CZ2009358A3 - 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující - Google Patents

5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující Download PDF

Info

Publication number
CZ2009358A3
CZ2009358A3 CZ20090358A CZ2009358A CZ2009358A3 CZ 2009358 A3 CZ2009358 A3 CZ 2009358A3 CZ 20090358 A CZ20090358 A CZ 20090358A CZ 2009358 A CZ2009358 A CZ 2009358A CZ 2009358 A3 CZ2009358 A3 CZ 2009358A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino
isopropylpyrazolo
hydroxy
pyrimidine
group
Prior art date
Application number
CZ20090358A
Other languages
English (en)
Inventor
Pechan@Paul
Havlícek@Libor
Original Assignee
C3 Bio Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by C3 Bio Gmbh filed Critical C3 Bio Gmbh
Priority to CZ20090358A priority Critical patent/CZ2009358A3/cs
Priority to PCT/CZ2010/000066 priority patent/WO2010139288A1/en
Publication of CZ2009358A3 publication Critical patent/CZ2009358A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

Technické rešení se týká 5,7-disubstituovaných 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinových derivátu pro inhibici proliferace a indukci apoptózy savcích bunek, zejména pro prevenci, inhibici a/nebo lécbu abnormální proliferace cévních bunek hladkého svalstva (VSMC) a s výhodou pro prevenci, inhibici a/nebo lécbu restenózy. Rešení dále zahrnuje farmaceutické prípravky obsahující tyto deriváty.

Description

5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako léčivo a farmaceutické přípravky tyto látky obsahující
Oblast techniky
Vynález se týká 5,7-disubstituovaných 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinových derivátů pro inhibici proliferace a indukci apoptózy savčích buněk, zejména pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu abnormální proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva (VSMC) a s výhodou pro prevenci, inhibici a léčbu restenózy.
Dosavadní stav techniky
Restenóza po koronární angioplastice je způsobena proliferací buněk vaskulárního hladkého svalstva v cévním lumenu, pod residuálními fragmenty atherosklerózních plaků, jak je patrno z nekroptických studií a analýz vzorků získaných atherektomií. Při histologických analýzách nejsou tromby a jejich fibrocelulámí organizace obvykle pozorovatelné. Proliferace buněk hladkého svalstva vedoucí k restenóze je velmi podobná té pozorované v experimentálních modelech založených na odpovědi k poškození, které jsou používány ke studiu patogenních mechanizmů restenózy. Hlavní stimulus vedoucí ke ztrátě kontraktibilního fenotypu a začátek proliferace buněk hladkého svalstva je způsoben růstovými faktory dodávanými krevními destičkami adherovanými k disendotelializované stěně či samotnými buňkami hladkého svalstva, napnutými při dilataci. Dalšími stimuly mohou být růstové faktory dodávané monocyty a fibroblasty, například thrombin, endothelin, angiotensin a interleukin 1. Elastický obal cévní stěny, pozůstatky plaků a místní stěnový stres se mohou rovněž podílet na vzniku restenózy. Restenózní tkáň je odlišná od atheromatózních plaků v tom, že se skládá pouze z buněk hladkého svalstva a intercelulární matrix, kdežto atheroma je mnohem komplexnější díky přítomnosti rozdílných typů buněk, nekrotických zbytků a lipidových látek. Proliferace buněk hladkého svalstva rovněž přispívá k patogenezi atherosklerózy, avšak stimul zodpovědný za tento proces nebyl zatím objasněn. Kromě toho je tento proces mnohem pomalejší než restenóza, neboť interaguje s mnohem více faktory. Doposud bylo dosaženo povzbudivých výsledků v prevenci restenózy po angioplastice u experimentálních modelů, ne však u lidí. Za účelem redukce incidence restenózy je možné zlepšit výsledky zejména angioplastiky, dokonce i při použití atherektomie a intrakoronámích stentů. Mezi farmakologické přístupy patří antikoagulanty, heparin, antiplateletární agens, blokátory vápníkových kanálů, kortikosteroidy - všechny jsou ale ne zcela efektivní. Na postupu je i studium účinků inhibitorů růstového faktoru krevních destiček (PDGF), protinádorových látek a radiační terapie, hirudinu, inhibitorů angiotensin-přeměňujících enzymů a inhibitorů HMG-CoA reduktasy.
Vývoj strategie proti restenóze, znovuzúžení cév po angioplastických intervencích, zůstává jedním z klíčových problémů cévní biologie a farmakologického výzkumu. V současné době jsou jednou z možností léčby pro pacienty, kteří jsou podrobeni perkutánní koronární revaskularizaci, stenty uvolňující léčiva (DES) (Kukreja et al. 2008, Pharm. Res. 57:171). První generace současně distribuovaných DES používá léčiva, jakými jsou například rapamycin a paclitaxel, která jsou zacílená na mTOR dráhu či tubulin (Windecker and Juni, 2008, Nat.Clin. Pract. Card. Med. 5:316-328). Bohužel, nedávno určité znepokojení vyvolaly zprávy, že uvedené látky mohou způsobit pozdní trombózu ve stentech (Steffel et al., 2008). Z těchto důvodů je hledání nových léčiv, která interferují s proliferací vaskulámích buněk hladkého svalstva (VSMC) a využívají jiných principů než rapamycin a paclitaxel, důležitým farmakologickým tématem.
Abnormální proliferace buněk cévního hladkého svalstva přispívá kpatogenezi restenózy. Z těchto důvodů jsou rovněž léčiva interferující s progresí buněčného cyklu u VSMC slibnými kandidáty anti-restenózní terapie. Roskovitin (ROSC) byl v enzymových testech charakterizován jako selektivní inhibitor cyklin-dependentních kinas (CDK) 1, 2 a 5 (Meijer et al. 1997, J. Biochem. 243: 527-536) a inhiboval proliferací různých typů buněk od mnoha nádorových linií až po keratinocyty a fibroblasty. Pozorované účinky byly ale silně závislé na použitém typu buněk, použitém stimulu a podmínkách ošetření (Alessi et al. 1998, Exp. Cell Res. 245:8; Atanasova et al. 2005, Biochem. Pharmacol. 70:824; Meijer and Raymond 2003, Acc. Chern. Res. 36:417-425; Mgbonyebi et al. 1999 Cancer Res. 59:1903-1910). V současné době se ROSC nachází ve fázi II. klinického zkoušení jako protinádorová látka (Benson et al. 2007, Br. J. Cancer 96:29-37). Úěinky ROSC na jiné buněčné typy účastnící se proliferativních onemocnění, jako jsou VSMC, však dosud nejsou známé.
Cílem tohoto vynálezu je poskytnout sloučeniny schopné inhibovat PDGF-indukovanou proliferací VSMC. Kromě toho je cílem vysvětlit molekulární mechanismus účinku nových sloučenin v porovnání s roskovitinem (ROSC). Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž antirestenózní látky mající vylepšený index selektivity a účinnosti, tedy jsou méně toxické a přitom efektivnější než analoga známá doposud.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou 5,7-disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I
R7
a jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde
R7jeR7’-NH-;
R7’ je vybráno ze skupiny zahrnující aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin může být případně substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující halogen, hydroxy, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy a amino skupinu;
R5je R5’-NH-;
R5’ je vybráno ze skupiny zahrnující lineární nebo rozvětvený alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl a cykloalkyl alkyl, ve kterém každá z těchto skupin může být případně substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino a hydroxy skupinu, pro použití jako léčiva. Tento vynález zahrnuje zejména použití uvedených derivátů pro inhibici proliferace a indukci apoptózy savčích buněk, zejména pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu abnormální proliferace buněk vaskulámího hladkého svalstva (VSMC) a s výhodou pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu restenózy.
“Halogen“ je vybrán ze skupiny zahrnující atomy fluoru, bromu, chloru a jodu.
“Hydroxy“ znamená skupinu -OH.
„Amino“ znamená skupinu -NH2.
“Alkyl“ znamená lineární nebo rozvětvenou Ci-Có alkylovou skupinu, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, isopropyl, isopropyl, tert-butyl, isobutyl, pentyl, isopentyl, hexyl, isohexyl. Tato alkylová skupina může být případně substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující halogen, amino, hydroxy a alkoxy.
“Alkenyl“ znamená lineární nebo rozvětvenou C2-C6 alkenylovou skupinu obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující allyl, vinyl,1-propenyl, 1methylethenyl, but-1 až 3-enyl, pent-1 až 4-enyl, isopentenyl, hex-1 až 5-enyl, hept-1 až 6enyl, isopentenyl, a 3,3-dimethylallyl. Tato alkylová skupina může být případně substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující halogen, amino, hydroxy a alkoxy.
„Alkynyl“ znamená lineární nebo rozvětvenou C2-Cé alkynylovou skupinu obsahující alespoň jednu trojnou vazbu, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující ethynyl a propargyl. Tato alkynylová skupina může být s výhodou substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující halogen, amino, hydroxy a alkoxy.
“Alkoxy“ znamená skupinu -ORa, kde Ra je alkyl, alkenyl, alkynyl, s výhodou methyl.
“Aryl“ nebo “Ar“ znamená aromatickou karbocyklickou skupinu, obsahující alespoň jeden aromatický kruh nebo násobně kondenzované kruhy, mající s výhodou 6 až 14 uhlíkových atomů. Aryl je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující fenyl, bifenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, fluorenyl, indenyl a fenantrenyl. Aryíová skupina může být s výhodou substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující halogen, amino, alkyl, alkenyl, alkynyl, hydroxy a alkoxy.
“Arylalkyl“ znamená skupinu -R-Ar, kde Ar znamená arylovou skupinu a R je přímý nebo rozvětvený Cj-Q můstkový uhlovodíkový řetězec, který může být nasycený nebo nenasycený. Aiylová a/nebo R skupina může být případně substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující halogen, amino, alkyl, alkenyl, alkynyl, hydroxy a alkoxy.
“Cykloalkyl“znamená C3-C15 monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu. C3-C15 cycloalkyl je přednostně vybrán ze skupiny obsahující cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl a adamantyl. Tato cycloalkylová skupina může být s výhodou substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující halogen, amino, alkyl, alkenyl, alkynyl, hydroxy a alkoxy.
“Cykloalkyl alkyl“znamená skupinu -R-cykloalkyl, kde cykloalkyl znamená cykloalkylovou skupinu a R je přímý nebo rozvětvený Ci-C^ můstkový uhlovodíkový řetězec, jak je definováno výše. Cykloalkylová a/nebo R skupina může být s výhodou substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující halogen, amino, hydroxy a alkoxy.
R7 je s výhodou skupina arylalkyl-ΝΗ-, která může být případně substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující halogen, alkoxy, alkyl, hydroxy a amino, a zejména je R7 je vybrán ze skupiny zahrnující benzylamino skupinu a benzylamino skupinu substituovanou jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující halogen, alkoxy, alkyl, hydroxy a amino. Arylalkylová skupina je s výhodou substituovaná jedním až třemi substituenty.
R7 je výhodněji vybrán ze skupiny zahrnující benzylamino skupinu a benzylamino skupinu substituovanou jedním až třemi substituenty vybranými nezávisle ze skupiny zahrnující halogen, methoxy, methyl, hydroxy a amino; zejména je R7 vybrán ze skupiny zahrnující benzylamino, 2-, 3-, 4-fluorbenzylamino, 2-, 3-, 4-chlorbenzy lamino, 2,3difluorbenzylamino, 3,4-difluorbenzy lamino, 2,3,4-trifluorbenzylamino, 3methoxybenzylamino, 2-hydroxy-3-methoxybenzylamino, 2-hydroxy-3-methylbenzylamino, 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino, 2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino, . 3-hydroxy-5chlorbenzylamino, 2- a 4-aminobenzylamino.
Přednostně je R5 vybrán ze skupiny zahrnující alkyl-NH-, alkenyl-ΝΗ-, alkynyl-NH-, cykloalkyl-ΝΗ-, ve kterém každá z těchto skupin případně může být substituovaná alespoň jednou amino a/nebo hydroxy skupinou, a s výhodou je R5 substituován jednou amino a/nebo jednou hydroxy skupinou.
R5 je výhodněji vybrán ze skupiny zahrnující 2-aminoethylamino, 3-aminopropy lamino, 4aminobutylamino, 2-aminocyclohexylamino, 3-aminocyclohexylamino, 4aminocyclohexylamino, (3-amino-2-hydroxypropyl)amino, [2-(2-aminoethoxy)ethyl]amino a (2-amino-2-methylpropyl)amino.
Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou deriváty obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 5-(3-aminopropyl)amino-7-benzylamino-3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-benzylamino-3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amino-7-benzylamino-3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino-7-(2-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3
d]pyrimidin, 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(-2-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amino-7-(2-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3djpyrimidin, 5-(4-aminobutyl)amino-7-(2-fluorbenzyl)amino-3-Ísopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino-7-(3-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(3-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amino-7-(3-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(3-amino-2-hydroxypropyl)amíno-7-(3-fluorbenzyl)amino-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(2-amino-2-methylpropyl)amino-7-(3 fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino-7-(4fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin) 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(-4fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-Ísopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4?3-d]pyrimidin,
-(2 -aminocy klohexy l)amíno-7 -(45-(3-aminopropyl)amino-7-(25 -(4-aminocyklohexy l)amino-7 -(25 -(2 -aminocy klohexy l)amino-7 -(25-(3 -aminopropyl)amino-7 -(35-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(35-(2-aminocyklohexyl)amino-7-(35 -(3 -aminopropy l)amino-7 -(45 -(4-aminocy klohexy l)amino-7 -(45 -(2-aminocy klohexy l)amino-7 -(45-(3-aminopropyl)amino-7-(2,3difluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(4-aminocy klohexyl)amino-7(2,3-difluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin,
5-(2aminocyklohexyl)amino-7-(2,3-difluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino-7-(3,4-difluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5 (4-aminocyktohexyl)amino-7-(3,4-difluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amino-7-(3,4-difluorbenzyl)amÍno-3-Ísopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino-7-(2,3,4-trifluorbenzyl)amino-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(2,3,4trifluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amino-7(2,3,4-trifluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino7-(3-methoxybenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(4aminocyklohexyl)amino-7-(3-methoxybenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5(2-aminocyklohexyl)amino-7-(3-methoxybenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino-7-(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3djpyrimidin, 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-amino-2-hydroxypropyl)amino-7-(2-hydroxy-3methoxybenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-djpyrimidin, 5-(2-amino-2methylpropyl)amino-7-(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3djpyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amino-7-(2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(2-aminobenzyl)amino-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amino-7-(2-aminobenzyl)amino-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)amino-7-(2-hydroxy-5fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-djpyrimidin, 5-(4-aminocyklohexyl)amino-7-(2hydroxy-5-íluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-amino-2hydroxypropyl)amino-7-(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3djpyrimidin, 5-(2-atnino-2-rnethylpropyl)amino-7-(2-hydroxy-5-fluorbenzyl)amino-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(2-aminocyklohexyl)amÍno-7-(2-hydroxy-5fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-aminopropyl)ammo-7-(2hydroxy-5-chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(4aminocy klohexy l)amino- 7-(2-hy droxy-5 -chlorbenzyl)amino-3 -isopropy Ipy razolo[4,3 djpyrimidin, 5 -(2-aminocy klohexy l)amino-7 - (3 -hy droxy-5-chlorbenzy l)amino-3 isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3-amino-2-hydroxypropyl)amino-7-(3-hydroxy-5chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(2-amino-2-methylpropyl)amino7-(3-2-hydroxy-5-chlorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(3aminopropyl)amino-7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(4 aminocyklohexyl)amino-7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, 5-(2aminocyklohexyl)amino-7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin.
Předmětem vynálezu jsou rovněž 5,7-disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I pro použití jako léčiva.
Předmětem vynálezu je dále použití 5,7-disubstituovaných 3-isopropylpyrazolo[4,3d]pyrimidinů obecného vzorce I pro inhibici proliferace a indukci apoptózy savčích buněk, zejména pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu abnormální proliferace buněk hladkého svalstva (VSMC) a s výhodou pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu restenózy.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden 5,7disubstituovaný 3-ísopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin obecného vzorce I a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob inhibice proliferace a indukce apoptózy savčích buněk, zejména pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu abnormální proliferace buněk hladkého svalstva (VSMC) a s výhodou pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu restenózy u savců podáním účinného množství 5,7-disubstituovaného 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimÍdinu obecného vzorce I savci.
Předmětem vynálezu je dále farmaceutická kompozice látky zahrnující farmaceutický přípravek ve směsi s jedním nebo více farmaceutickými nosiči.
Předmětem vynálezu je 5,7-disubstituovaný 3-isopropylpyrazolo[4,3-d)pyrimidin obecného vzorce la
ve kterém je R5 vybrán ze skupiny zahrnující alkyl-NH-, alkenyl-ΝΗ-, alkynyl-NH-, cykloalkyl-ΝΗ-, kde každá z těchto skupin může být substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným z amino a hydroxy skupin; a
R7 je vybrán ze skupiny zahrnující 2-fluorbenzylamino, 3-fluorbenzylamino, 4 fluorbenzylamino, 2-chlorbenzylamino, 3-chlorbenzylamino, 4-chlorbenzylamino, 2,3difluorbenzy lamino, 3,4-dífluorbenzy lamino, 2,3,4-trifluorbenzylamino, 3methoxybenzylamino, 2-hydroxy-5-fluorbenzy lamino, 2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino, 3hydroxy-5-chlorbenzylamino, 4-aminobenzylamino.
R5 je přednostně vybrán ze skupiny zahrnující 2-aminoethylamino, 3-aminopropylamino, 4aminobutylamino, 2-aminocyklohexylamino, 3-aminocyklohexylamino, 4aminocyklohexylamino, (3-amino-2-hydroxypropyl)amino, [2-(2-aminoethoxy)ethyl]amino, a (2-amino-2-methylpropyl)amino.
Farmaceutické kompozice
Farmaceutická kompozice obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90% aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.
Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.
Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-íer/-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cg až C12 od Hůls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sesamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejné.
Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.
Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.
Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulosové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinylpyrrol i din, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylový škrob, zesítěný póly vinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její solí jako stearát hořečnatý a/nebo vápenatý, polyethylen glykol nebo jeho deriváty.
Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovaci roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulosových preparátů jako acetylcelulosaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulosaftalát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.
Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát horečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylen glykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.
Další formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10% nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.
Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafínové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy.
Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofilizátu společně s excipienty kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro infúzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbová či benzoová.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.
Přehled výkresů
Obr. 1 ukazuje dávkově závislou křivku sloučeniny 1 (5-(2-aminocyklohexylamino)-7benzylamino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin, značeno v obrázcích jako Cmp 1) a ROSC (roskovitin) získanou měřením DNA syntézy v PDGF-aktivovaných buňkách vaskulámího hladkého svalstva (VSMC). Sérum-vyhladovělé VSMC byly předošetřeny vzrůstajícími koncentracemi sloučeniny 1 (0,1-15 μΜ) nebo ROSC (1-100 μΜ) po dobu 30 min následované ošetřeníám PDGF (20 ng/ml). Po 4 h byly buňky inkubovány s BrdU a PDGF po dalších 20 h. Inkorporace BrdU byla stanovena za 24 h po aktivaci buněk PDGFBB. Hodnoty IC50 byly vypočteny ze sigmoidních dávkově závislých kriek (variable slope, GraphPad Prism).
Obr. 2 ukazuje, že sloučenina 1 silně indukuje blok v Gl-fázi buněčného cyklu v PDGF-BBaktivovaných buňkách vaskulámího hladkého svalstva.
Obr. 3 ukazuje účinný blok v Gl-fázi u PDGF-BB-aktivovaných buněk vaskulámího hladkého svalstva sloučeninou 1.
Obr. 4 ukazuje vliv sloučeniny 1 a ROSC na PDGF-indukovaný vstup VSMC do S-fáze. Senim-vyhladovělé VSMC byly předošetřeny po dobu 30 min sloučeninou 1 (5 μΜ), ROSC (20 μΜ) nebo vehikulem (DMSO 1%) a kultivovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti PDGF (20 ng /ml). Po indikované časové periodě bylo procentuální zastoupení buněk v S-fázi stanoveno pomocí flow cytometrické analýzy PI-značených jader (propidium jodid). Sloupečky znázorňují průměr tří nezávislých experimentů ± SEM. n.s., nevýznamný, **/?<0,01, ***/?<0,001 (dvouparametrický ANOVA test následovaný Bonferroni post-testem versus PDGF-ošetření),
Obr. 5 ukazuje efektivní blok v Gl-fázi u PDGF-BB-aktivovaných vaskulámích buňkách hladkého svalstva vlivem sloučeniny 1.
Obr. 6 ukazuje vliv sloučeniny 1 a ROSC na časné signální události downstream od PDGF receptoru. Použitím western blot analýz jsme vyloučili jakýkoliv inhibiční vliv ROSC a sloučeniny 1 na fosfory láci MAPK kinas (p38, ERK, JNK) nebo aktivaci Akt a STAT3 kinas.
Obr. 7 ukazuje vliv sloučeniny 1 a ROSC na hladiny cyklinů. Serum-vyhladovělé VSMC byly předošetřeny po dobu 30 min sloučeninou 1 (5 μΜ), ROSC (20 μΜ) nebo vehikulem (DMSO 1%) před stimulací PDGF-BB (20 ng/ml) po indikovanou časovou periodu. Celkový buněčný lyzát byl poté podroben western blot analýze cyklinu Dl, A, E a a-tubulinu. Reprezentativní western bloty vybrané minimálně za tří nezávislých experimentů poskytující konsistentní výsedky jsou ukázány pro cyklin Dl (a), cyklin A (b) a cyklin E (c). Grafy zobrazují zkompilovaná data densitometricky evaluovaných poměrů cyklin/tubulin pro každý z časových bodů normalizovaných k odpovídajícímu kontrolnímu vehikulu. Ukázány jsou průměry ± SEM. *p<0.05, **/><0.01, ***p<0.001 (dvouparametrický ANOVA test následovaný Bonferroni post-testem versus PDGF-ošetření).
Obr. 8 ukazuje vliv aplikace sloučeniny 1 a ROSC na fosforylaci pocket proteinů. Serumvyhladovělé VSMC byly předošetřeny po dobu 30 min sloučeninou 1 (5 μΜ), ROSC (20 μΜ) nebo vehikulem (DMSO 1%) před stimulací PDGF-BB (20 ng/ml) po indikovanou časovou periodu. Celkový buněčný lyzát byl poté podroben western blot analýze fosforylovaného retinoblastomového proteinu (pRbSerS07+811), pl07/fosfo-pl07 (p-p!07) a a-tubulinu. (a) Reprezentativní western bloty vybrané minimálně za tří nezávislých experimentů poskytující konsistentní výsedky jsou ukázány pro pRbSer807+811 a p-pl07. (b, c) Grafy zobrazují zkompilovaná data densitometricky evaluovaných poměrů cyklin/tubulin pro každý z časových bodů normalizovaných k odpovídajícímu kontrolnímu vehikulu. Ukázány jsou průměry ± SEM. */><0,05, **/><0,01, ***/><0,001 (dvouparametrický ANOVA test následovaný Bonferroni post-testem versus PDGF-ošetření).
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady slouží k objasnění vynálezu, aniž by omezovaly jeho rozsah.
Chemikálie a reagencie
7,5-Dihydroxy-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinový prekursor byl připraven podle metody Kryštof et al. (Eur. J. Med. Chem. 41,2006, 1405-1411).
Není-li specifikováno jinak, všechny kultivační reagencie a média byla získána od Lonza
Group Ltd. (Basel, Switzerland) a všechny ostatní chemikálie od Carl Roth (Karlsruhe, Germany). Trypsin, kolagenáza II a HAM’s F-12 medium byly zakoupeny od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) a DMSO od Fluka (Buchs, Switzerland). Roskovitin byl od
Calbiochem (La Jolla, CA, USA) a rekombinantní lidská PDGF-BB od Bachem (Weil am Rhein, Germany). Anti-cyklin E, anti-cyklin A, anti-a-tubulin a anti-pl 07 protilátky byly zakoupeny od Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA), anti-phospho Ser 807+811 retinoblastoma protein, anti-cyklin Dl a králičí IgG protilátky z New England Biolabs (Beverly, MA, USA). Myší IgG byly získány od Upstate (Charlottesville, V A, USA). FITC-značené anti-SM-αactin protilátky a luminol byly obdrženy od Sigma Aldrich (St.Louis, MO, USA). Complete™ protease inhibitor byl získán od Roche Diagnostics (Basel, Switzerland). Immuno-Blot™ PVDF membrány a precision plus protein standard™ byly zakoupeny u BIORAD (Hercules, CA, USA).
Statistické analýzy
Všechny statistické analýzy byly prováděny s pomocí GraphPad PRISM™, version 4.03 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA; USA). Data jsou vyjádřena jako průměr nejméně tří nezávislých experimentů ± standardní odchylka (SD) nebo směrodatná chyba (SEM). Jednoduchý nebo dvoustranný ANOVA a Student t-test byly použity pro statistické analýzy výsledků, jak je naznačeno v legendě k obrázkům. P-hodnota < 0,05 byla považována za statisticky významnou.
Příklad 1
5-chlor- 7- (2-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-dpyrimidin
5,7-Dihydroxy-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin (1,16 g; 5,974 mmol) byl rozpuštěn v difosforyldichloridu (C12(O)POP(O)CI2, 11,5 ml). Tato směs byla zahřívána při 160 °C v uzavřené ampuli po dobu 8 h. Roztok byl odpařen do sucha in vacuo (teplota lázně do 100 °C) a odparek poté ochlazen a nalit za míchání na rozdrcený led. Vodný roztok byl extrahován benzenem. Kombinovaný benzenový extrakt byl vysušen (nad Na2SO4), poté odpařen do sucha. Odparek, 0,5 ml 2-fluorbenzy laminu, 0,6 ml ethyldiisopropy laminu a 12 ml N-methyl-2pyrrolidonu bylo mícháno ve směsi při 65 °C po dobu 3 h. Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem. Odparek byl chromatografován na silikagelu pomocí mobilní fáze CHCh/MeOH (99/1) při získání 5-chlor-7-(2-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3
d]pyrimidinu. Výtěžek 28 %; amorfní. MS ESI': 318.3 (100%, [M-H]’), 320.3(42%, [M-H]). 'H-NMR (300MHz, CDC13): 1.41 d (6H, J=6.9Hz), 3.42 sept (1H, J=6.9Hz), 4.80 bs (1H), 5.01 bd (2H), 6.6.0-7.32 m (4H), 8.06 bs (1H).
5-(3-aminopropyl)amino-7-(2-fluorbenzyl)amino~3-isopropylpyrazolo[4,3-dff>yrimidin
Směs 138 mg 5-chlor-7-(2-fluorbenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinu, 0,62 ml 1,3-diaminopropanu (20 eq.) a 0,6 ml N-methyl-2-pyrrolidonu byla zahřívána při 125 °C po dobu 12 h. Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem a pak chromatografována na silikagelu. Směs chloroform/methanol/NH4OH (91:9:1) byla použita jako mobilní fáze. Výtěžek=56%; b.t.=125-132 °C ; MS (ES+): 358.3(100%, M+H+). 'H-NMR (300 MHz, CD3OD): 1.39d (6H, >6.9 Hz), 2.02tt (2H, >5.8 Hz,>6.8 Hz), 3.22t (2H, >6.8 Hz), 3.39sept (1H, >6.9Hz), 3.77t (2H, 5.8Hz), 5.0Ibd (2H), 7.30m (4H).
Příklad 2
7-Benzylamino-5-chlor-3-isopropylpyrazolof4,3-dJpyrimidin
5,7-Dihydroxy-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin (1,16 g; 5,974 mmol) byl rozpuštěn v difosforyldichloridu (C12(O)POP(O)C12, 11.5 ml). Tato směs byla zahřívána při 160 °C v uzavřené ampuli po dobu 8 h. Tento roztok byl odpařen do sucha in vacuo (teplota lázně do 100 °C) a odparek poté ochlazen a nalít za míchání na rozdrcený led. Vodný roztok byl extrahován benzenem. Kombinovaný benzenový extrakt byl vysušen (nad Na2SO4), poté odpařen do sucha. Odparek, 1 ml benzylaminu a n-butanol (2 ml) byly míchány ve směsi při 65 °C po dobu 4 h. Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem. Odparek byl chromatografován na silikagelu mobilní fází CHCl3/MeOH (99/1) při získání 7-benzylamino5-chlor-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinu. Výtěžek 26 %; b.t. 69-72 °C, MS ESI+: 302.3(100%, [M+H]+), 304.3(38%, [M+H]+). *H NMR (CDC13; 300MHz): 1.37 d (6H, >7.1 Hz); 3.39 sept (1H, >7.1 Hz), 6.72 s (1H), 4.82 s (2H), 7.28 m (5H).
5-(4-Aminocyklohexyl)amino-7-benzylamino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin
Směs 248 mg 5-chlor-7-benzylamino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinu, 657 mg 1,4diaminocyklohexanu (10 eq.), 3 ml N-methyl-2-pyrrolidonu a 0,56 ml diisopropylethy laminu bylo zahříváno při 145 °C po dobu 13 h. Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem (0,2 Torr) a pak chromatografována na silikagelu. Směs chloroform/methanol/NELOH (95:5:0,5) byla použita jako mobilní fáze. Výtěžek=30%; b.t =100-103 °C ; MS (ES+): 380.3(100%, M+H+). 'H-NMR (300 MHz, DMSO-dó): 1,04 16
1,27 m (4H,), 1,32 d (6H, J = 7,0 Hz,), 1,76 bd (2H, J = 10,0 Hz), 1,90 bd (2H, J = 10,0 Hz), 2,54 m(lH), 3,15 sept (1H, J- 7,0 Hz), 3,6 m (1H), 4,66 d (2H, J = 5,3 Hz), 5,71 d (1H, J = 7,9 Hz), 7,241 (1H), 7,33 t (2H), 7,38 d (2H), 7,73 t (1H, J = 5,3 Hz), 12.13 bs (1H, 1).
5-(2-Aminocyklohexyl)amino-7-benzylamino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin byl připraven syntetickým postupem popsaným Kryštofem et al. (Kryštof et al. 2006, Eur. J. Med. Chem. 41:1405). Produkt byl čištěn kolonovou chromatografií a poskytl amorfní pevnou sklovitou hmotu, b.t. 95-105 °C. MS ESI+: [M+H]+ = 380,3 (100). lH - NMR (300 MHz, DMSO-d6): 1,01 - 1,31 m (3H), 1,32 d (6H, J = 7,0 Hz), 1,44 - 1,68 m (3H), 1,84 bd (1H), 2,01 bd (1H), 2,54 m (1H), 3,16 sept (1H, J - 7,0 Hz), 3,43 m (1H), 4,68 s (2H), 5,82 d (1H, J = 7,7 Hz), 7,25 t (1H), 7,341 (2H), 7,39 d (2H), 7,75 bs (1H), 11,98 bs (1H). I3C - NMR (300 MHz, DMSO-d6): 21,6; 21,7; 24,8; 24,9; 25,8; 31,9; 34,3; 43,0; 54,0; 57,1; 126,8; 127,5; 128,3; 136,0; 139,6; 145,7; 150,6; 157,4; 158,1; 168,6.
Příklad 3
7-(2-Ámmobenzyl)amino-5-chlor-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin
5,7-Dihydroxy-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin (1,16 g; 5,974 mmol) byl rozpuštěn v difosforyldichloridu (C12(O)POP(O)C12, 11,5 ml). Tato směs byla zahřívána v uzavřené ampuli po dobu 8 h a při 160 °C. Tento roztok byl odpařen do sucha in vacuo (teplota lázně do 100 °C) a odparek poté ochlazen a nalit za míchání na rozdrcený led. Vodný roztok byl extrahován benzenem. Kombinovaný benzenový extrakt byl vysušen (nad Na2SO4) poté odpařen do sucha. Odparek, 1,4 g (11,5 mmol) 2-amÍnobenzylaminu a 12 ml N-methyl-2pyrroiidonu bylo mícháno ve směsi při 70 °C po dobu 4 h. Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem (0,2 torr) a pak chromatografována na silikagelu mobilní fází CHCl3/MeOH (98.5/1.5) poskytujíc 7-(2-aminobenzyl)amino-5-chlor-3isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin. Výtěžek 28 %; amorfní. MS ESI+: 317,4 (100 %, [M+H]+), 319,3 (41 %, [M+H]+). 'H - NMR (300 MHz, CDC13): 1,35 d (6H, J = 7,0 Hz), 3,30 sept (1H, J = 7,0 Hz), 4,53 bs (2H), 5,16 bs (1H), 6,55 m (1H), 6,68 m (1H), 7,00 m (1H), 7,12 d (1H, J - 7,3 Hz), 8,06 bs (1H), 8,97 bs (1/3H), 14,04 bs (1/2H). I3C - NMR (300 MHz, CDCh): 21,6; 40,9; 48,4; 115,0; 116,0; 120,2; 121,5; 127,8; 128,4; 129,6; 140,1; 146,2; 146,7; 149,4; 151,2; 155,4; 173,7.
5f2<tminoethyl)amino-7-(2-ammobenzyl)amino-3dsopropylpyrazolo[4,3-dfoyrimidin Směs 93 mg 5-chlor-7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimÍdinu, 0,62 ml
1,2-diaminoethanu a 0,6 ml N-methyl-2-pyrrolidonu byla zahřívána na 130 °C po dobu 16 h Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem (0,2 torr) a pak chromatografována na silika gelu. Směs chlorform/methanol/NH4OH (91:9:1) byla použita jako mobilní fáze.
Výtěžek=38 %; b.t.=148-151 °C. MS ESI+: [M+H]+= 341,3 (100). ‘H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 1,32 d (6H, J - 7,0 Hz), 2,73 m (2H), 3,16 sept (1H, J = 7,0 Hz), 3,28 q (2H, J = 5,9 Hz), 4,53 d (2H, J = 4,6 Hz), 5,15 bs (2H), 6,07 t (1H, J = 5,1 Hz), 6,51 t (1H, J - 7,5 Hz), 6,64 d (1H, J = 8,1 Hz), 6,971 (1H, J - 7,5 Hz), 7,12 d (1H, J = 7,5 Hz), 7,60 bs (1H). 13C - NMR (300 MHz, DMSO-d6): 21,6; 25,7; 39,9; 41,3; 42,1; 44,4; 49,6; 69,7; 72,3; 114,6; 115,7; 121,1; 121,9; 127,9; 129,6; 139,6; 144,7; 146,3; 146,4; 150,8; 157,9; 168,8.
Příklad 4
5-(2-aminocyklohexyl)amino-7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4J-djfryrimidin Směs 196 mg 5-chlor-7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinu a 1,4 ml 1,2-diaminocyklohexanu byla zahřívána na 150 °C po dobu 18 h Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem (0,2 ton) a pak chromatografována na silikagelu. Směs chlorform/methanol/NHíOH (95:7:0,7) byla použita jako mobilní fáze. Výtěžek = 29 %, b.t -182-186 °C. MS ESf: [M+H]+ = 395,4 (100). *H - NMR (300 MHz, DMSO-d6): 1,03 1,26 m (3H), 1,32 d (6H, J - 7,0 Hz), 1,51 - 1,68 m (3H), 1,84 d (1H, J - 10,0 Hz), 2,06 d (1H, J = 12,4 Hz), 2,54 m (1H), 3,15 sept (1H, J - 7,0 Hz), 3,29 bs (2H), 3,38 m (1H), 4,53 d (2H, J - 5,3 Hz), 5,14 bs (2H), 5,86 d (1H, J = 7,7 Hz), 6,51 t (1H, J = 7,3 Hz), 6,64 d (1H, J = 7,9 Hz), 6,971 (1H, J = 7,9 Hz), 7,12 d (1H, J = 7,3 Hz), 7,50 bs (1H), 11,98 bs (1H). 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6): 21,5; 21.6; 24,9; 25,0; 25,8; 31,9; 34,7; 39,7; 54,1; 57,4; 114,6; 115,7; 121,9 ; 123,1; 127,3; 127,9; 129,5; 139,8; 145,7; 150,4; 158,1; 160,7.
Příklad 5
5-(4-aminocyklohexyl)amino- 7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidm Směs 350 mg 5-chlor-7-(2-aminobenzyl)amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinu, 889 mg 1,4-diaminocyklohexanu, 3 ml N-methyl-2-pyrrolidonu a 0,5 ml diisopropylethylaminu byla zahřívána na 150 °C po dobu 20 h. Reakční směs byla odpařena do sucha pod vakuem (0,2 torr) a pak chromatografována na silikagelu. Směs chlorform/methanol/NH4OH (95:5:0,5) byla použita jako mobilní fáze. Výtěžek=38 %; b.t.=87-91 °C ; MS ESI+: [M+H]+ = 395,5 (100). ’H - NMR (300 MHz, DMSO-d6): 1,04 - 1,29 m (4H), 1,32 d (6H, J = 7,0 Hz),
1,76 bd (2H, J = 12,0 Hz), 1,90 bd (2H, J = 12,0 Hz), 2,54 m (1H), 3,03 bs (1H), 3,15 sept (1H, J = 7,0 Hz), 3,65 m (1H), 4,52 d (2H, J = 5,3 Hz), 5,13 s (2H), 5,74 d (1H, J = 8,1 Hz), 6,51 t (1H, J = 7,3 Hz), 6,64 d (1H, J = 7,9 Hz,), 6,971 (1H, J = 7,7 Hz), 7,12 d (1H, J = 7,7 Hz), 7,50 t (1H, J = 5,3 Hz), 12,10 bs (1H). 13C - NMR (300MHz, DMSO-d6): 21,5; 25,8; 31,4; 35,2; 39,7; 49,5; 49,9; 114,6; 115,7; 121,9; 127,9; 129,5; 139,9; 144,6; 146,4; 150,7; 157,2.
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladu 1 - 5
č. SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS (ZMD)ANALÝZA
C5 C7 C3 [%] [M-H]’ a) [M+H]+ b)
1 2-aminocyklohexylamino benzy lamino isopropyl C=66,43;H=7,75 N=25,74 378,3 380,3
2 4-aminocyklohexylamino benzy lamino isopropyl C=66,39;H=7,74 N=25,70 378,3 380,3
3 3-aminopropylamino benzylamino isopropyl O63,69;H=7,44 N=28,78 338,3 340,2
4 2-aminoethylamino 2-hydroxy-3meihoxybcnzylamino isopropyl C=58,19;H=6,75 N=26,47 370,2 372,2
5 2-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-3methoxybenzylamino isopropyl C=62,08;H=7,60 N=23,00 424,3 426,3
6 4-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-3methoxybenzylamino isopropyl C=62,06;H=7,61 N=23,O3 424,3 426,3
7 3-aminopropylamino 2-hydroxy-3methoxybenzylamino isopropyl C=59,21;H=7,08 N=25,4l 384,2 386,3
8 (3-amino-2hydroxypropyl)amino 2-hydroxy-3methoxybenzylanino isopropyl C=56,54;H=7,08 N-24.41 400,5 402,5
9 (2-amino-2· methylpropyljamino 2-hydrexy-3methoxybenzylamino isopropyl C-59,91J3=7,28 N=24,71 398,5 400,5
10 4-aminobutylamino 2-hydroxy-3methoxybenzylamino isopropyl C59.S4;H-7,I8 N=25,41 398,5 400,5
11 2-aminoethylamino 2-hydroxy-3-methylbenzylamino isopropyl C=60,82;H=6,99 N=27,58; 354,3 356,3
12 2-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-3-methylbenzylamino isopropyl C=64,52;H=7,63 N=23,92; 408,3 410,3
13 4-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-3-methylbenzylamirD isopropyl C=64,58;H=7,60 N=23,92; 408,3 410,3
14 3-aminopropylaminO 2-hydroxy-3-methylbenzylamino isopropyl C=6I,77;H=7,38 51=26,50 368,3 370,3
15 2-aminoethylamino 2-fluorbenzylamino isopropyl C=59,43;H=6,47 N=28,55 342,3 344,3
16 2-aminocyklohexylamino 2-fluorbenzylamino isopropyl O63,44;H=7,10 N=24,66 396,3 398,3
17 4-aminocykldaexylamino 2-fluorbenzylamino isopropyl C=63,46;H=7,1O N=24,66 396,3 398,3
18 3-aminopropylamino 2-fluorbenzylamino isopropyl C=60,49;H=6,75 N=27,43 356,3 358,3
19 2-aminoethylamino 3-fluoibenzylamino isopropyl 059,46:11=6,48 N=28,54 342,3 344,3
20 2-aminocyklohexylamino 3-fluorbcnzylamino isopropyl C=63,45;H=7t12 N=24,66 396,3 398,3
21 4-aminocyklohexylamino 3-fluorbenzylamino isopropyl C=63,46;H=7,12 N=24.66 396,3 398,3
22 3-aminopropylamino 3-fluorbenzylamino isopropyl C=60,49;H=6,77 N=27,40 356,3 358,3
23 (3-amino-2hydroxypropyl)amino 3-fluorbenzylamino isopropyl C=57,49;H=6,47 N=26,40 372,4 374,4
24 (2-amino-2mcthyipropyljammo 3-fluorbenzylamino isopropyl C=60,49;H=6,77 N=27,40 370,5 372,5
25 4-aminobutylamino 3-fluorbenzylamino isopropyl C=60,49;H=6,77 N=27,40 370,5 372,5
26 2-aminoethylamino 4-fluorbenzylamino isopropyl C=59,45;H=6,49 N=28,50 342,3 344,3
27 2-aminocyklohexylamino 4-fluorbenzylamino isopropyl C=63,45;H=7,11 N=24,65 396,3 398,3
28 4-aminocyklohexylamino 4-fluorbenzylamino isopropyl C=63,46;H=7,12 N=24,66 396,3 398,3
29 3-aminopropylamino 4-fluorbenzylamino isopropyl C=6O,5O;H=6,78 N=27,40 356,3 358,3
30 2-aminoethylamino 2-chlorbenzylamino isopropyl C=56,74;H=6,I5 N=27,24;C1=9,85 358,3 360,3
31 2-aminocyklohexylamino 2-chlorbenzylamino isopropyl C=60,93 ;H“6.82 N=23,68;C1=8,55 412,3 414,3
32 4-aminocyklohcxylamino 2-chloťbenzylamino isopropyl 060,91 ;H=6,86 N=23,68;CI=8,55 412,3 414,3
33 3-aminopropylamino 2-chlorbenzylarilitlO isopropyl C=57,80;H=6,47 N=26,22;CI=9,48 372,3 374,3
34 2-aminoethylamino 3-chlorbenzylaniino isopropyl O56,76;H=6,16 N=27,24,CI=9,85 358,3 360,3
35 2-aminocyklohexylamino 3-chlorbenzylamino isopropyl 060,93,06.82 N=23,68;CI=8,56 412,3 414,3
36 4-aminocyklohexylamino 3-chlorbcnzylamino isopropyl C=60,90;H=6,86 N=23,67;C1=8,55 412,3 414,3
37 3-aminopropylamino 3-chlorbenzylamino isopropyl C=57,82;H=6,48 N=26,22;CI=9,48 372,3 374,3
38 2-aminoethylamino 2-hydroxybenzyl amino isopropyl 059,81 ;H=6,79 N-28,70 340,3 342,3
39 2-aminocyklohexylamino 2-hydroxybenzylamino isopropyl O63,77;H=7,38 N=24,77 394,3 396,3
40 4-aminocyklohexylamino 2-hydroxybenzy lamino isopropyl C=63,79;H=7,39 N=24,77 394,3 396,3
41 3-aminopropylamino 2-hydroxybenzylamino isopropyl 060,83;H=7,04 N=27,62 354,3 356,3
42 (3-amino-2hydroxypropyl)amino 2-hydroxybenzylam ino isopropyl 058,08,H=6,70 N=26,64 370,3 372,4
43 (2-amino-2methylpropyl)amino 2-hydroxybenzylamino isopropyl O61,55;H=7,40 N=26,71 368,5 370,5
44 4-aminobutylamino 2-hydroxybenzylamino isopropyl C=61,63;H=7,34 N=26,62 368,5 370,5
45 2-aminůethylamiti0 2-aminobenzyl amino isopropyl C=59,98;H=7,11 N=32,91 339,3 341,3
46 2-aminocyklohexylamino 2-aminobenzylamino isopropyl C=63,92;H=7,63 N=28,32 393,3 395,3
47 4-aminocyklohexylamino 4-aminobenzylamino isopropyl C=63,96;H=7,62 N=28,32 393,3 395,3
48 3-aminopropylamino 4-aminobenzylamino isopropyl C=67,02;H=7,40 N=31,60 353,3 355,3
49 2-aminocthylamino 3-methoxybenzylamino isopropyl 060,83;H=7,06 N=27,62 354,3 356,3
50 2-aminocyklohexylamino 3-tnethoxybenzyl amino isopropyl C=64,5O;H=7,53 N=23,86 408,3 410,3
51 4-aminocyklohexylamino 3-methoxybenzylamino isopropyl C=64,52;H=7,66 N-23,94 408,3 410,3
52 3-aminopropylamino 3-methoxybenzylamino isopropyl O61,77;H=7,32 N=26,50 368, 370,3
53 2-aminoethy lamino 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino isopropyl C=56,8O;H=6,16 N=27,27 358,3 360,3
54 2-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino isopropyl C=61,02;H=6,82 N=23,70 412,3 414,3
55 4-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino isopropyl C=61,00;H=6,84 N=23,70 412,3 414,3
56 3-aminopropylamino 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino isopropyl C=57,89;H=6,48 N=26,28 372,3 374,3
57 (3-amino-2hydroxypropyl)amino 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino isopropyl C=55,35;H=6,17 N=25,44 388,4 390,4
58 (2-amino-2methylpropyljamino 2-hydroxy-5-fluorbenzy lamino isopropyl C=58,64;H=6,59 1 N=25,52 386,5 388,5
59 4-aminobutyl amino 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino isopropyl C=58,69;H=6,78 N=25,48 386,5 388,5
60 2-aminoethyl amino 2-hydroxy-5-chlorbenzylamíno isopropyl C=54,33;H=5,90 N=26,01 374,3 376,3
61 2-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino isopropyl C=58,67;H=6,56 N=22,80 428,3 430,3
62 4-aminocyklohexylamino 2-hydroxy-5 -chlorbenzy lamino isopropyl C=58,65;H=6,55 N=22,80 428,3 430,3
63 3-aminopropylamino 2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino isopropyl C=55,45;H=6,20 N=25,21 388,3 390,3
64 2-aminocyklchexylamino 2,3-difluorbenzylamino isopropyl 060,5,11=6.3 N=23,80 414,5 416,5
65 4-aminocyklchexylamino 2,3-difluorbenzylamino isopropyl C=60,5;H=6,5 N=23,90 414,5 416,5
66 3-aminopropylamino 2,3-difluorbenzylamino isopropyl C=57,5;H=6,2 N=26,2 374,4 376,4
67 2-aminocykiohexylamino 3,4-difluorbenzylamino isopropyl C=60,4;H=6,4 N=23,80 414,5 416,5
68 4-aminocyklohexyiamino 3,4-difluorbenzylamino isopropyl O60,7;H=6,4 N=23,90 414,5 416,5
69 3-aminopropylamino 3,4-difl uorbenzylamino isopropyl C=57,7;H=6,2 N=26,l 374,4 376,4
70 2-aminocyklohexylamino 2,3,4-trifluorbenzylamino isopropyl C=57,9;H=6,1 N=22,80 432,5 434,5
71 4-aminocyklohcxylamino 2,3,4-trifluorbenzylamino isopropyl C=58,0;H=6,0 N=22,80 432,5 434,5
72 3-aminopropylamino 2,3,4-trifl uorbenzylamino isopropyl C=54,5;H=5,3 N=25,2 392,4 394,4
73 2-aminocyklohexylamino 2,3-dichlorbenzylamino isopropyl C=56,0;H=6,l N=22,3 446,4 448,4
74 4-aminocyklohexylamino 2,3-dichlorbenzyIamino isopropyl C=55,8,H=6,51 N=22,0 446,4 448,4
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 6
Vliv sloučeniny 1 a ROSC proliferaci VSMC buněk
Izolace a kultivace buněk vaskulárního hladkého svalstva (VSMC). VSMC používané v této studii pocházejí ze dvou nezávislých izolací z potkaních hrudních aort 3 sourozenců potkanů Sprague-Dawley. Aorty byly dokonale očištěny do okolních tkání, promyty v PBS a inkubovány v digesčním pufru po 3 h (RAM’s F12 medium doplněné 253 U/ml kolagenasy II, 10 mM HEPES, 0,28 mM kys. askorbová, 0,1 % BSA) po dobu 15 min při 37 °C. Po centrifugaci po dobu 10 min při 230 g byl supernatant odstraněn a buňky inkubovány ve standardním mediu (DMEM doplněný 2 mM L-glutaminem, 100 U/ml penicillinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10 % telecího séra) v humidifikovaném inkubátoru při 37 °C a v přítomnosti 5 % CO2. Čistota VSMC kultur byla kontrolována imunobarvením α-aktinu hladkého svalstva FITC-značenými protilátkami. VSMC byly vysety v indikované hustotě a po 24 h vyhladověny bez séra (standardní medium, 0,1% telecí serum) po dobu dalších 24 h před všemi experimenty. Byly použity pasáže 6 až 14.
5-bromo-2’-deoxyuridinový (BrdU) inkorporační test. Pro měření syntézy DNA byla stanovena inkorporace BrdU za použití buněčného proliferačního testu (Roche Diagnostics). VSMC byly vysety do černých 96-jamkových destiček (2 x 104 buněk na jamku), vyhladověny bez séra, předošetřeny testovanými sloučeninami nebo vehikulem (DMSO 1%) po dobu 30 min a následně stimulovány PDGF-BB (20 ng/ml). Po 4 h byl přidán BrdU (10 μΜ) a buňky byly dále kultivovány po dobu 20 h. Poté byly buňky fixovány a označeny enzymaticky značenými anti-BrdU protilátkami podle návodu výrobce. Relativní světelné jednotky (RLU) byly stanoveny pomocí 96-jamkového destičkového readeru (TECAN GENios Pro™). Experimenty byly provedeny v triplikáech.
Panel 26 nových syntetických derivátů byly screenován pro obecnou antiproliferativní aktivitu v VSMC kulturách pomocí barvení křištálovou violetí. Tento test ukázal, že derivát č. 1, který měl nej vyšší účinnost, je mnohem účinnější než známý roskovitin (ROSC). Z těchto důvodů jsme proto porovnali účinnosti obou sloučenin na PDGF-BB (20 ng/ml)indukovanou syntézu DNA za použití BrdU inkorporačního testu. DNA-syntéza byla dávkově závisle redukována oběma sloučeninami, přičemž sloučenina 1 vykazovalal opět mnohem silnější antiproliferativní aktivitu na VSMC (IC50: 3 μΜ) než ROSC (IC50: 17 μΜ) (Obr. 1).
V zájmu vyloučení potenciální cytotoxicity jsme průběžně monitorovali morfologické změny v porovnání se staurosporinem jako pozitivní kontrolou (Allen et al. 2005, Immunol. Cell Biol. 83:651-667). Buňky ošetřené až 5 μΜ sloučeniny 1 a 20 μΜ ROSC nevykazovaly žádné známky apoptózy (Obr. 2). Na rozdíl oproti staurosporinu nedošlo k poklesu počtu buněk po ošetření látkou 1 (3-10 μΜ) a ROSC (15-25 μΜ) po 48 h pod úroveň kontroly (Obr. 3). V souhlasu s těmito výsledky prokázalo značení trypanovou modří v buňkách ošetřených sloučeninou 1 (3-10 μΜ) a ROSC (15-25 μΜ) při porovnání s kontrolními buňkami více než 94 % VSMC viabilních 48 h po ošetření. Pro další experimenty jsme proto používali 5 μΜ sloučeniny 1 a 20 μΜ ROSC, což je koncentrace ROSC obvykle užívaná i pro jiné typy buněk.
Příklad 7
Vli sloučeniny 1 a ROSC na progresi buněčného cyklu a časný PDGF-BB-indukovaný signaling ve vaskulámích buňkách hladkého svalstva (VSMC)
Barvení propídium iodidem (PI) a flow cytometrické analýzy buněčného cyklu
Distribuce buněčného cyklu VSMC byla stanovena po značení propidium iodidem (PI) podle Riccardi a Nicoletti (Riccardi and Nicoletti, Nat Protoč 2006, 1(3):1458-1461). Krátce, VSMC byly naočkovány do 12-jamkových destiček (1 x 105 buněk na destičku), serumvyhladovělé, předošetřené testovanými sloučeninami nebo vehikulem (DMSO 1%) po dobu 30 min a následně stimulované PDGF-BB (20 ng/ml). Po 8 až 28 h byly buňky trypsinizovány, fixovány chladným HFS pufrem (0,1% (w/v), citrát sodný 0,1% (v/v) Triton X-100 v PBS) obsahující 50 pg/ml PI a inkubovány 2 h při 4 °C. 10,000 buněk bylo analyzováno flow cytometricky na přístroji FACSCalibur™. Experimenty byly provedeny v triplikátech.
Poté jsme vyzkoušeli, zda-li sloučenina 1 a ROSC zastavuje VSMC ve specifické fázi buněčného cyklu (Obr. 4 a 5). Obr. 4 ukazuje časově závislý vstup serum-vyhladovělých VSMC buněk do S-fáze buněčného cyklu po DGF-BB stimulaci v přítomnosti nebo v nepřítomnosti sloučeniny 1 a ROSC (8 až 28 h). PDGF-BB vedl k signifikantně zvýšenému počtu buněk v S- fázi a to již 10 h po aplikaci stimulu, což naznačuje, že buňky procházejí pozdní Gl-fází po přibližně 6 až 8 h a nastupují přechod S-fáze po 8 až 10 h (černé sloupce). Ošetření 5 μΜ sloučeniny 1 kompletně zrušilo PDGF-BB-indukovaný vstup do S-fáze, kdežto 20 μΜ CDK inhibitoru ROSC pouze slabě snížilo, dříve zpomalilo progres buněčným cyklem o přibližně 8 až 10 h (šedé sloupce). Konsistentně ukázaly ROSC-ošetřené buňky rovněž zpožděný vstup do G2/M-fáze (Obr.5). Následující experimenty dokonce s 25 μΜ ROSC po dobu až 48 h nevykázalo žádnou akumulaci VSMC ve specifické fázi buněčného cyklu.
Dále jsem zjišťovali, zda-li kterákoliv z testovaných látek interferuje s časnými signálními událostmi downstream PDGF receptorů. Použitím western blot analýz jsme vyloučili jakékoliv inhibiční vlivy ROSC nebo sloučeniny 1 na fosforylaci MAPK kinas (p38, ERK, JNK) nebo aktivaci Akt a STAT3 kinas (Obr. 6). Přestože některé literární odkazy naznačují interakci ROSC s aktivací MAPK, naše výsledky toto nepotvrzují a to i při testování při použití mnohem vyšších koncentrací obou sloučenin (10 μΜ sloučeniny 1 a 25 μΜ ROSC) a prodloužené inkubační doby (15 h).
Příklad 8
Vliv sloučeniny 1 a ROSC na klíčové regulatory buněčného cyklu
S cílem dále charakterizovat antiproliferativní účinky nových sloučenin jsme studovali časově závislé změny exprese a aktivity klíčových regulátorů buněčného cyklu vlivem PDGF-BB stimulace v aktivovaných buňkách vaskulámího hladkého svalstva za přítomnosti sloučeniny 1 a ROSC. Obr. 7a ukazuje, že hladina cyklinu Dl vzrůstá od 4 h až do 24 h po PDGF-BB stimulaci. ROSC a sloučenina 1 nejen že nesnížily, ale dokonce zvýšily významně hladiny cyklinu Dl v porovnání s kontrolními buňkami, což naznačilo, že obě sloučeniny neinterferují s časnými signálními událostmi vedoucími k výstupu z buněčného cyklu a jeho progresi. V souhlasu s flow cytometrickými daty vstupu do S-fáze (Obr. 4), sloučenina 1 inhibovala expresi S-fázového cyklinu A, kdežto ROSC pouze oddaloval expresi tohoto cyklinu (Obr. 7b). V PDGF-aktivovaných buňkách, v souhlasu s aktivací CDK4/6 cyklinem Dl a CDK2 cykliny A/E (Obr. 7b,c), jsou pocket proteiny jako například retinoblastomový protein (Rb) a pl07, hlavní cíle CDK, hyperfosforylovány od pozdní Gl-fáze (6 až 8 h) směrem vpřed (Obr. 8). Ošetření sloučeninou 1 kompletně zrušilo, kdežto ROSC opět pouze zpomalil, počátek hyperfosforylace PDGF-BB-indukovaných pocket proteinů (Obr. 8).
Obě sloučeniny inhibovaly expresi cyklinu E (Obr. 7c), regulujíce hlavně rodinu E2F transkripčních faktorů downstream pRb; nicméně, tato data jsou méně jasná a to díky faktu, že vehikulem-ošetřené buňky již vykazovaly vysoké hladiny cyklinu E, které byly jen mírně zvýšeny jako odpověd na PDGF-BB.
Závěrem lze tedy konstatovat, že cykliny a fosfory lace pocket proteinů naznačují, že sloučenina 1 přímo interferuje s CDK aktivitou v PDGF-aktivovaných VSMC.
Příklad 9
Suché tobolky
5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin vzorce I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složeni
Aktivní složka 1250 g
Talek180 g
Pšeničný škrob120 g
Magnesium stearát 80 g
Laktosa20 g
Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsí je přenesena do žeiatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 10
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek o vzorci I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
Lauroglykol 2 litry
Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 11
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
PEG 400 1 litr
Tween 80 1 litr
Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylengíykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 pm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
H°V
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I,
    R7
    a jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde
    R7jeR7*-NH-;
    R7’ je vybráno ze skupiny zahrnující aryl a arylalkyl, ve kterém každá z těchto skupin může být případně substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující halogen, hydroxy, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy a amino skupinu;
    R5jeR5’-NH-;
    R5’ je vybráno ze skupiny zahrnující lineární nebo rozvětvený alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl a cykloalkyl alkyl, ve kterém každá z těchto skupin může být případně substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny zahrnující amino a hydroxy skupinu, pro použití jako léčiva.
  2. 2. 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle nároku
    1 pro použití pro inhibici proliferace a indukci apoptózy v savčích buňkách.
  3. 3. 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití při prevenci, inhibici a/nebo léčbu abnormální proliferace buněk hladkého svalstva.
  4. 4. 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití pro prevenci, inhibici a/nebo léčbu restenózy.
  5. 5. 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou ve formě (R) nebo (S) isomerů v případě chirality v pozici R5 nebo R7.
  6. 6. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden 5,7disubstituovaný-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin obecného vzorce I podle nároku 1 a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič.
  7. 7. 5,7-Disubstituované-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce la,
    ve kterém je R5 vybrán ze skupiny zahrnující alkyl-NH-, alkenyl-ΝΗ-, alkynyl-NH-, cykloalkyl-ΝΗ-, kde každá z těchto skupin může být substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným z amino a hydroxy skupin; a
    R7 je vybrán ze skupiny zahrnující 2-fluorbenzylamino, 3-fluorbenzylamino, 4fluorbenzylamino, 2-chlorbenzylamino, 3-chlorbenzylamino, 4-chlorbenzylamino, 2,3difluorbenzylamino, 3,4-difluorbenzylamino, 2,3,4-trifluorbenzylamino, 3methoxybenzylamino, 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino, 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino, 3hydroxy-5-chlorbenzylamino, 4-aminobenzylamino.
  8. 8. 5,7-Disubstituované-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce la podle nároku 7, kde R5 je vybrán ze skupiny zahrnující 2-aminoethylamino, 3-aminopropylamino, 4-aminobutylamino, 2-aminocyklohexylamino, 3-aminocyklohexy lamino, 4aminocyklohexylamino, (3-amino-2-hydroxypropyl)amino, [2-(2-aminoethoxy)ethyl]amino a (2-amino-2-methylpropyl)amino.
CZ20090358A 2009-06-03 2009-06-03 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující CZ2009358A3 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090358A CZ2009358A3 (cs) 2009-06-03 2009-06-03 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující
PCT/CZ2010/000066 WO2010139288A1 (en) 2009-06-03 2010-06-02 5,7-disubstituted 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidines for use as medicaments and pharmaceutical compositions

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090358A CZ2009358A3 (cs) 2009-06-03 2009-06-03 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2009358A3 true CZ2009358A3 (cs) 2010-12-15

Family

ID=42935540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20090358A CZ2009358A3 (cs) 2009-06-03 2009-06-03 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ2009358A3 (cs)
WO (1) WO2010139288A1 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307147B6 (cs) * 2015-05-14 2018-02-07 Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i. 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ308056B6 (cs) * 2015-07-20 2019-11-27 Ustav Experimentalni Botaniky Av Cr V V I 5-Substituované-7-[4-(substituované)benzyl]amino-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako antirevmatika, a farmaceutické přípravky

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1348707T3 (da) * 2002-03-28 2010-12-13 Ustav Ex Botan Av Cr V V I Inst Of Ex Botany Academy Of Sciences Of The Czech Republic Pro Pyrazolo[4,3-d]pyrimidiner, fremgangsmåder til deres fremstilling samt deres terapeutiske anvendelse
KR20070026306A (ko) * 2003-10-28 2007-03-08 레디 유에스 테라퓨틱스 인코포레이티드 헤테로시클릴 화합물 및 그의 제조방법과 그의 용도

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ307147B6 (cs) * 2015-05-14 2018-02-07 Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i. 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010139288A1 (en) 2010-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2558092B1 (en) Combination comprising a cyclin dependent kinase 4 or cyclin dependent kinase 6 (cdk4/6) inhibitor and an mtor inhibitor for treating cancer
Li et al. Anticancer activities of harmine by inducing a pro-death autophagy and apoptosis in human gastric cancer cells
Song et al. Specific inhibition of cyclin-dependent kinases and cell proliferation by harmine
EP2870157B1 (en) Selective pi3k delta inhibitors
Marko et al. Inhibition of cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) by indirubin derivatives in human tumour cells
JP5566992B2 (ja) Ｊａｋおよび他のプロテインキナーゼの阻害剤として有用なアザインドール
JP5830094B2 (ja) 置換イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンおよび−ピリジン
KR20230173083A (ko) Cdk 억제제 및 이의 사용 방법
WO2019141254A1 (zh) 一种mTOR抑制剂、药物组合物及其应用
Daoud et al. B-9-3, a novel β-carboline derivative exhibits anti-cancer activity via induction of apoptosis and inhibition of cell migration in vitro
Geng et al. Harmines inhibit cancer cell growth through coordinated activation of apoptosis and inhibition of autophagy
KR20080018908A (ko) 암 치료용 디아릴 우레아 화합물 및 ｐｉ３, ａｋｔ 키나제또는 ｍｔｏｒ 억제제 (라파마이신)를 포함하는 병용요법
Conejo-García et al. Synthesis and anticancer activity of (RS)-9-(2, 3-dihydro-1, 4-benzoxaheteroin-2-ylmethyl)-9H-purines
WO2016151501A1 (en) Pharmaceutical combinations
JP2020530833A (ja) ピロロピリミジン及びピロロピリジン誘導体
EP1104423A1 (en) Anhydride modified cantharidin analogues useful in the treatment of cancer
WO2021229452A1 (en) Purine derivatives as sik-3 inhibitors
CZ2009358A3 (cs) 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující
Guo et al. Rhabdastrellic acid‐A inhibited PI3K/Akt pathway and induced apoptosis in human leukemia HL‐60 cells
Komina et al. Action of resveratrol alone or in combination with roscovitine, a CDK inhibitor, on cell cycle progression in human HL-60 leukemia cells
WO2013104611A1 (en) Substituted pyrazolopyrimidines as akt kinase inhibitors
Ferri et al. Fluvastatin synergistically improves the antiproliferative effect of everolimus on rat smooth muscle cells by altering p27Kip1/cyclin E expression
Zahran et al. Mode of action of potassium salt of 2-thioxo-4-hydroxycoumarin [3, 4-b] pyrimidine and 9-bromo-2-thioxo-hydroxycoumarin [3, 4-b] pyrimidine against Ehrlich Ascites carcinoma cells
CZ2016608A3 (cs) 2,6-disubstituované puriny pro použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky
Castroagudín et al. Safety of an immunosuppressant protocol based on sirolimus in liver transplant recipients with malignancies or high risk of tumor recurrence