CZ2015751A3 - 2,6-disubstituované puriny pro použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení se týká 2,6-disubstitutovaných purinů, způsobů jejich přípravy, farmaceutických přípravků obsahujících tyto sloučeniny a jejich použití pro léčbu onemocnění, v jejichž patogenezi hraje klíčovou úlohu deregulace kináz z rodiny ROCK, JAK a JNK. Přípravky obsahující tyto sloučeniny je možné použít k léčení nemocí plic, oka, střev, kůže a nervového systému, pro která je typická abnormální migrace buněk, zánět nebo fibróza.

Description

2,6-disubstituované puriny pro použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky

Oblast techniky

Tento vynález se týká 2,6-disubstitutovaných purinů obecného vzorce I, způsobů jejich přípravy, farmaceutických přípravků obsahujících tyto sloučeniny a jejich použití pro léčbu onemocnění, v jejichž patogenezi hraje klíčovou úlohu deregulace kináz z rodiny ROCK, JAK a JNK. Přípravky obsahující tyto sloučeniny je možné použít zejména k léčení nemocí plic, oka, střev, kůže a nervového systému, pro která je typická abnormální migrace buněk, zánět nebo fibróza.

Dosavadní stav techniky

Rho - ROCK dráha hraje klíčovou roli v organizaci aktinového cytoskeletu a tak reguluje řadu buněčných procesů včetně adheze, kontrakce, motility, proliferace a přežití (Amano, M. et al. 2010, Cytoskeleton Hoboken, N.J., 67(9), 545-54). Podílí se na hojení ran a metastazování nádorů. ROCK stabilizuje aktinový cytoskelet tím, že aktivuje LIM kinázy, které následně fosforylují kofilin. Fosforylace inhibuje jeho schopnost narušovat stabilitu aktinových vláken. Kontraktilita stresových vláken podobně jako kontraktilita aktino-myosinových vláken buněk hladké svaloviny závisí na fosforylaci lehkého řetězce myosinu (MLC). Ta je katalyzována kinázou lehkých řetězců myosinu (MLCK), zpětnou reakci působí příslušná fosfatáza. Rho kinázy inaktivují tuto fosfatázu fosforylaci její podjednotky MYPT1 („myosin phosphatase - targeting subunit 1“) na threoninech v pozicích 696 a 853. ROCK2 (stejně jako MLCK) přímo fosforyluje MLC na šeřinu v pozici 19, což způsobí zvýšení ATPázové aktivity. Regulace MLC Rho kinázou hraje roli také při dělení buňky. ROCK se váže na aktinomyosinový komplex kontraktilního prstence. Kromě Rho ji aktivuje též mitotická kináza PLK1. Další substráty ROCK, které hrají roli v organizaci aktinového cytoskeletu, jsou ezrin/radixin/moezin (ERM), CPI-17, calponin, adducin. Efekt ROCK na proliferaci a na buněčnou polaritu je zprostředkován fosforylaci PTEN.

Deregulovaná aktivita ROCK se podílí na patogenezi řady onemocnění včetně nádorových onemocnění, nemocí oka, kardiovaskulárního, dýchacího a nervového systému. Ovlivnění Rho-ROCK signalizace má terapeutický efekt v onemocněních osteoporóze a fibrózách nejrůznější etiologie (Hollanders, K. et al. 2015, Invest Ophthal. Vis. Sci. (2), 1335-48). Přípravky působící tímto mechanismem jsou schváleny v Japonsku v terapii glaukomu (ripasudil) a cerebrálního vazospazmu při subarachnoidálním krvácení (fasudil). V klinickém hodnocení se testuje vliv na aterosklerózu a pulmonální hypertenzi. Farmakologická inhibice ROCK mj. reguluje přežití, aktivaci, kontrakci a migraci buněk. Schopnost ovlivnit kontrakci buněk hladkého svalu vysvětluje pozitivní efekt na krevní tlak a na spasmus dýchacích cest při astmatu a chronické pulmonární obstrukční nemoci. Inhibice migrace v důsledku ovlivnění aktinového cytoskeletu se terapeuticky uplatňuje v rakovinách (inhibice neoangiogeneze a metastazováníjfibrotických onemocněních různých systémů (systémové flbrosy typu sklerodermy, flbrosy např. jater, plic, ledvin) a etiologie (mj. idiopatická, chemoterapií a radioterapií indukovaná) ale i dalších nemocech, kde dochází k přestavbě tkáně, jako je astma a chronická obstrukční plicní nemoc. Kromě rakovin (včetně hepatocelulárního a plicního karcinomu, myelomu, melanomu, fibrosarkomu, karcinomu prsu, ledvin a prostaty) má inhibice ROCK dependentní přestavby aktinového cytoskeletu a následné migrace buněk pozitivních efekt i u dalších neovarkularizací jako je makulární degenerace, ROCK inhibice má také příznivý efekt v modelech myelomu, některých léukemií a myeloproliferativních onemocnění. V řadě onemocnění (např. retinální degenerace, diabetická retinopatie, odchlípení sítnice, neurotrauma, chronická obstrukční plicní nemoc, zánětlivá onemocnění střev, lupus, psoriasis) k příyniznivému efektu ROCK inhibitorů přispívá schopnost ovlivnit několika mechanismy zánětlivou reakci včetně neuroinflamace (inhibice NfkB, suprese exprese prozánětlivých cytokinů, inhibice migrace imunitních buněk, maturace imunitních buněk) a fibrotizaci tkáně (regulace diferenciace fibroblastových prekurzorů, regulace přežití myofibroblastů, regulace aktinového cytoskeletu migrujících fibroblastů a dalších buněk). ROCK kinasy se jeví jako bezpečný terapeutický cíl, přesto výhodné může být lokální podání, což je možné například u onemocnění kůže (korekce jizvení), oka (glaukom, makulární degenerace - zde je možné uvažovat o medikovaných inzertech), plic (asthma, chronické pulmonární obstrukční nemoci.) a pooperační restenóze cév (medikované stenty). Také v případě onemocnění střev včetně těch s fibrotickou složkou (Crohnova nemoc, ulcerativní kolitida) je výhodné omezit působení léčiv na místní tkáň.

Janusovy kinasy (JAK1, JAK2, JAK3) přenáší signály širokého spektra extracelulámích cytokinů (hormony, interleukiny a interferony), které se vážou na cytokinové receptory typu I a II. Patří mezi ně proinflamatorní IL-6, IL-12, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22 a IL-23 spolu s interferony. Aktivované JAK kinasy pak fosforylují a aktivují transkripění faktory z STÁT rodiny (signál transducers and activators of transcription). TNF signalizace je také zprostředkována JAK-STAT drahou za určitých podmínkek. Inhibice JAK-STAT dráhy má příznivý efekt na imunitní onemocnění jako je rheumatoidní arthritida, psoriatická arthritida, ankylosující spondylitida, colitida, ulcerativní colitida, Crohnova nemoc, psoriasa, lupus erythematosus, záněty povrchu oka, syndrom suchého oka, uveitida a alergická reakce. Brání také odmítnutí transplantátu (Ghoreschi et Gadina, 2015 doi: 10.111 l/exd.12265; 0'Shea et al., 2013 10.1136/annrheumdis-2012-202576). Jednoznačnou výhodou nízkomolekulárních inhibitorů JAK ve srovnání s biologiky, která cílí na jednotlivé cytokiny nebo cytokinové receptory, je schopnost ovlivnit signalizaci řízenou několika cytokiny. Na rozdíl od protilátek také mohou být podávány perorálně. Lokální aplikace je ale také možná, s výhodou ji je možné použít např. u onemocnění oka, kůže a dýchacího traktu. Jako bzvláště zajímavá se jeví možnost využít JAK inhibici v terapii vitiliga a alopecia areata. Inhibice JAK také příznivě ovlivňuje fibrotická onemocnění včetně myelofibros (jako je polycythemia vera, essentialní thrombocytosis a primární myelofibrosa) a chemoterapií indukovaných fibros. Probíhají klinické zkoušky testující JAK inhibitory v terapii nádorů žaludku, plic, pankreatu, jater, prsu, tlustého střeva, kolorekta a prostaty.

Zvýšená exprese nebo aktivita JNK kinas je spojována s neurologickými, srdečními, hepatobiliarními, dýchacími, fibrotickými, zánětlivými a autoimunitními onemocněními. JNK také hrají roli v patogenezi nádorových onemocnění. Nově bylo zjištěno, že dysregulace JNK hraje roli v proteinopatiích jako je amyotrofická laterální skleróza a frontotemporální demence. Zvýšená aktivita JNK kinas přispívá k patogenezi následujících onemocnění (Sabapatha et al., 2014 (doi: 10.1016/B978-0-12-396456-4.00013-4.), Reich et al„ 2012 10.1136/annrheumdis-2011 -200412, a Gehringer et al., (2015) (doi: 10.1517/13543776.2015.1039984): neurologická onemocnění (Alzheimerova nemoc, frontotemporální demence, Parkinsonova nemoc, polyglutaminová onemocnění, Pickova nemoc, demence různé etiologie, iktus, nemoc (demence) s argyrofilními zrny (AgD), amyotrofická laterální skleróza), kardiovaskulární onemocnění (srdeční selhání, aneurysma abdominalní aorty), hepatobiliarní onemocnění (chronická infekce HCV, akutní poškození jater, nealkoholická steatosa jater, fibróza jater), zánětlivá onemocnění (zánětlivé onemocnění střev, ulcerativní kolitida, Crohnova nemoc, asthma,rheumatoidní arthritida, lupus erythematosus, Behcetova nemoc, zánět po chirurgickém zákroku, uveitida, syndrom suchého oka), nádorová onemocnění (retinoblastom, nádory kolorekta, prsu a ovaria), metabolická onemocnění (obesita, diabetes 2. typu), fibrotická onemocnění (systémová fibrosa (scleroderma), fibrosy jater, plic a kůže) různé etiologie včetně chemoterapií indukované fibrózy.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu jsou 2,6-disubstitutované puriny obecného vzorce I

(I) ve kterém A je vazba nebo -Z-(CH2)m-; Z je vybrán z S, O, NH, CH2; m je celé číslo v rozmezí 0 až 2; D a E jsou nezávisle vybrány z H a R2, nebo dohromady tvoří cyklus a -D-E-je pak -X-(CH2)n-Y-, kde X a Y jsou nezávisle vybrány z S, O, NH, CH2, přičemž alespoň jeden z X a Y jsou S, O, nebo NH, a n je celé číslo v rozmezí 2 až 4, a přičemž ve skupině -(CH2)n- může popřípadě alespoň jeden vodík být nahrazen substituentem vybraným z halogenu, OH, 0(C1-C4)alkylu, hydroxy(Cl-C4)alkylu, SH, S(Cl-C4)alkylu, merkapto(Cl-C4)alkylu, NH2, NH(C1-C4)alkylu, N((Cl-C4)alkyl)2; R1 je vybráno ze skupiny zahrnující - halogen vybraný z F, Cl, Br, I; - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent; - heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkyl skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, a která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;

- R’-G kde G je vybráno ze skupiny-NH- a -N(C1-C8 alkyl), a R’je vybráno ze skupiny zahrnující C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl, popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy a amino substituent, s výhodou jedním hydroxy a/nebo jedním amino substituentem; (dialkylamino)alkyl skupinu, kde alkyl je vybrán nezávisle ze skupiny zahrnující Cl-CIO lineární nebo rozvětvený alkyl; - C3-C10 cykloalkyl, což znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 10 uhlíkových atomů, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent; - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkyl je popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent; - heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkyl alkyl skupina je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent; - benzylová skupina, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující fluoro, chloro, hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent; R2 může nebo nemusí být přítomen, a představuje jeden nebo více substituentů vázaných v libovolné poloze kruhu, nezávisle vybraných z =0, -OH, -C(0)-(CH2)p-0-(H nebo C1-C4 alkyl), kde p je celé číslo v rozmezí O až 4, aryl, arylalkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, -S(0)2-aryl, -C(0)-aryl, -C(0> heteroaryl, -C(0)-heteroeyklyl, přičemž aryl, arylalkyl, heteroaryl, heterocyklyl mohou být substituované jedním nebo více substituenty vybranými z halogenu, OH, 0(C1-C4) alkylu, hydroxy(C 1 -C4)alkylu, SH, S(Cl-C4)alkylu, merkapto(Cl-C4)alkylu, NH2, NH(C1-C4)alkylu, N((Cl-C4)alkyl)2, ve kterém aryl je C6-C10 skupina obsahující alespoň jedno aromatické jádro, a s výhodou je arylem fenyl nebo naftyl; arylalkyl je skupina obsahující C6-C10 skupinu obsahující alespoň jedno aromatické jádro a C1-C4 alkylen, a s výhodou je arylalkylem benzyl; heteroaryl je C5-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N, a s výhodou je heteroaryl vybrán ze skupiny zahrnující furan, thiofen, pyrrol, pyrrazol; heterocyklyl je C4-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N.

Vzorec 1 zahrnuje i farmaceuticky přijatelné soli látek nesoucích výše uvedené substituenty, zejména s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.

Ve výhodném provedení, jsou-li D a E oba H, je A propylenový můstek. S výhodou je alespoň jeden z X a Y vybrán z S, O, NH, výhodněji z S a O. S výhodou je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl vybrán ze skupiny zahrnující propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, heptyl, oktyl, a nonyl.

Ve výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný hydroxy skupinou vybrán ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethyl, 2(RS, R nebo S)-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, 4-hydroxybut-2(RS, R, nebo S)-yl, 2-hydroxy-2-methylpropyl, 3-hydroxy-3-methylbutyl, 2,3-dihydroxypropyl, l-hydroxy-3-methylbut-2-yl a (3RS)-2-hydroxypent-3-yl.

Ve výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný amino skupinou vybrán ze skupiny zahrnující 2-aminoethyl, 3-aminopropyi, 4-aminobutyl, 5-aminopentyl, 6-aminohexyl. V dalším výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný amino a hydroxy skupinou 3-amino-2-hydroxypropyl. S výhodou je (dialkylamino)alkyl skupina vybrána ze skupiny zahrnující (dimethylamino)methyl, 2-(dimethylamino)ethyl, 3-(dimethylamino)propyl, 3-(dimethyIamino)butyl, (diethylamino)methyl, 2-(diethylamino)ethyl, 3-(diethylamino)propyl a 4-(diethylamino)butyl.

Ve výhodném provedení je C3-C10 cykloalkyl vybrán ze skupiny zahrnující cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl a cyklohexyl.

Ve výhodném provedení je C3-C10 cykloalkyl substituovaný amino skupinou vybrán ze skupiny zahrnující trans-A-<xvc[ i n ocy k lo h exy 1, cw-4-aminocyklohexyI, c As , /n?/7,y - 4 - a m i n o cy k I o h e xy I, cis-2-aminocyklohexyl, /ra».v-2-aminocyklohexyl, cis,trans-2-aminocyklohexyl, 3-aminocyklohexyl a cis, /ra«,s-4-hydroxycy klohexy I. V dalším výhodném provedení je heterocykloalkyl vybrán ze skupiny zahrnující N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-1 -yl, 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl.

Substituovaný benzyl je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující 2-methoxybenzyl, 3-methoxybenzyl, 4-methoxybenzyl, 3,5-dimethoxybenzyl, 2,6-dimethoxybenzyl, 2,4,6-trimethoxybenzyl, 3,4,5-trimethoxybenzyl, 2-fluorbenzyl, 3-fluorbenzyl, 4-fluorbenzyl, 2-chlorbenzyl, 3-chlorbenzyl a 4-chlorbenzyl.

Ve výhodném provedení je heterocykloalkyl alkyl vybrán ze skupiny zahrnující (aziridin-1 -yljethy 1, (azetidin-l-yl)ethyl, (azolidin-1 -yljethyl, (piperidin-1 -yljethyl, (aziridin-] -yljpropyl, (azetidin-1-yljpropyl, (azolidin-1 -yljpropyl a (piperidin-l-yl)propyl. V případě, že sloučeniny podle předloženého vynálezu mají chirální centrum, vynález zahrnuje všechny opticky aktivní isomeiy, jejich směsi i racemáty. Tedy sloučeniny obecného vzorce I, nezávisle na (R) nebo (S) konfiguraci na chirálních centrech, jsou zahrnuty v tomto vynálezu. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I jsou vhodné pro použití jako léčiva. Týká se to zejména jejich použití v terapii onemocněni, kde inhibice jedne nebo více kinas vybraných z kinasových rodin ROCK (ROCK1, ROCK2), JAK (JAK1, JAK2, JAK3) a JNK (JNK1, JNK2, JNK3) vede k terapeutickému efektu.

Současná inhibice alespoň dvou kináz z rodin ROCK, JNK a JAK je zejména vhodná pro uplatnění v terapii fibróz, zánětlivých a neurodegerativních onemocnění i nádorových onemocnění. Příslušné signální dráhy hrají roli ve výše zmíněných onemocněních, přičemž jsou v podstatě nezávislé. Jejich současná farmakologická inhibice má synergický efekt. Látky podle předkládaného vynálezu, které inhibují alespoň dvě z těchto drah, je možné podávat v nižších koncentracích než lék inhibující jen dráhujednu. Látky podle předkládaného vynálezu jsou inhibitory kinas z rodin ROCK, JAK a/nebo JNK, a tedy jsou zejména vhodné pro léčbu chorob vybraných ze skupiny zahrnující choroby dýchacího systému, kardiovaskulárního systému, oka, střev, kůže a nervového systému, jejichž patologie zahrnuje abnormální migraci buněk, zánět nebo fibrózu, hepatobiliárních onemocnění, zánětlivých onemocnění, neovaskularizací, neurodegenerativních a metastatických nádorových onemocnění, onemocněních ve kterých hraje role vazokonstrikce nebo bronchokonstrikce.

Konkrétněji jsou látky podle předkládaného vynálezu vhodné pro léčbu systémové fibrosy, fibros jednotlivých orgánů, zejména jater, ledvin, plic a kůže, inyelofibrosy, fibrosy po rádio a chemoterapii, Crohnovy nemoci, kolitidy, ulcerativní kolitidy, Behcetovy nemoci, chronická obstrukční plicní nemoci, metastatického melanomu, zánětů po operačních výkonech, zánětu povrchu oka, uveitidy, retinitidy, makulární degenerace, syndromu suchého oka, alergické rhinitis, alergického asthmatu, asthmatu bronchiale, sclerosis multiplex, systémové sklerosy, chronické infekce HCV, akutního poškození jater, nealkoholické steatohepatitis, rheumatoidní arthritidy, psoriatické arthritidy, ankylosní spondylitidy, psoriasy, lupus erythematosus, alopecia areata, vitiliga, cerebrálního vazospazmu, amyotrofické laterální sklerózy, frontotemporální demence, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, polyglutaminových onemocnění, Pickovy nemoci, demencí, iktu, nemoci s argyrofilními zrny (AgD), srdečního selhání, aneurysmatu abdominalní aorty, retinoblastomu, nádorů kolorekta, prsu a ovaria, obesity, diabetů 2. typu, atherosclerosy, hypertensní nemoci, pulmonamí hypertense, erektilní dysfunkce, restenosy po vaskulární nebo srdeční chirurgii, benigní neoplasií, neovaskulámího glaukomu, diabetické retinopatie, okulární neovaskularizace, diabetické nefropatie, hemorhagické teleangiektasie, prevenci rejekce transplantátu, korekci jizvení kůže.

Vynález také zahrnuje farmaceutické přípravky obsahující 2,6-disubstitutované puriny obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelné nosiče.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou deriváty obecného vzorce I, které nesou substituent R1 vybraný ze skupiny zahrnující: N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-l-yl, 4-(2-hydroxethyljpiperazinyl, (R)-(2-hydroxymethylpyrrolidine-l-yl), ethylamino, propylamino, butylamino, (2-hydroxyethyl)amino, (3-hydroxypropyl)amino, 2(R)-hydroxypropyl]amino, 2(Sj-hydroxypropyljamino, 4-hydroxybut-2(R)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(S)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(R,S)-yl]amino, 2-(hydroxy-2-methyl)propyl]amino, (2,3-dihydroxypropyl)amino, (l-hydroxy-3-methylbutyljamino, [(R,S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(R)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(S)-(2-hydroxypent-3 -yl)] amino, (R)-[l-isopropyl-2-hydroxyethyI]amino, (S)-[l-isopropyl-2- hydroxyethyljamino, (2-aminoethyl)amino, (3-aminopropyl)amino, (4-aminobutyl)amino, (5-aminopentyljamino, (6-aminohexyl)amino, [3-amino-2-hydroxypropyl]amino, [1-(dimethylamino)methyl]amino, [2-(dimethylamino)ethyl]amino, [3-(dimethylamino)propyl]amino, [4-(dimethylaminojbutyljamino, [2-(diethylamino)ethyl]amino, [3-(diethylamino)propyl]amino, (aziridin- l-yl)ethylamino, (azolidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (piperidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-1 -yljethylamino, (azetidin-l-yl)propylamino, cyklopropylamino, cyklobutylamino, cyklopentylamino, cyklohexylamino, (c7.y-2-aminocyklohexyl)amino, {trans-2- aminocyklohexyljamino, (c/s,/ra«5-2-aminocyklohexyl)amino, (c7V/ra«s-3-aminocyklohexyl)amino, (/ra«s-4-aminocyklohexyl)amino, (c/V4-aminocyklohexyl)amino, {cis,trans-4- aminocyklohexyljamino, (c/.s-2-hydroxycyklohexy I jam i no, (/ra«.v-2-hydroxycyklohexyl)amino. (cw,/ra«s'-2-hydroxycyklohexyl)amino, (a'.v,/rí/rt.s-3-hydroxycyklohexyl)amino, {trans-4- hydroxycyklohexyljamino, (c«-4-hydroxycyklohexyl)amino, (cis, trans-4-hyároxycyk I oli exy I jam i n o, (2-methoxybenzyl)amino, (3-methoxybenzyl)amino, (4-methoxybenzyl)amino, (3,5-dimethoxybenzyljamino, (2,6-dimethoxybenzyljamino, (3,4,5-trimethoxybenzyljamino, (2,4,6-trimethoxybenzyljamino, (2-fluorbenzyl)amino, (3-fluorbenzyl)amino, (4-fluorbenzyl)amino, (2-chlorbenzyljamino, (3-chlorbenzyl)amino, (4-chlorbenzyl)amino, (2,4-dichlorbenzyljamino, (3,4,5-trichlorbenzyljamino.

Farmaceutické kompozice

Vhodné cesty pro aplikaci systémovou aplikaci jsou orální, inhalační, injekční (intravazální, intramuskulární, subkutanní), bukáiní, sublingualní a nasální. Lokální podání je možné ve formě očních a ušních kapek a mastí, ve formě vaginálních přípravků a rektálních čípků. Pro terapii onemocnění skalpu a kůže jsou výhodou lékovou formou roztoky, krémy a masti. V případě onemocnění oka může být vhodnou formou podání intravitreální injekce nebo medikovaný inzert. V případě onemocnění plic pak inhalační lékové formy. Vhodnou formou prevene restenosy po cévní nebo srdeční chirurgii je medikovaný stent. V případě onemocnění gastrointestinálního traktu je výhodné perorální nebo rektální podání.

Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.

Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy. Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofílizací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu. Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, beta-karotenu nebo 3,5-di-fórt-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kvselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C8 až Cj2 od Hůls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sesamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně. Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.

Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.

Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulosové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxy methylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát hořečnatý a/nebo vápenatý, polyethylen glykol nebo jeho deriváty. Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční štávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulosových preparátů jako acetylcelulosaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulosaftalát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátorv. V měkkých tobolkách ie aWtivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahyjako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylen glykol ěi estery mastných kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, přičemž je také možno přidá, stabilizátory a detergenty „apř. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.

Další formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují akttvní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně „kolo 10 % nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, „apř. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce Farmaceutické přípravky, které mohou by, používány rektálně, jsou „apř. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafinové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy. Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující vtskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofilizátu spoleěně s excipienty kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity „apř. i pro infůzní roztoky

Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbová či benzoová.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří zejména uhlovodíky, např. vazelína, parafinový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloněeniny jako mastné alkoholy a jejich esteiy, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody

Emnlgatory JSOU odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estety mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou „apř. smáěedla jako polyalkoholy, „apř. glycerol, propylen glykol, sorbitol a/nebo polyethylen glykol, „ebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bází hlavné uhlovodíky, „apř. parafín, vazelínu nebo parafinový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin „ebo, s výhodou, hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo olej z podzemnice olejné, a dále částečné glycerolové es.eiy mastných kyselin, „apř. glycerol mono- a/nebo distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátoiy a/nebo aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50% vody. Používané olejové báze jsou zejména mastné alkoholy, např. lautyl, cetyl nebo staryl alkoholv. mastné i™„ii„„ palmitová nebo stearová kyselina, kapalné a pevné vosky, například isopropyl myristát, lanolin nebo včelí vosk, a/nebo uhlovodíky, například vazelína (petrolátum) nebo parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. estery polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery (Tween), dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátoiy, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.

Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci, Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako polyhalogenované alkany, napr. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N20 či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou používána aditiva tam zmíněná.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování, jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.

Tento vynález dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku a mohou to být látky pevne, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.

Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství, které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0,5 až 2 g.

Objasnění výkresů

Obrázek I ukazuje vliv látek na fosforylaci MLC2 v liniích A375 (a), A2058 (b) a HT1080 (c). Intenzita signálu odpovídající MLC2 a pMLC2 (Thrl8/Serl9) na membráně po SDS-PAGE a imunoblotu byla hodnocena denzitometricky.

Obrázek 2 ukazuje vliv látek na stav aktinového cytoskeletu a morfologii buněk BJ. Aktin byl vizualizován pomoci falloidinu značeného F1TC. Zvětšení lOx. Kontrolní buňky (a), s látkami 30 (b), 65 (c), 66 (d). Příklady provedení vynálezu

Vynález je popsán pomocí následujících příkladů, které ovšem nijak neomezují jeho rozsah.

Body tam byly stanoveny na Kofflerově bloku a nebyly korigovány. Všechny reagencie byly ze standardních komerčních zdrojů a analytické čistoty. Tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na hliníkových destičkách se silikagelem F254 od fy Merck. Skvrny byly vizualízovány pod UV svetlem (254 nm). Elementární analýzy (C, Η, N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo Finnigan). Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) byla prováděna na Beckman Gold systému. Vzorky jednotlivých látek byly pro HPLC analýzu rozpuštěny v methanolu a nastriknuty na kolonu LiChroCARD 250 x 4 mm s náplní Purospher RP-18e, 5 pm (Merck) a eluovány isokraticky mobilní fází sestávající z methanolu (HPLC grade) a AcOH/AcONH4 pufru (pH = 3,4; 40 mM; s přídavkem 5 % (v/v) MeOH) ve vhodném poměru (v/v) při průtoku 0,5 ml/min, není-h uvedeno jinak. Eluované látky byly detekovány UV detektorem při 200 - 300 nm. NMR spektra (σ PPm;J’ Hz) by|a měřena na Přístroji Bruker Avance AV 300 při teplotě 300 K a frekvenci 300,13 MHz (1H), respektive 75,48 MHz (13C) nebo JEOL ECA-500 spektrometr pracující při frekvencích 500,16 MHz (*H) a 125,76 MHz (13C) při 25 °C za použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu. Hmotnostní spektra byla měřena za použití přímého nástřiku na Waters Micromass ZMD 2000 hmotovém spektrometru (con voltage 20 V), ionizace elektrosprejem. Vzorky pro MS měření byly rozpuštěny v methanolu okyseleném kyselinou mravenčí (5 kapek HCOOH / 100 ml methanolu). Jako stacionární fáze pro sloupcovou chromatografii sloužil silikagel PharmPrep 60 CC (40-63 pm) nebo silikagel Kieselgel 60 (zrnitost 230-400) (Merck). Všechny sloučeniny vykázaly uspokojivé elementární analýzy (< 0,4 %). Příklad 1 Syntéza 2-chlor-6-(azepan-l-yl)-9//-purínu (62) 2,6-Dichlor-9//-purm (2 g, 10,582 mmol) byl refluxován s azepanem (1,154 g, 11,6402 mmoi, 1,399 ml) a triethylaminem (Et3N, 4,283 g, 42,328 mmol, 5,9 ml) v 40 ml PrOH při teplotě 100 "C po dobu 4 hodin. Výsledná směs byla ochlazena na pokojovou teplotu, vznikl pevný produkt, který byl zfiltrován, intenzivně promyt ledovým PrOH a následně ledovou vodou a sušen v sušárně při 50 °C. Výtežek reakce byl 2,0851 g látky 62, což odpovídá 78,28 ·/. teoretického výtěžku. Syntéza látky 62

byla uspesna, což se potvrdilo NMR spektrem. Bod tání byl stanoven na 248,3 - 249,1 »C, 'H NMR (300 MHz, DMSO-rfs) δ ppm: 1,45 (4H), 1,73 (4H), 3,31 (1H), 3,73 (2H), 4,285 (2H), 806 (IH) 13,07 (1H).

Schéma syntézy 62 Přiklad 2 Syntéza 2-(2-aminoethylamino)-6-(azepan-l-yl)-9tf-purinu (64) 2-Chlor-6-(azepan-1 -yl)-9//-purin (62) (0,5 g, 1,986 tnmol) byl umístěn do tlakové zkumavky s ethandtaminem (4,464 g, 74,2764 mmol, 4,96 ml) po dobu 3 hodin při teplotě 165 "C. Poté byla směs zchlazena na laboratorní teplotu, zahuštěna pod vakuem. Vzniklá sraženina byla rozpuštěna ve studené vodě a rektystalována. Výtěžek reakce byl 0,5258 g látky G, odpovídající 96,16 % teoretického výtěžku. Bod 176,9 - 179,3 C. H NMR (300 MHz, l.)MSO-,7v δ ppm: 1,44 (4H), 1,71 (4H), 2,63 (1H), 3,176 (2H), 3,72 (1H), 4,21 (IH), 6,075 (1H), 7,59 (1H).

syntézy 64 Přiklad 3 Syntéza 2-[(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-ethyl-6-(azepan-l-yl)-9//-purinu (146)

NaHC03 (91,534 mg, 1,0896 mmol, 3x v nadbytku) byl rozptýlen v MeOH, do roztoku byl přidán 2-(2-ammoethylamino)-6-(azepan-l-yl)-9//-purin (64) (100 mg, 0,3632 mmol). Následně byl do směsi pndan NBD-C1 (108,71 mg, 0,5448 mmol) rozptýlený v MeOH. Reakění směs ponechána reagovat při 50 oC po dobu 1 hodiny. Po odreagování výchozí látky přidávána 1M HC1 až do vytvoření hnědých krvstalů fnH zl_^X \lár.L4----:__i___i . , „ ........ 56,291 % teoretického výtěžku. Látka 146 byla připravena a její struktura potvrzena pomocí NMR. Následně bylo při stanovení bodu tání zjištěno, že látka taje za rozkladu, a to při teplotě 240,6 °C. ]H NMR (300 MHz, DMSCM) δ ppm: 1,43 (5H), 1,70 (5H), 3,58 (5H), 4,23 (2H), 6,43 (2H), 7,66 (1H), 8,56 (1H), 9,59 (1H), 12,19 (1H).

Schéma syntézy 146 Přiklad 4 Syntéza 2-hydroxyethylamino-6-(azepan-l-yl)-9//-purinu (65) 2-Chlor-6-(azepan-l-yl)-<W-purin (62) (0,5 g, 1,986 mmol) reagoval v tlakové zkumavce s ethanolammem (4,54 g, 74,345 mmol, 4,486 ml) po dobu 3 hodin při teploté 165 ”C. Poté byla směs zchlazena na laboratorní teplotu a došlo ke vzniku sraženiny. Vzniklá sraženina byla rekrystalována ve vodě. Výtezek reakce byl 326,4 mg látky 65, což odpovídá 56,4 % teoretického výtěžku. Struktura připravené látky byla potvrzena pomocí NMR spektra. Pomocí bodotávku bylo zjištěno, že připravená látka taje za rozkladu při dosažení teploty 211,6 Χ.Ή NMR (300 MHz, DMSO-rf,) δ ppm: 1,44 (6H), 1.70 (6H), 3,26 (3H), 3,32 (1H), 3,49 (3H), 3,71 (2H), 4,22 (2H), 4,64 (1H), 5,95 (IH), 7,6 (1H)’ 12,12 (1H).

Schéma syntézy 65 Příklad 5 Příprava 2-dimethylamino-6-(azepan-1 -yljpurinu (63) 2-Chlor-6-(azepan-1 -yljpurin (62, příklad 1) (210 mg; 0,83 mmol) byl rozpuštěn v 50% roztoku dimethylaminu a methanolu (3 ml). Roztok byl zahříván 16 li při 60 X a 4 h při 115 X, Po ochlazení byla reakční směs vložena na 3 h do lednice. Zreakění směsi vyktystalovává produkt v podobě jehlieovitých krystalů. Krystaly byly odfiltrovány a na fritě několikrát promyty methanolem (celkem 13 ml) a destilovanou vodou (celkem 30 ml). Tento první podíl produktu byl sušen v exikátoru s PA dva dny. Výtěžek (1): 113 mg; 52 %. T. t.: 237-238X (od 200 X sublimace). HPLC R, = 11,2 min (80 % CHjOH + 20 % pufr); UV (80 % CH3OH + 20 % pufr) λ,ΜΧ 245 nm, λ,™ 277 nm, λ,ΜΧ 291 nm. MS ESI+ (CV 17) m/z (rel. %): 261 [M+H]+ (100), ESI' (CV 23) m/z (rel. %): 259 [M]' (100). Příklad 6 Příprava 2-(3-hydroxypropylamino)-6-(azepan-l-yl)purinu (66) 2-Chlor-6-(azepan-l-yl)purin (62, příklad 1) (217 mg; 0,86 mmol) byl rozpuštěn v 3-aminopropyl-l-°lu (2 m1)· Roztok byl zahříván 26 h při 115 °C a 4 h při 160 °C. Po ochlazení byla reakční směs vložena na 2 týdny do lednice. Z reakční směsi vykrystalovává produkt v podobě hrudek. Krystaly (podíl 1 produktu) byly odfiltrovány, na fritě rozmělněny a několikrát důkladně promyty destilovanou vodou (celkem 15 ml). Z filtrátu zředěného destilovanou vodou při promývání a umístěného 1 den v lednici byl získán podíl II produktu., Po vysušení v exikátoru s P205 byl celkový výtěžek surového produktu (podíly I + II) 225 mg, 90 %. Surový produkt byl krystalován z ethanolu (20 ml). Bílá vatovitá látka. Výtěžek po krystalizací 153 mg; 61 %. T. t: 226-230T (od 200 °C sublimace). HPLC Rt = 5,1 min (75 % CH3OH + 25 % pufr), Rt = 6,4 min (60 % CH3OH + 40 % pufr); UV (75 % CH3OH + 25 % pufr) 239 nm, λ,™ 251 nm, Xmx 259 nm, λπιπι 275 nm, λΙΜΧ 290 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %): 291 [M+Hf (100), ESP (CV 22) m/z (rel. %): 289 [M]" (100). Příklad 7 Příprava 2-(morfolin-4-yl)-6-(azepan-l-yl)purinu (67) 2-Chlor-6-(azepan-l-yl)purin (62, příklad 1) (209 mg; 0,83 mmol) byl rozpuštěn vmorfolinu (2 ml). Roztok byl zahříván 14 h při 60 °C a 5 h při 115 °C. Po ochlazení byla reakční směs vložena do dalšího dne do lednice. Z reakční směsi vykrystalovává sádrovitý produkt. Produkt byl odfiltrován, na fritě několikrát důkladně promyt methanolem (celkem 10 ml) a vysušen v exikátoru s P205. Bílá sádrovitá látka. Výtěžek 221 mg; 88 %. T. t: 242-244°C (od 200 °C sublimace). HPLC Rt = 13,3 min (75 % CH3OH + 25 % pufr), Rt = 10,6 min (80 % CH3OH + 20 % pufr); UV (80 % CH3OH + 20 % pufr) I,rax 245 nm, λ,™ 275 nm, ληΐ3Χ 290 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %): 303 [M+H]+ (100); ESP (CV 23) m/z (rel. %): 301 [Μ]" (100). Příklad 8 Příprava 2-(l-hydroxymethylpropylamino)-6-(azepan-l-yl)purinu (68) 2-Chlor-6-(azepan-l-yl)purin (62, příklad 1) (216 mg; 0,86 mmol) byl rozpuštěn v 2-aminobut-l-olu (2 ml). Roztok byl zahříván 20 h při 115 °C a 19 h při 160 °C. Po ochlazení byl produkt vysrážen z reakční směsi destilovanou vodou (40 ml). Suspenze byla vložena přes noc do lednice. Mlékovitá sraženina produktu byla odfiltrována, na fritě několikrát důkladně promyta destilovanou vodou (20 ml) a vysušena v exikátoru s P205. Bílá sádrovitá látka. Výtěžek 251 mg; 96 %. T. t.: 185-188T. HPLC Rt = 7,8 min (65 % CH3OH + 35 % pufr); UV (65 % CH3OH + 35 % pufr) Ju 240 nm, λι11ιη 250 nm, λ,ΜΧ 261 nm, λιηπι 276 nm, λ,η3Χ 290 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %): 305 [M+H]+ (100); ESI" (CV 23) m/z (rel. %): 303 [M]' (100). Příklad 9 Příprava 2-chlor-6-(4-piperidon-1 -yl)purinu (8) 2,6-DichIorpurin (510 mg; 2,7 mmol) byl rozpuštěn v 2-propanolu (8 ml), přidán triethylamin (0,84 ml; 6,0 mmol) a 4-piperidon hydrochlorid monohydrát (502 mg; 3,3 mmol). Roztok byl zahříván 2 h při 60 °C. Po ochlazeni bylo pH reakční směsi upraveno kyselinou octovou (15 kapek) na pH - 6. Suspenze byla uložena přes noc do lednice. Sraženina produktu byla odfiltrována, na fritě několikrát důkladné promyta 2-propanolem (4,0 ml) a destilovanou vodou (10 ml) a vysušena v exikátoru s P2Os. Bílá sádrovitá látka. Výtěžek 514 mg; 76 %. T. t.: 283-286T. HPLC R, = 7,7 min (pik roztažený, R, = 5,6 - 9,0 min) (60 % CH,OH + 40 % pufr); U V (60 % CHjOH + 40 % pufr) U 238 nm, λ,„„ 278 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rek %): 252 [M+Hf (44), 254 [M+H]* (18), 284 [M+CH3OH+H]* (96), 286 [M+CHjOH+Hf (34), 306 [M+CH3OH+Naf (100), 308 [M+CH,OH+Na]* (33); ESP (CV 19) m/z (rek %); 250 [M] (100), 252 [M]’ (34), 282 [Μ+ΟΗ,ΟΗ]' (42), 284 [M+CHrOH]' (16). Ή NMR (500 MHz, DMSO-rf6): δ 2.47- 2.50 (m, 4H); 4.39 (bs, 4H); 8.16 (s, 1H); 13.22 (bs, 1H); IJC NMR (125 MHz, DMSO-<76): δ 40.3, 43.5 (bs), 118.0, 139.1, 152.4, 152.6, 153.3,207.1. Příklad 10 Příprava 2-chlor-6-(l,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]dekan-8-yl)purinu (18) 2,6-Dichlorpurin (206 mg; 1,1 mmol) byl rozpuštěn v 2-propanolu (3,0 ml), přidán triethylamin (0,23 ml; 1,6 mmol) a l,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]dekan (0,17 ml; 1,3 mmol). Roztok, kteiý záhy přešel v suspenzi, byl zahříván 1,5 h při 65 X. Po „chlazení bylo pH reakěnl směsi upraveno kyselinou octovou (10 kapek) na pH = 7. Suspenze byla uložena přes noc do lednice. Sraženina produktu byla odfiltrována, na fritě několikrát důkladně promyta 2-propanolem a destilovanou vodou a vysušena v exikátoru s NaOH. Bílá sádrovitá látka. Výtěžek 280 mg; 87 %. T. t.: 275-278T. HPLC R, = 16 9 min (60 % CH,OH + 40 % pufr); UV (60 % CH,OH + 40 % pufr) U 238 nm, λ_ 278 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rek %): 296 [M+H]* (74), 298 [M+HJ+ (27), 318 [M+Na]+ (100), 352 [M+Na]‘ (38); ESP (CV 19) m/z (rek %): 294 [Μ]' (100), 296 [M]‘ (31). Ή NMR (500 MHz, DMSO-rf6): δ 1.70-1.72 (m, 4H); 3.93 (s, 4H); 4.24 (bs, 4H); 8.08 (s, 1H); 13.07 (bs, IH); nC NMR (125 MHz, DMSO-r*): δ 34.6, 42.8 (bs), 63.8, 106.2, 117.7, 138.7, 152.4, 152.6, 153.0. Příklad 11 Příprava 2-(2-hydroxyethylamino)-6-(l,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]dekan-8-yl)purinu (19) 2-ChIor-6-(l,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]dekan-8-yl)purin (příklad 10) (143 mg; 0,49 mmol) byl rozpuštěn v ethanolaminu (1,5 ml). Roztok byl zahříván 25 h při 147 °C. Po ochlazení byla reakční směs vložena na týden do lednice. Z reakční směsi vykiystaloval sádrovitý produkt. Produkt byl odfiltrován, na fritě několikrát důkladně promyt vychlazeným 2-propanolem (celkem 10 ml) a destilovanou vodou (celkem 10 ml) a vysušen v exikátoru s P205. Bílá sádrovitá látka. Výtěžek 120 mg; 78 %. T. t.: 246-248°C. HPLC Rt = 5,4 min (60 % CH3OH + 40 % pufr), Rt = 6,9 min (50 % CH3OH + 50 % pufr); UV (50 % CH3OH + 50 % pufr) λ™χ 238 nm, λ™, 251 nm, X,rax 255 nm, ληιιη 273 nm, λ,^ 291 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %): 321 [M+H]+ (100); ESP (CV 19) m/z (rek %): 319 [Mf (100). JH NMR Í500 MHz. f * * * DMS(M): δ 1.62-1.64 (m, 4H); 3.27 (q, J= 6.11 Hz, 2H); 3.49 (U= 6.11 Hz, 2H); 3.91 (s, 4H); 4.18 (bs, 4H); 4.63 (bs, 1H); 6.08 (bt, J= 5.81 Hz, 1H); 7.66 (s, 1H); 12.26 (bs, 1H); l3C NMR (125 MHz, DMSO-(i6): δ 34.7, 42.4, 43.8, 60.3, 63.7, 106.6, 113.2, 134.6, 153.1, 153.7, 158.8. Příklad 12 Příprava 2-chlor-6-(l,4-dithia-8-azaspiro[4.5]dekan-8-yl)purinu (28) 2-Chlor-6-(4-piperidon-1 -yl)purin (8, příklad 9) (215 mg; 1,0 mraol) byl suspendován v toluenu (10,0 ml), přidán ethandithiol (0,11 ml; 1,3 mmol) a monohydrát kyseliny ^-toluensulfonové (198 mg; 1,0 mmol). Reakční směs byla zahřívána 3 h 40 min při 90 °C. Po ochlazení byla reakční směs vložena pres noc do lednice. Z reakční směsi vykrystaloval sádrovitý produkt. Produkt byl odfiltrován, na fritě několikrát důkladně promyt vychlazeným toluenem (celkem 10,0 ml), 2-propanolem (celkem 2,5 ml) a destilovanou vodou (celkem 5 ml) a vysušen v exikátoru s P205. Výtěžek surového produktu 207 mg; 63 %. Surový produkt byl kiystalován zethanolu. Bílý prášek. T. t.: 283-286T (tání předchází sublimace, tam za rozkladu). HPLC Rt = 16,7 min (80 % CH3OH + 20 % pufr); UV (80 % CH3OH + 20 % pufr) λπ,ΐη 238 nm, λ,ΜΧ 280 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %): 328 [M+H]+ (100), 330 [M+H]+ (48), 350 [M+Na]+ (97), 352 [M+Na]+ (46); ESP (CV 19) m/z (rel. %): 326 [M]‘ (100), 328 [M]' (42). H NMR (500 MHz, DMSCM): δ 2.09-2.12 (m, 4H); 3.34 (s, 4H); 4.24 (bs, 4H); 8.12 (s, 1H); 13.17 (bs, 1H); C NMR (125 MHz, DMSCM): δ 37.9, 41.2, 44.6 (bs), 66.2, 117.7, 138.7, 152 3 152 6 153.0. Přiklad 13 Příprava 2-(2-hydroxyethylamino)-6-(l,4-dithia-8-azaspiro[4.5]dekan-8-yl)purinu (30) 2-Chlor-6-(l,4-dithia-8-azaspiro[4.5]dekan-8-yl)purin (28, příklad 12) (137 mg; 0,42 mmol) byl byl rozpuštěn v ethanolaminu (1,3 ml). Roztok byl zahříván 19 h při 149 °C. Po ochlazení byl produkt vysrážen z reakční směsi destilovanou vodou (10 ml). Suspenze byla vložena přes noc do lednice. Mlékovitá sraženina produktu byla odfiltrována, na fritě několikrát důkladně promyta destilovanou vodou (celkem 10 ml) a vysušena v exikátoru s P205. Výtěžek surového produktu 134 mg; 91 %. Surový produkt byl krystalován z ethanolu. Bílá sádrovitá látka. T. t.: 222-224°C. HPLC R, = 6 3 min (80 % CH3OH + 20 % pufr), Rt - 8,5 min (70 % CH3OH + 30 % pufr); UV (80 % CH3OH + 20 % pufr) Xmax 239 nm, λ,™ 272 nm, žmax 294 nm. MS ESI+ (CV 18) m/z (rel. %); 353 [M+H]+ (100), 375 [M+Na]+ (15); ESP (CV 21) m/z (rel. %): 351 [M]' (100). ‘H NMR (500 MHz, DMS(M): δ 2.03- 2.05 (m, 4H); 3.28 (q, J = 6.11 Hz, 2H); 3.33 (s, 4H); 3.49 (app. bt, 2H); 4.20 (bs, 4H); 4.62 (bs, 1H); 6.10 (bt, J = 5.81 Hz, 1H); 7.66 (s, 1H); 12.27 (bs, 1H); l3CNMR(125 MHz, DMSO-4): δ 37.8, 41.4, 43.8,44.3,60.3,66.7, 113.2, 134.7,153.0, 153.7, 158.7.

Tabulka 1: Látky připravené podle metod popsaných v příkladech 1 až 13.

* pokud má fragment A více členů, je prvni uvedený atom ve struktuře umístěn blíže atomu ' dusíku vázanému na purin

a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH b) roztok: MeOH p.a. + H20 + NH3 Příklad 14 Hodnocení inhibice ROCK kinasy in vitro

Schopnost látek inhibovat rekombinantní ROCK2 byla hodnocena v testu založeném na sledování inhibice inkorporace 33P pocházejícího z ATP do oligopeptidu LRRWSLG odpovídajícímu části peptidove sekvence rozpoznávané ROCK2. Do jednotlivých jamek 96 jamkové desky bylo přidáno 2 11 ; 0"“n,r0Vané “ iá'ky’ ' 1,1 r°Zt0kU ««zy™. (Proqinase) I pl Γ7 S Ir"" “ “ ' V°dy' ““ ^ ~ * - reakčního

pufru obsahujícího [+ PjATP. Deska byla Inknbována 50 minn, v temtobloku nastaveném „a 37 T O e by,a reakce zastavena přidáním 5 p, 3·/. kyseliny „rthofosforeéné. 5 p, reakéní smési z každé Z ™T° "a,fosfocel“,ózový papír·kte*byi po,é op,áchnu·%% ^a ^y AE.PR.2023 s citlivou deskou. Ta byla po ,6 hodinách skenována v přístroji ,mage Reader Ba,l800 softwarem BAS-,800. Intenzita signálu byla odeétena v programu Aida „nage Analyzer odnoty ,C50 byly vypočteny z dávkových křivek pro ,0 koncentrací inhibitoru. Maximální testovaná ncen race by a obvykle ,0 nebo 50 pmol/litr, „ásledujicí koncentrace byla polovični oproti centraci předchozí. Experiment byl opakován alespoň 3 krát.

Složení pufrů bylo následující:

Reakční pufr (2x). 1 ml 2x kinasového pufru + 30 μΐ 1 mM ATP + 05 [γ-33Ρ]ΑΤΡ Ε^ΓοΓ,οΤ20^:1::4m,0'5mO,/,HePeSpH7’4 + “’2m,2™o^gC.2 + 0,4ml0,25mo,/, Výsledky jsou shrnuj v tabulce 2. Z výsledků je patnté, že testované látky efektivně inhibuji ROCK2

kinasu in vitro. J

Tabulka 2: Hodnocení inhibice ROCK kinasy in viso. Hodnoty jsou uvedeny v pmol/l

Příklad 15 Hodnocení inhibice kinas in vitro K určení zbytkové aktivity po aplikaci 50 mikromolárního roztoku látky v DMSO byl použit systém inomescan (Discoverx). Rekombinantní kmasy značené DMAjsou vázaný „a imobLovaný £ okud testovaná látka naimší vazbu, dojde k uvolnění kinasy. Její množství v eluátu je pak stanoveno pomoci RT-PCR. Každý experiment by, proveden v duplikátu. Výsledky shrnuje Tab 3 es „vane ,a,ky významně inhibuji kinasy z ROCK, JNK a JAK rodin (tučně), přičemž schopnost mhibovat dalších 52 kmas reprezentujících lidský kinom je podstatné nižší.

Tabulka 3: Hodnocení inhibice ROCK, JNK, JAK a dalších kinas in vitro.

Příklad 16 Hodnocení toxicity

Resazurin (7-Hydroxy-3//-phenoxazin-3-one 10-oxide) je modrá slabě fluorescentní látka, která je mitochondiremi ireverzibilne redukována na červený vysoce fluorescentní resofurin. Používá se proto k hodnocení viability bakteriálních i eukaryotických buněk. V testu byl sledován vliv 72 hodinového působení několika koncentrací látek (trojnásobná ředící řada, maximální koncentrace = 50 mikroM) na viabihtu kožních fibroblastů BJ , keratinocytů HaCaT a buněk sítnice ARPE-19. 5000 buněk bylo vyseto do jednotlivých jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky 24 hodin před přidáním testovaných látek. Jako negativní kontrola bylo použito DMSO vehículum. Po 72 hodinovém působení byl přidán roztok lOOOx koncentrovaný roztok resazurin v DMSO do konečné koncentrace 100 microM. Fluorescence byla měřena po 1 hodinové (ARPE-19) případně 3 hodinové (HaCaT a BJ) inkubaci Hodnoty IC50 byly vypočteny z dávkových křivek pomocí programu v jazyce R využívajícího knihovnu drc. Výsledky ukazuje tabulka 4. Látky v testovaném koncentračním rozmezí nevykazují významnou toxicitu proti nenádorovým buňkám kůže a oka.

Tabulka 4: Hodnocení toxicity „a buněčných liniích. Hodno* IC5(I jsou „vedeny v pm„l/|.

Příklad 17 Hodnocení inhibice ROCK kinas v buňkách

Jednta z cílu ROCK kinas v buňce je MLC2. MLC2 fosforovaná „a Thrlg a SeH9 reguíuje s,av a bnoveho cytoskeletu a v důsledku ,oh„ i ívar a pohyb buněk. Sledování vlivu íátek „a fosfore! . POm;CI ,m"n0de,ekCe P° SDS-PA0E a — ™ přenosu bylo použito k průkazu jejich sc opnost, d hn0"t efektivm. koncen(race vbu.k.ch ^ tatroia ^ ^ ^ ^ K k'naS Y'27632 3 faSUdil· Použi,y W lini® A375m2, A2058, HT1080. Linie byly kultivovaný v Du,becc„-s Modified Eagle Mediu. (Sigma, D6429) „bsahujícícm ,0% fatální hovili igma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37°C, 5% C02, absolutní vlhkost 7 "! P° 24 h°din0Vém PŮS°bení 'á,ek ('° W lyžovány v ledovém lyzaěním 391)1 PIA Γ" X''00 V TnS PUfrU S 0bSalKm il,hib't0rŮ Pr°KaS /SerVa’ 20384-07/ a fosfatas/Serva, 3905 .0,/). Buněčné lyzáty byly rozděleny pomocí ,0% SDS-PAGE, přeneseny „a nitrocelulézovou membránu (AmershamTM Pro,„„TM 0,45pm NC nitrocellulose blotting membranes od GE Healthcare L.fe science, ,0600002, pomoc, imunoblotingu. Aby se předešlo nespecíHcké vazbě pro i ate , membrány byly mkubovény I hodinu při laboratorní teplotě v Tris pufru obsahujícím 4 % bovinmho sérového albuminu (BSA) (Sigma, A7030) a ,% „d,„čněného sušeného mléka. Poté byly mem raný mkubovany pres noe při 4°C s primární protilátkou (MLC2 Cell Signaling - katalog, číslo ne o pMLC2 Thrl8/Serl9 Cell Signaling katalog, číslo 3674) v TTBS (1% roztok BSA v Tris pufru s obsahem 0.1 % Tween20). Po inkubaci byly membrány důkladně opláchnuty v TTBS a mkubovany , h za pokojové teplo* se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidasou (rabbtt ant,-mouše ant.body od Abcam, ab97046 nebo goat anti-rabbi, antibody od Santa Cruz Btotechnology, sc-2030). Po důkladném „plachu TTBS byla provedena detekce pomocí substrátu s o sa em lummolu. Detekce signálu byla provedena pomocí přístroje LAS-1000 Single System (Fujifílm, TokvO. JřlDříflV Dpn'7itntriiafi*;í'»k,; i,,. *

ImageJ software (http://rsbwcb.nih.go v/ii/ft Výsledky jsou zobrazeny na obr. 1. Experimenty prokázaly, že testované látky dosahují v živých buňkách koncentrací schopných inhibovat ROCK kinasy. Příklad 18 Vliv na stav aktinového cytoskeletu a morfologii fibroblastů

Společným rysem fibrotických onemocnění je reorganizace aktinového cytoskeletu zúčastněných buněk včetně fibroblastů podmíněná aktivací ROCK kinas. Látky inhibující přestavbu aktinového cytoskeletu včetně ROCK inhibitorů mají terapeutických efekt v modelech fibrotických onemocnění. Ke sledování schopnosti látek ovlivnit stav aktinového cytoskeletu byly vybrány fibroblasty BJ. Linie byla kultivovány v Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Sigma, D6429) obsahujícícm 10% fetální bovinní sérum (Sigma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37°C, 5% C02, absolutní vlhkost vzduchu). Efekt látek (100 pmol/l) na cytoskelet BJ, které byly vysety v nízké koncentraci (3000 buněk na jamku 96-jamkové destičky, otrava 24 hodin po nasazení) byl hodnocen po 24 hodinách po obarvení aktinu TRITC-faloidninem ve fluorescenčním mikroskopu. Výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 2a, 2b, 2c a 2d. Testované látky ovlivňují stav aktinového cytoskeletu a morfologii fibroblastů mají proto potenciál ovlinit fibrotická onemocnění. Příklad 19 Hodnocení vlivu na ROCK na migraci a invazivitu buněk

Schopnost vybraných inhibitorů (3625, 4686) ovlivňovat invazivitu buněk byla hodnocena v testu založeném na sledování schopnosti buněk pronikat do kolagenní matrix. Z počtu buněk v jednotlivých vrstvách (hloubkách ostrosti) byl po 72 hodinách vypočten index invazivity. Použity byly buňky A375m2 a A2058 (melanom), které se používají jako model ROCK dependentní migrace, a linie HT1080, která migruje ROCK nezávislým způsobem. Jako srovnávací látka byl použit klinicky používaný ROCK inhibitor fasudil. Jako kontrola sloužilo DMSO vehikulum.

Linie byly kultivovány v DuIbecco’s Modified Eagle Medium (Sigma, D6429) obsahujícícm 10% fetální bovinní sérum (Sigma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37°C, 5% C02, absolutní vlhkost vzduchu). Testování invazivity bylo provedeno v Ibidi 15μ-Slide Angiogenesis plates (ibidi, 81506), kdy do každé komůrky bylo naneseno v 10 μΐ krysího kolagenu (lmg/ml) obsahujícího testované látky (10 μιηοΐ/ΐ), fasudil (10 μιτιοΐ/ΐ) nebo DMSO vehikulum. Na zatuhlý kolagen bylo vyseto 1000 buněk 50μ1 kultivačního média obsahujícího testované látky (10 pmol/I). Po 8 hodinách bylo toto médium nahrazeno za médium bez séra obsahující stejnou koncentraci testovaných látek. Po 72 hodinách po vysazení byly buňky vyfotografovány v různých hloubkách kolagenního gelu (0, 10, 20, 30, 40, 50 pm) pomocí Nikon-Eclipse TE2000-S (20x/0.40 HMC objektiv). V každém ze tří nezávislých opakování experimentu byly pro jednotlivé látky i kontrolu hodnoceny 3 jamky a pro každou jamku 6 náhodně vybraných nepřektývajících se zorných polí. Index invazivity byl vypočten podle následujícího vzorce: sum(počet buněk v jednotlivých vrstvách * číslo vrstvy)/celkový počet buněk) a normalizován vzhledem ke kontrole. Statistická významost (p<0.05) byla vyhodnocena pomocí ANOVA a Tukeyho testu v R. Nové inhibitory a srovnávací látka fasudil v koncentraci 10 pmol/l statisticky významně snižovaly schopnost migrovat a invadovat oproti kontrole v případě améboidních linií A375m2 a A2058. Aktivita nových látek a komerčního inhibitorů byla srovnatelná. Efekt na migraci nebyl pozorován v případě mezenchymální linie HT1080. Pozorovaný efekt na linie améboidní, ale ne na mezenchymální linii je v souladu s inhibicí ROCK kinas v buňkách (tabulka 5, 6, 7). Látky ovlivňují ROCK dependentní migraci buněk, mohou proto najít uplatnění v onemocněních, kde patologická migrace přispívá k patogenezi jako jsou metastatická nádorová onemocnění včetně melanomu, neovaskularizace, restenózy po cévní či srdeční chirurgii, fibrózy a další nemoci, kde dochází k přestavbě tkáně (asthma, chronická obstrukční plicní nemoc),

Tabulka 5: Hodnocení invazivity pro linii A375m2

Tabulka 6: Hodnocení invazivitv Dro linii A2058

Tabulka 7: Hodnocení invazivity pro linii HT1080

Příklad 20 Hodnocení vlivu na morfologii buněk v kolagenní matrix

Buňky melanomu A375m2 a A2058 se v 3D-kolagenní matrix pohybují améboidním pohybem závislým na aktivitě ROCK kinasy. Inhibice ROCK kinasy vede ke ztátě améboidního pohybu, buňky přecházejí na epiteliální morfologii. Experiment sledující vliv nových látek, klinicky používaného ROCK inhibitoru fasudilu a DMSO vehikula na morfologii výše uvedených buněk v kolagenu byl proveden ve 48 jamkových panelech (Biofil, 011048). Linie byly kultivovány v Dulbecco’s Modified

Eagle Medium (Sigma, D6429) obsahujícícm 10% fetální bovinní sérum (Sigma, F7524) ve standardním inkubačním prostředí (37°C, 5% C02, absolutní vlhkost vzduchu). Následující hodnoty odpovídají výpočtu potřebného materiálu na jednu jamku panelu: 104-l,5x104 buněk v celkovém objemu 25 mikrolitrů média bylo smícháno s 225 mikrolitry roztoku krysího kolagenu (18 % 5x DMEM; 23,26 % voda; 5 % 7,5% NaHC03; 4,24 % 200mM NaOH; 2 % 750mM Hepes; 37,5% 4% krysí kolagen). K buněčné suspenzi byly přidány testované látky (10 pmol/l) nebo DMSO vehikulum. Po zatuhnutí kolagenní suspenze bylo do jamek panelu přidáno 500 μΐ kultivačního média s testovanými látkami (10 pmol/l) případně DMSO vehikulem. Morfologické změny byly hodnoceny po 24 h. Za mezenchymální byly považovány buňky jejichž délka byla minimálně dvakrát větší než jejich šířka. Výsledky shrnují tabulky 8-11. Působení testovaných inhibitorů mění fenotyp buněk z améboidního na epiteliální. Améboidní fenotyp je závislý na aktivitě ROCK a ROCK-dependentní přestavbě aktinového cytoskeletu. Testované látky tedy ovlivňují aktivitu ROCK a stav aktinového cytoskeletu v buňkách.

Tabulka 8: Linie A375m2, vliv látek na podíl morfologických typů

Tabulka 9: Linie A2058, experiment 1, vliv látek na podíl morfologických typů

Tabulka 10: Linie A2058, experiment 2, vliv látek na podíl morfologických typů

Tabulka 11: Linie A2058, experiment 3, vliv látek na podíl morfologických typů.

Příklad 21 Suché tobolky 5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 1250 g

Talek 180 g Pšeničný škrob 120 g Magnesium stearát 80 g

Laktosa 20 g

Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek. Příklad 22 Měkké tobolky 5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

Lauroglykol 2 litry

Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek. Příklad 23 Měkké tobolky 5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g PEG 400 1 litr

Tween 80 1 litr

Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY 1.2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I

   (I) ve kterém A je vazba nebo -Z-(CH2)m-; Z je vybrán z NH, CH2; m je 1; D a E jsou nezávisle vybrány z H a R2, R1 je vybráno ze skupiny zahrnující - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloaikylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent; - heterocykloalkyl alky], což znamená C3-C10 cykloalkyl skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, a která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent; - R’-G kde G je vybráno ze skupiny-NH- a -N(C1-C8 alkyl), a R’je vybráno ze skupiny zahrnující - C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl, popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy a amino substituent, s výhodou jedním hydroxy a/nebo jedním amino substituentem; R’je vybráno ze skupiny zahrnující - C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl, popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy a amino substituent, s výhodou jedním hydroxy a/nebo jedním amino substituentem; - (dialkylamino)alkyl skupinu, kde alkyl je vybrán nezávisle ze skupiny zahrnující C1-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl; - C3-C10 cykloalkyl, což znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 10 uhlíkových atomů, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent; - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkyl je popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent; - heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkyl alkyl skupina je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent; - benzylová skupina, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující fluoro, chloro, hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent; R2 může nebo nemusí být přítomen, a představuje jeden nebo více substituentů vázaných v libovolné poloze kruhu, nezávisle vybraných z =0, -OH, -C(0)-(CH2)p-0-(H nebo C1-C4 alkyl), kde p je celé číslo v rozmezí O až 4, aryl, arylalkyl, hydroxy(Cl-C4)alkyl, -S(0)2-aryl, -C(0)-aryl, -C(0)-heteroaryl, -C(0)-heterocyklyl, přičemž aryl, arylalkyl, heteroaryl, heterocyklyl mohou být substituované jedním nebo více substituenty vybranými z halogenu, OH, 0(C 1-C4) alkylu, hydroxy(Cl-C4)alkylu, SH, S(Cl-C4)alkylu, merkapto(Cl-C4)alkylu, NH2, NH(C1-C4)alkylu, N((Cl-C4)alkyl)2, ve kterém aryl je C6-C10 skupina obsahující alespoň jedno aromatické jádro, a s výhodou je arylem fenyl nebo naftyl; arylalkyl je skupina obsahující C6-C10 skupinu obsahující alespoň jedno aromatické jádro a C1-C4 alkylen, a s výhodou je arylalkylem benzyl; heteroaryl je C5-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N, a s výhodou je heteroaryl vybrán ze skupiny zahrnující furan, thiofen, pyrrol, pyrrazol; heterocyklyl je C4-C10 skupina, kde alespoň jeden uhlík je nahrazen heteroatomem vybraným z O, S, N. 2. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle nároku 1, které nesou substituent R1 vybraný ze skupiny zahrnující N N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-l-yl, 4-(2-hydroxethyl)piperazinyl, (R)-(2-hydroxymethylpyrrolidine-1 -yl), ethylamino, propylamino, butylamino, (2-hydroxyethyijamino, (3-hydroxypropyl)amino, 2(R)-hydroxypropyl]amino, 2(S)-hydroxypropyljamino, 4-hydroxybut-2(R)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(S)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(R,S)-yl]amino, 2-(hydroxy-2-methyl)propyl]amino, (2,3-dihydroxypropyl)amino, (l-hydroxy-3-methylbutyljamino, [(R,S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(R)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, (R)-[l-isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (S)-[l-isopropyl-2- hydroxyethyljamino, (2-aminoethyl)amino, (3-aminopropyl)amino, (4-aminobutyl)amino, (5-aminopentyljamino, (6-aminohexyl)amino, [3-amino-2-hydroxypropyl]amino, [1-(dimethylamino)methyl]amino, [2-(dimethylamino)ethyl]amino, [3-(dimethylamino)propyl]amino, [4-(dimethylamino)butyl]amino, [2-(diethylamino)ethyl]amino, [3-(diethylamino)propyl]amino, (aziridin-1 -yljethylamino, (azolidin-1 -yljethylamino, (azetidin-1 -yljethylamino, (piperidin-1 -yljethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (azetidin- l-yl)propylamino, cyklopropylamino, cyklobutylamino, cyklopentylamino, cyklohexylamino, (cM-2-aminocyklohexyl)amino, {trans-2-aminocyklohexyljamino, (c73',tra/w-2-aminocyklohexyl)amino, (c/.y,//Yy«.v-3-aminocyklohexyl)amino, (trara-4-aminocyklohexyl)amino, (c«-4-aminocyklohexyl)amino, {cis, trans-4- aminocyklohexyljamino, (c/í-2-hydroxycyklohexyl)amino, (tram-2-hydroxycyklohexyl)amino, {cis, /ra«A-2-hydroxycyklohexyl)amino, {cis, /ra//i-3-hydroxycyklohcxyl)amino, {trans-4- hydroxycyklohexyljamino, (cw-4-hydroxycyklohexyI)amino, (cw,/ra«s-4-hydroxycyklohexyl)amino, (2-methoxybenzyl)amino, (3-methoxybenzyl)amino, (4-methoxybenzyl)amino, (3,5-dimethoxybenzyljamino, (2,6-dimethoxybenzyl)amino, (3,4,5-trimethoxybenzyl)amino, (2,4,6-trimethoxybenzyljamino, (2-fluorbenzyl)amino, (3-fIuorbenzyl)amino, (4-fluorbenzyl)amino, (2-chlorbenzyljamino, (3-chlorbenzyl)amino, (4-chlorbenzyl)amino, (2,4-dichlorbenzyl)amino, (3,4,5-trichlorbenzyljamino. 3. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, vyznačené tím, že jsou-li D a E vodík nebo R2, je A propylenový můstek. 4. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jako léčiva. 5. 2,6-Disubstitutovane puriny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pro léčbu chorob vybraných ze skupiny zahrnující choroby dýchacího systému, kardiovaskulárního systému, oka, střev, kůže a nervového systému, jejichž patologie zahrnuje abnormální migraci buněk, zánět nebo fibrózu, hepatobiliárních onemocnění, zánětlivých onemocnění, patologických neovaskularizací, neurodegenerativních a metastatických nádorových onemocnění, onemocnění ve kterých hraje role vazokonstrikce nebo bronchokonstrikce . 6. 2,6-Disubstitutované puriny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pro léčbu chorob vybraných ze systémové fibrosy, fibros jednotlivých orgánů, zejména jater, ledvin, plic a kůže, myelofibrosy, fibrosy po rádio a chemoterapii, Crohnovy nemoci, kolitidy, ulcerativní kolitidy, Behcetovy nemoci, chronická obstrukční plicní nemoci, inetastatického melanomu, zánětů po operačních výkonech, zánětu povrchu oka, uveitidy, retinitidy, makulární degenerace, syndromu suchého oka, alergické rhinitis, alergického asthmatu, asthmatu bronchiale, sclerosis multiplex, systémové sklerosy, chronické infekce HCV, akutního poškození jater, nealcoholické steatohepatitis, rheumatoidní arthritidy, psoriatické arthritidy, ankylosní spondylitidy, psoriasy, alopecia areata, vitiligo, lupus erythematosus, cerebralniho vazospazmu, amyotrofické laterální sklerosy, frontotemporální demence, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, polyglutaminových onemocnění, Pickovy nemoci, demencí, iktu, nemoci s argyrofilními zrny (AgD), srdečního selhání, aneurysmatu abdominalní aorty, retinoblastomu, nádorů kolorekta, prsu a ovaria, obesity, diabetů 2. typu, atherosclerosy, hypertensní nemoci, pulmonarní hypertense, erektilní dysfunkce, restenosy po vaskulární nebo srdeční chirurgii, benigní neoplasie, neovaskulárního glaukomu, diabetické retinopatie, okulámí neovaskularizace, diabetické nefropatie, hemorhagické teleangiektasie, prevenci rejekce transplantátu, korekci jizvení kůže.
2. 7. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden 2,6-disubstitutované puriny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič.