CZ306987B6 - 2,6-disubstituované puriny pro použití jako léčiva a farmaceutické přípravky je obsahující - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká 2,6-disubstitutovaných purinů obecného vzorce I, způsobů jejich přípravy, farmaceutických přípravků obsahujících tyto sloučeniny a jejich použití pro léčbu onemocnění, v jejichž patogenezi hraje klíčovou úlohu deregulace kináz z rodiny ROCK (Rho-asociované proteinkinázy), JAK (Janusovy kinázy) a JNK (c-Jun N-terminální kinázy). Přípravky obsahující tyto sloučeniny je možné použít zejména k léčení nemocí plic, oka, střev, kůže a nervového systému, pro která je typická abnormální migrace buněk, zánět nebo fíbróza.

Dosavadní stav techniky

Rho - ROCK dráha hraje klíčovou roli v organizaci aktinového cytoskeletu a tak reguluje řadu buněčných procesů včetně adheze, kontrakce, motility, proliferace a přežití (Amano, M. et al. 2010, Cytoskeleton Hoboken, N.J., 67(9), 545-54). Podílí se na hojení ran a metastazování nádorů. ROCK stabilizuje aktinový cytoskelet tím, že aktivuje LIM kinázy, které následně fosforylují kofilin. Fosforylace inhibuje jeho schopnost narušovat stabilitu aktinových vláken. Kontraktilita stresových vláken podobně jako kontraktilita aktino-myosinových vláken buněk hladké svaloviny závisí na fosforylaci lehkého řetězce myosinu (MLC). Taje katalyzována kinázou lehkých řetězců myosinu (MLCK), zpětnou reakci působí příslušná fosfatáza. Rho kinázy inaktivují tuto fosfatázu fosforylaci její podjednotky MYPT1 (myosin phosphatase - targeting subunit 1) na threoninech v pozicích 696 a 853. ROCK2 (stejně jako MLCK) přímo fosforyluje MLC na šeřinu v pozici 19, což způsobí zvýšení ATPázové aktivity. Regulace MLC Rho kinázou hraje roli také při dělení buňky. ROCK se váže na aktinomyosinový komplex kontraktilního prstence. Kromě Rho ji aktivuje též mitotická kináza PLK1. Další substráty ROCK, které hrají roli v organizaci aktinového cytoskeletu, jsou ezrin/radixin/moezin (ERM), CPI-17, calponin, adducin. Efekt ROCK na proliferaci a na buněčnou polaritu je zprostředkován fosforylaci PTEN.

Deregulovaná aktivita ROCK se podílí na patogenezi řady onemocnění včetně nádorových onemocnění, nemocí oka, kardiovaskulárního, dýchacího a nervového systému. Ovlivnění RhoROCK signalizace má terapeutický efekt v onemocněních osteoporóze a fíbrózách nejrůznější etiologie (Hollanders, K. et al. 2015, Invest Ophthal. Vis. Sci. (2), 1335-48). Přípravky působící tímto mechanismem jsou schváleny v Japonsku v terapii glaukomu (ripasudil) a cerebrálního vazospazmu při subarachnoidálním krvácení (fasudil). V klinickém hodnocení se testuje vliv na aterosklerózu a pulmonální hypertenzi. Farmakologická inhibice ROCK mj. reguluje přežití, aktivaci, kontrakci a migraci buněk. Schopnost ovlivnit kontrakci buněk hladkého svalu vysvětluje pozitivní efekt na krevní tlak a na spasmus dýchacích cest při astmatu a chronické pulmonámí obstrukční nemoci. Inhibice migrace v důsledku ovlivnění aktinového cytoskeletu se terapeuticky uplatňuje v rakovinách (inhibice neoangiogeneze a metastazování) fibrotických onemocněních různých systémů (systémové fibrózy typu sklerodermy, fibrózy např. jater, plic, ledvin) a etiologie (mj. idiopatická, chemoterapií a radioterapií indukovaná) ale i dalších nemocech, kde dochází k přestavbě tkáně, jako je astma a chronická obstrukční plicní nemoc. Kromě rakovin (včetně hepatocelulámího a plicního karcinomu, myelomu, melanomu, fibrózarkomu, karcinomu prsu, ledvin a prostaty) má inhibice ROCK dependentní přestavby aktinového cytoskeletu a následné migrace buněk pozitivních efekt i u dalších neovarkularizací jako je makulámí degenerace. ROCK inhibice má také příznivý efekt v modelech myelomu, některých leukémií a myeloproliferativních onemocnění.

V řadě onemocnění (např. retinální degenerace, diabetická retinopatie, odchlípení sítnice, neurotrauma, chronická obstrukční plicní nemoc, zánětlivá onemocnění střev, lupus, psoriázis) k příznivému efektu ROCK inhibitorů přispívá schopnost ovlivnit několika mechanismy zánětlivou reakci včetně neuroinflamace (inhibice NfkB, suprese exprese prozánětlivých cytokinů, inhibice

- 1 CZ 306987 B6 migrace imunitních buněk, maturace imunitních buněk) a fibrotizaci tkáně (regulace diferenciace fibroblastových prekurzorů, regulace přežití myofíbroblastů, regulace aktinového cytoskeletu migrujících fibroblastů a dalších buněk). ROCK kinázy se jeví jako bezpečný terapeutický cíl, přesto výhodné může být lokální podání, což je možné například u onemocnění kůže (korekce jizvení), oka (glaukom, makulámí degenerace - zde je možné uvažovat o medikovaných inzertech), plic (astma, chronické pulmonámí obstrukční nemoci.) a pooperační restenóze cév (medikované stenty). Také v případě onemocnění střev včetně těch s fíbrotickou složkou (Crohnova nemoc, ulcerativní kolitida) je výhodné omezit působení léčiv na místní tkáň.

Janusovy kinázy (JAK1, JAK2, JAK3) přenáší signály širokého spektra extracelulámích cytokinů (hormony, interleukiny a interferony), které se vážou na cytokinové receptory typu I a II. Patří mezi ně proinflamatomí IL-6, IL—12, IL-19, IL-20, IL—21, IL—22 a IL-23 spolu s interferony. Aktivované JAK kinázy pak fosforylují a aktivují transkripční faktory z STÁT rodiny (signál transducers and activators of transcription). TNF signalizace je také zprostředkována JAK-STAT drahou za určitých podmínek. Inhibice JAK-STAT dráhy má příznivý efekt na imunitní onemocnění jako je rheumatoidní arthritida, psoriatická arthritida, ankylosující spondylitida, colitida, ulcerativní colitida, Crohnova nemoc, psoriáza, lupus erythematosus, záněty povrchu oka, syndrom suchého oka, uveitida a alergická reakce. Brání také odmítnutí transplantátu (Ghoreschi et Gadina, 2015 doi: 10.1111/exd. 12265; O'Shea et al., 2013 10.1136/annrheumdis-2012-202576). Jednoznačnou výhodou nízkomolekulámích inhibitorů JAK ve srovnání s biologiky, která cílí na jednotlivé cytokiny nebo cytokinové receptory, je schopnost ovlivnit signalizaci řízenou několika cytokiny. Na rozdíl od protilátek také mohou být podávány perorálně. Lokální aplikace je ale také možná, s výhodou ji je možné použít např. u onemocnění oka, kůže a dýchacího traktu. Jako obzvláště zajímavá se jeví možnost využít JAK inhibici v terapii vitiliga a alopecia areata. Inhibice JAK také příznivě ovlivňuje fibrotická onemocnění včetně myelofibróz (jako je polycythemia vera, essentiální thrombocytosis a primární myelofibróza) a chemoterapií indukovaných fibróz. Probíhají klinické zkoušky testující JAK inhibitory v terapii nádorů žaludku, plic, pankreatu, jater, prsu, tlustého střeva, kolorekta a prostaty.

Zvýšená exprese nebo aktivita JNK kináz je spojována s neurologickými, srdečními, hepatobiliarními, dýchacími, fibrotickými, zánětlivými a autoimunitními onemocněními. JNK také hrají roli v patogenezi nádorových onemocnění. Nově bylo zjištěno, že dysregulace JNK hraje roli v proteinopatiích jako je amyotrofická laterální skleróza a frontotemporální demence. Zvýšená aktivita JNK kináz přispívá k patogenezi následujících onemocnění (Sabapatha et al., 2014 (doi: 10.1016/B978—0—12—396456—4.00013—4.), Reich et al., 2012 10.1136/annrheumdis-2011200412, a Gehringer et al., (2015) (doi: 10.1517/13543776.2015.1039984): neurologická onemocnění (Alzheimerova nemoc, frontotemporální demence, Parkinsonova nemoc, polyglutaminová onemocnění, Pickova nemoc, demence různé etiologie, iktus, nemoc (demence) s argyrofilními zrny (AgD), amyotrofická laterální skleróza), kardiovaskulární onemocnění (srdeční selhání, aneurysma abdominalní aorty), hepatobiliární onemocnění (chronická infekce HCV, akutní poškození jater, nealkoholická steatosa jater, fíbróza jater), zánětlivá onemocnění (zánětlivé onemocnění střev, ulcerativní kolitida, Crohnova nemoc, astma,rheumatoidní arthritida, lupus erythematosus, Behcetova nemoc, zánět po chirurgickém zákroku, uveitida, syndrom suchého oka), nádorová onemocnění (retinoblastom, nádory kolorekta, prsu a ovaria), metabolická onemocnění (obesita, diabetes 2. typu), fibrotická onemocnění (systémová fíbróza (scleroderma), fibrózy jater, plic a kůže) různé etiologie včetně chemoterapií indukované fibrózy.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu jsou 2,6-disubstitutované puriny obecného vzorce I

-2CZ 306987 B6

ω, ve kterém

A je -Z-(CH₂)-; Z je vybrán z NH, CH₂;

D a E jsou nezávisle vybrány z H a R2,

Rl je vybráno ze skupiny zahrnující

- heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

- heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkyl skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, a která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

- -G-R' kde G je vybráno ze skupiny-NH- a -N(C1-C8 alkyl), a

R' je vybráno ze skupiny zahrnující

- C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl, substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy a amino substituent, s výhodou jedním hydroxy a/nebo jedním amino substituentem;

- (dialkylamino)alkyl skupinu, kde alkyl je vybrán nezávisle ze skupiny zahrnující C1-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl;

- C3-C10 cykloalkyl, což znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 10 uhlíkových atomů, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;

- heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkyl je popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybra- j CZ 306987 B6 ným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

- heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, kteráje vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkyl alkyl skupina je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

- benzylová skupina, kteráje popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující fluoro, chloro, hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;

R2 může nebo nemusí být přítomen, a představuje jeden nebo více substituentů vázaných v libovolné poloze kruhu, nezávisle vybraných z =0, -OH, -C(O)-(CH2)p-O-(H nebo C1-C4 alkyl), kde p je celé číslo v rozmezí 0 až 4, hydroxy(Cl-C4)alkyl, -S(O)₂-aryl, -C(O)-aryl, ve kterém aryl je C6-C10 skupina obsahující alespoň jedno aromatické jádro, a s výhodou je arylem fenyl nebo nafityl;

arylalkyl je skupina obsahující C6-C10 skupinu obsahující alespoň jedno aromatické jádro a ClC4 alkylen, a s výhodou je arylalkylem benzyl;

heteroaryl je C5-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N, a s výhodou je heteroaryl vybrán ze skupiny zahrnující furan, thiofen, pyrrol, pyrrazol; heterocyklyl je C4-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N.

Vzorec I zahrnuje i farmaceuticky přijatelné soli látek nesoucích výše uvedené substituenty, zejména s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.

S výhodou je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl vybrán ze skupiny zahrnující propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, heptyl, oktyl, a nonyl.

Ve výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný hydroxy skupinou vybrán ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethyl, 2(RS, R nebo S)-hydroxypropyl, 3hydroxypropyl, 4-hydroxybut-2(RS, R, nebo S)—yl, 2-hydroxy-2-methylpropyl, 3-hydroxy-3methylbutyl, 2,3-dihydroxypropyl, l-hydroxy-3-methylbut-2-yl a (3RS)-2-hydroxypent-3-yl.

Ve výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný amino skupinou vybrán ze skupiny zahrnující 2-aminoethyl, 3-aminopropyl, 4-aminobutyl, 5-aminopentyl, 6-aminohexyl.

V dalším výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný amino a hydroxy skupinou 3-amino-2-hydroxypropyl.

S výhodou je (dialkylamino)alkyl skupina vybrána ze skupiny zahrnující (dimethylamino)methyl, 2-(dimethylamino)ethyl, 3-(dimethylamino)propyl, 3-(dimethylamino)butyl, (diethylamino)methyl, 2-(diethylamino)ethyl, 3-(diethylamino)propyl a 4-(diethylamino)butyl.

Ve výhodném provedení je C3-C10 cykloalkyl vybrán ze skupiny zahrnující cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl a cyklohexyl.

-4CZ 306987 B6

Ve výhodném provedení je C3-C10 cykloalkyl substituovaný amino skupinou vybrán ze skupiny zahrnující /raw.$’-4-aminocyklohexyl, c/s’-4-aminocyklohexyl, c«,/ra«s-4-aminocyklohexyl, czs-2-aminocyklohexyl, /raws-2-aminocyklohexyl, czsJraws-2-aminocyklohexyl, 3-aminocyklohexyl a cis, íra«s-4-hydroxycyklohexyl.

V dalším výhodném provedení je heterocykloalkyl vybrán ze skupiny zahrnující N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-l-yl, 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl.

Substituovaný benzyl je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující 2-methoxybenzyl, 3-methoxybenzyl, 4-methoxybenzyl, 3,5-dimethoxybenzyl, 2,6-dimethoxybenzyl, 2,4,6-trimethoxybenzyl,

3,4,5-trimethoxybenzyl, 2-fluorbenzyl, 3-fluorbenzyl, 4-fluorbenzyl, 2-chlorbenzyl, 3-chlorbenzyl a 4-chlorbenzyl.

Ve výhodném provedení je heterocykloalkyl alkyl vybrán ze skupiny zahrnující (aziridin-1yljethyl, (azetidin-l-yl)ethyl, (azolidin-l-yl)ethyl, (piperidin-1-yljethyl, (aziridin-l-yl)propyl, (azetidin-l-yl)propyl, (azolidin-l-yl)propyl a (piperidin-l-yl)propyl.

V případě, že sloučeniny podle předloženého vynálezu mají chirální centrum, vynález zahrnuje všechny opticky aktivní izomery, jejich směsi i racemáty. Tedy sloučeniny obecného vzorce I, nezávisle na (R) nebo (S) konfiguraci na chirálních centrech, jsou zahrnuty v tomto vynálezu.

2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I jsou vhodné pro použití jako léčiva. Týká se to zejména jejich použití v terapii onemocnění, kde inhibice jedné nebo více kináz vybraných z kinázových rodin ROCK (ROCK1, ROCK2), JAK (JAK1, JAK2, JAK3) a JNK (JNK1, JNK2, JNK3) vede k terapeutickému efektu.

Současná inhibice alespoň dvou kináz z rodin ROCK, JNK a JAK je zejména vhodná pro uplatnění v terapii fibróz, zánětlivých a neurodegenerativních onemocnění i nádorových onemocnění. Příslušné signální dráhy hrají roli ve výše zmíněných onemocněních, přičemž jsou v podstatě nezávislé. Jejich současná farmakologická inhibice má synergický efekt. Látky podle předkládaného vynálezu, které inhibují alespoň dvě z těchto drah, je možné podávat v nižších koncentracích než lék inhibující jen dráhu jednu.

Látky podle předkládaného vynálezu jsou inhibitory kináz z rodin ROCK, JAK a/nebo JNK, a tedy jsou zejména vhodné pro léčbu chorob vybraných ze skupiny zahrnující choroby dýchacího systému, kardiovaskulárního systému, oka, střev, kůže a nervového systému, jejichž patologie zahrnuje abnormální migraci buněk, zánět nebo fíbrózu, hepatobiliámích onemocnění, zánětlivých onemocnění, neovaskularizací, neurodegenerativních a metastatických nádorových onemocnění, onemocněních ve kterých hraje role vazokonstrikce nebo bronchokonstrikce.

Konkrétněji jsou látky podle předkládaného vynálezu vhodné pro léčbu systémové fibrózy, fibróz jednotlivých orgánů, zejména jater, ledvin, plic a kůže, myelofibrózy, fibrózy po rádio a chemoterapii, Crohnovy nemoci, kolitidy, ulcerativní kolitidy, Behcetovy nemoci, chronická obstrukční plicní nemoci, metastatického melanomu, zánětů po operačních výkonech, zánětu povrchu oka, uveitidy, retinitidy, makulámí degenerace, syndromu suchého oka, alergické rhinitis, alergického astmatu, astmatu bronchiale, sclerosis multiplex, systémové sklerózy, chronické infekce HCV, akutního poškození jater, nealkoholické steatohepatitis, rheumatoidní arthritidy, psoriatické arthritidy, ankylosní spondylitidy, psoriázy, lupus erythematosus, alopecia areata, viti liga, cerebrálního vazospazmu, amyotrofické laterální sklerózy, frontotemporální demence, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, polyglutaminových onemocnění, Pickovy nemoci, demencí, iktu, nemoci s argyrofilními zrny (AgD), srdečního selhání, aneurysmatu abdominalní aorty, retinoblastomu, nádorů kolorekta, prsu a ovaria, obesity, diabetů 2. typu, atherosclerosy, hypertenzní nemoci, pulmonamí hypertenze, erektilní dysfunkce, restenózy po vaskulámí nebo srdeční

-5CZ 306987 B6 chirurgii, benigní neoplasií, neovaskulámího glaukomu, diabetické retinopatie, okulámí neovaskularizace, diabetické nefropatie, hemorhagické teleangiektasie, prevenci rejekce transplantátu, korekci jizvení kůže.

Vynález také zahrnuje farmaceutické přípravky obsahující 2,6-disubstitutované puriny obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelné nosiče.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou deriváty obecného vzorce I, které nesou substituent Rl vybraný ze skupiny zahrnující: N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-lyl, 4-(2-hydroxethyl)piperazinyl, (R)-(2-hydroxymethylpyrrolidine-l-yl), (2-hydroxyethyljamino, (3-hydroxypropyl)amino, 2(R)-hydroxypropyl]amino, 2(S)-hydroxypropyl]amino, 4hydroxybut-2(Rj- yljamino, 4-hydroxybut-2(S)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(R,S)-yl]amino, 2(hydroxy-2-methyl)propyl]amino, (2,3-dihydroxypropyl)amino, (l-hydroxy-3-methylbutyljamino, [(R,S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(R)-(2~hydroxypent-3-yl)]amino, [(S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, (R)-[ l-isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (S)-[l-isopropyl-2-hydroxyethyljamino, (2-aminoethyl)amino, (3-aminopropyl)amino, (4-aminobutyl)amino, (5-aminopentyljamino, (6-aminohexyl)amino, [3-amino-2-hydroxypropyl]amino, [l-(dimethylamino)methyljamino, [2-(dimethylamino)ethyl]amino, [3-(dimethylamino)propyl]amino, [4-(dimethylamino)butyl]amino, [2-(diethylamino)ethyl]amino, [3-(diethylamino)propyl]amino, (aziridin-1yl)ethylamino, (azolidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (piperidin—1—yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)propylamino, cyklopropylamino, cyklobutylamino, cyklopentylamino, cyklohexylamino, (czs-2-aminocyklohexyl)amino, (ZraMs-2-aminocyklohexy Ijamino, (cis, trans-2-aminocyklohexyl)amino, (cis, /razzs-3-aminocyklohexyl)amino, (traws-4-am inocyklohexy Ijamino, (czs-A-aminocyklohexy Ijamino, (cis, řra«5-4-aminocyklohexyljamino, (czs-2-hydroxycyklohexyl)amino, (/raws-2-hydroxycyklohexyl)amino, (cis,trans2-hydroxycyklohexy Ijamino, (cis, Zrazz5-3-hydroxycyklohexy 1 jamino, (trans-4-hydroxycyklohexyljamino, (cz.s-4-hydroxycyklohexyl)amino, (czs,trazzs-4-hydroxycyklohexyl)amino, (2methoxybenzyljamino, (3-methoxybenzyl)amino, (4-methoxybenzyl)amino, (3,5-dimethoxybenzyljamino, (2,6-dimethoxybenzyl)amino, (3,4,5-trimethoxybenzyljamino, (2,4,6-trimethoxybenzyljamino, (2-fluorbenzyl)amino, (3-fluorbenzyl)amino, (4-fluorbenzyl)amino, (2-chlorbenzyljamino, (3-chlorbenzyl)amino, (4-chlorbenzyl)amino, (2,4-dichlorbenzyl)amino, (3,4,5— trichlorbenzyljamino.

Vhodné cesty pro aplikaci systémovou aplikaci jsou orální, inhalační, injekční (intravazální, intramuskulámí, subkutánní), bukální, sublinguální a nasální. Lokální podání je možné ve formě očních a ušních kapek a mastí, ve formě vaginálních přípravků a rektálních čípků. Pro terapii onemocnění skalpu a kůže jsou výhodou lékovou formou roztoky, krémy a masti. V případě onemocnění oka může být vhodnou formou podání intravitreální injekce nebo medikovaný inzert. V případě onemocnění plic pak inhalační lékové formy. Vhodnou formou prevence restenózy po cévní nebo srdeční chirurgii je medikovaný stent. V případě onemocnění gastrointestinálního traktuje výhodné perorální nebo rektální podání.

Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.

Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.

-6CZ 306987 B6

Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofílizací. Zmíněné roztoky nebo suspenze mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.

Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, beta-karotenu nebo

3,5-di-/erc-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich izomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, Labrafil M 2375 (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), Labrafil M 1944 CS (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), Labrasol (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo Miglyol 812 (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C₈ až Ci₂ od Hiils AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně.

Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampuli nebo lahviček a uzavíráním obalů.

Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.

Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktóza, sacharóza, mannitol nebo sorbitol, celulózové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát horečnatý a/nebo vápenatý, polyethylen glykol nebo jeho deriváty.

Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulózových preparátů jako acetylcelulózaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulózaftalát. Barviva nebo pig

-7CZ 306987 B6 menty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátoiy. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylen glykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.

Další formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10% nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce. Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafínové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy.

Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofílizátu společně s excipienty kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro infuzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbová či benzoová.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří zejména uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol, propylen glykol, sorbitol a/nebo polyethylen glykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafín, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo, s výhodou, hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo olej z podzemnice olejné, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a/nebo distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a/nebo aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou zejména mastné alkoholy, např. lauryl, cetyl nebo stearyl alkoholy, mastné kyseliny, například palmitová nebo stearová kyselina, kapalné a pevné vosky, například isopropyl myristát, lanolin nebo včelí vosk, a/nebo uhlovodíky, například vazelína (petrolátum) nebo parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. estery polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery (Tween), dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných

-8CZ 306987 B6 alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např.

polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.

Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.

Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako polyhalogenované alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N₂O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou používána aditiva tam zmíněná.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování, jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolu, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.

Tento vynález dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku a mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.

Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství, které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0,5 až 2 g.

Objasnění výkresů

Obrázek 1 ukazuje vliv látek na fosforylaci MLC2 v liniích A375 (a), A2058 (b) a HT1080 (c).

Intenzita signálu odpovídající MLC2 a pMLC2 (Thrl8/Serl9) na membráně po SDS-PAGE a imunoblotu byla hodnocena denzitometricky.

Obrázek 2 ukazuje vliv látek na stav aktinového cytoskeletu a morfologii buněk BJ. Aktin byl vizualizován pomocí falloidinu značeného FITC. Zvětšení lOx. Kontrolní buňky (a), s látkami 30 (b), 65 (c), 66 (d).

Látka 30 je 2-(2-hydroxyethylamino)-6-(l,4-dithia-8-azaspiro[4.5]dekan-8-yl)purin, a nepatří do rozsahu tohoto vynálezu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Vynález je popsán pomocí následujících příkladů, které ovšem nijak neomezují jeho rozsah.

-9CZ 306987 B6

Body tání byly stanoveny na Kofflerově bloku a nebyly korigovány. Všechny reagencie byly ze standardních komerčních zdrojů a analytické čistoty. Tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na hliníkových destičkách se silikagelem F254 od fy Měrek. Skvrny byly vizualizovány pod UV světlem (254 nm). Elementární analýzy (C, Η, N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo Finnigan). Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) byla prováděna na Beckman Gold systému. Vzorky jednotlivých látek byly pro HPLC analýzu rozpuštěny v methanolu a nastříknuty na kolonu LiChroCARD 250 x 4 mm s náplní Purospher RP-18e, 5 pm (Měrek) a eluovány isokraticky mobilní fází sestávající z methanolu (HPLC grade) a AcOH7AcONH4 pufru (pH = 3,4; 40 mM; s přídavkem 5 % (v/v) MeOH) ve vhodném poměru (v/v) při průtoku 0,5 ml/min, neni-li uvedeno jinak. Eluované látky byly detekovány UV detektorem při 200 až 300 nm. NMR spektra (σ ppm; J, Hz) byla měřena na přístroji Bruker Avance AV 300 při teplotě 300 K a frekvenci 300,13 MHz (1H), respektive 75,48 MHz (13C) nebo JEOL ECA-500 spektrometr pracující při frekvencích 500,16 MHz (*H) a 125,76 MHz (¹³C) při 25 °C za použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu. Hmotnostní spektra byla měřena za použití přímého nástřiku na Waters Micromass ZMD 2000 hmotovém spektrometru (con voltage 20 V), ionizace elektrosprejem. Vzorky pro MS měření byly rozpuštěny v methanolu okyseleném kyselinou mravenčí (5 kapek HCOOH / 100 ml methanolu). Jako stacionární fáze pro sloupcovou chromatografií sloužil silikagel PharmPrep 60 CC (40-63 pm) nebo silikagel Kieselgel 60 (zrnitost 230—400) (Měrek). Všechny sloučeniny vykázaly uspokojivé elementární analýzy (< 0,4 %).

Příklad 1 Syntéza 2-chlor-6-(azepan-l-yl)-9/7-purinu (62)

2,6-Dichlor-9//-purin (2 g, 10,582 mmol) byl refluxován s azepanem (1,154 g, 11,6402 mmol, 1,399 ml) a triethylaminem (EfyN, 4,283 g, 42,328 mmol, 5,9 ml) v 40 ml PrOH při teplotě 100 °C po dobu 4 hodin. Výsledná směs byla ochlazena na pokojovou teplotu, vznikl pevný produkt, který byl zfíltrován, intenzivně promyt ledovým PrOH a následně ledovou vodou a sušen v sušárně při 50 °C. Výtěžek reakce byl 2,0851 g látky 62, což odpovídá 78,28 % teoretického výtěžku. Syntéza látky 62 byla úspěšná, což se potvrdilo NMR spektrem. Bod tání byl stanoven na 248,3 - 249,1 °C. *H NMR (300 MHz, DMSO-í/₆) δ ppm: 1,45 (4H), 1,73 (4H), 3,31 (1H), 3,73 (2H), 4,285 (2H), 8,06 (1H), 13,07 (1H).

Příklad 2 Syntéza 2-(2-aminoethylamino)-6-(azepan-l-yI)-9/7-purinu (64)

2-Chlor-6-(azepan-l-vl)-9/7-purin (62) (0,5 g, 1,986 mmol) byl umístěn do tlakové zkumavky s ethandiaminem (4,464 g, 74,2764 mmol, 4,96 ml) po dobu 3 hodin při teplotě 165 °C. Poté byla směs zchlazena na laboratorní teplotu, zahuštěna pod vakuem. Vzniklá sraženina byla rozpuštěna ve studené vodě a rekrystalována. Výtěžek reakce byl 0,5258 g látky G, odpovídající 96,16 % teoretického výtěžku. Bod 176,9 - 179,3 °C. 'H NMR (300 MHz, (DMSO-fy,) δ ppm: 1,44 (4H), 1,71 (4H), 2,63 (1H), 3,176 (2H), 3,72 (1H), 4,21 (1H), 6,075 (1H), 7,59 (1H).

-10CZ 306987 B6

Příklad 3 Syntéza 2-[(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-ethyl-6-(azepan-l-yl)-9//purinu (146)

NaHCO₃ (91,534 mg, 1,0896 mmol, 3x v nadbytku) byl rozptýlen v MeOH, do roztoku byl přidán 2-(2-aminoethylamino)-6-(azepan-l-yl)-9/f-purin (64) (100 mg, 0,3632 mmol). Následně byl do směsi přidán NBD-C1 (108,71 mg, 0,5448 mmol) rozptýlený v MeOH. Reakční směs ponechána reagovat při 50 °C po dobu 1 hodiny. Po odreagování výchozí látky přidávána 1M HC1 až do vytvoření hnědých krystalů (pH 4-5). Následovala izolace krystalů. Výtěžek reakce byl 92,7 mg látky 146, což odpovídá 56,291 % teoretického výtěžku. Látka 146 byla připravena ajejí struktura potvrzena pomocí NMR. Následně bylo při stanovení bodu tání zjištěno, že látka taje za rozkladu, a to při teplotě 240,6 °C. ’H NMR (300 MHz, DMSO-J_Ó) δ ppm: 1,43 (5H), 1,70 (5H), 3,58 (5H), 4,23 (2H), 6,43 (2H), 7,66 (1H), 8,56 (1H), 9,59 (1H), 12,19 (1H).

Schéma syntézy 146

Příklad 4 Syntéza 2-hydroxyethylamino-6-(azepan-l-yl)-9//-purinu (65)

2-Chlor-6-(azepan-l-yl)-9/f-purin (62) (0,5 g, 1,986 mmol) reagoval v tlakové zkumavce s ethanolaminem (4,54 g, 74,345 mmol, 4,486 ml) po dobu 3 hodin při teplotě 165 °C. Poté byla směs zchlazena na laboratorní teplotu a došlo ke vzniku sraženiny. Vzniklá sraženina byla rekrystalována ve vodě. Výtěžek reakce byl 326,4 mg látky 65, což odpovídá 56,4 % teoretického výtěžku. Struktura připravené látky byla potvrzena pomocí NMR spektra. Pomocí bodotávku bylo zjištěno, že připravená látka taje za rozkladu při dosažení teploty 211,6 C. ’H NMR (300 MHz, DMSO-^) δ ppm: 1,44 (6H), 1,70 (6H), 3,26 (3H), 3,32 (1H), 3,49 (3H), 3,71 (2H), 4,22 (2H), 4,64 (1H), 5,95 (1H), 7,6 (1H), 12,12 (1H).

.11.

Příklad 5 Příprava 2-dimethylamino-6-(azepan-l-yl)purinu (63)

2-Chlor-6-(azepan-l-yl)purin (62, příklad 1) (210 mg; 0,83 mmol) byl rozpuštěn v 50% roztoku dimethylaminu a methanolu (3 ml). Roztok byl zahříván 16 h při 60 °C a 4 h při 115 °C. Po ochlazení byla reakční směs vložena na 3 h do lednice. Z reakční směsi vykrystalovává produkt v podobě jehlicovitých krystalů. Krystaly byly odfiltrovány a na fritě několikrát promyty methanolem (celkem 13 ml) a destilovanou vodou (celkem 30 ml). Tento první podíl produktu byl sušen v exsikátoru s P₂O₅ dva dny. Výtěžek (I): 113 mg; 52 %. T. t: 237 až 238 °C (od 200 °C sublimace). HPLC R_t = 11,2 min (80 % CH₃OH + 20 % pufr); UV (80 % CH₃OH + 20 % pufr) X_max 245 nm, λ,_τ„„ 277 nm, Z_max 291 nm. MS ESI+ (CV 17) m/z (rel. %): 261 [M+H]⁺ (100), EST (CV 23) m/z (rel. %): 259 [M]~ (100).

Příklad 6 Příprava 2-(3-hydroxypropylamino)-6-(azepan-l-yl)purinu (66)

2-Chlor-6-(azepan-l-yl)purin (62, příklad 1) (217 mg; 0,86 mmol) byl rozpuštěn v 3-aminopropyl-l-olu (2 ml). Roztok byl zahříván 26 h při 115 °C a 4 h při 160 °C. Po ochlazení byla reakční směs vložena na 2 týdny do lednice. Z reakční směsi vykrystalovává produkt v podobě hrudek. Krystaly (podíl I produktu) byly odfiltrovány, na fritě rozmělněny a několikrát důkladně promyty destilovanou vodou (celkem 15 ml). Z filtrátu zředěného destilovanou vodou při promývání a umístěného 1 den v lednici byl získán podíl II produktu. Po vysušení v exsikátoru s P₂O₅ byl celkový výtěžek surového produktu (podíly I + II) 225 mg, 90 %. Surový produkt byl krystalován z ethanolu (20 ml). Bílá vatovitá látka. Výtěžek po krystalizaci 153 mg; 61 %. T. t.: 226 až 230 °C (od 200 °C sublimace). HPLC R, = 5,1 min (75 % CH₃OH + 25 % pufr), R_t = 6,4 min (60 % CH₃OH + 40 % pufr); UV (75 % CH₃OH + 25 % pufr) X_max 239 nm, λ_π„_η 251 nm, λ_1ΜΧ 259 nm, X_min 275 nm, X_max 290 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %): 291 [M+H]⁺ (100), ESP (CV 22) m/z (rel. %): 289 [Mf (100).

Příklad 7 Příprava 2-(morfolin-4-yl)-6-(azepan-l-yl)purinu (67)

2-Chlor-6-(azepan-l-yl)purin (62, příklad 1) (209 mg; 0,83 mmol) byl rozpuštěn v morfolinu (2 ml). Roztok byl zahříván 14 h při 60 °C a 5 h při 115 °C. Po ochlazení byla reakční směs vložena do dalšího dne do lednice. Z reakční směsi vykrystalovává sádrovitý produkt. Produkt byl odfiltrován, na fritě několikrát důkladně promyt methanolem (celkem 10 ml) a vysušen v exsikátoru s P₂O₅. Bílá sádrovitá látka. Výtěžek 221 mg; 88 %. T. t.: 242 až 244 °C (od 200 °C sublimace). HPLC R_t = 13,3 min (75 % CH₃OH + 25 % pufr), R_t = 10,6 min (80 % CH₃OH + 20 % pufr); UV (80 % CH₃OH + 20 % pufr) X_max 245 nm, λ_ιηίη 275 nm, λ_ηι;ιχ 290 nm. MS ES1+ (CV 18) m/z (rel. %): 303 [M+H]⁺ (100); EST (CV 23) m/z (rel. %): 301 [M]~ (100).

- 12CZ 306987 B6

Příklad 8 Příprava 2-(l-hydroxymethylpropylamino)-6-(azepan-l-yl)purinu (68)

2-Chlor-6-(azepan-l-yl)purin (62, příklad 1) (216 mg; 0,86 mmol) byl rozpuštěn v 2-amino5 but-l-olu (2 ml). Roztok byl zahříván 20 h při 115 °C a 19 h při 160 °C. Po ochlazení byl produkt vysrážen z reakční směsi destilovanou vodou (40 ml). Suspenze byla vložena přes noc do lednice. Mlékovitá sraženina produktu byla odfiltrována, na fritě několikrát důkladně promyta destilovanou vodou (20 ml) a vysušena v exsikátoru s P2O5. Bílá sádrovitá látka. Výtěžek 251 mg; 96 %. T. t: 185 až 188 °C. HPLC R_t = 7,8 min (65 % CH₃OH + 35 % pufr); UV (65 % 10 CH₃OH + 35 % pufr) Z_max 240 nm, Z_min250 nm, Z_max261 nm, X_min276 nm, Z_max290 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %): 305 [M+H]⁺ (100); ESL (CV 23) m/z (rel. %): 303 [M]~ (100).

- 13CZ 306987 B6

Tabulka 1: Látky připravené podle metod popsaných v příkladech 1 až 8.

č.	Rl	A*	R2	-D-E-	CHN ANALÝZA [%] vypočteno nalezeno	MS (ZMD)ANALÝZY
C	H	N	[M-H]* a)	[M+H]* w
61	F	-CHrCHr	H	H,H	56,16 56,2	6,00 6,1	29,77 29,9	234	236
62	Cl	-CHj-CH,-	H	H,H	52,49 52,2	5,61 5,7	27,82 27,5	250	252
63	N, iV-dimethylamino	-CHrCHr	H	Η, H	59,98 60,3	7,74 7,5	32,28 32,0	259	261
64	2-aminoethylamino	-CH2-CH2-	H	H,H	56,71 56,9	7,69 7,7	35,61 35,4	274	276
65	2-hydroxyethylamino	-ch2-ch2-	H	Η, H	56,50 56,8	7,30 7,2	30,41 30,5	275	277
66	3-hydroxypropylamino	-ch2-ch2-	H	H.H	57,91 57,8	7,64 7,8	28,94 30,1	289	291
67	morfolin-4-yl	-ch2-ch2-	H	H,H	59,58 59,7	7,33 7,5	27,79 27,5	301	303
68	(R/S)-l- hydroxymethylpropylamino	-ch2-ch2-	H	Η, H	59,19 59,1	7,95 7,9	27,61 27,6	303	305
69	(R/S)-4-hydroxybut-2-ylamino	-ch2-ch2-	11	H,H	59,19 59,3	7,95 8,0	27,61 27,7	303	305
70	3-amino-2-hydroxypropylamino	-CHrCHr	H	H,H	55,06 54,7	7,59 7,7	32,11 32,3	304	306
71	3-atninocyklohexyIamino	-CH2-CHr	H	Η, H	61,98 61,5	8,26 8,5	29,76 30,0	328	330
72	Cl	-CH2-CHr	4-oxo	H,H	49,73 49,4	4,55 4,7	26,36 26,5	264	266
73	2-(dimethylamino)ethylamino	-CH2-CH2-	4-oxo	H,H	56,76 56,2	7,30 7,7	30,89 31,0	316	318
74	morfolin-4-yl	-CHrCHr	4-oxo	H.H	56,95 56,4	6,37 6,0	26,56 26,1	315	317
75	3-hydroxypropylamino	-CH2-CH2-	4-oxo	H,H	55,25 55,0	6,62 6,7	27,61 27,4	303	305
76	(R)-4-hydroxybut-2-ylamino	-CHrCHr	4-OH	H,H	56,23 56,5	7,55 7,5	26,23 26,0	319	321
77	(S)-4-hydroxybut-2-ylamino	-CH2-CH2-	4-OH	H,H	56,23 56,0	7,55 7,1	26,23 26,1	319	321
78	frans-4-hydroxycyklohexylamino	-CHrCHr	4-OH	H,H	58,94 58,8	7,56 7,7	24,26 24,5	345	347
79	Cl	-CHrCHr	4-CHj	H,H	54,24 54,2	6,07 6,3	26,35 26,5	264	266
80	cw-2-aminocykIohexylamino	-CHrCHr	4-CHj	H,H	62,94 63,0	8,51 8,6	28,55 28,9	342	344
81	2-hydroxyethylamino	-CH2-CH2-	4-CHs	H,H	57,91 58,2	7,64 7,5	28,94 28,9	289	291
82	5-aminopentylamino	-CHrCHr	4-fenyl	H,H	67,15 67,4	7,94 8,0	24,91 253	392	394
83	1 -(hydroxymethyl)propylamino	-CHrCHr	4-fenyl	H,H	66,29 66,0	7,42 7,2	22,09 22,0	379	381
84	/rans-3-hydroxycyklohexylamino	-CH2-CH2-	3-(lpiperidyl)	H,H	63,89 64,0	8,53 8,6	23,71 24,0	412	414
114	Cl	-CHrHN-	H	H,H	47,53	5,19	33,26	251	253

- 14CZ 306987 B6

č.	Rl	A*	R2	-D-E-	CHN ANALÝZA [%] vypočteno nalezeno	MS (ZMD)ANALÝZY
C	H	N	(M-HJ* a)	[M+H]+ b)
					47,6	5,1	33,3
115	AfyV-dimethylamino	-CHrHN-	H	H.H	55,15 55,4	7,33 7,3	37,52 37,7	260	262
116	(R}-2-hydroxypropy!amino	-ch2-hn-	H	H.H	53,59 53,6	7,27 7,0	33,65 33,8	290	292
117	Ν,Λ'-dimethylamino	-CHrHN-	3-oxo	H,H	52,35 52,6	6,22 6,0	35,61 35,8	274	276
118	2-hydroxyethylamino	-CHrHN-	3-oxo	Η, H	49,48 50,0	5,88 5,5	33,66 34,0	290	292
119	(R/S)-l- hydroxymethylpropylamino	-CHrHN-	3-oxo	H.H	52,65 53,0	6,63 6,5	30,70 30,8	318	320
120	N, iV-dimethylamino	-CHj-HN-	5-oxo	H.H	52,35 52,4	6,22 6,5	35,61 35,7	274	276
121	(R)-2-hydroxypent-3-ylamino	-ch2-hn-	5-oxo	H.H	54,04 54,3	6,95 7,3	29,41 29,8	332	334
122	(S)-2-hydroxypent-3-ylamino	-ch2-hn-	5-oxo	H,H	54,04 54,1	6,95 7,0	29,41 29,6	332	334
123	/ra<is-3-hydrOxycyklohexylamino	-ch2-hn-	6-oxo	H.H	55,64 55,2	6,71 6,8	28,39 28,5	344	346
124	l-(dimethylamino)methylamino	-ch2-hn-	6-oxo	H,H	51,30 51,0	6,62 6,9	36,82 36,4	303	305
125	.ν,Λ'-dimethylamino	-ch2-hn-	6-oxo	H.H	52.35 52,6	6,22 6,4	35,61 35,5	274	276
126	3-amino-2-hydroxypropylamíno	-CH2-HN-	4-fenyI	H,H	58,68 57,0	6,57 6,3	30,41 30,6	367	369
127	3-aminopropylamino	-CH2-HN-	4-(4fluorfenyl)	H,H	59,36 59,0	6,55 6,8	29,15 28,8	383	385
128	3-hydroxypropylamino	-CHrHN-	4-(2nitrofenyl)	H,H	55,33 55,1	5,87 6,0	27,17 27,5	411	413
129	2-hydroxy-2-methylpropylamino	-CHrHN-	4-(3-pyridyl)	H.H	59,67 60,2	6,85 7,1	29,30 29,3	381	383
130	2-hydroxyethylamino	-CHrHN-	4-(4chinolinyl)	Η, H	62,36 62,4	5,98 6,0	27,70 27,9	403	405
131	2,3-dihydroxypropylamino	-CHrHN-	4-(l,3-thiazol- 2-yl)	H,H	49,22 49,0	5,68 5,8	28,70 29,0	389	391
132	írans-4-aminocyklohexylamino	-CHrHN-	4-(2hydroxyethyl)	H.H	57,73 57,5	8,07 8,3	29,92 29,2	373	375
133	4-hydroxybutylamino	-CHrHN-	5trifluormethyl	Η, H	48,25 48,5	5,94 5,5	26,26 26,0	372	374
134	2-acetamidoethylamino	-CHrHN-	6-hydroxy	H.H	50,29 50,1	6,63 6,2	33,51 33,8	333	335
135	tnorfolin-4-yl	-CHrHN-	4methoxymeth ylkarbonyl	H.H	54,39 54,6	6,71 6,9	26,12 26,1	374	376
136	rrans-2-hydroxycyklohexylamino	-CH2-HN-	4-benzyl	H.H	65,53 65,6	7,41 7,3	23,26 23,5	420	422
137	5-aminopentylamino	-CHz-HN-	4-(4kyanobenzyl)	H,H	63,72 64,0	7,21 7,4	29,08 28,7	432	434
138	N, V-dimethy lamino	-NH-CHr	H	H,H	55,15 55,3	7,33 7,6	37,52 37,3	260	262
139	3-hydroxypropylamino	-CH2-O-	H	H,H	53,41 53,3	6,90 7,0	28,75 29,0	291	293
140	3-aminopropylamino	-CH2-O-	3-hydroxymethyi	H,H	52,32 52,4	7,21 7,5	30,51 30,7	320	322
141	6-aminohexylamino	-CHrO-	2-hydroxymethyl	Η, H	56,18 56,3	8,04 7,7	26,98 27,2	362	364
142	3-hydroxy-3-methylbutylamino	-CH2-O-	5-dimethylaminomethyl	H,H	57,27 . 57,3	8,28 8,1	25,97 26,0	376	378
143	2-hydroxyethylamino	-CHrS-	H	H.H	48,96 48,7	6,16 5,8	28,55 28,8	293	295
144	(R/S)-2-hydroxypropyl	-CH2-S-	H	H.H	50,63 50,7	6,54 6,3	27,25 27,5	307	309
145	(R/S)-4-hydroxybut-2-yl	-CHrS-	H	H.H	52,15 52,5	6,88 7,0	26,06 25,7	321	323

* pokud má fragment A více členů, je první uvedený atom ve struktuře umístěn blíže atomu dusíku vázanému na purin

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH

b) roztok: MeOH p.a. + H₂O + NH₃

- 15 CZ 306987 B6

Příklad 9 Hodnocení inhibice ROCK kinázy in vitro

Schopnost látek inhibovat rekombinantní ROCK2 byla hodnocena v testu založeném na sledování inhibice inkorporace ³³P pocházejícího z ATP do oligopeptidu LRRWSLG odpovídajícímu části peptidové sekvence rozpoznávané ROCK2. Do jednotlivých jamek 96jamkové desky bylo přidáno 2 μΐ 5krát koncentrované testované látky, 1 μΐ roztoku rekombinantního enzymu (Proqinase), 1 μΐ roztoku substrátu peptidu LRRWSLG a 1 μΐ vody. Reakce byla nastartována přidáním 5 μΐ reakčního pufru obsahujícího [γ-³³Ρ]ΑΤΡ. Deska byla inkubována 50 minut v termobloku nastaveném na 37 °C. Poté byla reakce zastavena přidáním 5 μΐ 3% kyseliny orthofosforečné. 5 μΐ reakční směsi z každé jamky bylo přeneseno na fosfocelulózový papír, který byl poté opláchnut 96% etanolem a uzavřen do kazety AE-PR-2025 s citlivou deskou. Ta byla po 16 hodinách skenována v přístroji Image Reader Bas-1800 softwarem BAS-1800. Intenzita signálu byla odečtena v programu Aida Image Analyzer. Hodnoty IC50 byly vypočteny z dávkových křivek pro 10 koncentrací inhibitoru. Maximální testovaná koncentrace byla obvykle 10 nebo 50 pmol/litr, následující koncentrace byla poloviční oproti koncentraci předchozí. Experiment byl opakován alespoň 3 krát.

Složení pufrů bylo následující:

Reakční pufr (2x): 1 ml 2x kinázového pufru + 30 □ 1 1 mM ATP + 0,5 [γ-33Ρ]ΑΤΡ

Kinázový pufr (2x) (20 ml): 4 ml 0,5 mol/1 Hepes pH 7,4 + 0,2 ml 2 mol/1 MgC12 + 0,4 ml 0,25 mol/1 EGTA + 0,8 ml 0,5 mol/1 glycerol 2-fosfát + 0,2 ml 0,2 mol/1 NaF; úprava na pH 7,4; doplnění přesně na objem 20 ml H₂O

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. Z výsledků je patrné, že testované látky efektivně inhibují ROCK2 kinázu in vitro.

Tabulka 2: Hodnocení inhibice ROCK kinázy in vitro. Hodnoty jsou uvedeny v μπιοΙ/Ι

látka	IC50	SD
66	2,86	0,6
65	4,46	0,76
68	5,34	1,25
64	14,39	1,51

Příklad 10 Hodnocení inhibice kináz in vitro

K určení zbytkové aktivity po aplikaci 50 mikromolámího roztoku látky v DMSO byl použit systém KinomeScan (Discoverx). Rekombinantní kinázy značené DNA jsou vázaný na imobilizovaný ligand. Pokud testovaná látka naruší tuto vazbu, dojde k uvolnění kinázy. Její množství v eluátu je pak stanoveno pomocí RT-PCR. Každý experiment byl proveden v duplikátu. Výsledky shrnuje Tab. 3. Testované látky významně inhibují kinázy z ROCK, JNK a JAK rodin (tučně), přičemž schopnost inhibovat dalších 52 kináz reprezentujících lidský kinom je podstatně nižší.

- 16CZ 306987 B6

Tabulka 3: Hodnocení inhibice ROCK, JNK, JAK a dalších kináz in vitro.

kinasa	Látka 66 % residuální aktivity
JAK3	0.05
JNK1	0.1
ROCK2	0.3
JNK3	0.35
JNK2	0.85
JAK2	11
KIT	22
SRPK3	25
PDGFRA	28
ALK	35
ABL1 -phosphorylated	35
ABL1 -nonphosphorylated	35
TRKÁ	36
PIK3CG	39
VEGFR2	40
MEK1	46
CTK	47
MEK2	48
PLK4	50
CSNK1G2	58
ERK1	61
ERBB2	61
PLK1	62
PIK3C2B	63
PAK4	63
BRAF(V600E)	64
PLK3	66
ZAP70	66
PIM1	68
FGFR3	69
PIM3	69
PDPK1	70
MKNK1	72
GSK3B	72

- 17CZ 306987 B6

kinasa	Látka 66 % residuální aktivity
PHKG1	73
LKB1	77
FAK	78
p38-alpha	79
p38-beta	79
RPS6KA5(Kin.Dom.2-C-terminal)	80
PIM2	80
PAK2	81
EGFR	84
TIE2	85
PIK3CA	85
MAP3K4	88
ACVR1B	91
AK.T2	96
PKAC-beta	98
YANK3	98
MAPKAPK2	98
ΡΑΚΙ	99
SRC	100
EPHA2	100
PKAC-alpha	100
AKT1	100
IGF1R	100
RAF1	100
TGFBR1	100

Příklad 11 Hodnocení toxicity

Resazurin (7-Hydroxy-377-phenoxazin-3-one 10-oxid) je modrá slabě fluorescentní látka, která je mitochondriemi ireverzibilně redukována na červený vysoce fluorescentní resofurin. Používá se proto k hodnocení viability bakteriálních i eukaryotických buněk. V testu byl sledován vliv 72 hodinového působení několika koncentrací látek (trojnásobná ředící řada, maximální koncentrace = 50 mikroM) na viabilitu kožních fibroblastů BJ, keratinocytů HaCaT a buněk sítnice ARPE-19. 5000 buněk bylo vyseto do jednotlivých jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky 24 hodin před přidáním testovaných látek. Jako negativní kontrola bylo použito DMSO vehiculum. Po 72 hodinovém působení byl přidán roztok lOOOx koncentrovaný roztok resazurin v DMSO do konečné koncentrace 100 microM. Fluorescence byla měřena po 1 hodinové (ARPE-19) případně 3 hodinové (HaCaT a BJ) inkubaci. Hodnoty IC50 byly vypočteny z dávkových křivek pomocí programu v jazyce R využívajícího knihovnu drc. Výsledky ukazuje tabulka 4. Látky v testovaném koncentračním rozmezí nevykazují významnou toxicitu proti nenádorovým buňkám kůže a oka.

- 18 CZ 306987 B6

Tabulka 4: Hodnocení toxicity na buněčných liniích. Hodnoty IC50 jsou uvedeny v □ mol/1.

		Linie
látka	BJ	ARPE- 19	HaCaT
65	>100	>100	>100
64	>100	>100	>100
63	>100	>100	>100
66	>100	>100	>100
67	>100	>100	>100
68	>100	>100	>100

Příklad 12 Hodnocení inhibice ROCK kináz v buňkách

Jedním z cílů ROCK kináz v buňce je MLC2. MLC2 fosforylovaná na Thrl8 a Serl9 reguluje stav aktinového cytoskeletu a v důsledku toho i tvar a pohyb buněk. Sledování vlivu látek na fosforylaci MLC2 pomocí imunodetekce po SDS-PAGE a westernovém přenosu bylo použito k průkazu jejich schopnosti dosáhnout efektivní koncentrace v buňkách. Jako pozitivní kontrola byly použity známé inhibitory ROCK kináz Y-27632 a fasudil. Použity byly linie A375m2, A2058, HT1080. Linie byly kultivovány v Dulbecco's Modified Eagle Medium (Sigma, D6429) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (Sigma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37 °C, 5% CO₂, absolutní vlhkost vzduchu). Buňky po 24 hodinovém působení látek (10 mikromol) byly zlyzovány v ledovém lyzačním pufru (1% Triton X-100 v Tris pufru s obsahem inhibitorů proteáz/Serva, 20384.07/ a fosfatáz/Serva, 39055.01/). Buněčné lyzáty byly rozděleny pomocí 10% SDS-PAGE, přeneseny na nitrocelulózovou membránu (AmershamTM ProtonTM 0,45 pm NC nitrocellulose blotting membranes od GE Healthcare Life science, 10600002) pomocí imunoblotingu. Aby se předešlo nespecifické vazbě protilátek, membrány byly inkubovány 1 hodinu při laboratorní teplotě v Tris pufru obsahujícím 4 % bovinního sérového albuminu (BSA) (Sigma, A7030) a 1% odtučněného sušeného mléka. Poté byly membrány inkubovány přes noc při 4 °C s primární protilátkou (MLC2 Cell Signaling - katalog, číslo 3672 nebo pMLC2 Thrl8/Serl9 Cell Signaling katalog, číslo 3674) v TTBS (1% roztok BSA v Tris pufru s obsahem 0,1 % Tween20). Po inkubaci byly membrány důkladně opláchnuty v TTBS a inkubovány 1 h za pokojové teploty se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. (rabbit anti-mouse antibody od Abcam, ab97046 nebo goat anti-rabbit antibody od Santa Cruz Biotechnology, sc-2030). Po důkladném oplachu TTBS byla provedena detekce pomocí substrátu s obsahem luminolu. Detekce signálu byla provedena pomocí přístroje LAS-1000 Single Systém (Fujifílm, Tokyo, Japan)- Denzitometrická kvantifikace intenzity signálu byla provedena v programu ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ii/)· Výsledky jsou zobrazeny na obr. 1. Experimenty prokázaly, že testované látky dosahují v živých buňkách koncentrací schopných inhibovat ROCK kinázy.

Příklad 13 Vliv na stav aktinového cytoskeletu a morfologii fibroblastů

Společným rysem fíbrotických onemocnění je reorganizace aktinového cytoskeletu zúčastněných buněk včetně fibroblastů podmíněná aktivací ROCK kináz. Látky inhibující přestavbu aktinového cytoskeletu včetně ROCK inhibitorů mají terapeutický efekt v modelech fíbrotických onemocnění. Ke sledování schopnosti látek ovlivnit stav aktinového cytoskeletu byly vybrány fibroblasty BJ. Linie byly kultivovány v Dulbecco's Modified Eagle Medium (Sigma, D6429) obsahujícím

- 19CZ 306987 B6

10% fetální bovinní sérum (Sigma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37 °C, 5% CO₂, absolutní vlhkost vzduchu). Efekt látek (100 gmol/l) na cytoskelet BJ, které byly vysety v nízké koncentraci (3000 buněk na jamku 96jamkové destičky, otrava 24 hodin po nasazení) byl hodnocen po 24 hodinách po obarvení aktinu TRITC-faloidninem ve fluorescenčním mikroskopu. Výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 2a, 2b, 2c a 2d. Testované látky ovlivňují stav aktinového cytoskeletu a morfologii fibroblastů mají proto potenciál ovlivnit fíbrotická onemocnění.

Příklad 14 Hodnocení vlivu na ROCK na migraci a invazivitu buněk

Schopnost vybraných inhibitorů (3625, 4686) ovlivňovat invazivitu buněk byla hodnocena v testu založeném na sledování schopnosti buněk pronikat do kolagenní matrix. Z počtu buněk v jednotlivých vrstvách (hloubkách ostrosti) byl po 72 hodinách vypočten index invazivity. Použity byly buňky A375m2 a A2058 (melanom), které se používají jako model ROCK dependentní migrace, a linie HT1080, která migruje ROCK nezávislým způsobem. Jako srovnávací látka byl použit klinicky používaný ROCK inhibitor fasudil. Jako kontrola sloužilo DMSO vehikulum.

Linie byly kultivovány v Dulbecco's Modified Eagle Medium (Sigma, D6429) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (Sigma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37 °C, 5% CO₂, absolutní vlhkost vzduchu). Testování invazivity bylo provedeno v Ibidi 15μ—Slide Angiogenesis plates (ibidi, 81506), kdy do každé komůrky bylo naneseno v 10 μΐ krysího kolagenu (lmg/ml) obsahujícího testované látky (10 μιηοΐ/ΐ), fasudil (10 μτηοΐ/ΐ) nebo DMSO vehikulum. Na zatuhlý kolagen bylo vyseto 1000 buněk 50μ1 kultivačního média obsahujícího testované látky (10 μιτιο1/1). Po 8 hodinách bylo toto médium nahrazeno za médium bez séra obsahující stejnou koncentraci testovaných látek. Po 72 hodinách po vysazení byly buňky vyfotografovány v různých hloubkách kolagenního gelu (0, 10, 20, 30, 40, 50 μιη) pomocí Nikon-Eclipse TE2000-S (20x/0.40 HMC objektiv). V každém ze tří nezávislých opakování experimentu byly pro jednotlivé látky i kontrolu hodnoceny 3 jamky a pro každou jamku 6 náhodně vybraných nepřekrývajících se zorných polí. Index invazivity byl vypočten podle následujícího vzorce: sum(počet buněk v jednotlivých vrstvách * číslo vrstvy)/(celkový počet buněk) a normalizován vzhledem ke kontrole. Statistická významnost (p<0.05) byla vyhodnocena pomocí ANOVA a Tukeyho testu v R. Nové inhibitory a srovnávací látka fasudil v koncentraci 10 pmol/l statisticky významně snižovaly schopnost migrovat a invadovat oproti kontrole v případě améboidních linií A375m2 a A2058. Aktivita nových látek a komerčního inhibitoru byla srovnatelná. Efekt na migraci nebyl pozorován v případě mezenchymální linie HT1080. Pozorovaný efekt na linie améboidní, ale ne na mezenchymální linii je v souladu s inhibicí ROCK kináz v buňkách (tabulka 5, 6, 7). Látky ovlivňují ROCK dependentní migraci buněk, mohou proto najít uplatnění v onemocněních, kde patologická migrace přispívá k patogenezi, jako jsou metastatická nádorová onemocnění včetně melanomu, neovaskularizace, restenózy po cévní či srdeční chirurgii, fibrózy a další nemoci, kde dochází k přestavbě tkáně (astma, chronická obstrukční plicní nemoc).

Tabulka 5: Hodnocení invazivity pro linii A375m2

	index invazivity	poměr ke kontrole	s.d.	koncentrace inhibitoru
65	3,49	0,42	0,73	10 gmol/l
Fasudil	4,36	0,53	1,16	10 gmol/l
Kontrola	8,26	1	0,72	0 pmol/l

-20CZ 306987 B6

Tabulka 6: Hodnocení invazivity pro linii A2058

	index invazivity	poměr ke kontrole	s.d.	koncentrace inhibitoru
65	11,48	0,60	0,62	10 pmol/l
Fasudil	7,04	0,37	0,63	10 pmol/l
Kontrola	19,14	1	7,57	0 pmol/l

Tabulka 7: Hodnocení invazivity pro linii HT1080

	index invazivity	poměr ke kontrole	s.d.	koncentrace inhibitoru
65	9,92	1,33	1,69	10 pmol/l
Fasudil	7,62	1,02	0,67	10 pmol/l
Kontrola	7,44	1	1,08	0 pmol/l

Příklad 15 Hodnocení vlivu na morfologii buněk v kolagenní matrix

Buňky melanomu A375m2 a A2058 se v 3D-kolagenní matrix pohybují améboidním pohybem závislým na aktivitě ROCK kinázy. Inhibice ROCK kinázy vede ke ztrátě améboidního pohybu, buňky přecházejí na epiteliální morfologii. Experiment sledující vliv nových látek, klinicky používaného ROCK inhibitoru fasudilu a DMSO vehikula na morfologii výše uvedených buněk v kolagenu byl proveden ve 48 jamkových panelech (Biofil, 011048). Linie byly kultivovány v Dulbecco's Modified Eagle Medium (Sigma, D6429) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (Sigma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37 °C, 5% CO₂, absolutní vlhkost vzduchu).

Následující hodnoty odpovídají výpočtu potřebného materiálu na jednu jamku panelu: 10⁴1,5x10⁴ buněk v celkovém objemu 25 mikrolitrů média bylo smícháno s 225 mikrolitry roztoku krysího kolagenu (18 % 5x DMEM; 23,26 % voda; 5 % 7,5% NaHCO₃; 4,24 % 200mM NaOH; 2 % 750mM Hepes; 37,5% 4% krysí kolagen). K buněčné suspenzi byly přidány testované látky (10 pmol/l) nebo DMSO vehikulum. Po zatuhnutí kolagenní suspenze bylo do jamek panelu přidáno 500 μΐ kultivačního média s testovanými látkami (10 pmol/l) případně DMSO vehikulem. Morfologické změny byly hodnoceny po 24 h. Za mezenchymální byly považovány buňky, jejichž délka byla minimálně dvakrát větší než jejich šířka. Výsledky shrnují tabulky 8-11. Působení testovaných inhibitorů mění fenotyp buněk z améboidního na epiteliální. Améboidní fenotyp je závislý na aktivitě ROCK a ROCK-dependentní přestavbě aktinového cytoskeletu. Testované látky tedy ovlivňují aktivitu ROCK a stav aktinového cytoskeletu v buňkách.

Tabulka 8: Linie A375m2, vliv látek na podíl morfologických typů

Inhibitor	mezenchymální [%]	améboidní [%]	přechodná [%]
65	74,25	21,57	4,18
fasudil	55,14	34,32	10,54
Y-73632	65,45	25,31	9,24
kontrola	9,43	87,74	2,83

-21 CZ 306987 B6

Tabulka 9: Linie A2058, experiment 1, vliv látek na podíl morfologických typů

Inhibitor	mezenchymální [%]	améboidní [%]	přechodná [%]
65	50,56	41,37	8,08
fasudil	53,35	42,33	4,32
Y-73632	78,01	18,63	3,36

Tabulka 10: Linie A2058, experiment 2, vliv látek na podíl morfologických typů

Inhibitor	mezenchymální [%]	améboidní [%]	přechodná [%]
fasudil	59,44	26,57	13,99
66	55,22	41,79	2,99
68	54,04	34,16	11,80
kontrola	6,67	91,43	1,90

Tabulka 11: Linie A2058, experiment 3, vliv látek na podíl morfologických typů.

inhibitor	mezenchymální [%]	améboidní [%]	přechodná [%]
65	56,67	35,24	8,10
fasudil	68,49	24,20	7,31
kontrola	14,01	80,93	5,06

Příklad 16 Suché tobolky

5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 1250 g

Talek180 g

Pšeničný škrob120 g

Magnesium stearát 80 g Laktóza20 g

Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 17 Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

- 22 CZ 306987 B6

Složení

Aktivní složka

Lauroglykol

250 g litry

Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 18 Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka

PEG 400

Tween 80

Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I

   R2 ’N ri ve kterém

   A je -Z-(CH2)-; Z je vybrán z NH, CH₂;

   -23CZ 306987 B6

   D a E jsou nezávisle vybrány z H a R2,

   Rl je vybráno ze skupiny zahrnující

   - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

   - heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkyl skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, a která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

   - -G-R', kde G je vybráno ze skupiny -NH- a -N(C1-C8 alkyl), a

   R' je vybráno ze skupiny zahrnující

   - C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl, substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy a amino substituent, s výhodou jedním hydroxy a/nebo jedním amino substituentem;

   - (dialkylamino)alkyl skupinu, kde alkyl je vybrán nezávisle ze skupiny zahrnující C1-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl;

   - C3-C10 cykloalkyl, což znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 10 uhlíkových atomů, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;

   - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkyl je popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

   - heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkyl alkyl skupina je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

   - benzylová skupina, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující fluoro, chloro, hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;

   -24CZ 306987 B6

   R2 může nebo nemusí být přítomen, a představuje jeden nebo více substituentů vázaných v libovolné poloze kruhu, nezávisle vybraných z =0, -OH, -C(O)-(CH₂)p-O-(H nebo C1-C4 alkyl), kde p je celé číslo v rozmezí 0 až 4, hydroxy(Cl-C4)alkyl, -S(O)₂-aryl, -C(O)-aryl, ve kterém aryl je C6-C10 skupina obsahující alespoň jedno aromatické jádro, a s výhodou je arylem fenyl nebo nafty 1;

   arylalkyl je skupina obsahující C6-C10 skupinu obsahující alespoň jedno aromatické jádro a ClC4 alkylen, a s výhodou je arylalkylem benzyl;

   heteroaryl je C5-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N, a s výhodou je heteroaryl vybrán ze skupiny zahrnující furan, thiofen, pyrrol, pyrrazol;

   heterocyklyl je C4-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N.
2. 2. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle nároku 1, které nesou substituent Rl vybraný ze skupiny zahrnující: N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-l-yl, 4-(2-hydroxethyl)piperazinyl, (R)-(2-hydroxymethylpyrrolidine-l-yl), (2-hydroxyethyl)amino, (3-hydroxypropyl)amino, 2(R)-hydroxypropyl]amino, 2(S)-hydroxypropyl]amino, 4-hydroxybut-2(R)yljamino, 4-hydroxybut-2(S)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(R,S)-yl]amino, 2-(hydroxy-2methyl)propyl]amino, (2,3-dihydroxypropyl)amino, (l-hydroxy-3-methylbutyl)amino, [(R,Sý(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(R)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, (R)-[l-isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (S)-[l-isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (2aminoethyl)amino, (3-aminopropyl)amino, (4-aminobutyl)amino, (5-aminopentyl)amino, (6aminohexyl)amino, [3-amino-2-hydroxypropyl]amino, [l-(dimethylamino)methyl]amino, [2(dimethylamino)ethyl]amino, [3-(dimethylamino)propyl]amino, [4-(dimethylamino)butyl]amino, [2-(diethylamino)ethyl]amino, [3-(diethylamino)propyl]amino, (aziridin-l-yl)ethylamino, (azolidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (piperidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)propylamino, cyklopropylamino, cyklobutylamino, cyklopentylamino, cyklohexylamino, (czs-2-aminocyklohexyl)amino, (Zrazz5-2-aminocyklohexyl)amino, (cis, Zrazzs-2-aminocyklohexyl)amino, (cis, Zrara-S-aminocyklohexyljamino, (trans-4aminocyklohexyl)amino, (c/ó'4-aminocyklohexy Ijamino, (cis, Zraw.s'4-aminocyklohexyl)amino, (cz5-2-hydroxycyklohexyl)amino, (zra«.s-2-hydroxycyklohexy ljamino, (cis, írans-2-hydroxycyklohexyl)amino, (cis, Zranzř-3-hydroxycyklohexyl)amino, (Zram-4-hydroxycyklohexy I )amino, (m-4-hydroxycyklohexy l)am ino, (cis, Zrazzs-4-hydroxycyklohexyl)amino, (2-methoxybenzyl)amino, (3-methoxybenzyl)amino, (4-methoxybenzyl)amino, (3,5-dimethoxybenzyl)amino, (2,6— dimethoxybenzyl)amino, (3,4,5-trimethoxybenzyl)amino, (2,4,6-trimethoxybenzyl)amino, (2fluorbenzyl)amino, (3-fluorbenzyl)amino, (4-fluorbenzyl)amino, (2-chlorbenzyl)amino, (3chlorbenzyl)amino, (4-chlorbenzyl)amino, (2,4-dichlorbenzyl)amino, (3,4,5-trichlorbenzyl)amino.
3. 3. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jako léčiva.
4. 4. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2 pro použití pro léčbu chorob vybraných ze skupiny zahrnující choroby dýchacího systému, kardiovaskulárního systému, oka, střev, kůže a nervového systému, jejichž patologie zahrnuje abnormální migraci buněk, zánět nebo fíbrózu, hepatobiliámích onemocnění, zánětlivých onemocnění, patologických neovaskularizací, neurodegenerativních a metastatických nádorových onemocnění, onemocnění ve kterých hraje role vazokonstrikce nebo bronchokonstrikce.

   -25CZ 306987 B6
5. 5. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2 pro použití pro léčbu chorob vybraných ze systémové fibrózy, fibróz jednotlivých orgánů, zejména jater, ledvin, plic a kůže, myelofibrózy, fibrózy po rádio a chemoterapii, Crohnovy nemoci, kolitidy, ulcerativní kolitidy, Behcetovy nemoci, chronické obstrukční plicní nemoci, metastatického melanomu, zánětů po operačních výkonech, zánětu povrchu oka, uveitidy, retinitidy, makulámí degenerace, syndromu suchého oka, alergické rhinitis, alergického astmatu, astmatu bronchiale, sclerosis multiplex, systémové sklerózy, chronické infekce HCV, akutního poškození jater, nealkoholické steatohepatitis, rheumatoidní arthritidy, psoriatické arthritidy, ankylosní spondylitidy, psoriázy, alopecia areata, vitiligo, lupus erythematosus, cerebrálního vazospazmu, amyotrofické Iaterální sklerózy, frontotemporální demence, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, polyglutaminových onemocnění, Pickovy nemoci, demencí, iktu, nemoci s argyrofilními zrny (AgD), srdečního selhání, aneurysmatu abdominalní aorty, retinoblastomu, nádorů kolorekta, prsu a ovaria, obezity, diabetů 2. typu, atherosclerosy, hypertenzní nemoci, pulmonamí hypertenze, erektilní dysfunkce, restenózy po vaskulámí nebo srdeční chirurgii, benigní neoplasie, neovaskulámího glaukomu, diabetické retinopatie, okulámí neovaskularizace, diabetické nefropatie, hemorhagické teleangiektasie, prevenci rejekce transplantátu, korekci jizvení kůže.
6. 6. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden 2,6disubstitutovaný purin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2 a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič.