ES2708900A1 - Nuevos derivados de gramina con efecto protector de la actividad fosfatasa, y su aplicacion en el tratamiento de enfermedades humanas - Google Patents

Abstract

Nuevos derivados de gramina con efecto protector de la actividad fosfatasa, y su aplicación en el tratamiento de enfermedades humanas. {IMAGEN-01} La presente invención se refiere a compuestos de fórmula general (I), y su uso en la manufactura de medicamentos útiles para el tratamiento de enfermedades humanas, entre las que se encuentran, pero no limitadas, diversos tipos de cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del sistema nervioso, dolor y en general, cualquiera que curse con una inactivación, inhibición o depresión de la actividad enzimática de proteínas fosfatasas. Las enzimas fosfatasas participan en infinidad de procesos celulares esenciales, por lo que su disfunción provoca alteraciones que conducen a muy diversas patologías, según la enzima específica afectada, el sistema orgánico dañado o el estado general del enfermo. Así, los compuestos reivindicados en esta invención impiden su inhibición enzimática mediante un mecanismo competitivo sobre los inhibidores endógenos o agentes externos, tanto sintéticos como naturales, que puede deberse tanto a una interacción química sobre estos inhibidores, como a una interacción sobre las propias enzimas fosfatasas, y de esta manera evitar que estos inhibidores se acerquen al sitio catalítico de la presente invención se puede enmarcar en el campo de la industria farmacéutica.

Description

DESCRIPCION

NUEVOS DERIVADOS DE GRAMINA CON EFECTO PROTECTOR DE LA ACTIVIDAD FOSFATASA, Y SU APLICACION EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES HUMANAS

Sector de la tecnica

La presente invencion se incluye en el campo de la investigacion e industria farmaceutica. En particular, se centra en la smtesis qdmica de nuevos derivados basados en el alcaloide natural gramina y su aplicacion para el tratamiento de enfermedades humanas.

Estado de la tecnica

La principal vfa de regulacion celular consiste en la fosforilacion reversible de protemas, llevada a cabo por enzimas cinasas y fosfatasas, sobre residuos de tirosina (Tyr) o serina y treonina (Ser/Thr); esta separacion de funciones se debe a la diferente reactividad que implica la formacion del ester de fosfato o su hidrolisis sobre el fenol de Tyr o los alcoholes alifaticos presentes en Ser o Thr (Olsen JV y col. Cell 2006, 635). La union del grupo fosfato, un grupo voluminoso y con carga negativa a pH fisiologico, afecta directamente a la funcion proteica provocando cambios conformacionales que alteran su funcion catalftica, su afinidad por distintos ligandos, su localizacion subcelular o su estabilidad. Los procesos de fosforilacion y desfosforilacion deben estar estrechamente controlados ya que su desregulacion se asocia con gran variedad de enfermedades como el cancer, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares o las enfermedades neurodegenerativas (Zhang M y col. FEBS J 2013, 4739). Aunque existen evidencias de que tanto las enzimas cinasas como las fosfatasas se encuentran alteradas en estos escenarios patologicos, la mayona de los esfuerzos para disenar nuevos compuestos han estado dirigidos a la inhibicion de cinasas (Cohen P, Nat. Rev. Drug Disc. 2002, 309). Esta discriminacion se debe, en parte, a la creencia de que las fosfatasas son inespedficas. Por cada 10 Ser/Thr cinasas, hay una unica fosfatasa, y esto ha sido malinterpretado como que las fosfatasas son mas promiscuas y por tanto no adecuadas para ser consideradas dianas farmacologicas. Sin embargo, evidencias recientes demuestran lo contrario y nos presentan a las fosfatasas como prometedoras, aunque desafiantes, dianas terapeuticas (Zhang, 2013; McConnell JL y col. Mol. Pharmacol. 2009, 1249; Lajarm-Cuesta y col. Expert Opin. Ther. Pat. 2016, 389).

Segun su especificidad de sustrato, existen tres tipos de fosfatasas: Tyr fosfatasas, Ser/Thr fosfatasas y fosfatasas duales. Las Ser/Thr fosfatasas incluyen a las fosfoprotefnas fosfatasas (PPP, por sus siglas en ingles phosphoprotein phosphatases), las protefnas fosfatasas dependientes de metales y las fosfatasas basadas en aspartato (Fcp/Scp) (Shi Y Cell 2009, 468). Desde el punto de vista terapeutico, las mas importantes son las PPP, las cuales a su vez engloban a la fosfoprotefna fosfatasa 1 (PP1), fosfoprotefna fosfatasa 2A (PP2A), calcineurina (Cn, PP2C o PP3), fosfoprotefna fosfatasa 4 (PP4), fosfoprotefna fosfatasa 5 (PP5), fosfoprotefna fosfatasa 6 (PP6) y fosfoprotefna fosfatasa 7 (PP7). A pesar de tratarse de una superfamilia de enzimas, las enzimas PP1 y PP2A cubren el 90 % de la actividad Ser/Thr fosfatasa dentro de las celulas (Oliver CJ Front. Biosci. 1998, D961). Todos los miembros de la familia de las PPP comparten una alta homologfa en el sitio catalftico, tanto en la secuencia de aminoacidos como en el mecanismo de reaccion de la hidrolisis de esteres de fosfato, catalizada por metales. Seis aminoacidos conservados (tres histidinas, dos acidos asparticos y una asparragina) coordinan dos iones metalicos, que pueden ser Mg2+, Mn2+, Fe2+ o Zn2+ (Zhang, 2013). Estos metales se coordinan con una molecula de agua, activandola para realizar un ataque nucleofflico sobre el fosforo, eliminandolo del sustrato (Goldberg J Nature 1995, 745). La mayorfa de estas enzimas funcionan como holoenzimas, compuestas de una subunidad catalftica conservada y una gran variedad de subunidades reguladoras, que modulan la actividad de la primera, proveyendolas de la especificidad de sustrato y una sublocalizacion celular especffica (Shi, 2009).

Los principales inhibidores naturales son el acido okadaico (AO), la cantaridina, la nodularina, las microcistinas, la caliculina A, la fostriecina y la tautomicina. Estas toxinas ejercen una inhibicion de amplio espectro sobre las enzimas PPP a traves de su union al sitio activo, muy proximo a los dos iones metalicos, siendo calcineurina y PP7 las menos afectadas. Dado que la subunidad catalftica esta tan conservada, especialmente entre PP1 y PP2A, la selectividad de estas toxinas por cada subtipo de fosfatasa es pequena, mostrando valores de CI50 similares (Zhang, 2013; Swingle M y col. Meth. Mol. Biol. 2007, 23). No obstante, PP1 y PP2A realizan el 90 % de la actividad Ser/Thr fosfatasa celular (Oliver, 1998).

P P 1 es una Ser/Thr fosfatasa ubicua y de gran importancia por estar involucrada en un amplio rango de procesos celulares como la transcripcion de genes, la sfntesis de protefnas, el metabolismo de lfpidos y glucogeno, la contraccion muscular y la plasticidad sinaptica. Existe como una holoenzima compuesta por una subunidad catalftica (PP1c, 37 kDa) unida a mas de 50 subunidades reguladoras (PIP, protefnas que interaccionan con P P 1). Hay cuatro isoformas de P P 1c (PP1a , P P ip/5, P P 1y1 y P P 1y2), con los metales Mn2+ y Fe2+ situados en su sitio activo. Las PIP dotan a P P 1 de una sublocalizacion celular especffica y especificidad de sustrato, e incluso pueden ser sustratos de P P 1 por si mismas. La interaccion entre las PIP y P P 1c ocurre principalmente a traves de un motivo denominado RVxF, presente en mas del 90 % de las PIP, y un bolsillo hidrofobico RVxF/W de P P 1c, situado remotamente respecto al sitio catalftico. Este bolsillo de reconocimiento esta conservado solo en P P 1c, por lo que los compuestos dirigidos a el seran selectivos para P P 1. Los dos principales inhibidores endogenos de P P 1 son hPP1 y LPP1 (Shi, 2009).

PP2A es una de las enzimas mas abundantes en las celulas eucariotas (1 % del total de las protefnas celulares) (Cohen PT y col. Trends Biochem. Sci. 1997, 245), expresada de manera ubicua y muy conservada desde levaduras hasta humanos. PP2A participa en vfas celulares esenciales como el ciclo celular, el metabolismo, la migracion y las vfas de supervivencia, entre otras. Su alteracion esta asociada a multiples patologfas como el cancer, la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson o las enfermedades metabolicas. Se trata de una holoenzima heterotrimerica consistente en un nucleo heterodimerico y diferentes subunidades reguladoras (subunidad B). Dentro del nucleo heterodimerico, la subunidad catalftica (C o PP2Ac, 36 kDa) esta siempre asociada a la subunidad estructural (A o PR65 , 65 kDa). Los iones metalicos presentes en el sitio catalftico fueron identificados como dos iones de Mn2+ por Xing y col (Cell 2006, 341). Tanto la subunidad C como la A existen en dos isoformas, a y p. Las subunidades reguladoras incluyen cuatro familias: B (B55 o PR55), B’ (B56 o PR61), B’’ (PR48 , PR72 o P R 130) y B’’’ (PR93 o P R 110), y cada familia presenta de 2 a 5 isoformas con poca similitud entre ellas. La subunidad A presenta 15 repeticiones en tandem tipo HEAT (por sus siglas en ingles huntingtin-elongation-A subunit-TOR), reconociendo la subunidad C las repeticiones HEAT 11-15 y la subunidad B las repeticiones HEAT 2-8 (Shi, 2009). Estas subunidades nunca se encuentran por separado in vivo y, aunque dfmeros AC si son abundantes en tejidos, la forma predominante de PP2A son heterotrfmeros, es decir, el nucleo AC junto con la subunidad B. La actividad enzimatica completa de PP2A solo se consigue cuando la holoenzima heterotrimerica esta formada. La diversidad de subunidades B con las que puede interaccionar el nucleo AC (existen hasta 96 combinaciones), junto con sus diferentes expresiones segun el tipo de tejido y la celula, son los responsables de la especificidad de sustrato y sublocalizacion celular de PP2A. El mecanismo de regulacion de PP2A es extraordinariamente complejo (Haesen D y col. Front. Oncol. 2014, 347). Tras la sfntesis proteica de la subunidad C, para evitar que ejerza su actividad fosfatasa de manera indiscriminada, es inactivada mediante la union de dos protefnas: a4 (que se une a la subunidad C libre) y PP2A-metilesterasa 1 (PME-1, que se une al dfmero AC). Para generar las holoenzimas activas son necesarias enzimas reguladoras adicionales. En primer lugar, el activador fosfotirosil fosfatasa (PTPA, por sus siglas en ingles phosphotyrosyl phosphatase activator), con ATP y Mg2+ como cofactores necesarios, desfosforila PP2A en el residuo Tyr 307, promoviendo el plegamiento de la subunidad C en una conformacion activa y permitiendo asf a la enzima leucina carboxilo metiltransferasa 1 (LCMT-1) metilar el carboxilo terminal de la Leu 309 de PP2Ac. Esta metilacion es clave, ya que aumenta la afinidad del nucleo catalftico hacia las subunidades B y permite la formacion de la holoenzima heterotrimerica activa (Haesen, 2014). Por otro lado, en respuesta a diferentes estfmulos celulares, enzimas p60v-src y p56lck, factores de crecimiento o receptores de insulina pueden inducir la fosforilacion de la Tyr 307, dando lugar a la inactivacion de PP2A.

En estos casos, la enzima PTPA puede estimular a PP2A para que actue como una Tyr fosfatasa (lo que la convertirfa en una fosfatasa dual) y se reactive a si misma mediante autodesfosforilacion. Por ultimo, la desmetilacion de la Leu 309 por PME-1 tambien conduce a la inactivacion de PP2A por perdida de afinidad con las subunidades B (Sontag JM y col. Front. Mol. Neurosci. 2014, 16). Los principales inhibidores endogenos especfficos de PP2A son I1PP2A (tambien llamado ANP32a o PHAP-I), I2PP2A (tambien llamado SET, PHAP-II o TAFIP) y CIP2A (por sus siglas en ingles oncoprotein cancerous inhibitor of PP2A). La expresion de CIP2A apenas es detectable en celulas normales pero si tiene especial relevancia en tumorales, donde su sobreexpresion es indicadora de un mal pronostico para el paciente (Haesen, 2014). hPP2A e LPP2A, que estan altamente expresados en cerebro, ejercen su inhibicion a traves de su union directa a la subunidad C, aunque se desconocen los aminoacidos con los que interaccionan. LPP2A tiene una localizacion preferentemente nuclear, mientras que hPP2A es citosolica, y ambos pueden ser modificados por fosforilacion o modificar su expresion en respuesta a estfmulos celulares. El ejemplo mas destacado de esta regulacion es el mediado por la cinasa Bcr-abl, presente en pacientes con leucemia mieloide cronica y positivos para el cromosoma Filadelfia. Esta cinasa es capaz de promover la inhibicion de PP2A a traves de la sobreexpresion y fosforilacion del I2PP2A, lo cual conduce a la inmortalidad de las celulas leucemicas y es clave en el paso de leucemia mieloide en fase cronica a fase blastica (Neviani P y col, Cancer Cell 2005, 355). Otros inhibidores endogenos, como CIP2A y a4, tambien pueden estar sobreexpresados en ciertos subtipos de cancer, como por ejemplo el cancer de colon y el hepatico (Haesen, 2014). Ciertamente, PP2A se considera un importante supresor tumoral debido a su papel en el control del ciclo celular, por lo que es una de las dianas en terapia antineoplasica que mas interes esta despertando en los ultimos anos (Neviani y col. Clin. Cancer Res. 2014, 2026). Reafirmando su papel antitumoral, se ha visto que mutaciones en las distintas subunidades de PP2A conllevan la disociacion de la holoenzima y originan canceres de ovario, pulmon o colon (Haesen, 2014). En todos estos tipos de canceres, restaurar la actividad de PP2A es una estrategia prometedora. En cuanto a enfermedades del sistema nervioso, los altos niveles de expresion en cerebro de las dos isoformas de PP2Ac junto con la expresion especffica de ciertas isoformas de la subunidad B/PR55 y B’/PR61 sugieren que PP2A es clave para una funcion neuronal normal (Janssens V y col. Biochem. J.2001, 417). Dentro de las neuronas, esta fosfatasa esta especialmente asociada con los neurofilamentos, sobre los que regula su estado de fosforilacion y asf su estabilidad e interaccion con otros miembros del citoesqueletO. No obstante, el interes terapeutico sobre PP2A no radica en su papel sobre los neurofilamentos sino en la regulacion que ejerce sobre el estado de fosforilacion de la protefna asociada a microtubulos tau. PP2A es la principal fosfatasa cerebral responsable de la desfosforilacion de tau (> 70 %)(Liu F y col. Eur. J. Neurosci. 2005, 1942). Principalmente es la forma heterotrimerica con la subunidad reguladora Ba la que colocaliza con los microtubulos y tau, uniendose a ambos por lugares diferentes y pudiendo servir como punto de anclaje entre los dos (Sontag E y col. J. Biol. Chem. 1999, 25490; Xu Y y col. Mol. Cell 2008, 873). Mediante un ensayo in vitro de desfosforilacion y estudios de mutagenesis dirigida, Xu y col. dilucidaron los aminoacidos de contacto entre la subunidad B y la protefna tau: dos fragmentos en la protefna tau ricos en aminoacidos lisina, y por tanto de naturaleza basica, interaccionan con un bolsillo de caracter acido, rico en aminoacidos con carga positiva, presente en la subunidad Ba. El hecho de que haya dos secuencias de reconocimiento hace que la desfosforilacion de tau llevada a cabo por PP2A sea mucho mas eficiente, ya que ambas secuencias consiguen una mejor aproximacion de la protefna tau al sitio catalftico de PP2Ac (Xu, 2008).

Desde que en 1986 Grundke-Iqbal y col. descubrieron que la protefna tau hiperfosforilada era el principal componente de los NFT (Grundke-Iqbal I y col. J. Biol. chem. 1986, 6084), se han descubierto 30 residuos de Ser o Thr susceptibles de ser fosforilados (Gong CX y col. J. Neural Transm. 2005, 813). Los aminoacidos clave para su disociacion de los microtubulos y autoagregacion son Thr 231 y Ser 262, siendo tambien importantes Thr 181, Ser 199, Ser 202, Thr 212, Ser 396, Thr 403 y Ser 404 (Wang JZ y col. Eur. J. Neurosci. 2007, 59). Las fosfatasas que actuan sobre la protefna tau son PP1, PP2A, calcineurina y PP5, las cuales en condiciones fisiologicas contribuyen a su desfosforilacion en un 11, 71, 10 y 7 %, respectivamente (Figura 8) (Liu, 2005). Por tanto, PP2A es la principal fosfatasa que actua sobre tau, siendo capaz por si sola de desfosforilar todos los aminoacidos crfticos para su disociacion y agregacion. De hecho, de los 30 posibles residuos que tau puede tener fosforilados, todos pueden ser desfosforilados por PP2A, excepto Thr 212 y Ser 396, que son desfosforilados preferentemente por PP1 y calcineurina.

En los cerebros de pacientes con la EA, la hiperfosforilacion de la protefna tau se debe, al menos en parte, a una disminucion del 50 % de la actividad fosfatasa cerebral total, especialmente en areas de la corteza y el hipocampo (Gong CX y col. J. Neurochem. 1995, 732 y Curr. Med. Chem. 2008, 2321). Si se analiza la actividad de cada fosfatasa, PP2A se encuentra inhibida en un 50 % mientras que PP1 y PP5 en un 20 % (Liu, 2005), por lo que PP2A es la enzima mas afectada. Esta disfuncion de PP2A en pacientes con la EA ha sido ampliamente demostrada, describiendose deficits en la expresion genica de su subunidad C, afectando a la sfntesis del ARN mensajero (Vogelsberg-Ragaglia V y col. Exp. Neurol. 2001, 402) y de la protefna total (Sontag E y col. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2004, 287). Tambien la expresion de la subunidad Ba en la corteza frontal y la temporal esta disminuida, lo que correlaciona muy bien con la patologfa tau en pacientes con la EA. Asf mismo, los mecanismos de regulacion de PP2A estan alterados. La metilacion de PP2A se encuentra muy disminuida debido tanto a un aumento en la actividad de la enzima PME-1 como a la disminucion de la actividad de LCMT-1, lo que produce la inactivacion de PP2A y la perdida de afinidad por la subunidad Ba, responsable de la desfosforilacion de tau (Sontag E y col J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2004, 1080). Ademas, hay un aumento en la fosforilacion del residuo Tyr 307 de PP2Ac, lo cual la inactiva igualmente (Zhang CE, Neurobiol. Aging 2008, 1654). Por ultimo, en modelos de EA, existe un incremento del 20 % en la expresion de los inhibidores endogenos Ii PP2A e I2PP2A, asf como una traslocacion de este ultimo del nucleo al citosol (Tanimukai H y col. Am. J. Pathol.2005, 1761).

La inhibicion in vivo de PP2A conduce a signos y sfntomas que remedan la EA, incluidos los deficits cognitivos. La sobreexpresion de cualquiera de los inhibidores endogenos, Ii PP2A o I2PP2A, asf como el silenciamiento de la subunidad Ba, conducen a la hiperfosforilacion de la protefna tau, su disociacion de los microtubulos y la formacion de los NFT, la perdida de dendritas, alteraciones de los marcadores sinapticos y deficits en los test de comportamiento y de memoria espacial (Sontag E y col. Neuron 1996, 1201). Asf mismo, el inhibidor AO es una buena herramienta farmacologica para el estudio de la EA puesto que tambien reproduce dichas alteraciones (Sun L y col. Neurosci. 2003, 1175). No obstante, la inhibicion de PP2A no solo conduce a una hiperfosforilacion de la protefna tau por un descenso en su actividad fosfatasa, sino tambien por una regulacion al alza de enzimas cinasas como GSK-3P y cdk-5, las cuales aumentan su actividad si PP2A no es capaz de desfosforilarlas (Louis JV y col. PNAS 2011, 6957). PP2A tambien regula el metabolismo de la APP a traves de la desfosforilacion de su residuo Thr 668, de manera que ante una disminucion en la actividad de PP2A se favorece la produccion de PA (Sontag E y col. J. Neurosci. 2007, 2751). A su vez, cinasas como GSK-3P regulan la actividad enzimatica de PP2A a traves de la fosforilacion en Tyr 307 (Yao XQ y col. Biochem. J. 2011, 335), la inhibicion de LCMT-1 y la activacion de PME-1 (Yao XQ y col. FEBS Lett. 2012, 2522), asf como por la acumulacion citosolica de LPP2A (Tanimukai, 2005). Mencion especial merece la interaccion de PP2A y PP1 con el receptor de glutamato NMDA. Los receptores NMDA estan formados basicamente por las subunidades NR1 y NR2, y en algunos casos por NR3. El papel de PP2A, constitutivamente asociada a este complejo proteico, consiste en desfosforilar a Ser 897 de la subunidad NR1, disminuyendo asf la entrada de Ca2+ a traves del receptor (Chan SF y col. J. Neurosci. 2001, 7985). En condiciones patologicas, como la isquemia cerebral, se produce una sobreactivacion del receptor NMDA que provoca la disociacion de PP2A y una mayor permeabilidad de Ca2+. Por otra parte, PP1 regula la fosforilacion de la subunidad NR2, lo que tambien limita la entrada de Ca2+, reduciendo asf la posible muerte por excitotoxicidad, a la vez que activa vfas de neuroproteccion (Farinelli M y col. PloS one 2012, e34047).

Por todo ello, la reactivacion de Ser/Thr fosfatasas tiene el potencial de convertirse en una diana terapeutica factible para el tratamiento de gran variedad de enfermedades, como asf lo demuestran numerosas evidencias preclfnicas (Voronkov M y col. Future Med. Chem.

2011, 821). Sin embargo, a diferencia de PP2A, no se conoce ningun compuesto que actue sobre PP1 con indicacion para la EA, presumiblemente por despertar menos interes terapeutico ya que PP1 solo es responsable de un 20 % de la actividad fosfatasa sobre tau. Por el contrario, mas esfuerzos se han dirigido a desarrollar moduladores de la actividad de PP2A o compuestos con actividad dual sobre ambas fosfatasas. Segun Voronkov y col. (2011), existen diferentes familias de activadores de PP2A, que pueden ser agrupados en tres estrategias: 1) Activacion alosterica. Los primeros activadores de PP2A descritos fueron aminas basicas como la protamina y la polilisina, que se encuentran cargadas positivamente en pH fisiologico y son capaces de aumentar la actividad de PP2A mediante interaccion con su subunidad C (Pelech S y col. Eur. J. Biochem. 1985, 245). Las ceramidas son el ejemplo clasico de activadores endogenos de PP2A, las cuales son segundos mensajeros de naturaleza lipfdica generados por mecanismos dependientes de esfingomielinasa y que regulan el ciclo celular y la apoptosis. Las ceramidas pueden activar a PP2A por union directa a su subunidad B, a traves de la inhibicion de su desmetilacion o impidiendo la union del inhibidor endogeno I2PP2A (Dobrowsky RT y col. J. Biol. Chem. 1993, 15523). Recientemente, se ha visto que fenotiazinas como la perfenazina son capaces de inducir la apoptosis de celulas T en leucemia mieloide aguda a traves de una interaccion directa con la subunidad Aa (Gutierrez A y col. J. Clin. Invest. 2014, 644); 2) Inhibicion de una interaccion inhibidora. El FTY720 (Fingolimod) es un analogo sintetico de esfingosina aprobado para el tratamiento de la esclerosis multiple por su activacion de receptores de esfingosina 1-fosfato. No obstante, tambien es un potente activador de PP2A capaz de unirse al dominio de I2PP2A por el que se une a PP2Ac, provocando la disociacion del inhibidor endogeno, asf como su traslocacion al nucleo (Neviani P y col. J. Clin. Invest. 2007, 2408). Actualmente se estan disenando derivados de fingolimod carentes de actividad inmunosupresora (Neviani P y col. J. Clin. Invest. 2013, 4144); 3) Modulacion de enzimas que regulan PP2A a nivel postraduccional. Un ejemplo es la forskolina, que activa PP2A mediante la reduccion de la fosforilacion en Tyr307, por un mecanismo independiente de la activacion de la adenilato ciclasa (Cristobal I y col. Leukemia 2011, 606).

Neviani y col. fueron los primeros en defender el potencial interes terapeutico de farmacos activadores de PP2A, a los que llamaron PAD (por sus siglas en ingles PP2A-activating drugs). Demostraron como el uso de los activadores de PP2A fingolimod y forskolina tenia un efecto sinergico con el inhibidor de cinasas imatinib, para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda y cronica (Neviani, 2007). Actualmente, numerosas publicaciones defienden el uso de los PAD para el tratamiento del cancer y de enfermedades neurodegenerativas. A continuacion, se exponen los ejemplos mas relevantes:

Stock y col. observaron que extractos de diferentes plantas del genero Coffea mostraban una actividad inhibidora de la desmetilacion de PP2A, lo que reafirmarfa los estudios epidemiologicos que muestran una correlacion negativa entre el consumo del cafe y la incidencia de la EA y la enfermedad de Parkinson (Barranco-Quintana JL y col. Neurol. Res.

2007, 91). Se determino que el principal compuesto responsable de dicha actividad no era ni la cafefna ni ningun compuesto relacionado estructuralmente, sino el derivado indolico EHT (N-eicosanoilserotonina). Este compuesto es capaz de inhibir la desmetilacion de Leu 309 mediante la formacion de un complejo con PP2A que evita la interaccion con PME-1, manteniendo asf a la enzima en su forma activa. Posiblemente ese complejo tambien impida la union de inhibidores endogenos (Basurto-Islas G y col. Neurol. Aging 2014, 2701). En un modelo in vivo de EA inducido por la sobreexpresion del I2PP2A, el compuesto EHT, administrado via oral durante 6 meses, mantuvo la actividad fosfatasa de PP2A, revirtio la hiperfosforilacion de tau, disminuyo la expresion de PA y condujo a una reduccion de los deficits cognitivos. La biguanida metformina es capaz de prevenir la hiperfosforilacion de tau inducida por el AO o la fostriecina, en cultivo primario de neuronas murinas. El mecanismo propuesto es la interferencia con las protefnas MID y a4, las cuales regulan la degradacion de PP2Ac via proteasoma (Kickstein y col. PNAS 2010, 21830). En modelos in vivo de isquemia cerebral e in vitro de excitotoxicidad inducida por glutamato, la subunidad B/PR55 de PP2A se encuentra disminuida. Parece ser que uno de los mecanismos por los que la melatonina ejerce un efecto neuroprotector en estos modelos es a traves del mantenimiento de la actividad fosfatasa de PP2A, mediante la inhibicion del descenso en la expresion de esta subunidad B (Koh PO J. Pineal Res. 2012, 57. Varios artfculos demuestran que la memantina tambien actua como un activador de PP2A (Chohan MO y col. FEBS Lett. 2006, 3973). En cultivo organotfpico de rodajas de hipocampo de rata, tras la induccion de la hiperfosforilacion de tau con AO, la memantina, pero no otros antagonistas del receptor NMDA (como por ejemplo el acido 5,7-dicloroquinurenico o el acido D-2-amino-5-fosfopentanoico), es capaz de mantener la actividad fosfatasa de PP2A (Li L y col. FEBS Lett. 2004, 261). Posteriormente, en celulas PC-12 tratadas con AO, se demostro que el mecanismo implicaba un bloqueo de la interaccion entre el I2PP2A y PP2A, posiblemente mediante la inhibicion de la traslocacion del hPP2A del nucleo al citosol. De hecho, en ausencia del I2PP2A la memantina carece de efecto sobre PP2A (Chohan, 2006). Tambien el farmaco donepezilo parece tener un efecto activador sobre PP2A, aunque el mecanismo es desconocido (Noh MY y col. J. Neurochem. 2013, 562).

Por ultimo, el ion selenato (SeO42-) es un activador de PP2A potente y especffico para heterotrfmeros compuestos por la subunidad B/PR55, la responsable de la desfosforilacion de la protefna tau, siendo su mecanismo de accion la estabilizacion del complejo PP2A/tau (Corcoran NM y col. J. Clin. Neurosci. 2010, 1025). En varios modelos animales de EA, se ha observado como dosis bajas de Na2SeO4 via oral reducen la hiperfosforilacion de la protefna tau, previenen la formacion de los NFT, la consiguiente neurodegeneracion y el deficit cognitivo. Estos efectos son mediados por PP2A ya que el selenato no es capaz de reducir la hiperfosforilacion de tau en ratones que coexpresan una subunidad B/PR55 defectuosa (Van Eersel J y col. PNAS 2010, 13888). Recientemente, se ha completado el ensayo clfnico fase Ila en el que se ha demostrado que su sal sodica es segura y bien tolerada en pacientes con EA, por lo que parece prometedor (Malpas CB y col. J. Alz. Dis.

2016, 223).

Descripcion de la invencion

Descripcion breve

El objeto de esta invencion se refiere a nuevos compuestos basados en el esqueleto de gramina hasta ahora no descritos en la literatura cientffica, los cuales presentan en su molecula una o mas actividades biologicas que los convierten en productos potencialmente utiles, solos o en combinacion con otros farmacos, para el tratamiento de enfermedades humanas entre las que se encuentran, pero no limitadas, diversos tipos de cancer, enfermedades infecciosas, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del sistema nervioso, dolor y en general, cualquiera que curse con una inactivacion, inhibicion o depresion de la actividad enzimatica de protefnas fosfatasas.

Descripcion de las figuras

Figura 1. Ampliacion del modo de interaccion del derivado le con los aminoacidos de la subunidad catalftica de PP2Ac, dentro de un radio de 8 A.

Figura 2. Ampliacion de los residuos con los que el derivado Ir puede interaccionar, en un radio de 8A.

Descripcion detallada

La presente invencion se basa en la preparacion qufmica de una familia de compuestos, de formula general I, hasta ahora no descritos.

Estos nuevos compuestos, sometidos a evaluacion farmacologica, han presentado interesantes actividades biologicas:

• Mantenimiento de la actividad fosfatasa en cultivos celulares de neuroblastoma humano sometidos a un modelo de inactivacion de enzimas Ser/Thr fosfatasas

• Reduccion de la [Ca2+]c en cultivos celulares de neuroblastoma humano sometidos a despolarizacion por alto K+

• Neuroproteccion en cultivos celulares de neuroblastoma humano sometidos a un modelo de hiperfosforilacion de la protefna tau

• Neuroproteccion en cultivos celulares de neuroblastoma humano sometidos a un modelo de estres oxidativo

Los resultados obtenidos muestran que nos hallamos ante una familia de productos de alto interes terapeutico para el tratamiento de diversas enfermedades, como diversos tipos de cancer, enfermedades infecciosas, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del sistema nervioso, dolor y en general, cualquiera que curse con una inactivacion, inhibicion o depresion de la actividad enzimatica de protefnas fosfatasas

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invencion se refiere a los mismos productos de formula general (I):

donde:

Y puede ser un atomo de nitrogeno o un resto CH (carbono unido a hidrogeno).

Cuando Y = N, X podra ser un atomo de bromo o un resto alcoxido, es decir, un atomo de oxfgeno unido a alquilo del tipo metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo, tert-butilo o mayores elongaciones y ramificaciones de cadenas hidrocarbonadas saturadas.

Cuando Y = CH, X podra ser un atomo de cloro o hidrogeno.

Ri, R2 pueden ser cadenas alquflicas del tipo metilo, etilo, propilo o formar un ciclo donde Ri , R2 sean -CH2(CH2)nCH2-, siendo n un numero natural entero entre 1 y 5.

R3, R4, R5 definen el tipo sustitucion sobre el nitrogeno indolico, pudiendo ser esta sustitucion fenilo (-CR3R4R5 = -CeHe = -Ph), alquilo no ramificado (R3,R4 = H; R5 = propilo, Pr) o etinilo (-CR3R4R5 = -C=CH).

Un compuesto de formula general (I), donde X = H, Ri y R2 son metilos (CH3) y -CR3R4R5 es fenilo (-Ph), ha sido previamente descrito en “DL-p-(3-Oxindolyl)alanine(DL-hydroxytryptophan). I. Synthesis” Comforth JW y col. (1951) Biochemical Journal 48, 591-597, y en literatura cientffica posterior.

Un compuesto de formula general (I), donde X = H, R1 y R2 forman un ciclo tal que R1, R2 son -CH2(CH2)3CH2-, y -CR3R4R5 es fenilo (-Ph) ha sido previamente descrito en “Solvent-free aminoalkylation of phenols and indoles assisted by microwave irradiation” Sharifi A y col. (2001) Monatshefte fuer Chemie 132, 875-880; la sal de clorhidrato de este mismo compuesto ha sido previamente descrita en Ehrhart G , Henning, I “1-Benzylgramine derivatives with serotonin antagonism” (1961) Archiv der Pharmazie und Berichte der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft 294, 550-555.

Por “compuesto de la invencion” tambien se refiere en la presente invencion a cualquiera de sus derivados, un isomero, una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo. El termino “alquilo” o “alquiladas” se refiere en la presente invencion a cadenas alifaticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 atomos de carbono; por ejemplo, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, ter-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 6 atomos de carbono. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o mas sustituyentes tales como cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxilo, halogeno, haloalquilo, amino, aminoalquilo, aminocicloalquilo, amonioalquilo, amoniocicloalquilo o, en general, cualquier sustituyente situado en cualquier posicion.

En una realizacion preferida de la presente invencion, , R1 y R2 son metilo o forman un ciclo de piperidina con el N al que se unen (-CH2(CH2)3CH2-), y R3 es fenilo, propilo, o etinilo.

En otra realizacion mas preferida, los compuestos de la invencion se seleccionan de la lista que comprende:

• 1 -(1 -butil-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

• 1-butil-3-(piperidin-1-ilmetil)-1 H-indol

• H,H-dimetil-1 -(1 -(prop-2-in-1 -il)-1 H-indol-3-il)metanamina

• 3-(piperidin-1-ilmetil)-1 -(prop-2-in-1-il)-1 H-indol

• 1 -(1 -bencil-5-cloro-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

• 1 -bencil-5-cloro-3-(piperidin-1-ilmetil)-1 H-indol

• 1 -(1-butil-5-cloro-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

• 1 -butil-5-cloro-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-indol

• 1 -(5-cloro-1-(prop-2-in-1 -il)-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

• 5-cloro-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 -(prop-2-in-1 -il)-1 H-indol

• 1 -(1 -bencil-5-bromo-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina • 1 -bencil-5-bromo-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina

• 1 -(5-bromo-1 -butil-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina

• 5-bromo-1 -butil-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina

• 1 -(5-bromo-1 -(prop-2-in-1 -il)-1 H-pirrolo[2,3-b] piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina • 5-bromo-3-(piperidin-1-ilmetil)-1 -(prop-2-in-1-il)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina

• 1 -(1 -bencil-5-metoxi-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina

• 1 -bencil-5-metoxi-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina

Los compuestos de la presente invencion de formula (I) pueden ser obtenidos o producidos mediante una via sintetica qufmica y/o conseguidos a partir de una materia natural de distinto origen. Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento de obtencion de los compuestos de la invencion de formula (I), o un isomero, una sal farmaceuticamente aceptable y/o un solvato del mismo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) Reaccion de un compuesto derivado de indol de formula (II),

en donde X representa los atomos y sustituyentes indicados mas arriba al describir la formula general (I), en condiciones de sustitucion nucleofila en medio basico sobre haluros de alquilo. Esta reaccion darfa lugar a compuestos con formula general (III),

en donde R3, R4 y R5 representan los atomos y sustituyentes indicados mas arriba al describir la formula general (I)

b) Reaccion de Mannich con los compuestos de formula general (III) en medio acido debil, en presencia de formaldehfdo y dimetilamina o piperidina como fuentes de amina, para dar los compuestos de formula general (I).

c) Con el objeto de favorecer su manipulacion y solubilidad acuosa, los compuestos objeto de la presente invencion son sometidos a un tratamiento con acido oxalico en disolvente organico, generando la sal de oxalato de los compuestos de formula general (I).

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere al uso de los compuestos representados con la formula general (I) en la elaboracion de un medicamento o una composicion farmaceutica con actividades farmacologicas, utiles para el tratamiento de patologfas humanas o, en general, de enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biologicas mostradas por los productos descritos en la presente invencion, o bien de una sal, un derivado, profarmacos o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo.

Los compuestos de la invencion pueden estar en forma de aceites o sales de oxalato de forma cristalina, como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas esten dentro del alcance de la presente invencion. En este sentido, el termino “solvato”, tal como aquf se utiliza, incluye tanto solvatos farmaceuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de formula (I) que pueden ser utilizados en la elaboracion de un medicamento, como solvatos farmaceuticamente no aceptables, los cuales pueden ser utiles en la preparacion de solvatos o sales farmaceuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmaceuticamente aceptable no es crftica, siempre y cuando sea farmaceuticamente aceptable. En una realizacion particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por metodos convencionales de solvatacion bien conocidos por los expertos en la materia.

Asimismo, dentro del alcance de esta invencion se encuentran los profarmacos de los compuestos de formula (I). El termino “profarmaco” tal como aquf se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto de formula (I), por ejemplo, esteres, incluyendo esteres de acidos carboxflicos, esteres de aminoacidos, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metalicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto de formula (I) en el citado individuo. Ventajosamente, este derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de formula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberacion del compuesto de formula (I) en un receptor biologico. La naturaleza de dicho derivado no es crftica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de formula (I) en un receptor biologico del mismo. La preparacion de este profarmaco puede llevarse a cabo mediante metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Los compuestos de la presente invencion representados por la formula (I) pueden incluir isomeros, dependiendo de la presencia de enlaces multiples (por ejemplo, Z y E), incluyendo isomeros opticos o enantiomeros, dependiendo de la presencia de centros quirales en las cadenas Ri , R2, R3, R4 o R5. Los isomeros, los enantiomeros o los diastereoisomeros individuales, y las mezclas de los mismos caen, dentro del alcance de la presente invencion. Los enantiomeros o los diastereoisomeros individuales, asf como sus mezclas, pueden separarse mediante tecnicas convencionales.

Tal como aquf se utiliza, el termino “derivado” incluye tanto a compuestos farmaceuticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de formula (I) que pueden ser utilizados en la elaboracion de un medicamento, como derivados farmaceuticamente no aceptables, ya que estos pueden ser utiles en la preparacion de derivados farmaceuticamente aceptables. La naturaleza del derivado farmaceuticamente aceptable no es crftica, siempre y cuando sea farmaceuticamente aceptable.

Para su aplicacion en terapia, los compuestos de formula (I), sus isomeros, sus sales, sus profarmacos o sus solvatos se encontraran, preferentemente, en una forma farmaceuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmaceuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmaceuticos habituales, tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo materiales considerados toxicos a niveles de dosificacion normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, mas preferiblemente superiores al 70% y mas preferiblemente superiores al 90%. En una realizacion preferida, son superiores al 95% del compuesto de formula (I), o de sus sales, sus solvatos o profarmacos.

A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invencion tambien incluyen compuestos que difieren solo en la presencia de uno o mas atomos isotopicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepcion de la sustitucion de un hidrogeno por un deuterio o por tritio o la sustitucion de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C o un nitrogeno enriquecido en 15N, estan dentro del alcance de esta invencion.

Los compuestos descritos en la presente invencion, sus sales farmaceuticamente aceptables, sus profarmacos y/o sus solvatos, asf como las composiciones farmaceuticas que los contienen, pueden ser utilizados junto con otros farmacos adicionales para proporcionar una terapia de combinacion. Dichos farmacos adicionales pueden formar parte de la misma composicion farmaceutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composicion separada para su administracion simultanea, o no, a la de la composicion farmaceutica que incluye un compuesto de formula (I), o un profarmaco, solvato, derivado o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.

Los adyuvantes y los vehfculos farmaceuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y los vehfculos conocidos por los expertos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboracion de composiciones terapeuticas.

En el sentido utilizado en esta descripcion, la expresion “cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del agente o del compuesto capaz de desarrollar la accion terapeutica determinada por sus propiedades farmacologicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendra determinada, entre otras causas, por las caracterfsticas propias de los compuestos, la edad y el estado del paciente, la gravedad de la alteracion o del trastorno, y de la ruta y la frecuencia de administracion.

En otra realizacion particular, dicha composicion terapeutica se prepara en una forma solida o una suspension acuosa, en un diluyente farmaceuticamente aceptable. La composicion terapeutica proporcionada por esta invencion puede ser suministrada por cualquier via de administracion apropiada, para lo cual dicha composicion se formulara en la forma farmaceutica adecuada a la via de administracion elegida. En una realizacion particular, la administracion de la composicion terapeutica proporcionada por esta invencion se efectua por via oral, topica, rectal o parenteral.

El uso de los compuestos de la invencion es compatible con su utilizacion en protocolos en que los compuestos de la formula (I), o sus mezclas, se usan por si mismos o en combinaciones con otros tratamientos o cualquier procedimiento medico.

En otro aspecto, esta patente presenta un metodo para el tratamiento de pacientes afectados por enfermedades que afectan a la salud, consistente en la administracion a los individuos afectados por estas dolencias de cantidades terapeuticamente efectivas de un compuesto de formula (I), o una composicion farmaceutica que lo incluya. A tftulo de ejemplo, estas enfermedades podrfan ser diversos tipos de cancer, enfermedades infecciosas, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del sistema nervioso, dolor y en general, las enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biologicas mostradas por los productos descritos en la presente invencion.

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterfsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterfsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

EJEMPLOS

A continuacion, la invencion se ilustrara mediante unos ensayos realizados por los inventores que desarrollan el proceso de seleccion de los compuestos de la invencion.

1. OBTENCION DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION

Los compuestos cuya actividad biologica es objeto de la presente invencion se sintetizaron siguiendo un procedimiento general en sfntesis organica. Dicho procedimiento esta representado en el siguiente esquema de reacciones:

Los compuestos de formula (I) segun la presente invencion en los que X, Y, Ri, R2, R3, R4 Y R5 tienen los significados definidos en la reivindicacion 1, pueden ser preparados segun se describe a continuacion a partir de productos accesibles comercialmente o cuya preparacion se encuentra suficientemente descrita en el estado de la tecnica.

En la presente memoria se utilizan las siguientes abreviaturas con los significados que se detallan:

DMSO se refiere a dimetilsulfoxido,

AcOH se refiere al acido acetico,

AcOEt se refiere a acetato de etilo,

DMF se refiere a N,N-dimetilformamida

TLC se refiere a cromatograffa en capa fina (“Thin Layer Chromatography”),

Ph se refiere a un resto fenilo

Para la preparacion de los compuestos de forma general (II) donde X es un alcoxido, es decir, un atomo de oxfgeno unido a un resto alquilo, los compuestos de forma general (II) donde X es un atomo de Br se someten a tratamiento con el alcoxido sodico (RO-Na+) de eleccion en una mezcla de disolventes N,N-dimetilformamida y un alcohol en presencia de bromuro cuproso, manteniendo la mezcla en agitacion durante varias horas, despues de lo cual se elimino el disolvente a vacfo y se extrajo en una mezcla de agua y AcOEt. El producto, aislado de la fase organica, se purifico por cromatograffa en columna.

Los compuestos de formula general (II) donde Y = CH son sometidos a condiciones de desprotonacion en la amina con NaH en DMSO bajo atmosfera de argon, despues de lo cual se anade al medio de reaccion el correspondiente haluro de alquilo para proporcionar los compuestos con formula general (III), los cuales, una vez completada la reaccion y posterior work-up por extraccion con CH2Ch y evaporacion del disolvente, se obtienen puros sin necesidad de purificacion cromatografica.

Los compuestos de formula general (II) donde Y = N son sometidos a condiciones de sustitucion nucleofila en la amina con potasa (KOH) en presencia de un catalizador de transferencia de fase, como por ejemplo hidrogeno sulfato de tetrabutilamonio en acetona bajo atmosfera de argon, despues de lo cual se anade al medio de reaccion el correspondiente haluro de alquilo para proporcionar los compuestos con formula general (III), los cuales, una vez completada la reaccion y posterior work-up por extraccion con CH2Cl2 y evaporacion del disolvente, se aislo el producto que se purifico por cromatograffa en columna.

Los compuestos de formula general (III) se anadieron a una mezcla de formaldehfdo, y HN(CH^s)2 o piperidina como fuente de amina, en AcOH glacial a 0 °C y en atmosfera de argon, despues de lo cual se mantuvo la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 2 a 5 h. Cuando la reaccion no evaluciono mas (TLC), se interrumpio con solucion acuosa basica, extrayendo el compuesto puro con CH2Cl2 y posterior evaporacion.

EJEMPLOS DE REALIZACION

Ejemplo 1.- Sintesis de los compuestos de la invencion y su caracterizacion analitica y espectral

1.1. Procedimiento para la sfntesis de compuestos de formula (II) donde X = OCH³

Se siguio el metodo descrito por Wu y col. (J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 14426-1427. A una disolucion de 5-bromo-1H-pirrolo[2,3-b]piridina (1 equiv, 1 g, 5,07 mmol) en una mezcla de DMF (6,31 ml/mmol, 32 ml) y CH3OH (4 ml/mmol, 20 ml), bajo argon y agitacion, se anadio consecutivamente CH3ONa (53 equiv, 14,5 g, 268,7 mmol) y CuBr (2 equiv, 1,45 g, 10,1 mmol), a temperatura ambiente. La mezcla se calento a reflujo de 175 °C durante 4,5 h. Cuando la reaccion no evoluciono mas, se enfrio a temperatura ambiente y se elimino el disolvente a vacfo. El residuo se disolvio en agua (30 ml) y se extrajo con AcOEt (3 x 30 ml/mmol). La fase organica combinada se seco con Na2SO4 anhidro, se filtro y el disolvente se evaporo a vacfo. El crudo de reaccion se purifico por cromatograffa flash, utilizando como eluyente una mezcla de CH2Ch/MeOH (99/1). El producto resultante (5-metoxi-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina, compuesto de formula general (II) donde X = OCH3 e Y = N es un solido blanco (451 mg, 60 %). RMN de 1H (CDCL, 300 MHz) 59,23 (bs, 1H, NH), 8,12 (bs, 1 H, H6), 7,49 (d, 1H, J4-6 = 2,1, H4), 7,31 (d, 1 H, J2-3 = 3,0 Hz, H2), 6,45 (d, 1H, J2-3 = 3,0 Hz, H3), 3,90 (s, 3H, CH5). Datos espectrales acordes con la literatura (Wu, 2006).

1.2. Procedimiento general I para la sfntesis de compuestos de formula (III) donde Y = CH (N-alquilacion de 5-X-indol)

A una solucion de indol o 5-cloroindol (1 equiv.) en DMSO (1,4-5 ml/mmol de sustrato) se adiciono hidruro sodico (60% en aceite mineral, 1,2 equiv.) bajo argon. La mezcla de reaccion se mantuvo a temperatura ambiente con agitacion durante 1 o 2 h, tras lo cual se anadio el correspondiente haluro de alquilo (1,2—1,7 equiv), dejandose en agitacion 1-2 h mas, siguiendo la evolucion de la reaccion por TLC. Cuando la reaccion se completo, se adiciono agua (10 ml/mmol de sustrato) para parar la reaccion, y la mezcla se extrajo con CH2Cl2 (3 x 30 ml/mmol de sustrato). La fase organica se seco con Na2SO4 anhidro, se filtro y el disolvente se evaporo a vacfo. Los productos resultantes son aceites amarillentos que no necesitaron purificacion adicional por cromatograffa.

- 1-butil-1H-indol (Ilia). Siguiendo el Procedimiento General I, indol (250 mg, 2,13 mmol) [DMSO (8 ml), NaH (102 mg, 2,56 mmol), yoduro de butilo (291 pl, 2,56 mmol)] dio lugar a IIIa (339 mg, 92 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 57,67 (ddd, 1H, J4-7 = 0,9 Hz, J4-6 = 1,2 Hz, J4-5 = 7,8 Hz, H4), 7,44 (dm, 1H, J6-7 = 8,1 Hz, H7), 7,26 (ddd, 1H, J4-6 = 1,2 Hz, J5-6 = 7,4 Hz, J6-7 = 8,1 Hz, H6), 7,22 (d, 1H, J2-3 = 3,0 Hz, H2), 7,13 (ddd, 1H, J5-7 = 0,9 Hz, J5-6 = 7,4 Hz, J4-5 = 7,8 Hz, H5), 6,52 (dd, 1H, J3-7 = 0,6 Hz, J2-3 = 3,0 Hz, H3), 4,12 (t, 2H, J^nch2^ch2 = 6,9 Hz, NCH2), 1,79 (m, 2H, NCH2CH2), 1,32 (m, 2H, CH2CH3), 0,95 (t, 3H, J^ch2^ch3 = 8,8 Hz, CH3). Datos espectrales acordes con la literatura (Baehn S y col. Chem. Eur. J.

2010, 16, 3590-3593.

- 1-(prop-2-in-1-il)-1H-indol (Illb). Siguiendo el Procedimiento General I, indol (250 mg, 2,13 mmol) [DMSO (8 ml), NaH (102 mg, 2,56 mmol), 3-bromoprop-1-ino (285 ^ , 2,56 mmol)] dio lugar a Illb (289 mg, 87 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 57,70 (dm, 1H, J4-5 = 7,8 Hz, H4), 7,53 (dm, 1H, J6-7 = 8,1 Hz, H7), 7,34 (d, 1H, J2-3 = 3,3 Hz, H2), 7,29 (ddd, 1H, J4-6 = 1,2 Hz, J5-6 = 7,2 Hz, J6-7 = 8,1 Hz, H6), 7,19 (ddd, 1H, J5-7 = 0,9 Hz, J4-5 = 7,8 Hz, J5-6 = 7,2 Hz, H5), 6,58 (dd, 1H, J3-7 = 0,7 Hz, J2-3 = 3,3 Hz, H3), 4,98 (d, 2H, J^ch2^cch = 2,7 Hz, CH2), 2,92 (t, 1H, Jchcch2 = 2,7 Hz, CH).

- 1-bencil-5-cloro-1H-indol (lllc). Siguiendo el Procedimiento General I, 5-cloroindol (294 mg, 1,94 mmol) [DMSO (9 ml), NaH (93 mg, 2,33 mmol), bromuro de bencilo (275 ^ , 2,33 mmol)] dio lugar a lllc (434 mg, 93 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 57,69 (dd, 1H, J4-7 = 0,7 Hz, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,40-7,13 (m, 8H, Ar), 6,56 (dd, 1H, J3-7 = 0,9 Hz, J2-3 = 3,3 Hz, H3), 5,33 (s, 2H, CH2). Datos espectrales acordes con la literatura (Evans DA y col. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 10780).

- 1-butil-5-cloro-1H-indol (llld). Siguiendo el Procedimiento General I, 5-cloroindol (294 mg, 1,94 mmol) [DMSO (9 ml), NaH (93 mg, 2,34 mmol), yoduro de butilo (265 ^ , 2,33 mmol)] dio lugar a llld (384 mg, 95 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 57,61 (bd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,38 (bd, 1H, J6-7 = 8,7 Hz, H7), 7,27 (d, 1H, J2-3 = 3,3 Hz, H2), 7,16 (dd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, J6-7 = 8,7 Hz, H6), 6,45 (dd, 1H, J3-7 = 0,9 Hz, J2-3 = 3,3 Hz, H3) 4,11 (t, 2H, JNCH2CH2 = 7,2 Hz, NCH2), 1,75 (m, 2H, NCH2CH2), 1,29 (m, 2H, CH2CH3), 0,90 (t, 3H, Jch2ch3 = 7,2 Hz, CH3).

- 5-cloro-1-(prop-2-in-1-il)-1H-indol (llle). Siguiendo el Procedimiento General I, 5-cloroindol (245 mg, 1,62 mmol) [DMSO (8 ml), NaH (78 mg, 1,94 mmol), 3-bromoprop-1-ino (252 ^ , 2,26 mmol)] dio lugar a llle (300 mg, 98 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 5 7,63 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,50 (bd, 1H, J6-7 = 8,7 Hz, H7), 7,40 (d, 1H, J2-3 = 3,0 Hz, H2), 7,21 (dd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, Je-y = 8,7 Hz, H6), 6,50 (dd, 1H, J3-7 = 0,9 Hz, J2-3 = 3,0 Hz, H3), 5,03 (d, 2H, J^ch2^cch = 2,7 Hz, CH2), 2,95 (t, 1H, J^chcch2 = 2,7 Hz, CH).

I. 2. Procedimiento general II para la sfntesis de compuestos de formula (III) donde Y = N (N-alquilacion de 5-X-7-azaindol)

Basado en el procedimiento descrito por Garcfa-Frutos y col. (J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9173-9177), a una disolucion del sustrato correspondiente de formula general (II) con Y = N (1 equiv) en acetona (11 ml/mmol), se anadieron KOH (1,5 equiv), hidrogenosulfato de tetrabutilamonio (catalizador de transferencia de fase) (0,2 equiv) y el correspondiente haluro de alquilo (1,2 equiv). La mezcla se calento a 75 °C con agitacion en atmosfera inerte durante 2-5 h. Una vez completada la reaccion, monitorizada por TLC, se dejo enfriar hasta temperatura ambiente y se anadio agua (10 ml/mmol). La mezcla de reaccion se extrajo con CH2Cl2 (3 x 30 ml/mmol) y la fase organica combinada se seco con Na2SO4 anhidro, se filtro y el disolvente se evaporo a vacfo. El crudo de reaccion se purifico por cromatograffa en columna flash, utilizando como eluyente una mezcla de hexano/acetato de etilo (85/15), obteniendose el producto como un aceite.

- 1-bencil-5-bromo-1H-pirrolo[2,3-b]piridina (Illf). Siguiendo el Procedimiento General II, 5-bromo-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina (350 mg, 1,78 mmol) [KOH (168 mg, 2,70 mmol), [CH3(CH2)3]4N(HSO4) (51 mg, 0,15 mmol), bromuro de bencilo (252 pl, 2,13 mmol), acetona (20 ml)] dio lugar a IIIf (506 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 58,32 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H6), 8,14 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,55 (d, 1H, J2-3 = 3,3 Hz, H2), 7,28 (m, 5H, Ar), 6,50 (d, 1H, J2-3 = 3,3 Hz, H3), 5,52 (s, 2H, CH2). Datos espectrales acordes con la literatura (Laha JK y col. Chem. Comm. 2016, 52, 4329-4332)

- 5-bromo-1-butil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina (IIIg). Siguiendo el Procedimiento General II, 5-bromo-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina (350 mg, 1,78 mmol) [KOH (168 mg, 2,70 mmol), [CH3(CH2)3]4N(HSO4) (51 mg, 0,15 mmol), 1-iodobutano (243 pl, 2,13 mmol), acetona (20 ml)] dio lugar a IIIg (452 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 58,33 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H6), 8,05 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,42 (d, 1H, J2-3 = 3,6 Hz, H2), 6,42 (d, 1H, J2-3 = 3,6 Hz, H3), 4,26 (t, 2H, Jnch2ch2 = 7,2 Hz, NCH2), 1,79 (m, 2H, NCH2CH2), 1,26 (m, 2H, CH2CH3), 0,87 (t, 3H, J^ch2^ch3 = 7,5 Hz, CH3).

- 5-bromo-1-(prop-2-in-1-ii)-1H-pirroio[2,3-b]piridina (Illh). Siguiendo el Procedimiento General II, 5-bromo-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina (400 mg, 2,03 mmol) [KOH (192 mg, 3,09 mmol), [CH3(CH2)3]4N(HSO4) (59 mg, 0,15 mmol), 3-bromoprop-1-ino (271 pl, 2,44 mmol), acetona (23 ml)] dio lugar a Illh (255 mg, 53 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 58,32 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H6), 8,11 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,60 (d, 1H, J2-3 = 3,3 Hz, H2), 6,51 (d, 1H, J2-3 = 3,3 Hz, H3), 5,14 (d, 2H, Jch2cch = 2,7 Hz, CH2), 2,94 (t, 1H, Jchcch2 = 2,7 Hz, CH).

- 1-bencii-5-metoxi-1H-pirroio[2,3-b]piridina (IIIi). Siguiendo el Procedimiento General II, 5-metoxi-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina (80 mg, 0,054 mmol) [KOH (51 mg, 0,82 mmol), [CH3(CH2)3]4N(HSO4) (16 mg, 0,04 mmol), bromuro de bencilo (77 pl, 0,65 mmol), acetona (6 ml)] dio lugar a IIIi (128 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 58,10 (d, 1h, J4-6 = 2,7 Hz, H6), 7,52 (d, 1H, J4-6 = 2,7 Hz, H4), 7,42 (d, 1H, J2-3 = 3,3 Hz, H2), 7,27 (m, 5H, Ar), 6,43 (d, 1 H, J2-3 = 3,3 Hz, H3), 5,49 (s, 2H, CH2), 3,84 (s, 3H, CH3).

1.3. Procedimiento general III para ia sfntesis de compuestos de formula (I) (reaccion de Mannich)

Una disolucion de dimetilamina (40 %aq) o piperidina (1-1,5 equiv.) y formaldehido (37 %aq, 1-2 equiv.) en AcOH glacial (0,3-5,5 ml/mmol), bajo atmosfera de argon y agitada durante 10 min, se adiciono a una solucion de IIIa-i (1 equiv.) en AcOH glacial (0,1-2 ml/mmol) a 0 °C, dejando en agitacion durante 5 min, despues de lo cual se llevo la disolucion a temperatura ambiente y se agito durante 2-24 h. Cuando la reaccion dejo de evolucionar (TLC), se anadio NaOHaq (30%) hasta pH 14. La mezcla se extrajo con CH2Ch (3 x 30 ml/mmol de sustrato) y la fase organica resultante se seco con Na2SO4 anhidro, se filtro y el disolvente se evaporo a vacfo. En ciertos casos, los productos obtenidos necesitaron purificacion por cromatograffa en columna utilizando alumina basica como fase estacionaria. Posteriormente, todo los productos, en forma de aceites, se salinizaron a sales de oxalato. Las sales de oxalato se prepararon mediante la adicion gota a gota de una solucion de acido oxalico 1 M en acetato de etilo seco (1 equiv), bajo argon, al compuesto (I) previamente disuelto en acetato de etilo.

Una vez anadida la cantidad necesaria de acido, se mantuvieron en agitacion 2 h. El solido formado se decanto por centrifugacion y las trazas de disolvente se evaporaron a vado. Los disolventes empleados en la salinizacion se secaron previamente sobre MgSO4 anhidro.

- 1-(1-butil-1H-indol-3-il)-N,N-dimetilmetanamina (la). Siguiendo el Procedimiento General Ill, llla (174 mg, 1 mmol) [dimetilamina (127 gl, 1,00 mmol), formaldeddo (76 gl, 1,00 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a la. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (80/20) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (79 mg, 34 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 57,67 (dm, 1H, J4-5 = 8,1 Hz, H4), 7,37 (dm, 1H, J6-7 = 8,1 Hz, H7), 7,15 (m, 2H, H5 y H6), 7,01 (ddd, 1H, J4-5 = 8,1 Hz, J5-6 = 7,8 Hz, H5), 4,16 (t, 2H, J^nch2^ch2 = 6,9 Hz, NCH2CH2), 3,56 (s, 2H, C3CH2), 2,19 [s, 6H, N(CH3)2], 1,80 (m, 2H, NCH2CH2), 1,33 (m, 2H, CH2CH3), 0,92 (t, 3H, J^ch2^ch3 = 7,2 Hz, CH3).

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 142-144 °C. RMN de 13C (DMSO-de, 75,4 MHz) 5163,4; 135,8; 131,6; 127,7; 121,7; 119,7; 118,8; 110,3; 102,3; 50,8; 45,3; 41,1; 31,7; 19,4; 13,5. Anal. Elem. calc. para C15H22N2 H2O C2H2O4: C, 60,34; H, 7,74; N, 8,28. Encontrado: C, 60,54; H, 7,62; N, 7,97.

- 1-butil-3-(piperidin-1-ilmetil)-1H-indol (lb). Siguiendo el Procedimiento General lll, llla (170 mg, 0,98 mmol) [piperidina (97 gl, 0,98 mmol), formaldehfdo (74 gl, 0,98 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a lb. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (80/20) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (209 mg, 79 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 57,73 (dm, 1H, J4-5 = 7,8 Hz, H4), 7,36 (dm, 1H, Je-7 = 8,1 Hz, H7), 7,14 (m, 2H, H2 y H6), 7,02 (ddd, 1H, J4-5 = 7,8 Hz, J5-6 = 7,8 Hz, H5), 4,12 (t, 2H, J^nch2^ch2 = 7,1 Hz, NCH2CH2), 3,62 (s, 2H, C3CH2), 2,41 (m, 4H, H2'), 1,78 (m, 2H, NCH2CH2), 1,53 (m, 4H, H3'), 1,43 (m, 2H, H4'), 1,33 (m, 2H, CH2CH3), 0,92 (t, 3H, J^ch2^chs = 7,2 Hz, CH3).

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 156-158 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,4; 135,8; 131,5; 128,0; 121,7; 119,7; 118,9; 110,3; 101,2; 51,2; 50,5; 45,4; 31,8; 22,6; 21,5; 19,5; 13,5. Anal. Elem. calc. para C18H26N2-C2H2O4: C, 66,64; H, 7,83; N, 7,77. Encontrado: C, 66,28; H, 7,68; N, 7,64.

- N,N-dimetil-1-(1-(prop-2-in-1-il)-1H-indol-3-il)metanamina (Ic). Siguiendo el Procedimiento General III, Illb (167 mg, 1,08 mmol) [dimetilamina (136 gl, 1,08 mmol), formaldehfdo (81 gl, 1,08 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Ib como un aceite amarillo que no requirio purificacion (228 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 5 7,71 (dm, 1H, J4-5 = 8,1 Hz, H4), 7,47 (dm, 1H, J6-7 = 8,4 Hz, H7), 7,26 (s, 1H, H2), 7,20 (ddd, 1H, J4-6 = 1,2 Hz, J5-6 = 7,8 Hz, J6-7 = 8,4 Hz, H6), 7,07 (ddd, 1H, J5-7 = 1,2 Hz, J4-5 = 8,1 Hz, J5-6 = 7,8 Hz, H5), 5,02 (d, 2H , JNCH2CCH = 2,4 Hz, NCH2CCH), 3,59 (s, 2H, C3CH2), 2,93 (t, 1H, Jnch2cch = 2,4 Hz, CH), 2,21 [s, 6H, N(CH3)2].

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 168-170 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,2; 135,6; 131,0; 127,9; 122,1; 120,2; 119,0; 110,5; 103,8; 78,8; 76,0; 50,8; 41,3; 35,3. Anal. Elem. calc. para C14H16N2 C2H2O4: C, 63,56; H, 6,00; N, 9,27. Encontrado: C, 63,73; H, 6,03; N, 8,94.

- 3-(piperidin-1-ilmetil)-1-(prop-2-in-1-il)-1H-indol (Id). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIb (118 mg, 0,76 mmol) [piperidina (75 gl, 0,76 mmol), formaldehfdo (58 gl, 0,76 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Id. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (80/20) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (191 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 57,75 (dm, 1H, J4-5 = 8,1 Hz, H4), 7,46 (dm, 1H, Je-7 = 8,1 Hz, H7), 7,22 (s, 1H, H2), 7,19 (ddd, 1H, J5-6 = 7,8 Hz, J6-7 = 8,1 Hz, H6), 7,07 (ddd, 1H, J4-5 = 8,1 Hz, J5-6 = 7,8 Hz, H5), 5,01 (d, 2H , J^nch2C^ch = 2,4 Hz, NCH2CCH), 3,61 (s, 2H, C3CH2), 2,92 (t, 1H, Jnch2cch = 2,4 Hz, CH), 2,40 (m, 4H, H2'), 1,53 (m, 4H, H3'), 1,41 (m, 2H, H4').

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 162-164 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,1; 135,5; 131,1; 128,2; 122,1; 120,2; 119,0; 110,5; 103,2; 78,8; 76,1; 51,3; 50,3; 35,3; 22,6; 21,4. Anal. Elem. calc. para C17H20N2 H2O C 2H2O4: C, 63,32; H, 6,71; N, 7,77. Encontrado: C, 63,09; H, 6,51; N, 7,80.

- 1-(1-bencil-5-cloro-1H-indol-3-il)-N,N-dimetilmetanamina (Ie). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIc (219 mg, 0,91 mmol) [dimetilamina (115 gl, 0,91 mmol), formaldehfdo (68 gl, 0,91 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Ie como un aceite amarillo que no requirio purificacion (269 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 5 7,79 (bd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,36-7,14 (m, 7H, Ar), 7,11 (dd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, Je-7 = 8,1 Hz, H6), 5,34 (s, 2H, NCH2Ph), 3,57 (s, 2H, C3CH2), 2,22 [s, 6H, N(CH3)2].

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 177-179 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,3; 137,4; 135,7; 134,4; 133,5; 129,1; 128,6; 127,6; 127,0; 124,9; 122,0; 118,5; 50,6; 49,4; 41,3.

Anal. Elem. calc. para C18H19CW2 C2H2O4: C, 61,78; H, 5,44; N, 7,20. Encontrado: C, 61,67; H 5,51; N, 6,99.

- 1-bencil-5-cloro-3-(piperidin-1-ilmetil)-1H-indol (If). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIc (219 mg, 0,91 mmol) [piperidina (90 gl, 0,91 mmol), formaldehfdo (68 gl, 0,91 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a If. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (90/10) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (278 mg, 91 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 57,77 (bd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,37-7,16 (m, 7H, Ar), 7,08 (dd, 1 H, J4-6 = 2,1 Hz, J6-7 = 8,7 Hz, H6), 5,38 (s, 2H, NCH2Ph), 3,60 (s, 2H, C3CH2), 2,39 (m, 4H, H2'), 1,53 (m, 4H, H3'), 1,42 (m, 2H, H4').

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 198-200 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,1; 137,4; 134,4; 133,4; 129,3; 128,6; 127,6; 127,1, 124,8; 121,9; 118,5; 112,3; 51,4; 50,3; 49,4; 22,7; 21,6. Anal. Elem. calc. para C21H2sClN2-C2H2O4: C, 64,41; H, 5,88; N, 6,53. Encontrado: C, 64,30; H, 5,79; N, 6,29.

- 1-(1-butil-5-cloro-1H-indol-3-il)-N,N-dimetilmetanamina (Ig). Siguiendo el Procedimiento General III, IIId (168 mg, 0,81 mmol) [dimetilamina (102 gl, 0,81 mmol), formaldehfdo (61 gl, 0,81 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a 35 como un aceite amarillo que no requirio purificacion (210 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 5 7,71 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,37 (d, 1H, J6-7 = 8,7 Hz, H7), 7,21 (s, 1H, H2), 7,11 (dd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, J6-7 = 8,7 Hz, H6), 4,14 (t, 2H, JNCH2CH2 = 7,2 Hz, NCH2CH2), 3,53 (s, 2H, C3CH2), 2,18 [s, 6H, N(CH^s)2], 1,78 (m, 2H, NCH2CH2), 1,29 (m, 2H, CH2CH3), 0,93 (t, 3H, J^ch2^ch3 = 7,2 Hz, CH3).

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 150-152 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5163,7; 134,3; 133,2; 128,9; 124,7; 121,7; 118,3; 112,0; 102,5; 50,5; 45,6; 31,7; 19,3; 13,5. Anal. Elem. calc. para C15H21ClN2-H2O-C2H2O4: C, 54,76; H, 6,76; N, 7,51. Encontrado: C, 54,48; H, 6,32; N, 7,83.

- 1-butil-5-cloro-3-(piperidin-1-ilmetil)-1H-indol (Ih). Siguiendo el Procedimiento General III, Illd (212 mg, 1,02 mmol) [piperidina (101 pl, 1,02 mmol), formaldehfdo (76 pl, 1,02 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Ih. El crudo se purifico por cromatograffa en columna de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (80/20) como eluyente (287 mg, 92 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 57,73 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,38 (d, 1H, J6-7 = 8,7 Hz, H7), 7,20 (s, 1H, H2), 7,10 (dd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, J6-7 = 8,7 Hz, H6), 4,14 (t, 2H, J^nch2^ch2 = 7,2 Hz, NCH2CH2), 3,57 (s, 2H, C3CH2), 2,37 (m, 4H, H2'), 1,78 (m, 2H, NCH2CH2), 1,52 (m, 4H, H3'), 1,42 (m, 2H, H4'), 1,29 (m, 2H, CH2CH3), 0,91 (t, 3H, J^ch2^ch3 = 7,5 Hz, CH3).

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 184-186 °C. RMN de 13C (D2O gotas de acetona-d6 para calibracion, 75,4 MHz) 5 165,5; 134,5; 133,3; 128,7; 125,5; 122,3; 117,7; 112,0; 100,9; 52,1; 51,1; 46,0; 31,3; 22,8; 21,0; 19,3; 12,8. Anal. Elem. calc. para C18H25CIN2 C2H2O4: C, 60,83; H, 6,89; N, 7,09. Encontrado: C, 60,48; H, 6,75; N, 7,01.

- 1-(5-cloro-1-(prop-2-in-1-il)-1H-indol-3-il)-N,N-dimetilmetanamina (Ii). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIe (121 mg, 0,64 mmol) [dimetilamina (81 pl, 0,64 mmol), formaldehfdo (48 pl, 0,64 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Ii como un aceite amarillo que no requirio purificacion (149 mg, 95 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 5 7,72 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,48 (d, 1H, J6-7 = 8,7 Hz, H7), 7,32 (s, 1H, H2), 7,17 (dd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, J6-7 = 8,7 Hz, H6), 5,04 (d, 2H, Jnch2cch = 2,4 Hz, NCH2CCH), 3,54 (s, 2H, C3CH2), 2,96 (t, 1H, JNCH2CCH = 2,4 Hz, CH), 2,19 [s, 6H, N(CHs)2].

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 170-172 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,1; 134,1; 132,5; 129,1; 125,1; 122,1; 118,6; 112,2; 104,1; 78,5; 76,3; 50,7; 41,5; 35,6. Anal. Elem. calc. para C14H15CIN2 C2H2O4: C, 57,06; H, 5,09; N, 8,32. Encontrado: C, 56,73; H, 5,05; N, 8,03.

- 5-cloro-3-(piperidin-1-ilmetil)-1-(prop-2-in-1-il)-1H-indol (Ij). Siguiendo el Procedimiento General III, Ille (117 mg, 0,62 mmol) [piperidina (61 gl, 0,62 mmol), formaldehfdo (47 gl, 0,62 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Ij. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (50/50) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (175 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 57,76 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,47 (d, 1H, J6-7 = 8,7 Hz, H7), 7,29 (s, 1H, H2), 7,17 (dd, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, J6-7 = 8,7 Hz, H6), 5,03 (d, 2H , JNCH2CCH = 2,4 Hz, NCH2CCH), 3,57 (s, 2H, C3CH2), 2,95 (t, 1H, JNCH2CCH = 2,4 Hz, CH), 2,38 (m, 4H, H2'), 1,52 (m, 4H, H3'), 1,41 (m, 2H, H4').

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 187-189 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,3; 134,1; 132,7; 129,4; 125,2; 122,1; 118,6; 112,2; 103,3; 78,5; 76,4; 51,3; 49,9; 35,6; 22,6; 21,5. Anal. Elem. calc. para C17H19ClN2-C2H2O4: C, 60,56; H, 5,62; N, 7,43. Encontrado: C, 60,14; H, 5,73; N, 7,14.

- 1-( 1-bencil-5-bromo-1H-pirrolo[2,3Jb]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina (Ik). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIf (134 mg, 0,47 mmol) [dimetilamina (118 gl, 0,47 mmol), formaldehfdo (70 gl, 0,47 mmol), acido acetico glacial (2,5 ml)] dio lugar a Ik como un aceite verdoso que no requirio purificacion (161 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 58,32 (d, 1 H, J4-6 = 2,1 Hz, H6), 8,24 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,41 (s, 1H, H2), 7,27 (m, 5H, Ar), 5,47 (s, 2H, NCH2Ph), 3,52 (s, 2H, C3CH2), 2,17 [s, 6H, N(CHs)2].

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 203-205 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5175,7; 155,2; 154,0; 146,9; 144,1; 140,5; 139,0; 138,1; 137,2; 132,1; 122,3; 111,3; 61,6; 58,4; 51,7. Anal. Elem. calc. para C17H18BrNs C2H2O4: C, 52,55; H, 4,64; N, 9,68. Encontrado: C, 52,42; H, 4,64; N, 9,41.

- 1 -bencil-5-bromo-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1H -pirrolo[2,3-b]piridina (Il)

Siguiendo el Procedimiento General III, IIIf (280 mg, 0,98 mmol) [piperidina (96 gl, 0,98 mmol), formaldehfdo (73 gl, 0,98 mmol), acido acetico glacial (2,5 ml)] dio lugar a Il. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (80/20) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (372 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 58,31 (d, 1H, J4-6 = 2,4 Hz, H6), 8,27 (d, 1H, J4-6 = 2,4 Hz, H4), 7,38 (s, 1H, H2), 7,27 (m, 5H, Ar), 5,46 (s, 2H, NCH2Ph), 3,55 (s, 2H, C3CH2), 2,35 (m, 4H, H2'), 1,50 (m, 4H, H3'), 1,38 (m, 2H, H4').

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 214-216 °C. RMN de 13C (DMSO-de, 75,4 MHz) 5164,0; 145,4; 143,4; 137,5; 133,3; 130,0; 128,6; 127,6; 127,3; 121,9; 111,8; 51,5; 50,2; 47,5; 22,8; 21,6. Anal. Elem. calc. para C20H22BrN3 C2H2O4: C, 55,71; H, 5,10; N, 8,86. Encontrado: C, 55,58; H, 5,05; N, 8,52.

- 1-(5-bromo-1-butil-1H-pirrolo[2,3J0]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina (Im). Siguiendo el Procedimiento General III, Illg (174 mg, 0,69 mmol) [dimetilamina (87 pl, 0,69 mmol), formaldehfdo (52 pl, 0,69 mmol), acido acetico glacial (1,7 ml)] dio lugar a Im como un aceite que no requirio purificacion (198 mg, 93 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 5 8,27 (d, 1H, J4-6 = 2,4 Hz, H6), 8,19 (d, 1H, J4-6 = 2,4 Hz, H4), 7,38 (s, 1H, H2), 4,25 (t, 2H, J^nch2^ch2 = 6,9 Hz, NCH2CH2), 3,52 (s, 2H, C3CH2), 2,17 [s, 6H, N(CHs)s>], 1,81 (m, 2H, NCH2CH2), 1,27 (m, 2H, CH2CH3), 0,93 (t, 3H , JCH2CH3 = 7,5 Hz, CH3).

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 181-183 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5164,2; 145,5; 143,1; 133,3; 129,9; 121,6; 111,5; 101,8; 50,9; 43,9; 41,5; 31,6; 19,3; 13,5. Anal. Elem. calc. para C14H20BrN3^C2H2O4: C, 48,01; H, 5,54; N, 10,50. Encontrado: C, 48,43; H, 5,46; N, 10,35.

- 5-bromo-1-butil-3-(piperidin-1-ilmetil)-1H-pirrolo[2,3-0]piridina (In). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIg (125 mg, 0,49 mmol) [piperidina (49 pl, 0,49 mmol), formaldehfdo (37 pl, 0,49 mmol), acido acetico glacial (1,8 ml)] dio lugar a In. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (80/20) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (175 mg, > 99 %). RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 58,27 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H6), 8,22 (d, 1H, J4-6 = 2,1 Hz, H4), 7,35 (s, 1H, H2), 4,24 (t, 2H, J^nch2^ch2 = 7,2 Hz, NCH2CH2), 3,55 (s, 2H, C3CH2), 2,35 (m, 4H, H2'), 1,81 (m, 2H, NCH2CH2), 1,51 (m, 4H, H3'), 1,40 (m, 2H, H4'), 1,28 (m, 2H, CH2CH3), 0,90 (t, 3H, JCH2CH3 = 7,2 Hz, CH3).

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 20 8 -210 °C. RMN de 13C (D2O gotas de acetona-d6 para calibracion, 75,4 MHz) 5 215,8; 145,4; 143,7; 134,4; 130,7; 122,7; 112 ,1 ; 100,4; 52,6; 51,3; 45,2; 31,8; 23,2; 21,4; 19,7; 13,2. Anal. Elem. calc. para C17H24BrN3C2H2O4: C, 51,83; H, 5,95; N, 9,54. Encontrado: C, 51,95; H, 5,81; N, 9,46.

- 1 -(5-bromo-1 -(prop-2-in-1 -il)-1H -pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-N, N-dimetilmetanamina (lo). Siguiendo el Procedimiento General III, Illh (143 mg, 0,61 mmol) [dimetilamina (77 pl, 0,61 mmol), formaldehfdo (46 pl, 0,61 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Io. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (50/50) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (114 mg, 64 % ) . RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 5 8,31 (d, 1H, J ^{4 -6} = 2,4 Hz, H6), 8,24 (d, 1H, J ^{4 -6} = 2,4 Hz, H4), 7,35 (s, 1H, H2), 5,10 (d, 2H , JNCH2CCH = 2,4 Hz, NCH² CCH), 3,56 (s, 2H, C ³ C H ² ), 2,93 (t, 1H, J nch² cch = 2,4 Hz, CH), 2,19 [s, 6H, N(CHs)²].

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 179 -181 °C . RMN de 13C (DMSO-de, 75,4 MHz) 5 164,1; 145,0; 143,6; 132,6; 130,3; 121,8; 112 ,1 ; 103,1; 78,7; 75,9; 50,8; 41,7; 33,7. Anal. Elem. calc. para C13HuBrN3C2H2O4: C, 47,14; H, 4,22; N, 10,99. Encontrado: C, 47,22; H, 4,34; N, 10,55.

- 5-bromo-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 -(prop-2-in-1 -il)-1H -pirrolo[2,3-b ]piridina (Ip). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIh (113 mg, 0,48 mmol) [piperidina (47 pl, 0,48 mmol), formaldehfdo (36 pl, 0,48 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Ip. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (1/99) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (143 mg, 89 % ) . RMN de 1H (acetona-de, 300 MHz) 58,31 (d, 1 H, J ^{4 -6} = 2,1 Hz, H6), 8,28 (d, 1 H, J ^{4 -6} = 2,1 Hz, H4), 7,50 (s, 1H, H2), 5,10 (d, 2H, J ^{nch2 cch} = 2,4 Hz, NCH ² CCH), 3,60 (s, 2H, C ³ CH ² ), 2,92 (t, 1H, J nch² cch = 2,4 Hz, CH), 2,38 (m, 4H, H2'), 1,53 (m, 4H, H3'), 1,42 (m, 2H, H4').

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 198-200 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5 163,9; 145,0; 143,4; 132,6; 130,1; 122,0; 112,0 ; 102,7; 78,6; 75,9; 51,5; 50,2; 33,6; 22,8; 21,6. Anal. Elem. calc. para CieHieBrNs^HsOp C, 51,20; H, 4,77; N, 9,95. Encontrado: C, 50,81; H, 4,74; N, 9,68.

- 1-(1-bencil-5-metoxi- 1H-pirrolo[2,3Jb]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina (Iq). Siguiendo el Procedimiento General III, Illi (73 mg, 0,31 mmol) [dimetilamina (39 gl, 0,31 mmol), formaldehfdo (23 gl, 0,31 mmol), acido acetico glacial (1,5 ml)] dio lugar a Iq como un aceite amarillo que no requirio purificacion (67 mg, 74 % ) . RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 5 8,03 (d, 1 H, J ^{4 -6} = 2,7 Hz, H6), 7,63 (d, 1H, J ^{4 -6} = 2,7 Hz, H4), 7,33 (s, 1H, H2), 7,27 (m, 5H, Ar), 5,45 (s, 2H, NCH² Ph), 3,86 (s, 3H, CH ³ ), 3,54 (s, 2H, C3CH2), 2,18 [s, 6H, N(CHa)²].

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 187-189 °C. RMN de 13C (DMSO-de, 75,4 MHz) 5 164,3; 151,5 ; 142,3; 138,0; 133,8; 132,3; 128,6; 127,4; 127,2; 119,9; 110,3; 101,7; 56,1; 51,0; 47,4; 41,3. Anal. Elem. calc. para C ¹⁸ H²¹ N³ C ² H² O⁴ : C, 62,33; H, 6,01; N, 10,90. Encontrado: C, 62,10; H, 5,92; N, 10,68.

- 1-bencil-5-metoxi-3-(piperidin-1-ilmetil)-1H-pirrolo[2,3Jb]piridina (Ir). Siguiendo el Procedimiento General III, IIIi (60 mg, 0,25 mmol) [piperidina (25 gl, 0,25 mmol), formaldehfdo (19 gl, 0,25 mmol), acido acetico glacial (2 ml)] dio lugar a Ir. El crudo se purifico por cromatograffa en columna flash de alumina utilizando una mezcla de hexano/acetato de etilo (50/50) como eluyente, obteniendose el producto puro como un aceite amarillo (66 mg, 78 % ) . RMN de 1H (acetona-d6, 300 MHz) 58,02 (d, 1 H, J ^{4 -6} = 2,4 Hz, H6), 7,67 (d, 1 H, J4-6 = 2,4 Hz, H4), 7,30 (s, 1H, H2), 7,27 (m, 5H, Ar), 5,44 (s, 2H, NCH2Ph), 3,86 (s, 3H, CH3), 3,57 (s, 2H, C3CH2), 2,37 (m, 4H, H2'), 1,52 (m, 4H, H3'), 1,40 (m, 2H, H4').

Se preparo la sal de oxalato de acuerdo a lo descrito en el Procedimiento General III. Pf 195 -197 °C. RMN de 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz) 5 164,3; 151,5 ; 142,3; 138,0; 133,7; 132,4; 128,6; 127,5; 127,3; 120,2; 110,3; 56,1; 51,2; 50,4; 47,5; 22,7; 21,5. Anal. Elem. calc. para C ²¹ H²⁵ N³ O C ² H² O⁴ : C, 64,93; H, 6,40; N, 9,88. Encontrado: C, 64,55; H, 6,33; N, 9,60.

Ejemplo 2.- Propiedades biologicas de los compuestos objeto de la invencion.

2.1. Materiales y Metodos

- Reactivos. Medio esencial mfnimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en ingles Eagle's minimum essential medium), medio F12, penicilina/estreptomicina, gentamicina, L-glutamina, tripsina/EDTA, bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT), memantina, rotenona, melatonina, AO y DMSO fueron suministrados por Sigma-Aldrich/Merck. La oligomicina A se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Alemania). Los aminoacidos no esenciales, el suero fetal bovino (SFB) se obtuvo de Gibco (Madrid, Espana). El kit de fosfato de p-nitrofenol (pNPP) para medir la actividad fosfatasa fue suministrado por VWR. Todo el material esteril (frascos de cultivo, tubos Falcon, pipetas y placas multipocillo) se obtuvo de Corning (Madrid, Espana).

- Cultivos de celulas de neuroblastoma humano SH-SY5Y. En 1970, J.L. Biedler desarrollo la lfnea celular SH -SY5Y, como un subclon de la lfnea SK-N-SH, y establecio las condiciones basicas para su cultivo (Biedler JL y col. Cancer Res. 1978, 38, 3751-3757. Provienen de un neuroblastoma metastasico de una nina de 4 anos, por lo que presentan un fenotipo neuronal, y pueden ser diferenciadas con diferentes sustancias, como el acido retinoico (Korecka JA y col. PloS One 2013, 8, e63862. Estas celulas en cultivo son mayoritariamente adherentes, crecen en monocapa con tendencia a agregarse y presentan una morfologfa tipo epitelial con pequenas prolongaciones. Este modelo celular ha sido ampliamente utilizado para experimentos in vitro que requieran celulas de tipo neuronal.

Ademas, al ser de origen humano, expresan una serie de protefnas especfficas que no estan presentes en cultivos primarios de roedores. Las celulas SH -S Y 5Y no diferenciadas presentan actividad Tyr-hidroxilasa (Kume T y col. Neurosci. Lett. 2008, 443, 199-203), transportador de dopamina y sus receptores tipos 2 y 3 (Arun P y col. J. Neurochem. 2008, 106, 1669-1680), receptores muscarfnicos y nicotfnicos (Gould J y col. Neurosci. Lett. 1992, 145, 37-40), canales de C a 2+, Na+ y K+ dependientes de voltaje (Reeve HL y col. Neurosci. Lett. 1992, 135, 37-40; Reuveny E y col. Brain Res. 1993, 603, 64-73), receptores purinergicos P2X7 (Larsson KP y col. J. Neurochem. 2002, 83, 285-298) y receptores opioides (Kazmi SM y col. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1986, 137, 813-820.

Estas celulas se encuentran almacenadas en criotubos en un tanque con N² lfquido ( -173 °C). Para su descongelacion, que debe ser lo mas rapida posible, se resuspende el volumen del criotubo en 10 ml de medio de cultivo precalentado a 37 °C . El medio de crecimiento para la lmea celular S H -S Y 5Y consiste en una mezcla (1:1) de medios EMEM y F12, enriquecida con SFB al 10 % (previamente inactivado por calor, a 56 °C durante 30 min), penicilina /estreptomicina (100 Ul/ml y 100 pg/ml, respectivamente), aminoacidos no esenciales (0,1 mM), NaHCO3 (23 mM) y piruvato sodico (1 mM). A continuacion, se centrifugan las celulas a 800 rpm durante 10 min, el precipitado se resuspende en medio de cultivo fresco y se traspasa a un frasco de cultivo. Asf, las celulas se mantuvieron en cultivo en monocapa en frascos esteriles de 75-150 cm2, sustituyendoles el medio de cultivo por medio fresco cada 3-4 dfas.

Cuando las celulas alcanzaron una confluencia mayor del 80 % , se realizaron los pases y las siembras en placas, utilizando la tripsina/EDTA como proteasa para romper las uniones de las celulas entre ellas y al plastico de los frascos de cultivo. Tras una centrifugacion a 800 rpm durante 10 min, las celulas se resuspendieron en medio fresco al 10 % de SFB y se traspasaron a frascos de cultivo o se sembraron en placas. Para su almacenamiento, se depositaron en los criotubos suspendidas en medio celular con un 10 % de SFB y un 10 % de DMSO (actuando el DMSO como agente crioprotector) y se congelaron lentamente (1 h a 0 °C, 24 h a -80 °C y finalmente traspase al tanque de N² a - 173 °C).

- Incubacion de los compuestos. Los compuestos en forma de sal de oxalato se alicuotaron en soluciones madre a una concentracion 10 mM. Todas las alfcuotas se almacenaron a -20

- Experiments de neuroproteccion y actividad enzimatica en celulas SH-SY5Y. Para evaluar el efecto neuroprotector y la actividad fosfatasa de los derivados de gramina objeto de esta invencion, las celulas SH -S Y 5Y se preincubaron con los compuestos 24 h despues de su siembra, sin haber alcanzado la confluencia. Despues de lo cual, se procedio a la coincubacion de los compuestos con el correspondiente toxico, cambiando el medio de cultivo por medio fresco con un 1 % de SFB. Una vez finalizadas las 20 -24 h de coincubacion, se midio la viabilidad neuronal por el metodo de la reduccion del MTT o la actividad fosfatasa por el metodo del pNPP, que seran explicados en detalle mas adelante.

Para los ensayos de neuroproteccion con rotenona/oligomicina A (30 pM/10 pM, respectivamente), los compuestos se evaluaron a la concentracion de 10 nM. Para los experimentos con AO (20 nM para neuroproteccion y 15 nM para la actividad fosfatasa), los compuestos se cribaron a 0,1 pM.

- Metodo de la reduction del MTT para la medicion de la viabilidad celular. Este metodo, que usa el MTT o bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio como sustrato, se desarrollo en la decada de los 80 (Mosmann y col. J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63) y permite medir la viabilidad celular de forma rapida, economica y sencilla. Se trata de un ensayo colorimetrico, comunmente utilizado para el cribado de compuestos, el cual extrapola la viabilidad celular a partir del metabolismo mitocondrial. Las enzimas mitocondriales deshidrogenasas de las celulas viables, o metabolicamente activas, son capaces de reducir el MTT (coloracion amarilla, soluble en medio acuoso) a formazan (coloracion morada, insoluble). Asf, se utiliza la funcion mitocondrial como marcador de viabilidad celular asumiendo que la reduccion del MTT sera proporcional al numero de celulas viables.

Para llevar a cabo el metodo, el MTT, disuelto en agua (12 mM), se anade directamente a los pocillos (concentracion final 1,2 mM) y se incuba durante 2 h en el caso de las celulas SH -S Y 5Y o 30 min en el caso de neuronas de corteza motora y de rodajas de hipocampo de rata. Tras retirar el medio, se anade DMSO que lisa las celulas y solubiliza el formazan resultante. La absorbancia se mide a 540 nm en un lector de placas multipocillo FLUOstar Optima (BMG, Alemania), siendo la senal dependiente de la concentracion. A mayor absorbancia, mayor viabilidad celular.

- Metodo del pNPP para la medicion de la actividad fosfatasa. El p-nitrofenilfosfato (pNPP) actua como sustrato cromogenico para la mayorfa de enzimas fosfatasas. Al desfosforilarlo, generan p-nitrofenol, el cual en condiciones alcalinas produce p-nitrofenolato, sustancia que absorbe a 405 nm. Es un metodo inespecffico ya que mide la actividad fosfatasa total de la muestra, pero en presencia de un inhibidor especffico de Ser/Thr fosfatasas, como el AO, se acepta que los cambios en la absorbancia se deben a la actividad de estas enzimas (McAvoy T y col. Curr. Prot. Mol. Biol.2010, C h .18:18.

Para medir la actividad fosfatasa de las muestras se utilizo el kit Biosciences Phosphatase Assay (VWR, Espana), que proporciona tanto el sustrato de reaccion como el buffer para la reaccion. Se elimina el medio de cultivo de los pocillos y se anade 100 pl por pocillo de una mezcla 1 :1 de sustrato y buffer de reaccion, siendo la concentracion final de pNPP 10 mM.

La mezcla de reaccion se incubo en oscuridad a 37 °C durante 30 minutos y la absorbancia se midio a 405 nm en un lector de placas FLUOstar Optima (BMG, Alemania), siendo la senal de absorbancia dependiente de la concentracion. La mayor absorbancia a esta longitud de onda es indicativa de mayor actividad fosfatasa.

- Analisis estadfstico y representation de los datos farmacologicos. Los i/alores de los resultados farmacologicos se expresan como la media ± error estandar, habiendose utilizado siempre al menos cuatro experimentos independientes para cada valor. Las comparaciones entre los grupos experimentales y el control se realizaron mediante un analisis estadfstico de la varianza (ANOVA) seguido de un test post hoc Newman-Keuls, en el resto de experimentos. Las diferencias entre los grupos se consideraron estadfsticamente significativas cuando p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***). Todos los analisis estadfsticos se realizaron con el programa GraphPad Prism 5.0. (California, EE.UU.).

En los experimentos de neuroproteccion, el % Viabilidad celular se calcula tomando como 100 % el promedio de las absorbancias obtenidas en las celulas sin tratamiento, aplicando la siguiente formula:

% Viabilidad = (Absorbancia media celulas tratadas)/(Absorbancia media celulas control)x100

De manera analoga, el % Actividad fosfatasa se calcula tomando como 100 % el promedio de las absorbancias obtenidas en las celulas sin tratamiento, aplicando la siguiente formula: % Actividad fosfatasa = (Absorbancia media celulas tratadas)/(Absorbancia media celulas control)x100

El % Proteccion se calcula tomando como 100 % el promedio de la muerte celular obtenida en los pocillos tratados unicamente con el toxico, aplicando la formula:

% Proteccion = 100-[(% muerte celulas con toxico y compuesto)/(% muerte celulas solo toxico)x100]

El % Mantenimiento de la actividad fosfatasa se calcula tomando como 100 % el promedio de la actividad fosfatasa obtenida en los pocillos tratados unicamente con el toxico, aplicando la formula:

% Mantenimiento actividad = 100-[(% actividad fosfatasa en celulas con toxico y compuesto)/(% actividad fosfatasa en celulas solo toxico)x100]

2.2. Evaluation de la actividad fosfatasa de los compuestos objeto de la invention

Existen diferentes alternativas para medir la actividad fosfatasa de una muestra biologica, ya sea mediante ensayos colorimetricos o metodos radioactivos. Estos ultimos son la manera clasica de medir la actividad fosfatasa, mediante el uso de sustratos marcados con [y-32P]-ATP (Kililea SD y col. Meth. Mol. Biol. 1998, 93, 23-33) que, si bien presentan la ventaja de ser una medida muy precisa de la cinetica de la reaccion de desfosforilacion, tienen el gran inconveniente de su naturaleza radiactiva. En relacion a los ensayos colorimetricos, el metodo del verde malaquita y el del p-nitrofenilfosfato (pNPP) son los mas utilizados. El verde malaquita es un compuesto capaz de formar complejos con los fosfatos libres en solucion acuosa, los cuales absorben a una longitud de onda de 620 nm (Baykov AA y col. Anal. Biochem. 1988, 171,266-270). Se trata de un ensayo preciso pero complicado, puesto que requiere el aislamiento por inmunoprecipitacion de la enzima fosfatasa, la limpieza de la muestra biologica de fosfatos y la necesidad de anadir exogenamente un sustrato o peptido fosforilado, lo cual encarece el ensayo (McAvoy, 2010). En cuanto al metodo del pNPP, esta sustancia actua como sustrato cromogenico para la mayorfa de las enzimas fosfatasas (Tyr fosfatasas y Ser/Thr fosfatasas), las cuales, al desfosforilarlo, generan p-nitrofenol, que en condiciones alcalinas produce el p-nitrofenolato, que presenta una gran absorbancia a 405 nm (McAvoy, 2010). Se trata de un metodo sencillo, puesto que no requiere de un tratamiento especffico de las muestras, y economico, apto para el cribado farmacologico de un gran numero de compuestos. Por ello, el metodo de eleccion fue el ensayo colorimetrico del pNPP. No obstante, es un metodo inespecffico, puesto que mide la actividad fosfatasa total de la muestra, pero en presencia de un inhibidor especffico de Ser/Thr fosfatasas, como el AO, se acepta que los cambios en la absorbancia se deben a la actividad de enzimas Ser/Thr fosfatasas.

Se llevo a cabo la puesta a punto del ensayo en base a los experimentos de neuroproteccion con AO, modificandose ligeramente el protocolo utilizado puesto que era necesaria una concentracion de AO capaz de inhibir a las enzimas PPP, pero sin llegar a causar muerte celular, ya que eso disminuirfa la actividad fosfatasa registrada, no por inhibicion de las enzimas sino por un menor numero de celulas viables en los pocillos. Se redujo la concentracion de AO de 20 a 15 nM, una concentracion todavfa adecuada para inhibir PP1 y PP2A (Swingle M y col. Meth. Mol. Biol. 2007, 365, 23-38; McAvoy, 2010; Perez M y col. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 1484), asf como el tiempo de exposicion de 20 a 18 h. Bajo estas condiciones experimentales, el AO disminuyo la actividad fosfatasa total en un 32 % , de manera estadfsticamente significativa, pero sin afectar a la viabilidad celular, medida por el metodo de la reduccion del MTT. De esta manera, se establece una ventana adecuada entre la actividad fosfatasa de los pocillos sin tratamiento y los pocillos tratados con AO, dentro de la cual los compuestos pueden mostrar su capacidad para mantener la actividad Ser/Thr fosfatasa en presencia del inhibidor AO.

Se evaluaron todos los derivados de gramina objeto de la presente invencion en su forma de sal de oxalato a la concentracion de 0,1 DM, sometiendo a los cultivos de neuroblastoma al toxico AO a una concentracion de 15 nM durante 18 h. En la Tabla 1 se puede observar como, de los 18 compuestos nuevos evaluados, 14 fueron capaces de evitar la inhibicion inducida por el AO. Si se expresan los datos como % de mantenimiento de la actividad fosfatasa (calculado tal y como se ha explicado en el apartado anteriormente), los compuestos llegan a alcanzar hasta un 50 % de mantenimiento de la actividad, observandose los mejores resultados en los derivados le (54 % ) , Ic (52 % ) , Ij (42 % ) y II (41 % ) .

Com puesto X Y R1,R2 CR 3 R4 R5 ^{% Actividad} _fosfatasa Basal - - - - 100

AO - - - - 61 ± 3###

G ram ina H CH CH3 - 80 ± 5* M em antina - - - - 77 ± 3* la H CH CH3 CH2CH2CH3 78 ± 4ns lb H CH -(CH2)5- CH2CH2CH3 82 ± 3* Ic H CH CH3 C=CH 86 ± 4** Id H CH -(CH2)5- C=CH 81 ± 4ns Ie Cl CH CH3 Ph 86 ± 6** If Cl CH -(CH2)5- Ph 79 ± 6ns Ig Cl CH CH3 CH2CH2CH3 80 ± 4* Ih Cl CH -(CH2)5- CH2CH2CH3 83 ± 5** Ii Cl CH CH3 C=CH 81 ± 2* Ij Cl CH -(CH2)5- C=CH 86 ± 4** Ik Br N CH3 Ph 81 ± 5* Il Br N -(CH2)5- Ph 82 ± 4** Im Br N CH3 CH2CH2CH3 80 ± 4* In Br N -(CH2)5- CH2CH2CH3 80 ± 5* Io Br N CH3 C=CH 82 ± 4* Ip Br N -(CH2)5- C=CH 81 ± 3ns Iq CHsO N CH3 Ph 83 ± 3** Ir CHsO N -(CH2)5- Ph 84 ± 4* Tabla 1. Efecto de la gramina y sus derivados objeto de la invencion sobre la actividad fosfatasa total, medido por la tecnica del pNPP. Los datos como actividad fosfatasa de los cultivos respecto a la situacion sin tratamientos, y se expresan como la media ± error estandar de al menos 5 experimentos. Los compuestos se evaluaron a la concentracion de 0,1 gM y la memantina a 10 nM. ### p < 0,001, respecto a las celulas sin tratar; **p < 0,01, *p < 0,05 y n-s- = no significativo, respecto a las celulas tratadas solo con AO.

Las posiciones que mas han afectado a la actividad son la N-alquilacion y las sustituciones en el anillo bencenico fusionado. Tanto la no sustitucion, como la introduccion de un Cl en C5 o la modificacion por un anillo de piridina, ofrecen excelentes resultados, mostrando un buena actividad fosfatasa en practicamente todos sus derivados. En la familia Derivados Piridfnicos (Y = N), el cambio del Br, presente en los derivados Ik y Il, por el grupo CH ³ O, que caracteriza a los derivados Iq y Ir, no supone un aumento en su actividad, ya que los cuatro compuestos mantienen la actividad fosfatasa de forma similar (35 % ) . La presencia de dimetilamina o piperidina en C 3 no se puede asociar con un aumento o disminucion en la actividad.

2.3. Estudio de docking molecular de los mejores compuestos y PP2Ac

Con el objetivo de profundizar y complementar los estudios sobre la actividad fosfatasa, se analizo, mediante tecnicas de docking molecular, la interaccion entre PP2Ac y algunos de los derivados de gramina sintetizados. Los derivados Ie y Ir se seleccionaron por su destacable actividad fosfatasa. El derivado Ie, el mejor compuesto activador de fosfatasa de toda la familia de derivados objeto de esta invencion, adopta una pose capaz de establecer un enlace de hidrogeno fuerte entre el nitrogeno protonado de la dimetilamina del compuesto y el grupo hidroxilo de la Ser 120 (d = 1,75 A). Tambien presenta una interaccion hidrofobica plana n -n con el Trp 200 (d = 4,04 A), asf como una interaccion ionica de transferencia de carga con la His 191 (d = 3,06 A) (Figura 1). Otra de las poses del compuesto Ie generada por el programa de docking molecular, muestra un posible enlace de halogeno entre el cloro y el oxfgeno de la Ser 120 (d = 3,66 A) (Figura 1). No obstante, los enlaces de halogeno son mas debiles e infrecuentes que los enlaces de hidrogeno (Bissantz C y col. J. Med. Chem. 2010, 53, 5061-5084, por lo que la pose mas probable serfa la que presenta el enlace de hidrogeno fuerte (Figura 1)

En general, la familia de Derivados Piridfnicos (Y = N) destaca por el buen mantenimiento de la actividad fosfatasa, sobresaliendo el derivado Ir. El estudio de su docking molecular es de especial interes dado que presenta piperidina, bioisostero del benceno, como anillo fusionado al pirrol, y un grupo O CH ³ en posicion C5, ambos propuestos durante la fase de diseno con el fin de favorecer nuevas interacciones. Si bien no se ha encontrado ninguna interaccion con el nitrogeno de la piridina, el oxfgeno del grupo metoxilo es capaz de aceptar un enlace de hidrogeno del hidroxilo de la Ser 120 (d = 2,23 A). Ademas, este compuesto se adapta muy bien al bolsillo hidrofobico, presentando numerosas interacciones con los residuos Ala 216 (con la cadena hidrocarbonada de la piperidina, d = 3,59 A), Ile123 (con el grupo bencilo, d = 4,01 A) y Val 126 (con el grupo bencilo, d = 3,86 A) (Figura 2).

2.4. Evaluacion del perfil neuroprotector de los compuestos de la invencion

Con el fin de evaluar si esta familia de nuevos activadores de enzimas fosfatasas presentan una actividad farmacologica interesante para su posicionamiento terapeutico, a modo de ejemplo en el tratamiento de patologfas del sistema nervioso, se llevaron a cabo experimentos de neuroproteccion en varios modelos in vitro que remedan algunas de estas patologfas. La capacidad de los compuestos para reducir o mitigar el dano causado por los toxicos propuestos se monitorizo mediante de la reduccion de MTT segun se ha explicado anteriormente.

- Neuroproteccion en celulas SH-SY5Y danadas por exposicion a acido okadaico. El AO es un potente inhibidor de las Ser/Thr fosfatasas con cierta selectividad para PP2A (PP2A), induce la hipefosforilacion de la protefna Tau en cultivos primarios neuronales y en lfneas de neuroblastoma, lo que las lleva a la consiguiente degeneracion neuronal y a la perdida sinaptica debido a la formacion de agregados intracelulares de esta protefna, siendo una de las evidencias morfologicas de la existencia de una demencia de corte neurodegenerativo de tipo Alzheimer. Por este motivo, el uso de AO remeda el escenario de degeneracion que sufren las neuronas de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa como la de Alzheimer. Asf, los cultivos de neuroblastoma humano en placas de 48 pocillos se preincubaron con los compuestos a la concentracion de 0,1 |iM durante 24 horas, segun lo descrito en el capftulo de materiales y metodos. Finalmente, la viabilidad celular se determino midiendo la capacidad de reduccion del MTT

Todos los compuestos de formula general (I) mostraron un marcado perfil neuroprotector frente al dano generado por AO (Tabla 2), lo que les convierte en potenciales farmacos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

Tabla 3.- Efecto de los derivados indolicos de formula general (I), a la concentracion de 0,1 pM, sobre la viabilidad celular de la lfnea de neuroblastoma humano SH -S Y 5Y sometida al dano generado por acido okadaico 20 nM durante 20 h, medida por el metodo de la reduccion del MTT. Los datos se expresan como la media ± error estandar de al menos 5 experimentos. Los compuestos se evaluaron a la concentracion de 0,1 pM y la memantina a 10 nM. ***p < 0,001, **p < 0,01, n.s.= no significativo

Com puesto X Y R1,R2 CR 3 R4 R5 % Proteccion G ram ina H CH CH3 - 45 ± 2*** M em antina - - - - 63 ± 2*** la H CH CH3 CH2CH2CH3 50 ± 3*** lb H CH -(CH2)5- CH2CH2CH3 55 ± 4*** Ic H CH CH3 C=CH 74 ± 2** Id H CH -(CH2)5- C=CH 58 ± 5*** le Cl CH CH3 Ph 88 ± 2*** If Cl CH -(CH2)5- Ph 59 ± 4*** Ig Cl CH CH3 CH2CH2CH3 93 ± 1*** Ih Cl CH -(CH2)5- CH2CH2CH3 98 ± 1*** Ii Cl CH CH3 C=CH 43 ± 6** Ij Cl CH -(CH2)5- C=CH 55 ± 7* Ik Br N CH3 Ph 84 ± 2*** Il Br N -(CH2)5- Ph 57 ± 4*** Im Br N CH3 CH2CH2CH3 55 ± 4*** In Br N -(CH2)5- CH2CH2CH3 98 ± 1*** Io Br N CH3 C=CH 63 ± 5** Ip Br N -(CH2)5- C=CH 68 ± 3*** Iq CHsO N CH3 Ph 51 ± 5*** Ir CHsO N -(CH2)5- Ph 62 ± 2*** - Neuroproteccion en celulas SH-SY5Y danadas por exposition al coctel formados por rotenona y oligomicina A (R/O). Debido a la importancia que el estres oxidativo y la disfuncion mitocondrial tienen en la etiopatogenia de la EA, tambien se evaluo el efecto de los derivados de gramina sobre el dano producido por el coctel R/O en celulas SH -SY5Y. Teniendo en cuenta que la gramina presento propiedades neuroprotectoras frente a este modelo a las concentraciones comprendidas entre 10 nM y 0,3 pM, se decidio utilizar la concentracion de 10 nM para la evaluacion de sus derivados. En la Tabla 3 se puede observar que las familias de Derivados no sustituidos (X = H) y Derivados Piridfnicos (Y = N) alcanzan el 40 % de neuroproteccion, equiparandose al compuesto hit gramina y al control melatonina (por ejemplo los derivados Id o Ir).

En conclusion, los compuestos descritos en esta invencion con formula general (I), que presentan en la mayorfa de los casos una capacidad activadora de enzimas fosfatasas, y en particular de PP2A, en situaciones de inhibicion como la exacerbada por AO, muestran un perfil neuroprotector en varios modelos in vitro de patologfas del sistema nervioso.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1 Compuestos de formula general (I):

   

   donde:

   Y puede ser un atomo de nitrogeno o un resto CH (carbono unido a hidrogeno).
2. 2.- Compuestos segun la reivindicacion 1, donde Y = N, X podra ser un atomo de bromo o un resto alcoxido, es decir, un atomo de oxfgeno unido a alquilo del tipo metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo, tert-butilo o mayores elongaciones y ramificaciones de cadenas hidrocarbonadas saturadas.
3. 3.- Compuestos segun la reivindicacion 1, donde Y = CH, X podra ser un atomo de cloro o hidrogeno.
4. 4. - Compuestos segun la reivindicaciones 2 y 3, R^{i ,} R² pueden ser cadenas alquflicas del tipo metilo, etilo, propilo o formar un ciclo donde Rⁱ , R² sean -CH²(CH²)ⁿCH²-, siendo n un numero natural entero entre 1 y 5.
5. 5. - Compuestos de la reivindicacion 4, donde R³ , R⁴ , R⁵ definen el tipo sustitucion sobre el nitrogeno indolico, pudiendo ser esta sustitucion fenilo (-CR³ R⁴R⁵ = -C^eH^e = -Ph), alquilo no ramificado (R³ ,R⁴ = H; R⁵ = propilo, Pr) o etinilo (-CR³ R⁴R⁵ = -C=CH).
6. 6. - Compuestos de la reivindicacion 5, excluyendo un compuesto de formula general (I), donde X = H, R¹ y R² son metilos (CH³) y -CR³ R⁴R⁵ es fenilo (-Ph).
7. 7. - Compuestos de la reivindicacion 5, excluyendo un compuesto de formula general (I), donde X = H, R1 y R2 forman un ciclo tal que R1, R2 son -CH2(CH2)3CH2-, y -CR3R4R5 es fenilo (-Ph)
8. 8. - Compuestos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, seleccionados de la lista que comprende:

   • 1 -(1 -butil-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

   • 1-butil-3-(piperidin-1-ilmetil)-1 H-indol

   • H,H-dimetil-1 -(1 -(prop-2-in-1 -il)-1 H-indol-3-il)metanamina

   • 3-(piperidin-1-ilmetil)-1 -(prop-2-in-1-il)-1 H-indol

   • 1 -(1 -bencil-5-cloro-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

   • 1 -bencil-5-cloro-3-(piperidin-1-ilmetil)-1 H-indol

   • 1 -(1-butil-5-cloro-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

   • 1 -butil-5-cloro-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-indol

   • 1 -(5-cloro-1 -(prop-2-in-1 -il)-1 H-indol-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

   • 5-cloro-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 -(prop-2-in-1 -il)-1 H-indol

   • 1 -(1 -bencil-5-bromo-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina

   • 1 -bencil-5-bromo-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina

   • 1 -(5-bromo-1 -butil-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

   • 5-bromo-1 -butil-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina

   • 1 -(5-bromo-1 -(prop-2-in-1 -il)-1 H-pirrolo[2,3-b] piridin-3-il)-H,H-dimetilmetanamina

   • 5-bromo-3-(piperidin-1-ilmetil)-1 -(prop-2-in-1-il)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina

   • 1 -(1 -bencil-5-metoxi-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-N,N-dimetilmetanamina

   • 1 -bencil-5-metoxi-3-(piperidin-1 -ilmetil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridina
9. 9. - Procedimiento de obtencion de los compuestos de formula general (I) segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende los siguientes pasos:

   a) reaccion de un derivado de indol de formula (II),

   

   en donde X representa los atomos y sustituyentes indicados mas arriba al describir la formula general (I), en condiciones de sustitucion nucleofila en medio basico sobre haluros de alquilo. Esta reaccion dana lugar a compuestos con formula general (III),

   

   b) Reaccion de Mannich con los compuestos de formula general (III) en medio acido debil, en presencia de formaldehfdo y dimetilamina o piperidina como fuentes de amina, para dar los compuestos de formula general (I).

   c) Reaccion de salinizacion por tratamiento con acido oxalico en disolvente organico, generando la sal de oxalato de los compuestos de formula general (I).
10. 10. - Uso de los compuestos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la elaboracion de un medicamento
11. 11. - Uso de los compuestos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades humanas 12.- Uso de los compuestos segun la reivindicacion anterior, donde las enfermedades se seleccionan de la lista que comprende que cursan con una inactivacion, inhibicion o depresion de la actividad enzimatica de protemas fosfatasas.
12. 13.- Uso de los compuestos segun la reivindicacion anterior, donde las enfermedades afectadas por una inactivacion de enzimas fosfatasas son enfermedades neurodegenerativas, cancer, enfermedades metabolicas o enfermedades infecciosas
13. 13.- Uso de los compuestos objeto de esta invencion como agentes reguladores de la activadad enzimatica de enzimas fosfatasas
14. 14. - Uso de los compuestos objeto de esta invencion como agentes reguladores de la activadad enzimatica de enzimas serina/treonina fosfatasas
15. 15. - Uso de los compuestos objeto de esta invencion como agentes reguladores de la activadad enzimatica de la enzima fosfatasa 2§