzyDamino	ethyl	61.6/7,1/22.7	369,4	371,4
62	3-hydroxy-3-methylbutylamino	(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino	ethyl	62,5/7,3/21,9	383.5	385,5
70	4-amino cyklohexyl amin o	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino	ethyl	61,3/7.1/23.8	410,5	412,5
71	2-hydroxypropylamino	(2 -hy droxy-3-methoxy benzy 1)am i no	ethyl	58,1/6,5/22,6	371,4	373.4
72	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-4-incthoxy benzy Ijamino	ethyl	61.3/7,1/23,8	410.5	412,5
73	(i -hydroxy methy Dpropylamino	(2-hydroxy-4-methoxy benzy Danu no	ethyl	59.1/6,8/21,8	385.4	387,4
74	4-bydrqxycyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-methoxy benzy l)amino	ethyl	61,2/6,8/20,4	411.5	413,5
75	(1 'hydrcxymethy Dpropy lamino	(2-hydroxy-5-methoxy benzy Daroíno	ethyl	59,1/6,8/21,8	385,4	387,4

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H₃O + NH₃

Tabulka 3; Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

	SUBSTITUENTY NA PURINU	CHN ANALÝZY	M.S (ZM DIAN ALÝZ A
	R2	R6	R9	[%]	[M-H]’ a)	[M+H]' b)
76	2-aminocykiohexylamino	(2-hydroxy-5-ch!orbenzyDamino	isopropyl	58,7/6.6/22,8	428.9	430,9
77	4-aminocyklohexylamino	(2-hydiOxy-5-chlorbenzy!)amino	isopropyl	58.7/6,6/22,8	428,9	430,9
78	2-hydroxy propyl amino	(2-hydroxy-5-ehIorbcnzyDamino	isopropyl	55,3/5,9/21,5	389.9	391.9
79	(1 -hydro xymcthyDpro pyl amino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	isopropyl	56,4/6,2/20,8	403,9	405,9
80	(1 -hydroxvmethyl-2- - methy Dpropy lamino	(2-hvdroxy-5-chlorbenzyDamino	isopropyl	57,3/6,5/20,1	417.9	419.9
81	2-hydroxy-2-methylpropylammc	(2-liydroxv-5-chlorbenzyl)amino	isopropyl	56,4/6.2/20.8	403.9	405,9
82	3-hydroxy-3-methylbul-2-y lamino	(2-hydroxy-5-clilorbenzyDamino	isopropyl	57,3/6.5/20,1	417,9	419,9
83	3-hy droxy-3-methyl butylamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzy Ijamino	isopropyl	57,3/6.5/20,1	417,9	419,9

- 18 CZ 302711 B6

84	4-hy droxy-4-methy lpěn t-2- -yt amino	(2-hydroxy-5-chlorbenzy])amino	isopropyl	58,3/6,8/19,4	431,9	433,9
85	2-hydroxypent-3-ylamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	isopropyl	57,3/6,5/20,1	417,9	419,9
86	2-aminocyklohexylamino	(2-hy droxy-5-fluorbenzyl)amino	isopropyl	61,0/6,8/23,7	412,5	414,5
87	4-aminocyklohexy 1 am i no	(2-hydroxy-5-tluorbenzyl)am ino	isopropyl	61,0/6,8/23,7	412,5	414,5
88	2-hydroxypropylamino	(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino	isopropyl	57,7/6,2/22,5	373,4	375.4
89	(l-hydroxymethyl)propy lamino	(2-hy droxy-5 -fl uorbenzyl)ami no	isopropyl	58,8/6,5/21,6	387,4	389,4
90	2-hydroxy-2-methy 1 pent-3 - -y lamino	(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino	isopropyl	60,6/7,0/20,2	415,5	417,5
91	2-hydro xy pent-3-y 1 am i no	(2-hy droxy-5-fluorbenzyl)am ino	isopropyl	59,7/6,8/20,1	401.5	403.5
92	2-aminocyklohcxy lamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino	isopropyl	58,7/6,6/22,8	428.9	430,9
93	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-ch lorbenzy Dam ino	isopropyl	58,7/6.6/22,8	428,9	430,9
94	(1 -hydroxy methyl )propy lamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino	isopropyl	56.4/6,2/20,8	403,9	405,9
95	(l -hy droxy methy 1-2- -methyl)propylamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amtno	isopropyl	57,3/6,5/20,1	417,9	419,9
96	2-hydroxy-2-methylpropylamino	(2-hy droxy-3 -ch lorbenzy 1 Jam ino	isopropyl	56,4/6,2/20,8	403,9	405,9
97	2-hydroxypent-3-ylamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino	isopropyl	57,3/6,5/20, l	417.9	419,9
98	2-aminocyklohexylamino	(2-hy droxy-3-methy lbe nzy! Jamino	isopropyl	64,5/7,6/23,9	408,5	410,5
99	4-aminocyklohexy lam ino	(2-hydraxy-3-methy[benzyl)amino	isopropyl	64,5/7,6/23,9	408,5	410,5
100	2-hydroxypropylamino	(2-hydroxy-3-methyl benzyl Jam ino	isopropyl	61,6/7,1/22,7	369,4	371,4
101	(l-hydroxymethyl)propylamino	(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino	isopropyl	62,5/7,3/21,9	383,5	385,5
102	3-hy droxy-3-methy Ibuty lam ino	(i-hydroxy-S-mcthylhcnzylJamino	isopropy,	63,3/7,6/21,1	397,5	399,5
103	2-hy droxy-2-methylpent-3- -y lamino	(2-hydroxy-3-methyibenzyl)amino	isopropyl	64,1/7,8/20,4	411,5	413.5
104	2-hydroxypent-3-ylamino	(2-hydroxy-3-mcthylbenzyl)amino	isopropyl	63,3/7,6/21,1	397,5	399.5
105	2-am i nocy kl ohexyi amino	(2-hydroxy-3-methyl benzyl lamino	isopropyl	64.5/7,6/23,9	408,5	410,5
106	4-amí nocy kl ohexyi amino	(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino	isopropyl	64.5/7,6/23,9	408,5	410,5
107	(1 -hydroxy methyl)propyl amino	(2-hydro xy-5 -methyl benzyl)ami no	isopropyl	62,5/7,3/21,9	383,5	385.5
108	3-hydroxy-3-methy Ibuty lam ino	(2-hydroxy-5-methyl be nzy IJamino	isopropyl	63.3/7,6/21,1	397,5	399,5
109	2-hydroxy-2-methylpent-3- -ylamino	(2 -hydro xy-5 -methyl be nzy 1 Jamino	isopropyl	64,1/7.8/20,4	411,5	413,5
110	2-hy droxy pent-3-y lamino	(2 -hy droxy-5-methyl be nzy l Jamino	isopropyl	63,3/7,6/21,1	397,5	399,5
125	2-aminocyklohcxylamino	(2-hy droxy-3-methoxy benzy IJamino	isopropy!	62.1/7,3/23,0	424,5	426,5
126	4-aminocyklohexylamino	(2-hy droxy-3-melhoxy benzy l)am ino	isopropyl	62,1/7,3/23.0	424,5	426,5
127	2-hydroxypropylamino	(2-hydroxy-3-mcthoxybenzyl Jamino	isopropyl	59,1/6,8/21,8	385,4	387,4
128	(l -hydroxy methyOpropyl amino	(2-hy droxy-3-methoxy benzyl )amino	isopropyl	60,0/7,1/21,0	399,5	401.5
129	(l-hydroxymethyl-2- - methy Opropy lam ino	(2-hy droxy-3-methoxy benzyl lamino	isopropyl	60,9/7,3/20,3	413,5	415,5
no	2-hydroxy-2-methylpropylamino	(2-hydroxy-3-metIioxybenzyl Jamino	isopropyl	60,0/7,1/21,0	399,5	401,5
131	3-hydroxy-3 -methy 1 but-2 -y 1 amino	(2-hy droxy-3-methoxy benzyl )ammo	isopropyl	60,9/7,3/20,3	413,5	415,5
132	3-hydroxy-3-methytbutylamino	(2 -hydroxy-3 -methoxy benzy 1 Jam ino	isopropyl	60,9/7,3/20,3	413,5	415,5
133	4-hy droxy-4 -me thy 1 pcnt-2- , yl amino	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl )amino	isopropyl	61,6/7,5/19,6	427,5	429,5
134	2-hydroxypcnt-3-ylamino	(2-hydroxy-3-methoxybenzyllamino	isopropyl	60,9/7,3/20,3	413,5	415,5
135	2-aminoethylamino	(2-hy droxy-3-methoxy benzy Dam ino	isopropyl	58,2/6.8/26,4	370,4	372,4
136	4-hydroxycyklohexylamino	(2-hydroxy-3-melhoxybenzyl)amino	isopropyl	61,9/6,8/19,7	425,5	427.5
Í37	2-aminocyklohexylamino	(2-hy droxy-4-mcthoxy benzyl Jam ino	isopropyl	62,1/7,3/23,0	424,5	426,5

- 19( 7. 302711 B6

138	4-hydroxycy klohexy lamino	(2-hydroxy-4-niethoxy benzyl lamino	isopropyl	62,0/7,1/19,7	425.5	427,5
139	(1 -hydroxymethyl)propylamino	(2-h y droxy-4-methoxy benzyl lamino	tsopropyt	60,0/7.1/71,0	399.5	401,5
140	(l-hydroxymethyl-2- - methyl Ipropy lamino	(2-hydroxy-4-methoxy benzyl )ammo	isopropyl	60.9/7.3/20,3	413,5	415,5
141	2-hydroxy-2-methy Ipropy lanu no	(2-hydrnxy-4-methoxy benzyl lamino	isopropyl	60.0/7.1/21,0	399.5	401,5
142	2-hydroxypent-3-y lamino	(2-hydroxy-4-melhoxy benzy l)amino	isopropyl	60,9/7,3/20.3	413,5	415,5
143	2-antinocy Ido hexyl amino	(2-hydroxy-5-rnelhoxybenzyl)armno	isopropyl	62,1/7,3/23.0	424,5	426,5
144	4-hydroxy cyklohexyl amí no	(2-liydroxy-5-merkaptobeiizyl)amino	isopropyl	58,0/6,6/19,6	427.5	429,5
US	(1 -hydroxy methyl) propy lamino	(2-hydroxy-5-nitrohenzyl)amino	iso propy i	54,9/6,1/23,6	414,4	416,4
146	(1-hydroxy metliy 1-2- - methy l)propy lamino	(2-hydroxy-5-mtrobcnzyl)ammo	isopropyl	55,9/6.3/22,8	428,5	430,5

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H₂O + NH,

Tabulka 4: Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

	SUBSTITUENTY NA PURINU	CBN ANALÝZY	MS (ZMD)- ANALÝZA
	R2	R6	R9	[%J	(M-H]' a)	[M+Hf bj
147	4-aminocy klohexy lamino	(2-hydroxy-5-ehlorbenzyl)amino	propyl	58,7/6,6/22,8	428,9	430,9
148	4-hydroxy ey klohexylamino	(2-hydroxy-5-chtorbcnzyl)aimno	propyl	58.5/6,3/19,5	429,9	431,9
149	2-hy droxy propyl amino	(2-hydroxy-5-ť]uorbenzyl)amino	propyl	57,7/6,2/22,5	373,4	375,4
150	(1 -hydroxy methyl Ipropy lamino	(2-hydroxy-3-methylbenzyl lamino	propyl	62,5/7,3/21,9	383.5	385,5
151	heptylamino	(2-hy droxy-5-methyl benzy l)amino	propyl	67,6/7,9/20,6	407.5	409,5
152	(1 -hydroxymelhyl-2- - methyl Ipropy lamino	(2-hydroxy-3-methoxy benzyl lamino	propyl	60,9/7,3/20,3	413.5	415.5
153	2-hydroxy-2-methylpropylamino	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino	propyl	60,0/7,1/21,0	399,5	401,5
154	3-hydroxy-3-methy1but-2-y lamino	(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino	propyl	60,9/7,3/20,3	413,5	415,5

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H₂O + Nil·

Tabulka 5: Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

SUBSTITUENTY NA PURINU	CBN ANALÝZY	MS (ZMD)- ANALÝZA
	R2	R6	R9	[%]	[M-H]' a)	(MHlT bl
157	4-aminoey klohexy lamino	(2-hydroxy-5-ehlorbenzyl )amino	cyklohcxyl	61.3/6,9/20,9	469,0	471,0
158	(1-hydroxy methy Dpropylamino	(2-hydroxy-5-ehl o rbenzy Lamino	cyklohexyl	59,4/6,6/18,9	444,0	446.0
159	(1-hydroxy methy 1-2- - methyl Ipropy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzy l)amino	cyklohcxyl	60,2/6,8/18,3	458,0	460.0
160	2-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-5-tluorbenzyI)amino	cyklohcxyl	63,6/7,1/21,6	452,6	454,6
161	4-aminocykJohcxy lamino	(2-bydroxy-5-lluorbenzyllamino	cyklohcxyl	63,6/7,1/21.6	452,6	454,6
162	(1-hydroxy methyl Ipropy lamino	(2-h y droxy-5-fluorbenzy Lamino	cyklohexyl	61,7/6.8/19.6	427,5	429.5
163	4-aminocyklohexy lamino	(2-hy droxy-3-chlorbenzy l)ann no	cyklohexyl	61 3/6,9/20,9	469,0	471,0
164	4-aminocy klohexy lamino	(2-hydroxy-3-methylbenzyl lamino	cyklohexyl	66,8/7,9/21.8	448.6	450.6
165	2-hydro\y-2-melhylpent-3-	(2-hydroxy-3-meihy1benzyl]amino	cyklohexyl	66,3/8.0/18.6	451,6	453.6

-20CZ 302711 B6

	-ylamino
166	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-mcthylbenzyl)amino	cyklohexyl	66.8/7,9/21,9	448,6	450.6
167	(1 -hydroxymethyOpropylamino	(2-hydroxy-5-methylbe nzyl lamino	cyklohexyl	65,1/7,6/19.8	423,5	425,5
168	3-hydroxy-3-meihylbutylamino	(2 -hydroxy- 5-melhy lbe nzyl )am ino	cyklohexyl	65,7/7,8/19,2	437.6	439,6
174	2 -hy dro xy propylamino	(2-hydroxy-3- - methoxybenzyl)amino	cyklohexyl	62,0/7,1/19,7	425.5	427,5
17S	(l-hydroxymethyl)propylamino	(2-hydroxy-3- - methoxy benzy Lamino	cyklohexyl	62,7/7,3/19,1	439,5	441.5
176	2-hydroxy pent-3 -ylamino	(2-hydroxy-3- - methoxy benzyl) ann no	cyklohexyl	63.4/7.5/18,5	453,6	455,6
177	2-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-4- - methoxybenzyl)amino	cyklohexyl	64.5/7,6/21,1	464,6	466,6
178	(1 -hydroxy methyl )propy tam ino	(2-hydroxy-5- - methoxy benzyl )amino	cyklohexyl	62.7/7.3/19.1	439,5	441.5

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H₂O + NH₃

Tabulka 6: Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

	SUBSTITUENTY NA PURINU	CHN ANALÝZY	MS (ZMD> ANALÝZA
	R2	R6	R9	[%]	[M-H]‘ a)	[M+H]’ b)
179	2-aminocyklohexytamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	benzyl	62,8/5,9/20.5	477,0	479,0
180	4-aminoeyklohexylamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	benzyl	62.8/5,9/20,5	477,0	479.0
181	2-hydroxv propylamino	{2-hydroxy-5-chlorbenzy0amino	benzyl	60,2/5,3/19,2	437,9	439,9
182	ί 1 -hydroxy methyDpropy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbeiizyl)amino	benzyl	61,0/5,6/18,6	451,9	453,9
183	{1 -hydroxymethyl-2- - methy i )propy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	benzy!	61,7/5,8/18,0	466,0	468,0
184	4-hydroxy-4-methy!pent-2- -ylaniino	(2-hydroxy-5-chlorbcnzyl)amino	benzyl	62.4/6,1/17,5	480,0	482.0
185	2-hydro xypent-3-ylamino	(2-hydroxy-5-chlorbcnzyl)amino	benzyl	61,7/5,8/18,0	466,0	468.0
186	2-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino	benzyl	65,1/6,1/21,2	460,5	462,5
187	4-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-5-floorbenzyl)amino	benzyl	65,1/6,1/21,2	460,5	462,5
188	(I -hydroxymethyDpropylammo	(2-hydroxy-5-íluorbenzyl)am]no	benzyl	63,3/5.8/19,3	435,5	437,5
189	2-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino	benzyl	62,8/5.9/20,5	477,0	479,0
190	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-chlorbcnzyl)amino	benzyl	62,8/5,9/20,5	477,0	479,0
191	2-hydroxypent-3-ylamino	(2 -hydroxy-3 -ch lorbenzy l)ami no	benzyl	61,7/5,8/18.0	466.0	468,0
192	2-aminocyklohexy lamino	(2 -hy droxy-3 -methyl benzy l)amino	benzyl	68,3/6,8/21,4	456,6	458,6
193	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino	benzyl	68.3/6,8/21,4	456,6	458,6
194	2 -hyd roxy-2-methy 1 pent-3 - -ylamino	(2-hy droxy-3-methyl benzyl )atn ino	benzyl	67,8/7,0/18,3	459,6	461,6
195	2-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino	benzyl	68,3/6,8/21,4	456,6	458,6
196	4-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-5-melhylbenzyl)amřno	benzyl	68,3/6,8/21,4	456,6	458,6
197	(! -hydroxymethyOpropylamino	(2-hy d ro xy-5 -methyl benzy l)am ino	benzyl	66,7/6,5/19,4	431,5	433.5
198	3-hydroxy-3-methylbutylamino	(2-hydroxy-5-nnethylbenzyl)amino	benzyl	67.2/6,8/18.8	445,5	447,6
210	2-aminocyklohexylamino	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino	benzyl	65,9/6,6/20,7	472,6	474,6

-21 CZ 302711 B6

211	4-aminůCyklohe.xylammo	(2-hydroxy-3-melhoxybenzyDamino	benzyl	65,9/6,6/20,7	472.6	474,6
212	(i -hydroxy methyDpropy lamino	(2-hydro xy-3-methoxy benzy Dam i no	benzyl	64,3/6,3/18,7	447,5	449,5
213	2-hydroxypent-3-yÍainino	(2-hydroxy-3-methoxy benzyDami no	benzyl	64,9/6.5/18.2	461.5	463.5
214	2-aminocyklohexy lamino	(2-hy droxy-4-mcthoxy benzy Dammo	benzyl	65,9/6.6/20.7	472,6	474.6
215	4-hydroxy cyklohexy lamino	(2-hydroxy-4-methoxy benzy l)am i no	benzyl	65,8/6,4/17,7	473.6	475,6
216	(l-hydroxymethyDpropyliimino	(2-hydroxy-4-methoxybcnzyDamino	benzyl	64,3/6,3/18,7	447.5	449.5
217	{l-hydroxyrnethyl-2- - methy Dpropy lamino	í2-hydroxy-4-methoxybenzyDamino	benzyl	64.9/6,5/18,2	461.5	463.5
218	2-hydroxypent-3-ylamino	(2-hydroxy-4-methoxy benzy l)amino	benzyl	64,9/6.5/18,2	461.5	463,5
219	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-methoxy be nzy l)am mo	benzyl	65,9/6.6/20,7	472,6	474,6
220	2-hy droxy propyl amino	(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino	benzyl	63,6/6,0/19.3	433,5	435,5
221	4-hydroxy cyklohexy lamino	(2*hydroxy-5-mellioxybenzyl)amino	benzyl	65,8/6.4/17.7	473,6	475,6
222	(1 -hydroxy methyDpropy lamino	(2-liydroxy-5-nitrobeiizyl)amino	benzyl	59,6/5.4/21.2	462.5	464,5

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H_?O + NH₃

Tabulka 7; Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

	1 SUBSTITUENTY NA PURINU	CHN ANALÝZY	MS (ZMD)- ANALÝZA
	R2	R6	R9	[%]	(M-H)' a)	[M+Hf b)
223	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	3-pentyl	60.3/7.0/21,4	456,3	458.3
224	(i -hydroxymethyDpropy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	3-pentyl	58.3/6.8/19,4	431,0	433,0
225	(1 -hydroxymethyl-2- - methyDpropylamino	(2-hy dro xy-5-chlorbenzyl)amino	3-pentyl	59,1/7,0/18,8	445,0	447.0
226	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-fl uorbenzy l)amino	3-pentyl	62,6/7,3/22,2	440.6	442.6
227	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-fl uorbenzy l)am ino	3-pentyl	62,6/7,3/22.2	440,6	442,6
228	(1 -hydroxy methyl )propyl amino	(2-hy droxy-5-fl uorbenzy Dam i no	3-penty i	60,6/7,0/20.2	415,5	417,5
229	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-melhylbcnzyl)amino	3-pentyl	65,9/8,1/22,4	436,6	438,6
230	4-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-5-methy 1 benzyl )ami no	3-pentyl	65,9/8,1/22,4	436,6	438,6
231	(1 -hydroxymethyDpropy lamino	(2-hydroxy-5-methyl benzyl Jamino	3-pentyl	64,1/7,8/20,4	411,5	413,5
236	2-hydroxypropylamíno	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino	3-pentyl	60,8/7,3/20,3	413,5	415,5
237	(1 -hydroxymethyDpropy lam ino	(2-hydroxy-3-methoxybenzyDamino	3-penty i	61.7/7,5/19,6	427.5	429.5
238	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)annno	3-pentyl	63.6/7,8/21,6	453,6	455,6
239	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-4-methoxybenzy l)amino	3-pentyl	63.6/7,8/21,6	453,6	455,6
240	(l-hydroxymethyDpropy lamino	(2-hydroxy-5-methoxy benzyDami no	3-pentyl	61,7/7,5/19,6	427,5	429,5

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H₂O + NH₃

Tabulka 8: Sloučeniny připravené způsobem podle příkladu 2

	SUBSTITUENTY NA PURINU	CHN ANALÝZY	MS (ZMD)- ANALÝZA
	R2	R6	R9	[%]	[M-H] a)	[M+H]* b]
241	2-aminocykIolicxy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)annno	isopentcnyl	60.3/7,0/21,4	456,3	458.3

- 22 CZ 302711 B6

242	(t -hydroxy methy Dprapy lamino	(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino	isopentenyl	58,3/6,8/19,4	431,0	433,0
243	(1 -hydroxymethyl-2- - methy 1 )propy 1 amino	(2 -hydro xy-5-chlorbenzyl )amino	isopentenyl	59.1/7,0/18.8	445,0	447,0
244	2-am i nocy klohexy 1 amino	(2 -hy dro xy- 5-fl uorbenzy l)amtno	isopentenyl	62,6/7,3/22.2	440,6	442,6
245	4-aminocyklohexyl amino	(2-hy droxy-5-fl uorbenzy Darnino	isopentenyl	62,6/7,3/22,2	440,6	442,6
246	(1 -hydroxy methy Dpropy lamino	(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino	isopentenyl	60,6/7,0/20,2	415,5	417,5
247	2-aminocy klohexy lamino	(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino	isopentenyl	65,9/8,1/22,4	436,6	438,6
248	(1 -hydroxy methy l)propy lamino	(2-hy droxy-5-methyl benzy l)amino	isopentenyl	64,1/7,8/20,4	411,5	413,5
249	(1 -hydroxymethyDpropy lamino	(2-hy droxy-3-methoxy benzy Darnino	isopentenyl	61,7/7,5/19,6	427,5	429.5
250	2-aminocyklohexy lamino	(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino	isopentenyl	63,6/7.8/21.6	453,6	455.6

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H?O + NH-,

Příklad 3

Testování inhibice CDK id Vybrané sloučeniny byly podrobeny měření jejich inhibičních schopností vůči purifikovaným rekombinantním kinasam cdkl/cyklin B, cdk2/cyklin E, cdk5/p25, cdk7/cyklin H a cdk9/cyklin T z důvodu určení základních vztahů mezi strukturou těchto sloučenin ajejich aktivitou.

Cdk/cyklin komplexy byly exprimovány v Sf9 buňkách koinfikovaných odpovídajícími bakulo15 virálními vektory. Buňky byly sklizeny 70 h po infekci v lyzačním pufru (50mM Tris pH ,4, 150mM NaCI, 5mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), 20mM NaF, 1% Tween 20, inhibitory proteas) po dobu 30 min na ledu a rozpustná frakce byla získána centrifugací při 14 000 g po dobu 10 min. Proteinový extrakt byl před použitím uskladněn při -80 °C. Měření aktivity kinas bylo prováděno analýzou koncového bodu reakce a enzym byl použit v dávce, která se nachází v lineární části závislosti množství produktu na jeho koncentraci. Reakční směs obsahovala 1 mg/ml histonu coby substrátu pro cdkl, cdk2 a cdk5 (Sigma-Aldrich, typ Ul—S), (YSPTSPS>3 peptidu coby substrátu pro cdk7 a cdk9, 15μΜ ATP, 0,2 pCi [γ-³³Ρ] ATP a testovanou sloučeninu v konečném objemu 20 μί, vše v reakčním pufru: 50mM Hepes pH 7,4, lOmM MgCE, 5mM kyselina ethylenglykoltetraoctová (EGTA), lOmM 2-glycerolfosfátu, ImM NaF,

ImM dithiothreitol (DTT) a inhibitory proteas. Po 30 min byla inkubace zastavena přídavkem 5% H3PO4 a pak byly bazické proteiny od nízkomolekulamích látek odděleny vazbou na fosfocelose. Měření inhibice CDK bylo prováděno bezfilmovým digitálním radiografickým systémem BAS 1800. Aktivita CDK byla vyjádřena jako procento maximální aktivity (tedy reakce bez jakéhokoliv inhibitoru). Síla inhibitoru byla vyjádřena hodnotou IC₅₀, která byla určena grafickou analýzou závislosti aktivity CDK na koncentraci daného inhibitoru (Obr. 1).

-23CZ 302711 B6

Tabulka 9: Inhibice CDK vybranými deriváty substituovaných 6-(2-hydroxybenzylamino)purinů

	SUBSTITUENTY NA PUR1NU	IC_S0 (μΜ)
	Ró	R2	R9	CDK2	CDK.9
oc	benzyl	hydroxy ethylamino	methyl	7	19
1	2-hydroxy-5-chlorbenzylamino	2-aminocyklohexy lamino	methy)	0.29	0.18
2	2-hydroxy-5-chlorbcnzylamino	4-aminocyklohexylamino	methyl	0.27	0.15
3	2-hydroxy-5-chlorbenzyl amino	(1 -hy dro xy methy 1 propy l)amí no	methyl	0,3	0,12
4	2-hydrůxy-5-cli lorbenzy 1 aminů	(1 «hydroxy methy 12 - methyl )propy lamino	methyl	0.25	0,08
7	2-hy droxy-5-íluorbenzy lamí no	2-aminocyklohexylamino	methyl	0,26	0,15
8	2-hy droxy-5-tluorbenzyl amino	4-aminocyklohcxy lamino	methyl	0,25	0,12
9	2-hydroxy-5-fluorbenzy lamino	(1 -hydroxymethy Ipropy 1 )amino	methyl	0.3	0,17
31	2-hydroxy-3-methoxy benzyl amino	2-aminocyklohexy lam ino	methyl	0.26	0.19
32	2-hydroxy-3-mcthoxybenzy lamino	4-aininocyklohexylamino	methyl	0,22	0,18
34	2-hy droxy-3-methoxy benzy lamino	(1 -hydro xymethyl propyl )amino	methyl	0,27	0.16
48	2-hydroxy-5-chlorbenzylamino	4-aminocyklohexylamino	ethyl	0,14	0,09
50	2-hydroxy-5-chlorbenzylamino	(1 -hydroxy methy Ipropy Damino	ethyl	0,13	0,12
51	2-hydroxy-5-ťluorbenzy lamino	4-aminocyklohexylamino	ethyl	0,16	0.1
59	2-hydroxy-5-methylbenzylamino	2-aminocyklohexy lamino	ethyl	0,12	0.05
70	2-hy droxy-3-methoxy benzy lamino	4-aminocyklohexylamino	ethyl	OJ 1	0.07
73	2-hydroxy-4-methoxy benzy lamino	(1 -hydroxy methy i propyl )amino	ethyl	0.17	0,09
ROSC	benzylamino	(1 -hy dro xy methy 1 propy l)am i no	isopropyl	OJ	0.7
OCII	2-hydroxy benzy lam ino	(1 -hydroxymethylpropyl lamino	isopropyl	OJ	0.06
76	2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino	2-aminocykIoliexylamino	isopropyl	0,05	0.03
77	2-hydroxy-5-chlorbenzyl amino	4-aminoeyklohexylamino	isopropyl	0,04 ;	0,01
79	2-hydroxy-5-chlorbenzylamino	(1 -hydroxymethyipropyljammo	isopropyl	0,07	0,04
80	2-hydroxy-5-chlorbenzyl amino	(1 -hydroxy methy 1-2- methylIpropylamino	isopropyl	0,06	0.05
Sl	2-hydroxy-5-chlorbenzylamino	2-hydroxy-2-methylpropylamino	isopropyl	0.03	0,02
82	2-hydroxy-5-ch lorbenzy lam ino	3-hydro xy-3-methyl but-2-enylamino	isopropyl	0,04	0.01
83	2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino	3 -hydro xy-3 -methy 1 b uty lam i no	isopropyl	0,02	0,007
86	2-hydroxy-5-il uorbcnzyl amino	2-aminocyklohcxy lamino	isopropyl	0,04	0,02
87	2-hydroxy-5-fluorbenzyíamíno	4-nminocyklohcxylamino	isopropyl	0.02	0,008
89	2-hy dro xy-5-tluorbenzy lamino	(l-hydroxymethylpropyl)amíno	isopropyl	0,05	0,02
101	2-hydroxy-3-methyl benzy lam ino	(1 -hydro xy methy Ipropy l)ami no	isopropyl	OJ	0,04
107	2-hydroxy-5-methyl benzy lam ino	(l-hydroxymelhylpropyl)amino	isopropyl	0.02	0.006
125	2-hydroxy-3-methoxybenzylamino	2-aminocyklohexylamino	isopropyl	0.02	0.007
126	2-hydroxy-3-mcthoxybenzy lamino	4-aminocyklohexy lamino	isopropyl	0,02	0.009
128	2-hydroxy-3-methoxy benzy lam i no	(l -liydroxyniethylpropyDamino	isopropyl	0.07	0,04
127	2-hy droxy-3-methoxy benzylamino	2-hydroxy propyl amino	isopropyl	0,08	0.06
136	2 -hydro xy-3 -methoxy benzy 1 am ino	4-hy droxy cyklohexyl amino	isopropyl	0.05	0.03
139	2-hydroxy-4-methoxybenzylamino	(1-hydro xymethyl propyl )amino	isopropyl	0.09	0,04

-24 CZ 302711 B6

223	2-hy droxy-5 - f J uorbenzy 1 am ino	2-aminocyklohcxylamino	3-pentyl	0,08	0,05
224	2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino	(l-hydroxymcthylpropyl)amino	3-pcntyl	0.09	0,06
227	2 -hydroxy- 5- tl uorbenzy 1 am ino	4-aminocyklohexylamino	3-pentyl	0.06	0,01
228	2-hy droxy-5-íl uorbenzy 1 amino	(1 -hydroxymethylpropyl)amino	3-pentyl	0,07	0,04
237	2-hydroxy-3-mcthoxybcnzylamino	(1 -hydroxymethylpropyDamino	3-pentyl	0,04	0,02
238	2-hy droxy-3-methoxy bertzyl amino	2-aminocyklohexylamino	3-pentyl	0.06	0,04
240	2-hydro xy-5 -methoxy benzy lamino	(1 -hy droxy methy lpropyl)amino	3-pentyl	OJ	0,07

OC - Olomoucin, OCII - Olomoucin II, Rose - Roskovitin, známé z předchozího stavu techniky

Tabulka 9 shrnuje inhibiční schopnosti nově připravených sloučenin vůči CDK9 a CDK2. Pro srovnání jsou uvedena i data prototypových sloučenin, jako jsou Olomoucin II a Roskovitin. Většina nových derivátů vykazuje významný nárůst inhibiční aktivity v enzymových testech sCDK. Modifikace benzylového kruhu hydroxylovou skupinou v or/Zro-poloze zpravidla vedla ke zvýšení inhibiční aktivity testovaných sloučenin vůči CDK9.

Příklad 4

Modulace aktivity andrenergních receptorů

Linie gliálních potkaních buněk C6 (ATCC CCL107) byla kultivována jako monovrstva ve směsi média Ham F10 a minimálního esenciálního média (poměr 1:1) bez fetálního séra, doplněném 2mM L-glutaminem, 1% (vol/vol) vitamíny minimálního esenciálního média (lOOx), 1% (vol/vol) neesenciálními aminokyselinami minimálního esenciálního média (lOOx), penicilinem (100 U/ml), streptomycinem (100 pg/ml) a seleničitanem sodným (30mM). Buňky byly inkubovány pri 37 °C ve vlhčené atmosféře. Vliv sloučenin na buňky byl sledován v logaritmické fázi jejich růstu při hustotě 2,5 χ 10⁵ buněk/cm². Produkce cytoplasmatického cAMP byla indukována přídavkem 5μΜ (-f-isopropterenolu. Po 30min inkubaci při 37 °C bylo médium odstraněno a množství cAMP v buňkách bylo stanoveno pomocí imunochemického kitu (Amersham). Hodnoty lC₅o pro testované sloučeniny byly určeny z křivek závislosti koncentrace cAMP na koncentraci testovaných sloučenin (provedeno v duplikátech). Vliv nově připravených derivátů substituovaných 6-(2-hydroxybenzylamino)purinů byl měřen po současné aplikaci s isoproterenolem.

-25 C7. 302711 B6

Tabulka 9: Modulace aktivity β-adrenergních receptorů vybranými novými deriváty substituovaných 6-(2-hydroxybenzylarnino)purinů

	SUBSTITUENTY NA PURINU
	R6	R2	R9	ÚČINEK	IC_W (μΜ)
oc	benzyl	hydroxyethylamino	methyl	neaktivní	neaktivní
ROSC	benzyl	(1 -hydroxymethylpropyl)amino	isopropyl	neaktivní	neaktivní
86	2-hydroxy-5-fluorbcnzylamino	2-aminocykiohexy lamino	isopropyl	inhibice	8±2
105	2-hydroxy-3-methylbenzy lamino	2-aminocyklohexy lamino	isopropyl	inhibice	12±4
106	2-hydroxy-5-methyl benzyl amino	2-aminocyklohexy lamino	isopropyl	inhibice	7±2
125	2-hy droxy-3-methoxybenzy lamino	2-aminocyklohexy lam i no	isopropyl	inhibice	2±0
126	2-hy droxy-3-methoxy benzyl amino	4-aminocyklohexy lamino	isopropyl	inhibice	4±1
79	2 -hydroxy-5-chlorbenzy lamino	(1 -hydroxymeihyl propy l)amino	isopropyl	1,5-násobná aktivace
80	2-bydroxy-5-chlorbenzy lamino	(1 -hydroxymethyl-2-methyOpropylamíno	isopropyl	1,8-násobná aktivace
81	2-hy droxy-5-chlorbenzy lamino	2-hydroxy-2- methy Ipropy lamino	isopropyl	1.7-násobná aktivace
89	2-hydroxy-5-fluorbenzy lamino	(1 -hydro xymethylpropyl)amino	isopropyl	1,9-násobná aktivace

Příklad 5 io Cytotoxieká aktivita nových sloučenin in vitro

Cytotoxicita sloučenin je jednou zjejich klíčových vlastností a určují jejích proti nádorový účinek in vivo. Jednou z možností, jak cytotoxickou aktivitu sloučenin zjišťovat, je měření poklesu metabolické aktivity živých buněk. Jedna z metod kvantifikace buněčné proliferace a cytotoxicity is je založena na využití fluoresceinového derivátu Calcein AM, aplikovaného mj. při hledání nových léčiv nebo zjišťování chemosensitivity. Principem využití je metabolizace Calceinu AM živými buňkami na intenzivně fluoreskující derivát, akumulovaný v cytoplasmě. Specifická fluorescence produktu v buňkách je přímo-úměrná množství živých buněk v kultuře.

Pro studium cytotoxicity nových sloučenin byla použita řada nádorových buněčných linií: MCF7 (adenokarcinom prsu), K562 (chronická myelogenní leukemie), HOS (osteosarkom), HeLa (cervikální karcinom), HL 60 (promyelocytární leukemie), G 36Ϊ (maligní melanom), C£A/(lymfoblastická leukemie). Všechny linie byly udržovány v mediu DMEM (Gibco BRL) doplněném 10% (v/v) fetálního telecího séra a L-glutaminem při 37 °C v atmosféře obohacené 5% CO?· Pro měření cytotoxicity byly buňky v médiu vysety do mikrotitrační desky (10⁴ na jamku) a po minimálně 2 hod byly k nim přidány testované sloučeniny v různých koncentracích v rozmezí 0,1 - 100μΜ. Po třech dnech kultivace byl přidán detekční roztok Calceinu AM (Molecular Probes) a po 1 hod byla pomocí mikrodestičkového fiuormetru Fluorskan Ascent (Microsystems) měřena fluorescence. Z grafů závislosti fluorescence, úměrné počtu živých buněk, na koncentraci testoío váné látky, byly odečteny hodnoty GI₅o, které představují koncentraci látek způsobující pokles počtu živých buněk na 50 % (Obr. 2).

Cytotoxický potenciál nových sloučenin byl studován na souboru buněčných linií s různým histologickým původem. Všechny testované sloučeniny vykazovaly výrazný cytotoxický účinek na

-26 CZ 302711 B6 většinu buněčných linií (např. Tab. 10). Nové sloučeniny měly účinek zejména na liniích s prokázanými mutacemi v genech regulujících buněčný cyklus, jako jsou HL-60, BT549, Hela, U2OS, MDA-MB23I, a další. Tyto výsledky naznačují, že nové sloučeniny mohou mít výrazný účinek také na nádory in vivo, a to nezávisle na funkčnosti či mutacích genů regulujících cyklus (např.

nádorové supresory p53, Rb, atd.).

Tabulka 10: Cytotoxické schopnosti vybraných nově připravených derivátů substituovaných 6(2-hydroxybenzylamino)purinů.

	SUBSTITUENTY NA PURINU	IC₅„(gM)
	R6	R2	R9	MCF7	«562	nos
OC	benzyl	2-hydroxyethyl amino	methyl	133	163	144
¹	2-hy droxy-5-chlorbenzy lamino	2-ítminoeyklohexy lamino	methyl	43	78	65
2	2-hy droxy-5-chlorbenzy lam ino	4-amínoeyk lohexylamino	methyl	46	82	64
J	2 -hy droxy-5 -chlorbenzy lam i no	(1 -hydroxymet Iiylpropy1)amino	methyl	55	84	71
7	2-hydroxy-5-fíuorbenzylamino	2-aminocyklohexylamino	methyl	35	61	47
8	2-hydroxy-5-lluorbenzy lamino	4-aminocyklohexylamino	methyl	39	64	50
9	2-hydroxy-5-Huorbenzy lamino	(1 -bydroxymethylpropy l)amino	methyl	42	67	53
31	2-hy droxy-3-methoxy benzylam i no	2-am mocy k lohexy 1 am i no	methyl	36	60	45
47	2-hydroxy-5-chl orbenzy lam ino	2-aminocy klohexylamino	ethyl	32	55	41
50	2-hyd roxy-5-chl orbenzy lamino	(l-hydroxymethylpropyl)amino	ethyl	38	58	44
51	2-hydroxy-5-fluoi benzy 1 amino	4-aminocy klohexylamino	ethyl	32	52	to
ROSC	benzyl	(l-hydroxymethylpropyl)amino	isopropy l	12,3	45.5	24.3
76	2-hy droxy-5-chlorbenzy lam ino	2-aminoey klohexylamino	isopropy l	2.8	9.9	4.1
79	2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino	(1-hydroxy methy Ipropyl lamino	isopropy!	3.5	11.9	5,3
86	2-hy droxy-5-fl uorbenzyl amino	2-aminocyklohexylamino	isopropy 1	1,8	7.6	3.2
89	2-hydroxy-5-íluorbenzy lamino	(1 -hydroxymethyl propy l)ammo	isopropyl	3.2	14,7	5,3
107	2-hydroxy-5-methy! benzylam i no	(1 -hydroxymethyl propyl )am ino	isopropy!	6.6	24,9	18
125	2-hydroxy-3-metlioxybenzy lam i no	2-aniinocyfe lohexy lamino	isopropyl	3.2	10,9	n.t.
128	2-hydroxy-3-methoxy benzyl amino	{l-bydroxymetliylpropyljamino	isopropyl	5,0	15,5	5.9
143	2-hydroxy-5-methoxybenzy lamino	2-aminocyklohexylamino	isopropyl	5,0	13,1	n.t.
179	2-hyd roxy-5-chlorbenzyl amino	2-aminocyklohexylamino	benzyl	8.7	19,5	10,2
186	2-hydroxy-5-ll uorbenzyl amino	2-aminoey klohexylamino	benzyl	6.9	15,4	9,3
223	2-hydroxy-5-ehlorbenzy lamino	2-aminoey klohexylamino	3-pentyl	4,8	17,6	6,8
224	2-hy droxy-5 -chl orbenzy 1 am ino	(l-hydroxymethylpropyl lamino	3-pcntyl	5,5	15.6	7.2
226	2-hy droxy-5 -fl uorbenzyl am ino	2-aminocyklohexylamino	3-pentyl	4.1	12.4	4,3
228	2-hy droxy-5-fluorbenzy lam ino	(1 -hydroxymethyl propyOamino	3-pentyl	4.6	13,2	6,8

- 27 15 Příkladó

Inhibice CDK9 a inaktivace RNA polymerasy II

Vliv nových sloučenin na aktivitu CDK9 v buňkách byl monitorován mimo jiné také specifickou fosforylací jejich substrátů, jako je RNA polymerasa II, a to metodou imunoblotingu. Pro tuto analýzu byly buňky ovlivněné studovanými sloučeninami sklizeny škrabkou, opláchnuty 3x vychlazeným fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) a homogenizovány v lyzačním pufru (50mM Tris, pH 7,4, 250mM NaCI, 5mM EDTA, 50mM NaF, ImM Na^VOj,

1% Nonidet P40) doplněném o inhibitory proteas a losfatas (Sigma-Aldrich, USA). Homogenáty obsahující 20 pg proteinu byly rozděleny SDS-polyakrylamidovou elektroforézou (SDS-PAGE) a přeneseny na nitrocelulosovou membránu. Membrány byly blokovány v 5% nízkotučném mléku v PBS s 0,1% Tween 20 a proteiny na nich byly detekovány specifickými protilátkami. Primární protilátky specifické pro RNA polymerasu II zahrnovaly (Santa Cruz Biotechnology, California, USA): (i) N-20 použitá v koncentraci 1 pg/ml, (ii) H14, specifická pro fosforylovanou formu serinu-5, použitá v koncentraci 6 pg/inl a (iii) 115, specifická pro fosforylovanou formu serinu-2, použitá v koncentraci 4 pg/ml. Další primární protilátky zahrnovaly (iv) antip53 (klon DO-1) použitá v koncentraci 1 pg/inl, (v) anti-p21^WAH (klon 118), použitá v koncentraci I pg/ml, (vi) anti-aetin (A-2066, Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA) použitá v koncentraci 1 pg/ml, (vii) anti-T-antigen (419, in house), použitá v koncentraci 1 pg/ml, Všechny primární protilátky byly ředěny v blokovacím médiu. Sekundární protilátky, králičí imunoglobuliny proti myším imunoglobulinům a prasečí imunoglobuliny proti králičím imunoglobulinúm (DAKO, Denmark), byly značeny křenovou peroxidasou ajejich aktivita byla vizualízována chemiluminiscenčním kitem EC'L (Amersham-Pharmacia, Líttle Chalfont, UK).

C-tcrminální doména největší podjednotky RNA polymerasy lije důležitou regulační doménou, často označovanou jako CTD (C-termínal domain), aje fosforylována specificky CDK9 na serinech 2. Sledovali jsme proto vliv nových sloučenin na ťosfórylaci CTD serinů 2 a 5. Úroveň fosfory láce obou serinových zbytků v buňkách MCF-7 vystavených vlivu nových sloučenin výrazně klesala, jak je doloženo na příkladu sloučeniny 128 (Obr. 3). Tyto experimenty jasně dokazují inhibiční vliv nových sloučenin na CDK a RNA polymerasu II a navíc dokládají, že mechanismus cytotoxického působení těchto sloučenin je závislý na jejich vlivu na transkripci.

Příklad 7

Indukce nádorového supresoru p53 v nádorových buňkách

Silná protinádorová účinnost nově připravených sloučenin může být dána také jejich pozitivním vlivem na stabilitu a aktivitu nádorového supresoru p53, která je pravděpodobně dána inhibici CDK2, CDK7 a CDK9. Protein p53, akumulovaný v jádrech buněk vystavených vlivu nových sloučenin, totiž stimuluje expresi přirozeného inhibitoru CDK, proteinu p21^WAH, který dále zesiluje inhibiční vliv sloučenin na buněčný cyklus. Pro kvantifikaci vlivu sloučenin na transkripční aktivitu proteinu p53 byla měřena enzymatická aktivita produktu reporterového genu (β-galaktosidasy) v buněčné linii Arn8. Linie Arn8 byla získána stabilní transfekcí linie A375 konstruktem pRGCAfoslacZ obsahujícím p53-responzívní receptor (Frebung et ai, Cancer Res., 52, 1992 6976). Tento systém umožňuje kvalitativní i kvantitativní zhodnocení vlivu nově připravených sloučenin na transkripční aktivitu závislou na p53 v buňkách. Měření je paralelně verifikováno nezávislými metodami, jako je např. immunoblotting proteinu p53 a proteinů jím kontrolovaných.

Aktivita β-galaktosidasy v buněčné linii Arn8 byla měřena podle publikované metody. Pro měření aktivity je nutné buňky zlyzovat a enzymovou aktivitu kvantifikovat kolorimetricky dle metody popsané Sambrookem et ai (Mol. Cloning, New York, 3989). Novějším způsobem je měření aktivity fluorimetricky, a to specifickou fluorescencí hydrolytického produktu získaného z methylumbelliferyl-P-D-galaktopyranosidu. Buněčné linie použité pro tyto experimenty (Arn8 a MCF-7) byly kultivovány v mediu DMEM doplněném supplemented 10% fetálního telecího séra za standardních podmínek.

Pro analýzu immunoblottingem byly buňky ošetřené studovanými sloučeninami sklizeny škrabkou, opláchnuty 3x vychlazeným PBS a homogen izovány v lyzačním pufru (50mM Tris, pH 7,4,

250mM NaCI. 5mM EDTA, 50mM NaF, ImM Na?VO₄, 1% Nonidet P40) doplněném o inhibitory proteas a fosťatas (Sigma-Aldrich, USA). Homogenáty obsahující 20 pg proteinů byly rozdě-28CZ 302711 B6 lény SDS-polyakrylamidovou elektroforézou (SDS-PAGE) a přeneseny na nitrocelulosovou membránu. Membrány byly blokovány v 5% nízkotučném mléku v PBS s 0,1% Tween 20 a proteiny na nich byly detekovány specifickými protilátkami. Byly využity protilátky specifické pro p53 (klon DO-I), p21^WAFI (klon 118), PARP-1 (2C10, Sigma-Aldrich St Louis, Missouri, USA), Mcl-1 (S—19, Santa Cruz, USA), všechny aplikované v koncentraci 1 pg/ml v blokovacím médiu. Sekundární protilátky, králičí imunoglobulíny proti myším imunoglobulinům a prasečí imunoglobuliny proti králičím imunoglobulinům (DAKO, Denmark), byly značeny křenovou peroxidasou ajejich aktivita byla vizualizována chemiluminiscenčním kitem ECL (Amersham— Pharmacia, Little Chalfont, UK).

Měření proapoptotického potenciálu nových sloučenin bylo založeno na analýze enzymové aktivity kaspas. Pro tuto analýzu byly buňky vystavené vlivu nových sloučenin sklizeny a homogenizovány v extrakčním pufru (10mM KCI, 5mM Hepes, lmM EDTA, lmM EGTA, 0,2% 3—[(3— cholamidopropyl)dimethylammonium]-l-propan sulfonát (CHAPS), inhibitory proteas, pH 7.4) na ledu po dobu 20 min. Homogenáty byly zbaveny nerozpustného podílu centrifugací při 10 000 g po dobu 20 min při 4 °C. Koncentrace proteinů byla stanovena metodou dle Bradfordové a lyzáty byly naředěny na stejnou koncentraci. Enzymová aktivita kaspas byla detekována po 1 hod inkubaci lyzátu se 100μΜ Ac-DEVD-AMC (syntetický tetrapeptidový fluorogenní substrát pro kaspázu 3 se štěpným místem Asp-Glu-Val-Asp) použitým jako substrát (Sigma-Aldrich) ve vhodném pufru (25mM piperazin-W'~bis(2—ethansulfonová) kyselina (PIPES)), 2mM EGTA, 2mM MgCl₂, 5mM DTT, pH 7,3). Fluorescence produktu štěpení byla měřena mikrodestičkovým fluorimetrem Fluorskan Ascent (Labsystems, Helsinki, Finland) při 346 nm/442 nm (ex/em).

Vliv nově připravených sloučenin na aktivaci proteinu p53 byl prokázán měřením v buněčné linii Am8. Akumulace a aktivace p53 v těchto buňkách vystavených např. vlivu sloučeniny 128 v koncentraci 5μΜ způsobuje aktivaci p53—responzivního promotoru a expresi genu pro β— galaktosidasu. Celková aktivita β-galaktosidasy v lyzátu buněk Arn8 byla měřena fluorimetricky. Výsledky dokládají výrazný nárůst aktivity tohoto enzymu v buňkách po 12 a 24 hod ve srovnání s kontrolními neovlivněnými buňkami (typická křivka závislosti aktivity β-galaktosidasy na koncentraci testované sloučeniny je uvedena na Obr. 4). Pokles fluorescence (aktivity β-galaktosidasy) při vyšších koncentracích testované sloučeniny může být vysvětlen kompletním blokem transkripce, což způsobilo pokles exprese měřeného enzymu. Aktivita p53-závislé transkripce v buňkách Arn8 byla také ověřena kolorimetricky. Typický zeleno-modrý signál chromogenního produktu enzymové reakce rozkládající substrát X-gal v ovlivněných zafixovaných buňkách in je dokumentován na mikrofotografíích na Obr. 4.

Schopnost aktivovat p53 byla dále ověřována analýzou proteinových hladin p53 a p21^WAF1v buňkách MCF-7. Akumulace proteinu p53 byla evidentní již po 4hod působení sloučenin, ale výrazné zesílení exprese proteinu p21^WAF1 bylo pozorováno teprve po 12hod působení sloučeniny 128 (Obr. 5). Doby působení 12 a 24 hod byly vybrány pro sledování vlivu na tyto vybrané proteiny, neboť předchozí analýzy ukázaly, že po této době jsou již proteinové hladiny ustáleny.

Většina nově připravených sloučenin vykazovala kvalitativně srovnatelné účinky, ale koncentrace indukující maximum aktivity β-galaktosidasy se lišily. Výsledky kvantitativního měření aktivity β-galaktosidasy pro některé žňových sloučenin jsou proto uvedeny v Tabulce 15, a to jako koncentrace indukující maximum enzymové aktivity. Tyto výsledky jednoznačně dokazují, že nově připravené sloučeniny jsou silnými induktory proteinu p53 a exprese jím řízené v buňkách se standardní (funkční) formou jeho genu.

Provedli jsme rovněž analýzu exprese proteinu p53 v dalších buněčných liniích, včetně nádorových linií odvozených z nádorů prsu BT549 (mutace p53) a BT474 (mutace p53), linii kolorektálního karcinomu HT29 (mutace p53), linie osteosarkomu HOS (mutace p53) a linie mnohočetného myetomu RPMI8226 (mutace p53). V žádné z uvedených linií se exprese p53 neměnila.

-29CZ 302711 B6

Dalším důležitým zjištěním bylo, že tyto linie s mutovaným p53 nejsou méně citlivé na studované látky než linie s funkčním p53.

V dalších pokusech byl sledován vliv nově připravených sloučenin na buněčné linie exprimující některé teplotně-senzitivní formy proteinu p53. Například v buněčných liniích BT474 a RPMI8226 je exprimována teplotně-senzitivní forma p53 (substituce E285K), jehož konformace se v závislosti na teplotě mění. Při restriktivní teplotě 37 °C je exprimovaný protein p53 nefunkční, avšak pri kultivaci buněk při permisivní teplotě (30 °C)je p53 konformován správně aje aktivní. Pro posouzení vlivu funkčního zapojení p53 do protinádorového účinku připravených sloučenin byly buňky RPMI-8226 kultivovány pri dvou různých teplotách (restriktivní i permisivní) se vzrůstajícími koncentracemi sloučenin. Po kultivaci byly z buněk připraveny lyzáty a v nich byly imunobiottingem analyzovány hladiny některých proteinů buněčného cyklu. Sloučenina 128 podporovala akumulaci funkčního p53 v buňkách kultivovaných při permisivní teplotě, ale nijak neovlivnila hladinu p53 v buňkách při restriktivní teplotě. Tento experiment vede k závěru, že sloučenina 128 podporuje stabilizaci funkční formy p53. Funkčnost p53 při permisivní teplotě byla navíc potvrzena sledováním některých proteinů, jejichž geny jsou řízeny p53, jako jsou p21^Wíltl a MDM2, jejichž buněčné koncentrace působením nově připravených látek vzrostly. Pri restriktivní teplotě nebyly tyto proteiny vůbec detekovány.

Pozoruhodný vliv sloučeniny 128 i roskovitinu byl také pozorován na zesílení indukci apoptózy, pokud byly tyto buňky kultivovány pri permisivní teplotě. Fragmentace proteinu PARP-1 byla pozorována po aplikaci dvakrát nižších koncentrací nově připravených sloučenin než v buňkách držených při restriktivní teplotě. Podobně reagoval také anti-apoptotický protein Mcl-1, jehož hladina klesala rychleji v buňkách po působení obou látek při 30 °C. Také aktivity kaspas-3/7 extrahovaných v buňkách držených v obou teplotních režimech se signifikantně lišily; byly vyšší v lyzátech připravených z buněk držených při teplotě 30 °C. Tato data dokazují, že standardní typ proteinu p53 exprimovaný v buňkách RPMI-8226 za pemnisivních podmínek usnadňuje indukci apoptózy vyvolanou působením nových sloučenin.

Tabulka 11: Vliv vybraných derivátů substituovaných 6-(2-hydroxybenzylamino)purinů na indukci proteinu p53 v buněčné linii Am8 stabilně transfekované reportérovým genem kódujícím β-galaktosidasu (-H- velmi silný, + slabý, - žádný vliv).

No	SUBSTITUENTY NA PURINU	p53 (vliv/ koncentrace maxima piku v μΜ)
	C6	C2	N9
ROSC	benzyl amino	{1 -hydroxyniethylpropyl)antmo	isopropyl	++/23,0
OCII	2-hydro xv benzylamino	{1 -hydroxymethylpropyDamino	isopropyl	++/ 12,0
79	2-hydroxy-5-chtorbeiizylaiitiiio	(1 -hydroxymethylpropyDamino	isopropyl	++ / 8.0
89	2-hy droxy-5 -11 uorbenzy lamino	11-hydroxymethylpropyDamino	isopropyl	++ ί 6,0
107	2-hy droxy-5-methyl benzy tam ino	(1 -hydroxymethylpropyDamino	isopropyl	t+/6,0
125	2-hydro xy-3-methoxy benzy lam ino	2-aminocyklohexylamino	isopropyl	++/ 10.0
126	2 -hydro xv-3-methoxy benzy lam i no	4-aminocyklohexylamino	isopropyl	++/ 11.0
128	2-hydroxy-3-methoxy benzy lamí no	(1 -hydroxymethylpropyDammo	isopropyl	++ / 8,0

-30CZ 302711 Β6

Příklad 8

Suché tobolky

5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 1250 g

Talek 180 g

Pšeničný škrob 120 g

Stearát hořečnatý 80 g

Laktosa 20 g

Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsí je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 9

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahuje jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

Lauroglykol 2 litry

Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 10

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, ta. 1 a 2, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

PEG 400 1 litr

Tween 80 1 litr

Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát. Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1* Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)puriny obecného vzorce I

U), kde

H) (R)„ znamená t až 4 substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné, přičemž tyto substituenty jsou vybrané ze skupiny zahrnující alkyl, alkoxy, amino. halogen, merkapto a nitro skupinu, a

R2 je R2'-NH~, ve kterém

R2' znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyi, aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin případně může být substituována jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino, hydroxy, merkapto, a alkoxy skupinu, a

R9 znamená substituent vybraný ze skupiny zahrnující alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkyl alkyi, aryl a arylalkyl skupinu, přičemž

25 alkoxy znamená -O-R_a, kde R_a je alkyl nebo cykloalkyl, amino znamená skupinu -NH:, halogen je vybrán ze skupiny zahrnující atomy fluoru, bromu, chloru a jodu, hydroxy znamená skupinu -OH, merkapto znamená skupinu -SH, .to alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 uhlíkových atomů, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, Ísopropyl, butyl, isobutyl, pentyl. isopentyl, hexyl, isohexyl;

alkenyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkeny lovou skupinu obsahující 2 až 7 uhlíkových atomů, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující vinyl, allyl. 1-propeny!, 1-methylethenyl, but35 1 až 3-enyl, pent-1 až 4-enyl, isopentenyl, 3,3-dimethylallyl, hex-1 až 5-enyl, hept-1 až 6enyl, cykloalkyl znamená monocykliekou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 15 uhlíkových atomů, přednostně cyklopropyl, cyklohexyl nebo cyklopentyl,

- 32 CZ 302711 Bó cykloalkyl alkyl znamená skupinu -R_b(cykloalkyl), kde cykloalkyl znamená eykloalkylovou skupinu, jak definováno výše, a R_b je alky lenová můstková skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, aryl znamená aromatickou karbocyklickou skupinu obsahující 6 až 18 uhlíkových atomů a tvořenou alespoň jedním aromatickým kruhem nebo násobně kondenzovanými kruhy, z nichž alespoň jeden kruh je aromatický, s výhodou aryl je fenyl, arylalkyl znamená skupinu -R_c-Ar, kde Ar znamená arylovou skupinu a Reje alkylenová můstková skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, s výhodu methylen, ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adičních solí s kyselinami.
2. Substituované 6-(2-hydroxybenzyIamino)purinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě (R) nebo (£) isomerů v případě chirality v pozici R2.
3. Substituované 6-(2- hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I podle nároku

1 vybrané ze skupiny zahrnující 2-({6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)aminoJ-9—(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl>-9/7-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, ;\^<>-(2-hydroxy-5chlorbenzyl)-_JY²-(2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9/7-purin-2,6—diamin. 2-({6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi,

3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/y-purin~2-yl}amino}_3-methylbutan-I-ol, 7V⁶-(2-hydroxy-5chlorbenzy1)-A’²-(4-aminocyklohexyl)9-(m ethyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2,6—diamin, l-({6[(2-hydroxy--5chlorbenzyl)amino|-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 3-({6[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino}-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-chiorbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol. 4-({6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyÍ, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl )~9H~purin-2-y l} amino)-2_methylpentan-2-ol, l-( {6-[(2-hydroxy-5chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl}amino)propan-2-ol, 4—({6—[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9f/-purin-2-yl}am ino)-2,3-di methy lbutan-2-ol, 3-({6-[(2hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylý-9//-purin-2-yl]amino}pentan—2-ol, 1({6-[(2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-puri n-2-yl }amino)-2-methylpropan-2-ol, 2-( {6-[(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9H-purin-2-yI}amino)butan-l-ol, ;V’-(2-hy droxy-3-chIor benzy 1)-Ύ²-( 2-am i nop ropy 1)-9-( methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/ř-purin-2,6-diamin, 2-{{6-[(2-hydroxy-3-chlorbenzyI)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yt} amino)-3methylbutan-l-ol, A⁶-(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)-/V²-(4-amÍnocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9/í-purin-2,6-diamin, 7V⁶-(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)-V²—(4—aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2,6-diamin, l-({6~[(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino]-9-(methyI, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)~9tf-purin-2-yJ}amino)propan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-3chlorbenzyl)amÍno]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9Á/-purin-2yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 3-( {6-[(2-hy d roxy-3-chl orbě nzyl)am i no]-9-( methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6[(2-hydroxy—3-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyi, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/f-purin-2-yl}amino)-2methylpentan-2-ol, 4—({6-[(2-hydroxy-3-chlorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyi, 3pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl}amino}~2,3-dimethylbutan-2-ol, 3—< (6—[(2—

-33 CZ 3027 Π Β6 hydroxy-3ehlorbenzyl)amino|-9-(methyl, ethyl, isopropyl. 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//purin-2-yljamino)-2-methylpentan-2 -ol, 3-( j6-[(2-hydroxy -3 ehlorbenzyl)amino|-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-penlyl, cyklohexyl, benzyl)-9Z/-piinn-2 yl Jamino) pentan-2-ol, I({6_| (2-hydroxy-3-ehlorbenzyl )amino )-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl}--9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 2-< {6-[(2-hy droxy-5- fluorbenzyl)aminoHmcthyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9Á/-punn-2-yl}ainino)butanI —ol, V’-( 2-hy droxy-5- fiuorbenzy 1)—/V²—(2-aminopropyl)-9- (methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl. benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, l-( {6-[(2-hydroxy-5“fluorbtínzyl)ammo)9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, bcnzyl)-9/7-pLirÍn-2-yl}amino)propan-2-ol,

2- ({6-f(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)am ino )-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9/7-pLirin-2-y0amino)-3-methylbutan-l-ol, V’-(2-hydroxy-5-íliiorbenzyl)-/V²-(4aminoeyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6diamin, l-({ó-)(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino )-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl Jamino)-2-methylpropan-2-ol, 3-( {6-[( 2-hy droxy-5tluorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/7-purin-2yl}amino)-2-methylbutan-2 ol. 4-({6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)aminol-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-punn-2 yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6í(2-hydroxy-5-f1uorbenzyl)amino)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4-( {6-[( 2-hy droxy-5-fluor benzy Oamino ]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/y-purin-2-yl jamino)-2,3-dimethyl” butan-2-ol, 3-( j6-[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)aminoj-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl. benzy! )-9A/-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5fluorbcnzyl)amino)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9Z/-purin-2yl|ainino)pentan-2-ol, 1 —({6—[(2-hy droxy-5-fiuorbenzy l}am i no )-2-( methyl, ethyl, isopropyl,

3- pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl}amino>-2--methyl propan-2-ol, 2-({6-[(2hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy1)-9/lpurin-2-yl}amino)butan-l-ol, 7V^í,-(2-hydroxy-5-jodobenzyl)-jV²-(2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purm-2,6-dÍamin, 2-({6-[(2-hydroxy-5jodobenzyl)am ino )-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3—pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purm-2yljamino)-3-methylbutan-l-ol, l-( {6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amíno]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}annino)propan-2-ol, KV⁶-(2-hydroxy5-jodobenzyl>—TV²—(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9H-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 3-({6[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9/Y-purin-2-yl jamino)--2--methyl butan--2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yljamino)-2metbylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl jamino)—2-methylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy5-jodobenzyl)amino]- 9 (methyl. ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/¥-purin-2-yljamino)-2-methylpentan-2—ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl jamino jpentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-jodobenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2methylpropan-2-ol, 2-( í6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yI}amino)butan-l-ol, A/⁶-(2-hydroxy-5-methylbenzyl>~jV²-(2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//purin-2,6-diamin, 2-{{6-[( 2-hy droxy-5-methy lbe nzy l)am i no]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-punn-2-yl )amino)-3-methylbutan-l-ol, ,V’-(2hydroxy-5methylbenzyl)-/V²-(4-aminocyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-punn-2,6-diamin, /^-(2 -hydroxy-5-methylbenzyl)-_JV²-{4-aminocyklohexyl>-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, l—({6—[(2— hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl. benzyl)9//-purin-2-yl}amino>-2-methylpropan-2-ol, 1-({6-[(2-hydroxy-5~ methy lbenzy l)ami no J-9- 34 CZ 302711 B6 (methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3({6-[(2-hydroxy-5~methyl benzy l)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-oI, 4~( {6-[(2-hydroxy-5-methy 1 benzy I)am i no]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2~yl}amino)-25 methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 4-({6-f(2-hydroxy5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin~

2- yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amíno]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, io 3-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//—purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-methylbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 2-<{6-[(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)~9//-punn-2-yl}amino)butan-l-ol, M-(2-hydroxy-3-methylbenzy!)-_JV²15 (2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6diamin, 2-( {6~[(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-punn-2-yl}amino)~3-methylbutan~l-ol, .V’-(2-hydroxy-3-methylbenz\l).V²-(4-aminocyklohexvl>-9-(methyl, ethyl, isopropyl. 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin2,6-diamin, .V’-(2-h\dro xy-3-methvlbenzyl)-;V²-( 4-aminocyklohexy 1)-9-(methyl, ethyl,

20 isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-piirin-2,6-diamin, l-({6-[(2-hydroxy-3-methyl· benzy!)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-3-methyÍbenzyl)amino]-9-(methy], ethyl, isopropyl, 3-pentyi, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol, 3-<{6-[(2hydroxy-3-methylbenzyl)amÍno]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)25 9//-purin-2-yI}amino)-2-methylbutan~2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino]-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cy k I ohexy I, benzyl )-9//-pur i n-2-y i} am i n oý-2-methy 1 pentan-2-o 1, 4-( {6-[(2-hyd roxy-3methyIbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-23o yl}amino)-2,3-dimethy lbutan-2-ol, 3-( {6-[(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol,

3- ({6~[(2-hydroxy-3-methylbenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy 1)-9//- purin-2-yl]amino)pentan-2-ol, I-({6-[(2-hydroxy~3-methylbenzyl)amino]-9~ (methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2~yl}amino)-2-methyl35 propan-2-ol, 2-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/ř-purin-2-yl}amino)butan-l-ol, A*-(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)-7V²-(2-aminopropyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy!)-9//purin-2,6~diamin, 2-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]~9-{methyl, ethyl, isopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2~yl}amino)-3-methylbutan-l-ol, _JV⁶-(2-hydroxy-340 methoxybenzyl)-iV²-(4-aminocyklohexyl}-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-pLirin-2,6-diamin, /V⁶-^2-hydroxy-3-methoxybenzyl)-/V²-{4—aminocyklohexyl)-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, 1—<{6—[(2— hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylý9//-purin-2-yl}amino)-2-methyIpropan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]45 9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)propan-2-ol,

3- ({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9—(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino}-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3-methoxy benzy l)am i no]-9-( methyl,

50 ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol,
4- ({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-3~ methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl}amino)-2,3-dimethy lbutan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl,

55 ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino>-2-methylpentan-2-ol,

-35 (’Ζ 302711 B6

3-(} 6-[(2-hy droxy-3-melhoxy benzy l)am ino )-9-(methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy 1 >-97/-purin-2~y I jam ino} pentan-2 ol, l-(|6—|(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)am ino )-9-( methyl, ethyl, ísopropyl, 3 pentyl, cyklohexyl, benzy 1)-97/-purin-2-yl}amino)-2-metliylpropan-2· ol, l-(}6-[(2-hydroxy-5-methoxy benzy l)am i no]-9-( methyl, ethyl, Ísopropyl, 3 pentyl, cyklohexyl. benzyl)-9//-purin-2yl}amino)propan-2-ol, 2—({6—[(2— hydroxy~5-methoxybenzyl)amino|-9-(methyl, ethyl, Ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)9//—purin—2—yl }amino)butan-l-ol, y’-(2-hydroxy-5-methoxybeiizyÍ)-/V²-(2-aminopropyl)-9(methyl, ethyl, Ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)—9//-purin-2,6-diamin, 2-({6-[(2hydroxy-5-fkiorbenzyl)amino)-9-{methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/pLirin-2-yl}amino)-3-niethylbutan-l-ol, Y’-(2-hydroxy-5-rnethoxybenzylHV²-(4-aminoeyklohexy 1)-9-(methyl, ethyl, Ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin”2,6-diamin, V’-(2-hydroxy-5-methoxybenzyl>—/V²—(4-aminocyklohexy 1)-9-(methyl, ethyl, Ísopropyl, 3pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2,6-diamin, 1-({6-[( 2-hy dro xy-5-meth oxybenzyl)amino]—9—(methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino )-9-( methy i, ethyl, Ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylbutan-2-ol, 4—({6— [(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin 2 _vúamino) 2 incthylbutan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino)-9-(methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-97/-piirin-2-yl}amino)-2methylpentan-2-ol, 4-({6-[(2-hydroxy-5-melhoxybenzyl)aminoJ-9-(methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2,3-dimethylbutan-2-ol, 3—({6—[(2— hydroxy-5-methoxybenzyl)aminoj-9-(methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)97/-purin-2-yl}amino)-2-nnethylpentan-2-ol, 3-( {6-[( 2-hyd roxy-5-meth oxy benzy l)am ino] 9-(methyl, ethyl, Ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-methoxybenzyl)amino)-9-(methyl, ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purÍn-2-yl}amÍno)-2-methylpropan-2—ol, 3-({6—[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-methyl-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5merkaptobenzyl)amino)-9-ethyl-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-isopropyi-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-9//-purin-2-yl}amino)-2methylpentan-2-ol, 3-( {6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzy l)amÍno]-9-benzyl-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-methyl-9//purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2hydroxy-5-mcrkaptobcnzyl)amino)-9—cthyl-97/purin-2-yl Jamino} pentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-isopropyl9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-h\droxy 5 -merkaptobenzyl)amino]-9-cykloΙι exy 1-9 /7—pu r i n-2-y 1 ] am i no} pe ntan-2-o 1, 3 -({6-[( 2-hy d roxy-5-mer kapto be n zy 1 )am i n o]-9benzyl-97/-piirin-2-yl]amino}pentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9eyklopropyl-977-purin-2-yl }amino)-2-methylpropan-2-ol, 1 -({6-[(2-hydroxy-5merkaptobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-97/-purin-2—yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 1-((6)(2-hydroxy-5-merkaptobenzyl)amino]-9-benzyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-nÍtrobenzyl)amino]-9-methyl-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-( (6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-ethyl-9//-purin-2-yl}amino)-2methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-isopropyl-9//-purin-2-y]}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-97/purtn-2-yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, 3-((6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-benzyl97/-purin-2~yl}amino)-2-methylpentan-2-ol. 3-({6-[( 2-hyd roxy-5-ni tro benzy l)am ino ]-9methyl-97/-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-((6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9ethyl-9//-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-isopropyl-97/purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-((6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9-cyklohexyl-97/-purin-2-yl]amino}pentan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)amino]-9benzyl-97/-purin-2-yl]amtno}pentan-2-ol, 1 -((6-[( 2-hyd roxy-5-n i trobenzyl)am i no]-9—cy klopropy l-97/-purin-2-y I} amino)-2-methylpropan-2-ol, I -({6-[<2-hydroxy-5-nitrobenzyl>

amin o]-9—eyklohexyl-97/-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5nitrobenzyl)amino]-9-benzyl-977-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 2-( (6—[(2— hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methy], ethyl, ísopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)- 36 CZ 302711 B6

9H-purin-2-y IJ amino) butan-1 -ol, A⁶-(2-hydroxy-5-aminobenzyl)-A^ř2-(2-am i n opropyl )-9(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/í~purin-2,6-diamin, 2-({6-[(2hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzylý9H-purin-2-yl}amino>-3-methylbutan-l -ol, //-^-hydroxy-S-aminobenzylj-M-^-amino5 cyklohexyl)-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2,6-diamin, l-({6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2-methylpropan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-yl}amino)-2methylbutan-2-ol, 4-ý{6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)am i no]-9-( methyl, ethyl, isopropyl, 3to pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-ylJamino)-2-methylbutan-2-ol, 4-{{6-[(2-hydroxy5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2yl}amino)-2-methylpentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl} amino )propan-2-ol, 4—({6—[(2— hydroxy-5—aminobenzyl)amino]-9~(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)15 9//-purin-2—yl Jam i no)-2,3-dimethyl butan-2-ol, 3-({6-[(2-hydroxy-5—aminobenzyl)amino]9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9//-purin-2-ylJamino}-2-methylpentan-2-ol, 3-({6~[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzy l)-9//-purin-2-yl]aminoj pentan-2-ol, l-({6-[(2-hydroxy-5-aminobenzyl)amino]-9-(methyl, ethyl, isopropyl, 3-pentyl, cyklohexyl, benzyl)-9/f-purin-2-ylJamino}~220 methyIpropan-2-ol.

4. Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako léčiva.
5. Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako inhibitory evklin-dependentních kinas vybraných ze

25 skupiny zahrnující cyklin-dependcntní kinasy 2, 5, 7, a 9.
6. Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purÍnové deriváty obecného vzorce I podle kteréhooliv z nároků 1 až 3 pro použití pri léčbě onemocnění zahrnujících buněčnou proliferací.
7. Substituované 6-(2-hydroxybenzyÍamÍno)purinové deriváty obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro indukci apoptosy v živočišných buňkách.

3<>
8. Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pri léčbě onemocnění zahrnujících buněčnou proliferací, s výhodou onemocnění vybraných z onemocnění zahrnujících nádorový supresor p53 a onemocnění zahrnujících cyklin-dependentní kinasy vybrané ze skupiny zahrnující cyklin-dependentní kínasy 2, 5, 7 a
9.

35 9. Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pri léčbě onemocnění vybraných ze skupiny zahrnující nádory, astma, kardiovaskulární, neurodegenerativní a zánětlivá onemocnění.
10. Substituované 6-(2-hy droxy benzy lam ino)purinové deriváty obecného vzorce 1 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití při léčbě onemocnění vybraných ze skupiny zahrnující nádo40 ry, restenózu, psoriázu, revmatickou artritis, diabetes I. typu, odmítnutí transplantátu neboli host versus graft disease, dnu, roztroušenou sklerózu, Parkinsonovu a Alzheimerovu chorobu.
11. Substituované 6-(2-hydroxybenzylamino)purinové deriváty obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pri potlačení zánětů.
12. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden substi45 tuovaný 6-(2-hydroxybenzyiamino)purinový derivát obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a farmaceuticky přijatelný nosič.