DE60308893T2

DE60308893T2 - Quinolinyl-pyrrolopyrazole

Info

Publication number: DE60308893T2
Application number: DE60308893T
Authority: DE
Inventors: Wade Douglas Frankfort BEIGHT; SCOTT Jason Indianapolis SAWYER; Michael Jonathan Fishers YINGLING
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2023-11-11
Also published as: CN1714090A; US7265225B2; EA008387B1; CA2501322C; PT1565471E; HRP20050436B1; ES2273046T3; US20080027102A1; KR20050083945A; KR101057282B1; US7834029B2; WO2004048382A1; MXPA05005432A; EA200500859A1; ATE341550T1; AU2003291643A1; ZA200503121B; EG25822A; JP4542906B2; US20060040983A1

Description

Die Erfindung betrifft neue Chinolinylpyrazolverbindungen und ihre Verwendung als pharmazeutische Mittel, insbesondere ihre Verwendung als TGF-beta Signaltransduktionsinhibitoren.
Hintergrund der Erfindung
Die transformierenden Wachstumsfaktor-beta-polypeptide (TGF beta) ("TGF-β") beeinflussen Wachstum, Differenzierung und Genexpression in vielen Zelltypen. Das erste Polypeptid dieser Familie, das charakterisiert wurde, nämlich TGF-β1, hat zwei identische 112 Aminosäuren große Untereinheiten, die kovalent verbunden sind. TGF-β1 ist ein hoch konserviertes Protein mit nur einer einzigen Aminosäure Unterschied, die den Menschen von der Maus unterscheidet. Es gibt zwei andere Vertreter der TGF-β Genfamilie, die in Säugern exprimiert werden. TGF-β2 ist zu TGF-β1 zu 71 % homolog (de Martin et al. (1987) EMBO J. 6: 3673–3677), wobei TGF-β3 zu 80 % homolog zu TGF-β1 ist (Derynck et al. (1988) EMBO J. 7: 3737–3743). Die strukturellen Eigenschaften von TGF-β1, wie sie durch Kernmagnetresonanz bestimmt wurden (Archer et al. (1993) Biochemistry 32: 1164–1171) stimmen mit der Kristallstruktur von TGF-β2 überein (Daopin et al. (1992) Science 257: 369–374, Schlunegger und Gruttler (1992) Nature 358: 430–434).
Es gibt mindestens drei unterschiedliche extrazelluläre TGF-β Rezeptoren, nämlich Typ I, II und III, die in den biologischen Funktionen von TGF-β1, β2 und β3 beteiligt sind (bezüglich Zusammenfassungen siehe Derynck (1994) TIBS 19: 548–553 und Massague (1990) Ann. Rev. Cell. Biol. 6: 597–641). Die Typ I und Typ II Rezeptoren sind Serin/Threonintransmembrankinasen, die in Gegenwart von TGF-β einen heteromeren Signalkomplex bilden (Wrana et al (1992) Cell 71: 1003–1014).
Der Aktivierungsmechanismus des heteromeren Signalkomplexes an der Zelloberfläche wurde untersucht (Wrana et al. (1994), Nature 370: 341–347). TGF-β bindet zuerst an den Typ II Rezeptor, der eine konstitutiv aktive Serin-Threonin-Transmembrankinase ist. Der Typ I Rezeptor wird anschließend in den Komplex einbezogen, an der GS Domäne phosphoryliert und aktiviert, um stromabwärts liegende Signalkomponenten zu phosphorylieren (beispielsweise Smad Proteine), um die intrazelluläre Signalkaskade zu initiieren. Von einem konstitutiv aktiven Typ I Rezeptor (T204D Mutante) wurde gezeigt, dass er effektiv TGF-β Reaktionen transduzieren kann und so die Erfordernis für TGF-β und den Typ II Rezeptor umgeht (Wieser et al. (1995) EMBO J. 14: 2199–2208). Obwohl keine Singnalfunktion für den Typ III Rezeptor gefunden wurde, erhöht er die Affinität von TGF-β2 für den Typ II Rezeptor, was es im wesentlichen gleich stark zu TGF-β1 und TGF-β3 macht (Lopez-Casillas et al. (1993) Cell 73: 1435–1444).
Vaskulären Endothelzellen fehlt der Typ III Rezeptor. Anstelle dessen exprimieren Endothelzellen ein strukturell verwandtes Protein, das Endoglin genannt wird (Cheifetz et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 19027–19030), das nur TGF-β1 und TGF-β3 mit hoher Affinität bindet. Daher spiegelt die relative Stärke der TGF-β's den Typ an Rezeptor wider, der in einem Zell- und Organsystem exprimiert wird. Zusätzlich zur Regulation der Komponenten im multifaktioriellen Signalweg beeinflusst die Verteilung der Synthese der TGF-β Polypeptide auch die physiologische Funktion. Die Verteilung von TGF-β2 und TGF-β3 ist begrenzter (Derynck et al. (1988) EMBO J. 7: 3737–3743) als die von TGF-β1, wobei beispielsweise TGF-β3 auf Gewebe mit mesenchymalem Ursprung beschränkt ist, während TGF-β1 sowohl in Geweben mesenchymalen als auch epithelialen Ursprungs vorkommt.
TGF-β1 ist ein multifunktionelles Cytokin, das für die Gewebereparatur entscheidend ist. Es werden hohe Konzentrationen an TGF-β1 an eine Verletzungsstelle durch Blutplättchengarnula geliefert (Assoian und Sporn (1986) J. Cell. Biol. 102: 1217–1223). TGF-β1 initiiert eine Reihe an Ereignissen, die die Heilung fördern, einschließlich die Chemotaxis von Zellen, wie Leukozyten, Monocyten und Fibroblasten und die Regulation von Wachstumsfaktoren und Cytokinen, die bei der Angiogenese beteiligt sind, mit Gewebereparatur assoziierte Zellteilung und Entzündungsreaktionen. TGF-β1 stimuliert auch die Synthese der extrazellulären Matrixkomponenten (Roberts et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4167–4171, Sporn et al. (1983) Science 219: 1329–1330, Massague (1987) Cell 49: 437–438) und am wichtigsten zum Verständnis der Pathophysiologie von TGF-β1 autoreguliert TGF-β1 seine eigene Synthese (Kim et al. (1989), J. Biol. Chem. 264: 7041–7045).
Die hierin beschriebenen Verbindungen können auch eine andere Kinaseaktivität zeigen, wie eine p38 Kinasehemmung und/oder KDR (VEGFR2) Kinasehemmung. Tests zur Bestimmung einer solchen Kinaseaktivität sind in der Technik bekannt und der Fachmann ist dazu fähig, die beschriebenen Verbindungen auf eine solche Aktivität zu testen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die beschriebene Erfindung betrifft auch die ausgewählte Verbindung der Formel II:
2-(6-Methylpyridin-2-yl)-3-[6-amidochinolin-4-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol und die pharmazeutisch annehmbaren Salze hiervon.
Die obige Verbindung ist allgemein beschrieben und beansprucht in der PCT Patentanmeldung PCT/US02/11884 vom 13. Mai 2002, die die Priorität der US Patentanmeldung 60/293 464 vom 24. Mai 2001 beansprucht, welche hiermit eingeführt ist. Die obige Verbindung wurde wegen eines überraschend überlegenen Toxikologieprofils gegenüber den Verbindungen ausgewählt, die speziell in der oben zitierten Anmeldung beschrieben sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Ausdruck "effektive Menge", wie er in "eine effektive Menge einer Verbindung der Formel I" verwendet wird, bezieht sich auf eine Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, die zur Hemmung von TGF-beta fähig ist.
Der Ausdruck μM bezieht sich auf Mikromolar.
Die allgemeinen chemischen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, haben ihre gewöhnlichen Bedeutungen.
Es werden die folgenden Abkürzungen in den Syntheseschemata und Beispielen verwendet:
DMF bezieht sich auf Dimethylformamid
THF bezieht sich auf Tetrahydrofuran
Ms bezieht sich auf Mesyl, das Methylsulfonyl ist
THP bezieht sich auf Tetrahydropyran
Die hierin beschriebenen Verbindungen können gemäß dem folgenden Schema und der Beispiele hergestellt werden. Die Beispiele sollen nicht so verstanden werden, dass sie die Art der Herstellung der Verbindungen auf irgendeine Weise beschränken.
Das folgende Schema erläutert die Herstellung der Verbindung der Formel I.
Schema I
Das folgende Schema erläutert die Herstellung der Verbindung der Formel II.
Schema II
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie dies schematisch in den Schemata I und II gezeigt ist.
Beispiel 1
Herstellung von 7-(2-Morpholin-4-yl-ethoxy)-4-(2-pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)chinolin
A. Herstellung von 4-(2-Pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)-7-[2-(tetrahydropyran-2-yloxy)ethoxy]chinolin
Es werden 4-(2-Pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)chinolin-7-ol (376 mg, 1,146 mmol), Cäsiumcarbonat (826 mg, 2,54 mmol) und 2-(2-Bromethoxy)tetrahydro-2H-pyran (380 μl, 2,52 mmol) in DMF (5 ml) bei 120°C für 4 Stunden erhitzt. Die Reaktion wird mit gesättigtem Natriumchlorid gestoppt und dann mit Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Reaktionsgemisch wird auf einer Silicagelsäule unter Elution mit Dichlormethan bis 10 % Methanol in Dichlormethan unter Bildung des gewünschten Untertitelzwischenprodukts als gelbes Öl (424 mg, 81 %) gereinigt.
MS ES⁺ m/e 457,0 (M + 1).
B. Herstellung von 2-[4-(2-Pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4N-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)chinolin-7-yloxy]ethanol
Eine Lösung aus 4-(2-Pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)-7-[2-(tetrahydropyran-2-yloxy)ethoxy]chinolin (421 mg, 0,92 mmol) in Essigsäure:Tetrahydrofuran:Wasser (4:2:1) (20 ml) wird erhitzt. Das Lösemittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit Chloroform:Isopropyl (3:1) aufgenommen. Die organische Phase wird mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Dann wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand ist rein genug für den nächsten Schritt im Schema (425 mg, 100 %).
MS ES⁺ m/e 373,1 (M + 1).
C. Herstellung von Methansulfonsäure-2-[4-(2-pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)chinolin-7-yloxy]ethylester
Es wird eine Lösung aus 4-(2-Pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)chinolin-7-yloxy]ethanol (293 mg, 0,78 mmol) und Methansulfonylchlorid (68 μl, 0,81 ml) in trockenem Pyridin (5 ml) für 2 Stunden gerührt. Das Pyridin wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit Chloroform erhalten. Die organische Phase wird mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen und über Natriumsulfat unter Bildung des gewünschten Untertitelprodukts als weißer Schaum (425 mg, 100 %) getrocknet.
MS ES⁺ m/e 451,1 (M + 1).
D. Herstellung von 7-(2-Morpholin-4-yl-ethoxy-4-(2-pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)-chinolin
Es wird Methansulfonsäure-2-[4-(2-pyridin-2-yl-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)-chinolin-7-yloxy]ethylester (87 mg, 0,19 mmol) mit Morpholin (1 ml) bei 50°C für 4 Stunden erhitzt. Das Morpholin wird im Vakuum entfernt und dann wird das Produkt mit Isopropylalkohol:Chloroform (1:3) extrahiert. Die organische Phase wird mit Natriumchlorid gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Dann wird im Vakuum unter Bildung des Titelprodukts als hellgelber Feststoff (83 mg, 100 %) konzentriert.
MS ES⁺ m/e 442,0 (M + 1).
Beispiel 2
Herstellung von 2-(6-Methylpyridin-2-yl)-3-[6-amidochinolin-4-yl)-5,6-dihydro-4N-pyrrolo[1,2-b]pyrazol
A. Herstellung von 6-Brom-4-methyl-chinolin
Es wird eine Lösung aus 4-Brom-phenylamin (1 Äquivalent) in 1,4-Dioxan gerührt und auf etwa 12°C gekühlt. Dann wird Schwefelsäure (2 Äquivalente) langsam zugegeben und am Rückfluss erhitzt. Methylvinylketon (1,5 Äquivalente) wird tropfenweise in die Lösung am Rückfluss gegeben. Die Lösung wird für 1 Stunde erhitzt, nachdem die Zugabe vollständig ist. Die Reaktionslösung wird zur Trockne ein gedampft und in Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird mit 1 M Natriumcarbonat auf pH 8 eingestellt und dreimal mit Wasser extrahiert. Eine Chromatographie des Rückstands auf SiO₂ (70/30) Hexan/Ethylacetat) ergibt das gewünschte Untertitelzwischenprodukt.
MS ES⁺ m/e = 158,2 (M + 1).
B. Herstellung von 6-Methyl-pyridin-2-carbonsäuremethylester
6-Methylpyridin-2-carbonsäure (10 g, 72,9 mmol) wird in Methylenchlorid (200 ml) suspendiert. Dann wird es auf 0°C gekühlt. Methanol (10 ml), 4-Dimethylaminopyridin (11,6 g, 94,8 mmol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) (18,2 g, 94,8 mmol) werden zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt, mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Gemisch wird filtriert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie des Rückstands auf SiO₂ (50 % Ethylacetat/Hexan) ergibt 9,66 g (92 %) des gewünschten Untertitelzwischenprodukts als farblose Flüssigkeit.
¹H NMR (CDCl₃) δ 7,93-7,88 (m, 1H), 7,75-7,7 (m, 1H), 7,35-7,3 (m, 1H), 4,00 (s, 3H), 2,60 (s, 3H).
C. Herstellung von 2-(6-Brom-chinolin-4-yl)-1-(6-methylpyridin-2-yl)ethanon
6-Brom-4-methylchinolin (38,5 g, 153 mmol) wird in 600 ml trockenem THF gelöst. Es wird auf –70°C gekühlt und mit der tropfenweisen Zugabe von 0,5 M Kaliumhexamethyldisilazan (KN(SiMe₃)₂ (400 ml, 200 mmol) über 2 Stunden behandelt, während die Temperatur unter –65°C gehalten wird. Die entstehende Lösung wird bei –70°C für 1 Stunde gerührt und eine Lösung aus 6-Methylpyridin-2-carbonsäuremethylester (27,2 g, 180 mmol) in 100 ml trockenem THF wird tropfenweise über 15 Minuten zugegeben. Während der Zugabe verändert sich das Gemisch von dunkelrot zu erbsengrün und bildet einen Niederschlag. Das Gemisch wird bei –70°C für 2 Stunden gerührt und kann sich dann unter Rühren für 5 Stunden auf Umgebungstemperatur erwärmen. Das Gemisch wird gekühlt und dann mit 12 N HCl auf pH ∼1 gestoppt. Der pH wird mit festem Kaliumcarbonat auf 9 erhöht. Die Lösung wird aus den Feststoffen dekantiert und zweimal mit 200 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen und über Kaliumcarbonat getrocknet. Die Feststoffe werden in 200 ml Wasser und 200 ml Ethylacetat gerührt und mit zusätzlichem Kaliumcarbonat behandelt. Die organische Portion wird abgetrennt und die vorherigen Ethylacetatextrakte werden getrocknet. Die Lösung wird im Vakuum zu einem dunklen Öl konzentriert. Das Öl wird durch ein 300 ml Silicakissen mit Methylenchlorid und dann Ethylacetat gegeben. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum unter Bildung eines hellbraunen Öls konzentriert. Das Öl wird von den Kolbenseiten mit Methylenchlorid heruntergewaschen und wird dann mit Hexan verdünnt, während der Kolben unter Bildung von 38,5 g (73,8 %) des gewünschten Untertitelzwischenprodukts als gelber Feststoff gedreht wird.
MS ES⁺ = 341 (M + 1).
D. Herstellung von 1-[2-(6-Bromchinolin-4-yl)-1-(6-methylpyridin-2-yl)-ethylidenamino]pyrrolidin-2-on
Ein Gemisch aus 2-(6-Bromchinolin-4-yl)-1-(6-methylpyridin-2-yl)ethanon (38,5 g, 113 mmol) und 1-Aminopyrrolidinonhydrochlorid (20 g, 147 mmol) in 115 ml Pyridin wird bei Umgebungstemperatur für 10 Stunden gerührt. Es werden etwa 50 g an 4 Å inaktivierten Sieben zugegeben. Das Rühren wird für weitere 13 h fortgesetzt und 10–15 g Silica werden zugegeben und das Gemisch wird durch ein 50 g Sili cakissen filtriert. Das Silicakissen wird mit 3 l Ethylacetat eluiert. Die Filtrate werden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Der Hydrazonniederschlag wird durch Filtration gesammelt und unter Bildung von 33,3 g (69,7 %) des gewünschten Untertitelzwischenprodukts als nicht ganz weißer Feststoff getrocknet.
MS ES⁺ = 423 (M + 1).
E. Herstellung von 6-Brom-4-[2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]chinolin
Zu einem Gemisch aus Cäsiumcarbonat (1,2 Äquivalente) und 1-[2-(6-Bromchinolin-4-yl)-1-(6-methylpyridin-2-yl)ethylidenamino]pyrrolidin-2-on (33,3 g, 78,7 mmol) werden 300 ml trockenes N,N-Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird für 20 Stunden bei 100°C gerührt. Das Gemisch wird während der Reaktion dunkel. N,N-Dimethylformamid wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird dann zwischen Wasser und Methylenchlorid aufgeteilt. Die wässrige Portion wird mit zusätzlichem Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Lösungen werden durch ein 300 ml Silicakissen unter Elution mit 1,5 l Methylenchlorid, 1,5 l Ethylacetat und 1,5 l Aceton filtriert. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Der entstehende Niederschlag wird durch Filtration unter Bildung von 22,7 g (71,2 %) des gewünschten Untertitelzwischenprodukts als nicht ganz weißer Feststoff gesammelt.
MS ES⁺ = 405 (M + 1).
F. Herstellung von 4-[2-(6-Methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]chinolin-6-carbon-säuremethylester
6-Brom-4-[2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]chinolin (22,7 g, 45 mmol) wird zu einem Gemisch aus Natriumacetat (19 g, 230 mmol) und dem Palladiumkatalysator [1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocen]dichlorpalladium(II) mit Dichlormethan (1:1) (850 mg, 1,04 mmol) in 130 ml Methanol gegeben. Das Gemisch wird unter 50 psi Kohlenmonoxidatmosphäre gesetzt und gerührt, während es über 1 Stunde auf 90°C erwärmt wird und wobei zusätzliches Kohlenmonoxid zugegeben wird. Das Gemisch kann über 8 Stunden kühlen und wird wieder mit Kohlenmonoxid befüllt und auf 90°C erhitzt. Der Druck kann auf etwa 75 psi ansteigen. Die Reaktion ist nach etwa einer Stunde vollständig, wenn der Druck stabil ist und die TLC (1:1 Toluol/Aceton) anzeigt, dass kein Bromid mehr vorhanden ist. Dann erfolgt eine Auftrennung des Gemisches zwischen Methylenchlorid (600 ml) und Wasser (1 l). Die wässrige Portion wird mit einer zusätzlichen Portion Methylenchlorid (400 ml) extrahiert. Die organische Lösung wird durch ein 300 ml Silicakissen filtriert und mit 500 ml Methylenchlorid, 1200 ml Ethylacetat und 1500 ml Aceton gewaschen. Die Acetonmenge wird verworfen. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt und unter Bildung von 18,8 g (87,4 %) des gewünschten Untertitelzwischenprodukts als pinkfarbenes Pulver konzentriert.
MS ES⁺ = 385 (M + 1).
G. Herstellung von 2-(6-Methylpyridin-2-yl)-3-[6-amidochinolin-4-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol
Ein Gemisch aus 4-(2-(6-Methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]chinolin-6-carbonsäuremethylester in 60 ml an 7 N Ammoniak in Methanol wird bei 90°C in einem Edelstahldruckgefäß für 66 Stunden erwärmt. Der Druck steigt auf etwa 80 psi. Der Druck wird für die Dauer der Reaktion aufrechterhalten. Das Gefäß wird gekühlt und das braune Gemisch wird im Vakuum konzentriert. Der restliche Feststoff wird auf zwei 12 g RediPak Kartuschen, die in Reihe geschalten sind, unter Elution mit Aceton gereinigt. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Der entstehende fast weiße Feststoff wird in Methylenchlorid suspendiert, mit Hexan verdünnt und filtriert. Der gesammelte nicht ganz weiße Feststoff 1,104 g (63,8 %) ergibt das gewünschte Titelprodukt.
MS ES⁺ = 370 (M + 1).
Die hierin beschriebenen Verbindungen werden durch die folgenden Protokolle für die TGF-β Hemmung getestet, wie dies im folgenden in der Protokollbeschreibung beschrieben ist.
Reinigung des TGF-β Rezeptors und der in vitro Kinasereaktionen
Für TGF-β Typ I (RIT204D) Rezeptoren:
Die cytoplasmatische Kinasedomäne jedes Rezeptors mit 6X-HIS Anhang wird aus Sf9 Insektenzelllysaten exprimiert und gereinigt, wie dies kurz unten beschrieben ist:
Die Zellpellets werden nach 48 bis 72 Stunden Infektion in Lysepuffer lysiert (LB: 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 % NP40 mit frisch zugegebenem 20 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, 1 mM PMSF, 1 × EDTA-freier kompletter Proteaseinhibitor (Boehringer Mannheim).
Die Zelllysate werden durch Zentrifugation gereinigt und mit 0,45 μM vor der Reinigung durch Ni/NTA Affinitätschromatographie (Qiagen) filtriert.
Chromatographieprotokoll:
Man äqilibriert mit 10 SV an LB, trägt die Probe auf, wäscht mit 10 SV RIPA Puffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 % NP40, 1 mM EDTA, 0,25 % Natriumdesoxycholat, wozu frisches 20 mM β-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF zugegeben wurde), wäscht mit 10 SV LB, wäscht mit 10 SV 1 × KB (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 1 mM NaF, 2 mM β-Mercaptoethanol) und eluiert mit einem linearen Gradienten aus 1 × KB, der 200 mM Imidazol enthält.
Beide Enzyme sind zu etwa 90 % rein und haben eine Autophosphorylierungsaktivität.
Reaktionen: 170 bis 200 nM Enzym in 1 × KB, Verbindungsverdünnungsreihe in 1 × KB/16 DMSO (20 μM bis 1 nM Endkonzentration mit 4 % DMSO Endkonzentration), wobei die Reaktionen durch die Zugabe von ATP Mix (4 μM ATP/1 μCi³³P-γ-ATP Endkonzentrationen) in 1 × KB gestartet werden.
Die Reaktionen werden für 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Die Reaktionen werden gestoppt und mittels TCA/BSA Fällung auf Millipore FB Glasfaserfilterplatten und durch Flüssigscintillationszählung auf einem MicroBeta Jet quantifiziert.
Die hierin beschriebenen Verbindungen hemmen die TGF-β Typ I (RIT204D) Rezeptorkinasedomäne mit HK₅₀ Werten < 20 μM, während sie eine geringere Toxizität in vivo aufweisen als strukturell verwandte Verbindungen, wie dies in PCT/US02/11884 beschrieben ist, die oben angegeben ist.
Bedingungen, die "durch eine erhöhte TGF-β Aktivität gekennzeichnet sind" umfassen jene, worin die TGF-β Synthese so stimuliert wird, dass TGF-β in erhöhten Mengen vorhanden ist oder worin latentes TGF-β Protein unerwünscht aktiviert oder in aktives TGF-β Protein umgewandelt wird oder worin die TGF-β Rezeptoren hochreguliert werden oder worin das TGF-β Protein eine erhöhte Bindung an Zellen oder eine extrazelluläre Matrix am Ort der Erkrankung zeigt. Daher bezieht sich "erhöhte Aktivität in jedem Fall auf einen Zustand, worin die biologische Aktivität von TGF-β unabhängig von der Ursache unerwünscht hoch ist.
Es werden mehrere Erkrankungen mit einer TGF-β1 Überproduktion assoziiert. Inhibitoren des intrazellulären TGF-β Signalwegs sind brauchbare Behandlungen für fibroproliferative Erkrankungen. Genauer gesagt umfassen fibroproliferative Erkrankungen Nierenstörungen, die mit einer unregulierten TGF-β Aktivität und exzessiver Fibrose assoziiert sind, einschließlich Glomerulonephritis (GN), wie eine mesangiale prolifertive GN, Immun GN und sichelförmige GN. Andere Nierenzustände umfassen diabetische Nephropathie, interstitielle Nierenfibrose, Nierenfibrose bei Transplantationspatienten, die Cyclosporin erhalten und HIV-assoziierte Nephropathie. Vaskuläre Kollagenstörungen umfassen progressive systemische Sklerose, Polymyositis, Sklerodermie, Dermatomyositis, Eosinophilenfaszitis, Morphea oder jene, die mit dem Auftreten des Raynaud's Syndrom assoziiert sind. Lungenfibrosen, die aus einer übermäßigen TGF-β Aktivität resultieren umfassen Atemstresssyndrom beim Erwachsenen, idiopathische pulmonale Fibrose und interstitielle Lungenfibrose, die oft mit autoimmunen Störungen assoziiert sind, wie systemischem Lupus erythematodes und Sklerodermie, chemischem Kontakt oder Allergien. Eine weitere autoimmune Störung, die mit fibroproliferativen Eigenschaften assoziiert ist, ist die rheumatoide Arthritis.
Augenerkrankungen, die mit fibroproliferativen Zuständen assoziiert sind, umfassen eine proliferative Vitreoretinopathie, die eine Retinawiederanheftungsoperation begleitet, eine Kataraktextraktion mit intraokularar Linsenimplantation und Postglaucomdrainagenoperation und sind mit einer TGF-β1 Überproduktion assoziiert.
Fibrotische Erkrankungen, die mit TGF-β1 Überproduktion assoziiert sind, können in chronische Zustände eingeteilt werden, wie Fibrose der Niere, Lunge und Leber und akutere Zustände, wie Hautnarben und Restenose (Chamberlain, J. Cardiovascular Drug Reviews, 19 (4): 329–344). Die Synthese und Sekretion von TGF-β1 durch Tumorzellen kann auch zu einer Immunsuppression führen, wie dies in Patienten mit aggressiven Gehirn- oder Brusttumoren beobachtet werden kann (Artega et al. (1993), J. Clin. Invest. 92: 2569–2576). Der Verlauf der Leishmanieninfektion in Mäusen wird drastisch durch TGF-β1 verändert (Barral-Netto et al. (1992), Science 257: 545–547). TGF-β1 verschlimmert die Erkrankung, während TGF-β1 Antikörper den Fortschritt der Erkrankung in genetisch empfindlichen Mäusen aufhält. Genetisch resistente Mäuse werden für eine Leishmanieninfektion nach einer Verabreichung von TGF-β1 empfänglich.
Die grundlegenden Effekte von TGF-β1 auf die exatrzelluläre Matrixablagerung wurden zusammengefasst (Rocco und Ziyadeh (1991) in Contempory Issues in Nephrology v. 23, Hormones, autocoids and the kidney, Herausgeber Jay Stein, Churchill Livingston, New York Seiten 391–410, Roberts et al. (1988) Rec. Prog. Hormone Res. 44: 157–197) und umfassen die Stimulierung der Synthese und die Hemmung des Abbaus von extrazellulären Matrixkomponenten. Da die Struktur und Filtrationseigenschaften des Glomerulus großteils von der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix des Mesangiums und der Glomerulimembran bestimmt wird, ist es nicht überraschend, dass TGF-β1 grundlegende Effekte auf die Niere hat. Die Akkumulation der mesangialen Matrix bei proliferativer Glomerulonephritis (Border et al. (1990) Kidney Int. 37: 689–695) und diabetische Nephropathie (Mauer et al. (1984) J. Clin. Invest. 74: 1143–1155) sind klare und dominante pathologische Merkmale der Erkrankung. Die TGF-β1 Spiegel sind bei der humanen diabetischen Glomerulosklerose (fortgeschrittene Neuropathie) erhöht (Yamamoto et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1814–1818). TGF-β1 ist ein wichtiger Mediator bei der Genese der Nierenfibrose bei mehreren Tiermodellen (Phan et al. (1990) Kidney Int. 37: 426, Okuda et al. (1990) J. Clin. Invest. 86: 453). Die Suppression der experimentell induzierten Glomerulonephritis in Ratten wurde durch Antiserum gegen TGF-β1 (Border et al. (1990) Nature 346: 371) und durch ein extrazelluläres Matrixprotein, nämlich Decorin, gezeigt, das TGF-β1 binden kann (Border et al. (1992) Nature 360: 361–363).
Zu viel TGF-β1 führt zu einer Hautgewebenarbenbildung. Neutralisierende TGF-β1 Antikörper, die in die Ränder von heilenden Wunden in Ratten injiziert werden, hemmen die Narbenbildung, ohne die Geschwindigkeit der Wundheilung oder der Zugstärke der Wunde zu beeinflussen (Shah et al. (1992) Lancet 339: 213–214). Gleichzeitig finden sich eine geringere Angiogenese, eine verringerte Anzahl an Makrophagen und Monocyten in der Wunde und eine verringerte Menge an unorganisierter Kollagenfaserablagerung im Narbengewebe.
TGF-β1 kann ein Faktor in der progressiven Verdickung der Arterienwand sein, die aus der Proliferation von glatten Muskelzellen und einer Ablagerung von extrazellulärer Matrix in der Arterie nach einer Ballonangioplastie resultiert. Der Durchmesser der Restenosenarterie kann durch diese Verdickung um 90 % verringert werden und da der Großteil der Verringerung im Durchmesser auf einer extrazellulären Matrix anstelle von glatten Muskelzellkörpern beruht, kann es möglich sein, diese Gefäße um 50 % einfach durch die Verringerung der übermäßigen extrazellulären Matrixablagerung zu öffnen. Bei nicht verletzten Schweinearterien, die in vivo mit einem TGF-β1 Gen transfiziert sind, ist die TGF-β1 Genexpression sowohl mit einer extrazellulären Matrixsynthese als auch einer Hyperplasie assoziiert (Nabel et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10759–10763). Die durch TGF-β1 induzierte Hyperplasie ist nicht so exzessiv, wie die, welche durch PDGF-BB induziert wird, aber die extrazelluläre Matrix ist bei TGF-β1 Transfektanden ausgeprägter vorhanden. Es wird keine extrazelluläre Matrixablagerung mit der durch FGF-1 (eine sekretierte Form von FGF) induzierten Hyperplasie in diesem Gentransferschweinemodell assoziiert (Nabel (1993) Nature 362: 844–846).
Es gibt mehrere Arten an Krebs, bei denen vom Tumor gebildetes TGF-β1 schädlich sein kann. MATLyLu Rattenprostatazellen (Steiner und Barrack (1992) Mol. Endocrinol. 6: 15–25) und humane MCF-7 Brustkrebszellen (Arteaga et al. (1993) Cell Growth und Differ. 4: 193–201) werden nach einer Transfektion mit einem Vektor, der das Maus TGF-β1 exprimiert, tumorigener und metastatischer. TGF-β1 wird mit Angiogenese, Metastase und schlechter Prognose bei humanem Prostatakrebs und fortgeschrittenem Magenkrebs assoziiert (P. Wikstrom et al. (1998) Prostate 37: 19–29, H. Saito et al. (1999) Cancer 86: 1455–1462). Bei Brustkrebs ist die schlechte Prognose mit erhöhtem TGF-β assoziiert (Dickson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 837–841, Kasid et al. (1987) Cancer Res. 47: 5733–5738, Daly et al. (1990) J. Cell Biochem. 43: 199–211, Barrett-Lee et al. (1990) Br. J. Cancer 61: 612–617, King et al. (1989) J. Steroid Biochem. 34: 133–138. Welch et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7678–7682, Walker et al. (1992) Eur. J. Cancer 238: 641–644) und die Einführung von TGF-β1 durch die Tamoxifenbehandlung (Butta et al. (1992) Cancer Res. 52: 4261–4264) wird mit dem Versagen der Tamoxifenbehandlung von Brustkrebs assoziiert (Thrompson et al. (1991) Br. J. Cancer 63: 609–614). Anti-TGF-β1 Antikörper hemmen das Wachstum von humanen MDA-231 Brustkrebszellen in Mäusen ohne Thymus (Arteaga et al. (1993) J. Clin. Invest. 92: 2569–2576), eine Behandlung, die mit einer Zunahme der natürlichen Killerzellaktivität der Milz korreliert. CHPO Zellen, die mit latentem TGF-β1 transfiziert sind, zeigen auch eine verringerte NK Aktivität und erhöhtes Tumorwachstum bei Nacktmäusen (Wallick et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 1777–1784). Daher kann TGF-β, das durch Brusttumoren sekretiert wird, eine endokrine Immunsuppression verursachen. Von hohen Plasmakonzentrationen an TGF-β1 wurde gezeigt, dass sie eine schlechte Prognose für Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs anzeigen (Anscher et al. (1993) N. Engl. J. Med. 328: 1592–1598). Patienten mit hohem zirkulierendem TGF-β sind vor einer hochdosierten Chemotherapie und einer autologen Knochenmarkstransplantation einem hohen Risiko für eine hepato-venöse Verschlusskrankheit (15–50% aller Patienten mit einer Mortalitätsrate von bis zu 50 %) und für eine idiopathische interstitielle Pneumonitis (40–60 % aller Patienten) ausgesetzt. Die Implikation dieser Feststellung ist 1) dass erhöhte Plasmaspiegel an TGF-β1 zur Identifizierung von Risikopatienten verwendet werden können und 2) dass die Verringerung von TGF-β1 die Morbidität und Mortalität dieser allgemeinen Behandlungen für Brustkrebspatienten verringern könnte.
Viele maligne Zellen sekretieren den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), ein potentes Immunsuppressivum, was nahelegt, dass die TGF-β Produktion einen signifikanten Tumorfluchtmechanismus vor der Immunüberwachung des Wirts darstellen kann. Die Etablierung einer Leukozytensubpopulation mit einem zerstörten TGF-β Signalweg in einem Tumor-tragenden Wirt bietet ein potentielles Mittel für eine Immuntherapie von Krebs. Ein transgenes Tiermodell mit einem zerstörten TGF-β Signalweg in T Zellen ist zur Eliminierung eines normalerweise letalen TGF-β überexprimierenden Lymphomtumors, nämlich EL4 fähig (Gorelik und Flavell (2001) Nature Medicine 7 (10): 1118–1122). Die Herabregulierung der TGF-β Sekretion in Tumorzellen führt zur Wiederherstellung der Immunogenität im Wirt, während die T-Zellunempfindlichkeit gegenüber TGF-β zu einer beschleunigten Differenzierung und Autoimmunität führt, Elemente, die erforderlich sind, um die Selbstantigen-exprimierenden Tumoren in einem tolerant gemachten Wirt zu bekämpfen. Die immunsuppressiven Effekte von TGF-β wurden auch bei einer Subpopulation von HIV Patienten mit einer geringeren als der vorhergesagten Immunreaktion basierend auf ihrer CD4/CD8 T Zellzahlen beobachtet (Garba et al. J. Immunology (2002) 168: 2247–2254). Ein TGF-β neutralisierender Antikörper ist zur Umkehr der Effekte in Kultur fähig, was zeigt, dass Inhibitoren für das TGF-β Signal eine Brauchbarkeit bei der Umkehr der Immunsuppression haben könnten, die in dieser Untergruppe an HIV Patienten vorkommt.
Während der frühesten Stadien der Carzinogenese kann TGF-β1 als potenter Tumorsuppressor wirken und kann die Wirkungen einiger chemoprotektiver Mittel vermitteln. Jedoch scheinen an einem Punkt während der Entwicklung und Progression von malignen Neoplasmen Tumorzellen der TGF-β- abhängigen Wachstumshemmung parallel mit dem Auftreten von bioaktivem TGF-β in der Mikroumgebung zu entkommen. Die duale Tumorunterdrückung/Tumorpromotionrollen von TGF-β wurden am deutlichsten in einem transgenen System ermittelt, das TGF-β in Keratinocyten exprimiert. Während die Transgenen resistenter gegenüber der Bildung von benignen Hautläsionen sind, erhöht sich die metastatische Umwandlung bei den Transgenen dramatisch (Cui et al (1996) Cell 86(4): 531–542). Die Bildung von TGF-β1 durch maligne Zellen in primären Tumoren scheint mit zunehmenden Stadien der Tumorprogression zu steigen. Studien in vielen der Hauptepithelzellkrebsarten legen nahe, dass die erhöhte Bildung von TGF-β durch humane Krebsarten als relativ spätes Ereignis während der Tumorprogression auftritt. Ferner stattet das Tumor-assoziierte TGF-β die Tumorzellen mit einem selektiven Vorteil aus und fördert die Tumorprogression. Die Wirkungen von TGF-β auf Zelle/Zell und Zell/Stroma Interaktionen führt zu einem größeren Hang zur Invasion und Metastase. Tumor-assoziiertes TGF-β kann es Tumorzellen erlauben, der Immunüberwachung zu entkommen, da es ein starker Inhibitor der klonalen Expansion von aktivierten Lymphozyten ist. Von TGF-β wurde auch gezeigt, dass es die Bildung von Angiostatin hemmt. Krebstherapeutische Modalitäten, wie Bestrahlungstherapie und Chemotherapie induzieren die Bildung von aktiviertem TGF-β im Tumor, wobei das Herauswachsen von malignen Zellen selektiert wird, die gegenüber wachstumshemmenden Effekten von TGF-β resistent sind. Daher erhöhen diese Antikrebsbehandlungen das Risiko, beschleunigen die Entwicklung von Tumoren mit verstärktem Wachstum und verstärkter Invasivität. In dieser Situation könnten Mittel die auf die durch TGF-β vermittelte Signaltransduktion abzielen eine sehr wirksame therapeutische Strategie sein. Es wurde von der Resistenz von Tumorzellen gegenüber TGF-β gezeigt, dass sie den Großteil der cytotoxischen Effekte der Bestrahlungstherapie und Chemotherapie negieren und die behandlungsabhängige Aktivierung von TGF-β im Stroma sogar schädlich sein kann, da sie die Mikroumgebung für eine Tumorprogression zugänglicher macht und zur Gewebeschädigung beiträgt, die zur Fibrose führt. Die Entwicklung eines Inhibitors für die TGF-β Signaltransduktion dürfte alleine und in Kombination mit anderen Therapien zur Behandlung von fortgeschrittenem Krebs nützlich sein.
Die Verbindungen sind zur Behandlung von Krebs und anderen Krankheitszuständen brauchbar, die durch TGF-β beeinflusst werden, indem sie TGF-β bei einem Patienten hemmen, der dessen bedarf, indem diese Verbindungen an den Patienten verabreicht werden. TGF-β wäre auch brauchbar gegen Artherosklerose (T.A. McCaffrey: TGF-βs and TGF-β Rezeptors in Atherosclerosis: Cytokine and Growth Factor Reviews 2000, 11, 103–114) und Alzheimersche Erkrankung (E. Masliah, G. Ho, T. Wyss-Coray: Functional Role of TGF-β in Alzheimer's Disease Microvascular Injury: Lessons from Transgenic Mice: Neurochemistry International 2001, 393–400).
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind therapeutisch wirksame Mengen der oben erwähnten TGF-β Antagonisten. Die Zusammensetzung kann mit herkömmlichen Hilfsstoffe, Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert werden und zu Tabletten verpresst werden oder als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung formuliert werden oder durch intramuskuläre oder intravenöse Wege verabreicht werden. Die Verbindungen können transdermal verabreicht werden und können als verzögert freisetzende Dosierungsformen und dergleichen formuliert werden.
Die TGF-β Antagonisten werden in Formulierungen formuliert, die durch orale und rektale Wege, topisch, parenteral, beispielsweise durch Injektion und durch kontinuierliche oder diskontinuierliche intraarterielle Infusion verabreicht werden können in Form von beispielsweise Tabletten, Longetten, sublingualen Tabletten, Sachets, Cachets, Elixieren, Gelen, Suspensionen, Aerosolen, Salben, die beispielsweise 1 bis 10 Gewichtsprozent des Wirkstoffs in einer geeigneten Grundlage enthalten, Weich- und Hartgelatibekapseln, Zäpfchen, injizierbaren Lösungen und Suspensionen in physiologisch annehmbaren Medien und sterilen verpackten Pulvern, die auf einem Trägermaterial zur Herstellung von injizierbaren Lösungen absorbiert werden. Vorteilhafterweise können die Zusammensetzungen für diesen Zweck in Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden, wobei jede Dosierung vorzugsweise etwa 5 bis etwa 500 mg (etwa 5 bis 50 mg im Fall einer parenteralen oder inhalativen Verabreichung und etwa 25 bis 500 mg im Fall einer oralen oder rektalen Verabreichung) der Verbindungen enthalten. Dosierungen von etwa 0,5 bis etwa 300 mg/kg pro Tag, vorzugsweise 0,5 bis 20 mg/kg des Wirkstoffs können verabreicht werden, obwohl es natürlich leicht verständlich ist, dass die Menge an tatsächlich verabreichter Verbindung von einem Arzt in Anbetracht aller relevanten Umstände bestimmt wird, einschließlich dem zu behandelnden Zustand, der Wahl der zu verabreichenden Verbindung und der Wahl des Verabreichungswegs und daher sollen die oben angegebenen bevorzugten Dosierungsbereiche den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränken.
Die Formulierungen, die zur getrennten Verabreichung der TGF-β Antagonisten brauchbar sind, bestehen normalerweise aus zumindest einer Verbindung, die aus den hierin angegebenen Verbindungen ausgewählt ist, gemischt mit einem Träger oder verdünnt durch einen Träger oder durch einen essbaren Träger eingeschlossen oder verkapselt in Form einer Kapsel, eines Sachets, eines Cachets, eines Papiers oder eines anderen Behälters oder durch einen Einwegbehälter, wie eine Ampulle. Ein Träger oder Verdünnungsmittel kann ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Träger, Hilfsstoff oder Medium für den therapeutischen Wirkstoff dient. Einige Beispiele für Verdünnungsmittel oder Träger, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Lactose, Dextrose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Propylenglycol, flüssiges Paraffin, weiße Vaseline, Kaolin, pyrogen hergestelltes Siliciumdioxid, mikrokristalline Cellulose, Calciumsilicat, Silicat, Polyvinylpyrrolidon, Cetostearylalkohol, Stärke, modifizierte Stärkearten, Akaziengummi, Calciumphosphat, Kakaobutter, ethoxylierte Ester, Theobrominöl, Erdnussöl, Alginate, Traganth, Gelatine, Sirup, Methylcellulose, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Ethyllactat, Methyl- und Propylhydroxybenzoat, Sorbitantrioleat, Sorbitansesquioleat und Oleylalkohol und Treibmittel, wie Trichlormonofluormethan, Dichlordifluormethan und Dichlortetrafluorethan. Im Fall von Tabletten kann ein Gleitmittel eingearbeitet werden, um die Klebrigkeit und die Bindung der pulverisierten Inhaltsstoffe in den Pressformen und am Stempel der Tablettiermaschine zu verhindern. Für einen solchen Zweck können beispielsweise Aluminium-, Magnesium- oder Calciumstearate, Talkum oder Mineralöl verwendet werden.
Bevorzugte pharmazeutische Formen der vorliegenden Erfindung sind Kapseln, Tabletten, Zäpfchen, injizierbare Lösungen, Cremes und Salben. Speziell bevorzugt sind Formulierungen zur Inhalationsanwendung, wie als Aerosol, zur Injektion und zur oralen Einnahme.

Claims

Verbindung der Formel II
und die pharmazeutisch annehmbaren Salze hiervon.
Verbindung, die 2-(6-Methylpyridin-2-yl)-3-[6-amidochinolin-4-yl)-5,6-dihydro-4N-pyrrolo[1,2-b]pyrazol ist und die pharmazeutisch annehmbaren Salze hiervon.
Pharmazeutische Formulierung, die eine Verbindung nach Anspruch 1 oder das pharmazeutisch annehmbare Salz hiervon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Träger umfasst.
Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.