ES2559521T3 - Pirazolil tienopiridinas terapéuticas - Google Patents

Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo que consiste de:**Fórmula** y una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores.

Description

DESCRIPCION

Pirazolil tienopiridinas terapeuticas

Los TGF-b's (factor de crecimiento transformante-b) activan las cascadas de senalizacion promotoras de tumores y fibroticas. Tres TGFb's mamufero, TGFb1, TGFb2, y TGFb3, pueden activar la via TGFb. La union de TGFb's y la senal a 5 traves de los receptores de la superficie celular (vease Singh et al. (2004) Curr. Opin. Drug Disc. and Dev., 7: 437-445). Un primer TGFb se une a un receptor de tipo II (TbRII), que luego se une a y fosforila un receptor de tipo I (TbRI) (i.e., una quinasa similar al receptor de la activina (ALK)). Existe una familia de proteinas ALK incluyendo ALK-5, que es la ALK mas especifica para TGFb. La activacion de ALK-5, conduce a la fosforilacion de proteinas intracelulares, que resulta en la regulacion de la fibrosis y la tumorigenesis. Por lo tanto, el descubrimiento de inhibidores de ALK-5 es un 10 area activa de investigacion para descubrir inhibidores para tratar el cancer, y condiciones que involucran la fibrosis (vease Singh et al. (2004)).

Un ejemplo de una condicion que implica la fibrosis es la formation de cicatrices durante la reparation de la herida. Las cicatrices, incluyendo cicatrices hipertroficas y queloides, por lo general son el resultado de la deposition de colageno en los sitios de la herida. Las heridas pueden ser producidas a traves de muchos tipos diferentes de mecanismos que 15 incluyen cirugia, lesiones accidentales, quemaduras, trauma, etc. Se ha informado de que la aplicacion de TGFb3, los anticuerpos para TGFbi y TGFb2 que inhiben la via TGFb puede ayudar en la reduction de cicatrices (O'Kane and Ferguson, (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol., 29: 63-78). De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad continua en la tecnica de inhibidores de ALK-5 de moleculas pequenas que se puedan utilizar, para reducir la formacion de cicatrices, y para el tratamiento de otras condiciones fibroticas, asi como el cancer.

20 WO 2006/026305 describe derivados de pirimidina sustituidos con pirazolilo, que son utiles para el tratamiento de condiciones mediadas por TGFb.

En un aspecto, la presente invention proporciona compuestos seleccionados del grupo que consiste en:

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una sal farmaceuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona los compuestos anteriores para uso en metodos de reduccion de la formacion de cicatrices, que comprende administrar a un mamifero en necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de dicho compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. En ciertas realizaciones, el compuesto se administra por via topica.

En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona los compuestos anteriores para uso en metodos de reduccion de cicatrices existentes, que comprende administrar a un mamifero en necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de dicho compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona los compuestos anteriores para uso en metodos de tratamiento de una condicion mediada por TGFp, que comprende administrar a un mamifero en necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. En ciertas realizaciones, la condicion mediada por TGFp se selecciona del grupo que comprende: cancer, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de pancreas, melanoma, enfermedades fibroticas, glomerulonefritis, nefropatia diabetica, fibrosis hepatica, fibrosis pulmonar, hiperplasia arterial, restenosis, escleroderma, y cicatrices dermicas. En ciertas realizaciones, la condicion mediada por TGFp es la cicatrizacion dermica.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona las composiciones farmaceuticas que comprenden: una cantidad terapeuticamente eficaz de dicho compuesto y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona las composiciones farmaceuticas topicas que comprenden: una cantidad terapeuticamente eficaz de dicho compuesto o sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmaceuticamente aceptable apropiado para aplicacion topica.

En una realization adicional, la invencion se refiere a un kit que contiene al menos uno de los compuestos de la presente invencion empaquetado para su distribucion al por menor, en asociacion con las instrucciones, aconsejando al consumidor sobre como utilizar el compuesto que alivia una condicion mediada por TGFp. Una realizacion adicional se refiere al uso de un compuesto como un agente de diagnostico para detectar la activation inapropiada de una via activada por TGFp.

Definiciones

Como se utiliza en toda esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones, los siguientes terminos tienen los significados definidos a continuation, salvo que se indique especificamente lo contrario.

El plural y singular deben ser tratados como intercambiables, con exception de la indication del numero:

Una "cicatriz" es una marca que esta presente despues de la reparation de la herida en el sitio de una herida. El termino "cicatriz" incluye las cicatrices queloides, cicatrices hipertroficas y cicatrices que predominantemente no se elevan y predominantemente no crecen mas alla de los limites de la herida original.

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Una "cicatriz queloide" es un crecimiento excesivo de tejido cicatricial en un sitio de la herida, que normalmente crece mas alla de los llmites de la herida original.

Una "cicatriz hipertrofica" es una cicatriz elevada que predominantemente no crece mas alla de los llmites de la herida original.

El termino "herida" se refiere a una lesion que altera la integridad normal de un tejido, tal como la piel. Un "herida" puede ocurrir intencional o accidentalmente. Ejemplos de heridas incluyen laceraciones, heridas contusas, heridas cerradas, heridas abiertas, heridas perforadas, heridas incisas, heridas punzantes, quemaduras, etc.

El termino "paciente" se refiere a animales de sangre caliente tales como, por ejemplo, cobayas, ratones, ratas, jerbos, gatos, conejos, perros, monos, chimpances, macacos de cola de tocon, y los seres humanos.

El termino "tratar" se refiere a la capacidad de los compuestos para mitigar, aliviar, o ralentizar la progresion de la enfermedad del paciente (o condition) o cualquier dano tisular asociado con la enfermedad.

El termino "mamlfero" se refiere a un miembro de la clase Mammalia. Los ejemplos de mamlferos incluyen, sin limitation, seres humanos, primates, chimpances, roedores, ratones, ratas, conejos, caballos, ganado, perros, gatos, ovejas y vacas. En una realization particular, un mamlfero es un humano.

El termino "isomero" significa "estereoisomero" e "isomero geometrico", como se define a continuation.

El termino "estereoisomero" significa compuestos que poseen uno o mas centros quirales y cada centro puede existir en la configuration R o S. Los estereoisomeros incluyen todas las formas diastereomericas, enantiomericas y epimericas as! como racematos y mezclas de los mismos.

El termino "isomero geometrico" significa compuestos que puedan existir en las formas cis, trans, anti, entgegen (E), y zusammen (Z), as! como mezclas de las mismas.

Algunos de los compuestos pueden existir como isomeros geometricos. Los compuestos pueden poseer uno o mas centros asimetricos, por lo tanto, existentes como dos, o mas, formas estereoisomericas. La presente invention incluye todos los estereoisomeros individuales e isomeros geometricos de los compuestos y mezclas de los mismos. Los enantiomeros individuales se pueden obtener por separation quiral, mediante el uso de bloques de construction sintetica disponibles que incorporan el centro asimetrico relevante con la estereoqulmica apropiada en la slntesis, o mediante slntesis asimetrica a partir de bloques de construccion sinteticos aquirales.

Ciertos compuestos de la presente invencion pueden existir como formas tautomericas. Todas estas formas tautomericas se incluyen dentro del alcance de la presente invencion.

Ademas, los compuestos de la presente invencion pueden existir en formas no solvatadas, as! como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas, con solventes farmaceuticamente aceptables tales como agua, etanol, y similares. Los compuestos tambien pueden existir en uno o mas estados cristalinos, i.e., polimorfos, o pueden existir como solidos amorfos. Todas estas formas estan destinadas a ser abarcadas dentro del alcance de la presente invencion.

Preparation de los compuestos

Los esquemas de slntesis general para la preparacion de tales compuestos se exponen a continuacion.

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El esquema 1 representa la slntesis de pirazol 6. Una tieno[3,2-c] piridina 1 (vease, por ejemplo, Wikel et al. (1993) J. Het. Chem., 30: 289-290) en un solvente aprotico tal como THF (tetrahidrofurano), eter dietllico, etc. se puede hacer reaccionar con un reactivo de alquillitio tal como n-butillitio en o por debajo de aproximadamente -40 °C. La tieno [3,2-c] 5 piridina se muestra como no sustituida en el Esquema 1, sin embargo, puede estar opcionalmente sustituida como se describe en este documento. A continuacion, se adicionan N-metil-N-metoxiacetamida 2 (u otros agentes de acilacion apropiados, tales como N-acetil-morfolina, anhldrido acetico, y cloruro de acetilo) a la reaccion y se deja que la reaccion prosiga de -30 a -45 °C para proporcionar la cetona 3 (por ejemplo, 1- (tieno [3,2-c] piridin-2-il) etanona).

A continuacion, la cetona 3 se hace reaccionar con dimetoxi-N,N-dimetilmetanamina ("DMF-DMA") en DMF 10 (dimetilformamida) a aproximadamente 70 °C, para proporcionar 4 (por ejemplo (E)-3-(dimetilamino)-1-(tieno[3,2- c]piridin-2-il)prop-2-en-1-ona). 4 se trata con una piridinil-hidrazina 5 (por ejemplo, 1-(6-metilpiridin-2-il)hidrazina) en acido acetico a aproximadamente 80 °C para dar los regioisomeros 6 y 7. El regioisomero 7 se puede separar desde 6 para proporcionar 8 usando tecnicas de purificacion convencionales tales como precipitacion, filtracion y cromatografla en columna.

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El Esquema 2 representa una ruta de slntesis alternativa para el pirazol 6. Una solucion de un tieno [3,2-c] piridina 1 se puede hacer reaccionar en una atmosfera de gas nitrogeno, en un solvente tal como THF a aproximadamente -50 °C a - 78 °C con un reactivo alquillitio tal como n-butillitio. El tieno [3,2-c] piridina se muestra como no sustituido en el Esquema 2, sin embargo, puede estar opcionalmente sustituido como se describe en este documento. La adicion de borato de triisopropilo y acido fosforico produce la sal de acido fosforico del acido boronico 9. A continuacion, el boronato 9 se acopla al piridinil-pirazol 10 para proporcionar el pirazol 6, mediante la adicion de una base tal como una base carbonato inorganica (por ejemplo, Na2CO3, K2CO3, NaHCO3, etc.) o fosfato tribasico de potasio, y un catalizador de paladio tal como Pd(Cl2) dppf (dicloro(1,1 bis (difenilfosfino)ferroceno) paladio (II)) y dppf [(1,1 bis (difenilfosfino) ferroceno. La reaccion se puede llevar a cabo por calentamiento a reflujo, durante 1-24 horas en un solvente apropiado tal como THF o 1,2-dimetoxietano, o a aproximadamente 80-100 °C en dioxano. Esta reaccion tambien se puede llevar a cabo en presencia de KF y agua. Los esteres de boronato correspondientes se pueden utilizar en lugar del acido borico 9. El grupo LG de 10 representa un grupo saliente apropiado tal como trifluorometanosulfonilo, Br, I, o Cl. Los correspondientes analogos tieno[3,2- b]piridin-2-il, tieno[2,3-c]piridin-2-il, y tieno[2,3-b]piridin-2-il de 6, se pueden preparar utilizando tieno[3,2-b] piridina, tieno[2,3-c]piridina, y tieno[2,3-b]piridina, respectivamente, en lugar de 1.

Sales farmaceuticamente aceptables

Los compuestos de la presente invention pueden ser capaces de formar sales farmaceuticamente aceptables, incluyendo, pero no limitando a, sales de adicion de acido y/o base. Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos incluyen las sales de adicion de acido y base (incluyendo disales) de los mismos. Ejemplos de sales apropiadas se pueden encontrar por ejemplo en Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2002); y Berge et al., 'Pharmaceutical Salts," J. of Pharmaceutical Science, 1977;66: 1-19.

Las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables de los compuestos incluyen sales no toxicas derivadas de acidos inorganicos tales como clorhldrico, nltrico, fosforico, sulfurico, bromhldrico, yodhldrico, fosforo, y similares, as! como las sales derivadas de acidos organicos, tales como acidos alifaticos mono- y dicarboxllicos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxi alcanoicos, acidos alcanodioicos, acidos aromaticos, acidos alifaticos y sulfonicos aromaticos, etc. Tales sales incluyen de este modo las sales acetato, aspartato, benzoato, besilato (bencenosulfonato), bicarbonato/carbonato, bisulfato, caprilato, camsilato (alcanforsulfonato), clorobenzoato, citrato, edisilato (1,2-etano disulfonato), dihidrogenfosfato, dinitrobenzoato, esilato (etano sulfonato), fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hibenzato, clorhidrato/cloruro, bromhidrato/bromuro, hidroyoduro/yoduro, isobutirato, monohidrogenofosfato, isetionato, D-lactato, L-lactato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato (metanosulfonato), metafosfato, metilbenzoato, metilsulfato, 2-napsilato (2-naftaleno sulfonato), nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmoato, fenilacetato, fosfato, ftalato, propionato, pirofosfato, pirosulfato, sacarato, sebacato, estearato, suberato, succinato sulfato, sulfito, D-tartrato,

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L-tartrato, tosilato (tolueno sulfonato), y sales de xinafoato, y similares de los compuestos de Formula I. Tambien se contemplan las sales de aminoacidos tales como arginato, gluconato, galacturonato, y similares.

Las sales de adicion de acido de los compuestos basicos se pueden preparar poniendo en contacto la forma de base libre con una cantidad suficiente del acido deseado para producir una sal particular. La forma de base libre se puede regenerar poniendo en contacto la forma de sal con una base y aislando la base libre. Las formas de base libre pueden diferir de sus respectivas formas de sal en ciertas propiedades flsicas tales como la solubilidad en solventes polares.

Las sales de adicion de base farmaceuticamente aceptables se pueden formar con metales o aminas, tales como hidroxidos de metales alcalinos y alcalinoterreos, o de aminas organicas. Ejemplos de metales usados como cationes son aluminio, calcio, magnesio, potasio, sodio, y similares. Ejemplos de aminas apropiadas incluyen arginina, colina, cloroprocalna, N, N'-dibenciletilenodiamina, dietilamina, dietanolamina, diolamina, etilendiamina (etano-1,2-diamina), glicina, lisina, meglumina, N-metilglucamina, olamina, procalna (benzatina) y trometamina.

Las sales de adicion de base de compuestos acidos se pueden preparar poniendo en contacto la forma de acido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma de acido libre se puede regenerar poniendo en contacto la forma de sal con un acido y aislando el acido libre. Las formas de acido libre pueden diferir desde sus respectivas formas de sal un poco en ciertas propiedades flsicas tales como solubilidad en solventes polares.

Composiciones farmaceuticas

En general, los compuestos de la presente invencion se pueden administrar como una composicion farmaceutica, que comprende uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. La frase "composicion farmaceutica" se refiere a una composicion apropiada para la administracion en uso medico o veterinario. La frase "cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad de un compuesto, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, suficiente para inhibir, detener, o permitir una mejora en la enfermedad que se esta tratando cuando se administra sola o en combinacion con otro agente farmaceutico o tratamiento en un sujeto particular o poblacion de sujetos. Por ejemplo, en un humano u otro mamlfero, una cantidad terapeuticamente eficaz se puede determinar experimentalmente en un laboratorio o entorno cllnico, por la enfermedad particular y sujeto que se va a tratar.

Se debe apreciar que la determinacion de formas de dosificacion apropiadas, cantidades de dosificacion y vlas de administracion esta dentro del nivel de experiencia ordinaria en la tecnica farmaceutica y medica, y se describe a continuacion.

El termino "excipiente" se usa en este documento para describir cualquier ingrediente distinto del(los) compuesto(s) de la invencion. Por lo general, la eleccion del excipiente depende en gran medida de factores tales como el modo particular de administracion, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad y la naturaleza de la forma de dosificacion. Los excipientes farmaceuticamente aceptables se determinan en parte por la composicion particular que se administra, as! como por el metodo particular usado para administrar la composicion. De acuerdo con lo anterior, hay una amplia variedad de formulaciones apropiadas de composiciones farmaceuticas de la presente invencion (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennaro et al. Eds., Lippincott Williams and Wilkins, 2000).

Un compuesto de la presente invencion se puede formular como una composicion farmaceutica en forma de un jarabe, un elixir, una suspension, un polvo, un granulo, un comprimido, una capsula, un comprimido para deshacerse en la boca, un trocisco, una solucion acuosa, una crema, un unguento, una locion, un gel, una emulsion, etc.

Para preparar las composiciones farmaceuticas a partir de los compuestos de la presente invencion, los excipientes farmaceuticamente aceptables por lo general son excipientes solidos y llquidos. Las preparaciones en forma solida incluyen polvos, comprimidos, plldoras, capsulas, sellos, supositorios y granulos dispersables. Un excipiente solido puede ser una o mas sustancias que pueden actuar tambien como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes disgregantes de comprimidos, o un material encapsulante.

En los polvos, el excipiente es por lo general un solido finamente dividido que esta en una mezcla con el componente activo finamente dividido. En los comprimidos, el componente activo se mezcla con el excipiente que tiene las propiedades aglutinantes necesarias en proporciones apropiadas y se compacta en la forma y tamano deseados.

Los polvos y comprimidos contienen por lo general desde 1% a 95% (peso/peso) del compuesto activo. En ciertas realizaciones, el compuesto activo varla desde 5% a 70% (peso/peso). Los excipientes apropiados son carbonato de magnesio; estearato de magnesio, talco, azucar, lactosa, pectina, dextrina, almidon, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica, una cera de bajo punto de fusion, manteca de cacao y similares. El termino "preparation" pretende incluir la formulation del compuesto activo con material encapsulante como un excipiente que proporciona una capsula en la que el componente activo con o sin otros excipientes, esta rodeado por un excipiente, que esta as! en asociacion con este. Del mismo modo, estan incluidos sellos y comprimidos para deshacer en la boca. Los comprimidos,

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polvos, capsulas, plidoras, sellos y comprimidos para deshacer en la boca se pueden utilizar como formas de dosificacion solidas apropiadas para administracion oral.

Para preparar supositorios, una cera de bajo punto de fusion, tal como una mezcla de gliceridos de acidos grasos o manteca de cacao, se funde primero y el componente activo se dispersa homogeneamente en este, como por agitacion. La mezcla homogenea fundida puede entonces ser vertida en moldes de tamano conveniente, se deja enfriar y de ese modo solidificar.

Las preparaciones en forma llquida incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones de agua/propilenglicol. Las preparaciones llquidas se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en un solvente farmaceuticamente aceptable acuoso o no acuoso, que tambien puede contener agentes de suspension, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, y agentes conservantes como son conocidos en la tecnica.

Tambien se incluyen preparaciones en forma solida que estan destinadas a ser convertidas, poco antes del uso, en preparaciones en forma llquida para administracion oral. Tales formas llquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, ademas del componente activo, colorantes, sabores, estabilizantes, soluciones reguladoras, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

Un compuesto de la presente invencion, solo o en combination con otros componentes apropiados, se puede hacer en formulaciones en aerosol (i.e., pueden ser "nebulizados") para administrarse por inhalation. Las formulaciones en aerosol se pueden colocar en propelentes presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano nitrogeno, y similares.

Una composition topica de acuerdo con la presente invencion puede estar en la forma de soluciones, lociones, balsamos, cremas, unguentos, liposomas, aerosol, geles, espumas, palos de rodillos, o cualquier otra formulation usada rutinariamente para entregar una composicion farmaceutica topica.

Las formulaciones apropiadas para la administracion parenteral, tales como, por via intravenosa, intramuscular, intradermica y subcutanea, incluyen soluciones de inyeccion acuosas y no acuosas isotonicas esteriles, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras, bacteriostaticos y solutos que hacen la formulacion isotonica con la sangre del receptor previsto y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes.

La preparation farmaceutica esta preferiblemente en forma de dosificacion unitaria. En tal forma la preparation se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificacion unitaria puede ser una preparacion envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de preparacion, tales como comprimidos envasados, capsulas y polvos en viales o ampollas. Tambien, la forma de dosificacion unitaria puede ser una capsula, comprimido, sello, o comprimido para deshacer en la boca en si, o puede ser el numero apropiado de cualquiera de estos en forma envasada. Las formulaciones de compuestos se pueden presentar en dosis unitarias o recipientes multidosis sellados, tales como ampollas y viales.

Las composiciones que contienen un compuesto de la presente invencion se pueden envasar para la distribution minorista (i.e., un artlculo de fabrication). Tales artlculos pueden ser etiquetados y envasados en la forma que indique al paciente como utilizar el producto. Tales instrucciones pueden incluir la condition que se va a tratar, la duration del tratamiento, esquema de dosificacion, etc.

La cantidad del componente activo en una preparacion de dosis unitaria se puede variar o ajustar desde 0.1 mg a 1000 mg, preferiblemente desde 1.0 mg a 100 mg, o desde 0.01% a 95% (peso/peso) de una dosis unitaria, de acuerdo a la aplicacion particular y la potencia del componente activo. La dosis administrada a un sujeto, en el contexto de la presente invencion debe ser suficiente para afectar a una respuesta terapeutica beneficiosa en el sujeto con el tiempo. La composicion puede, si se desea, contener tambien otros agentes terapeuticos compatibles.

La determination de la dosificacion apropiada para una situation particular esta dentro de la experiencia del medico. Por lo general la dosis sera determinada por la eficacia del compuesto particular empleado y la condicion del sujeto, la gravedad de la enfermedad que se va a tratar, as! como el peso corporal o el area de la superficie del sujeto a tratar. El tamano de la dosis tambien sera determinado por la existencia, naturaleza y extension de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompanan la administracion de un compuesto particular en un sujeto particular. En la determinacion de la cantidad eficaz del compuesto que se va a administrar en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad que se esta tratando, el medico puede evaluar factores tales como los niveles circulantes en plasma del compuesto, toxicidades del compuesto, y/o la progresion de la enfermedad, etc. Ademas, los compuestos de la presente invencion se pueden administrar a una velocidad determinada por factores que pueden incluir el perfil farmacocinetico del compuesto, farmacos contraindicados y los efectos secundarios del compuesto a diversas concentraciones, tal como se aplica a la masa y salud general del sujeto.

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Generalmente, el tratamiento se inicia con dosis mas pequenas, que son menores que la dosis optima del compuesto. En lo sucesivo, la dosificacion se aumenta en pequenos incrementos hasta que se alcanza el efecto optimo bajo las circunstancias. Por conveniencia, la dosificacion diaria total se puede dividir y administrar en porciones durante el dla, si se desea.

Metodos de uso

Mientras que un compuesto de la presente invencion se puede utilizar mas por via topica para reducir la cicatrizacion, la invention no se limita a esta condition especlfica. Un compuesto de la presente invencion se puede utilizar para reducir una cicatriz existente. Un compuesto de la presente invencion tambien se puede utilizar para aliviar cualquier tipo de condicion mediada por TGFp. Ejemplos de las condiciones mediadas por TGp incluyen todos los tipos de cancer (por ejemplo, mama, pulmon, colon, prostata, ovario, pancreas, melanoma, todas las neoplasias hematologicas, etc.), as! como todos los tipos de enfermedades fibroticas (por ejemplo, glomerulonefritis, nefropatla diabetica, fibrosis hepatica, fibrosis pulmonar, hiperplasia arterial y reestenosis, esclerodermia y cicatrizacion dermica). En una realization particular, la condicion mediada por TGFp es la cicatrizacion dermica.

El termino "administration" se refiere al metodo de poner en contacto un compuesto con un sujeto. Por lo tanto, los compuestos de la presente invencion se pueden administrar por una variedad de rutas incluyendo la inyeccion, es decir, por via intravenosa, intramuscular, intracutanea, subcutanea, intraduodenal, parenteral, o intraperitoneal. Tambien, los compuestos descritos en este documento se pueden administrar por inhalation, por ejemplo, por via intranasal. Adicionalmente, los compuestos de la presente invencion se pueden administrar por via transdermica, topica, y por medio de la implantation. En ciertas realizaciones, los compuestos de la presente invencion se suministran por via oral. Los compuestos tambien pueden ser entregados por via rectal, bucal, intravaginal, u ocular.

Cuando se administra para reducir las cicatrices, un compuesto de la presente invencion por lo general se puede aplicar a la herida y/o el area alrededor de una herida. Por ejemplo, un compuesto de la presente invencion se puede administrar por via topica a una herida en forma de un parche, solution, locion, balsamo, crema, unguento, liposoma, aerosol, gel, espuma, palo de rodillo, o cualquier otra formulation usada rutinariamente para entregar una composition farmaceutica topica. Alternativamente, un compuesto de la presente invencion se puede administrar a traves de inyeccion en una herida o el area alrededor de una herida. En ciertas realizaciones, un compuesto de la presente invencion se administra a una herida que ha sido suturada, grapada, pegada, y/o vendada, etc. En ciertas realizaciones, un compuesto de la presente invencion se administra inmediatamente despues de producirse la herida. En otras realizaciones, un compuesto de la presente invencion se administra dentro de 1 hora, 8 horas, 12 horas, 1 dla, 2 dlas, 3 dlas, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 ano, o mas de 1 ano, despues de la aparicion de heridas. En una realizacion particular, la herida se produce a traves de una incision. En ciertas realizaciones, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la presente invencion, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo se pueden administrar a un mamlfero en necesidad de tal tratamiento para inhibir la formation de cicatriz queloide. En ciertas realizaciones, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la presente invencion, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo se puede administrar a un mamlfero en necesidad de tal tratamiento para inhibir la formacion de cicatriz hipertrofica. En ciertas realizaciones son metodos para inhibir la formacion de cicatrices, que comprende administrar a un mamlfero en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde se producirla la cicatriz en la piel.

La reduction de la cicatrizacion o la inhibition de la formacion de cicatrices esta destinada a transmitir que los compuestos de la presente invencion se refieren a la reduccion de la aparicion de una cicatriz como se juzga por el paciente o un profesional de la salud (por ejemplo, un medico). La reduccion de la formacion de cicatrices o la inhibicion de la formacion de cicatrices puede ser acompanada por una mejora en uno o mas de los siguientes indicios, incluyendo, reduccion de la deposition de matriz extracelular durante la curacion, reduccion de la deposition de colageno, reduccion del tamano, reduccion de la forma, reduccion del espesor, reduccion del area superficial, reduccion de la severidad, reduccion de la altura, mejora en la coloration etc.

En una realizacion tlpica, el compuesto se administra por via topica. Como se utiliza en este documento, topica se refiere a la aplicacion de los compuestos (y el portador opcional) directamente sobre la piel o area de la herida. La administracion topica es especialmente apropiada para heridas a la piel. La dosis puede variar, pero como una directriz general, el compuesto puede estar presente en un portador farmaceuticamente aceptable, en una cantidad desde aproximadamente 0.01 a 50 % peso/peso, y mas por lo general desde aproximadamente 0.1 a 10 % peso/peso. La composicion farmaceutica puede ser aplicada al area afectada desde 1 a 4 veces al dla.

En otras realizaciones de la invencion, el compuesto puede ser coadministrado con otros compuestos, agentes, o apositos para mejorar aun mas su actividad, o para reducir al mlnimo los posibles efectos secundarios. Como se utiliza en esta aplicacion, coadministrado se refiere a la administracion del compuesto de Formula I con un segundo medicamento, que por lo general tiene un mecanismo de accion diferente, utilizando un regimen de dosificacion que promueve el resultado deseado. Esto se puede referir a dosificacion simultanea, la dosificacion en diferentes momentos durante un unico dla, o incluso dosificacion en diferentes dlas. Los compuestos se pueden administrar por separado o se pueden combinar en una unica formulacion. Para la reduccion de la cicatrizacion, se pueden administrar agentes,

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compuestos, o apositos conjuntamente con un compuesto de la presente invencion, incluyendo TGFp3, anticuerpos TGFP1, anticuerpos TGFP2, acetonido de triamcinolona (9-fluoro-11,16,17-trihidroxi-17-(2-hidroxiacetil) -10,13-dimetil- 6,7,6,9,10,11,12, 13,14,15,16,17-dodecahidrociclopenta[ a]fenantren-3-ona), esteroides, corticoides, antibioticos, antibioticos topicos y laminas de silicona. Ademas, los agentes, compuestos, o apositos se pueden administrar conjuntamente a una herida que mejoran la cicatrizacion de heridas, incluyendo 5-fluorouracilo, estrogeno, agonistas del receptor nACh (nicotlnico de la acetilcolina), FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), EGF (factor de crecimiento epidermico), IGF (factor de crecimiento similar a la insulina), y PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas).

Ademas, los siguientes agentes terapeuticos pueden ser coadministrados con un compuesto de la presente invencion para tratar una condicion mediada por TGFp. Ejemplos de agente(s) terapeutico(s) apropiado(s) incluyen, pero no se limitan a, agentes no esteroideos antiinflamatorios estandar (en adelante NSAID) (por ejemplo, piroxicam, diclofenaco), acidos propionicos (por ejemplo, naproxeno, flubiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno), fenamatos (por ejemplo, acido mefenamico, indometacina, sulindac, apazona), pirazolonas (por ejemplo, fenilbutazona), salicilatos (por ejemplo, aspirina), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib, valdecoxib y etoricoxib), analgesicos y terapias intraarticulares (por ejemplo, corticosteroides) y acidos hialuronicos (por ejemplo, Hyalgan y Synvisc), agentes contra el cancer (por ejemplo, endostatina y anglostatin), farmacos citotoxicos (por ejemplo, adriamicina, daunomicina, cis-platino, etoposido, taxol, taxotere), alcaloides (por ejemplo, vincristina), y antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato), agentes cardiovasculares (por ejemplo, bloqueadores de los canales de calcio), agentes hipolipemiantes (por ejemplo, estatinas), fibratos, betabloqueantes, inhibidores de la ACE. Antagonistas de los receptores de Angiotensina-2 e inhibidores de la agregacion plaquetaria, agentes del CNS (por ejemplo, como antidepresivos (tales como sertralina)), farmacos contra el parkinson (por ejemplo, deprenil, L-dopa, Requip, Mirapex), inhibidores de MAOB (por ejemplo, selegina y rasagilina), inhibidores de comP (por ejemplo, Tasmar), inhibidores de A-2, inhibidores de la recaptacion de dopamina, antagonistas de NMDA, agonistas de nicotina, agonistas de la dopamina e inhibidores de oxido nltrico sintasa neuronal), farmacos contra el Alzheimer (por ejemplo, donepezil, tacrina, inhibidores de COX-2, propentofilina o metrifonato), agentes contra la osteoporosis (por ejemplo, roloxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno o fosomax) y agentes inmunosupresores (por ejemplo, FK-506 y rapamicina).

Aunque la invencion se ha descrito en relacion con las realizaciones especlficas de la misma, se entendera que es capaz de modificaciones adicionales. Los siguientes ejemplos y datos biologicos se presentan con el fin de ilustrar adicionalmente la invencion. Esta divulgacion no se debe interpretar como limitante de la invencion de ninguna manera.

EJEMPLOS

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Ejemplo 1. 2-(1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il)tieno[3,2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

Etapa i: Tieno[3,2-c]piridina. Tieno[3,2-c]piridina (9.20 g; solido de color naranja marron oscuro; vease Wikel et al. (1993) J. Het. Chem., 30: 289-290) se disolvio en CH2O2 y se sometio a cromatografla en columna (sistema Biotage Horizon, columna Isco RediSep de 120 g, equilibrada con hexanos, se eluye con EtOAc al 45% ("acetato de etilo")/hexanos, isocratico). Las fracciones recolectadas fueron un aceite de color amarillo palido que se concentro a vaclo para proporcionar 8.48 g de un solido.

Alternativamente, tieno[3,2-c]piridina tambien se purifico de la siguiente manera: se disolvio tieno[3,2-c]piridina (84.6 g) en aproximadamente 180 mL de diclorometano. La solucion se dividio en tres porciones aproximadamente iguales. Cada porcion se aplico a un cartucho instantaneo de silica (Analogix SuperFlash SF65-400) y se eluyo con un metodo isocratico (45 % o 50 % de acetato de etilo en hexanos). Las fracciones deseadas se concentraron para proporcionar tieno[3,2-c]piridina como un solido de color amarillo claro. Tres cromatograflas combinadas proporcionaron un total de 75 g del compuesto del tltulo; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 8 9.12 (d, 1H, J=1.0 Hz), 8.44 (d, 1H, J=5.7 Hz), 7.79 (dt, 1H, J=5.7, 1.0 Hz), 7.47 (m, 1H), 7.43 (m, 1H); MS (APCI+) m/z 136 (MH+).

Etapa ii: 1-(tieno[3,2-c]piridin-2-il)etanona. Una solucion de tieno[3,2-c]piridina (5.0 g) en 75 mL de THF (tetrahidrofurano) se enfrio a -45 °C en un bano de hielo seco/CH3CN. Se adiciono n-butillitio (1.6M en hexanos) (35.0 mL) gota a gota manteniendo la temperatura interna a o por debajo de -40 °C. La adicion llevo unos 45 minutos. La reaccion se agito, durante 1 hora a -45 °C. Se adiciono N-metil-N-metoxiacetamida en 5 mL de THF y como resultado la reaccion se calento a -30 °C. La reaccion se agito a -45 °C, durante 1.5 horas. La reaccion se inactivo con NH4O saturado. La capa acuosa tenia un pH de aproximadamente 8. La capa acuosa se extrajo tres veces en EtOAc. Los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgSO4. El material se filtro, se concentro en un evaporador rotatorio y se sometio a cromatografla en columna (sistema Biotage Horizon, columna Analogix de 120 g, equilibrada con hexanos, se eluye con EtOAc al 50 %/hexanos). Las fracciones mas puras se concentraron en un

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evaporador rotatorio y a continuacion, se trituraron con Et2O para eliminar algo de color y recoger un solido de color naranja palido por filtracion (2.667 g).

Etapa iii: (E)-3-(dimetilamino)-1-(tieno[3,2-c]piridin-2-il)prop-2-en-1-ona. Se adiciono N,N-dimetilformamidadimetilacetal (DMF-DMA) (9.5 mL) a una solucion de 1-(tieno[3,2-c]piridin-2-il)etanona (3.17 g) en 20 mL de DMF. La reaccion se calento a 70 °C, durante la noche. A continuacion, la reaccion se enfrio a temperatura ambiente. La DMF se elimino en un evaporador rotatorio para obtener un solido de color naranja marron oscuro. El residuo se diluyo con EtOAc y agua. Una gran cantidad de solido de color amarillo fue evidente. Este se recolecto por filtracion (3.54 g). Este solido se seco en un horno de vaclo a 50°C.

Etapa iv: 2-(1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il)tieno[3,2-c]piridina.

La (E)-3-(dimetilamino)-1-(tieno[3,2-c]piridin-2-il)prop-2-en-1-ona (3.69 g) y la 1-(6-metilpiridin-2-il)hidrazina (3.3 g) (que se puede sintetizar como se describe a continuacion para el ejemplo 7, Etapa ii) se disolvieron en 40 mL de acido acetico. La reaccion se calento a 80 °C, durante 4.5 horas. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente y el solvente se elimino en un evaporador rotatorio.

EL residuo de color rojo naranja intenso se disolvio en EtOAc y se le adiciono NaHCO3 saturado hasta que el pH de la capa acuosa fue aproximadamente 7-8 (aproximadamente 250 mL). La capa acuosa se extrajo cuatro veces en EtOAc. Los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgSO4. El material se filtro, se concentro, y se sometio a cromatografla en columna (sistema Biotage Horizon, columna Isco RediSep de 80 g, 0-50%, se mantiene a 50%. 50-75%, se mantiene a 75% de EtOAc/hexano).

Las fracciones que contienen el material deseado se combinaron y concentraron. El material resultante se disolvio en MeOH caliente y se formo un precipitado al enfriar a temperatura ambiente. Despues de una hora a temperatura ambiente, el matraz se almaceno a 4°C, durante 3 horas. El solido se recolecto por filtracion, aclarando con hexanos dando 2.79 g. El material se disolvio en acetonitrilo hirviendo y se dejo enfriar a temperatura ambiente. Una vez que un precipitado se hizo evidente, el precipitado se recolecto por filtracion. El precipitado fue el regioisomero no deseado (2- (1-(6-metilpiridin-2-il)-1 Hpirazol- 3-il)tieno[3,2-c]piridina). Este proceso se repitio cuatro veces para enriquecer el filtrado de acetonitrilo con el regioisomero deseado (2-(1-(6-metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-5-il)tieno[3,2-c]piridina). El filtrado de acetonitrilo en el enfriamiento contenla un precipitado de color blanco que fue el producto deseado. Un rendimiento total de 1.21 g del producto deseado fue obtenido (2-(1-(6- metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il)tieno[3,2-c]piridina).

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Ejemplo 2. 2-[3-metil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

Etapa i: Acido tieno[3,2-c]piridin-2-il boronico. Un matraz de tres cuellos equipado con un termometro interno que contiene tieno[3,2-c]piridina (5.0 g, 37 mmol, 1 equivalente) se evacuo y luego se lleno con una atmosfera de gas nitrogeno. Se adiciono THF (60 mL) y la solucion se enfrio a -44 °C (CH3CN/hielo seco). Se adiciono n-butillitio (1.6M/hexano, 25 mL, 41 mmol, 1.1 equivalentes) durante 10 minutos, mientras se mantenla la temperatura interna a o por debajo de -33 °C. La reaccion se agito a -33 a -45 °C, durante 60 minutos. Se adiciono borato de triisopropilo (10.2 mL, 44 mmol, 1.2 equivalentes) y el bano de enfriamiento se elimino. La reaccion se dejo proceder, durante 105 minutos. A continuacion, se adicionaron 3.0 mL de acido fosforico (85% acuoso, 3.0 mL, 44 mmol, 1.2 equivalentes). Un solido de color amarillo formado, que se diluyo con agua y Et2O (aproximadamente 150 mL cada uno). Un solido de color amarillo se recolecto por filtracion y se seco por succion durante la noche (5.05 g). Datos anallticos: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 7.95 (1 H, s), 8.09 (1 H, d, J= 5.9 Hz), 8.34 (1 H, d, J=6.1 Hz), 9.09 (1 H, s). MS (APCI, M+1) 180.1. Microanalisis de C7H6BNSO2 H3PO4: C calculado, 30.35; H, 3.27; N, 5.06; P, 11.18. Encontrado: C, 41.12; H, 3.19; N, 6.53; P, 0.68%.

Etapa ii. 3-metil-1 -(6-metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-5-ol. Se combinaron acetoacetato de etilo (10 mL, 78 mmol) y (6- metil- piridin-2-il)-hidrazina (10.1 g, 82 mmol) en 100 mL de acido acetico. La reaccion se calento a 80 °C, durante 4 horas y 15 minutos. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente. El solvente se elimino en un evaporador rotatorio para proporcionar un residuo oscuro, que se disolvio en EtOAc. La solucion se lavo dos veces con NaHCO3 saturado, a continuacion, una vez con agua, y luego una vez con salmuera. Un solido de color marron rojizo se hace evidente en la mezcla bifasica. La mezcla bifasica se filtro, recolectando el solido. El solido se lavo con Et2O para proporcionar un primer solido (6.02 g). Las capas del filtrado se separaron utilizando un embudo de separacion. La capa organica se seco sobre MgSO4. El material se filtro y se concentro por evaporacion rotatoria. El solido de color marron resultante se

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trituro con Et2O y se sometio a filtracion para proporcionar un segundo solido (1.98 g) y un primer filtrado. Un solido se precipito fuera del primer filtrado, que se recolecto vertiendo el filtrado en otro filtro para proporcionar 1.69 g de un tercer solido. El primer filtrado y el 1.98 g (segundo solido) se concentraron a sequedad. El solido resultante se disolvio en EtOAc caliente y se adicionaron hexanos hasta que una turbidez persistio. La solucion se dejo reposar durante la noche. Un solido muy oscuro se aislo por filtracion y se sometio a cromatografla en columna (sistema Biotage Horizon, columna Analogix de 35 g, EtOAc al 30 %/hexano). Se aislo un solido de color amarillo que se disolvio en EtOAc caliente y se adicionaron hexanos hasta que una turbidez persistio. La solucion se dejo reposar durante la noche. El licor madre se decanto y el solido se seco solido en el horno de vaclo a 50 °C, durante varias horas para proporcionar un cuarto solido. El primer solido (6.02 g), tercer solido (1.69 g), y cuarto solido (4.03 g) se combinaron para proporcionar 11.74 g del compuesto del tltulo.

Etapa iii. 3-metil-1 -(6-metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-5-il trifluorometanosulfonato. Una mezcla de 3-metil- 1 -(6-metilpiridin-2- il)-1 H-pirazol-5-ol (10.0 g en CH2Cl2 (100 mL) y Et3N (trietilamina) (8.1 mL) se enfrio a -70 °C. Se adiciono anhldrido trlflico (9.8 mL) durante 10 minutos mientras se mantenla la temperatura por debajo de -50 °C. La suspension de reaccion se calento a temperatura ambiente y se convirtio en una solucion. La solucion se concentro para eliminar la mayor parte del CH2O2. La solucion se cargo directamente sobre una Analogix SuperFlash SF65-400: utilizando un colector de fracciones Biotage auto; EtOAc/hexanos (20/80). Las fracciones que contienen un llquido incoloro se aislaron (9.46 g).

Etapa iv: 2-[3-metil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina.

En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 100 mL equipado con un condensador de reflujo se adicionaron 3- metil-1- (6-metilpiridin-2-il) - 1 H-pirazol-5-ilo (1.16 g), acido tieno [3,2 -c] piridin-2-ilboronico (1.0 g), fosfato tribasico de potasio (2,3 g) y 30 mL de dioxano. El matraz se evacuo bajo un vaclo y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. A este se le adiciono PdCl2 (dppf) (Corriente, aducto dicloro [1,1 '-bis (difenilfosfino) ferroceno] paladio (II) diclorometano, 0.60 g). De nuevo, el matraz se evacuo bajo un vaclo y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. La reaccion se calento a 100 °C y se dejo funcionar durante la noche. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se filtro a traves de un lecho de Celite, eluyendo con EtOAc (-600 mL). El filtrado de EtOAc se concentro a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo se diluyo con CH2Cl2 y un solido de color beige se separo por filtracion. El filtrado de CH2Cl2 se purifico por cromatografla en columna (sistema Horizonte Biotage, columna Analogix de 34 g, 0-100% EtOAc/hep, se mantiene a 100% EtOAc seguido por MeOH al 10%/EtOAc). Las fracciones que contenlan el producto deseado se combinaron y se concentraron en el evaporador rotatorio para dar un aceite oscuro. El aceite oscuro (aproximadamente 800 mg) se sometio a cromatografla en columna preparativa en una Phenomenex, columna Gemini C-18 (150x19 mm, 5 pM; fase movil A: agua (+NH4OH al 0.1%), B: CH3CN (+NH4OH al 0.1%); Gradiente: 90-10% A durante 10 min, se mantiene a 90% A durante 1.5 minutos; Velocidad de flujo: 28 mL/min; Volumen de inyeccion: 2 mL; Deteccion: DAD 210-350 nm, MS APCI+, MS APCI-).

Las fracciones deseadas se secaron en un evaporador rotatorio. El solido se disolvio en EtOH caliente y despues se adicionaron 2-5 mL de heptano. Despues de reposar, el material se filtro.

El filtrado se concentro a sequedad. Se adiciono eter dietllico y la solucion se filtro en un embudo de vidrio sinterizado. Se uso eter dietllico adicional para lavar el material hasta que <10 mg del solido de color marron permanecio en el embudo de vidrio sinterizado. El filtrado se concentro a sequedad dando un solido de color blanco crema.

El solido de color blanco crema se disolvio en EtOH caliente (aproximadamente 1-2 mL) y se diluyo con heptano hasta que una turbidez persistio, y se dejo reposar. A continuacion, agujas (ligero color amarillo) comenzaron a precipitar a partir de la solucion. Despues de aproximadamente 3 horas, los licores madre se decantaron en otro matraz. Las agujas se secaron en un horno de vaclo a 40 °C, durante mas de 48 horas, para proporcionar 65 mg de un solido de color blanco. pf 131-132 °C.

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Ejemplo 3. 2-[3-etil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

Etapa i: 5-etil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-ol. Una mezcla en agitacion de 6-metil-piridin-2-il)-hidrazina (10.0 g) y propionilacetato de etilo (12 mL) en acido acetico glacial (100 mL) se calento a 80 °C, durante cinco horas. La mezcla de reaccion se concentro a presion reducida y el evaporado se trato con bicarbonato de sodio acuoso saturado (200 mL).

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La mezcla se extrajo con acetato de etilo (200 mL). La fase organica se lavo con una porcion fresca de bicarbonato de sodio acuoso saturado (200 mL), agua (200 mL) y solucion de salmuera (200 mL). La fase organica se seco posteriormente sobre sulfato de sodio anhidro y se concentro bajo presion reducida. El evaporado se purifico por cromatografla instantanea en columna de silica gel. La elucion a traves de un cartucho de silica (Analogix, 400 g) con un gradiente (hexanos al 100% con acetato de etilo al 60% en hexanos) proporciono un aceite. El aceite se reconstituyo en cloroformo y la solucion se concentro a presion reducida para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite (7.2 g); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 13.07 (ancho s, 1H), 7.70 (m, 1H), 7.64 (d, 1H, J=8.2 Hz), 6.92 (d, 1H, J=7.4 Hz), 5.42 (s, 1H), 259 (cuarteto, 2H, J=7.6 Hz), 2.51 (s, 3H), 1.24 (t, 3H, J=7.6 Hz); 13C RMN (100 MHz, CDCls) 8 13.5, 227, 23.8, 86.8, 108.8, 119.2, 140.2, 154.3, 155.0, 157.2, 157.4; MS (APCI+) 204 (MH+).

Etapa ii: 5-etil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il ester del acido trifluoro-metanosulfonico. A una mezcla en agitacion de 5-etil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-ol (7.1 g) y trietilamina (5.4 mL) en diclorometano (75 mL) a -78 °C bajo una atmosfera de nitrogeno se le adiciono anhidrido trifluorometanosulfonico (6.5 mL) durante 5 minutos. El bano frio se retiro y la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante la noche. La mezcla de reaccion se concentro bajo presion reducida y el concentrado se purifico por cromatografla instantanea en columna de silica gel. La elucion a traves de un cartucho de silica (Analogix SuperFlash SF65-400) con un gradiente (100% hexanos a 35% de acetato de etilo en hexanos sobre 2400 mL) proporciona el compuesto del titulo como un aceite (10.38) despues de aislarlo con cloroformo; 1H NMR (400 MHz, CDCla) 8 7.69 (m, 1H), 7.59 (dd, 1H, J=8.2, 0.6 Hz), 7.07 (dd, 1H, J=7.6, 0.4 Hz), 6.10 (s, 1H), 2.68 (cuarteto, 2H, J=7.6 Hz), 2.57 (s, 3H), 1.28 (t, 3H, J=7.6 Hz); 19F NMR (376 MHz, CDCh) 8 - 73.9 (s); MS (APCl+) 336 (MH+). 204 (MH+-SO2CF3).

Etapa iii: 2-[3-etil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina. En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 100 mL equipado con un condensador de reflujo se adicionaron 3-etil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il trifluorometanosulfonato (1.21 g), acido tieno[3,2-c]piridin-2-ilboronico (1.0 g), fosfato tribasico de potasio (2.3 g) y 30 mL de dioxano. El matraz se evacuo bajo vacio y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. A este se le adiciono PdCl2 (dppf) (Corriente, aducto dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (II) diclorometano, 0.60 g). De nuevo, el matraz se evacuo bajo un vacio y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. La reaccion se calento a 100 °C y se dejo proceder durante la noche. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente. Despues, la reaccion se filtro a traves de Celite, aclarando bien con EtOAc. El filtrado se concentro en un evaporador rotatorio y el material oleoso oscuro se diluyo con CH2Cl2. Se filtro un solido de color blanco crema desde el CH2Cl2. El filtrado se cargo en una columna (sistema Biotage Horizon, columna Analogix de 34 g, 0-100% heptano/EtOAc), a continuacion, se mantiene a 100% de EtOAc). Las fracciones deseadas se recolectaron para dar un aceite oscuro (aproximadamente 900 mg). Las fracciones se sometieron a cromatografla en una Phenomenex, columna Gemini C-18 como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2.

Las fracciones deseadas se combinaron y se secaron en un evaporador rotatorio para proporcionar una muestra solida. La muestra solida se disolvio en EtOH caliente. La solucion se concentro a sequedad en un evaporador rotatorio para obtener un residuo oscuro. El residuo se seco en horno de vacio a 45 °C, durante 2 horas. El material resultante fue parte de aceite oscuro y parte solida. Se adiciono eter dietilico y el material se filtro para proporcionar un solido de color marron oscuro, y un filtrado de color amarillo anaranjado claro. El filtrado se concentro a sequedad para obtener un solido de color marron claro (231 mg).

Se adiciono eter dietilico al solido de color marron claro. El material se filtro a traves de papel filtro plegado, dejando un residuo marron sobre papel de filtro. El filtrado se concentro a sequedad en el evaporador rotatorio. Los solidos resultantes se disolvieron de nuevo en EtOH caliente (1-2 mL) y se diluyo con heptano hasta que una turbidez persistio. Despues de 2 horas de reposo, ningun precipitado fue evidente. El liquido se concentro luego a sequedad. Mientras que, en un evaporador rotatorio, cuando el liquido se habia reducido a aproximadamente la mitad del volumen original, un solido de color marron fue evidente. El liquido fue retirado del evaporador rotatorio y la solucion comenzo a mostrar una turbidez blanca. El liquido se filtro en otro matraz con papel de filtro para eliminar el solido de color marron. Un solido de color blanco comenzo a precipitar en el filtrado. Despues de aproximadamente 15 minutos, no se observo mas precipitacion, y el material se filtro para obtener un solido. El solido se seco en un horno de vacio a 40 °C, durante aproximadamente 48 horas para proporcionar 71 mg. pf 89-90 °C.

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Ejemplo 4. 2-[4-etil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

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Etapa i: 4-etil-1- (6-metilpiridin-2-il) -1H-pirazol-5-ol. Una suspension de KOMe (14.0 g) y butirato de etilo (19.8 mL) en DMF (15 mL) se agito a temperatura ambiente. Se adiciono formiato de etilo (8.1 mL) durante 15 minutos, lo que resulto en mucha formacion de espuma. La reaccion se agito durante una hora adicional, y la reaccion se convirtio en una mezcla muy agitable sin capa espumosa. Una solucion de 1- (6-metilpiridin-2-il) hidrazina (12.3 g), MeOH (35 mL) y HOAc (5.7 mL) se adicionaron durante 20 minutos. La reaccion fue exotermica y alcanzo una temperatura de 30 °C, despues de una adicion inicial. Un bano de agua helada se utiliza para mantener la reaccion por debajo de 20 °C, para la adicion de la solucion restante. La reaccion se calento a reflujo durante 3 horas y despues se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 48 horas.

La reaccion se enfrio a 10 °C con un bano de agua congelada. El pH se ajusto a aproximadamente 7 con HOAc (10 mL) para obtener una masa espesa, no agitable. La reaccion se diluyo con H2O (100 mL) para dar como resultado una solucion de color rojo oscuro. La solucion se extrajo con EtOAc (200 mL). La fase organica se lavo con H2O (2 x 100 mL), se seco (MgSO4) y SiO2 (30 mL), y se filtro a traves de SiO2 (30 mL). El material se concentro para proporcionar 10.50 g de un aceite de color marron oscuro. El aceite se sometio a cromatografla utilizando un Analogix SuperFlash SF65-400 y autocolector de fracciones Biotage; EtOAc/hexanos (40/60). Las fracciones que contenlan el producto deseado se combinaron para dar 6.40 g de un llquido de color amarillo-naranja.

Etapa ii: 4-etil-1 -(6-metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-5-il trifluorometanosulfonato. Una solucion de 4-etil- 1 -(6-metilpiridin-2-il)- 1H-pirazol-5-ol (6.40 g) en CH2O2 (65 mL) y Et3N (4.8 mL) se enfrio a -70 °C. Se adiciono anhldrido trlflico (Tf2O) (5.83 mL) durante 10 minutos manteniendo la temperatura por debajo de 50 °C. La reaccion es exotermica. La reaccion se agito durante 30 minutos adicionales a menos de -50 °C y despues se calento a temperatura ambiente. Despues, la reaccion se enfrio a menos de -50 a °C y una porcion adicional de Tf2O (1.1 mL; 20%) y Et3N (1.0 mL; 20%) se adiciono. Despues de una hora de incubacion, a continuation, la reaccion se concentro para eliminar la mayor parte del CH2Cl2. La reaccion se cargo directamente en una SF40-150 Analogix SuperFlash; utilizando un autocolector de fracciones Horizon EtOAc/heptano (20/80). La columna se lavo con EtOAc/heptano (30/70). Las fracciones que contenlan el producto deseado se recolectaron para proporcionar 6.98 g de un llquido de color amarillo palido.

Etapa iii: 2-[4-etil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina. En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 100 mL equipado con un condensador de reflujo se adicionaron 4-etil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-5-il trifluorometanosulfonato (1.2 g), acido tieno[3,2-c]piridin-2-ilboronico (1.2 g), fosfato tribasico de potasio (2.3 g) y 30 mL de dioxano. El matraz se evacuo bajo un vaclo y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. A este se le adiciono PdCl2(dppf) (Corriente, aducto dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (II) diclorometano, 0.60 g). De nuevo, el matraz se evacuo bajo un vaclo y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. La reaccion se calento a 100 °C, durante la noche. A continuacion, se adicionaron 0.295 g de PdCh(dppf) (Corriente, aducto de dicloro[1,1'- bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (II) diclorometano) y la reaccion se continuo, durante 4 horas y 15 minutos. La reaccion se enfrio a temperatura ambiente.

Los contenidos de la reaccion se filtraron a traves de Celite aclarando bien con EtOAc, hasta que el producto deseado se habla eluido. El filtrado se concentro a sequedad en un evaporador rotatorio para formar un residuo oscuro. El residuo oscuro se recolecto en CH2Cl2 y los solidos se filtraron a distancia. El filtrado resultante se redujo por la concentration en un evaporador rotatorio antes de cargar el material en una columna (sistema Biotage Horizon, 0-100% EtOAc sobre 700 mL a continuacion, se mantiene a 100% de EtOAc, 500 mL). Los tubos con mas producto evidente tenlan un solido de color blanco en los lados del matraz.

Los tubos que contenlan el producto deseado se concentraron por evaporation rotatoria para proporcionar un aceite oscuro. El aceite oscuro se trituro con Et2O y el solido se separo por filtration. El precipitado solido adicional fue aislado a partir del filtrado y se combino con el solido de la filtracion inicial. Los solidos combinados se disolvieron en EtOH caliente (aproximadamente 2 mL). Se adiciono heptano hasta que un precipitado comenzo a formarse. A continuacion, un solido oscuro se formo. Despues de unos 10 minutos, parecla que el solido habla terminado la precipitation. La mezcla se filtro a traves de filtro de papel en otro matraz. El filtrado se diluyo con mas heptano hasta que una turbidez persistio. El filtrado se dejo reposar durante la noche a temperatura ambiente. Se formaron agujas de color blanco en el matraz con un residuo oscuro en la parte inferior del matraz. Los contenidos del matraz se concentraron a sequedad en un evaporador rotatorio y se disolvieron en 1-2 mL de EtOH caliente, se filtraron a traves de papel de filtro y se diluyeron con heptanos hasta que una turbidez persistio. El matraz se dejo reposar durante 2 horas. A continuacion, la mezcla se puso en un evaporador rotatorio para reducir el volumen del material. Mientras que, en el evaporador rotatorio, se hizo evidente un solido de color pardo, cuando aproximadamente la mitad del volumen original estaba presente. Se retiro el matraz del evaporador rotatorio y se filtro en otro matraz con papel de filtro para eliminar un solido de color marron. Un solido de color blanco comenzo a precipitar en el filtrado. El solido de color blanco se recolecto por filtracion y se seco en un horno de vaclo a 40 °C, durante mas de 48 horas para obtener 85 mg del compuesto del tltulo.

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Ejemplo 5. 2-(2-(6-metilpiridin-2-il)-2,4,5,6-tetrahidrociclopenta[c]pirazol-3-il)tieno[3,2-c]piridina.

Etapa i: acido tieno[3,2-c]piridina-2-bor6nico. A una mezcla en agitacion, que consta de tieno[3,2-c]piridina (2.0 g) en tetrahidrofurano anhidro (25 mL) a -40 °C, se le adiciono una solucion que consta de n-butillitio 1.6 M en hexanos (10 mL) durante varios minutos (gota a gota al principio seguido por una corriente suave, constante). La mezcla de reaccion se agito, durante cinco minutos y se adiciono posteriormente borato de isopropilo (4.2 mL). El bano frlo se retiro y la mezcla se dejo agitar durante una hora. Se adiciono agua (2 mL) a la mezcla en agitacion, lo que causo que un solido de color amarillo palido precipitara instantaneamente. El precipitado se recolecto mediante filtracion por vaclo y los solidos se aclararon ligeramente con agua (dando un filtrado de color amarillo turbio) y posteriormente con eter dietllico (dando un filtrado de color naranja oscuro). La porcion acuosa del filtrado se separo a partir del solvente organico, y luego se diluyo con 1,4-dioxano (100 mL) y la solucion se concentro bajo presion reducida. La adicion de 1,4-dioxano (100 mL) al concentrado y la posterior concentracion bajo presion reducida se repitio dos veces para proporcionar un polvo de color amarillo (0.8 g) despues de la evaporacion final.

Etapa ii: ester etllico del acido 2-[(8-metil-piridin-2-il)-hidrazono]-ciclopentanocarboxllico. Una solucion de etil 2- oxociclopentanocarboxilato (6.34 g, 5.88 mL) y (6-metil-piridin-2-il)-hidrazina (5 g) en etanol (100 mL) se calento a 80 °C, bajo una atmosfera de nitrogeno, durante aproximadamente 19 horas. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y el solvente se elimino por vaclo para proporcionar un material en bruto (7.72 g), que se tomo directamente para la siguiente reaccion.

Etapa iii: 2-(6-metil-piridin-2-il)-2,4,5,6-tetrahidro-ciclopentapirazol-3-ol. Una solucion de ester etllico del acido 2-[(6- metil- piridin-2-il)-hidrazono]-ciclopentanocarboxllico en bruto (6.6 g) y metoxido de sodio (2.73 g) en metanol (250 mL) se concentro bajo presion reducida, casi hasta sequedad, para proporcionar una pasta de color marron. A continuacion, esta pasta se calento a 160 °C, durante 2 horas siendo cauteloso el burbujeo excesivo. Despues de 2 horas, la reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se adiciono agua (100 mL). El pH se ajusto a 7 con HCl 1 N, luego se adiciono acetato de etilo (200 mL) y la mezcla resultante se agito hasta que la disolucion del precipitado ocurrio. Las capas se separaron y la capa acuosa se lavo con otra porcion de acetato de etilo (100 mL). Las capas organicas combinadas se lavaron con agua (200 mL) y salmuera (200 mL) y se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se concentraron por vaclo para proporcionar (3.6 g) del producto para utilizar, sin ninguna purificacion adicional.

Alternativamente: La misma reaccion se puede llevar a cabo a una temperatura inferior de 125 °C a partir de 21.0 g de ester etllico del acido 2-[(6-metil-piridin-2-il)-hidrazono]-ciclopentanocarboxllico, para proporcionar 17.3 g del producto en bruto.

Etapa iv: 2-(6-metil-piridin-2-il)-2,4,5,6-tetrahidro-ciclopentapirazol- 3-il ester del acido trifluoro-metanosulfonico. A un matraz de fondo redondo secado en horno se le adiciono 2-(6-metil-piridin-2-il)-2,4,5,6-tetrahidro-ciclopentapirazol- 3-ol (17.3 g) y trietilamina (9.76 g, 13.44 mL) en diclorometano (350 mL) y la mezcla de reaccion se enfrio a -78 °C. A este se le adiciono anhldrido trifluorometano sulfonico (16.23 mL) a traves de un embudo igualador de presion, durante 10 minutos. La mezcla resultante se agito a -78 °C, durante 1 hora y luego se dejo calentar a temperatura ambiente y agitar por una hora adicional. El solvente se elimino a vaclo para proporcionar un precipitado de color marron. El precipitado de color marron se purifico a traves de cromatografla instantanea de silica gel (60% de hexanos/40% de acetato de etilo) para proporcionar un solido de color blanco crema (8.848 g) seguido por otro lote de material (12.2 g) de material ligeramente menos puro.

Etapa iv: 2-(2-(6-metilpiridin-2-il)-2,4,5,6-tetrahidrociclopenta[c]pirazol-3-il)tieno[3,2-c]piridina. Un matraz de fondo redondo de tres bocas secado en horno equipado con condensador de reflujo y valvula de entrada de gas se cargo con acido tieno[3,2- c]piridina-2-boronico (0.7 g). El matraz se evacuo y purgo con gas nitrogeno tres veces. El contenido del matraz se mantuvo bajo una atmosfera de nitrogeno, durante cuatro dias. Al matraz de reaccion se le adiciono 2-(6- metil-piridin-2-il)-2,4,5,6-tetrahidro-ciclopentapirazol-3-il ester del acido trifluoro-metanosulfonico (0.7 g), fosfato tribasico de potasio (2.5 g), y 1,4-dioxano (30 mL). El matraz se evacuo y purgo con nitrogeno tres veces mas. Se adicionaron aducto de dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino) ferroceno]paladio (II) diclorometano (0.65 g) y 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno (0.43 g) y la mezcla se desgasifico y purgo con nitrogeno tres veces mas. La mezcla de agitacion se llevo a reflujo durante la noche. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (250 mL) y la solucion se trato con carbon activado y se filtro a traves de Celite.

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El filtrado resultante se concentro a presion reducida y el concentrado se purifico en un cartucho instantaneo de silica RediSep de 120 g en el sistema Biotage con 100% de hexanos a 100% de acetato de etilo sobre 1800 mL seguido por 100% de acetato de etilo hasta que eluyo el material deseado. El material deseado fue un residuo oscuro. Un llquido oscuro separado de un solido que se adhirio al interior del matraz. El llquido se elimino con etanol absoluto extrayendo con una pipeta y la solucion oscura se evaporo durante la noche para dar un residuo viscoso oscuro. El material se disolvio en acetonitrilo (15 mL) y se purifico por HPLC preparativa (Waters prep HPLC system; Stationary phase: Waters DeltPak C18 5 pm, 100 Angstom, 300x50 mm I.D., P/N 011801, WAT 011801, No. 330C09125W; Fase movil 80:20 a 40:60 agua-acetonitrilo con 0.1 % de acido formico durante 30 minutos). Las fracciones combinadas se combinaron y se concentraron a presion reducida para dar una solucion acuosa incolora transparente. La solucion se trato con carbonato de potasio acuoso saturado para dar una suspension lechosa. La extraccion con una porcion de eter dietllico y dos porciones de acetato de etilo, el secado de los extractos combinados sobre carbonato de potasio anhidro, y la concentracion bajo presion reducida dio una pellcula que comenzo a solidificar con el tiempo. La pellcula se disolvio en etanol absoluto y se concentro a presion reducida para proporcionar un aceite de color amarillo claro que solidifico con el tiempo. El material se sometio a alto vaclo a temperatura ambiente para dar el compuesto del tltulo como un solido (21 mg) de color amarillo claro; punto de fusion: forma solida se transforma desde 121-126 °C, se funde a 146-148 °C.

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Ejemplo 6. 2-[3,4-dimetil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

Etapa i. 3,4-dimetil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-ol. A un matraz de fondo redondo de 250 mL se le adicionaron etil 2-metil acetoacetato (5.0 g, 35 mmol), 1 -(6-metilpiridin-2-il)hidrazina (4.48 g, 36 mmol), y 12 mL de acido acetico. La mezcla se calento a 80°C, durante 9 horas. Se adicionaron agua y EtOAc a la mezcla. Las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron a vaclo (6.68 g).

Etapa ii. 3,4-dimetil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il trifluorometanosulfonato. Al matraz de fondo redondo de 500 mL con 3,4-dimetil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-ol (6.68 g, 33 mmol) se le adicionaron Et3N (5.5 mL, 39 mmol) y 35 mL de CH2O2, la solucion se enfrio en bano de acetona hielo seco. Se adiciono lentamente Tf2O (6.1 mL, 36 mmol). La mezcla se agito a -78°C y se dejo calentar a temperatura ambiente. A continuacion, la mezcla se concentro a vacio. El producto en bruto se purifico utilizando un Sistema Biotage Horizon (0 a 25% de EtOAc/hexano) para proporcionar un aceite incoloro (8.28 g).

Etapa iii: 2-[3,4-dimetil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il]tieno[3,2-c]piridina. En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 100 mL equipado con un condensador de reflujo se adicionaron 3,4-dimetil-1 -(6-metilpi ridin-2-il)-1 H-pi razol-5-il trifluorometanosulfonato (0.90 g. 2.7 mmol, 1.2 equivalentes), trihidrogeno fosfato del acido tieno[3,2-c]piridin-2- ilboronico (0.72 g, 2.6 mmol, 1 equivalente), fosfato tribasico de potasio y 20 mL de dioxano. El matraz se evacuo bajo un vacio y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. A este se le adiciono PdCl2(dppf) (Corriente, aducto dicloro[1, 1'- bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (II) diclorometano, 0.54 g, 0.65 mmol, 0.3 equivalentes). De nuevo, el matraz se evacuo bajo un vacio y la suspension se burbujeo con gas nitrogeno. La reaccion se calento a 100 °C, durante 16 horas y luego se enfrio a temperatura ambiente.

La reaccion se filtro a traves de Celite, aclarando bien con EtOAc hasta que todo el material deseado se eluyo (aproximadamente 400 mL). El filtrado de EtOAc se concentro a un residuo oscuro. El residuo oscuro se recolecto en CH2O2 y los solidos se separaron por filtracion. El CH2O2 se sometio a cromatografia en columna (sistema Biotage Horizon, 0-100% de heptano/EtOAc mas de 800 mL a continuacion, se sostiene a 100% de EtOAc. 500 mL). Las fracciones se concentraron en 3 porciones: la porcion que contenia un aceite ligeramente coloreado (420 mg) parcialmente solidificado despues de reposar durante la noche. El material se disolvio en EtOH caliente y se adiciono heptano. Al reposar durante la noche no aparecio ningun solido precipitado. El material se concentro a sequedad. Se adicionaron aproximadamente 15 mL de Et2O y se filtro el material a traves de un filtro de papel, dejando una cantidad menor de un residuo de color marron claro. El residuo se concentro a sequedad y se adicionaron aproximadamente 1 mL de Et2O. Luego se adicionaron aproximadamente 15 mL de heptano hasta que la mezcla se mantuvo nublada. Un precipitado no era evidente despues de permanecer a 4 °C, durante aproximadamente 2 horas. El material se concentro despues a sequedad para obtener un aceite de color marron claro. Se adiciono heptano y se formaron pequenos circulos de solidos, algunos eran de color blanco crema, otros fueron de color marron. El heptano se decanto y el solido se seco en un horno de vacio a 50 °C, durante aproximadamente 48 horas para proporcionar 229 mg de un solido de color marron claro. pf 108-109 °C.

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Ejemplo 7. 2-[4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

Etapa i: trihidrogeno fosfato del acido tieno[3,2-c]piridina 2-boronico. A una mezcla en agitacion de tieno[3,2-c] piridina (2.0 g) en tetrahidrofurano anhidro (25 mL) a -40 °C se le adiciono una solucion de n-butillitio 1.6 M en hexanos (10 mL) gota a gota, durante cinco minutos. La mezcla de reaccion se agito, durante diez minutos y borato de isopropilo (4.2 mL) se adiciono posteriormente. El bano frlo se retiro y la mezcla se dejo agitar durante tres horas. Se adiciono acido fosforico (85 % de solucion acuosa, 1.2 mL) a la mezcla en agitacion. Posteriormente, se le adiciono agua (10 mL), lo que causo que se precipitara un solido de color amarillo palido instantaneamente. Se adiciono mas agua (100 mL) y se adiciono eter dietllico (100 mL). La suspension se filtro por vaclo. Los solidos se secaron por succion para proporcionar el compuesto del tltulo como un polvo de color amarillo palido (2.73 g); microanalisis de C7H6BNO2S H3PO4 %C(calc/encontrado) 30.35/31.41, %H 3.27/3.24. %N 5.06/5.04, %S 11.58/11.93, %P 11.18/8.58; 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d5, CDCla, CD3OD, mezcla D2O) 8 9.01 (d, 1H, J=1.0 Hz), 8.26 (d, 1H, J=6.0 Hz), 7.94 (s, 1H), 7.91-7.83 (m, 1H); MS (APCl+) m/z 180 (MH+).

Etapa ii: 1-(6-metilpiridin-2-il)hidrazina. Una mezcla de 2-bromo-6-metil-piridina (602.10g) e hidrato de hidrazina (1570 mL) se calento a reflujo a 120°C, durante 6 horas, y luego se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 48 horas. El solido separado se extrajo con eter dietllico (3 x 1.5L) y los extractos de eter combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron (-430g). El residuo se agito en una mezcla de eter (200ml) y hexano (1.5L), se filtraron y lavaron con 5% de eter dietllico en hexano para dar un solido de color amarillo palido (pegajoso). El solido se destilo con vaclo a 106-113°C/2mm, que se solidifico instantaneamente. El solido luego se disolvio en 2L de eter dietllico y se precipito por la adicion de 2L de hexano, se filtro y se seco al vaclo para dar la 1- (6-metilpiridin-2-il)hidrazina como solido de color blanco (240 g).

Alternativamente, la 1- (6-metil-piridin-2-il) -hidrazina tambien se sintetizo de la siguiente manera:

Un matraz de reaccion con chaqueta estaba equipado con agitador mecanico, entrada de nitrogeno y condensador de reflujo y la chaqueta se enfrio a 10 °C. El reactor fue programado para enfriar automaticamente a 0 °C si en algun momento la temperatura interna supera los 80 °C. El reactor se purgo con una corriente constante de gas nitrogeno. El reactor se cargo con 25 g (0.225 mol) de 2-fluoro-6-metilpiridina, seguido de 100 mL de isopropanol y la temperatura de la chaqueta se ajusto a 73 °C (correspondiente a una temperatura interna de 70 °C). El reactor se cargo con 44 g (0.90 mol) de hidrazina acuosa al 65% y la mezcla se agito durante la noche con la chaqueta fijado a 70 °C. Los contenidos del reactor se diluyeron con 125 mL de metil-t-butil eter (MTBE) y 13 mL de salmuera saturada para dar dos capas que se separaron. La capa acuosa se extrajo con 2x60 mL de MTBE. Las capas organicas combinadas se combinaron y se secaron sobre sulfato de sodio (anhidro). El agente de secado se retiro por filtracion y el filtrado organico se concentro por evaporacion rotatoria. El aceite resultante solidifico al dejarlo en reposo para dar el producto deseado (21.1 g) como un solido de color blanco.

Etapa iii: 4-metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-ol. A una mezcla en agitacion de metoxido de sodio (13.6 g) en tetrahidrofurano anhidro (50 mL) bajo una atmosfera de nitrogeno a temperatura ambiente en un recipiente de reaccion de tres bocas de 500 mL secados al horno se le adiciono formiato de metil anhidro (12.6 mL). La mezcla se espumo y a la suspension se le adiciono formiato de etilo (28.7 mL) con una corriente lenta, constante mediante una jeringa mientras se agita el recipiente de reaccion con la mano para facilitar una mezcla mas eficiente de la suspension. La mezcla posterior se agito a temperatura ambiente durante cinco horas. Se adiciono acido acetico glacial (14 mL) mientras que el recipiente de reaccion se agito vigorosamente a mano durante varios minutos para facilitar la mezcla mas eficiente. La posterior suspension se agito durante la noche y se filtro a traves de Celite. El tapon de filtro de Celite se lavo dos veces con eter dietllico (2 x 200 mL) y se filtro con succion. El filtrado produjo un precipitado solido de color blanco escaso que se elimino por una filtracion al vaclo adicional a traves de un embudo fritado medio Buchner. El filtrado posterior se concentro bajo presion reducida (temperatura del bano de agua = 45 °C) para dar un aceite claro, ligeramente coloreado (aproximadamente 15 g). El aceite posela el olor distintivo del acido acetico. El aceite se disolvio en etanol absoluto (50 mL). A esta solucion se le adiciono (6-metil-piridin-2-il) -hidrazina solido (5,4 g). La mezcla en agitacion se llevo a reflujo suave bajo una atmosfera de nitrogeno durante cuatro dlas. La mezcla se concentro a presion reducida y el aceite de color naranja suministrado se disolvio en diclorometano (50 mL). La solucion de diclorometano se aplico a un cartucho instantaneo de silica Analogix de 400-g en un instrumento Biotage. La elucion en el instrumento Biotage con un gradiente (100% de heptano a 70% acetato de etilo en heptano durante cuatro volumenes de columna, o 2400 mL). Las fracciones se secaron para proporcionar un solido (7.1 g).

Alternativamente, 4-metil-2- (6-metil-piridin-2-il) -2H-pirazol-3-ol tambien fue producido de la siguiente manera:

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A una solucion de formiato de etilo (117.5g) y propionato de etilo (54.0g) en 40 mL de tetrahidrofurano (THF) se le adiciono, gota a gota, t-butoxido de potasio (502 mL de una solucion 1.0 molar en THF) a temperatura ambiente durante aproximadamente 0.5 horas. Un precipitado de color blanco se comenzo a formar junto con algo de burbujeo. Despues de otras 7.5 horas la reaccion se filtro, el solido se lavo con eter dietllico y despues se seco a vaclo a 40 °C, durante 16 horas para dar potasio 2- etoxicarbonil-propen-1-olato como un polvo de color gris (23.5g). A una solucion de esta sal de potasio (17.6 g) en 450 mL de 1- propanol se le adiciono (6-metil-piridin-2-il) -hidrazina (11.7 g) seguido de acido acetico (6.5 mL). Despues de agitar durante 10 minutos la mezcla se calento a reflujo suave durante 5 horas. Se adiciono mas acido acetico (5.5 mL) y se continuo el reflujo durante otras 16 horas.

El solvente se elimino a vaclo. El residuo resultante se diluyo con acetato de etilo (350 mL) y la solucion se lavo cuidadosamente con solucion saturada de bicarbonato de sodio (200 mL) hasta que el acido acetico restante se neutralizo. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (50 mL). Las fases organicas se combinaron y a continuacion se lavaron con agua (100 mL), despues con salmuera (100 mL) y se secaron sobre sulfato de magnesio. El agente de secado se retiro por filtracion y el solvente se elimino a vaclo para dar el producto como un solido de color naranja (16.26g).

Etapa iv: 4-metil-246-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il ester del acido trifluoro-metanosulfonico. A una mezcla en agitacion de una solucion en diclorometano de 4-metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-ol (13.39 g en 50 mL de diclorometano) y trietilamina (11 mL) en diclorometano adicional (50 mL mas, 100 mL de diclorometano total) a -78 °C bajo una atmosfera de nitrogeno se adiciono anhldrido trlflico (13.3 mL) con una corriente lenta, constante a traves de una jeringa durante cinco minutos. El bano frlo se retiro y la mezcla se dejo calentar gradualmente durante una hora, treinta minutos a temperatura ambiente. La mezcla se concentro bajo presion reducida y el concentrado se purifico por cromatografla instantanea en silica. La elucion con un gradiente (100 % de heptano a 30 % de acetato de etilo en heptano durante tres volumenes de columna, o 1800 mL, luego 30 % a 45 % de acetato de etilo durante dos volumenes de columna adicionales, o 1200 mL) a traves de un cartucho instantaneo de silica Analogix de 400 g en el instrumento Biotage proporciono el compuesto del titulo como un aceite incoloro claro (18.04 g). 1H-RMN (400 MHz. CDCh) 8 7.68 (m, 1H), 7.59 (d, J=8.0 Hz, 1H). 7.50 (s, 1H), 7.07 (d, J=7.4 Hz, 1H), 2.56 (s, 3H), 207 (s, 3H); 19F-RMN (376 MHz. CDCls) 8 - 74.12 (s, 3F); "C-RMN (100 MHz, CDCla) 157.9. 151.1. 141.3, 139.5, 139.0, 122.0, 118.6 (cuarteto, JC-F=321.0 Hz), 111.9, 108.7, 23.6, 7.3; MS (APCI*) m/z 322.

Etapa v: 2-[4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina. Un matraz de fondo redondo de tres bocas secado en horno equipado con condensador de reflujo y valvula de entrada de gas se cargo con acido tieno[3,2- c]piridina-2-boronico trihidrogeno fosfato (1.0 g), 4-metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il ester del acido trifluoro- metanosulfonico (1.16 g), fosfato tribasico de potasio (2.3 g), 1,4-dioxano (30 mL), aducto de dicloro[1, 1 '- bis(difenilfosfino)ferroceno] paladio (II) diclorometano (0.60 g), y 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno (0.40 g) y la mezcla agitada se llevo a reflujo bajo una atmosfera de nitrogeno durante 18 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (250 mL) y la solucion se trato con carbon activado y se filtraron a traves de Celite. El filtrado se concentro bajo presion reducida y el concentrado se purifico por cromatografla de silica gel. La elucion a traves de un cartucho instantaneo de silica RediSep de 120 g en un Sistema Biotage con 100 % de heptano a 100 % de acetato de etilo sobre 1800 mL seguido de 100 % de acetato de etilo hasta que el material, con la masa deseada eluya proporciona un aceite (1.2 g); MS (APCI+) m/z 307 (MH+). El producto se purifico adicionalmente disolviendo en acetonitrilo (30 mL) y dividiendo en dos porciones iguales. Despues de la filtracion, las soluciones se purificaron secuencialmente por HPLC preparativa (Sistema Waters de HPLC preparativa: Fase estacionaria: Waters DeltPak C18 5 pm. 100 Angstrom, 300x50 mm I.D., P/N 011801, WAT 011801, No. 330C09125W; Fase movil 90:10 a 50:50 agua-acetonitrilo con acido formico al

0.1 % durante 30 minutos). Las fracciones combinadas se concentraron bajo presion reducida a una solucion acuosa, eliminando el acetonitrilo. La solucion acuosa clara se trato con carbonato de potasio acuoso saturado para dar una suspension turbia de color blanco. La suspension se dejo en reposo a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado solido de color blanco que se habia formado se recolecto mediante filtracion por vaclo y se seco en el horno de vaclo (77 °C) durante la noche para proporcionar el compuesto del titulo como un solido de color blanco (0.506 g). Punto de fusion 157-158 °C.

Los datos anallticos de 1H RMN y espectrometrla de masas, para los Ejemplos 1-7 se presentan a continuacion en la Tabla 1:

Tabla 1

Ejemplo

1H RMN MS

1

1H RMN (400 MHz, ds-DMSO) 8 9.06 (d. J = 0.975 Hz, 1H), 8.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H). 7.98 (m, 1H), 7.91 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.84 (d, J =1.8 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.95 (d, J =1.9 Hz, 1H), 3.29 (s, 3H) MS (APCI) m/z 293.1 (M+H)+

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Ejemplo

1H RMN MS

2

1H RMN (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm 9.08 (s, 1H), 8.40 (d, J=5.5 Hz, 1H), 8.01 (dd, J=0.78, 5.7 Hz, 1H), 7.89 (t, J=7.9 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.50 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.31 (s, 3H) MS (APCI, M+1) 307.3

3

1H RMN (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm 9.07 (s, 1H), 8.40 (d, J=5.7 Hz, 1H), 8.00 (dd, J=0.78, 5.7 Hz, 1H), 7.89 (t, J=7.8 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.50 (d, J=7 8 Hz, 1H), 7.32 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 2.68 (q, J=7.5 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.27 (t, J=7.6 Hz, 3H) MS (APCI) m/z 321.2 (M+H)+

4

1H RMN (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm 9.12 (s, 1H), 8.42 (dd, J=5.6, 1.3 Hz, 1H), 8.03 (d, J=5.5 Hz, 1H), 7.83 (m, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.50 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.19 (d, J=7.6 Hz, 1H), 2.53 (q, bajo pico de DMSO, 2H), 2.12 (s, 3H), 1.17 (t, J=7.4 Hz, 3H) MS (APCI) m/z 321.2 (M+H)+

5

1H-RMN (400 MHz, CDCla) 8 8.99 (s, 1H), 8.41 (d, 1H, J=5.5 Hz), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.36 (d, 1H, J=8.0 Hz), 7.27 (d, 1H, J=0.5 Hz), 7.14 (d, 1H, J=7.6 Hz), 2.89-2.83 (m, 4H), 2.562.49 (m, 2H), 2.47 (s, 3H); MS (APCI+) m/z 333 (MH+).

6

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 9.11 (s. 1H), 8.41 (d, J=5.5 Hz, 1H), 8.01 (d, J=5.5 Hz. 1H), 7 79 (t, J=7.7 Hz. 1H), 7.56 (s, 1H), 7.46 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.14 (d, J=7.4 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.05 (s, 3H) MS (APCI) m/z 321.2 (M+H)+

7

1H-RMN (400 MHz, CDCl3) 8 ppm 9.06 (s, 1H), 8.44 (d, J=5.7 Hz, 1H), 7.73 (d, J=5.7 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.62 (m, 1H), 7.37 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.04 (d, J=7.6 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.18 (s, 3H) (APCI+) m/z 307 (M+H)+

Ejemplo 8. 2-[4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina.

Etapa 1. 2-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tieno[3.2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

Una solucion de tieno[3,2-c]piridina (5.0 g) en 100 mL de THF bajo una atmosfera de N2 se enfrio a -78 °C (acetona/hielo seco). n-butillitio (28 mL, 1.6M en hexanos, botella recien abierta) se adiciono gota a gota durante veinte minutos, mientras se mantenla la temperatura interna a o por debajo de -64 °C. La mezcla se agito, durante una hora a - 78 °C y se adiciono posteriormente borato de isopropilo (botella recien abierta, 10.2 mL). El bano frlo se retiro, permitiendo que la mezcla se caliente a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla se agito a temperatura ambiente por una hora. Una mezcla de pinacol (5.9 g) en eter dietllico (20 mL) se adiciono a la mezcla de reaccion. Despues de veinte minutos, se adiciono acido acetico glacial (2.2 mL) y se formo un precipitado en la mezcla de reaccion. La mezcla de reaccion se filtro a traves de Celite, aclarando con cloroformo hasta que el material activo UV se eluyo (aproximadamente 2500 mL). El filtrado se extrajo dos veces con solucion acuosa de hidroxido de sodio al 5% (aproximadamente 500 mL en total). La fase acuosa basica se puso a temperatura ambiente durante la noche. La capa acuosa se enfrio en un bano de hielo seco/CH3CN y se neutralizo con acido clorhldrico acuoso al 10 % mientras se mantenla la temperatura interna a o por debajo de 5 °C. La solucion acuosa neutralizada se extrajo en cloroformo diez veces. Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentraron bajo presion reducida para obtener un solido. Este producto se combino con los productos de tres otras reacciones realizadas en la misma escala de una manera similar para proporcionar un solido combinado (23.52 g). El solido combinado se disolvio en aproximadamente 1 L de etanol en ebullicion. La solucion se dejo enfriar a temperatura ambiente. Despues de aproximadamente cuatro horas a temperatura ambiente, la solucion se almaceno a 4 °C, durante la noche. Un material de color marron claro precipitado a partir de solucion. El llquido se separo por decantacion a traves de un filtro. El solido se seco en un horno de vaclo (50 °C), durante una hora para proporcionar el compuesto del tltulo (14.02 g) como un solido de color marron claro; 1H-RMN (400 MHz, CDCl3 con una gota de D2O para disolver completamente) 8 1.39 (12 H, s), 7.89 (1 H, d, J=5.3 Hz), 7.97 (1 H, s), 8.45 (1 H, d, J=4.5 Hz), 9.18 (1 H, s); MS (APCI+) m/z 262.

Alternativamente, 2-(4.4.5.5-Tetrametil-[1.3,2]dioxaborolan-2-il)-tieno[3,2-c]piridina tambien se produjo de la siguiente manera:

A una solucion a -70 °C de tieno[3,2-c]piridina (21.6g) en 400 mL de tetrahidrofurano seco bajo gas nitrogeno se adiciono n-butil litio (99.9 mL de una solucion 1.6 molar en hexanos) durante aproximadamente 15-20 minutos manteniendo la temperatura por debajo de -65 °C. La solucion se convirtio marron oscuro y turbio. Despues de 45 minutos se adiciono borato de isopropilo (33.06g) y la mezcla se convirtio homogenea. La mezcla se agito a - 70 a -75 °C, durante 2 horas. La mezcla se dejo calentar a -30 °C, luego una solucion de pinacol en 100 mL de eter dietllico se

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adiciono durante 4 minutos. La mezcla de reaccion se convirtio en una solucion homogenea de color naranja. La temperatura se dejo calentar a 5 °C y se mantuvo a esta temperatura, durante 1 hora. La mezcla de reaccion se neutralizo (pH 7) muy lentamente con 40 mL de acido clorhldrico 4 M en 1,4-dioxano, manteniendo la temperatura por debajo de 10 °C. Se formo un precipitado. La mezcla de reaccion se agito durante 1 hora y luego el solido se recolecto por filtracion. El solido se seco bajo vaclo a 40 °C, durante 16 horas. El solido seco (36 g) se agito con 400 mL de agua durante 1.5 horas. La suspension se filtro y el solido se recolecto. El solido se seco bajo un flujo de aire durante 60 horas para dar el producto deseado (34.5g). 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 8 ppm 1.21 (s, 12 H) 7.66 - 7.70 (m, 1 H)

7.80 (d, J=0.78 Hz, 1 H) 8.28 (d, J=5.65 Hz, 1 H) 8.98 (d, J=0.97 Hz, 1 H).

Etapa ii: 2-[4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina. Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 500 mL secado al horno equipado con condensador de reflujo y valvula de entrada de gas se cargo con 2-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tieno[3,2-c]piridina (11.56 g), 5-etil-2-(6-metilpiridin- 2-il)-2H-pirazol-3-il ester del acido trifluorometanosulfonico (16.4 g), fosfato tribasico de potasio (28 g), y 1,4-dioxano (300 mL). El recipiente de reaccion se evacuo y se purgo con gas nitrogeno. La desgasificacion y purga de nitrogeno se repitio dos veces. A la mezcla se le adicionaron aducto dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (II) diclorometano (7.3 g), y 1,1'-

bis(difenilfosfino)ferroceno (5.0 g) y la mezcla agitada se desgasifico y se purgo con gas nitrogeno tres veces mas, y posteriormente se llevo gradualmente a reflujo suave durante un periodo de treinta minutos. La mezcla se agito a reflujo bajo nitrogeno durante 2.5 horas, y se adicionaron posteriormente fluoruro de potasio (13 g) y agua (1.2 mL). La mezcla de agitacion continuo a reflujo durante quince minutos y posteriormente se enfrlo ligeramente y se filtro a traves de Celite. La almohadilla de filtro se lavo con acetato de etilo (1 L) y el filtrado se trato con carbon activado. La suspension de carbono se filtro a traves de Celite. Esta almohadilla de filtro se lavo con acetato de etilo adicional (300 mL), y el filtrado se concentro a presion reducida para proporcionar un residuo en bruto, aceitoso de color marron rojizo (aproximadamente 35 g). El residuo se trato con varios mililitros de etanol absoluto y se concentro bajo presion reducida. El residuo se mezclo con silica gel instantanea (100 g) y una solucion de metanol al 5% en acetato de etilo (200 mL). La mezcla se filtro y la silica se lavo dos veces con 200 mL de metanol al 5% fresco en solucion de acetato de etilo. El filtrado se concentro a presion reducida para proporcionar un residuo oleoso de color marron rojizo (aproximadamente 25 g). El residuo se disolvio en varios mililitros de etanol. Se formo un precipitado posteriormente al ponerse de reposo, y se recolecto mediante filtracion por vacio. Los solidos se lavaron con heptano para producir un polvo de color rojo-naranja, pegajoso (4.6 g). El filtrado de etanol-heptano dio un precipitado que se recolecto mediante filtracion por vacio para dar un solido de color beige (4.3 g). El solido de color beige se disolvio en etanol absoluto sobre vapor. El enfriamiento gradual de la solucion clara produjo un precipitado que se recolecto mediante filtracion por vacio. El secado por succion proporciono un solido (2.25 g). El solido se hirvio en y se precipito a partir de etanol absoluto (15 mL) para dar un solido de color blanco (1.62 g). El solido se hirvio en y se precipito de nuevo a partir de etanol para proporcionar el compuesto del titulo como un solido de color blanco (1.20 g). 1H-RMN (400 MHz, CDCH) 8 9.12 (s, 1H), 8.46 (d, J=5.9 Hz, 1H), 7.94 (d, J=6.0 Hz, 1H), 7.68-7.64 (m, 2H), 7.48-7.43 (m, 2H), 7.04 (d, J=7.6 Hz, 1H), 2.21 (s, 3H), 2.19 (s, 3H); MS (APCI+) m/z 307.

Ejemplo 9. 2- (4-metil-2- (6-metil-piridin-2-il) -2H-pirazol-3-il] tieno [3,2, c] piridina. (Ejemplo de referenda)

Etapa I: 2-metil-6-(4-metil-pi razol-1-il)-pi ridina.

Condicion de reaccion 1

A una solucion de 4-metil-pirazol (1.0 g) en 50 mL de acetonitrilo anhidro se le adiciono carbonato de cesio (5.9 g), seguido de 2-flouro-6-metilpiridina (1.5 g). La mezcla de reaccion se agito a reflujo durante 18 horas. La mezcla de reaccion se filtro para eliminar las sales de cesio y luego el filtrado se evaporo para dar un aceite en bruto. La purificacion por cromatografia instantanea (silica gel, 20% acetato de etilo en heptano) proporciono, despues del secado, 1.32 g del compuesto del titulo como un aceite de color amarillo. 1H-RMN (400 MHz: DMSO-d6) 8 6.34 (s, 1H),

7.80 (t, 1H), 7.63 (d, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.13 (d, 1H), 247 (s, 3H), 2.08 (s, 3H); MS (APCI+) m/z 174 (MH+).

Condicion de reaccion 2

La reaccion realizada en la etapa i para la reaccion 1 se llevo a cabo de una manera similar a gran escala, iniciando con 4-metil-pirazol (5.0 g). Se produjeron 5.92 g del compuesto del titulo.

Condicion de reaccion 3

Alternativamente: iniciando con 4-metil-pirazol (1.0 g) en acetonitrilo utilizando 1.1 eq de t-butoxido de potasio como base, se produjeron 1.75 g del compuesto del titulo.

Condicion de reaccion 4

Alternativamente: iniciando con 4-metil-pirazol (1.0 g) en THF utilizando 1.1 eq de t-butoxido de potasio como base, se produjeron 0.238 g del compuesto del titulo.

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Condicion de reaccion 5

Ademas, el compuesto del tltulo de la etapa i se preparo de la siguiente manera: A una suspension de hidruro de sodio al 60% (8.04 g) en DMF anhidro (40 mL) bajo una atmosfera de nitrogeno se le adiciono gota a gota una solucion de 4- metil- pirazol (15 g) en 30 mL de DMF en un bano de hielo durante un perlodo de 40 minutos. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 0.5 horas y despues se adiciono gota a gota 2-fluoro-6-metilpiridina (22.33 g). La mezcla se agito a 80 °C, durante 3 horas y se enfrio. La mezcla de reaccion se vertio en agua congelada y se extrajo dos veces con acetato de etilo. La fase organica combinada se lavo con agua y salmuera, se seco sobre Na2SO4 y se filtro. El filtrado se concentro a vaclo para dar un residuo, que se purifico por cromatografla (2% -10% de acetato de etilo en heptanos) para dar 29.9 g del compuesto del tltulo como un aceite incoloro.

Etapa II: 2-(5-bromo-4-metilpirazol-1-il)-6-metilpiridina. A una solucion frla (-60 °C) de 2-metil-6- (4- metil-pirazol-1-il) piridina (0.52 g,) (preparado mediante la condicion de reaccion 1 en la etapa i) en 14 mL de THF anhidro se le adicionaron 1.33 mL de una solucion de n-butillitio 2.5M (0.21 g) en hexanos. La mezcla de reaccion se agito a -60 °C, durante una hora. Se adicionaron 10 mL de una solucion de N-bromosuccinimida (0.59 g) en THF y luego la solucion final se agito a -60 °C, durante 2 horas. Se adiciono cloruro de amonio saturado (20 mL) y despues la mezcla de reaccion se dejo calentar a 24 °C. La mezcla de reaccion se diluyo con 300 mL de acetato de etilo y despues la fase acuosa se separo. La fase organica se lavo con cloruro de amonio saturado adicional (50 mL) y despues con salmuera (50 mL). La capa organica se separo, se seco (sulfato de sodio), se filtro y despues el filtrado se evaporo para dar un aceite de color rojo en bruto. La purification por cromatografla instantanea (silica gel, 20% de acetato de etilo en heptano) proporciono, despues de secar, 0.377 g del compuesto del tltulo como un aceite de color amarillo; 1H-RMN (400 MHz; DMSO-d6) 8 7.88 (t, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.02 (s, 3H); MS (APCI+) m/z 254 (MH+).

Condiciones de reaccion alternativas: El compuesto de la etapa ii, 2- (5-bromo-etilpirazol-1-il) -6-metilpiridina, tambien se preparo de la siguiente manera.

1. ) Utilizando condiciones de reaccion similares a las descritas anteriormente, 2- (5-bromo-4-metilpirazol-1-il) -6- metilpiridina, se preparo iniciando con 2-metil-6- (4-metil-pirazol-1- il) piridina (1.0 g) para proporcionar el compuesto del tltulo (829 mg).

2. ) Utilizando condiciones de reaccion similares a las descritas anteriormente, 2- (5-bromo-4-metilpirazol-1-il) -6- metilpiridina, se preparo iniciando con 2-metil-6- (4-metil-pirazol-1- il) piridina (5.0 g) para proporcionar el compuesto del titulo (2.64 g).

3. ) Utilizando condiciones de reaccion similares a las descritas anteriormente, 2- (5-bromo-4-metilpirazol-1-il) -6- metilpiridina, se preparo iniciando con 2-metil-6- (4-metil-pirazol-1- il) piridina (1.0 g) para proporcionar el compuesto del titulo. Ademas, se utilizo 1,2-dibromotetrafluoroetano (1.5 equivalentes) en lugar de N-bromosuccinimida (NBS) como el agente de bromacion (756mg).

Etapa iii: 2-[4-metil-2-(8-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina. A una solucion de 2- (5- bromo-4- metilpirazol-1-il) -6-metilpiridina (2.0 g) en 20 mL de 1,2-dimetoxietano anhidro (DME) se le adiciono dicloruro de bistrifenilfosfina de paladio (0.153 g). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos y despues se adicionaron 20 mL de agua, seguido de bicarbonato de sodio (2.0 g) y se adiciono 5- etil-2-(6-metil-piridin-2- il)-2H-pirazol-3-il ester acido trifluoro-metanosulfonico (3.1 g). La mezcla de reaccion se calento a reflujo durante 18 horas y despues se enfrio a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se diluyo con 400 mL de eter dietilico y despues la fase organica se lavo con agua (100 mL), bicarbonato de sodio saturado (2 x 100 mL), y salmuera (100 mL). La capa organica se seco (sulfato de magnesio), se filtro, y luego el filtrado se evaporo para dar una suspension de color amarillo. La mezcla se diluyo con 25 mL de acetato de etilo. El material no todo fue a la solucion. La mezcla se trituro durante 15 minutos y luego se filtro (primera filtration) para eliminar un solido amarillo, que se aclaro con acetato de etilo (2 x 10 mL). El solido se seco al aire durante 15 minutos para proporcionar 448 mg de producto ligeramente impuro. El filtrado desde la primera filtracion anterior se evaporo sobre 6 g de silica gel y se sometio a cromatografla instantanea (silica gel, 80% de acetato de etilo en heptano, acetato de etilo, seguido de 95% acetato de etilo en metanol) para dar 0.565 g. El peso combinado del compuesto del tltulo fue 1.01 g como un solido de color amarillo. La precipitation a partir de etanol dio el compuesto del tltulo (0.764 g) como un solido de color amarillo; punto de fusion 155-156 °C; MS (APCI+) m/z 307 (MH+).

Ejemplo 10. 2-[4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina. (Ejemplo de referenda)

Etapa i: 4-Bromo-piridina. El clorhidrato de 4-bromopiridina (20.0 g, 102.9 mmol) se sometio a repartition entre EtOAc y NaHCO3 al 5%. Las capas se separaron, y la fase acuosa se extrajo con EtOAc. Los extractos organicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, y se evaporaron a presion reducida en un bano de 40 °C para proporcionar 13.7 g (84%) de un aceite volatil que se uso inmediatamente en la siguiente etapa.

Etapa ii: 4-Bromo-piridina-3-carbaldehido. Una suspension de 4-bromopiridina (13.7 g, 86.8 mmol) en 300 mL de THF se purgo con N2 y se enfrio a -78 °C bajo una atmosfera de N2 seco. Se adiciono una solucion de diisopropilamida de litio

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(solucion 2.0 M en heptano/THF/etilbenceno, 43.4 mL, 86.8 mmol), durante aproximadamente 3 minutos. Despues de 30 minutos, se adiciono DMF (dimetilformamida). La mezcla de reaccion se mantuvo a -78 °C, durante 3 horas antes de permitir que se caliente a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccion se inactivo con NH4Cl saturado y se concentro bajo presion reducida para eliminar la mayor parte del THF. La mezcla acuosa se extrajo con EtOAc. Los extractos organicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se seco sobre Na2SO4, se evaporaron y se sometieron a cromatografla (columna de silica gel Analogix de 150 g, eluyendo con un gradiente de 100% de heptano a 30 % de EtOAc/heptano mas de 45 minutos). Las fracciones que contenlan el producto se combinaron y se evaporaron para dar 2.20 g (13.6%) del compuesto del tltulo. MS m/z 186 (m + H)+.

Etapa III: 1-tieno [3,2-c] piridin-2-il-propan-1-ona. A una solucion de hidrato de hidrosulfuro de sodio (1.31 g, 17.7 mmol) en 5 mL de agua, se le adiciono DMF (30 mL) y K2CO3 (3.27 g, 23.7 mmol). La mezcla se enfrio a 0 °C en un bano de hielo antes de la adicion de 1-bromo-2-butanona (2.68 g, 17.7 mmol). Despues de 15 minutos, se adiciono una solucion de 4-bromopiridina-3- carbaldehldo (2.20 g, 11.8 mmol) en DMF (20 mL) La mezcla de reaccion se agito a 45 °C, durante 2.5 dlas. La mezcla de reaccion se diluyo con agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos organicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se seco sobre Na2SO4, y se evaporaron para dar el producto bruto (1.80 g, 80%) que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. MS m/z 192 (M + H)+.

Etapa iv: 3-Dimetilamino-2-metil-1-tieno[3,2-c]piridin-2-il-propenona. Una solucion de 1 -tieno[3,2-c]piridin- 2-il-propan-1- ona (1.80 g, 9.41 mmol) y dimetoximetil-dimetil-amina (5.32 mL, 37.8 mmol) en DMF (20 mL) se purgo con N2 y se calento a 80 °C, durante 18 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con agua/salmuera 1: 1 y se extrajo con EtOAc. Los extractos organicos se lavaron con agua/salmuera 1:1 y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, y se evaporaron para dar 2.1 g de material bruto. El residuo se disolvio repetidamente en tolueno y se evaporo hasta que se obtuvo un residuo de peso constante. MS m/z 247 (M + H)+.

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Etapa v: 2-[4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina. Una solucion de 3- dimetilamino-2-metil-1- tieno[3,2-c]piridin-2-il-propenona (1.31 g, 5.32 mmol) en acido acetico (20 mL) se calento a 90°C. Una solucion de (6- metil-piridin-2-il)-hidrazina en acido acetico (8 mL) se calento a 90°C antes de adicionar a la solucion 3- dimetilamino-2- metil-1-tieno[3,2-c]piridin-2-il-propenona. La mezcla se calento a 95°C, durante 15 minutos antes de retirar del calor y la agitacion a temperatura ambiente durante 18 horas. El solvente se elimino a presion reducida, y el residuo se evaporo dos veces a partir de tolueno. El residuo as! obtenido se sometio a cromatografla (columna Analogix de 110 g de silica gel eluyendo con 100% de CH3CN) para proporcionar 0.45 g (28%) de un aceite de color naranja.

Un segundo metodo de preparacion del compuesto de la etapa iii del Ejemplo 10, (1-tieno[3,2-c]piridin-2-il-propan-1-ona) tambien se llevo a cabo de la siguiente manera:

Etapa i. 4-Bromo-piridina-3-carbaldehido. Una suspension de clorhidrato de 4-bromopiridina (5.0 g, 25.7 mmol) en THF (100 mL) se purgo con N2 y se enfrio a -78°C. Una solucion de diisopropilamida de litio (solucion 2.0 M en heptano/THF/etilbenceno, 27.0 mL, 54.0 mmol) se adiciono durante 3 minutos. Despues de 30 minutos, se adiciono DMF (8.56 mL, 110.6 mmol). La mezcla de reaccion se agito a -78 °C, durante 15 minutos antes de calentar rapidamente a temperatura ambiente en un bano de agua. La reaccion se dejo agitar a temperatura ambiente, durante 18 horas. La reaccion se inactivo con NH4Cl saturado (100 mL) y se extrajo con EtOAc. Los extractos organicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se seco sobre Na2SO4, se evaporaron y se sometieron a cromatografla (columna Analogix de 150 g de silica gel eluyendo con un gradiente de 100% de heptano 50% de EtOAc/heptano mas de 1 hora) para dar 1.50 g (31%) del compuesto del tltulo como un solido de color amarillo claro. MS m/z 186 (M + H)+.

Etapa ii. ester metllico del acido tieno [3,2-c] piridina-2-carboxllico. A una solucion de 4-bromo-piridina-3-carbaldehldo (1.50 g, 8.06 mmol) en DMF (10 mL) y agua (1 mL), se le adiciono K2CO3 (1.34 g, 9.68 mmol) y tioglicolato de metilo (0.87 mL, 9.68 mmol). La mezcla se calento a 45 °C, durante 18 horas. La mezcla de reaccion se retiro del bano de calentamiento y se diluyo con agua (50 mL). Despues de 1 hora, el solido esponjoso que se formo se filtro y se lavo con agua. El material as! obtenido se seco en un horno de vaclo a 60 °C, hasta un peso constante de 0.92 g (59%). MS m/z 194 (M + H)+.

Etapa iii). metoxi-metilamida del acido tieno[3.2-c]piridina-2-carboxllico. Una suspension de O,N-dimetilhidroxilamina clorhidrato (2.32 g, 23.8 mmol) en THF (20 mL) se purgo con N2 y se enfrio a-78°C antes de adicionar n-butillitio (1.6 M

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en hexanos, 30.0 mL, 48.1 mmol). Se retiro el bano y se agito 15 minutos antes de sustituir el bano y la adicion de una solucion de ester metllico del acido tieno[3.2-c]piridina-2-carboxllico (0.92 g, 4.76 mmol) en THF (l0 mL). Despues de 45 minutos, se adiciono NH4Cl saturado. La mezcla se diluyo con EtOAc; se lavo con agua, HCl 1 M, agua, NaHCO3 al 5%, agua, y salmuera; se seco sobre Na2SO4, y se evaporo para dar 0.54 g (51%) de un aceite que solidifico al reposar. El producto as! obtenido se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. MS m/z 223 (M + H)+.

Etapa iv. 1-Tieno[3,2-c]piridin-2-il-propan-1-ona. La metoximetilamida del acido tieno[3.2-c]piridina-2-carboxllico (0.54 g, 2.43 mmol) se disolvio en THF (10 mL), purgado con N2, y se enfrlo a 0°C en un bano de hielo. Se adiciono bromuro de etil magnesio (3 M en eter, 2.43 mL, 7.29 mmol) y la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccion no se purifico adicionalmente. MS m/z 192 (M + H)+.

Un tercer segundo metodo de preparacion del compuesto de la etapa iii del Ejemplo 10, (1-tieno[3,2-c]piridin-2-il-propan- 1-ona) tambien se llevo a cabo de la siguiente manera:

Etapa i: N-metoxi-N-metil-propionamida. A una mezcla en agitacion de 0,N-dimetil-hidroxilamina clorhidrato (11.1 g) y cloruro de propionilo (9.4 mL) en diclorometano (300 mL) a 0 °C, bajo una atmosfera de nitrogeno, se le adiciono piridina (18.2 mL). El bano frlo se retiro y la mezcla se dejo calentar gradualmente a temperatura ambiente, temperatura a la cual se agito durante el fin de semana. Un precipitado blanco se habla formado en la mezcla de agitacion. La mezcla se trato con acido clorhldrico acuoso al 10% y se agito hasta que el precipitado se habla disuelto en la solucion bifasica. Las capas se separaron y la fase de diclorometano se lavo con bicarbonato de sodio acuoso saturado (100 mL) y solucion de salmuera (100 mL), se seco sobre sulfato de magnesio anhidro, y se concentro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tltulo como un aceite incoloro transparente (12.05 g): 1H-RMN (400 MHz; CDCh) 8 3.62 (s, 3H), 3.11 (s, 3H), 2.38 (cuarteto, J=7.6 Hz, 2H), 1.07 (t, J=7.6 Hz, 3H); 13C-RMN (100 MHz; CDCla) 8 175.5, 61.3, 325, 25.4, 8.9; MS (APCI+) m/z 118 (MH+).

Etapa ii: 1-tieno[3,2-c]piridin-2-il-propan-1-ona. A una mezcla en agitacion de tieno [3,2-c] piridina (1.0 g) en tetrahidrofurano anhidro (50 mL) a -40 °C (bano de hielo seco-acetonitrilo) se le adiciono una solucion de n-butillitio (1.6 M, 4.7 mL) en hexanos. La mezcla se enfrio a -78 °C seguido de la posterior adicion de una solucion de N-metoxi-N- metil- propionamida (0.97 g) en tetrahidrofurano anhidro (10 mL). El bano frlo se retiro y la mezcla de reaccion se dejo calentar gradualmente a temperatura ambiente. La mezcla se agito durante la noche (14 horas). La mezcla se trato con cloruro de amonio acuoso saturado (150 mL). Despues, la mezcla se extrajo con acetato de etilo (500 mL), y el extracto se lavo con solucion de salmuera (100 mL). La fase organica se seco sobre carbonato de potasio anhidro y se concentro bajo presion reducida, se reconstituyo en cloroformo, y se concentro de nuevo a presion reducida para proporcionar el semisolido de color naranja-marron (1.17 g). El semisolido se purifico por cromatografla instantanea sobre silica utilizando una columna Analogix de silica (115 g de silica), eluyendo con 0-30% de acetato de etilo/heptano, a continuacion, 30-60% del acetato de etilo/heptano. La concentracion de las fracciones que contienen el producto proporciono 0.49 g del producto. El material inicial (0.45 g) tambien se aislo por evaporacion de las fracciones apropiadas.

Ejemplo 11. 2-[4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina (Ejemplo de referencia). Un

matraz de fondo redondo de tres bocas de 500 mL equipado con un condensador de reflujo y valvula de entrada de gas se cargo con 2- (4.4,5,5- tetrametil [1,3,2] dioxaborolan-2-il) tieno [3, 2-c] piridina (10 g), 4-metil-2-(6-metilpiridin- 2-il)-2H- pirazol-3-il ester del acido trifluoro-metanosulfonico (14 g), fosfato tribasico de potasio (24 g), y 1,4-dioxano (200 mL). El recipiente de reaccion se evacuo y se purgo con gas nitrogeno. La desgasificacion y purga de nitrogeno se repitio dos veces. A la mezcla se le adicionaron dicloro [1,1 '-bis (difenilfosfino) ferrocenopaladio (ll) diclorometano (3.2 g), 1,1 '-bis (difenilfosfino) ferroceno (2.2 g), fluoruro de potasio (11 g), y agua (1 mL) y la mezcla en agitacion se desgasifico y se purgo con gas nitrogeno tres veces mas, y posteriormente se llevo gradualmente a 80 °C, durante un perlodo de veinte minutos. La mezcla se agito a 80 °C, durante diez minutos y posteriormente se enfrio gradualmente a temperatura ambiente tal como estaba durante la noche. La mezcla se filtro por vacio a traves de Celite y se lavo a traves del tapon de filtro con dos porciones de acetato de etilo (800 mL y 600 mL). Los filtrados se combinaron y se concentraron a presion reducida para dar un residuo oscuro. El residuo se disolvio en diclorometano (200 mL). Un solido precipito y se separo mediante filtracion por vacio. El filtrado se concentro a presion reducida para proporcionar un solido de color naranja-marron (20 g). El solido se trato con acetonitrilo (200 mL) a temperatura ambiente y la suspension resultante se agito y se filtro por vacio para dar un solido de color amarillo (9.1 g). Este segundo solido se disolvio en acetonitrilo hirviendo sobre un bano de vapor de agua (volumen de la solucion caliente 75 mL) y la solucion naranja se dejo enfriar a temperatura ambiente durante treinta minutos. Un solido se precipito, y el matraz se sello y se almaceno a 4 °C, durante la noche. El precipitado se filtro por vacio y se seco por succion para proporcionar el compuesto del tltulo como un solido de color blanco crema (4.80 g). Este solido se combino con lotes de solido aislado de una manera similar a partir de otros experimentos (21.5 g de masa total) para dar un solido combinado.

El solido combinado se combino ademas con el solido (8.92 g) obtenido a partir del siguiente experimento:

Las soluciones de 3-dimetilamino-2-metil-1-tieno [3,2-c] piridin-2-il-propenona (31,35 g) en acido acetico glacial (500 mL) y (6-metil-piridin 2-il) -hidrazina (15.67 g) en acido acetico glacial (200 mL) se purgaron con nitrogeno seco y se calentaron a 90 °C bajo gas nitrogeno. Las dos mezclas se combinaron y se calentaron a 95 °C, durante 15 minutos. Se

interrumpio el calentamiento y la mezcla de reaccion se dejo enfriar y se agito a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccion en bruto se concentro hasta aproximadamente 100 g de un aceite oscuro bajo presion reducida. El residuo se disolvio en tolueno y se evaporo a aproximadamente 70 g. Un fuerte olor a acido acetico fue evidente, por lo que el evaporado se disolvio en tolueno y se evaporo a aproximadamente 70 g de un aceite. Aunque el residuo as!

5 obtenido todavla tenia un olor debil a acido acetico, se disolvio en acetonitrilo (200 mL) y se dejo reposar a temperatura

ambiente. Despues de 2.5 dlas, no se habla formado precipitado, por lo que la solucion se evaporo bajo presion reducida en un bano de 60 °C. El aceite resultante se disolvio en acetonitrilo (aproximadamente 200 mL) y se dejo enfriar a temperatura ambiente. Una pequena cantidad de precipitado se habla formado, que se recolecto y se lavo con una pequena cantidad de acetonitrilo. Tras la filtracion, una gran cantidad de solido precipito a partir del licor madre. El 10 precipitado se recolecto y se lavo con una pequena cantidad de acetonitrilo. Tras el secado en un horno de vacio a 60

°C, se obtuvieron 12.05 g de material. El solido asi obtenido se fue aislado otra vez a partir de 250 mL de acetonitrilo

hirviendo para proporcionar, despues de secado hasta peso constante en un horno de vacio a 60 °C, el solido (8.92 g) de 2- [4-metil-2- (6-metil-piridin 2-il) -2Hpirazol- 3-il] tieno [3,2-c] piridina.

Los lotes combinados 21.5 g y 8.92 g se suspendieron en acetonitrilo a 500 mL de volumen total. La suspension se 15 calento sobre un bano de vapor de agua a ebullicion. La mayor parte del solido se disuelve en solucion, pero algunas particulas permanecieron sin disolver y se eliminaron mediante filtracion por vacio caliente. El filtrado recogido en el matraz de filtro de 2 L produjo rapidamente un precipitado solido de color blanco. El acetonitrilo se adiciono a un volumen de 600 mL. El filtrado se llevo a ebullicion sobre un bano de vapor hasta que todos los solidos se disuelven. El matraz se retiro del bano de vapor y la mezcla se enfrio gradualmente a temperatura ambiente, tal como estaba en 20 reserva durante 2.5 horas. Se formo un solido de color blanco desde la solucion durante ese tiempo y se recolecto mediante filtracion por vacio para proporcionar el compuesto del titulo como un solido de color blanco (24.85 g); 1H- RMN (400 MHz, CDCla) 8 9.06 (d, J=0.8 Hz, 1H), 8.43 (d, J=5.7 Hz, 1H), 7.72 (ddd, J=5.7. 1.0. 0.8 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.61 (t, J=7.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.31 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.03 (d, J=7.6 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.18 (s, 3H); MS (APCI+) m/z 307 (MH+), (APCI-) m/z 305 (M-H+).

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Ejemplo 12. 2-(4-metil-1-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-5-il)tieno[2,3-c]piridina.

Tieno[2,3-c]piridina de la etapa iii, Ejemplo 12 se ha sintetizado previamente (vease, por ejemplo, Graulich et al. (2004) Synthesis 12: 1935-1937; Graulich et al. (2005) J. Med. Chem. 48(15): 4972-4982).

Etapa i. (2,2-Dimetoxi-etil)-tiofen-2-ilmetilen-amina. Una solucion de tiofen-2-carboxaldehido (7.5 mL, 82.3 mmol, Alfa 30 Aesar), aminoacetaldehido dimetil acetal (8.82 mL, 82.3 mmol, Alfa Aesar) en 100 mL de tolueno se calento a 115 °C, utilizando una trampa Dean-Stark para eliminar agua. Despues de 3 horas, la reaccion se enfrio a temperatura ambiente. La reaccion se coloco en un evaporador rotatorio para evaporar el tolueno, que dio un liquido de color marron (aproximadamente 17.3 g), que se uso sin manipulation adicional en la siguiente etapa. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 8 ppm 3.42 (6 H, s), 3.73 (1 H, d, J=5.3 Hz), 4.65 (1 H, t, J=5.3 Hz), 7.07-7.41 (3 H, m).

35 Etapa ii. ester dimetilico del acido {[(2,2-dimetoxi-etil)-etoxicarbonil-amino]-tiofen-2-il-metil}-fosfonico. Al aceite obtenido en la etapa i (16.3 g, 82.3 mmol) se le adicionaron 60 mL de THF bajo una atmosfera de N2. La reaccion se enfrio a -10 °C (MeOH/hielo) y equipado con un termometro interno. Se adiciono gota a gota cloroformiato de etilo (7.9 mL, 82.3 mmol) manteniendo la temperatura interna igual o por debajo de -9,5 °C. La reaccion se agito durante 10 minutos a -10 °C y luego se retiro el bano y la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. Utilizando un bano de hielo como un 40 disipador de calor, se adiciono fosfito de trimetilo (10.7 mL, 90.5 mmol). La reaccion se dejo calentar gradualmente a temperatura ambiente y se agito durante la noche. El solvente se elimino en un evaporador rotatorio. Se adiciono tolueno y se evaporo en un evaporador rotatorio. A continuation, se llevo a cabo la adicion de tolueno y la evaporation por segunda vez.

El aceite de color marron espeso resultante se purifico mediante cromatografia en columna (sistema Biotage Horizon, 45 columna Isco RedlSep de 330 g, 0-100% de EtOAc/hexano durante 1 volumen de columna a continuacion, se mantiene a 100% de EtOAc). Las fracciones deseadas se combinaron y concentraron para dar 23.48 g de un aceite espeso, de color marron.

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Etapa iii. Tieno[2,3-c]piridina. El material desde la etapa ii (23.5 g, 61.6 mmol), se disolvio en 100 mL de CH2CI2. El matraz de tres bocas se equipo con un condensador de reflujo y termometro interno bajo atmosfera de N2. El matraz se evacuo y se purgo con nitrogeno. Se adiciono lentamente cloruro de titanio (IV) (40 mL. 369 mmol) a la reaccion. La temperatura de reaccion se mantuvo a alrededor de 40 °C. Despues se adicionaron aproximadamente 15 mL, la reaccion se coloco en un bano de hielo para controlar la temperatura. La reaccion se dejo calentar gradualmente a temperatura ambiente antes de calentar a 40 °C, durante la noche. La reaccion se calento a 40 °C, durante 18 horas, despues se enfrio a temperatura ambiente. Los contenidos de la reaccion se vertieron en porciones en un gran vaso de precipitados que contiene 200 g de hielo y 200 mL de NH4OH observando una gran emision de gases. La reaccion se agito vigorosamente durante unos minutos. La reaccion se filtro y el solido se lavo con CHCh (3x100 mL).

El filtrado bifasico se transfirio a un embudo de separacion y se separaron las capas. La capa organica se extrajo en HCl 1 N (2x100 mL). La capa acuosa de HCl se lavo con 20 mL de CH2Cl2 y cuidadosamente basifico con NH4OH concentrado hasta que se alcanzo un pH de aproximadamente 9. El producto se extrajo en CH2Cl2 (3x100). La capa organica se seco sobre MgSO4, se filtro, se concentro hasta un aceite de color naranja que solidifico a un solido de color naranja. El material en bruto se purifico por cromatografla en columna (sistema Biotage Horizon, columna Isco RediSep de 120 g, equilibrada con 100% de heptano, se eluye con 45% de EtOAc/heptano). Un solido de color blanco se aislo (4.20 g). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 7.56 (1 H, dd, J=5.5, 0.8 Hz), 7.86 (1 H, dd, J=5.5, 1.0 Hz), 8.10 (1 H, d, J=5.3 Hz), 8.46 (1 H, d, J=5.5 Hz), 9.25 (1 H, s). 1H RMN (400 MHz. CLOROFORMO-d) 8 ppm 7.40 (1 H, d, J=5.5 Hz), 7.74 (2 H, m), 8.52 (1 H, d, J=5.5 Hz), 9.19 (1 H, s). MS (APCI, M+1) 136.0.

Etapa iv. trihidrogeno fosfato del acido tieno[2,3-c]piridin-2-ilboronico. Un matraz de tres bocas equipado con un termometro interno que contiene el material de la etapa III (4.12 g, 30.5 mmol) se evacuo y luego se lleno con una atmosfera de nitrogeno. Se adiciono THF (50 mL) y la solucion se enfrio a -44 °C (CHsCN/hielo seco). Se adiciono n- butillitio (1.6 M/hexano, 21 mL, 34 mmol) durante 10 minutos, manteniendo la temperatura interna igual o por debajo de - 35 °C. La reaccion se agito a -33 a -45 °C, durante 75 minutos. Se adiciono borato de triisopropilo (8.4 mL, 36.6 mmol) y el bano de enfriamiento se elimino. La reaccion se agito durante una hora y luego se adiciono acido fosforico (85% acuoso, 2.5 mL, 33.5 mmol). La reaccion se diluyo con 10 mL de agua que producira un precipitado. La reaccion se agito vigorosamente durante 15 minutos. Un solido de color amarillo se recolecto por filtracion, aclarando con EtOAc (aproximadamente 50 mL) para proporcionar un solido en polvo de color blanco (9.57 g). Aproximadamente la mitad del material se lavo con 50 mL de agua para aislar 3.16 g de un solido de color rosa palido. Ambos cultivos de material son iguales como se determina por los datos espectrales. 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) 8 ppm 7.87 (1 H, d, J=5.5 Hz), 7.95 (1 H, s), 8.41 (1 H, d, J=5.7 Hz), 9.11 (1 H, s).

Etapa v. 2-(4-metil-1 -(6-metilpiridin-2-il)-1 H-pirazol-5-il)tieno[2,3-c]piridina. En un matraz de tres bocas de 250 mL se adiciono 4-metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il ester del acido trifluoro-metanosulfonico (1.23 g. que se puede sintetizar como se describe en el ejemplo 7, etapa iv), el material de la etapa iv (2.00 g), fluoruro de potasio (1.11 g), fosfato de potasio tribasico (2.44 g) en 50 mL de dioxano. El matraz fue evacuado con un vaclo y se purgo con gas nitrogeno. A este se le adiciono PdCh (dppf) (Corriente, aducto dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (II) diclorometano 280 mg)) y ligando de dppfo (Corriente, 1,1-bis (difenilfosfino) ferroceno, 212 mg) y agua (0.10 mL). La reaccion se calento a 80-111 °C, durante 2.5 horas despues se enfrio a temperatura ambiente. La reaccion se combino con material desde otra reaccion que se ejecutan de una manera similar. El material de reaccion en bruto se filtro a traves de un lecho de Celite aclarando con EtOAc (aproximadamente 750 mL). El filtrado se concentro a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo oscuro se diluyo con CH2O2 y el solido se separo por filtracion. El filtrado de CH2O2 se concentro en un evaporador rotatorio para dar un residuo negro. El material en bruto se purifico por filtracion a traves de un tapon de silica gel eluyendo con 50% EtOAc/hexano (aproximadamente 800 mL en total). Las fracciones desde la filtracion del tapon de silica gel produjeron dos lotes de material (uno puro, uno impuro). Estos se concentraron a sequedad por separado. El material impuro se trituro con Et2O y un solido de color blanco se recolecto por filtracion. El filtrado se concentro y se repitio la trituracion con Et2O para dar 83 mg. Las fracciones que contenian solamente el producto deseado mas el lote de 83 mg se combinaron y se purificaron junto con el lote puro. Aproximadamente 5-10 mL de EtOH se adicionaron al material, que se calento hasta ebullicion. Una vez que todo el material se disolvio, se retira del calor y se dejo reposar. Un solido de color beige entonces comenzo a precipitar. Los licores madre se decantaron y el precipitado se aclaro con una pequena cantidad de EtOH frio. El precipitado se seco en un horno de vacio a 50 °C, durante la noche para proporcionar 550 mg de un solido de color beige. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 ppm 9.09 (1 H, s), 8.50 (1 H, d, J= 5.7 Hz), 7.62-7.69 (3 H, m), 7.39 (1 H, d, J= 7.99 Hz), 7.27 (1 H, d, J= 0.6 Hz). 7.04 (1 H, d, J= 7.4 Hz), 2.25 (3 H, s), 2.19 (3 H, s). MS (APCI, M+1) 307.1. pf 124.-125 °C

5

10

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25

30

35

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45

imagen14

Ejemplo 13. 2-(2-(6-metilpiridin-2-il)-2,4,5,6-tetrahidrociclopenta[c]pirazol-3-il)tieno[2,3-c]piridina.

En un matraz de tres bocas de 250 mL se adiciono 2- (6-metil) piridin-2-il) -2,4,5,6- tetrahidrociclopentapirazol- 3-il ester del acido trifluoro-metanosulfonico (1.33 g, que puede ser sintetizado como se describe en el ejemplo 5, Etapa iv), el material del Ejemplo 12, Etapa iv (2.00 g), fluoruro de potasio (1.11 g), fosfato de potasio tribasico (2.44 g) en 45 mL de dioxano. El matraz se evacuo a presion reducida y se purgo con gas y nitrogeno. A este se le adiciono PdCl2 (dppf) (Corriente, aducto dicloro[1,1'-bis(difenilfosfino)ferrocenopaladio (II) diclorometano, 280 mg)) y ligando de dppf (Corriente, 1.1'-bis(difenilfosfino)ferroceno. 212 mg) y agua (0.10 mL). La reaccion se calento a 80-111 °C, durante 3.5 horas y luego se enfrlo a temperatura ambiente. El material de reaccion se filtro a traves de una almohadilla de Celite aclarando con EtOAc (aproximadamente 250 mL). El filtrado de EtOAc se concentro a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo oscuro resultante se diluyo con CH2O2 y el solido se separo por filtracion. El filtrado de CH2O2 se concentro en un evaporador rotatorio para dar un residuo negro que se diluyo con CH3CN y se sonico. Un solido de color marron claro (0.520 g) se recolecto por filtracion. El filtrado se concentro hasta sequedad y se purifico por cromatografla en columna (sistema Horizon Biotage, columna Analogix de 12 g, 0-50% de EtOAc/heptano, a continuacion, se mantiene a 50% de EtOAc/heptano) para producir aproximadamente 300 mg de un solido. Los 300 mg del solido y el solido de color marron claro (0.520 g) se combinaron y se diluyeron con aproximadamente 10 mL de EtOH, se calentaron a ebullicion, se filtraron y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. El material solido comenzo a precipitar. Despues de reposar durante la noche a temperatura ambiente, los licores madre se decantaron y el material restante se aclaro con una pequena cantidad de EtOH frlo. El solido se seco en un horno de vaclo a 45 °C, durante 1.5 horas para proporcionar 410 mg de un solido. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8 ppm 9.05 (1 H, s), 8.45 (1 H, d, J= 5.7 Hz), 7.70 (1 H, t, J= 7.7 Hz), 7.62 (1H, d, J= 5.7 Hz), 7.38 (1 H, d, J= 7.9 Hz), 7.25 (1 H, d, J= 1.2 Hz), 7.15 (1 H, d, J= 7.6 Hz), 2.85-2.91 (4 H, m), 2.51-2.58 (2 H, m), 2.46 (3 H, s). MS (APCI, M+1) 333.1. pf 145-146 °C.

Ejemplo 14. 2-[4-metil-2-(6-metilpiridin-2-il)2H-pirazolo-3-il]tieno[3,2-c]piridina (Ejemplo de referencia).

4-metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il ester del acido trifluorometanosulfonico (36.6 g, 114 mmoL), carbonato de potasio (39,4 g, 285 mmol), y 2- (4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2] dioxaborolan-2-il) tieno [3,2-c] piridina (31.2 g, 120 mmol) se suspendieron en tolueno (300 mL), alcohol isopropllico (IPA) (75 mL) y agua (75 mL). La mezcla de reaccion se sometio secuencialmente a vaclo seguido de purga con nitrogeno. Esto se repitio por un total de cinco veces. Se adiciono bis (trifenilfosfina) paladio (II) cloruro (4.4 g, 6.27 mmol), y la reaccion se calento a 78 °C. Despues de 2 horas la mezcla de reaccion se dejo enfriar. La capa acuosa se separo, y la capa organica se filtro para eliminar el residuo de catalizador de color negro. La capa organica se lavo con agua (80 mL). La capa organica se extrajo con HCl 3 M (100 mL) y agua (100 mL). Se adicionaron carbono (0.5 g) y celite (9 g) a la fase acuosa y la solucion se concentro para eliminar el tolueno residual. La capa acuosa se filtro. La fase acuosa se hizo basica (pH = 10) con la adicion de NaOH al 50%. Un solido de color amarillo se precipito. El solido se filtro, se lavo con agua y se seco tirando aire a traves de este para dar 24.1g (69.1%) de un solido de color amarillo. El solido se suspendio en tolueno (250 mL). La suspension se calento a 65 °C y se filtro. El filtrado se concentro. El residuo se suspendio en tolueno (100 mL) y se filtro. La torta se lavo con tolueno (40 mL). La torta se seco tirando aire a traves de esta para dar 19.2 g (55%) del producto en bruto

Los 19.2 g se combinaron con otras muestras preparadas de manera similar para dar 141.7 g. Los solidos combinados se suspendieron en IPA (500 mL) y la suspension se calento a 83 °C, pero no todos los solidos entraron en la solucion. Se adiciono IPA (300 mL) y la suspension se calento a 83 °C, para dar una solucion oscura. La solucion se dejo enfriar a temperatura ambiente a 8 °C/hora. La suspension se filtro, y la torta se lavo con IPA (200 mL). La torta se seco a 50 °C, durante 60 horas para dar 131.8 g del producto deseado.

Ejemplo biologico 1

Los metodos del ensayo de quinasa ALK-5 se han descrito en la tecnica (vease, por ejemplo, Laping et al. (2002) Mol. Pharmacol. 2002; 62: 58-82). Los compuestos mencionados en los ejemplos especlficos se pusieron a prueba de la siguiente manera para la inhibicion de actividad de autofosforilacion de ALK-5 y de la fosforilacion de ALK-5 de a- caselna. Materiales:

• Solucion reguladora: HEPES 50 mM, pH 7.6, con NaCl 10 mM, MgCb 10 mM y DTT 1 mM.

• Protelna GST-ALK-5 - 0.44 mg/mL (stock de aproximadamente 7 pM). Una dilucion 1: 350 da un stock de 20 nM, que se traduce en 2 nM final en el ensayo. ALK-5 humana se expreso en celulas de insecto Sf9 infectadas con Baculovirus que expresan una secuencia de truncamiento de ALK-5 (aminoacidos H149 -M503), fusionada en el N-terminal con la glutation S-transferasa GST, en un vector pFastBac (Invitrogen). Las celulas se rompieron por sonicacion a 4 °C. El

5 lisado se centrifugo a 40,000 xg durante 45 minutos, y el sobrenadante se aplico a una columna de 10 mL de glutation Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Bioscienses) equilibrada con Tris-HCl 100 mM, pH 7.6 que contiene NaCl 300 mM, 10% de glicerol, 1 % de NP40, ditiotreitol 2 mM (dTt) y un inhibidor de proteasa comprimido completo libre de EDTA por cada 50 mL (Roche). La columna se lavo con 5 volumenes de columna de Tris HCl 50 mM pH 8.0 que contiene NaCl 150 mN, 10% de glicerol, DTT 2 mM y un inhibidor de proteasa comprimido completo libre de EDTA por cada 100 10 mL. La columna se eluyo con solucion reguladora de lavado que contiene glutation reducido 8 mM. Las fracciones se recolectaron y se dializaron durante la noche en Tris HCl 20 mM pH 8.0 que contiene 10% de glicerol, NaCl 150 mM, DTT 2 mM y 4- (2-aminoetil) -bencenosulfonilfluoruro. HCl 1 mM (AEBSF) (Sigma) a 4 °C.

• a-caselna (Sigma, # C8032) se prepara a 2 mM en solucion reguladora (50 mg/mL).

• ATP frlo contiene ATP frlo 10 pM (de un stock 10 mM de solucion reguladora).

15 • ATP caliente consiste de 0.5 pCi/pozo g-33P-ATP (Amersham, AH9968) en solucion reguladora.

• Solucion reguladora de Ensayo - por 10 mL de solucion reguladora 1 mL de HEPES 500 mM (pH 7,6)

20 pL de NaCl 5 M 100 pL de MgCl2 1 M 20 10 pL de DTT 1 M (ditiotreitol)

Metodo de ensayo:

En una placa de fondo de filtro de 96 pozos (Millipore, #MSDV N6B 50), 58 pL de solucion reguladora de ensayo se adicionan para alcanzar el pozo. Adicionar 10 pL de mezcla de ATP frlo en solucion reguladora de ensayo, luego 10 pL de una dilucion 1:10 de a-caselna stock. A continuacion, se adicionan 2 pL del compuesto que se prueba (DMSO) a una 25 concentracion final de 50X. Se adiciona la mezcla de ATP caliente (10 pL), y la reaccion se inicia con la adicion de 10 pL de una dilucion 1: 350 de la protelna ALK-5 (2 nM final) en solucion reguladora de ensayo con 0.05% de BSA (albumina de suero bovino). La reaccion se mezclo durante 5 minutos a temperatura ambiente, y luego se continuo durante 145 minutos a temperatura ambiente. La reaccion se detiene luego con la adicion de 100 pL de TCA (acido tricloroacetico) al 20% frlo como el hielo. El ensayo se incuba a continuacion durante al menos 1 hora a 4 °C. y luego los contenidos de 30 cada pozo se filtran por succion a traves del filtro. Los pozos se lavaron tres veces con 200 pL de TCA al 10% frlo como

el hielo. El fondo de la placa se mancha antes y despues se retira la sub-base de plastico, y se seco durante la noche a temperatura ambiente. Adicionar 30 pL de llquido de centelleo, y contar 1 minuto por pozo en un contador de centelleo Wallac Tri-Lux.

Los valores de IC50 (nM) se reportan a continuacion, en la Tabla 2 como la media de dos o mas valores de IC50 que 35 fueron determinados en uno o mas experimentos. El numero de determinaciones ("n") se reporta dentro de los

parentesis. Los valores individuales que produclan los valores medios de IC50 se enumeran dentro de los parentesis si habla 4 o menos determinaciones. El error estandar (SE) tambien se reporta. El error estandar es la desviacion estandar dividida por el numero de determinaciones ("n").

Tabla 2

Ejemplo

IC50 (nM)

1

23.4 (n=18); SE=3.5

2

94.1 (n=2; 111, 76.8); SE=17.3

3

108 (n=2; 121, 94.8); SE=13.3

4

4.33 (n=4; 1.0, 2.84, 5.66, 7.82); SE=1.51

5

12.9 (n=4; 31, 12.5, 1.0, 7.24); SE=6.46

5

10

15

20

25

30

Ejemplo

IC50 (nM)

6

35.2 (n=2; 38.6, 31.8); SE=3.41

7

6.65 (n=16); SE=0.61

12

7.94 (n=2; 10.4, 5.47); SE=2.48

13

18.9 (n=2; 26.7, 11.2); SE=7.73

Ejemplo Biologico 2

Metodos de ensayo del gen indicador de ALK-5 se han descrito en la tecnica (vease, por ejemplo, Maliekal et al. (2004) J Biol Chem279(35):36287-36292). Los compuestos nombrados en los ejemplos especificados se ensayaron de la siguiente manera para la inhibicion de la actividad indicadora de luciferasa del elemento de union Smad (SBE) en celulas NIH-3T3 estimuladas por TGFpi. El siguiente ensayo de luciferasa emplea celulas NIH/3T3 (fibroblastos de murino), que se transfectaron transitoriamente con una construccion indicadora de luciferasa del elemento de union Smad (SBE). Esta construccion expresada es sensible a agentes que estimulan la via de senalizacion de Smad.

Materiales:

• Celulas NIH-3T3 (ATCC CRL-1658)

• Medio Eagle Modificado de Dulbecco con rojo fenol (Life Technologies 11965-092)

• Medio Eagle Modificado de Dulbecco sin rojo fenol (Life Technologies 21063-029)

• Suero fetal bovino (Life Technologies SH30071.03)

• Fugene(Roche 1814443)

• Opti-MEM I (Life Technologies 31985-070)

• Sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega E2940, E2980)

• Solucion de gentamicina (10 miligramos/millmetro) (Life Technologies 15710-064)

• Placas de ensayo de 96 pozos, blancas, TCT (Corning Costar 3917)

• Frascos de cultivo de tejidos de 75 centlmetros (Corning Costar 430 641)

• Vector pRL-CMV (Promega Corporation, Madison, WI, Producto E2261) (pRL es un vector que codifica una Renilla reniformis luciferasa bajo el control de un promotor de citomegalovirus constitutivamente activo (CMV))

• Factor de crecimiento transformante p1 - (R & D Systems, Minneapolis, MN, producto 240-B)

• Vector pSBE4-Luc/BV4 (tambien conocido como vector pSBE4-luc) (que contiene 4 copias de una region codificante del elemento de union Smad y luciferasa de luciernaga) (Zawel et al (1998). Mol Cell 1 (4): 611-617).

Metodos:

Las celulas NIH-3T3 se mantienen en Medio Eagle Modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino y 10 microgramos/mL de gentamicina. Las celulas se dividen todos los lunes, 1: 5 a 1:10, y se dividen de nuevo el miercoles. Las celulas se dividieron el viernes 1:20, para las celulas necesarias para el ensayo y mantenimiento del lunes. No permitir que las celulas crezcan hasta confluencia total.

Dla 1, 0 horas (inicio del experimento)

Placa de 1.6 millones de celulas NIH/3T3 en un matraz de 75 centlmetros para transfecciones utilizando 15 millmetros de medio de crecimiento (medio Eagle modificado de Dulbecco, suero fetal bovino 10%, Gentamicina 10 microgramos/millmetro).

Dla 1, 7 horas despues del inicio del experimento

5

10

15

20

25

30

35

40

Preparar la transfeccion:

a. En un tubo de microcentrlfuga de 1.5 millmetros, adicionar 48 microlitros de Fugene directamente a 400 microlitros de Opti-MEM. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

b. Durante el perlodo de incubacion anterior, allcuota de 8 microgramos de SBE-luc y 0.16 microgramos de CMV-pRL a 400 microlitros Opti-MEM.

c. Adicionar Fugene/Opti-MEM desde la etapa "a" a los ADN en la etapa "b". Incubar a temperatura ambiente durante 15 a 45 minutos.

d. Adicionar los ADN acomplejados con celulas sembradas en placas anteriormente (Dla 1, 0 horas). No es necesario cambiar los medios de comunicacion, incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO2.

Dla 2, 24 horas despues del inicio del experimento

Preparar la(s) suspension(es) de celulas a partir de celulas transfectadas (Dla 1, etapa 2) a una densidad de 200,000 celulas/mL en Medio Eagle Modificado de Dulbecco, suero fetal bovino al 10%, 10 microgramos/millmetro de gentamicina. Las celulas de la placa en placas de ensayo (TCT blancas). 100 microlitros/pozo para placas de 96 pozos. Esto pondra el numero de celulas a 20,000 celulas/pozo. Incubar durante 5-6 horas a 37 °C, 5% de CO2.

Dla 2, 31 horas despues del inicio del experimento

a. Preparar placas de respuesta dosis, si es necesario.

b. Lavar la placa con 100 microlitros de Medio Eagle Modificado de Dulbecco, 10 microgramos/millmetro de Gentamicina sin suero.

c. Adicionar 170 microlitros/pozo de Medio Eagle Modificado de Dulbecco, 10 microgramos/millmetro de gentamicina, 0.5% de suero fetal bovino,

d. Compuestos y controles de prueba de transferencia a placas de ensayo (TCT, blancas), 20 microlitros de 10X de stock para placas de 96 pozos.

e. Despues de 30-60 minutos de tratamiento con el compuesto, adicionar 250 picogramos/millmetro de Factor b de crecimiento de transformation, a cada pozo. (Adicionar 10 microlitros de un stock 20X).

Dla 3, 51 horas despues del inicio del experimento

Placas de ensayo para la actividad de luciferasa.

a. Reconstituir sustrato de luciferasa Dual-Glo liofilizado con solucion reguladora de luciferasa Dual-Glo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

b. Retirar las placas de ensayo de la incubadora y permitir que alcancen la temperatura ambiente durante 10 minutos.

c. Aspirar los medios desde la placa de ensayo. Adicionar 80 microlitros del sustrato de lucoferasa Dual-Glo estable diluido que contiene 1 parte de medios de medio de Eagle Modificado de Dulbecco sin rojo fenol. Sellar las placas e incubar durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente.

d. Leer en el lector de placas Packard TopCount HTS utilizando el modo de recuento de fotones individuales (SPC) durante 6 segundos/pozo para leer la actividad luciferasa de luciernaga de pSBE4-Luc/BV4 pSBE4-luc.

e. Despues de leer las placas para la actividad luciferasa de luciernaga, retirar los sellos y adicionar 40 microlitros de reactivo de parada y Glo en cada pozo. Volver a sellar las placas e incubar durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Las placas de lectura en Packard TopCount como con la luciferasa de luciernaga, para leer la actividad de luciferasa de Renilla a partir de pRL.

La actividad de luciferasa Renilla presenta un control de transfeccion. La actividad de luciferasa de luciernaga sirve como el ensayo de lectura. La actividad de ensayo de luciferasa se normaliza a la actividad de ensayo de Renilla para cada muestra particular.

Los valores de IC50 (nM) son reportados, a continuation, en la Tabla 3 como la media de dos o mas valores de IC50 que fueron determinados en uno o mas experimentos. El numero de determinaciones ("n") se reporta dentro de los parentesis. Los valores individuales que produclan los valores medios de IC50 se enumeran dentro de los parentesis

5

10

15

20

25

donde n es 4 o menos. El error estandar (SE) tambien se reporta. El error estandar es la desviacion estandar dividida por el numero de determinaciones (* n *).

Tabla 3

Ejemplo

IC50 (nM)

1

149 (n=4; 117, 133, 164, 183); SE=14.9

2

440 (n=3; 211, 504, 605); SE=118

3

403 (n=3; 286, 453, 471); SE=58.9

4

21.5 (n=3; 11.5, 26, 27); SE=5.0

5

30.8 (n=4; 22, 27, 30, 44) :SE=4.71

6

244(n=3; 186, 199, 348); SE=520

7

35.9(n=21); SE=2.47

12

42.5 (n=2; 51.0, 34.0); SE=8.5

13

57.5 (n=2; 52.0. 63.0); SE=5.5

Ejemplo de Formulacion 1

Preparacion de un gel que contiene 2% (peso/peso) 2- [4-metil-2- (6-metil-piridin-2-il) -2H-pirazol-3-il) tieno [3,2 -c] piridina.

Materiales:

Etanol (200 Proof), USP (Aaper Alcohol and Chemical Co, KY)

Propilenglicol de (pureza> 99.5%), reactivo ACS (Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO)

Polietilenglicol (PEG 400), Peso molecular: 380-420 (Mallinkrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ)

Hidroxipropil celulosa (KLUCEL® HF) (Hercules Incorporated, Wilmington, DE)

Agua, Chromosolve® para HPLC (Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO)

Alcohol bencllico (pureza> 99%) (Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO)

Procedimiento:

2- [4-metil-2- (6-metil-piridin-2-il) -2H-pirazol-3-il) tieno [3,2-c] piridina (2 g) se transfirio en una botella de vidrio de 150 mL. A continuacion, se adicionaron a la botella propilenglicol (30 g), polietilenglicol (30 g), agua (10 g), y alcohol bencllico (2 g) y etanol (20 g). La mezcla se agito durante 2 horas. A continuacion, se adiciono KLUCEL® HF (500 mg) a la solucion, seguido de etanol q.s. a 100 g. La solucion se agito durante la noche para producir un gel que contiene 2 % (peso/peso) 2-[4- metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina.

Ejemplo de Formulacion 2

Preparacion de un gel que contiene 1% (peso/peso) de 2-[4-metil-2- (6-metil-piridin-2-il) -2H-pirazol-3-il] tieno [3,2 -c] piridina.

Materiales:

Etanol (200 Proof), USP (Aaper Alcohol and Chemical Co, KY)

Propilenglicol (pureza> 99.5%). Reactivo ACS (Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO)

Polietilenglicol (PEG 400), Peso molecular: 380-420 (Mallinkrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ)

30

Hidroxipropil celulosa (KLUCEL® HF) (Hercules Incorporated, Wilmington, DE)

Agua, Chromosolve® para HPLC (Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO)

Alcohol bencllico (pureza > 99%) (Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO)

Procedimiento:

5 2- [4-Metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno [3,2-c] piridina (1 g) se transfirio a una botella de vidrio de 150 mL.

A continuacion, se adicionaron a la botella propilenglicol (30 g), polietilenglicol (30 g), agua (10 g) y alcohol bencllico (2 g) y etanol (20 g). La mezcla se agito durante 30 minutos a 1 hora. A continuacion, se adiciono KLUCEL® HF (500 mg) a la solucion, seguido de etanol q.s. a 100 g. La solucion se agito durante la noche para producir un gel que contiene 1% (peso/peso) de 2-[4-metil-2-(6-metil-piridin-2-il)-2H-pirazol-3-il]-tieno[3,2-c]piridina.

10

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste de:

   imagen1

   imagen2

   5 y

   una sal farmaceuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores.
2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde el compuesto es:

   imagen3

   o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
3. 3. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde el compuesto es:

   imagen4

   5 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
4. 4. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde el compuesto es:

   imagen5

   o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende: una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de una 10 cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
6. 6. Una composition farmaceutica topica que comprende: una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmaceuticamente aceptable apropiado para aplicacion topica.
7. 7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para 5 uso en la reduction de cicatrices o en la inhibition de la formation de cicatrices.
8. 8. El compuesto para uso de la reivindicacion 7, en donde dicha cicatriz es una cicatriz queloide o una cicatriz hipertrofica.
9. 9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de una condition mediada por TGF-p.

   10 10. El compuesto para uso de la reivindicacion 9, en donde dicha condicion mediada por TGFP se selecciona entre el

   grupo constituido por cancer, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de pancreas, melanoma, una enfermedad fibrotica, glomerulonefritis, nefropatla diabetica, fibrosis hepatica, fibrosis pulmonar, hiperplasia arterial, restenosis, escleroderma, una neoplasia hematologica y cicatrization dermica.

   15 11. Una composicion farmaceutica que comprende: el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una

   sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un segundo agente medicinal.
10. 12. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 11, en donde dicho segundo agente medicinal se selecciona del grupo que consiste en: TGFP3, un anticuerpo TGFP1, un anticuerpo TGFP2, acetonido de triamcinolona (9-fluoro-11, 16,17-tri h i d roxi - 17-(2-hidroxiacetil)-10,13-dimetil-6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17- dodecahidrociclopenta[a]fenantren-3- 20 ona), un esteroide, un corticosteroide, un antibiotico, un antibiotico topico, una lamina de silicona, 5-fluorouracilo, estrogeno, un agonista del receptor de nACh (nicotlnico de la acetilcolina), FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), EGF (factor de crecimiento epidermico), IGF ( factor de crecimiento similar a la insulina), y PDGF (factor de crecimiento derivado