NO321504B1

NO321504B1 - Fremgangsmater for in vitro fremstilling av proteinhydrolysatsammensetning, oral proteinhydrolysatsammensetning og anvendelser derav.

Info

Publication number: NO321504B1
Application number: NO19975832A
Authority: NO
Inventors: Eeva-Liisa Syvaoja; Erika Isolauri; Leena Metsaniitty; Hannu Korhonen; Seppo Salminen
Original assignee: Valio Ltd
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2006-05-15
Also published as: RO120243B1; DK0833649T3; EE03424B1; CZ291904B6; DK0833649T4; CA2224320A1; CZ399797A3; CN1154506C; AU710126B2; JP3983804B2; DE69625690T2; SK171597A3; DE69625690D1; NZ310478A; US7172756B2; NO975832D0; AU6127896A; EE9700339A; IL122577A0; WO1997000078A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for in vitro fremstilling av en proteinhydrolysatsarnmensetning og anvendelser derav. Oppfinnelsen vedrører også utvikling av spesifikke formler for allergiske nyfødte med redusert tarmbarrierefunksjon.

Kumelk-allergi (CMA) er definert som en immunmediert negativ reaksjon overfor proteiner i kumelk. Den beste behandlingen er fullstendig utelukkelse av kumelk-antigener. I nyfødte med CMA er det nødvendig å anvende en erstatningsformel når human melk ikke er tilgjengelig. Hydrolyserte formler, basert på kumelkavledet myse eller kasein, blir anvendt for å tilveiebringe tilstrekkelig næring med en redusert antigen-belastning. Preliminær varmebehandling av kumelk påvirker hovedsakelig konformasjon av proteinene og letter deres hydrolyse. Påfølgende enzymatisk hydrolyse med pepsin, trypsin, bukspyttkjertelekstrakter og ekstrakter fra tarmslimhinnen forårsaker progressiv ødeleggelse av sekvensielle epitoper og omgjør formlene til den minst antigene og allergene formen.

I de fleste tilfellene kan omfattende hydrolyserte kumelk-avledete formler trygt bli innført og disse er effektive og kliniske og metabolsk godt tålbare. Enzymatisk hydrolyse gjør ikke nødvendigvis formlene ikke-allergene, idet optimal grad av hydrolyse ikke er kjent og spor av opprinnelig protein er detektert i hydrolysatet. Innføring av disse substituttene til barn med kumelk-allergi må utføres forsiktig. Metoder for å kontrollere allergisk inflammasjon ved antigen-eliminering har ikke vært tilfredsstillende, spesielt i pasienter med flere matallergier (Sampson et al., 1992). Disse pasientene viser ofte øket tarmpermeabilitet og dysfunksjon av tarmens motstandsbarriere (Majamaa et al., 1996, Majamaa and Isolauri, 1996). Dette forsterker risikoen for vekstforstyrrelser og sensibilisering overfor mange matvarer. Nye metoder er nødvendige for behandling av kumelk-allergi for å forbedre substitutt-formlene i

CMA.

Tarm-antigen håndtering bestemmer påfølgende immunrespons overfor antigen. I kroppen blir antigener absorbert over epitelet ifølge to funksjonelle reaksjonsverdier. Hovedveien er degenerativ redusering av immunogenisiteten til antigenet. En mindre vei muliggjør transport av intakte proteiner som er avgjørende for antigen-spesifikke immunresponser. Varierende antigenabsorpsjon forsterker sensibiliseirngsprosessen (Fargeas et al., 1995).

Forskjellig produksjon av cytokiner ved T-hjelper (Th) celler i løpet av en immunreaksjon har viktige regulatoriske effekter på naturen til immunresponsen. Cytokinprofilen til naturlig immunrespons bestemmer fenotypen til påfølgende spesifikke immunrespons. Bortsett fra å kontrollere IgE syntesen er IL-4 avgjørende for utviklingen og modningen av Th2 fenotypen, karakterisert for allergisk inflammasjon.

Denne fremgangsmåten ser ut til å være helt nødvendig for utvikling av toleranse overfor fordøyd protein. Oral toleranse er en tilstand med antigen-spesifikk systemisk ikke-reagerbarhet kjennetegnet ved lokal antigen-spesifikk IgA respons.

En isolert human tarmstamme, Lactobacillus stamme GG { Lactobacillus GG, ATCC 53103) har nylig vist å fremme lokale IgA responser overfor diett-antigener som oppstår ifølge innvortes vei og kan derfor behjelpe i immunelimineringen (Isolauri et al., 1993). Det er ikke foreløpig kjent om bestemte stammer av tarmbakterier direkte kan modifisere immunogenisiteten til matvare-antigenene og følgelig nedregulere hypersensitivitetsreaksj onene.

Lactobacilli er innbefattet i de mikrobielle floraene til friske tarmer. Det har vært antatt at Lactobacilli virker i tarmkanalen ved å konkurrere med reseptorer og næringsstoffer overfor patogene mikrober på tarmslimhinnen.

Probiotika er levedyktige mikrobielle preparater som fremmer helsen ved å opprettholde den naturlige mikrofloraen i tarmen. Et mikrobielt preparat kan bli ansett som et probiotisk middel dersom de deri virkende mikrobene og deres virkningsmåte er kjente. Probiotika blir koblet til tarmslimhinnen, koloniserer human tarmkanal og forhindrer kobling av skadelige mikrober. En viktig antagelse er at de går opp i tarmslirnhinnen og blir ikke ødelagt i den øvre delen av magetarmkanalen. Lactobacillus GG er en av de kjente bakteriene som har prebiotiske karaktertrekk.

Foreliggende oppfinnere har nå oppdaget at visse bakterier i magetarmkanalen, spesielt Lactobacilli, og spesielt bakterier med prebiotiske karaktertrekk, kan bli anvendt for å forsterke effektiviteten til eliminerende dietter og å forbedre den orale toleransen, ved forhindring eller behandling av matvare-induserte hypersensitivitetsreaksjoner i en pasient.

Et aspekt av oppfinnelsen er at proteinhydrolysater oppnådd ved hydrolyse av proteiner med ovennevnte magetarmbakterier også kan bli anvendt for nevnte formål. Det er vist heri at proteinhydrolysater oppnådd ifølge foreliggende oppfinnelse har en immunologisk effekt som fremmer hypoallergenisiteten. Hydrolysatene nedregulerer hypersensitivitetsreaksjonene og fremmer følgelig tarm-immunbarirerefunksjonen, dvs. stabiliserer tarmslimhinne-barrieren.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbedret proteinhydrolysatformel som nedregulerer hypersensitivitetsreaksjonene og som fremmer tarmens irnmunbarriere-funksjon. Generelt kan hydrolysatformlene oppnås ved hydrolysering av proteiner med enzymer avledet fra probiotiske magetarm-bakterier, spesielt Lactobacilli, som har adhesiv og koloniserende karaktertrekk og et proteaseenzymsystem som ligner de til stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103) og med trypsin og/eller pepsin.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig en fremgangsmåte for in vitro fremstilling av en proteirmydrolysatsammensetning for nedregulering av hypersensitivitetsreaksjoner og for å fremme tarmimmunbarrieren, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: hydrolysering av proteiner med enzymer avledet fra et bakterielt preparat omfattende stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103), og med pepsin og/eller trypsin.

Alternativt kan en proteinhydrolysatformel generelt bli oppnådd ved hydrolysering av proteiner med trypsin og/eller pepsin, og tilsetning til hydrolysatet oppnådd på denne måten et bakterielt preparat omfattende probiotiske magetarmbakterier, spesielt Lactobacilli, som har adhesiv og koloniserende karaktertrekk og et proteaseenzymsystem som ligner de ifølge stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103). Bakteriene blir tilsatt til hydrolysatformelen, fortrinnsvis som et lyofilisert preparat.

Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse også fremgangsmåte for in vitro fremstilling av en proteinhydrolysatsammensetning for nedregulering av hypersensitivitetsreaksjoner og for å fremme tarmimmunbarrieren, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: hydrolysering av proteiner med pepsin og/eller trypsin, og tilsetning til hydrolysatet et bakterielt preparat omfattende stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse oral proteinhydrolysatsammensetning for nedregulering av hypersensitivitetsreaksjoner og for å fremme tarmimmunbarrieren, kjennetegnet ved at hydrolysatet kan oppnås ifølge fremgangsmåten som definert i krav 1 eller 2.

Ved administrering av en slik hydrolysatformel til en pasient, er det ventet at hydrolyserende enzymer til bakteriene tilstede blir frigjort in vivo idet den samme effekten blir oppnådd som med en forbedret hydrolysatformel som definert ovenfor. I tillegg stabiliserer de levedyktige bakteriene tarmslimhinnebarriere som forsterker det lokale forsvaret.

I henhold til dette omfatter oppfinnelsen også anvendelse av et

proteinhydrolysatsammensetning ifølge krav 3, for fremstilling av en sammensetning for å forhindre eller behandle matindusert hypersensitivitetsreaksjoner hos et barn.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av et

proteinhydrolysatsammensetning ifølge krav 3, for fremstilling av en sammensetning for å behandle kumelksallergi hos en pasient.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et

proteinhydrolysatsammensetning ifølge krav 3, for fremstilling av en sammensetning som skal administreres oralt for å fremme tolerogeniske immunresponser til matantigener hos en pasient.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et proteirmydrolysatsammensetning sammen med et bakterielt preparat, som omfatter Lactobacillus GG (ATCC 53103) for fremstilling av et formular for å forhindre eller behandle matindusert hypersensitivitetreaksjoner hos et barn.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et

proteinhydrolysatsammensetning sammen med et bakterielt preparat, som omfatter stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103) for å fremstille et formular for behandling av kumelk-allergi hos en pasient.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et proteinhydrolysatformular sammen med et bakterielt preparat som omfatter stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103) for fremstilling av en sammensetning for å fremme tolerogeniske immunresponser til matantigener hos en pasient.

Når en proteinhydrolysatformel blir anvendt i kombinasjon med selekterte probiotiske bakterier, kan en formel være en hvilken som helst egnet protein-hydrolysatformel, kjent eller ny. Den kan følgelig være enten et delvis protein-hydrolysat, eller alternativt være en omfattende hydrolysert formel. Preparering av et proteinhydrolysat egnet for dette formålet er for eksempel, beskrevet i EP patentsøknad nr. 601 802.

Foretrukne bakterier som blir anvendt i formlene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er Lactobacillus GG (ATCC 53103).

I beskrivelsen angir betegnelsen "bakterier, spesielt Lactobacilli, som har adhesiv og koloniserende karaktertrekk og et proteaseenzymsystem som ligner de i stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103) bakterier hvor de adhesive og koloniserende karaktertrekkene kan sammenlignes med de til LGG stammen, for eksempel., som definert i EP patent 199 535. Disse bakteriene antas også å ha samme type enzymsystem som LGG, som betyr at enzymene avledet fra slike bakterier kan degradere proteinene for å produsere hydrolyseringsprodukter med samme effekt som de som blir oppnådd ved anvendelse av enzymer avledet fra LGG.

Forkortelser

CI konfidensintervall

IFN-y friterferon-y

IgA Immunoglobulin A

IgE Immunoglobulin E

EL-4 Interleukin-4

LGG Lactobacillus GG (ATCC 53103)

OKT3 anti-CD3 antistoff

PBMC perifere blodmononukleære celler

TNF-a tumornekrosefaktor a

WF testgruppe som mottar omfattende hydrolysert myseformel

WF-GG testgruppe som mottar omfattende hydrolysert myseformel og LGG

preparat

P/T-kasein = kasein hydrolysert av pepsin og trypsin

P/T-asi-kasein = asi-kasein hydrolysert av pepsin og trypsin.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. IA - ID Mitogen-induserte proliferative responser til PBMC in vitro overfor P/T-kasein (IA), P/T-ctsi-kasein (IB), P/T-kasein i tillegg hydrolysert med LGG avledede enzymer (1C) og P/T-ctsi-kasein i tillegg hydrolysert med LGG avledede enzymer (ID). Resultatene blir uttrykt som gjennomsnittlige tellinger pr. minutt for kulturer uten hydrolysert produkt (PHA-RPMI1640) og med hydrolysert produkt ved tre konsentrasjoner (0,1,10 og 1000 ug/ml). Horisontale linjer representerer geometrisk gjennomsnitt av tellinger pr. minutt i seks eksperimenter, nummerert likt for hvert individ.

Fig. 2 Klinisk registrering av atopisk dermatitt (SCORAD) i hver pasient og gjennomsnittlig registrering for grad (A), intensitet (B) og subjektiv registrering (C) for atopisk dermatitt før behandling (0) og en måned senere (I) i nyfødte som mottar omfattende hydrolysert myseformel uten (WF) eller samme med Lactobacillus GG

(WF-GG).

Fig. 3 Effekt av kasein og Lactobacillus GG-degradert kasein på produksjon av IL-4 og IFN-y ved PBMC i atopiske pasienter (a, b) og i ikke-atopiske friske barn (c,d). Hvite kolonner representerer middels cytokinproduksjon i kontrollkulturen; svarte kolonner, i kulturer inneholdende renset kasein; og skraverte kolonner, i kulturer inneholdende Lactobacillus GG-degradert kasein. Kryssende linjer representerer øvre og nedre kvartiler. * Statistisk signifikant parvis sammenligning med kontrollkulturer. Fig. 4 Effekt av asi -kasein og Lactobacillus GG-degradert ccsi -kasein på produksjon av IL-4 og IFN-y ved PBMC i atopiske pasienter (a,b) og i ikke-atopiske friske barn (c,d). Hvite kolonner representerer middels cytokinproduksjon i kontrollkulturer; svarte kolonner, i kulturer inneholdende asi-kasein; og skraverte kolonner, i kulturer inneholdende Lactobacillus GG-degradert asi-kasein. Kryssende linjer representerer øvre og lavere kvartiler. *Statistisk signifikant parvis sammenligning med kontrollkulturer.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Fremgangsmåter for fremstilling av forbedret hydrolysat er beskrevet, samt eksperimenter som viser den fordelaktige terapeutiske effekten observert i foreliggende studier.

Eksperimentelt

Eksempel 1 Suppresjon av lymfocytproliferasjon i vitro ved bovine kaserner hydrolysert ved Lactobacillus GG avledete enzymer.

l.a. Hydrolyse av kumelkproteiner

Bovin totalkasein og kaseinkomponenter (asi-kasein) ble renset fra kumelk (Syvåoja, 1992). Hydrolyse med enzymblandingen avledet fra Lactobacillus GG ble påført separat til kasein og asi-kasein. Enzymene ble isolert ved anvendelse av den modifiserte metoden til Exterkate og de Veer, 1985. Enzymene ble frigjort ved somkering av frosne bakterieceller. Supernatanten til de sentrifugerte cellene ble separert og anvendt for hydrolyse av kasein og asi-kasein. Hydrolysen ble utført i 241 ved 34°C.

GG-hydrolysater oppnådd på denne måten ble ytterligere hydrolysert med pepsin og trypsin. Prøvene ble hydrolysert først med 0,1% pepsin i 0,1 mol/l HC1 i 3 timer og 37°C, pH 2.5. Etter pH justering med 250 mg NaHC03 og 2 mol/l NaOH, ble 0,1% trypsin tilsatt til prøvene og disse ble hydrolysert i 5 timer ved 37°C, pH 8.0.

P/T-kasein og P/T-asi kaseinprøver ble oppnådd ved hydrolysering av renset kasein og asi kasein alene med pepsin og trypsin som beskrevet ovenfor, uten GG-hydrolysering.

l.b. Lymfocyttransformasjonstest

En modifikasjon av fullblod mikrometoden for mitogen-indusert lymfocyttransformasjon blir anvendt. Seks til åtte frivillige friske individer var med som bloddonorer i eksperimentet. Heparinisert venøst blod ble oppnådd og fortynnet 1:7 med RPMI1640 kulturmedium (Grand Island Biological Co. NY, USA) inneholdende antibiotika. Phytohemagglutinin (PHA) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) ble fortynnet med RPMI 1640 inneholdende antibiotika, med områder av sluttkonsentrasjoner i kulturer fra 5 til 1250 ug/ml. Lyofiliserte hydrolysater av kasein og ctsi-kasein ble fortynnet i RPMI 1640 til deres fulle konsentrasjoner på 0,1 ug/ml (lav), 10 ug/ml (middels) og 1000 ug/ml (høy) vist å være ikke-toksiske på T celler i fargeeksklusjonsstudier med eosin.

To sett av eksperimenter ble gjennomgått for å undersøke mitogen-induserte proliferative responser til perifere blod-mononukleære celler (PBMC) til (A) kasein hydrolysert med pepsin og trypsin (=P/T-kasein), (B) ccsi-kasein hydrolysert med pepsin og trypsin (=P/T-cCsi-kasein), (C) P/T-kasein i tillegg hydrolysert med Lactobacillus GG avledede enzymer og (D) P/T-ctsi -kasein i tillegg hydrolysert med Lactobacillus GG avledede enzymer.

Eksperimentet besto av fire kontrollkulturer med forskjellige fortynninger av kulturmediet og mitogen, samt korresponderende testkulturer med 25 ul hydrolyserte produkter ved tre forskjellige konsentrasjoner. Analysen ble utført som beskrevet i Sutas et al., 1996.

Mitogen-indusert proliferasjon av PBMC ble uttrykt som tellinger pr. minutt, bakgrunn ekskludert. Resultatene ble presentert for kontrollkulturer inneholdende 125 ug/ml PHA og RPMI 1640 og for tre testkulturer inneholdende 125 ug/ml PHA og hydrolyserte produkter ved lave, middels og høye konsentrasjoner.

l.c. Statistiske analyser

En ikke-parametrisk parvis test (Wilcoxon signed-rank test) ble anvendt for å sammenligne forandring i verdiene i tellinger pr. minutt til hver av testkulturene med de til kontrollkulturene. Signifikansnivået var p<0,05. Signifikantresultater til parvise sammenligninger ble presentert som suppresjon eller stimulering ifølge reduksjon eller økning av verdier i tellinger pr. minutt i testkulturen.

1. d. Resultater

Eksperimentene utført med P/T-kasein og P/T-asi-kasein i tillegg hydrolysert med Lactobacillus GG avledede enzymer ble mitogen-indusert proliferasjon av PBMC betydelig undertrykt ved 0,1,10 og 1000 ug/ml (p=0,03, p=0,03 og p=0,03) (Fig. 1C og ID) sammenlignet med P/T-kasein og P/T-Osi-kasein (Fig. IA og IB).

Eksempel 2. Behandling av nyfødte med atopisk dermatitt med

proteinhydrolysatformel supplementert med melkesyrebakterier 2. a. Pasienter og studiekonstruksjon

Studien omfatter 31 nyfødte, alder 2,5 til 15,7 (gjennomsnittlig alder 8) måneder, som oppfyller Hanifin kriteriene (Hanifin, 1987) for atopisk eksem hos barn. De har blitt referert til som en paediatrisk klinikk på grunnlag av atopisk eksem og antatt kumelk allergi. Gjennomsnittsalderen ved begynnelsen av symptomene var 2,4 måneder. Varigheten til total brystforing var 5,9 måneder. En positiv familiehistorie med atopiske sykdommer (astma, atopisk eksem og allergisk rhinitis) eller matvareallergi i første grad avkom ble notert i 26 (84%) pasienter. Eksematøse lesjoner ble behandlet med bløtgjørende midler og topiske kortikosteroider. Ingen av pasientene mottok systemisk corticosteroidterapi. Bortsett fra atopisk eksem fremkom magetarmforstyrrelser så som løs avføring, oppkast og diaré i 9 (19%) pasienter. Etter studieperiodene ble pasientene allokert til dobbel-blind placebo-kontrollert kumelkeksponering. Bare de som har en positiv reaksjon (27/31) ble innbefattet i endelig studiepopulasjon.

Pasientene ble plassert tilfeldig i to grupper i en måned. En gruppe (WF, n=14) mottok omfattende hydrolysert myseformel (Valio Ltd, Helsinki, Finland, EP-A-601802) og en annen gruppe (WF-GG, n=13) mottok samme formel med ytterligere Lactobacillus GG preparat (5 x IO<8> cfu/g) (tilført av Valio Ltd., Helsinki, Finland). Etter en-måneds terapi med tildelt formler, mottok begge gruppene en omfattende hydrolysert myseformel (Valio Ltd) i ytterligere en måned. Total IgE serumkonsentrasjon, kumelk-spesifikk IgE (RAST, Pharmacia, Uppsala, Sverige) og hudprikketester ble bestemt for alle pasienter før diettmessig intervensjon. Prikketesting ble utført på det volare aspektet av forarmen ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig kumelk allergen ALK (Allergologisk Laboratorium, Horsholm, Danmark) og testformelen ble fortynnet til normal for-konsentrasjon. En 1 mm enkel-topplancet med skulder for å forhindre dypere penetrering (ALK) ble anvendt, med histamin dihydroklorid 10 mg pr. ml (ALK) som positiv kontroll. Reaksjonene ble avlest etter IS minutter, og en respons som var halvparten av histaminreaksjonsstørrelsen eller mer ble registrert som positiv dersom den gjennomsnittlige diameteren til pølsen var minst 3 mm og negativ kontroll på samme tid 0 mm.

Fekalprøver for bestemmelse av a-l-anti-trypsin og TNF-a ble samlet før begynnelse av administreringen og 1. (tilsvarende studieperioden) og 2 måneder senere.

Hvor alvorlig atopisk dermatitt var, ble registrert ifølge SCORAD metoden, etablert av European Task Force on Atopic Dermatitis (1993). Grad (registrering A) av dermatitt ble bestemt ved anvendelse av "the rule of nines". Intensiteten (registrering B) av dermatitt var summen av de individuelle registreringene (0-3) for erythema, ødem og/eller papuler, ekskoriasjon, lichenifikasjon og tørrhet. Subjektive (registrering C) manifestasjoner (registrering 1-10), inkludert pruritus og søvntap, ble vurdert fra pasientens vurderinger. SCORAD ble oppnådd med beregningene: A/5+3,5xB+C.

Studieprotokollen ble godkjent av Ethical Review Committee of Tampere University Hospital. Godkjennelse ble også oppnådd fra foreldrene.

2.b. Bestemmelse av a-1 anti-trypsin i fekalprøver

Frosne fekalprøver ble tint ved romtemperatur og homogenisert. Omtrent 1 g ble overført til et glassrør og lyofilisert. Det resulterende tørre materialet ble malt og 50 mg overført til et Eppendorfrør. 1 ml 0,15 M NaCl oppløsning ble tilsatt og a-1 anti-trypsin ble ekstrahert ved vigorøs blanding i en Vortex blander i 20 minutter ved romtemperatur. Den resulterende suspensjonen ble sentrifugert ved 25.000 g i 10 minutter for å fjerne debris, og supernatanten ble anvendt for å bestemme a-1 anti-trypsin ved anvendelse av et Behring BNA nefelometer ifølge forhandlerens instruksjoner. Resultatene er gitt som mg/g tørrvekt av lyofilisert feces (avføring).

2.c. Bestemmelse av TNF-a i avføringsprøver

Dypfrosne avføringsprøver ble tint ved romtemperatur, suspendert 1:1 (w/v) i fysiologisk saltvann og sedimentert. Av supernatanten ble 0,5 - 1,0 ml overført til et Eppendorfrør og sentrifugert ved 25.000 g i 10 minutter. Supernatanten ble deretter anvendt for å bestemme TNF-a. En kommersiell enzym immunanalyse (Human TNF-a ELISA Kit, Endogen Inc., Boston, Massachusetts, USA) ble anvendt, som instruert for serumprøver, for bestemmelse av TNF-a i avføring.

2.d. Statistikker

På grunn av de skjeve fordelingene av serum IgE konsentrasjonene ble logaritmisk (ln) transformasjon anvendt og data blir presentert som gjennomsnitt med 95% sikkerhets-intervaller (CI). Konsentrasjonene til inflammatoriske parametere er presentert med medier med lavere og øvre kvartiller. Wilcoxon signed ranktest og Mann-Whitney U-test ble anvendt i statistiske sammenligninger.

2.e. Resultater

2.e.l. Kliniske data

Gjennomsnittlig (95% CI) serum total IgE var 31 (15 - 61) kU/I i pasienter som mottar hydrolysatformlene. RAST for kumelk var positive (>0,4 kU/ T) i 10/31 (37%) atopiske eksempasienter. Hudprikketest for kumelk var positive i 8/31 (30%) pasienter. Alvorligheten til atopisk dermatitt i hver pasient før begynnelse av behandlingene og en måned senere, dvs. etter at studieperioden er presentert i Figur 2. Middels (lavere kvartil-øvre kvartil) SCORAD registrering var 21 (14-31) i gruppe WF og 26 (17-38) i gruppe WF-GG før behandlingen (p=0,33). Det var en betydelig forbedring av SCORAD registreringen etter en måneds intervensjon i de som mottok Lactobacillus GG (p=0,008), men ikke de som mottok omfattende hydrolyserte formler uten Lactobacillus GG (p=0,89). SCORAD registreringen var da 19 (13-31) i gruppen WF og 15 (7-28) i gruppen WF-GG. Reduksjon i SCORAD registrering i WF-GG var forårsaket av reduksjon av grad (registrering A, p=0,004), intensitet (registrering B, p=0,05) og subjektiv registrering (registrering C, p=0,01) for atopisk dermatitt (Figur 2). Forbedring av SCORAD registreringen ble oppnådd innen 2 måneder i WF gruppen, og i gruppen WF-GG forble uforandret etter avslutning med Lactobacillus GG. Etter 2 måneder var middels (lavere kvartil-øvre kvartil) SCORAD registreringen i gruppe WF 14 (2-38) og i gruppen WF-GG 16 (6 - 25).

2.e.2. Konsentrasjoner av a-1 anti-trypsin og TNF-a i avføringen

I friske kontroller (n=9) var middels (lavere kvartil-øvre kvartil) konsentrasjonen til a-1 anti-trypsin 0,5 (0,5 -1,7) mg/g. Konsentrasjonen av a-1 anti-trypsin kunne sammenlignes mellom gruppene WF og WF-GG før behandlingen (p=0,22). Som indikert i Tabell 1, ble konsentrasjonen av a-1 anti-trypsin redusert betydelig i gruppen WF-GG (p=0,33), men ikke i gruppen WF (p=0,68) i løpet av studieperioden på 1 måned. Etter to måneder var konsentrasjonen av a-1 anti-trypsin 1,2 (0,5 -1,6) i WF og 0,5 (0,5 - 0,7) i WF-GG.

Konsentrasjonen av avføring TNF-a var 0 (0 - 0,08) pg/g i friske kontroller. Konsentrasjonen av TNF-a i avføring var betydelig høyere i atopiske barn, p<0,0001 (Tabell 1). Konsentrasjonen til TNF-a kunne sammenlignes mellom gruppene WF og WF-GG før behandlingen (p=0,57). Konsentrasjonen av TNF-a i avføring ble betydelig redusert i WF-GG (p=0,003), men ikke i WF (p=0,38) i løpet av studieperioden i 1 måned (Tabell 1). En reduksjon i TNF-a konsentrasjonen ble oppnådd innen 2 måneder i gruppe WF, mens i gruppe WF-GG som også ble gitt den omfattende hydrolyserte formelen uten Lactobacillus GG ble en tendens til øket TNF-a detektert. Konsentrasjonen av TNF-a var da 84 (25 -129) i WF og 144 (20 - 338) i WF-GG.

Tabell 1.

Konsentrasjonene av a-1 anti-trypsin i avføring og TNF-a før behandling (0) og en måned senere (I) i nyfødte som mottok omfattende hydrolysert myseformel (WF) eller samme formel inneholdende Lactobacillus GG bakterier (WF-GG). Data angir middels (lavere kvartil-øvre kvartil).

Eksempel 3. Nedregulering av cytokinproduksjonen til perifere

blodmononukleære celler i atopiske barn

3.a. Pasienter og metoder

Totalt ble 14 pasienter i alder 5-29 (gjennomsnittlig, 16) måneder som oppfylte Hanifin kriteriene for atopisk dermatitt (Hanifin, 1987) og åtte alders-parrede ikke-atopiske friske barn ble studert. Ingen fikk systemisk kortikosteroider ved studietidspunktet.

OKT3 (anti-CD3-antistoff) inneholdende ascitesfluid var en gave fra Dr. M. Kaartinen, Department of Bacteriology and Immunology, University of Helsinki, Helsinki, Finland. Bovint totalt kasein var blitt renset fra bovin melk som beskrevet i Syvåoja (1992). Renset kasein ble hydrolysert med Lactobacillus GG-avledede enzymer som beskrevet i Eksempel 1. Renset kasein eller Lactobacillus GG-degradert kasein ble lyofilisert og lagret ved romtemperatur. Før eksperimentene ble de fortynnet i RPMI 1640 og filtersteirlisering (0,1 fim, Millipore corporation, Bedford, MA, USA) ble anvendt.

Fullstendig kulturmedium besto av RPMI 1640 med 10% føtalt kalveserum, 10 mM Hepes buffer, 2 mM L-glutamin (Gibo Life Technologies, Paisley, UK), 50 U/ml benzylpenicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mg/ml gentamycin (Roussel Laboratories Ltd., Uxbridge, Middlesex, UK). Perifert venøst blod (5 ml) ble oppnådd. PBMC inneholdende 90% lymfoidcelier ble isolert ved FicollPaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige) gradientsentrifugering og suspendert med 1 x IO<6> celler/ml i fullstendig kulturmedium. Kulturbrønnene ble på forhånd belagt med anti-CD3 antistoff inneholdende ascites fluid i en på forhånd testet optimal fortynning. Testkulturen inneholdt i tillegg fortynning av kasein eller Lactobacillus GG-degradert kasein i en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml. Disse eksperimentene ble gjentatt for renset bovin asi-kasein og Lactobacillus GG-degradert ccsi-kasein. Etter 241 inkubasjon i en fuktig 5% CO2 atmosfære ved 37°C ble supernatantene samlet og lagret ved -70°C for cytokinanalyser. IL-4 og IFN-y i kultursupernatantene ble bestemt ved kommersielt tilgjengelige ELISA sett ifølge forhandlerens instruksjoner (IL-4: CLB, Compact Human Interleukin-4 ELISA kit, Central Laboratory of The Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, The Netherlands; IFN-y. EIFNG, Endogen Inc., Cambridge, MA, USA). Resultater fra forskjellige kjøringer ble jevnstilt ved anvendelse av sammenligning av standardkurver og ble uttrykt som pg/ml. Sensitiviteten til analysene for IL-4 var 2,3 pg/ml og for DFN-y, 5 pg/ml. Wilcoxon signed-rank test ble anvendt for statistiske sammenligninger av testkulturene med kontrollkulturene. Signifikansnivået var P < 0,05.

3.b. Resultater

I atopiske pasienter ble både IL-4 og IFNy produksjonen økt i kulturer inneholdende renset kasein når sammenlignet med kontrollkulturene, P = 0,008 og P = 0,008, (Fig. 3a, b). Ingen slik effekt av bovint kasein ble observert, når degradert av enzymer fra Lactobacillus GG. IL-4 produksjonen i kulturer inneholdende Lactobacillus GG-degradert kasein var betydelig mindre enn i kontrollkulturene, P = 0,003 (Fig. 3 a), og IFN-y produksjonen i disse kulturene kunne sammenlignes med kontrollkulturene, P = 0,10 (Fig. 3b).

I friske barn var produksjonen av IL-4 og IFN-y i kulturer inneholdende renset kasein sammenlignet med kontrollkulturene, P = 0,10 og P = 0,10 (Fig. 3c, d). Parallelt med funnene i atopiske pasienter hadde friske barn betydelig mindre IL-4 produksjon i kulturer inneholdende Lactobacillus GG-degradert kasein enn i kontrollkulturene, P = 0,01 (Fig. 3c) og IFN-y produksjon i disse kulturene forble sammenlignbare med kontrollkulturene, P - 0,50 (Fig. 3d). Parallelle resultater ble oppnådd med asi -kasein og Lactobacillus GG-degradert asi-kasein (Fig. 4).

Referanser

European -task force on atopic dermatitis. Severity scor-ing of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186:23-31.

Exterkate F and de Veer G. Partial isolation and degra-dation of caseins by cell wall proteinase(s) of Strepto-coccus cremoris. Appl Environ Microbiol 1985; 49:328-32.

Fargeas MJ, Theodorou V, Hore J, Wal JM, Fioramonti 3, Bueno L. Boosted systemic immune and local respons!veness after intestinal inflammation in orally sensitized guinea pigs. Gastroenterology 1995; 109:53-62.

Hanifin JM. Epidemiology of atopic dermatitis. Monogr Allergy 1987; 21:116-131

Isolauri E, Majamaa H, Arvola T, Rantala I, Virtanen E, Arvilommi H. Lactobacillus casex strain GG reverses increased intestinal permeability inducéd by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105:1643-1650.

Majamaa H, Isolauri E. Evaluation of gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic eczema. J Allergy Clin Immunol 1996, in press.

Majamaa H, Miettinen A, Laine S, Isolauri E. Intestinal inflammation in children with atopic eczema: faecal eosinophil cationic protein and tumor necrosis factor-a as noninvasive indicators of food allergy. Clin Exp. Allergy 1996; 26:181-187.

Sampson HA,. James MJ and Bernhisel-Broadbent J. Safety of an amino acid-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 1992; 90:463-465.

Sutas Y, Soppi E, Korhonen H, Syvaoja EL, Saxelin M, Rokka T, Isolauri E. Suppression of lymphocyte prolifer-ation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG deri ved enzymes. J Allergy Clin Immunol 1996, in press.

Syvaoja EL. Quantitative determination of the main casein components and purification of a.2- and K-casein from bovine milk. Milchwissenschaft 1992; 47:563-566

Claims

1. Fremgangsmåte for in vitro fremstilling av en proteinhydrolysatsammensetning for nedregulering av hypersensitivitetsreaksjoner og for å fremme tarmimmunbarrieren, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: hydrolysering av proteiner med enzymer avledet fra et bakterielt preparat omfattende stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103), og med pepsin og/eller trypsin.

2. Fremgangsmåte for in vitro fremstilling av en proteinhydrolysatsammensetning for nedregulering av hypersensitivitetsreaksjoner og for å fremme tarmimmunbarrieren, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: hydrolysering av proteiner med pepsin og/eller trypsin, og tilsetning til hydrolysatet et bakterielt preparat omfattende stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103).

3. Oral proteinhydrolysatsammensetning for nedregulering av hypersensitivitetsreaksjoner og for å fremme tarmimmunbarrieren, karakterisert v e d at hydrolysatet kan oppnås ifølge fremgangsmåten som definert i krav 1 eller 2.

4. Anvendelse av et proteinhydrolysatsammensetning ifølge krav 3, for fremstilling av en sammensetning for å forhindre eller behandle matindusert hypersensitivitetsreaksjoner hos et barn.

5. Anvendelse av et proteinhydrolysatsammensetning ifølge krav 3, for fremstilling av en sammensetning for å behandle kumelksallergi hos en pasient.

6. Anvendelse av et proteinhydrolysatsammensetning ifølge krav 3, for fremstilling av en sammensetning som skal administreres oralt for å fremme tolerogeniske immunresponser til matantigener hos en pasient.

7. Anvendelse av et proteinhydrolysatsammensetning sammen med et bakterielt preparat, som omfatter Lactobacillus GG (ATCC 53103) for fremstilling av et formular for å forhindre eller behandle matindusert hypersensitivitetreaksjoner hos et barn.

8. Anvendelse av et proteinhydrolysatsammensetning sammen med et bakterielt preparat, som omfatter stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103) for å fremstille et formular for behandling av kumelk-allergi hos en pasient.

9. Anvendelse av et proteinhydrolysatformular sammen med et bakterielt preparat som omfatter stammen Lactobacillus GG (ATCC 53103) for fremstilling av en sammensetning for å fremme tolerogeniske immunresponser til matantigener hos en pasient.