ES2871949T3 - N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidilmetil]tiazol-2-il]acetamida como inhibidor de OGA - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidilmetil]tiazol-2-il]acetamida como inhibidor de OGA

La presente invención se refiere a nuevos compuestos de 5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-ilo, a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos, a los compuestos para su uso en el tratamiento de trastornos fisiológicos, y a compuestos intermedios y procesos útiles en la síntesis de los compuestos.

La presente invención se encuentra en el campo del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, la parálisis supranuclear progresiva (PSP) y otras enfermedades y trastornos que implican la neurodegeneración mediada por tau, conocidas colectivamente como tauopatías.

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo devastador que afecta a millones de pacientes en todo el mundo. A la vista de los agentes actualmente aprobados en el mercado, que sólo aportan beneficios sintomáticos y transitorios al paciente, existe una importante necesidad no cubierta en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La oligomerización de la proteína tau asociada a los microtúbulos en estructuras filamentosas tal como los filamentos helicoidales emparejados (PHF) y los filamentos rectos o retorcidos, que dan lugar a los ovillos neurofibrilares (NFT) y a los hilos neuropilares (NT), es una de las características patológicas que definen la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías. Se ha comprobado que el número de NFT en los cerebros de individuos con enfermedad de Alzheimer está estrechamente correlacionado con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que tau tiene un papel clave en la disfunción neuronal y la neurodegeneración (Nelson et al., JNeuropathol Exp Neurol., 71(5), 362-381(2012)). Se ha demostrado que la patología de Tau se correlaciona con la duración de la enfermedad en la PSP; los casos con un curso más agresivo de la enfermedad tienen una mayor carga de tau que los casos con una progresión más lenta. (Williams et al., Brain, 130, 1566-76 (2007)).

Estudios recientes (Yuzwa et al., Nat Chem Biol, 4(8), 483-490 (2008)) apoyan el potencial terapéutico de los inhibidores de O-GlcNAcasa (OGA) para limitar la hiperfosforilación de tau y su agregación en tau patológica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y los trastornos de neurodegeneración relacionados mediados por tau. En concreto, el inhibidor de la OGA Thiamet-G se ha relacionado con la ralentización de la pérdida de neuronas motoras en el modelo de ratón JNPL3 tau (Yuzwa et al., Nat Chem Biol, 8, 393-399 (2012)) y a una reducción de la patología tau y de las neuritas distróficas en el modelo de ratón tau Tg4510 (Graham et al., Neuropharmacology, 79, 307-313 (2014)). En consecuencia, los inhibidores de la OGA se reconocen como un enfoque terapéutico válido para reducir la acumulación de formas patológicas hiperfosforiladas de tau, tal como NFT y NT.

La Patente Estadounidense No. 9.120.781 divulga derivados de hexahidrobenzooxazol y hexahidrobenzotiazol que poseen actividad inhibidora de OGA y se divulgan además como útiles en el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la deficiencia o sobreexpresión de OGA, y/o la acumulación o deficiencia de 2-acetamido-2-deoxi-Sp-D-glucopiranósido(ü-GlcNAc). Además, el documento US 2016/0031871 divulga ciertos inhibidores de la glucosidasa para tratar la enfermedad de Alzheimer.

Se desean inhibidores de OGA que sean penetrantes en el cerebro para proporcionar tratamientos para los trastornos de neurodegeneración mediados por tau, tal como la enfermedad de Alzheimer y PSP. La presente invención proporciona ciertos compuestos novedosos que son inhibidores de OGA.

En consecuencia, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

Además, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula Ia:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

Además, esta invención proporciona un compuesto de las Fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo para su uso en terapia, en particular para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para su uso en la prevención de la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer. Además, esta invención proporciona un compuesto de las fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo para su uso en el tratamiento de la parálisis supranuclear progresiva.

La invención también proporciona un compuesto de las fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo para su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos mediados por tau.

Además, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de las fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para prevenir la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer. Además, esta invención proporciona el uso de un compuesto de las fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la parálisis supranuclear progresiva. La invención también proporciona el uso de un compuesto de las fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para la fabricación de un medicamento para tratar los trastornos neurodegenerativos mediados por tau.

La invención proporciona además una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de las fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico. La invención proporciona además un proceso para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto de las fórmulas I o la, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico. Esta invención también abarca nuevos compuestos intermedios y procesos para la síntesis de los compuestos de las fórmulas I y Ia.

El deterioro cognitivo leve se ha definido como una posible fase prodrómica de la demencia asociada a la enfermedad de Alzheimer, en base a la presentación clínica y en la progresión de los pacientes que presentan un deterioro cognitivo leve a la demencia de Alzheimer a lo largo del tiempo. El término "prevenir la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer" incluye frenar, ralentizar, detener o revertir la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer en un paciente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "tratamiento" o "tratar" incluyen frenar, ralentizar, detener o revertir la progresión o la gravedad de un síntoma o trastorno existente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "paciente" se refiere a un ser humano.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis del compuesto de la invención, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo que, tras la administración de una dosis única o múltiple al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente bajo diagnóstico o tratamiento. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad eficaz mediante el uso de técnicas conocidas y observando los resultados obtenidos en circunstancias análogas. A la hora de determinar la cantidad eficaz para un paciente, se tienen en cuenta una serie de factores, entre los que se incluyen: la especie del paciente; su tamaño, edad y estado de salud general; la enfermedad o el trastorno específico de que se trate; el grado de afectación o la gravedad de la enfermedad o el trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto concreto administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad del preparado administrado; el régimen de dosis seleccionado; el uso de medicación concomitante; y otras circunstancias relevantes.

Los compuestos de la presente invención son generalmente eficaces en un amplio intervalo de dosis. Por ejemplo, las dosis por día normalmente están dentro del intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal. En algunos casos, los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aún mayores con efectos secundarios aceptables.

Los compuestos de la presente invención se formulan preferentemente como composiciones farmacéuticas administradas por cualquier vía que haga que el compuesto sea biodisponible, incluidas las vías oral y transdérmica. Lo más preferente es que dichas composiciones sean para administración oral. Dichas composiciones farmacéuticas y los procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, editor, 22° edición, Prensa farmacéutica, 2012).

Los compuestos de las fórmulas I y la, o las sales aceptables para uso farmacéutico de los mismos son particularmente útiles para los usos terapéuticos de la invención, pero son preferentes ciertas configuraciones. Los siguientes párrafos describen estas configuraciones preferentes. Se entenderá que estas preferencias son aplicables tanto a los usos terapéuticos como a los compuestos de la invención.

Los compuestos de la presente invención incluyen:

y sus sales aceptables para uso farmacéutico.

El compuesto de Fórmula I en el que los sustituyentes metilo y oxígeno en el anillo de piperidina están en la configuración cis o trans, o la sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, se incluyen dentro del alcance de la invención, siendo preferente la configuración c is . Por ejemplo, una persona con conocimientos ordinarios de la técnica apreciará que el metilo en la posición 2 está en la configuración cis en relación con el oxígeno en la posición como se muestra en el esquema A a continuación:

Además, una persona con conocimientos ordinarios de la técnica apreciará que el metilo en la posición 2 está en la configuración trans en relación con el oxígeno en la posición 4, como se muestra en el esquema B a continuación:

Son preferentes además los compuestos en los que el centro quiral en la posición 2 del anillo de piperidina está en la configuración S. Aunque la presente invención contempla todos los enantiómeros y diasterómeros individuales, así como las mezclas de los enantiómeros de dichos compuestos, incluidos los racematos, se prefieren especialmente los compuestos con la configuración absoluta que se expone a continuación:

N-[4-fluoro-5-[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida, y sales aceptables para uso farmacéutico de los mismos; y N-[4-fluoro-5-[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida son particularmente preferentes.

Se prefiere especialmente la forma cristalina de N-[4-fluoro-5-[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida. La forma cristalina de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida que se caracteriza por un pico en el espectro de difracción de rayos X en el ángulo de difracción 2-theta de 121 ° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 15,3°, 21,6°, 22,2°, 22,7°, 23,5°, 24,3°, y 26,8°, con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados, es más preferente.

Los isómeros, enantiómeros y diastereómeros individuales pueden ser separados o resueltos por un experto en la técnica en cualquier punto conveniente de la síntesis de los compuestos de la invención, mediante procedimientos como las técnicas de cristalización selectiva o la cromatografía quiral (Véase, por ejemplo, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981y E.L. Eliel y S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994).

Una sal aceptable para uso farmacéutico de los compuestos de la invención puede formarse, por ejemplo, por reacción de una base libre apropiada de un compuesto de la invención y un ácido aceptable para uso farmacéutico apropiado en un disolvente adecuado bajo condiciones estándar bien conocidas en la técnica. La formación de dichas sales es bien conocida y apreciada en la técnica. Véase, por ejemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs", International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986) Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities", Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); y Berge, S.M., et al,, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977).

Los compuestos de la presente invención, o las sales de los mismos, pueden prepararse mediante una variedad de procedimientos conocidos por un experto en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en los siguientes esquemas, las preparaciones y los ejemplos. Un experto en la técnica reconoce que las etapas sintéticas específicas de cada una de las rutas descritas pueden combinarse de diferentes maneras, o junto con etapas de diferentes esquemas, para preparar compuestos de la invención, o sales de los mismos. Los productos de cada etapa de los esquemas que se presentan a continuación pueden recuperarse mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, como la extracción, la evaporación, la precipitación, la cromatografía, la filtración, la trituración y la cristalización. En los esquemas que se presentan a continuación, todos los sustituyentes, a menos que se indique lo contrario, son los definidos anteriormente. Los reactivos y los materiales de partida están fácilmente disponibles para un experto en la técnica. Los siguientes esquemas, preparaciones y ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención. Además, un experto en la técnica aprecia que los compuestos de las fórmulas la, Ib, Ic e Id pueden prepararse utilizando material de partida con la correspondiente configuración estereoquímica que puede preparar un experto en la técnica. Por ejemplo, los esquemas que se presentan a continuación utilizan materiales de partida con la configuración correspondiente en última instancia a la Fórmula Ia. En general, un compuesto de Fórmula Ia puede prepararse a partir de un compuesto de Fórmula II (Esquema 1). Más específicamente, un compuesto de Fórmula IIa se alquila reductivamente con N-(4-fluoro-5-formiltiazol-2-il)acetamida en presencia de un agente reductor adecuado, tal como triacetoxiborohidruro de sodio, en un disolvente adecuado, para proporcionar un compuesto de Fórmula Ia en un disolvente adecuado, tal como acetato de etilo. N-(4-Fluoro-5-formiltiazol-2-il)acetamida puede prepararse por procedimientos conocidos en las técnicas químicas, así como por los procedimientos proporcionados en las siguientes Preparaciones y Ejemplos.

Un compuesto de Fórmula IIa puede prepararse a partir de un compuesto de Fórmula IIIa donde Pg es un grupo protector de amina adecuado. Más específicamente, un compuesto de Fórmula IIa donde Pg es carboxilato de tercbutilo (t-BOC) se hace reaccionar con un ácido tal como ácido clorhídrico o ácido trifluoroacético en un disolvente adecuado tal como dioxano o diclorometano para proporcionar un compuesto de Fórmula IIa. Los grupos protectores de amina adecuados son conocidos en las técnicas químicas e incluyen el t-BOC y el Cbz, así como los analizados en T. W. Green, P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis" Wiley-Interscience, Nueva York, 1999.

Un compuesto de Fórmula IIIa donde Pg es un grupo protector de amina adecuado puede prepararse a partir de un compuesto de Fórmula IVa (Esquema 2). Más específicamente, un compuesto de Fórmula IVa donde Pg es carboxilato de terc-butilo se hace reaccionar con 3-(clorometil)-5-metil-1,2,4-oxadiazol en presencia de una base tal como terc-butóxido de sodio para proporcionar un compuesto de Fórmula IIIa. La reacción se lleva a cabo convenientemente en un disolvente tal como acetonitrilo o dimetilformamida. Un compuesto de Fórmula IVa donde Pg es carboxilato de terc-butilo puede prepararse esencialmente como se describe en el documento WO 2004/094380 A1. Más específicamente, un compuesto de Fórmula Va se hace reaccionar con un agente reductor tal como tri(sec-butil)borohidruro de litio en un disolvente tal como tetrahidrofurano para proporcionar un compuesto de Fórmula IVa donde Pg es carboxilato de terc-butilo. Un compuesto de Fórmula Va donde Pg es un grupo protector de amina adecuado puede prepararse mediante procesos conocidos en las técnicas químicas, incluyendo los descritos en el documento w O 2004/094380 A1.

Preparación 1

Síntesis de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)carbamato de terc-butilo.

Se añade fluoruro de cesio (227 g, 1480 mmol) a una solución de N-(4-doro-5-formil-tiazol-2-il)carbamato de tercbutilo (38,8 g, 148 mmol; para la preparación del N-(4-cloro-5-formil-tiazol-2-il)carbamato de terc-butilo véase, por ejemplo, N. Masuda, et al., Bioorg Med Chem, 12, 6171-6182 (2004)) en DMSO (776 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agita en un bloque de calentamiento de 145 °C con una temperatura interna de 133 °C durante 48 horas, y luego se enfría la mezcla en un baño de agua helada. A la mezcla se le añade solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (500 ml), salmuera (500 ml) y acetato de etilo (500 ml). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se filtra a través de tierra de diatomeas, lavando con acetato de etilo (500 ml). El filtrado se transfiere a un embudo de separación y se separan las capas, luego se extrae la capa acuosa con acetato de etilo (1 L). Los componentes orgánicos combinados se lavan con salmuera (1 L), y luego la capa de salmuera se extrae con acetato de etilo (300 ml). Los componentes orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran para dar un residuo. El residuo se pasa por una almohadilla de gel de sílice (330 g) eluyendo con acetato de etilo al 5% en diclorometano (1,5 L) y el filtrado se concentra para dar un residuo (24,2 g).

El residuo (32,7 g de lotes combinados, 133 mmol) se disuelve en isopropanol (303 ml), se filtra y luego se purifica por SFC (cromatografía de fluidos supercríticos) utilizando una columna IC (derivado de polisacáridos de celulosa: tris (3,5-diclorofenilcarbamato, 30 x 250mm, 5u) con IPA al 10% (sin aditivo) a 180 ml/minuto con inyecciones de 3 ml. Las fracciones que contienen productos se concentran para dar el compuesto del título (16,1 g. MS m/z 247,0 (M+H).

Preparación 2

Síntesis N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamida (Procedimiento A)

En un recipiente encamisado, se añade bromuro de zinc (91,9 g, 408 mmol) en una porción a una mezcla de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)carbamato de terc-butilo (33,5 g, 136 mmol) y diclorometano (503 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agita durante la noche a una temperatura interna de 37 °C, después se ajusta la temperatura de la camisa a -10 °C y se añade tetrahidrofurano (111 ml) gota a gota durante 15 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a 6 °C. La temperatura de la camisa se ajusta entonces a -30 °C y se añade piridina (110 ml, 1360 mmol) gota a gota durante 5 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a 5 °C. La temperatura de la camisa se ajusta a 0 °C y se añade anhídrido acético (116 ml, 1220 mmol) gota a gota durante 5 minutos. La mezcla de reacción se agita durante la noche a una temperatura interna de 37°C, luego se enfría a temperatura ambiente y se pasa por una almohadilla corta de tierra de diatomeas, eluyendo con tetrahidrofurano (500 ml). El filtrado se transfiere a un matraz y la mezcla se concentra para dar un residuo, que se concentra en tolueno (50 ml). Al residuo se le añade una solución de ácido cítrico monohidratado (57,2 g, 272 mmol) en agua (400 ml) y 2-metiltetrahidrofurano (400 ml) y la mezcla se agita a 40 °C durante 5 minutos, después se pasa por una almohadilla corta de tierra de diatomeas, eluyendo con 2-metiltetrahidrofurano (100 ml). El filtrado se transfiere a un embudo de separación y se separan las capas. La capa acuosa se extrae con 2-metiltetrahidrofurano (2 x 250 ml) y los componentes orgánicos combinados se diluyen con agua (500 ml). A la mezcla se le añade bicarbonato sódico sólido en partes durante 5 minutos con agitación hasta que cese la evolución del gas. La mezcla se transfiere a un embudo de separación y se separan las capas, luego se extrae la capa acuosa con 2-metiltetrahidrofurano (200 ml y 100 ml). Los componentes orgánicos combinados se secan sobre sulfato sódico, se filtran y se concentran para dar un residuo, que se diluye con 2-metiltetrahidrofurano (100 ml) y la mezcla se pasa por una almohadilla corta de gel de sílice (250 g), eluyendo con 2-metiltetrahidrofurano (2,5 L). El filtrado se concentra para dar un residuo que se suspende en una mezcla 1:1 de diclorometano y heptano (202 ml). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se filtra. El sólido filtrado se seca al vacío a 40 °C durante 2 horas para dar el compuesto del título (18,0 g, 70%). MS m/z 189,0 (M+H).

Síntesis alternativa de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamida (Procedimiento B).

Añadir diclorometano (1325 g, 15,6 mol) a 2-amino-4-clorotiazol-5-carbaldehído (100 g, 0,61 mol) y piridina (194,6 g, 2,46 mol), y se enfría a 0-5 °C. Añadir anhídrido acético (188,4 g, 1,85 mol) gota a gota, manteniendo la temperatura a 0-5 °C. Una vez completada la adición, ajustar la temperatura a 20-25 °C y agitar durante 41 horas. Concentrar a presión reducida y añadir HCl acuoso al 35% (200 ml) y agua (1,5 L), manteniendo la temperatura a menos de 40 °C. Enfriar a 20-25 °C y agitar durante 18 horas. Filtrar la mezcla y lavar el sólido recogido con agua. Secar los sólidos a 60-65 °C durante 24 horas para proporcionar N-(4-cloro-5-formiltiazol-2-il)acetamida (75 g, 0,4 mol).

Bajo una atmósfera inerte, añadir sulfolano (1000 ml) a N-(4-cloro-5-formiltiazol-2-il)acetamida (50 g, 0,244 mol, preparada directamente arriba), cloruro de tetrametilamonio (107,1 g, 0,977 mol) y fluoruro de cesio (370,6 g, 2,44 mmol). Calentar a 130 °C y agitar durante 23 horas. El análisis por HPLC muestra una conversión del 75% con un rendimiento in situ del 45% del compuesto del título.

Síntesis alternativa de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamida (Procedimiento C).

Añadir 2-propanol (150 ml) al fluoruro de tetrametilamonio.tetrahidratado (10,2 g, 109,0 mmol) y concentrar la mezcla hasta 2-3 volúmenes al vacío con temperatura interna mantenida a 70 °C para eliminar el agua. Añadir 2-propanol (200 ml) y concentrar la mezcla a 2-3 volúmenes bajo vacío. Repetir dos veces más. Añadir DMF (200 ml) y concentrar hasta 2-3 volúmenes bajo vacío. Añadir THF (200 ml) y concentrar hasta 2-3 volúmenes. Repetir dos veces más. Cargar N-(4-cloro-5-formiltiazol-2-il)acetamida (1,22 g, 5,96 mmol, preparado anteriormente en el procedimiento B) y DMF (12 ml). Calentar a 110 °C y agitar durante 12 horas. Enfriar la mezcla de reacción a 25 °C. Añadir 2-metiltetrahidrofurano (40 ml) y agua (40 ml). Se separan las capas y se extrae la capa acuosa con 2­ metiltetrahidrofurano (40 ml). Las capas se separaron y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (20 ml). Las capas se separaron y la capa orgánica se concentró. Añadir acetato de etilo (20 ml) y agua (5 ml). Las capas se separaron y la capa orgánica se concentró para eliminar el disolvente. Añadir acetato de etilo (2 ml) y heptano (2 ml) y filtrar. El sólido filtrado se seca al vacío a 55 °C durante 18 horas para dar el compuesto del título como una mezcla al 93% con N-(4-cloro-5-formiltiazol-2-il)acetamida.

Preparación 3

Síntesis de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidina-1-carboxilato de terc-butilo.

A un matraz se añade (2S)-2-metil-4-oxo-piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (50 g, 234,44 mmol) y tetrahidrofurano (500 ml). La mezcla se enfría a -65 °C bajo una atmósfera de nitrógeno y se añade tri(secbutil)borohidruro de litio (304,77 ml, 304,77 mmol; 1 M en tetrahidrofurano) gota a gota durante 45 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a -60 °C. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se enfría a -30 °C. A la mezcla de reacción se añade una mezcla de agua (25,34 ml) y tetrahidrofurano (100,16 ml), manteniendo una temperatura interna inferior a -20 °C. Se añade una disolución acuosa de peróxido de hidrógeno (118,88 ml, 1,17 mol, 30 % p/p) en agua (126,70 ml) gota a gota durante 1 hora, manteniendo una temperatura interna inferior a 10 °C. A la mezcla se le añade una solución acuosa de cloruro de hidrógeno (46,89 ml, 234,44 mmol, 5 M) y metil t-butil éter (1,00 L) y la mezcla se calienta hasta la temperatura ambiente. Las capas se separan y la fase orgánica se agita con una solución de metabisulfito sódico (222,84 g, 1,17 mol) en agua (500 ml) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las capas se separan y la fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía flash (0-50% metil t-butil éter /isohexano, gel de sílice) y las fracciones que contienen el producto se combinan y concentran para dar el compuesto del título (40,4 g, 78%). ES/MS (m/e) 238 (M+Na).

Síntesis alternativa de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidina-1-carboxilato de terc-butilo.

En un reactor revestido de vidrio que contiene agua desionizada (460 L), y dihidrógeno fosfato de potasio (6,5 kg, 0,41 equivalentes) a 20°C se carga DMSO (27,4 kg, 1,0 vol) y D-(+)-glucosa monohidratada (28,9 kg, 1,25 equivalentes). La temperatura interna se ajusta a 30°C, y el pH de la reacción se ajusta a 6,9 mediante la adición de hidróxido de sodio acuoso (8%, 15 L, 0,28 equivalentes). Se carga el reactor con (2S)-2-metil-4-oxo-piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (24,9 kg, 1,0 equivalente (99,1%EE)), y se agita la mezcla a 30°C durante 15 min. La cetorreductasa (KRED-130, 250 g, 1% p/p), la glucosa deshidrogenasa (GDH-101,250 g, 1% p/p) y la sal sódica de NADP (63 g, 0,25% p/p) se cargan directamente en la mezcla de reacción a través de un puerto abierto. La mezcla se mantiene a una temperatura de 30°C y un pH de 7,0± 0,2 mediante la adición de NaHCO³ acuoso al 8%. Tras agitar durante 16,5 horas (conversión del 99,5%), se carga la reacción con Celite™ (12,5 kg, 50% p/p) y tolueno (125 L, 5 vol). Después de agitar durante 30 minutos a 30°C, la mezcla se transfiere a otro reactor de 2000 L a través de un filtro GAF en línea (4 calcetines) durante 1 hora. La mezcla se deja reposar 30 minutos sin agitación, se separan las capas y se vuelve a extraer la capa acuosa con tolueno (2 x 125 L). Las capas orgánicas combinadas se filtran (filtro GAF en línea), y la mezcla de tolueno se lava con solución acuosa de cloruro sódico (25%, 125 L, 5 vol) a 25°C. La solución de tolueno resultante se seca azeotrópicamente (vacío parcial, temperatura interna < 60°c ) hasta 0,10 % p/p de agua, y se enfría a 20°C. La mezcla se filtra fuera del reactor a través de un filtro de cartucho en tambores limpios bajo presión positiva de nitrógeno. A continuación, la mezcla de reacción se transfiere de los tambores a un recipiente revestido de vidrio de 500 L y se concentra al vacío (< 60°C) hasta alcanzar un volumen residual objetivo de 56 L (2,25 vol). Se carga n-Heptano (169 kg, 10 vol) a 40°C, y la mezcla se siembra con 25 g de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidina-1-carboxilato de terc-butilo. La suspensión espesa resultante se diluye con nheptano adicional (25 L, 1 vol) y se enfría a 16°C durante 4 horas. El producto se aísla por centrifugación, lavando con n-heptano (25 L por vuelta; se necesitan 4 vueltas), y se obtienen 20,3 kg (81%; >99,9% ee) después de secar durante 11 horas en un secador de bandeja a 30°C. ES/MS (m/e) 238 (M+Na).

Preparación 4

Síntesis de (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidina-1-carboxilato de terc-butilo.

Se añade 3-(clorometil)-5-metil-1,2,4-oxadiazol (43,5 g, 301 mmol) a una solución de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-1-piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (29,5 g, 137 mmol) en acetonitrilo (590 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agita en un baño de agua helada y se añade terc-butóxido de sodio (54,3 g, 548 mmol) en porciones durante 10 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a 10 °C. La mezcla de reacción se agita en un baño de agua helada a una temperatura interna de 5 °C durante 9 horas, luego se calienta lentamente hasta la temperatura ambiente y se agita durante la noche. La mezcla de reacción se enfría en un baño de agua helada y se añade una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (200 ml) a lo largo de 5 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a 10 °C durante la adición. A continuación, la mezcla se diluye con agua (100 ml) y se calienta a temperatura ambiente. La mezcla se extrae con metil terc-butil éter (2 * 300 ml) y los componentes orgánicos combinados se lavan con salmuera (300 ml). Los componentes orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran para dar un residuo. El residuo se pasa rápidamente a través de una almohadilla de gel de sílice (300 g) eluyendo con metil terc-butil éter (1 L) y el filtrado se concentra para dar el compuesto del título (46,5 g, 109%). MS m/z 334,0 (M+Na).

Síntesis alternativa de (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxilpiperidina-1-carboxilato de terc-butilo.

A una solución de (2S,4S)-4-hidroxi-2-metil-piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (0,25 g, 1,16 mmol) y 3-(clorometil)-5-metil-1,2,4-oxadiazol (0,308 g, 2,32 mmol) en N,N-dimetilformamida (3 ml) bajo nitrógeno a 0 °C se añade porciones de terc-butóxido de sodio (0,35 g, 3,5 mmol) durante 5 min. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 10 min y luego a 40 °C durante 12 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se enfría con agua (10 ml). Se separan las capas y se extrae la fase acuosa con metil tercbutil éter (2x10 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavan con una solución acuosa de cloruro de litio (5%), se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran a presión reducida para obtener el compuesto del título (0,49 g, 0,7 mmol, 81% de rendimiento, 60% de pureza) como un aceite marrón. MS m/z 334,0 (M+Na).

Preparación 5

Síntesis del clorhidrato de 5-metil-3-[(2S,4S)-2-metil-4-piperidil]oximetil]-1,2,4-oxadiazol.

Un matraz que contiene (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (4,03 g, 12,9 mmol) se sumerge en un baño de agua helada. A este matraz se añade una solución 4 M de ácido clorhídrico en 1,4-dioxano (25,9 ml, 104 mmol) gota a gota durante 5 minutos con agitación, manteniendo una temperatura interna inferior a 20 °C durante la adición. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se concentra para dar el compuesto del título (3,56 g, 92% de rendimiento basado en el 83% de pureza medido por RMN de 1H. MS m/z 212.0 (M+H).

Síntesis alternativa del clorhidrato de 5-metil-3-[(2S,4S)-2-metil-4-pipelidilloximetill-1,2,4-oxadiazol.

Añadir metanol (50 ml) a (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (12,9 g, 0,041 mol). La mezcla se enfría a 0 °C. Se añade gota a gota una solución 4M de ácido clorhídrico en metanol (80 ml) a la mezcla enfriada, manteniendo una temperatura interna inferior a 20 °C. La mezcla de reacción se agita a continuación a temperatura ambiente durante 18 horas. A continuación, la mezcla se concentra para eliminar el disolvente. Se añade acetona (10 ml) y se agita la mezcla durante 20 min. Se añade tetrahidrofurano (40 ml) y se agita la mezcla durante 3 horas. El sólido se recoge por filtración bajo nitrógeno y la torta sólida filtrada se enjuaga con tetrahidrofurano. El sólido filtrado se seca al vacío a 45 °C durante 2 horas para dar el compuesto del título con una pureza del 90%. La recristalización con acetona puede aumentar la pureza del compuesto del título al 95%.

Preparación 6

Síntesis de 5-metil-3-[[(2S,4S)-2-metil-4-piperidil]oximetil]-1,2,4-oxadiazol.

A una solución de (2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (0,49 g, 1,6 mmol) en diclorometano (10 ml) bajo nitrógeno se añade ácido trifluoroacético (1,8 ml, 23 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se concentra a presión reducida para obtener un aceite amarillo. El residuo se disuelve en metanol (5 ml) y se vierte en un cartucho de intercambio catiónico, se eluye con metanol (2* 10 ml) y luego con una solución de amoníaco 2 M en metanol (10 ml). El filtrado se concentra a presión reducida para dar el compuesto del título (0,3 g, 1,4 mmol, 91%). MS m/z 212,0 (M+H).

Ejemplo 1

Síntesis de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida.

Se añade N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamida (28,3 g, 150 mmol) a clorhidrato de 5-metil-3-[[(2S,4S)-2-metil-4-piperidil]oximetil]-1,2,4-oxadiazol (48,7 g, 185 mmol, 94% de pureza) en acetato de etilo (707 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente y se añade N,N-diisopropiletilamina (34,1 ml, 195 mmol) gota a gota durante 1 minuto, luego se añade triacetoxiborhidruro de sodio (98,5 g, 451 mmol) en una porción. La mezcla de reacción se agita en un bloque de calentamiento de 31 °C durante toda la noche con una temperatura interna de 30 °C, y luego se enfría en un baño de agua helada hasta una temperatura interna de 5 °C. A la mezcla se le añade una solución acuosa de ácido clorhídrico 2 M (226 ml) durante 15 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a 10 °C. A la mezcla se le añade agua (250 ml) y se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las capas se separan y la capa orgánica se extrae con una mezcla de solución acuosa de ácido clorhídrico 2 M (28 ml) en agua (50 ml). La primera capa acuosa se agita en un baño de agua helada y se añade gota a gota solución acuosa de hidróxido sódico al 50% (25,7 ml) durante 10 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a 10 °C. La mezcla se diluye con solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (100 ml), se agita a temperatura ambiente durante 10 minutos y se extrae con acetato de etilo (3 * 400 ml). Los componentes orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran para dar un residuo. La segunda capa acuosa procedente de la extracción con ácido clorhídrico acuoso se diluye con 2-metiltetrahidrofurano (200 ml) y la mezcla se hace pasar por una almohadilla corta de tierra de diatomeas. El filtrado se transfiere a un embudo de separación y se separan las capas. La capa acuosa se agita en un baño de agua helada y se añade gota a gota solución acuosa de hidróxido sódico al 50% (3,15 ml) durante 5 minutos, manteniendo una temperatura interna inferior a 10 °C. La mezcla se diluye con solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (10 ml), se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos y se extrae con acetato de etilo (3 * 40 ml) y 10% de isopropanol en acetato de etilo (100 ml). Los componentes orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran para dar un residuo, que se combina con el residuo de la primera parte de la elaboración. El residuo combinado se pasa por una almohadilla de gel de sílice (350 g) eluyendo con acetato de etilo (3,5 L) y el filtrado se concentra para dar un residuo (45,8 g).

El residuo (47,5 g de lotes combinados, 123,9 mmol) se purifica por cromatografía flash, eluyendo con 50-100% de acetato de etilo en heptano. Las fracciones que contienen producto se concentran hasta el residuo, que se suspende en una mezcla 1:1 de metil-terc-butil éter y heptano (448 ml). La mezcla se agita en un bloque de calentamiento de 46 °C durante 30 minutos a una temperatura interna de 45 °C, y luego se enfría a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación. Se filtra la mezcla, lavando el sólido con una mezcla 1:1 de metil-terc-butil-éter y heptano (30 ml). El sólido filtrado se seca al vacío a 40 °C durante la noche para dar el compuesto del título (28,5 g). MS m/z 384,0 (M+H); [a]D20= 33,4 °(C=0,26, metanol).

Síntesis alternativa de N-[4-fluoro-5-[(2S.4S)-2-met¡l-4-[(5-met¡l-1.2.4-oxad¡azol-3-¡l)metox¡1-1-p¡perid¡l1met¡l1t¡azol-2-illacetamida.

A una solución de N-(4-fluoro-5-formil-tiazol-2-il)acetamida (0,05 g, 0,28 mmol) y 5-metil-3-[(2S,4S)-2-metil-4-p¡perid¡l]ox¡met¡l]-1,2,4-oxad¡azol (0.04 g, 0,19 mmol) en diclorometano (10 ml) bajo nitrógeno se añaden N,N-diisopropiletilamina (0,1 ml, 0,57 mmol) y triacetoxiborhidruro de sodio (0,12 g, 0,57 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla de reacción se vierte en una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (10 ml). Se separan las capas y se extrae la fase acuosa con diclorometano (2*10 ml). Los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran a presión reducida para obtener un aceite de color naranja.

El residuo se capta en metanol (hasta un volumen total de 9,8 ml), se filtra y se purifica por-HPLC preparativa (Phenomenex Gemini-NX 10 Micron 50*150mm C-18) (CH³CN & Agua con 10 mM de bicarbonato de amonio ajustado a pH 9 con hidróxido de amonio, 15% a 100% CH³CN durante 10 min a 110 ml/min) (1 inyección) (271/204 nm) para dar el compuesto del título (0,02 g, 0,05 mmol, 28%). MS m/z 384,2 (M+H).

Ejemplo 1A

N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-met¡l-4-[(5-met¡l-1,2,4-oxad¡azol-3-¡l)metox¡]-1-p¡perid¡l]met¡l]t¡azol-2-¡l]acetam¡da cristalina. Suspender la N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-met¡l-4-[(5-met¡l-1,2,4-oxad¡azol-3-¡l)metox¡]-1-p¡perid¡l]met¡l]t¡azol-2-il]acetamida cruda (29,9 g) en 448 ml de metil terc-butil éter al 50% en heptano a 46 °C durante 30 minutos. Agitar la mezcla y enfriar a 19 °C durante dos horas antes de filtrar siguiendo con un lavado de 30 ml de metil terc-butil éter al 50% en heptano para proporcionar el compuesto del título (28,5 g, 95% de rendimiento).

Difracción de polvo de rayos X (XRPD) del ejemplo 1A

Los patrones de XRPD de los sólidos cristalinos se obtienen en un difractómetro de rayos X Bruker D4 Endeavor, equipado con una fuente de CuKa (A = 1,54060 A) y un detector Vantec, operando a 35 kV y 50 mA. La muestra se escanea entre 4 y 40° en 20, con un tamaño de etapa de 0,0087° en 20 y una velocidad de escaneo de 0,5 segundos/etapa, y con divergencia de 0,6 mm, antidispersión fija de 5,28 mm y rendijas de detector de 9,5 mm. El polvo seco se coloca en un portamuestras de cuarzo y se obtiene una superficie lisa con un portaobjetos de vidrio. Es bien sabido en el arte de la cristalografía que, para cualquier forma de cristal dada, las intensidades relativas de los picos de difracción pueden variar debido a la orientación preferente resultante de factores como la morfología y el hábito del cristal. Cuando los efectos de la orientación preferente están presentes, las intensidades de los picos se alteran, pero las posiciones de los picos característicos del polimorfo no se modifican. (véase, por ejemplo The U. S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35 Capítulo 941 Caracterización de los sólidos cristalinos y parcialmente cristalinos por difracción de rayos X (XRPD) Oficial 1 de mayo de 2015). Además, también es bien conocido en el arte de la cristalografía que para cualquier forma de cristal dada las posiciones de los picos angulares pueden variar ligeramente. Por ejemplo, las posiciones de los picos pueden cambiar debido a una variación en la temperatura o la humedad a la que se analiza una muestra, al desplazamiento de la muestra o a la presencia o ausencia de un estándar interno. En el presente caso, una variabilidad de la posición de los picos de ± 0,2 en 20 tendrá en cuenta estas posibles variaciones sin obstaculizar la identificación inequívoca de la forma cristalina indicada. La confirmación de una forma cristalina puede hacerse sobre la base de cualquier combinación única de picos distintivos (en unidades de ° 20), normalmente los picos más prominentes. Los patrones de difracción de la forma de los cristales, recogidos a temperatura ambiente y humedad relativa, se ajustan en base a los picos del estándar NIST 675 a 8,85 y 26,77 grados 2-theta.

Una muestra preparada de N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-p¡perid¡l]met¡l]t¡azol-2-¡l]acetam¡da cristalina se caracteriza por un patrón XRPD usando radiación CuKa que tiene picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la Tabla 1 a continuación. Específicamente el patrón contiene un pico a 12,1° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 15,3°, 21,6°, 22,2°, 22,7°, 23,5°, 24,3° y 26,8° con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

Tabla 1: Picos de difracción de rayos X de N-[4-fluoro-5-[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-p¡perid¡l]met¡l]t¡azol-2-¡l]acetam¡da cristalina, Ejemplo 1A.

Ensayo de la enzima OGA humana in vitro

Generación de proteína OGA

La secuencia de nucleótidos que codifica la O-GIcNAc-/3-N-acetiIgIucosaminidasa humana de longitud completa (NM_012215) se inserta en el vector pFastBac1 (Invitrogen) con una etiqueta N-terminal de poli-histidina (HIS). La generación de baculovirus se realiza según el protocolo del sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen). Las células Sf9 se infectan a 1,5 x106 células/ml utilizando 10 ml de virus P1 por litro de cultivo y se incuban a 28°C durante 48 horas. Las células se centrifugan, se enjuagan con PBS y los sedimentos se almacenan a -80°C. La proteína OGA anterior (His-OGA) se purifica como sigue: Se lisan 4 L de células en 200 ml de tampón que contiene 50 mM de Tris, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol, 10 mM de Imidazol, 1 mM de Ditiotreitol (DTT), 0,1% de Triton™ X-100, 4 pastillas de inhibidores de proteasa (completos sin EDTA, Roche) durante 45 min a 4°C. Este lisado celular se centrifuga durante 40 min a 16500 rpm a 4°C, y el sobrenadante se incuba con 6 ml de resina Ni-NTA (ácido níquel-nitrilotriacético) durante 2 horas a 4°C.

A continuación, la resina se empaqueta en la columna y se lava con 50 mM Tris, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% de glicerol, 10 mM de Imidazol, 0,1% de Triton™ X-100, 1 mM de DTT, seguido de 50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM de Imidazol, 10% de glicerol, 1 mM de DTT. Las proteínas se eluyen con 50 mM de Tris, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 300 mM de Imidazol, 10% de glicerol y 1 mM de DTT. Las fracciones que contienen His-OGA se concentran en 6 ml y se cargan en Superdex75 (16/60). La proteína se eluye con 50 mM de Tris, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol y 2 mM de DTT. Las fracciones que contienen His-OGA se agrupan y la concentración de proteínas se mide con BCA (ensayo colorimétrico de Bradford).

Ensayo de enzima OGA

La enzima OGA cataliza la eliminación de O-GIcNAc de las proteínas nucleocitoplasmáticas. Para medir esta actividad, la fluoresceína di-N-acetil-p-N-acetil-D-glucosaminida('FD-GIcNAc, Kim, Eun Ju; Kang, Dae Ook; Love, Dona C.; Hanover, John A. Carbohydrate Research (2006), 341(8), 971-982) se utiliza como sustrato a una concentración final de 10 pM (en el formato de ensayo de 96 pocillos) o 6,7 pM (en el formato de ensayo de 384 pocillos). Este sustrato fluorogénico se vuelve fluorescente al ser escindido por la OGA, de modo que la actividad de la enzima puede medirse por el aumento de la fluorescencia detectado a 535 nm (excitación a 485nm).

El tampón de ensayo se prepara para obtener una concentración final de 50 mM H²NaPO³-HNa²PO³ , 0,01% de albúmina de suero bovino y 0,01% de Triton™ X-100 en agua, a pH 7. La concentración final de la enzima es de 3 nM (en el formato de ensayo de 96 pocillos) o de 3,24 nM (en el formato de ensayo de 384 pocillos). Ambos formatos de ensayo dan resultados esencialmente equivalentes.

Los compuestos a ensayar se diluyen en dimetilsulfóxido (DMSO) puro utilizando curvas de respuesta de concentración de diez puntos. La concentración máxima del compuesto en la mezcla de reacción es de 30 pM. Los compuestos a la concentración adecuada se preincuban con la enzima OGA durante 30 minutos antes de iniciar la reacción mediante la adición de sustrato. Se deja que las reacciones se desarrollen durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, sin detener la reacción, se lee la fluorescencia. Los valores IC⁵⁰ se calculan trazando los datos normalizados frente al logaritmo del compuesto y ajustando los datos mediante una ecuación logística de cuatro parámetros.

El compuesto del Ejemplo 1 se probó esencialmente como se describió anteriormente y mostró un IC⁵⁰ de 2,36 nM± 0,786 (n=8). Estos datos demuestran que el compuesto del Ejemplo 1 inhibe la actividad de la enzima OGA in vitro.

Ensayo de células enteras para medir la inhibición de la actividad de la enzima OGA

Siembra en placas de células:

Utilizando condiciones estándar conocidas en la técnica, se generan células TRex-293 modificadas para la expresión inducible de la forma P301S-1N4R de la proteína tau asociada a los microtúbulos y se mantienen en medios de crecimiento consistente en DMEM con alto contenido en glucosa (Sigma# D5796), complementado con 10% de suero bovino fetal sin tetraciclina (FBS, Sigma F2442), 20 mM de HEPES, 5 pg/ml de Blasticidin (Life Technologies# A11139-03) y 200 pg/ml de Zeocin (Life Technologies# R250-01). Para los experimentos, las células se colocan en medios de crecimiento a 10.000-14.000 células por pocillo en una placa Corning Biocoat (356663) de 384 pocillos revestidas con poli-D-Lisina, y se incuban 20-24 hora en un incubador de células a 37°C/5% de CO². Los experimentos se realizan sin inducir la expresión de Tau.

Tratamiento de compuestos:

Los compuestos que se van a probar se diluyen en serie 1/3 en DMSO puro utilizando curvas de respuesta de concentración de diez puntos y se diluyen aún más en medios de crecimiento. 20-24 horas después de la siembra, las células se tratan con el compuesto de prueba en medios de crecimiento; la concentración máxima del compuesto es de 15 pM (0,15% DMSO). La inhibición máxima se define por las mediciones repetidas de 15 uM de Thiamet G y la inhibición mínima se define por las mediciones repetidas del tratamiento con 0,15% de DMSO. Las células se devuelven a la incubadora a 37°C/5% de CO² durante 20-24 horas. Los compuestos se prueban por duplicado en cada placa.

Inmunotinción:

Después de 20-24 horas de tratamiento con compuestos, se retira el medio de la placa de ensayo y se añaden 25 pl de solución de formaldehído al 3,7% (Sigma # F1635) en DPBS (Sigma #D8537) a cada pocillo y se incuba durante 30 minutos. A continuación, se lavan las células una vez con DPBS y se permeabilizan con Triton™ X-100 al 0,1% (Sigma# T9284). Después de 30 minutos, las células se lavan dos veces con DPBS y, a continuación, se añade a cada pocillo una solución de bloqueo (1% BSA/DPBS/0,1% Triton™ X-100) y se incuba durante 60 minutos. Se retira la solución de bloqueo y se añade a las células una solución de 0,40-0,33 pg/ml de anticuerpo contra la proteína O-GIcNAc (clon RL2, Thermo, MA1072) en solución de bloqueo y se deja reposar toda la noche a 2-8 °C. Al día siguiente, las células se lavan dos veces con DPBS y se añade a cada pocillo el anticuerpo secundario, IgG de cabra anti-ratón Alexa Fluor 488 (Life Technologies # A11001) a 2 ug/ml en DPBS y se deja reposar a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se retira el anticuerpo secundario, se lavan las células dos veces con DPBS y se añade a cada pocillo una solución de DAPI (Sigma #D9564) y RNasa (Sigma, R6513) en DPBS a una concentración de 1 y 50 ug/ml, respectivamente. La placa se sella, se incuba durante una hora y se analiza en un Acumen eX3 hci (TTP Labtech). Todas las incubaciones y lavados descritos anteriormente se realizan a temperatura ambiente, excepto para el anticuerpo primario.

Análisis y resultados:

Las placas se analizan en un instrumento Acumen eX3 utilizando un láser de excitación de 488 y 405 nm y dos filtros de emisión FL2 (500-530 nm) y FL1 (420-490 nm). El filtro FL2 es la señal correspondiente al anticuerpo de la proteína O-GIcNAc (clon RL2) y el filtro FL1 es la señal correspondiente a los núcleos celulares (DAPI). Para el análisis de los datos se utiliza la relación Total FL2/Total FL1 (fluorescencia total de cada pocillo sin selección de objetos o poblaciones). Los datos están normalizados a una inhibición máxima referida a un tratamiento de 15 pM de Thiamet G y una inhibición mínima lograda por un tratamiento de 0,15% de DMSO. Los datos se ajustan con una aplicación de ajuste de curvas no lineales (ecuación logística de 4 parámetros) y se calculan y comunican los valores de IC⁵⁰.

El compuesto del Ejemplo 1 se probó esencialmente como se describió anteriormente y mostró un IC⁵⁰ de 21,9 nM± 7,3 (n=5). Estos datos demuestran que el compuesto del Ejemplo 1 inhibe la actividad de la enzima OGA en un ensayo celular.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

2. El compuesto o la sal según la reivindicación 1, en el que el metilo en la posición 2 está en la configuración cis con respecto al oxígeno en la posición 4 del anillo de piperidina:

3. El compuesto o la sal según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el compuesto es N-[4-fluoro-5-[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida.

4. El compuesto según la reivindicación 3 que es N-[4-fluoro-5-[[(2S,4S)-2-metil-4-[(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)metoxi]-1-piperidil]metil]tiazol-2-il]acetamida.

5. El compuesto según la reivindicación 4, en el que el compuesto es cristalino.

6. El compuesto según la reivindicación 5 que se caracteriza por tener un pico en el espectro de difracción de rayos X en el ángulo de difracción 2-theta de 12,1° en combinación con uno o más picos seleccionados del grupo que consiste en 15,3°, 21,6°, 22,2°, 22,7°, 23,5°, 24,3° y 26,8°, con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

7. Un compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6 para su uso en terapia.

8. Un compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

9. Un compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6 para su uso en el tratamiento de la progresión del deterioro cognitivo leve a la enfermedad de Alzheimer.

10. Un compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6 para su uso en el tratamiento de la parálisis supranuclear progresiva.

11. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico.

12. Un proceso para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo según una de las reivindicaciones 1-6 con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico.