KR20190096421A

KR20190096421A - Oga 억제제로서의 n-[4-플루오로-5-[[(2s,4s)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드

Info

Publication number: KR20190096421A
Application number: KR1020197021750A
Authority: KR
Inventors: 니콜라스 자크 프란시스 드레이푸스; 피터 제임스 린제이-스콧
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2017-01-27
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2019-08-19
Also published as: EP3573983A1; SI3573983T1; MY197494A; IL267693A; EA038368B1; US10081625B2; PE20191406A1; JP2020504142A; JOP20190182A1; BR112019013535A2; CN110198940B; CR20190320A; RS61979B1; MA47368B1; ES2871949T3; EA201991515A1; AR110747A1; PT3573983T; CL2019001978A1; MX2019008846A

Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 화합물:

또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 신경변성 질환 및 장애, 예컨대 알츠하이머병의 치료를 위한 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공한다.

Description

OGA 억제제로서의 N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드

본 발명은 신규 5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물, 상기 화합물을 사용하여 생리학적 장애를 치료하는 방법, 및 상기 화합물의 합성에서 유용한 중간체 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비 (PSP) 및 총체적으로 타우병증으로 공지된 타우-매개 신경변성을 수반하는 다른 질환 및 장애의 치료 분야이다.

알츠하이머병은 전세계적으로 수백만명의 환자에게 영향을 미치는 치명적인 신경변성 장애이다. 환자에게 단지 일시적이며 대증적 이점을 제공하는, 시장에서 현재 승인된 작용제를 고려할 때, 알츠하이머병의 치료에 있어서 중요한 충족되지 않은 필요성이 있다.

신경원섬유 엉킴 (NFT) 및 신경망사 (NT)를 야기하는, 필라멘트 구조 예컨대 쌍나선 필라멘트 (PHF) 및 곧은 또는 꼬인 필라멘트로의 미세소관-연관 단백질 타우의 올리고머화는, 알츠하이머병 및 다른 타우병증의 본질적인 의미를 규정하는 병리학적 특징 중 하나이다. 알츠하이머병을 가진 개체의 뇌에서 NFT의 수는 알츠하이머병의 중증도과 밀접하게 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 타우가 뉴런 기능장애 및 신경변성에 핵심적인 역할을 한다는 것을 시사한다 (Nelson et al., J Neuropathol Exp Neurol., 71(5), 362-381(2012)). 타우 병리학은 PSP에서의 질환 지속기간과 상관관계가 있는 것으로 나타났고; 더 공격적인 질환 과정을 가진 사례는 더 느린 진행을 가진 사례보다 더 높은 타우 부담을 갖는다. (Williams et al., Brain, 130, 1566-76 (2007)).

최근 연구 (Yuzwa et al., Nat Chem Biol, 4(8), 483-490 (2008))는 알츠하이머병 및 관련 타우-매개 신경변성 장애의 치료를 위해 병적 타우로의 응집 및 타우 과인산화를 제한하는 O-GlcNAcase (OGA) 억제제의 치료적 잠재력을 뒷받침한다. 구체적으로, OGA 억제제 티아메트-G는 JNPL3 타우 마우스 모델에서 운동 신경세포 손실을 둔화시키는 것에 연계되어 있으며 (Yuzwa et al., Nat Chem Biol, 8 , 393-399 (2012)) Tg4510 타우 마우스 모델에서 타우 병리학 및 이영양성 신경돌기 감소와 연계되어 있다 (Graham et al., Neuropharmacology, 79, 307-313 (2014)). 따라서, OGA 억제제는 타우의 과인산화된 병적 형태, 예컨대 NFT 및 NT의 축적을 감소시키는 타당한 치료 접근법으로서 인식된다.

미국 특허 번호 9,120,781은 헥사히드로벤조옥사졸 및 헥사히드로벤조티아졸 유도체를 개시하고 있으며, 이러한 유도체는 OGA 억제 활성을 보유하고 추가로 OGA의 결핍 또는 과다발현, 및/또는 2-아세트아미도-2-데옥시-5β-D-글루코피라노시드 (O-GlcNAc)의 축적 또는 결핍과 관련된 질환 및 장애를 치료하는데 유용한 것으로 개시되어 있다. 게다가, US 2016/0031871은 알츠하이머병을 치료하기 위한 특정 글리코시다제 억제제를 개시하고 있다.

뇌 침투제인 OGA 억제제는 타우-매개 신경변성 장애, 예컨대 알츠하이머병 및 PSP에 대한 치료법을 제공하고자 한다. 본 발명은 OGA의 억제제인 특정 신규 화합물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 화학식 I의 화합물:

또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

게다가, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물:

또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명은 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 진행성 핵상 마비의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 진행성 핵상 마비를 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 타우-매개 신경변성 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 타우-매개 신경변성 장애를 치료하는 방법을 또한 제공한다.

더욱이, 본 발명은 요법에서 사용하기 위한, 특히 알츠하이머병의 치료에서 사용하기 위한 또는 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행을 예방하는데 사용하기 위한 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 게다가, 본 발명은 진행성 핵상 마비의 치료에서 사용하기 위한 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 본 발명은 타우-매개 신경변성 장애를 치료하는데 사용하기 위한 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 또한 제공한다.

추가로 더욱이, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 위한 또는 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행을 예방하기 위한 의약의 제조를 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 게다가, 본 발명은 진행성 핵상 마비의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 본 발명은 타우-매개 신경변성 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 또한 제공한다.

본 발명은 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 포함하는, 제약 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 신규 중간체 및 화학식 I 및 Ia의 화합물의 합성 방법을 또한 포함한다.

경도 인지 장애는 시간이 지남에 따라 알츠하이머 치매로의 경도 인지 장애를 나타내는 환자의 임상적 제시 및 진행에 기초하여 알츠하이머병과 연관된 치매의 잠재적인 전구기로서 정의되어 있다. 용어 "경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행을 예방하는"는 환자에서 알츠하이머병으로의 경도 인지 장애의 진행을 억제, 둔화, 정지, 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료하기 위해"는 기존의 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 억제, 둔화, 정지, 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 인간을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여시, 진단 또는 치료 중인 환자에서 원하는 효과를 제공하는, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다.

유효량은 공지 기술의 사용에 의해 그리고 유사한 환경 하에 수득된 결과의 관찰에 의해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 환자에 대한 유효량을 결정하는데 있어서, 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 고려된다: 환자의 종; 그의 크기, 연령, 및 전반적 건강; 관여된 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 중증도 또는 관여의 정도; 개별 환자의 반응; 투여된 특정한 화합물; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특성; 선택된 용량 요법; 수반되는 약물의 사용; 및 다른 관련 상황.

본 발명의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 하루 투여량이 통상 약 0.1 내지 약 15 mg/kg 체중의 범위 내에 속한다. 일부 경우에, 앞서 언급한 범위의 하한선 미만의 투여량 수준이 아주 적절할 수 있으며, 한편 다른 경우에는 허용되는 부작용으로 여전히 더 많은 용량이 사용될 수 있으므로, 상기 투여량 범위는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것이 아니다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 경구 및 경피 경로를 포함하여, 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 가장 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여용이다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, Editor, 22^nd Edition, Pharmaceutical Press, 2012] 참조).

화학식 I 및 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 본 발명의 치료 방법에서 특히 유용하나, 특정 배위가 바람직하다. 하기 단락은 이러한 바람직한 배위를 기재한다. 이들 선호도는 치료 방법 및 본 발명의 화합물 둘 다에 적용가능한 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 화합물은 하기를 포함한다:

및 그의 제약상 허용되는 염.

피페리딘 고리 상의 메틸 및 산소 치환기가 시스 또는 트랜스 배위인 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 본 발명의 범위 내에 포함되며, 시스 배위가 바람직하다. 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 위치 2에서의 메틸이 하기 반응식 A에 나타낸 바와 같이 위치 4에서의 산소에 대해 시스 배위임을 인식할 것이다:

반응식 A

게다가, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 위치 2에서의 메틸이 하기 반응식 B에 나타낸 바와 같이 위치 4에서의 산소에 대해 트랜스 배위임을 인식할 것이다:

반응식 B

피페리딘 고리의 위치 2에서의 키랄 중심이 S-배위인 화합물이 추가로 바람직하다. 비록 본 발명이 모든 개별 거울상이성질체 및 부분입체이성질체, 뿐만 아니라 라세미체를 포함한, 상기 화합물의 거울상이성질체의 혼합물을 고려하긴 하지만, 하기 제시되는 바와 같은 절대 배위를 가진 화합물이 특히 바람직하다:

N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드, 및 그의 제약상 허용되는 염; 및

N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드가 특히 바람직하다.

N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드의 결정질 형태가 특별히 바람직하다. 0.2도의 회절각에 대한 허용오차로 15.3°, 21.6°, 22.2°, 22.7°, 23.5°, 24.3°, 및 26.8°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 조합된 12.1°의 회절각 2-세타에서의 X-선 분말 회절 스펙트럼의 피크를 특징으로 하는 N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드의 결정질 형태가 추가로 바람직하다.

개별 이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체는 본 발명의 화합물의 합성에서 임의의 편리한 시점에서, 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 분리되거나 분할될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981], 및 [E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조).

본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 염은, 예를 들어, 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 조건 하에 적합한 용매 중에서 본 발명의 화합물의 적절한 유리 염기 및 적절한 제약상 허용되는 산의 반응에 의해 형성될 수 있다. 이러한 염의 형성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 인식되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)]; [Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)]; 및 [Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)] 참조.

본 발명의 화합물, 또는 그의 염은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 여러 가지의 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부는 하기 반응식, 제조예 및 실시예에 예시되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기재된 경로 각각에 대한 구체적 합성 단계가 상이한 방식으로, 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어, 본 발명의 화합물, 또는 그의 염을 제조할 수 있음을 인식한다. 하기 반응식의 각각의 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리, 및 결정화를 포함한, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 하기 반응식에서, 달리 명시하지 않는 한 모든 치환기는 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다. 본 발명의 범위를 제한함이 없이, 하기 반응식, 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된다. 게다가, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학식 Ia, Ib, Ic, 및 Id의 화합물이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있는 상응하는 입체화학적 배위을 가진 출발 물질을 사용함으로써 제조될 수 있음을 인식한다. 예를 들어, 하기 반응식은 궁극적으로 화학식 Ia에 상응하는 배위를 가진 출발 물질을 이용한다.

일반적으로, 화학식 Ia의 화합물은 화학식 II의 화합물로부터 제조될 수 있다 (반응식 1). 보다 구체적으로, 화학식 IIa의 화합물을 적합한 용매 중에서 적합한 환원제 예컨대 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드의 존재 하에 N-(4-플루오로-5-포르밀티아졸-2-일)아세트아미드로 환원적으로 알킬화시켜 적합한 용매, 예컨대 에틸 아세테이트 중에서의 화학식 Ia의 화합물을 수득한다. N-(4-플루오로-5-포르밀티아졸-2-일)아세트아미드는 화학 분야에 공지된 방법 뿐만 아니라 하기 제조예 및 실시예에서 제공된 방법에 의해 제조될 수 있다.

화학식 IIa의 화합물을 Pg가 적합한 아민 보호기인 화학식 IIIa의 화합물로부터 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, Pg가 tert-부틸 카르복실레이트 (t-BOC)인 화학식 IIa의 화합물을 적합한 용매 예컨대 디옥산 또는 디클로로메탄 중에서 산 예컨대 염산 또는 트리플루오로아세트산과 반응시켜 화학식 IIa의 화합물을 수득한다. 적합한 아민 보호기는 화학 분야에 공지되어 있으며, t-BOC 및 Cbz 뿐만 아니라 문헌 [T. W. Green, P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis" Wiley-Interscience, New York, 1999]에 논의된 것들을 포함한다.

반응식 1

Pg가 적합한 아민 보호기인 화학식 IIIa의 화합물을 화학식 IVa의 화합물로부터 제조할 수 있다 (반응식 2). 보다 구체적으로, Pg가 tert-부틸 카르복실레이트인 화학식 IVa의 화합물을 염기 예컨대 나트륨 tert-부톡시드의 존재 하에 3-(클로로메틸)-5-메틸-1,2,4-옥사디아졸과 반응시켜 화학식 IIIa의 화합물을 수득한다. 반응은 용매 예컨대 아세토니트릴 또는 디메틸포름아미드 중에서 편리하게 수행한다. Pg가 tert-부틸 카르복실레이트인 화학식 IVa의 화합물을 본질적으로 WO 2004/094380 A1에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 화학식 Va의 화합물을 용매 예컨대 테트라히드로푸란 중에서 환원제 예컨대 리튬 트리(sec-부틸)보로히드라이드와 반응시켜 Pg가 tert-부틸 카르복실레이트인 화학식 IVa의 화합물을 수득한다. Pg가 적합한 아민 보호기인 화학식 Va의 화합물을 WO 2004/094380 A1에 기재된 것들을 포함하여 화학 분야에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.

반응식 2

제조예 1

tert-부틸 N-(4-플루오로-5-포르밀-티아졸-2-일)카르바메이트의 합성.

플루오린화세슘 (227 g, 1480 mmol)을 실온에서 DMSO (776 mL) 중 tert-부틸 N-(4-클로로-5-포르밀-티아졸-2-일)카르바메이트 (38.8 g, 148 mmol; tert-부틸 N-(4-클로로-5-포르밀-티아졸-2-일)카르바메이트의 제조에 대해서는 예를 들어, 문헌 [N. Masuda, et al., Bioorg Med Chem, 12, 6171-6182 (2004)] 참조)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 133℃의 내부 온도로 145℃ 가열 블록 내에서 48시간 동안 교반한 다음에, 혼합물을 빙수조에서 냉각시켰다. 혼합물에, 포화 중탄산나트륨 수용액 (500 mL), 염수 (500 mL) 및 에틸 아세테이트 (500 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음에, 규조토를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트 (500 mL)로 세척하였다. 여액을 분별 깔때기로 옮기고 층을 분리한 다음에, 수성 층을 에틸 아세테이트 (1 L)로 추출하였다. 합해진 유기물을 염수 (1 L)로 세척한 다음에, 염수 층을 에틸 아세테이트 (300 mL)로 추출하였다. 합해진 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (1.5 L) 중의 5% 에틸 아세테이트로 용리시키는 실리카겔 (330 g)의 패드를 통과시키고, 여액을 농축시켜 잔류물 (24.2 g)을 수득하였다.

잔류물 (32.7 g의 합해진 로트, 133 mmol)을 이소프로판올 (303 mL)에 용해시키고, 여과한 다음에, 180 mL/분에서 3 mL 주입으로 10% IPA (첨가제 없음)를 가진 IC 칼럼 (셀룰로스 폴리사카라이드 유도체: 트리스 (3,5-디클로로페닐카르바메이트, 30 x 250 mm, 5u)을 사용하여 SFC (초임계 유체 크로마토그래피)에 의해 정제하였다. 생성물-함유 분획을 농축시켜 표제 화합물 (16.1 g)을 수득하였다. MS m/z 247.0 (M+H).

제조예 2

N-(4-플루오로-5-포르밀-티아졸-2-일)아세트아미드의 합성 (방법 A)

재킷형 용기에서, 브로민화아연 (91.9 g, 408 mmol)을 실온에서 tert-부틸 N-(4-플루오로-5-포르밀-티아졸-2-일)카르바메이트 (33.5 g, 136 mmol)와 디클로로메탄 (503 mL)의 혼합물에 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃의 내부 온도에서 밤새 교반한 다음에, 재킷 온도를 -10℃로 설정하고 내부 온도를 6℃ 미만으로 유지하면서 테트라히드로푸란 (111 mL)을 15분에 걸쳐 적가하였다. 그 다음에 재킷 온도를 -30℃로 설정하고 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 피리딘 (110 mL, 1360 mmol)을 5분에 걸쳐 적가하였다. 재킷 온도를 0℃로 설정하고 아세트산 무수물 (116 mL, 1220 mmol)을 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 37℃의 내부 온도에서 밤새 교반한 다음에, 실온으로 냉각시키고, 테트라히드로푸란 (500 mL)으로 용리시키는, 규조토의 짧은 패드를 통과시켰다. 여액을 플라스크로 옮기고 혼합물을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 톨루엔 (50 mL)으로부터 농축시켰다. 잔류물에 물 (400 mL) 및 2-메틸테트라히드로푸란 (400 mL) 중 시트르산 1수화물 (57.2 g, 272 mmol)의 용액을 첨가하고 혼합물을 40℃에서 5분 동안 교반한 다음에, 2-메틸테트라히드로푸란 (100 mL)으로 용리시키는, 규조토의 짧은 패드를 통과시켰다. 여액을 분별 깔때기로 옮기고 층을 분리하였다. 수성 층을 2-메틸 테트라히드로푸란 (2 × 250 mL)으로 추출하고 합해진 유기물을 물 (500 mL)로 희석하였다. 혼합물에 가스 발생이 중단될 때까지 교반하면서 5분에 걸쳐 고체 중탄산나트륨을 나누어 첨가하였다. 혼합물을 분별 깔때기로 옮기고 층을 분리한 다음에, 수성 층을 2-메틸테트라히드로푸란 (200 mL 및 100 mL)으로 추출하였다. 합해진 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 잔류물을 수득하고,이를 2-메틸테트라히드로푸란 (100 mL)으로 희석하고, 혼합물을 2-메틸테트라히드로푸란 (2.5 L)으로 용리시키는, 실리카겔 (250 g)의 짧은 패드를 통과시켰다. 여액을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 디클로로메탄과 헵탄 (202 mL)의 1:1 혼합물에 현탁시켰다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반한 다음에 여과하였다. 여과된 고체를 진공 하에 40℃에서 2시간 동안 건조시켜 표제 화합물 (18.0 g, 70%)을 수득하였다. MS m/z 189.0 (M+H).

N-(4-플루오로-5-포르밀-티아졸-2-일)아세트아미드의 대안적인 합성 (방법 B).

디클로로메탄 (1325 g, 15.6 mol)을 2-아미노-4-클로로티아졸-5-카르브알데히드 (100 g, 0.61 mol) 및 피리딘 (194.6 g, 2.46 mol)에 첨가하고, 0-5℃로 냉각시켰다. 온도를 0-5℃로 유지하면서 아세트산 무수물 (188.4 g, 1.85 mol)을 적가하였다. 첨가가 완료된 후, 온도를 20-25℃로 조정하고 41시간 동안 교반하였다. 감압 하에 농축시킨 후, 온도를 40℃ 미만으로 유지하면서 35% 수성 HCl (200 mL) 및 물 (1.5 L)을 첨가하였다. 20-25℃로 냉각시키고 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 수집된 고체를 물로 세척하였다. 고체를 60-65℃에서 24시간 동안 건조시켜 N-(4-클로로-5-포르밀티아졸-2-일)아세트아미드 (75 g, 0.4 mol)를 수득하였다.

불활성 분위기 하에, 술포란 (1000 ml)을 N-(4-클로로-5-포르밀티아졸-2-일)아세트아미드 (50 g, 0.244 mol, 바로 상기에서 제조됨), 테트라메틸암모늄 클로라이드 (107.1 g, 0.977 mol), 및 플루오린화세슘 (370.6 g, 2.44 mmol)에 첨가하였다. 130℃로 가열하고 23시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 45%의 표제 화합물의 계내 수율로 75% 전환율을 나타냈다.

N-(4-플루오로-5-포르밀-티아졸-2-일)아세트아미드의 대안적인 합성 (방법 C).

2-프로판올 (150 mL)을 테트라메틸암모늄 플루오라이드.4수화물 (10.2 g, 109.0 mmol)에 첨가하고 혼합물을 내부 온도를 70℃로 유지하면서 진공 하에 2-3 부피로 농축시켜 물을 제거하였다. 2-프로판올 (200 mL)을 첨가하고 혼합물을 진공 하에 2-3 부피로 농축시켰다. 2회 더 반복하였다. DMF (200 mL)를 첨가하고 진공 하에 2-3 부피로 농축시켰다. THF (200 mL)를 첨가하고 2-3 부피로 농축시켰다. 2회 더 반복하였다. N-(4-클로로-5-포르밀티아졸-2-일)아세트아미드 (1.22 g, 5.96 mmol, 방법 B에서 상기에서 제조됨) 및 DMF (12 ml)를 충전하였다. 110℃로 가열하고 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 25℃로 냉각시켰다. 2-메틸테트라히드로푸란 (40 mL) 및 물 (40 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 층을 2-메틸테트라히드로푸란 (40 mL)으로 추출하였다. 층을 분리하고 합해진 유기 층을 물 (20 mL)로 세척하였다. 층을 분리하고 유기 층을 농축시켰다. 에틸 아세테이트 (20 mL) 및 물 (5 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 층을 농축시켜 용매를 제거하였다. 에틸 아세테이트 (2 mL) 및 헵탄 (2 mL)을 첨가하고 여과하였다. 여과된 고체를 진공 하에 55℃에서 18시간 동안 건조시켜 N-(4-클로로-5-포르밀티아졸-2-일)아세트아미드와 93% 혼합물로서 표제 화합물을 수득하였다.

제조예 3

tert-부틸 (2S,4S)-4-히드록시-2-메틸-피페리딘-1-카르복실레이트의 합성.

플라스크에 tert-부틸 (2S)-2-메틸-4-옥소-피페리딘-1-카르복실레이트 (50 g, 234.44 mmol) 및 테트라히드로푸란 (500 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에 -65℃로 냉각시키고 내부 온도를 -60℃ 미만으로 유지하면서 리튬 트리(sec-부틸)보로히드라이드 (304.77 mL, 304.77 mmol; 테트라히드로푸란 중 1 M)를 45분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음에, -30℃로 냉각시켰다. 내부 온도를 -20℃ 미만으로 유지하면서 반응 혼합물에 물 (25.34 mL)과 테트라히드로푸란 (100.16 mL)의 혼합물을 첨가하였다. 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 물 (126.70 mL) 중 과산화수소의 수용액 (118.88 mL, 1.17 mol, 30 wt/wt%)을 1시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물에 염화수소 수용액 (46.89 mL, 234.44 mmol, 5 M) 및 메틸 t-부틸 에테르 (1.00 L)를 첨가하고 혼합물을 실온으로 가온하였다. 층을 분리하고, 유기 상을 물 (500 mL) 중 메타중아황산나트륨 (222.84 g, 1.17 mol)의 용액과 함께 실온에서 10분 동안 교반하였다. 층을 분리하고, 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (0-50% 메틸 t-부틸 에테르/이소헥산, 실리카겔)에 의해 정제하고 생성물-함유 분획을 합하고 농축시켜 표제 화합물 (40.4 g, 78%)을 수득하였다. ES/MS (m/e) 238 (M+Na).

tert-부틸 (2S,4S)-4-히드록시-2-메틸-피페리딘-1-카르복실레이트의 대안적인 합성.

20℃에서 탈이온수 (460 L), 및 인산이수소칼륨 (6.5 kg, 0.41 당량)을 함유하는 글래스-라이닝된(glass-lined) 반응기에 DMSO (27.4 kg , 1.0 부피) 및 D-(+)-글루코스 1수화물 (28.9 kg, 1.25 당량)을 충전하였다. 내부 온도를 30℃로 조정하고, 수산화나트륨 수용액 (8%, 15 L, 0.28 당량)을 첨가하여 반응물의 pH를 6.9로 조정하였다. 반응기를 tert-부틸 (2S)-2-메틸-4-옥소-피페리딘-1-카르복실레이트 (24.9 kg, 1.0 당량 (99.1% ee))로 충전하고, 혼합물을 30℃에서 15분 동안 교반하였다. 케토리덕타제 (KRED-130, 250 g, 1% w/w), 글루코스 데히드로게나제 (GDH-101, 250 g, 1% w/w), 및 NADP 나트륨 염 (63 g, 0.25% w/w)을 개방 포트를 통해 반응 혼합물에 직접 충전하였다. 혼합물을 8% 수성 NaHCO₃의 첨가를 통해 30℃의 온도 및 pH 7.0 ± 0.2에서 유지하였다. 16.5시간 동안 교반한 후 (99.5% 전환율), 반응물에 셀라이트(Celite)™ (12.5 kg, 50 w/w%) 및 톨루엔 (125 L, 5 부피)을 충전하였다. 30℃에서 30분 동안 교반한 후, 혼합물을 1시간의 기간에 걸쳐 인-라인 GAF-필터 (4 소크)를 통해 또 다른 2000L 반응기로 옮겼다. 혼합물을 교반 없이 30분 방치하고, 층을 분리하고, 수성 층을 톨루엔 (2 × 125 L)으로 역-추출하였다. 합해진 유기 층을 여과하고 (인-라인 GAF-필터), 톨루엔 혼합물을 25℃에서 염화나트륨 수용액 (25%, 125 L, 5 부피)으로 세척하였다. 생성된 톨루엔 용액을 공비 건조 (부분 진공, 내부 온도 < 60℃)시켜 0.10 w/w% 물을 수득하고, 20℃로 냉각시켰다. 혼합물을 카트리지 필터를 통해 반응기로부터 질소 양압 하에 깨끗한 드럼으로 여과하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 드럼으로부터 500 L 글래스 라이닝된 용기로 옮기고 진공 하에 (< 60℃) 56 L (2.25 부피)의 목표 잔류 부피로 농축시켰다. n-헵탄 (169 kg, 10 부피)을 40℃에서 충전하고, 혼합물을 25 g의 tert-부틸 (2S,4S)-4-히드록시-2-메틸-피페리딘-1-카르복실레이트로 시딩하였다. 생성된 농후한 슬러리를 추가 n-헵탄 (25 L, 1 부피)으로 희석하고 4시간에 걸쳐 16℃로 냉각시켰다. 생성물을 원심분리를 통해 단리하고, n-헵탄 (스핀당 25 L; 4개의 스핀 필요)으로 세척하고, 30℃에서 트레이 건조기에서 11시간 동안 건조한 후 20.3 kg (81%; >99.9% ee)을 수득하였다. ES/MS (m/e) 238 (M+Na).

제조예 4

tert-부틸 (2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]피페리딘-1-카르복실레이트의 합성.

3-(클로로메틸)-5-메틸-1,2,4-옥사디아졸 (43.5 g, 301 mmol)을 실온에서 아세토니트릴 (590 mL) 중 tert-부틸 (2S,4S)-4-히드록시-2-메틸-피페리딘-1-카르복실레이트 (29.5 g, 137 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 빙수조에서 교반하고 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 나트륨 tert-부톡시드 (54.3 g, 548 mmol)를 10분에 걸쳐 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃의 내부 온도에서의 빙수조에서 9시간 동안 교반한 다음에, 서서히 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수조에서 냉각시키고, 첨가 동안에 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 포화 염화암모늄 수용액 (200 mL)을 5분에 걸쳐 첨가하였다. 그 다음에 혼합물을 물 (100 mL)로 희석하고 실온으로 가온하였다. 혼합물을 메틸 tert-부틸 에테르 (2 x 300 mL)로 추출하고 합해진 유기물을 염수 (300 mL)로 세척하였다. 합해진 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 메틸 tert-부틸 에테르 (1 L)로 용리시키는 실리카겔 (300 g)의 패드를 통해 신속하게 통과시키고, 여액을 농축시켜 표제 화합물 (46.5 g, 109%)을 수득하였다. MS m/z 334.0 (M+Na).

tert-부틸 (2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]피페리딘-1-카르복실레이트의 대안적인 합성.

0℃에서 질소 하에 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 중 tert-부틸 (2S,4S)-4-히드록시-2-메틸-피페리딘-1-카르복실레이트 (0.25 g, 1.16 mmol) 및 3-(클로로메틸)-5-메틸-1,2,4-옥사디아졸 (0.308 g, 2.32 mmol)의 용액에 나트륨 tert-부톡시드 (0.35 g, 3.5 mmol)를 5분에 걸쳐 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음에, 40℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음에 물 (10 mL)로 켄칭하였다. 층을 분리하고 수성 상을 메틸 tert-부틸 에테르 (2×10 mL)로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 염화리튬 (5%)의 수용액으로 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (0.49 g, 0.7 mmol, 81% 수율, 60% 순도)을 갈색 오일로서 수득하였다. MS m/z 334.0 (M+Na).

제조예 5

5-메틸-3-[[(2S,4S)-2-메틸-4-피페리딜]옥시메틸]-1,2,4-옥사디아졸 히드로클로라이드의 합성.

tert-부틸 (2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]피페리딘-1-카르복실레이트 (4.03 g, 12.9 mmol)를 함유하는 플라스크를 빙수조에 침수시켰다. 이 플라스크에 1,4-디옥산 (25.9 mL, 104 mmol) 중 4 M 염산 용액을 교반하면서 5분에 걸쳐 적가하고, 첨가 도중에 내부 온도를 20℃ 미만으로 유지하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음에, 농축시켜 표제 화합물 (3.56 g, ¹H NMR에 의해 측정된 83% 순도에 기초한 수율 92%)을 수득하였다. MS m/z 212.0 (M+H).

5-메틸-3-[[(2S,4S)-2-메틸-4-피페리딜]옥시메틸]-1,2,4-옥사디아졸 히드로클로라이드의 대안적인 합성.

메탄올 (50 mL)을 tert-부틸 (2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]피페리딘-1-카르복실레이트 (12.9 g, 0.041 mol)에 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 메탄올 (80 mL) 중 염산의 4M 용액을 냉각된 혼합물에 내부 온도를 20℃ 미만으로 유지하면서 적가하였다. 그 다음에, 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 그 다음에, 혼합물을 농축시켜 용매를 제거하였다. 아세톤 (10 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 테트라히드로푸란 (40 mL)을 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 고체를 질소 하에 여과에 의해 수집하고, 여과된 고체 케이크를 테트라히드로푸란으로 세정하였다. 그 다음에, 여과된 고체를 진공 하에 45℃에서 2시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 90% 순도로 수득하였다. 아세톤을 사용하는 재결정화는 표제 화합물의 순도를 95%까지 증가시킬 수 있다.

제조예 6

5-메틸-3-[[(2S,4S)-2-메틸-4-피페리딜]옥시메틸]-1,2,4-옥사디아졸의 합성.

질소 하에 디클로로메탄 (10 mL) 중의 tert-부틸 (2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]피페리딘-1-카르복실레이트 (0.49 g, 1.6 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (1.8 mL, 23 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 잔류물을 메탄올 (5 mL)에 용해시키고 양이온 교환 카트리지에 붓고, 메탄올 (2×10 mL) 그 다음에 메탄올 (10 mL) 중 2 M 암모니아 용액으로 용리시켰다. 여액을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (0.3 g, 1.4 mmol, 91%)을 수득하였다. MS m/z 212.0 (M+H).

실시예 1

N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드의 합성.

N-(4-플루오로-5-포르밀-티아졸-2-일)아세트아미드 (28.3 g, 150 mmol)를 실온에서 에틸 아세테이트 (707 mL) 중 5-메틸-3-[[(2S,4S)-2-메틸-4-피페리딜]옥시메틸]-1,2,4-옥사디아졸 히드로클로라이드 (48.7 g, 185 mmol, 94% 순도)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 N,N-디이소프로필에틸아민 (34.1 mL, 195 mmol)을 1분에 걸쳐 적가한 다음에, 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (98.5 g, 451 mmol)를 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30℃의 내부 온도로 밤새 31℃ 가열 블록에서 교반한 다음에, 빙수조에서 5℃의 내부 온도로 냉각시켰다. 혼합물에 2 M 염산 용액 (226 mL)을 15분에 걸쳐, 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 첨가하였다. 혼합물에 물 (250 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 층을 분리하고 유기 층을 물 (50 mL) 중 2 M 염산 수용액 (28 mL)의 혼합물로 추출하였다. 제1 수성 층을 빙수조에서 교반하고 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 50% 수산화나트륨 수용액 (25.7 mL)을 10분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 포화 중탄산나트륨 수용액 (100 mL)으로 희석한 다음에, 실온에서 10분 동안 교반한 다음에, 에틸 아세테이트 (3 × 400 mL)로 추출하였다. 합해진 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 수성 염산을 사용한 추출로부터의 제2 수성 층을 2-메틸테트라히드로푸란 (200 mL)으로 희석하고 혼합물을 규조토의 짧은 패드를 통과시켰다. 여액을 분별 깔때기로 옮기고 층을 분리하였다. 수성 층을 빙수조에서 교반하고 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 50% 수산화나트륨 수용액 (3.15 mL)을 5분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 포화 중탄산나트륨 수용액 (10 mL)으로 희석한 다음에, 실온에서 5분 동안 교반한 다음에, 에틸 아세테이트 (3 × 40 mL) 및 에틸 아세테이트 (100 mL) 중 10% 이소프로판올로 추출하였다. 합해진 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 후처리의 제1 부분으로부터의 잔류물과 합하였다. 합해진 잔류물을 에틸 아세테이트 (3.5 L)로 용리시키는 실리카겔 (350 g)의 패드를 통과시키고, 여액을 농축시켜 잔류물 (45.8 g)을 수득하였다.

잔류물 (47.5 g의 합해진 로트, 123.9 mmol)을 헵탄 중 50-100% 에틸 아세테이트로 용리시키는 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물-함유 분획을 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 메틸-tert-부틸 에테르와 헵탄 (448 mL)의 1:1 혼합물에 현탁시켰다. 혼합물을 45℃의 내부 온도에서 30분 동안 46℃ 가열 블록에서 교반한 다음에, 교반하면서 2시간에 걸쳐 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 여과하고, 고체를 메틸-tert-부틸 에테르와 헵탄 (30 mL)의 1:1 혼합물로 세척하였다. 여과된 고체를 진공 하에 40℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물 (28.5 g)을 수득하였다. MS m/z 384.0 (M+H);

[α]_D ²⁰ = +33.4° (C=0.26, 메탄올).

N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드의 대안적인 합성.

질소 하에 디클로로메탄 (10 mL) 중 N-(4-플루오로-5-포르밀-티아졸-2-일)아세트아미드 (0.05 g, 0.28 mmol) 및 5-메틸-3-[[(2S,4S)-2-메틸-4-피페리딜]옥시메틸]-1,2,4-옥사디아졸 (0.04 g, 0.19 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.1 mL, 0.57 mmol) 및 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (0.12 g, 0.57 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 수용액 (10 mL)에 부었다. 층을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄 (2×10 mL)으로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 오렌지색 오일을 수득하였다.

잔류물을 메탄올에 (9.8 ml의 총 부피까지) 용해시키고, 여과하고, prep-HPLC (페노메넥스(Phenomenex) 제미니-NX 10 미크론 50*150 mm C-18) (수산화암모늄으로 pH 9로 조정된 10 mM 중탄산암모늄을 가진 CH₃CN & 물, 110 mL/분에서 10분에 걸쳐 15% 내지 100% CH₃CN) (1회 주입) (271/204 nm)에 의해 정제하여 표제 화합물 (0.02 g, 0.05 mmol, 28%)을 수득하였다. MS m/z 384.2 (M+H).

실시예 1A

결정질 N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드.

조 N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드 (29.9 g)를 헵탄 중 448 mL의 50% 메틸 tert 부틸 에테르에 46℃에서 30분 동안 현탁하였다. 혼합물을 교반하고, 2시간에 걸쳐 19℃로 냉각시킨 후, 헵탄 중 30 mL의 50% 메틸 tert 부틸 에테르의 세척으로 여과한 후, 표제 화합물 (28.5 g, 95% 수율)을 수득하였다.

실시예 1A의 X-선 분말 회절 (XRPD)

결정질 고체의 XRPD 패턴은 35 kV 및 50 mA에서 작동하는, 반텍(Vantec) 검출기 및 CuKα 공급원 (λ = 1.54060 Å)이 장착된, 브루커(Bruker) D4 엔데버(Endeavor) X-선 분말 회절계 상에서 수득하였다. 샘플은 2θ에서 4 내지 40°에서, 2θ에서 0.0087°의 스텝 크기 및 0.5초/스텝의 스캔 속도로, 그리고 0.6 mm 발산, 5.28 mm 고정 항-산란제, 및 9.5 mm 검출기 슬릿으로 스캔하였다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고 유리 슬라이드를 사용하여 평활한 표면을 수득하였다. 임의의 주어진 결정 형태에 대해, 회절 피크의 상대 강도가 결정 형태 및 습성과 같은 인자로부터 생긴 바람직한 배향으로 인해 변할 수 있는 것은 결정학 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 영향이 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되나, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. (예를 들어, 문헌 [The U. S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35 Chapter 941 Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD) Official May 1, 2015] 참조). 더욱이, 임의의 주어진 결정 형태에 대해 각이 진 피크 위치가 약간 변할 수 있다는 것은 결정학 분야에서 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도의 변화, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동할 수 있다. 본 경우에, 2θ에서 ±0.2의 피크 위치 가변성은 명시된 결정 형태의 명확한 식별을 방해함이 없이 이들 잠재적 변화를 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 구별되는 피크의 임의의 특유한 조합 (° 2θ 단위로), 전형적으로 더 두드러진 피크를 기준으로 하여 이루어질 수 있었다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된, 결정 형태의 회절 패턴은, NIST 675 표준 피크 (8.85 및 26.77도 2-세타)를 기준으로 조정되었다.

결정질 N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드의 제조된 샘플은 하기 표 1에 기재된 바와 같이 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것으로 CuKα 방사선을 사용하는 XRPD 패턴에 의해 특성화되었다. 구체적으로 패턴은 0.2도의 회절각에 대한 허용오차로 15.3°, 21.6°, 22.2°, 22.7°, 23.5°, 24.3°, 및 26.8°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 조합된 12.1°에서의 피크를 함유하였다.

표 1: 결정질 N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드, 실시예 1A의 X-선 분말 회절 피크.

시험관내 인간 OGA 효소 검정

OGA 단백질의 생성

전장 인간 O-GlcNAc-β-N-아세틸글루코사미니다제 (NM_012215)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 N-말단 폴리-히스티딘 (HIS) 태그를 가진 pFastBac1 (인비트로젠(Invitrogen)) 벡터에 삽입하였다. 바큘로바이러스 생성은 Bac-대-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템(Bac-to-Bac Baculovirus Expression system) (인비트로젠) 프로토콜에 따라 수행하였다. Sf9 세포를 배양액 리터당 10 mL의 P1 바이러스를 사용하여 1.5 x 10⁶개 세포/mL로 감염시키고 28℃에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 스핀다운시키고, PBS로 세정하고 펠렛을 -80℃에서 보관하였다.

상기 OGA 단백질 (His-OGA)은 다음과 같이 정제하였다: 4 L의 세포를 50 mM 트리스, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, 10 mM 이미다졸, 1 mM 디티오트레이톨 (DTT), 0.1% 트리톤(Triton)™ X-100, 4개의 정제의 프로테아제 억제제 (완전 EDTA-미함유, 로슈(Roche))를 함유하는 200 mL의 완충제에 4℃에서 45분 동안 용해시켰다. 그 다음에 이 세포 용해물을 4℃에서 16,500 rpm으로 40분 동안 회전시키고, 상청액을 4℃에서 2시간 동안 6 mL의 Ni-NTA 수지 (니켈-니트릴로트리아세트산)와 함께 인큐베이션하였다.

그 다음에 수지를 칼럼 상으로 패킹하고 50 mM 트리스, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, 10 mM 이미다졸, 0.1% 트리톤™ X-100, 1 mM DTT에 뒤이어, 50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 1 mM DTT로 세척하였다. 단백질은 50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 1 mM DTT로 용리시켰다. 풀링된 His-OGA 함유 분획을 6 ml로 농축시키고 슈퍼덱스75(Superdex75) (16/60) 상에 로딩하였다. 단백질은 50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM DTT로 용리시켰다. His-OGA를 함유하는 분획을 풀링하고 단백질 농도를 BCA (브래드포드 비색 검정(Bradford Colorimetric Assay))로 측정하였다.

OGA 효소 검정

OGA 효소는 핵세포질 단백질로부터 O-GlcNAc의 제거를 촉매한다. 이 활성을 측정하기 위해 플루오레세인-디-N-아세틸-β-N-아세틸-D-글루코사미니드 (FD-GlcNAc, Kim, Eun Ju; Kang, Dae Ook; Love, Dona C.; Hanover, John A. Carbohydrate Research (2006), 341(8), 971-982)를 10 μM (96 웰 검정 포맷에서) 또는 6.7 μM (384 웰 분석 포맷에서)의 최종 농도로 기질로서 사용하였다. 이 형광원성 기질은 OGA에 의해 절단시 형광이 되어, 효소 활성은 535 nm (485 nm에서 여기)에서 검출된 형광의 증가에 의해 측정할 수 있었다.

검정 완충제는 pH 7에서, 물 중 50 mM H₂NaPO₃-HNa₂PO₃, 0.01% 소 혈청 알부민 및 0.01% 트리톤™ X-100의 최종 농도를 제공하도록 제조하였다. 최종 효소 농도는 3 nM (96 웰 분석 포맷에서), 또는 3.24 nM (384 웰 분석 포맷에서)이었다. 검정 포맷 둘 다는 본질적으로 동등한 결과를 산출하였다.

시험할 화합물을 10점 농도 반응 곡선을 사용하여 순수 디메틸 술폭사이드 (DMSO)에 희석하였다. 반응 혼합물의 최대 화합물 농도는 30 μM이었다. 적절한 농도의 화합물을 30분 동안 OGA 효소로 미리 인큐베이션한 후, 기질을 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응을 실온에서 60분 동안 진행시켰다. 그 다음에, 반응을 정지시키지 않으면서, 형광을 판독하였다. IC₅₀ 값은 정규화된 데이터 대 화합물의 로그를 플로팅하고 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 데이터를 피팅함으로써 계산하였다.

실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기에 기재한 바와 같이 시험하였고 2.36 nM ± 0.786 (n=8)의 IC₅₀을 나타냈다. 이 데이터는 실시예 1의 화합물이 시험관내에서 OGA 효소 활성을 억제한다는 것을 입증한다.

OGA 효소 활성의 억제를 측정하기 위한 전세포 검정

세포 플레이팅:

관련 기술분야에 공지된 표준 조건을 이용하여, 미세소관 연관 단백질 타우의 P301S-1N4R 형태의 유도성 발현을 위해 변형된 TRex-293 세포를 10% 테트라시클린-미함유 태아 소 혈청 (FBS, 시그마(Sigma) F2442)이 보충된 DMEM 고 글루코스 (시그마 # D5796), 20 mM HEPES, 5 μg/mL 블라스티시딘 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) # A11139-03) 및 200 μg/mL 제오신 (라이프 테크놀로지스 # R250-01)으로 이루어진 성장 배지에서 생성시키고 유지하였다. 실험을 위해, 폴리 D-리신으로 코팅된 코닝(Corning) 바이오코트(Biocoat) (356663) 384 웰 플레이트에서 웰당 10,000-14,000개의 세포로 성장 배지에 플레이팅하고, 37℃/5% CO₂에서 세포 인큐베이터에서 20-24 시간 동안 인큐베이션하였다. 타우 발현의 유도 없이 실험을 수행하였다.

화합물 처리:

시험할 화합물을 10점 농도 반응 곡선을 사용하여 순수 DMSO 중에서 1/3으로 연속 희석하고 성장 배지에서 추가로 희석하였다. 플레이팅 후 20-24 시간에, 세포를 성장 배지 중 시험 화합물로 처리하고; 최대 화합물 농도는 15 μM (0.15% DMSO)이었다. 최대 억제는 15 uM 티아메트 G의 반복 측정에 의해 정의되며, 최소 억제는 0.15% DMSO 처리의 반복 측정에 의해 정의하였다. 세포를 37℃/5% CO₂에서 20-24 시간 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 화합물을 각각의 플레이트 내에서 이중으로 시험하였다.

면역염색:

화합물 처리 20-24 시간 후, 배지를 검정 플레이트로부터 제거하고 DPBS (시그마 #D8537) 중의 25 μL의 3.7% 포름알데히드 용액 (시그마 # F1635)을 각각의 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 세포를 DPBS로 1회 세척 한 다음에 0.1% 트리톤™ X-100 (시그마 # T9284)으로 투과화하였다. 30분 후, 세포를 DPBS로 2회 세척한 다음에 차단 용액 (1% BSA/DPBS/0.1% 트리톤™ X-100)을 각각의 웰에 첨가하고 60분 동안 인큐베이션하였다. 차단 용액을 제거하고 차단 용액 중 O-GlcNAc 단백질 항체 (RL2 클론, 써모(Thermo), MA1072)의 0.40-0.33 μg/mL 용액을 세포에 첨가하고 2-8℃에서 밤새 방치하였다. 다음날, 세포를 DPBS로 2회 세척하고 2차 항체, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-마우스 IgG (라이프 테크놀로지스 # A11001)를 DPBS 중 2 ug/mL로 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 90분 동안 방치하였다. 2차 항체를 제거하고, 세포를 DPBS로 2회 세척하고 DPBS 중의 DAPI (시그마 #D9564) 및 RNase (시그마, R6513)의 용액을 각각 1 및 50 ug/mL의 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 아큐멘(Acumen) eX3 hci (TTP 랩테크(Labtech)) 상에서 분석하였다. 상기에 기재한 모든 인큐베이션 및 세척 단계는 1차 항체를 제외하고, 실온에서 수행하였다.

분석 및 결과:

플레이트를 488 및 405 nm 여기 레이저 및 2개의 방출 필터 FL2 (500-530 nm) 및 FL1 (420-490 nm)을 사용하는 아큐멘 eX3 기기에서 분석하였다. FL2 필터는 O-GlcNAc 단백질 항체 (RL2 클론)에 상응하는 신호이고 FL1 필터는 세포 핵 (DAPI)에 상응하는 신호이다. 총 FL2/총 FL1 비 (대상 또는 집단 선택 없이 각각의 웰의 총 형광)를 데이터 분석에 사용하였다. 데이터는 티아메트 G의 15 μM 처리에 의해 참조된 바와 같은 최대 억제 및 0.15% DMSO 처리에 의해 달성된 바와 같은 최소 억제로 정규화하였다. 데이터는 비선형 곡선 피팅 적용 (4-파라미터 로지스틱 방정식)으로 피팅하고 IC₅₀ 값을 계산하고 보고하였다.

실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기에 기재한 바와 같이 시험하였고 21.9 nM ± 7.3 (n=5)의 IC₅₀을 나타냈다. 이 데이터는 실시예 1의 화합물이 세포 검정에서 OGA 효소 활성을 억제한다는 것을 입증한다.

Claims

하기 화학식의 화합물:

또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서, 위치 2에서의 메틸이 피페리딘 고리 상의 위치 4에서의 산소에 대해 시스 배위인 화합물 또는 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물이 N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드인 화합물 또는 염.
제3항에 있어서, N-[4-플루오로-5-[[(2S,4S)-2-메틸-4-[(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)메톡시]-1-피페리딜]메틸]티아졸-2-일]아세트아미드인 화합물.
제4항에 있어서, 화합물이 결정질인 화합물.
제5항에 있어서, 0.2도의 회절각에 대한 허용오차로 15.3°, 21.6°, 22.2°, 22.7°, 23.5°, 24.3°, 및 26.8°로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 피크와 조합된 12.1°의 회절각 2-세타에서의 X-선 분말 회절 스펙트럼의 피크를 특징으로 하는 화합물.
알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 방법.
경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는 방법.
진행성 핵상 마비의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 진행성 핵상 마비를 치료하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알츠하이머병의 치료에서 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 경도 인지 장애의 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 진행성 핵상 마비를 치료하는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법.