TW201836607A - 5－甲基－1,2,4－㗁二唑－3－基化合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種式I化合物：

Description

5－甲基－1,2,4－㗁二唑－3－基化合物

本發明係關於新穎5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基化合物、關於包含該等化合物之醫藥組合物、關於使用該等化合物治療生理失調之方法且關於用於合成該等化合物之中間體及方法。 本發明屬於治療阿茲海默症(Alzheimer's disease)、進行性核上麻痹(PSP)及其他包括統稱為tau蛋白病之tau介導的神經退化(tau-mediated neurodegeneration)的疾病及病症的領域。

阿茲海默症為影響全世界數百萬患者之破壞性神經退化性病症。鑒於市場上當前批准之藥劑僅向患者提供短暫的對症利益，所以在治療阿茲海默症中存在顯著未滿足之需要。 微管相關蛋白低聚合成諸如配對螺旋絲(paired helical filament，PHF)及直絲或絞撚絲之絲狀結構引起神經原纖維纏結(NFT)及神經纖維網線(NT)，此係阿茲海默症及其他tau蛋白病之定義性病理學特性中之一種。已發現患有阿茲海默症之個人之大腦中的NFT數目與疾病嚴重程度密切相關，這表明tau在神經元功能障礙及神經退化中具有關鍵作用(Nelson 等人,J Neuropathol Exp Neurol. ,71 (5), 362-381(2012))。已顯示tau病理與PSP中之疾病持續時間相關；患有更多種侵襲性疾病病程的情況比患有更慢發展的情況具有更高的tau負擔。(Williams 等人，Brain ,130 , 1566-76 (2007))。 近期的研究(Yuzwa 等人，Nat Chem Biol ,4 (8), 483-490 (2008))支持O-GlcNA 酶 (OGA)抑制劑對tau過磷酸化的限制及聚集至病理性tau中以用於治療阿茲海默症及相關tau介導的神經退化病症的治療潛能。特定言之，OGA抑制劑Thiamet-G已與減緩JNPL3 tau小鼠模型中之運動神經元損耗(Yuzwa 等人，Nat Chem Biol,8 , 393-399 (2012)) 且與減少Tg4510 tau小鼠模型中之tau病理及營養不良性神經突聯結(Graham 等人，Neuropharmacology ,79 , 307-313 (2014))聯結。因此，OGA抑制劑識別為用於減少諸如NFT及NT之過磷酸化且病理性形式之tau的聚積的有效治療方法。 美國專利案第9,120,781號揭示具有OGA抑制活性的六氫苯并唑及六氫苯并噻唑衍生物且進一步揭示其用於治療與OGA不足或過度表現及/或2-乙醯胺基-2-去氧-5ß-D-葡萄哌喃糖苷(O-GlcNAc) 聚積或不足有關之疾病及病症。另外，US2016/0031871揭示某些用於治療阿茲海默症之糖苷酶抑制劑。 需要作為大腦滲透劑之OGA抑制劑以提供對諸如阿茲海默症及PSP之tau介導的神經退化病症的治療。本發明提供某些作為OGA抑制劑之新穎化合物。

因此，本發明提供式I化合物：式I 或其醫藥學上可接受之鹽。 另外，本發明提供式Ia化合物：式Ia 或其醫藥學上可接受之鹽。 本發明亦提供一種用於治療需要該治療之患者的阿茲海默症之方法，其包含向患者投與有效量的式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽。 本發明進一步提供一種用於治療需要該治療之患者的輕度認知障礙發展為阿茲海默症之方法，其包含向患者投與有效量的式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽。 本發明亦提供一種用於治療需要該治療之患者的進行性核上麻痹之方法，其包含向患者投與有效量的式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明亦提供一種用於治療患者的tau介導的神經退化病症之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量的式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽。 此外，本發明提供式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽以用於治療法，尤其用於治療阿茲海默症或用於預防輕度認知障礙發展為阿茲海默症。另外，本發明提供式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽以用於治療進行性核上麻痹。本發明亦提供式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽以用於治療tau介導的神經退化病症。 甚至此外，本發明提供式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於製造供治療阿茲海默症用或供預防輕度認知障礙發展為阿茲海默症用之藥劑的用途。另外，本發明提供式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於製造供治療進行性核上麻痹之藥劑用的用途。本發明亦提供式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於製造供治療tau介導的神經退化病症之藥劑用的用途。 本發明進一步提供包含式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。本發明進一步提供一種用於製備醫藥組合物之方法，其包含摻合式I或Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦涵蓋用於合成式I及Ia化合物之新穎中間體及方法。

基於臨床表現及患者隨時間推移所展現的輕度認知障礙成為阿茲海默癡呆症之發展，輕度認知障礙已定義為潛在前驅期的與阿茲海默症有關之癡呆。術語「預防輕度認知障礙發展為阿茲海默症」包括抑制、減緩、遏止或逆轉患者的輕度認知障礙發展為阿茲海默症。 如本文所使用的術語「治療」或「以治療」包括抑制、減緩、遏止或逆轉現存症狀或病症之發展或嚴重程度。 如本文所使用的術語「患者」係指人類。 如本文所使用的術語「有效量」係指當向患者投與單或多劑量時在診斷或治療下提供患者的所需效應之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的量或劑量。 有效量可容易地由熟習此項技術者藉由使用已知技術且藉由在類似情況下獲得的觀測結果來確定。在確定用於患者之有效量中，考慮多種因素，其包括但不限於：患者之物種；其體型、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之涉及程度或嚴重程度；個體患者之反應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與之製劑的生物可用性特徵；所選擇之劑量方案；伴隨藥療之用途；及其他相關情況。 本發明之化合物通常在寬劑量範圍內有效。舉例而言，每日劑量通常在約0.1至約15 mg/kg體重範圍內。在一些情況下，低於前述範圍之下限值的劑量可完全足夠，同時在其他情況下，在可接受的副作用之情況下仍可採用較大劑量，且因此上文劑量範圍並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。 本發明之化合物較佳調配為以任何使得化合物具有生物可用性之途徑投與的醫藥組合物，該途徑包括口服及經皮途徑。最佳經口投與該等組合物。該等醫藥組合物及其製備方法在此項技術中眾所周知(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, 編者, 第22版, Pharmaceutical Press, 2012)。 式I及Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽特別適用於本發明之治療方法，但較佳為某些組態。以下段落描述該等較佳組態。應瞭解此等偏好可適用於治療方法及本發明之化合物。 本發明之化合物包括：式Ia式Ib式Ic式Id， 及其醫藥學上可接受之鹽。 其中哌啶環上之甲基及氧取代基呈順式或反式組態的式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽包括在本發明之範疇內，且較佳為順式組態。舉例而言，一般熟習此項技術者應瞭解位置2處之甲基相對於位置4處之氧呈順式組態，如下文流程A中所示：流程A 式Ia式Ic 另外，一般熟習此項技術者應瞭解位置2處之甲基相對於位置4處之氧呈反式組態，如下文流程B中所示：流程 B 式Ib式Id 更佳為其中哌啶環之位置2處之對掌性中心呈S-組態的化合物。儘管本發明涵蓋所有單獨的對映異構體及非對映異構體以及該等化合物之對映異構體的混合物，包括外消旋體，但特別較佳為具有如下文所闡述之絕對組態之化合物： N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺及其醫藥學上可接受之鹽；及 N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺均為特別佳。 尤其佳為結晶形式的N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺。更佳為此類結晶形式的N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺：其特徵在於X射線粉末繞射光譜中之12.1°繞射角2θ處之峰值與一或多個選自由15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°及26.8°組成之群之峰值之組合，且繞射角之公差為0.2度。 另外，單獨的異構體、對映異構體或非對映異構體可由一般熟習此項技術者在合成本發明之化合物中之任何適宜點，藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析之方法來分離或解析(參見例如 J. Jacques, 等人，「 Enantiomers, Racemates, and Resolutions 」 , John Wiley and Sons, Inc., 1981, 及E.L. Eliel及S.H. Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds 」, Wiley-Interscience, 1994)。 可例如藉由在此項技術中眾所周知之標準條件下，使本發明化合物的適當游離鹼與適當的醫藥學上可接受之酸在合適溶劑中反應，形成本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽。該等鹽之形成在此項技術中已眾所周知且瞭解。參見例如Gould, P.L., 「Salt selection for basic drugs」,International Journal of Pharmaceutics ,33 : 201-217 (1986)； Bastin, R.J., 等人，「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities」,Organic Process Research and Development ,4 : 427-435 (2000)；及Berge, S.M., 等人，「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences ,66 : 1-19, (1977)。 可藉由一般熟習此項技術者已知的各種程序來製備本發明之化合物或其鹽，其中一些在以下流程、製備方案及實例中加以說明。一般熟習此項技術者認識到，所描述之各途徑中之特定合成步驟可以不同方式組合或與不同流程之步驟結合以製備本發明之化合物或其鹽。以下流程中之各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法來回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。在以下流程中，除非另外指示，否則所有取代基均如先前所定義。試劑及起始材料可為一般熟習此項技術者容易獲得。在不限制本發明之範疇的情況下，提供以下流程、製備方案及實例以進一步說明本發明。另外，一般熟習此項技術者瞭解到，式Ia、Ib、Ic及Id化合物可藉由使用可由熟習此項技術者製備之具有對應立體化學組態之起始物質來製備。舉例而言，以下流程利用具有與式Ia最終對應之組態之起始材料。 一般而言，式Ia化合物可由式II化合物來製備(流程1)。更特定言之，在存在諸如三乙醯氧基硼氫化鈉之合適還原劑的情況下在適合溶劑中用N-(4-氟-5-甲醯基噻唑-2-基)乙醯胺來還原性地烷基化式IIa化合物以得到適合溶劑中之式Ia化合物，諸如乙酸乙酯。N-(4-氟-5-甲醯基噻唑-2-基)乙醯胺可藉由化學技術中已知之方法以及以下製備方案及實例中所提供之方法來製備。 式IIa化合物可由式IIIa化合物來製備，在式IIIa化合物中，Pg為合適的胺保護基。更特定言之，使其中Pg為羧酸第三丁酯(t-BOC)之式IIa化合物與諸如鹽酸或三氟乙酸之酸在諸如二噁烷或二氯甲烷之適合溶劑中反應以得到式IIa化合物。合適的胺保護基在化學技術中已知且包括t-BOC及Cbz以及論述於T. W. Green, P. G. M. Wuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」 Wiley-Interscience, New York, 1999中之彼等者。流程 1 其中Pg為合適的胺保護基之式IIIa化合物可由式IVa化合物來製備(流程2)。更特定言之，在存在諸如第三丁醇鈉之鹼的情況下使其中Pg為羧酸第三丁酯之式IVa化合物與3-(氯甲基)-5-甲基-1,2,4-㗁二唑反應以得到式IIIa化合物。反應宜在諸如乙腈或二甲基甲醯胺之溶劑中進行。其中pg為羧酸第三丁酯之式IVa化合物可基本上如WO 2004/094380 A1中所描述來製備。更特定言之，使式Va化合物與諸如三(第二丁基)硼氫化鋰之還原劑在諸如四氫呋喃之溶劑中反應以得到其中pg為羧酸第三丁酯的式IVa化合物。其中pg為合適的胺保護基之式Va化合物可藉由化學技術中已知之方法來製備，包括彼等描述於WO 2004/094380 A1中之方法。流程 2 製備方案 1 合成N-(4-氟-5-甲醯基-噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯。將氟化銫(227 g，1480 mmol)添加至N-(4-氯-5-甲醯基-噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯溶液(38.8 g，148 mmol)中以用於在室溫下在DMSO(776 mL)中製備N-(4-氯-5-甲醯基-噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯，參見例如N. Masuda, 等人，Bioorg Med Chem ,12 , 6171-6182 (2004))。在133℃內部溫度情況下在145℃加熱組中攪拌反應混合物48小時，隨後在冰-水浴中冷卻混合物。向混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液(500 mL)、鹽水(500 mL)及乙酸乙酯(500 mL)。在室溫下攪拌混合物10分鐘，隨後經由矽藻土過濾，用乙酸乙酯(500 ml)洗滌。將濾液轉移至分液漏斗中且分離各層，隨後用乙酸乙酯(1 L)萃取水層。用鹽水(1 L)洗滌合併之有機物，隨後用乙酸乙酯(300 mL)萃取鹽水層。使合併之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到殘餘物。使殘餘物通過矽膠墊(330 g)，用二氯甲烷(1.5 L)中之5%乙酸乙酯溶離，且濃縮濾液，得到殘餘物(24.2 g)。 將殘餘物(32.7 g合併批料，133 mmol)溶解於異丙醇(303 mL)中，過濾且接著藉由SFC(超臨界流體層析法)使用IC管柱(纖維素多醣衍生物：三(3,5-二氯苯基胺基甲酸酯)，30×250 mm，5u)且以180 毫升/分鐘注入3 mL 10% IPA(無添加劑)來純化。濃縮含產物溶離份，得到標題化合物(16.1 g)。MS m/z 247.0 (M+H)。製備方案 2 合成N-(4-氟-5-甲醯基-噻唑-2-基)乙醯胺(方法A)在夾套容器中，在室溫下將溴化鋅(91.9 g，408 mmol)一次全量加至N-(4-氟-5-甲醯基-噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯(33.5 g，136 mmol)與二氯甲烷(503 mL)的混合物中。在37℃內部溫度下攪拌反應混合物一夜，隨後將夾套溫度設定成-10℃且以15分鐘時間逐滴添加四氫呋喃(111 mL)，保持內部溫度低於6℃。隨後將夾套溫度設定成-30℃且以5分鐘時間逐滴添加吡啶(110 mL，1360 mmol)，保持內部溫度低於5℃。將夾套溫度設定成0℃且以5分鐘時間逐滴添加乙酸酐(116 mL，1220 mmol)。在37℃內部溫度下攪拌反應混合物一夜，隨後冷卻至室溫且通過矽藻土短墊，用四氫呋喃(500 mL)溶離。將濾液轉移至燒瓶中且濃縮混合物，得到從甲苯(50 mL)中濃縮的殘餘物。向殘餘物中添加含單水合檸檬酸(57.2 g，272 mmol)之水(400 mL)溶液及2-甲基四氫呋喃(400 mL)，且在40℃下攪拌混合物5分鐘，隨後通過矽藻土短墊，用2-甲基四氫呋喃(100 mL)溶離。將濾液轉移至分液漏斗且分離各層。用2-甲基四氫呋喃(2×250 mL)萃取水層且用水(500 ml)稀釋合併之有機物。以5分鐘時間向混合物中分批添加碳酸氫鈉固體，且攪拌直至氣體停止逸出。將混合物轉移至分液漏斗中且分離各層，隨後用2-甲基四氫呋喃(200 mL及100 mL)萃取水層。使合併之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到的殘餘物使用2-甲基四氫呋喃(100 ml)稀釋，且使混合物通過矽膠短墊(250 g)，用2-甲基四氫呋喃(2.5 L)溶離。濃縮濾液，得到之殘餘物懸浮於二氯甲烷與庚烷的1:1混合物(202 mL)中。在室溫下攪拌混合物30分鐘且接著過濾。濾出之固體在真空在40℃下乾燥2小時，得到標題化合物(18.0 g，70%)。MS m/z 189.0(M+H)。替代合成 N-(4- 氟 -5- 甲醯基 - 噻唑 -2- 基 ) 乙醯胺 ( 方法 B) 。 將二氯甲烷(1325 g，15.6 mol)添加至2-氨基-4-氯噻唑-5-甲醛(100 g，0.61 mol)及吡啶(194.6 g，2.46 mol)中，且冷卻至0-5℃。逐滴添加乙酸酐(188.4 g，1.85 mol)，保持溫度在0-5℃。完成添加之後，將溫度調節至20-25℃且攪拌41小時。在減壓下濃縮，隨後添加35%水性HCl(200 mL)及水(1.5 L)，保持溫度低於40℃。冷卻至20-25℃且攪拌18小時。過濾混合物且用水洗滌所收集之固體。在60-65℃下乾燥固體24小時，得到N-(4-氯-5-甲醯基噻唑-2-基)乙醯胺(75 g，0.4 mol)。 在惰性氛圍下將環丁碸(1000 ml)添加至N-(4-氯-5-甲醯基噻唑-2-基)乙醯胺(50 g，0.244 mol，即在上文所製備)、氯化四甲銨(107.1 g，0.977 mol)及氟化銫(370.6 g，2.44 mmol)中。加熱至130℃且攪拌23小時。HPLC分析顯示75%轉化率及標題化合物45%原位產率。替代合成 N-(4- 氟 -5- 甲醯基 - 噻唑 -2- 基 ) 乙醯胺 ( 方法 C) 。 將2-丙醇(150 mL)添加至氟化四甲基氟化銨四水合物(10.2 g，109.0 mmol)中且在真空下將混合物濃縮至2-3體積且保持內部溫度在70℃以移除水。添加2-丙醇(200 mL)且在真空下將混合物濃縮至2-3體積。再重複兩次。添加DMF(200mL)且在真空下濃縮至2-3體積。添加THF(200 mL)且濃縮至2-3體積。再重複兩次。裝料N-(4-氯-5-甲醯基噻唑-2-基)乙醯胺(1.22 g，5.96 mmol，上文方法B中所製備)及DMF(12 ml)。加熱至110℃且攪拌12 h。將反應混合物冷卻至25℃。添加2-甲基四氫呋喃(40 mL)及水(40 mL)。分離各層且用2-甲基四氫呋喃(40 mL)萃取水層。分離各層且用水(20 ml)洗滌合併之有機層。分離各層且濃縮有機層。添加乙酸乙酯(20 mL)及水(5 ml)。分離各層且濃縮有機層以移除溶劑。添加乙酸乙酯(2 mL)及庚烷(2 mL)且過濾。在真空在55℃下乾燥經過濾之固體18小時，得到標題化合物作為具有N-(4-氯-5-甲醯基噻唑-2-基)乙醯胺的93%混合物。製備方案 3 合成(2S,4S)-4-羥基-2-甲基-哌啶-1-羧酸第三丁酯。向燒瓶中添加(2S)-2-甲基-4-側氧基-哌啶-1-羧酸第三丁酯(50 g，234.44 mmol)及四氫呋喃(500 mL)。在氮氣氛圍下將混合物冷卻至-65℃且以45分鐘時間逐滴添加三(第二丁基)硼氫化鋰(304.77 mL，304.77 mmol；在四氫呋喃中為1 M)，保持內部溫度低於-60℃。在室溫下攪拌反應混合物1小時，隨後冷卻至-30℃。向反應混合物中添加水(25.34 mL)與四氫呋喃(100.16 mL)的混合物，保持內部溫度低於-20℃。以1小時時間逐滴添加水(126.70 mL)中之過氧化氫水溶液(118.88 mL，1.17 mol，30 wt/wt%)，保持內部溫度低於10℃。向混合物中添加氯化氫水溶液(46.89 mL，234.44 mmol，5 M)及甲基第三丁基醚(1.00 L)，且將混合物升溫至室溫。分離各層且在室溫下用水(500 mL)中之偏亞硫酸氫鈉溶液(222.84 g，1.17 mol)攪拌有機相10分鐘。分離各層且使有機相經硫酸鎂乾燥且濃縮。藉由急驟層析法(0-50%甲基第三丁基醚/異己烷，矽膠)來純化殘餘物，且合併並濃縮含產物溶離份，得到標題化合物(40.4 g，78%)。ES/MS (m/e) 238 (M+Na)。替代合成 (2S,4S)-4- 羥基 -2- 甲基 - 哌啶 -1- 羧酸第三丁酯。 在20℃下向含有去離子水(460 L)及磷酸二氫鉀(6.5 kg，0.41當量)的玻璃襯反應器中裝料DMSO(27.4 kg，1.0 vol)及D-(+)-葡萄糖單水合物(28.9 kg，1.25當量)。將內部溫度調節至30℃且藉由添加水性氫氧化鈉(8%，15 L，0.28當量)將反應的pH調節至6.9。使反應器裝料有(2S)-2-甲基-4-側氧基-哌啶-1-羧酸第三丁酯(24.9 kg，1.0當量(99.1%ee))，且在30℃下攪動混合物15 min。將酮還原酶(KRED-130，250 g，1% w/w)、葡萄糖去氫酶(GDH-101，250 g，1% w/w)及NADP鈉鹽(63 g，0.25% w/w)經由開放口直接裝料至反應混合物中。將混合物保持在30℃溫度且經由添加8%水性NaHCO₃ 保持在7.0±0.2 pH下。攪拌16.5小時之後(99.5 %轉化率)，使反應裝料有Celite™ (12.5 kg，50 w/w%)及甲苯(125 L，5 vol)。在30℃下攪拌30 min之後，經由串聯式GAF過濾器(4罩)經歷1 h時間段將混合物轉移至另一個2000 L反應器中。使混合物靜置30 min而不攪拌，分離各層，且用甲苯(2×125 L)反萃取水層。過濾(串聯式GAF過濾器)合併有機層，且在25℃下用氯化鈉水溶液(25%，125 L，5 vol)洗滌甲苯混合物。使所得甲苯溶液共沸乾燥(部分真空，內部溫度＜60℃)成0.10 w/w%水且冷卻至20℃。在正氮氣壓力下經由濾筒過濾器使混合物濾出反應器至潔淨圓筒中。隨後將反應混合物自圓筒轉移至500 L玻璃襯容器中且在真空(＜60℃)下濃縮成56 L(2.25 vol)目標殘餘體積。在40℃下裝料正庚烷(169 kg，10 vol)，且使混合物接種有25 g (2S,4S)-4-羥基-2-甲基-哌啶-1-羧酸第三丁酯。用額外的正庚烷(25 L，1 vol)稀釋所得濃稠漿液且經歷4小時冷卻至16℃。經由離心分離產物，用正庚烷(每轉25 L；必要4次旋轉)洗滌，在30℃下在盤式乾燥器中乾燥11 h之後產生20.3 kg (81%；＞99.9% ee)。ES/MS (m/e) 238 (M+Na)。製備方案 4 合成(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-羧酸第三丁酯。在室溫下將3-(氯甲基)-5-甲基-1,2,4-㗁二唑(43.5 g，301 mmol)添加至乙腈(590 mL)中之(2S,4S)-4-羥基-2-甲基-哌啶-1-羧酸第三丁酯溶液(29.5 g，137 mmol)中。在冰-水浴中攪拌反應混合物且逐份添加第三丁醇鈉(54.3 g，548 mmol)10分鐘，保持內部溫度低於10℃。在5℃內部溫度下在冰-水浴中攪拌反應混合物9小時，隨後緩慢地升溫至室溫且隔夜攪拌。在冰-水浴中冷卻反應混合物且以5分鐘時間添加飽和氯化銨水溶液(200 mL)，在添加期間保持內部溫度低於10℃。隨後用水(100 ml)稀釋混合物且升溫至室溫。用甲基第三丁基醚(2×300 mL)萃取混合物且用鹽水(300 mL)洗滌合併之有機物。使合併之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到殘餘物。使殘餘物快速通過矽膠墊(300 g)，用甲基第三丁基醚(1 L)溶離且濃縮濾液，得到標題化合物(46.5 g，109%)。MS m/z 334.0 (M+Na)。替代合成 (2S,4S)-2- 甲基 -4-[(5- 甲基 -1,2,4- 㗁二唑 -3- 基 ) 甲氧基 ] 哌啶 -1- 羧酸第三丁酯 。 在氮氣在0℃下向N,N-二甲基甲醯胺(3 mL)中之(2S,4S)-4-羥基-2-甲基-哌啶-1-羧酸第三丁酯(0.25 g，1.16 mmol)與3-(氯甲基)-5-甲基-1,2,4-㗁二唑(0.308 g，2.32 mmol)溶液中，以5分鐘時間逐份添加第三丁醇鈉(0.35 g，3.5 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物10 min，且隨後在40℃下攪拌12 h。使反應混合物冷卻至室溫，隨後用水(10 mL)驟冷。分離各層且用甲基第三丁基醚(2×10 mL)萃取水相。使合併之有機萃取物經氯化鋰(5%)水溶液洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到棕色油狀標題化合物(0.49 g，0.7 mmol，81%產率，60%純度)。MS m/z 334.0 (M+Na)。製備方案 5 合成5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-㗁二唑鹽酸鹽將含有(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-羧酸第三丁酯(4.03 g，12.9 mmol)的燒瓶浸入冰-水浴中。以5分鐘時間，向此燒瓶中逐滴攪拌添加4 M 1,4-二噁烷(25.9 mL，104 mmol)之鹽酸溶液，在添加期間保持內部溫度低於20℃。在室溫下攪拌反應混合物1小時，隨後濃縮，得到標題化合物(3.56 g，基於藉由¹ H NMR所量測之83%純度之92%產率)。MS m/z 212.0 (M+H)。替代合成 5- 甲基 -3-[[(2S,4S)-2- 甲基 -4- 哌啶基 ] 氧基甲基 ]-1,2,4- 㗁二唑鹽酸鹽。 將甲醇(50 mL)添加至(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-羧酸第三丁酯(12.9 g，0.041 mol)中。使混合物冷卻至0℃。將甲醇(80 mL)中之4 M鹽酸溶液逐滴添加至經冷卻之混合物中，保持內部溫度低於20℃。隨後在室溫下攪拌反應混合物18小時。隨後濃縮混合物以移除溶劑。添加丙酮(10 mL)且攪拌混合物20 min。添加四氫呋喃(40 mL)且攪拌混合物3小時。在氮氣下藉由過濾來收集固體且用四氫呋喃沖洗經過濾之固體餅。隨後在真空在45℃下乾燥經過濾之固體2小時，得到90%純度之標題化合物。使用丙酮進行再結晶可將標題化合物之純度提高至95%。製備方案 6 合成5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-㗁二唑。在氮氣下向二氯甲烷(10 mL)中之(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-羧酸第三丁酯(0.49 g，1.6 mmol)溶液中添加三氟乙酸(1.8 mL，23 mmol)。在室溫下攪拌混合物3 h。在減壓下濃縮混合物，得到黃色油。將殘餘物溶解於甲醇(5 mL)中且傾倒至陽離子交換濾筒上，用甲醇(2×10 mL)溶離，隨後用甲醇(10 mL)中之2 M氨溶液溶離。在減壓下濃縮濾液，得到標題化合物(0.3 g，1.4 mmol，91%)。MS m/z 212.0 (M+H)。實例 1 合成N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺。在室溫下將N-(4-氟-5-甲醯基-噻唑-2-基)乙醯胺(28.3 g，150 mmol)添加至乙酸乙酯(707 mL)中之5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-㗁二唑鹽酸鹽(48.7 g，185 mmol，94%純度)中。在室溫下攪拌反應混合物且以1分鐘時間逐滴添加N,N-二異丙基乙胺(34.1 mL，195 mmol)，隨後一次性添加三乙醯氧基硼氫化鈉(98.5 g，451 mmol)。在31℃加熱組中攪拌反應混合物一夜且內部溫度為30℃，隨後在冰-水浴中冷卻至內部溫度為5℃。以15分鐘時間，向混合物中添加2 M鹽酸水溶液(226 mL)，保持內部溫度低於10℃。向混合物中添加水(250 mL)且在室溫下攪拌混合物5分鐘。分離各層且用水(50 mL)中之2 M鹽酸水溶液(28 mL)的混合物萃取有機層。在冰-水浴中攪拌第一水層且以10分鐘時間逐滴添加50%氫氧化鈉水溶液(25.7 mL)，保持內部溫度低於10℃。用飽和碳酸氫鈉水溶液(100 ml)稀釋混合物，隨後在室溫下攪拌10分鐘且接著用乙酸乙酯(3×400 mL)萃取。使合併之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到殘餘物。使由用鹽酸水溶液萃取的第二水層經2-甲基四氫呋喃(200 mL)稀釋且使混合物通過矽藻土短墊。將濾液轉移至分液漏斗且分離各層。在冰-水浴中攪拌水層且以5分鐘時間逐滴添加50%氫氧化鈉水溶液(3.15 mL)，保持內部溫度低於10℃。用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)稀釋混合物，隨後在室溫下攪拌5分鐘且接著用乙酸乙酯(3×40 mL)及乙酸乙酯(100 ml)中之10%異丙醇萃取。使合併之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到與來自處理的第一部分之殘餘物合併之殘餘物。使合併之殘餘物通過矽膠墊(350 g)，用乙酸乙酯(3.5 L)溶離且濃縮濾液，得到殘餘物(45.8 g)。 藉由急驟層析法來純化殘餘物(47.5 g合併批料，123.9 mmol)，用庚烷中之50-100%乙酸乙酯溶離。使含產物溶離份濃縮成殘餘物，其懸浮於甲基-第三丁基醚與庚烷的1:1混合物(448 mL)中。在45℃內部溫度下在46℃加熱組中攪拌混合物30分鐘，隨後經歷2小時伴以攪拌冷卻至室溫。過濾混合物，用甲基-第三丁基醚與庚烷的1:1混合物(30 mL)洗滌固體。在真空在40℃下隔夜乾燥經過濾之固體，得到標題化合物(28.5 g)。MS m/z 384.0 (M+H)； [a]_D ²⁰ =+33.4°(C=0.26，甲醇)。替代合成 N-[4- 氟 -5-[[(2S,4S)-2- 甲基 -4-[(5- 甲基 -1,2,4- 㗁二唑 -3- 基 ) 甲氧基 ]-1- 哌啶基 ] 甲基 ] 噻唑 -2- 基 ] 乙醯胺。 在氮氣下向二氯甲烷(10 mL)中之N-(4-氟-5-甲醯基-噻唑-2-基)乙醯胺(0.05 g，0.28 mmol)與5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-㗁二唑(0.04 g，0.19 mmol)之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(0.1 mL，0.57 mmol)及三乙醯氧基硼氫化鈉(0.12 g，0.57 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物12 h。將混合物倒入飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)中。分離各層且用二氯甲烷(2×10 mL)萃取水相。使合併之有機萃取物經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到橙色油。 將殘餘物溶解於甲醇中(至總容積為9.8 ml)，過濾且藉由製備型HPLC(Phenomenex Gemini-NX 10微米50*150 mm C-18) (CH₃ CN及水，且用氫氧化銨使10 mM碳酸氫銨調節至pH 9，以110 ml/min經歷10 min使得15%至100%CH₃ CN) (1次注入) (271/204 nm)來純化，得到標題化合物(0.02 g，0.05 mmol，28%)。MS m/z 384.2 (M+H)。實例 1A 結晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺。 在46℃下在庚烷中之448 mL 50%甲基第三丁基醚中懸浮粗製N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺(29.9 g) 30分鐘。攪拌混合物且在過濾之前經歷2小時冷卻至19℃，隨後清洗庚烷中之30 mL 50%甲基第三丁基醚，得到標題化合物(28.5 g，95%產率)。X 射線粉末繞射 (XRPD) 實例 1A 在配備有CuKa源(λ=1.54060 Å)及Vantec偵檢器且在35 kV及50 mA下操作的Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之XRPD圖。在2θ中之4與40°之間掃描樣品，且2θ中之步長為0.0087°且掃描速率為0.5秒/步，且發散度為0.6 mm，固定抗散射為5.28 mm，且偵檢器狹縫為9.5 mm。將乾燥粉末裝填於石英樣品固持器上，且使用玻璃載片獲得光滑表面。結晶學技術中已眾所周知，對於任何給定結晶形式，由於由諸如晶體形態及習性之因素所產生之擇優取向，所以繞射峰值之相對強度可變化。在擇優取向之效應存在的情況下，峰值強度變更，但多晶型物之特徵峰值位置不變。(參見例如U.S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35，第941章，藉由X射線粉末繞射(XRPD)之結晶及部分結晶固體之特徵化，官方，2015年5月1日)。此外，結晶學技術中亦已眾所周知，對於任何給定結晶形式，角峰值位置可略微變化。舉例而言，峰值位置可能由於分析樣品時之溫度或濕度變化、樣品置換或內標存在或不存在而發生偏移。在本發明之情況下，2θ中之±0.2之峰值位置可變性將考慮此等潛在變化而不妨礙明確識別指定結晶形式。結晶形式之確認可基於區別性峰值(以°2θ為單位)、通常為更主要之峰值之任何獨特組合來進行。在周圍溫度及相對濕度下所收集之結晶形式繞射圖基於8.85及26.77度2θ之NIST 675標準峰值來調節。 結晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺的製備樣品之特徵在於如下表1中所描述之使用CuKa輻射作為具有繞射峰值(2θ值)的XRPD圖。特定言之，圖含有與一或多個選自由15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°及26.8°組成之群的峰值組合之12.1°處的峰且繞射角之公差為0.2度。 表1：結晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺之X射線粉末繞射峰值，實例1A。 活體外人類 OGA 酶分析 產生 OGA 蛋白 將核苷酸序列編碼之全長人體O-GlcNAc-β-N- 乙醯葡萄糖胺苷酶 (NM_012215)嵌入具有N封端之聚組胺酸(HIS)標記之pFastBac1(Invitrogen)載體中。桿狀病毒產生根據Bac-to-Bac桿狀病毒表現系統(Invitrogen)方案來進行。使用每升培養物10 mLP1 病毒使Sf9細胞以1.5×10⁶ 個細胞/毫升經受感染且在28℃下培育48小時。短暫離心細胞，用PBS沖洗且在-80℃下儲存離心塊。 如下純化上文OGA蛋白(His-OGA)：在4℃下將4 L細胞溶解於含有50 mM pH為8.0的Tris、300 mM NaCl、10%甘油、10 mM咪唑、1 mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.1% Triton^TM X-100、4片蛋白酶抑制劑(完全不含EDTA，Roche)之200 mL緩衝液中45 min。隨後在4℃下使此細胞溶解產物以16500 rpm自旋40 min，且在4℃下使上澄液與6 mL Ni-NTA樹脂(鎳-氮基三乙酸)一起培育2小時。 隨後將樹脂裝填至管柱上且用50 mM pH為8.0之Tris、300 mM NaCl、10%甘油、10 mM咪唑、0.1% Triton^TM X-100、1 mM DTT洗滌，隨後用50 mM pH為8.0之Tris、150 mM NaCl、10 mM咪唑、10%甘油、1 mM DTT洗滌。用50 mM pH為8.0之Tris、150 mM NaCl、300 mM咪唑、10%甘油、1 mM DTT溶離蛋白。將混合的含His-OGA之溶離份濃縮至6 ml且加載至Superdex75 (16/60)上。用50 mM pH為8.0之Tris、150 mM NaCl、10%甘油、2 mM DTT溶離蛋白。混合含His-OGA之溶離份且用BCA(布萊德福比色分析(Bradford Colorimetric Assay))量測蛋白濃度。OGA 酶分析 OGA酶催化自核質蛋白移除O-GlcNAc 。為量測此活性，使用螢光素二-N-乙醯基-β-N-乙醯基-D-葡萄胺糖苷(FD-GlcNAc , Kim, Eun Ju; Kang, Dae Ook; Love, Dona C.; Hanover, John A.Carbohydrate Research (2006), 341(8), 971-982)作為受質，最終濃度為10 μM(在96孔分析格式中)或6.7 μM(在384孔分析格式中)。此螢光受質在由OGA裂解後具有螢光，從而可藉由在535 nm處偵測(在485 nm處激發)之螢光增加來量測酶活性。 製備分析緩衝液，得到最終濃度為50 mM H₂ NaPO₃ -HNa₂ PO₃ 、0.01%牛血清白蛋白及0.01% Triton^TM X-100於水中，pH7。最終酶濃度為3 nM(在96孔分析格式中)或3.24 nM(在384孔分析格式中)。兩種分析格式均產生基本上等效的結果。 使用十點濃度反應曲線將待測試之化合物稀釋於純二甲亞碸(DMSO)中。反應混合物中之最大化合物濃度為30 µM。使在適當的濃度下的化合物與OGA酶一起預培育30分鐘，隨後藉由添加受質開始反應。在室溫下使反應進行60分鐘。接著，在不停止反應的情況下，讀取螢光。藉由對化合物之標準化資料對對數繪圖且使用四參數邏輯方程式擬合資料來計算IC₅₀ 值。 基本上如上文所描述測試實例1之化合物且IC₅₀ 展現為2.36 nM±0.786(n=8)。此資料證實實例1之化合物抑制活體外OGA酶活性。用於量測對 OGA 酶活性之抑制的全細胞分析 細胞接種 ： 利用此項技術中已知之標準條件，生成經修飾用於誘導性表現P301S-1N4R形式的微管相關蛋白tau之TRex-293細胞且保持在生長培養基中，該生長培養基由DMEM高葡萄糖(Sigma編號D5796)組成，補充有10%不含四環素之胎牛血清(FBS，Sigma F2442)、20 mM HEPES、5 µg/mL殺稻瘟菌素(Life Technologies編號A11139-03)及200 µg/mL吉歐黴素(Life Technologies編號R250-01)。對於實驗，將細胞以每孔10,000-14,000個細胞接種在塗佈有聚-D-離胺酸之Corning Biocoat(356663)384孔盤中的生長培養基中，且在37℃/5% CO₂ 下在細胞培育箱中培育20-24 h。在不誘導Tau表現的情況下進行實驗。化合物處理： 使用十點濃度反應曲線使待測試之化合物在純DMSO中連續稀釋1/3且在生長培養基中進一步稀釋。接種之後20-24 h，在生長培養基中用測試化合物處理細胞；最大化合物濃度為15 µM(0.15%DMSO)。最高抑制由15 µM Thiamet G之重複量測結果來界定且最低抑制由0.15%DMSO處理之重複量測結果來界定。使細胞返回至在37℃/5% CO₂ 下之培育箱中維持20-24小時。在各盤內一式兩份測試化合物。免疫染色 ： 20-24小時化合物處理之後，將培養基自分析盤移除且將含25 μL 3.7%甲醛溶液(Sigma編號F1635)之DPBS(Sigma編號D8537)添加至各孔中且培育30分鐘。接著用DPBS洗滌細胞一次，且接著用0.1% Triton^TM X-100 (Sigma編號T9284)透化。30分鐘之後，用DPBS洗滌細胞兩次且接著將阻斷溶液(1% BSA/DPBS/0.1% Triton^TM X-100)添加至各孔中且培育60分鐘。移除阻斷溶液且將0.40-0.33 μg/mLO-GlcNAc 蛋白抗體(RL2純系，Thermo，MA1072)於阻斷溶液中之溶液添加至細胞中且使其在2-8℃下靜置隔夜。次日，用DPBS洗滌細胞兩次且將含2 µg/mL二級抗體Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(Life Technologies編號A11001)之DPBS添加至各孔中且使其在室溫下靜置90分鐘。移除二級抗體，用DPBS洗滌細胞兩次且將DAPI (Sigma編號D9564)及RNA酶(Sigma，R6513)(濃度分別為1及50 µg/mL)於DPBS中之溶液添加至各孔中。密封盤，培育一小時且在Acumen eX3 hci (TTP Labtech)上分析。除了初級抗體以外，所有上文所描述之培育及洗滌步驟均在室溫下進行。分析及結果 ： 在使用488及405 nm激發雷射及兩個發射過濾器FL2(500-530 nm)及FL1(420-490 nm)之Acumen eX3儀器上分析盤。FL2過濾器為與O-GlcNAc 蛋白抗體(RL2純系)相對應之信號且FL1過濾器為與細胞核(DAPI)相對應之信號。總FL2/總FL1(各孔之總螢光而無對象或種群選擇)比率用於資料分析。使資料標準化成由15 µM處理Thiamet G標記之最高抑制及由0.15%DMSO處理達成之最低抑制。使資料擬合有非線性曲線擬合應用(4-參數對數等式)且計算並報告IC₅₀ 值。 基本上如上文所描述測試實例1之化合物且IC50展現為21.9 nM±7.3 (n=5)。此資料證實實例1之化合物抑制細胞分析中之OGA酶活性。

Claims (15)

1. 一種化合物，其具有下式：， 或其醫藥學上可接受之鹽。
2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中哌啶環上之位置2處之甲基相對於位置4處之氧呈順式組態：。
3. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物為N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺。
4. 如請求項3之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其為N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-㗁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙醯胺。
5. 如請求項4之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物為結晶。
6. 如請求項5之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其特徵在於X射線粉末繞射光譜中之12.1°繞射角2θ處之峰值與一或多個選自由15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°及26.8°組成之群之峰值之組合且繞射角之公差為0.2度。
7. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於療法中。
8. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療阿茲海默症。
9. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療輕度認知障礙成為阿茲海默症之發展。
10. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療進行性核上麻痹。
11. 一種如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療阿茲海默症用之藥劑。
12. 一種如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療輕度認知障礙成為阿茲海默症發展用之藥劑。
13. 一種如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療進行性核上麻痹用之藥劑。
14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
15. 一種製備醫藥組合物之方法，其包括摻和如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。