RO120243B1

RO120243B1 - Procedee de preparare a unor formule de hidrolizat proteic, pentru prevenirea sau tratarea alergiilor şi utilizarea acestora

Info

Publication number: RO120243B1
Application number: RO97-02328A
Authority: RO
Inventors: Erika Isolauri; Leena Metsaniitty; Hannu Korhonen; Seppo Salminen; Eeva Liisa Syvaoja
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2005-11-30
Also published as: MY113912A; ES2191103T5; NO975832L; ES2191103T3; KR19990022914A; IL122577A0; WO1997000078A1; DE69625690T2; CA2224320C; NZ310478A; CN1187772A; CA2224320A1; CZ399797A3; AR003960A1; US7172756B2; ATE230606T1; EE9700339A; BG63153B1; JPH11510791A; SK171597A3

Abstract

Prezenta invenţie se referă la metode şi mijloace pentru suprimarea reacţiilor de hipersensibilitate indusă, la pacienţi ce suferă de alergie la alimente. În special, invenţia prezintă procedee pentru prepararea unei formulări de hidrolizat proteinic, pentru scăderea reglată a reacţiilor de hipersensibilitate şi pentru întărirea barierei imunitare a intestinului, şi metode pentru prevenirea sau tratarea alergiilor, în special alergia la laptele de vacă, la copii, prin fortificarea dietei de eliminare a laptelui de vacă, cu bacterii probiotice, adecvate, derivate din traectul gastrointestinal, în special lactobacili. În plus, administrând fragmente dintr-un alergen modificat, prin reacţie imunitară la bacterii gastrointestinale, se poate trece de la sensibilizare la hiposensibilitate sistemică. O bacterie preferabilă a fi utilizată în această invenţie este Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Description

Prezenta invenție se referă la procedee de preparare a unor formule de hidrolizat proteic, pentru prevenirea sau tratarea alergiilor induse de alimente. în particular, invenția prezintă utilizarea acestor produse hidrolizate, pentru obținerea unor formule active farmaceutic, pentru prevenirea sau tratarea alergiilor și, în special, a alergiei la laptele de vacă, manifestată de copii. De asemenea, invenția se referă la dezvoltarea unor formule specifice pentru copiii alergici, cu funcția de barieră a intestinului, diminuată.

Alergia la laptele de vacă (CMA) este definită ca o reacție adversă, mediată imunitar față de proteinele din laptele de vacă. Tratamentul actual preferat constă în eliminarea completă a antigenilor de lapte de vacă. La copii cu CMA este necesar să se utilizeze o formulă de înlocuire atunci când laptele uman nu este disponibil. Formulele de hidrolizate, bazate pe zer derivat din lapte de vacă sau caseină, sunt utilizate pentru a asigura nutriția adecvată cu o sarcină antigenică redusă. Tratamentul de încălzire preliminară a laptelui de vacă afectează, în principal, configurația proteinelor și facilitează hidroliza acestora. Hidroliza enzimatică ulterioară cu extracte de pepsină, de tripsină, extracte pancreatice și extracte din mucoasa intestinală determină distrugerea progresivă a epitopilor secvențiali și transformă formulele în formele cele mai puțin antigenice și alergice.

în cele mai multe cazuri, formulele de derivați ai laptelui de vacă, hidrolizate extensiv, pot fi introduse în siguranță și acestea sunt eficiente și bine tolerate din punct de vedere clinic și metabolic. Totuși hidroliza enzimatică nu duce, în mod necesar, la o formulă nealergică, deoarece împotriva antigenilor dintr-un regim dietetic atacat pe cale enterică și poate, prin urmare, ajuta la eliminarea imunitară (Isolauri ș.a., 1993).

Nu se cunoaște încă dacă anumite tulpini de bacterii intestinale ar putea modifica direct imunogenicitatea antigenilor din alimente și, în consecință, să scadă reacțiile de hipersensibilitate.

Lactobacilii sunt incluși în flora microbiană a intestinelor în stare de sănătate. Este cunoscut că lactobacilii acționează în tractul intestinal concurând, cu receptorii și substanțele nutritive, împotriva microbilor patogeni în mucoasa intestinală.

Probioticele sunt preparate microbiene viabile care stimulează starea de sănătate prin menținerea microflorei naturale în intestine. Un preparat microbian poate fi confirmat ca probiotic, dacă microbii activi ai acestuia și modul lor de acțiune sunt cunoscuți. Probioticele atacă mucoasa intestinală, colonizează tractul intestinal uman și previn atașarea microbilor nocivi. O prezumție crucială este aceea că acestea intră în mucoasa intestinului și nu sunt distruse în partea superioară a tractului gastro-intestinal. Lactobaciilus GG este una din bacteriile cunoscute ca având caracteristici probiotice.

Invenția se referă la un procedeu de preparare in vitro a unei formule de hidrolizat proteic, pentru diminuarea controlată a reacțiilor de hipersensibilitate și pentru stimularea barierei imunitare a intestinului care cuprinde etapele de hidroliză a proteinelor cu ajutorul enzimelor derivate dintr-un preparat bacterian, cuprinzând tulpina Lactobaciilus GG (ATCC 53103) și cu pepsină și/sau tripsină.

într-o altă variantă procedeul, conform invenției, cuprinde etapele de hidroliză a proteinelor cu pepsină și/sau tripsină și adăugarea la hidrolizat a unui preparat bacterian, cuprinzând tulpina Lactobaciilus GG (ATCC 53103).

Conform invenției, s-a constatat că anumite bacterii ale tractului gastro-intestinal și, în special, bacteriile având caracteristici probiotice, în special Lactobacilii care prezintă caracteristici adezive și de colonizare și un sistem enzimatic de tip protează, similare celor ale tulpinii Lactobaciilus GG (ATCC 53103), potfi folosite pentru a spori eficacitatea eliminării reziduurilor alimentare și a îmbunătăți toleranța orală, în prevenirea sau tratarea reacțiilor de hipersensibilitate induse de alimente la un pacient.

RO 120243 Β1

Un aspect al invenției este acela că hidrolizatele proteice, obținute prin hidroliza pro- 1 teinelor cu bacteriile gastrointestinale, denumite mai sus, pot, de asemenea, să fie utilizate în acest scop. Se arată aici că hidrolizatele proteice, obținute conform invenției, au efect imu- 3 nologic, promovând hipoalergenicitatea. Hidrolizatele scad reacțiile de hipersensibilitate, stimulând astfel funcțiunea de barieră imunitară a intestinului, adică stabilizând bariera muco- 5 zală a intestinului.

Invenția de față prezintă o formulă îmbunătățită de hidrolizat proteic, pentru a scădea 7 reacțiile de hipersensibilitate și pentru stimularea funcției de barieră imunitară a intestinului. Formula de hidrolizat este obținută prin hidroliza proteinelor cu enzime derivate din tulpina 9 de Lactobacillus GG (ATCC 53103) și cu tripsina și/sau pepsina.

Procedeul de preparare a formulei de hidrolizat proteic reprezintă un obiect al 11 invenției.

în mod alternativ, o formulă de hidrolizat proteic, conform invenției, poate fi preparată 13 prin hidrolizarea proteinelor cu tripsina și/sau pepsină și adăugarea la hidrolizatul astfel obținut a unui preparat bacterian, care conține tulpina de Lactobacillus GG (ATCC 53103). Pro- 15 cedeul de preparare a formulei de hidrolizat proteic reprezintă un obiect al prezentei invenții. Bacteriile sunt adăugate în formula de hidrolizat, de preferință, ca preparat liofilizat. 17 în timpul administrării unei astfel de formule de hidrolizat la un pacient, este de așteptat ca enzimele de hidrolizare ale bacteriilor prezente să fie eliberate in vivo, prin aceasta 19 obținându-se același efect ca și cu o formulă de hidrolizat îmbunătățită, așa cum s-a definit mai sus. în plus, bacteriile viabile stabilizează bariera mucozală a intestinului, intensificând 21 apărarea locală.

Invenția de față are în vedere și utilizarea unei formule îmbunătățite de hidrolizat pro- 23 teic conform invenției sau, alternativ, unei formule de hidrolizat proteic împreună cu un preparat bacterian care conține tulpina de Lactobacillus GG (ATCC 53103) pentru prepararea 25 unei formule active farmaceutic pentru prevenirea sau tratarea reacțiilorde hipersensibilitate induse de alimente la un copil cu risc. 27

Invenția de față se mai referă și la utilizarea unei formule îmbunătățite de hidrolizat proteic sau, alternativ, a unei formule de hidrolizat proteic împreună cu un preparat bacterian 29 ce conține tulpina de Lactobacillus GG (ATCC 53103) pentru prepararea unei formule active farmaceutic, pentru tratarea alergiei unui pacient la laptele de vacă. 31

Invenția se referă, de asemenea, la utilizarea, la un pacient, a formulei îmbunătățite de hidrolizat proteic conform invenției sau, alternativ, a unui preparat bacterian ce conține 33 tulpina de Lactobacillus GG (ATCC 53103) sau, alternativ, a unei formule de hidrolizat proteic împreună cu un preparat bacterian, ce conține tulpina de Lactobacillus GG (ATCC 35 53103) pentru prepararea unei formule active farmaceutic, în vederea administrării orale, pentru stimularea răspunsurilor imunitare de toleranță față de antigenii alimentari la un 37 pacient.

în utilizările conform invenției, definite mai sus, când o formulă de hidrolizat proteic 39 este utilizată în asociere cu Lactobacillus GG (ATCC 53103), o astfel de formulă poate fi orice fel de formulă adecvată de hidrolizat proteic, cunoscută sau nouă. Astfel, aceasta paote 41 fi fie un hidrolizat proteic parțial, fie alternativ, o formulă hidrolizată extensiv. Prepararea unui hidrolizat proteic adecvat, în acest scop, este descrisă, de exemplu, în EP A 601802. 43

Tulpina de Lactobacillus GG (ATCC 53103) și caracteristicile adezive și de colonizare ale acesteia sunt descrise în brevetul EP 199535. 45

Abrevieri

CI interval de siguranță 47

IFN-y interferon-Y

RO 120243 Β1

igA	imunoglobulină A
igE	imunoglobulină E
IL-4	interleukină-4
LGG	Lactobacillus GG (ATCC 53103)
OKT3	anticorp anti-CD3
PBMC	celule mononucleare de sânge periferic
TNF-ct	factor a de necroză tumorală
WF	grup de testare ce primește formula de zer hidrolizată extensiv
WF-GG	grup de testare ce primește formula de zer hidrolizată extensiv și preparat LGG

P/T = caseină hidrolizată de pepsină și tripsină

P/T-a_s1 -caseină= caseină-a_s1 hidrolizată de pepsină și tripsină

Descrierea pe scurt a figurilor:

-fig. 1A-1D, răspunsuri proliferative induse de mitogen ale PBMC in vitro la caseină -P/T (1 A), caseină -P/T-a_s1 (1B), caseină -P/T adițional hidrolizată cu enzime derivate din LGG (1C) și caseină -P/T-a_s1 adițional hidrolizată cu enzime derivate din LGG (1D). Rezultatele sunt exprimate ca numere medii per minut, pentru culturi fără produs hidrolizat (PHA-RPM11640) și cu produs hidrolizat la 3 concentrații (0,1,10 și 1000 pg/ml). Liniile orizontale reprezintă media geometrică a numerelor per minut ale celor 6 experimente, enumerate la fel pentru fiecare.

-fig.2, înregistrarea clinică a dermatitei atopice (SCORAD) la fiecarepacientși înregistrarea mediană a extensiei (A), intensității (B) și înregistrării subiective (C) pentru dermatita atopică înainte de administrare (0), și o lună mai târziu (I), la copii, la care se administrează extensiv o formulare de zer hidrolizat, fără (WF), sau aceiași cu Lactobacillus OG (WF-GG).

- fig. 3, efectul caseinei și caseinei degradate cu Lactobacillus OG asupra producției de IL-4 și IFN-γ prin PBMC la pacienți atopici (a, b) și la copii sănătoși neatopici (c, d). Coloanele albe reprezintă producția medie de citokină în culturile de control; coloanele negre, în culturile ce conțin caseină purificată și coloanele hașurate, în culturile ce conțin caseină degradată cu Lactobacillus GG. Intersectarea liniilor reprezintă cuartile superioare și inferioare; statistic, comparare cuplată semnificativ la culturile de control.

-fig. 4, efectul caseinei-a_s1 și caseinei-a_s1 degradată cu Lactobacillus GG, asupra producerii de IL-4 și IFN-γ prin PBMC la pacienți atopici (a, b) și la copii sănătoși neatopici (c,d). Coloanele albe reprezintă producția medie de citokină în culturile de control; coloanele negre, în culturile ce conțin caseină-a_s1 și coloanele hașurate, în culturile ce conțin caseină-a_s1 degradată cu Lactobacillus GG. Intersectarea liniilor reprezintă cuartile superioare și inferioare; statistic comparare cuplată semnificativ la culturile de control.

Următoarele exemple ilustrează, în continuare, invenția. Sunt descrise procedee pentru prepararea hidrolizatelorîmbunătățite, precum și experi mente ce prezintă efectul terapeutic benefic observat în studiile prezentate.

Exemplul 1. Suprimarea proliferării limfocitare in vitro cu caseine de bovine, hidrolizate cu enzime derivate de la Lactobacillus GG.

.a. Hidroliza proteinelor din lapte de vacă

Caseina totală bovină și componenți de caseină (caseină-a_s1) au fost purificate din lapte de vacă (Syvăoja, 1992). Hidroliza cu amestec de enzime derivat de la Lactobacillus GG s-a aplicat, separat, la caseină și la caseină-a_s1. Enzimele au fost izolate, utilizând metoda modificată de Exterkate și de Veer, 1985. Pe scurt, enzimele au fost eliberate prin sonicarea celulelor bacteriale congelate. Supernatantul de la celulele centrifugate a fost separat și utilizat pentru hidroliza caseinei și caseinei-a_s1. Hidroliza s-a efectuattimpde24 h, la 34°C.

RO 120243 Β1

Hidrolizatele GG, astfel obținute, au fost în continuare hidrolizate cu pepsină și trip-1 șină. Pe scurt, probele au fost hidrolizate întâi cu pepsină 0,1% în 0,1 mol/IHC1,timpde 3 h, la 37°C, pH=2,5. După ajustarea pH-ului cu 250 mg NaHC₃ și 2 mol/l NaCH, s-a adăugat la3 probe 0,1% tripsină și acestea au fost hidrolizate timp de 5 h, la 37”C, pH=8,0.

Probele de caseină -P/T și caseină-a_s1-P/T s-au obținut prin hidroliză caseinei purifi- 5 cate și a caseinei-a_s1 numai cu pepsină și tripsină, așa cum s-a descris mai sus, fără hidrolizare GG.7 .b. Test de transformare fimfocitară

A fost utilizată o modificare a micrometodei de sânge integral pentru transformarea 9 limfocitară indusă de mitogen. S-a experimentat pe 6 până la 8 indivizi donori voluntari, de sânge. Pe scurt, sânge venos heparinizat a fost obținut și diluat 1:7 cu mediu de cultură 11 RPM11640 (GrandIslandBiological Co. NY, USA) conținând antibiotice. Fitohemaglutinina (PHA) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) s-a diluat cu RPM11640 cu conținut de anti- 13 biotice, cu intervale ale concentrațiilor finale în culturi de la 5 până la 1250 pg/ml. Hidrolizate liofilizate de caseină și caseină-a_s1 s-au diluat în RPM11640 la concentrațiile finale ale aces- 15 tora de 0,1 pg/ml (scăzut), 10 pg/ml (mediu) și 1000 pg/ml (ridicat), care s-au dovedit a fi netoxice pe celule T în studiile de excludere cu colorant eozină. 17

Două seturi de experiențe s-au efectuat pentru a investiga răspunsurile proliferative induse de mitogen ale celulelor mononucleare de sânge periferic (PBMC) la (A) caseina 19 hidrolizată cu pepsină și tripsină (=caseină -P/T), (B) caseină-a_s1 hidrolizată cu pepsină și tripsină (=caseină -a_s1-P/T), (C) caseină-P/T adițional hidrolizată cu enzime derivate de la 21 Lactobacillus GG și (D) caseină -a_s1-P/T adițional hidrolizată cu enzime derivate de la Lactobacillus GG. 23

Experimentul a constat din 4 culturi de control cu diferite diluții ale mediului de cultură și mitogen, precum și culturi test, corespunzătoare cu 25 pl de produse hidrolizate la 3 con- 25 centrații diferite. Determinarea a fost efectuată așa cum s-a descris de Sijtas ș.a.,1996.

Proliferarea indusă de mitogen a PBMC a fost exprimată în numere pe minut, cele 27 inferioare fiind excluse. Rezultatele au fost prezentate pentru culturile de control cu conținut de 125 pg/ml PHA și RPM11640 și pentru cele 3 culturi test cu conținut de 125 pg/ml PHA 29 și produse hidrolizate la concentrații scăzute, medii și înalte.

.c. Analiză statistică 31

S-a utilizat un test dublu neparametric (test grad-semnat Wilcoxon) pentru a compara schimbarea valorilor la numere per minut ale fiecăreia dintre culturile test față de culturile de 33 control. Nivelul de importanța a fost p < 0,05.

Rezultate semnificative ale comparațiilor duble au fost prezentate ca suprimare sau 35 stimulare, conform descreșterii sau creșterii valorilorîn numere per minut în testul de cultură.

1. d. Rezultate 37 în experimentele făcute cu caseină -P/T și caseină -a_s1-P/T adițional hidrolizată cu enzime derivate de la Lactobacillus GG, proliferarea indusă de mitogen a PBMC a fost 39 semnificativ suprimată la 0,1, 10 și 1000 pg/ml (p=0,03, p=0/03 și p=0,03) (fig. 1C și 1D) comparată cu caseină -P/T și caseină -a_s1-P/T (fig. 1A și 1B). 41

Exemplul 2. Tratamentul copiilor cu dermatită atopică, cu formulare de hidrolizat proteinic suplimentată cu bacterii de acid lactic. 43

2. a. Pacienți și plan de studiu

Studiul a cuprins 31 de copii, de vârste între 2,5 și 15,7 (în medie 8) luni, îndeplinind 45 criteriile Hanifin (Hanifin, 1987) pentru eczema atopică la copii. Aceștia au fost îndrumați la o clinică pediatrică pe baza eczemei atopice și suspectați de alergie la laptele de vacă. 47 Vârsta medie a apariției simptomelor a fost 2,4 luni. Durata totală a alimentării la sân a fost

RO 120243 Β1

5, 9 luni. A fost notat un istoric de familie pozitiv al bolilor atopice (astm, eczema atopică și rinite alergice) sau alergie la alimente de prim grad, la 26 (84%) pacienți. Leziunile eczematoase au fost tratate cu emolienți și cu corticosteroizi topici. Nici un pacient nu a primit o terapie de corticosteroizi sistematică. S-au observat la 9 (19%) pacienți eczeme atopice, tulburări gastrointestinale, cum sunt scaune nelegate, vomitări sau diareie. După perioadele de studiu, pacienții au fost supuși la provocări controlate cu lapte de vacă-placebo, dublu orb. Numai cei care au avut o reacție pozitivă (27/31) au fost incluși în studiul final. Pacienții au fost împărțiți arbitrar în două grupe pe o perioadă de o lună. Un grup (WF, n=14) a primit formulare de zer hidrolizat extensiv (Valio Ltd, Helsinki, Finland, EP-A-601802) și celălalt grup (WF-GG, n=13) a primit aceiași formulare cu preparat de Lactobacillus GG adițional (5x10¹ cfu/g) (furnizatde către Valio Ltd, Helsinki, Finland). După terapia de o lună, cu formulările lor repartizate, ambele grupuri au primit o formulare de zer hidrolizat extensiv (Valio Ltd) timp de încă o luna. Concentrația IgE totală de ser, IgE specific pentru laptele de vacă (RAST, Pharmacia, Uppsala, Suedia) și teste de înțepături ale pielii au fost determinate la toți pacienții înainte de intervenția dietetică. Testarea cu înțepături a fost făcută pe antebraț, aproape de palmă, utilizând un alergen de lapte de vacă disponibil comercial ALK (Allergologisk Laboratorium, Horsholm, Danemarca) și formularea de testare s-a diluat la concentrația de alimentare normală. S-a utilizat o lanțetă cu un singur vârf de 1 mm, pentru a preveni o penetrare mai adâncă (ALK), cu diclorhidrat de histamină 10 mg/ml (ALK) drept control pozitiv. Reacțiile au fost citite după 15 min și un răspuns de jumătate din dimensiunea reacției la histamină sau mai mare a fost înregistrat ca pozitiv, în condiția în care diametrul mediu al umflăturii a fost de cel puțin 3 mm și controlul negativ la același timp, 0 mm.

Probe de fecale pentru determinarea antitripsinei a-1 și TNF-a s-au colectat înainte de începutul analizei și după 1 lună (corespunzând perioadei de studiu) și după 2 luni mai târziu.

Severitatea dermatitei atopice a fost numărată conform metodei SCORAD, stabilită de norma europeană pentru dermatita atopică (1993). Pescuit, extinderea (scor A) dermatitei a fost estimată utilizând regula lui 9. Intensitatea (scor B) dermatitei a fost suma numerelor individuale (0-3) pentru eritem, edem și/sau papule, excoriații, lichenizare și uscăciune. Manifestări subiective (scor C) (numărate 1 -10) incluzând prurit și insomnie au fost determinate din estimările părinților. SCORAD a fost obținut cu calculul: A/5+3,5xB+C.

Protocolul de studiu a fost aprobat de către Comitetul de Revizuire Etică de la Spitalul Universității din Tampere. Un consimțământ informativ a fost obținut de la părinți.

2.b. Determinarea antitripsinei a-1 în probe de fecale

Probe de fecale congelate au fost dezghețate la temperatura camerei și omogenizate. Aproximativ 1 g s-a transferat într-un tub de sticlă și s-a liofilizat. Materialul uscat rezultat a fost mărunțit și 50 mg s-au transferat într-un tub Eppendorf. S-a adăugat 1 ml de soluție 0,15M de NaCI și antitripsina a-1 s-a extras cu amestecare puternică într-un amestecător Vortex, timp de 20 min, la temperatura camerei. Suspensia rezultată a fost centrifugată la 25.000 g timp de 10 min pentru a îndepărta rămășițele și supernatantul s-a folosit pentru determinarea antitripsinei a-1, utilizând un nefelometru BNA Behring, conform instrucțiunilor producătorului. Rezultatele sunt date în mg/g greutate uscată de fecale liofilizate.

2.c. Determinarea TNF-α în probe de fecale

Probe de fecale congelate s-au încălzit la temperatura camerei, s-au suspendat 1:1 (greutate/volum) în soluție salină fiziologică și s-au lăsat sa se sedimenteze. 0,5...1,0 ml s-au transferat într-un tub Eppendorf și s-au centrifugat la 25.000 g timp de 10 min. Supernatantul

RO 120243 Β1 a fost apoi utilizat pentru determinarea TNF-α. S-a utilizat o probă de enzimă comerciala 1 (Trusă ELISAde TNF-α uman, Endogen Inc., Boston, Massachusetts, USA), ca la probele de serum, pentru determinarea TNF-α fecal. 3

2.d. Statistici

Din motivul repartițiilor asimetrice ale concentrațiilorde serum IgE s-au utilizat trans- 5 formările logaritmice (In) și datele sunt prezentate ca medii cu intervale de siguranță de 95% (CI). Concentrațiile parametrilor inflamatorii sunt prezentate cu mediane cu cuartile inferioare 7 și superioare. în comparările statistice s-au utilizat testul Wilcoxon și testul U Mann-Whitney.

2.e. Rezultate 9

2.e.1. Date clinice

Media (95% CI) de IgE ser total a fost de 31 (15-61) kU/1 la pacienții care au primit 11 formulare de hidrolizat. RAST pentru laptele de vacă a fost pozitiv (>0,4 kU/1) la 10/31 (37%) pacienți cu eczeme atopice. Testul cu începături ale pielii, pentru laptele de vacă a fost 13 pozitiv la 8/31 (30%) pacienți.

Severitatea dermatitei atopice la fiecare pacient înainte de începutul analizelor și la 15 1 lună mai târziu, adică după perioada de studiu se prezintă în fig. 2. înregistrarea mediană SCORAD (cuartil inferior-cuartil superior) a fost 21 (14-31) în grupul WF și 26 (17-38) în 17 grupul WF-GG înainte de analiză (p=0,33). A fost o îmbunătățire semnificativa a înregistrării SCORAD după intervenția de 1 lună la cei care au primit Lactobacillus GG (p=0,008), dar 19 nu la cei care au primit formulare hidrolizată extensiv fără Lactobacillus GG (p=0,89). înregistrarea SCORAD a fost apoi 19 (13-31) în grupul WP și 15 (7-28) în grupul WP-GG. Des- 21 creșterea în înregistrarea SCORADIa WF-GG s-a datorat reducerii întinderii (scor A, p=0,004), intensității (scorB, p=0,05) și scorului subiectiv (scorC, p=0,01) pentru dermatita 23 atopică (fig. 2).

îmbunătățirea înregistrării SCORAD s-a obținut la 2 luni în grupul WP și în grupul 25 WF-GG a rămas neschimbat după oprirea de Lactobacillus GG. La 2 luni, înregistrarea mediană SCORAD (cuartil inferior-cuartil superior) a fost în grupul WF 14 (2-38) și în grupul 27 WF-GG 16 (6-25).

2.e.2. Concentrațiile, antitripsinei a-1 și TNF-aln fecale 29

La controale de sănătate (n=9), concentrația mediană (cuartil inferior-cuartil superior) a antitripsinei a-1 a fost 0,5 (0,5...1,7) mg/g. Concentrația antitripsinei a-1 a fost comparabilă 31 între grupurile WF și WF-GG înainte de analiză (p=0,22). Așa cum s-a indicat în tabelul 1, concentrația antitripsinei a-1 a scăzut semnificativ în grupul WF-GG (p=0,03), dar nu în 33 grupul WF (p=0,68) în timpul unei perioade de studiu de 1 lună. La 2 luni, concentrația antitripsinei a-1 a fost 1,2 (0,5...1,6) la WF și 0,5 (0,5...0,7) la WF-GG. 35

Concentrația TNF-α în fecale a fost 0 (0...0,8) pg/g la controalele de sănătate. Concentrația TNF-α în fecale a fost semnificativ mai mare la copii atopici, p<0,0001 (tabel 1). 37

Concentrația TNF-α a fost comparabilă între grupurile WP și WF-GG înainte de analiză (p=0,57). Concentrația TNF-α în fecale a scăzut semnificativ la WF-GG (p=0,003), dar nu 39 la WF (p=G,38) în timpul perioadei de o luna de studiu (tabel 1). O reducere în concentrația TNF-α s-a realizat la 2 luni în grupul WF, în timp ce în grupul WF-GG la care, de asemenea, 41 s-a dat o formulare hidrolizată extensiv fără Lactobacillus GG, s-a detectat o tendința de descreștere a TNF-α. Concentrația TNF-α a fost apoi 84 (25-129) la WF și 144 (20-338) la 43 WF-GG.

RO 120243 Β1

Tabelul 1 Concentrațiile antitripsinei a-1 și TNF-adin fecale înainte de analiză (0) și la o lună mai târziu (I), la copii ce au primit formulare de zer hidrolizată extensiv (WF) sau aceeași formulare cu conținut de bacterii Lactobacillus GG (WF-GG). Datele prezintă media (cuartil inferior-cuartil superior).

	WF	WF-GG
antitripsină a-1 0 (mg/g)	1,7 (1,5-2,3)	1,4 (0,5-1,9)
antitripsină α-1 I (mg/g)	1,7 (1m1-2,8)	0,5 (0,5-1,0)
TNF-a 0 (pg/g)	632 (126-1880)	709(91-1131)
TNF-a (Og/g)	494 (147-1009)	34 (19-103)

Exemplul 3. Scăderea reglată a producției de citokină de către celulele mononucleare de sânge periferic la copii atopici

3.a. Pacienți și metode în total, 14 pacienți de vârste de 5-29 (în medie 16) luni, care au îndeplinit criteriile Hanifin pentru dermatită atopică (Hanifin, 1987) și opt copii sănă toși, de vârste egale, neatopici, au fost studiați. Nici unul dintre aceștia nu a primit, în timpul studiului, corticosteroizi sistemici.

OKT3 (anticorp anti CD3) cu conținut de fluid abdominal a fost o donație de la Dr. M. Kaartinen, Departamentul de Bacteriologie și Imunologie, Universitatea din Helsinki, Finlanda. Caseina totală bovină a fost purificată din laptele de vacă, așa cum s-a descris în Syvăoja (1992). Caseina purificată a fost hidrolizată cu enzime derivate din Lactobacîllus-GG, așa cum s-a descris în exemplul 1. Caseina purificată sau caseina degradată cu Lactobacillus-GG s-a liofilizat și s-a menținut la temperatura camerei. înainte de experimente, acestea s-au diluat cu RPMI 1640 și s-au filtrat cu sterilizare (0,1 pm, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA).

A fost obținut un mediu de cultură complet constituit din RPMI 1640 cu ser de vițel fetal 10%, tampon Hepes 10 mM, L-glutamină2 mM (Gifco LifeTechnologies, Paisley.GB), 50 U/ml benzilpenicilină (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mg/ml gentamicină (RousselLaboratoriesLtd, Uxbridge, Middlesex, GB). A fost obținut sânge venos periferic (5 ml). PBMCcu conținut de 90% celule limfoide s-a izolat prin centrifugare FicollPaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suedia) și s-a suspendat la 1 x 10⁵ celule/ml în mediul de cultură complet. Cultura s-a prestratificat cu anticorp anti-CD3 cu conținut de fluid abdominal la o diluție optimă, protestată. Cultura de testare a conținut adițional caseina diluată sau caseina degradată cu Lactobacillus GG, la o concentrație finală de 1 mg/ml. Aceste experimente au fost repetate pentru caseină-a_s1 de bovine, purificată sau caseină-a_s1 degradată cu Lactobacillus GG. După 24 h de incubație într-o atmosferă umidificată de 5% CO₂, la 37’C, supernatanții s-au colectat și s-au menținut la -70’C pentru analizele de citokină. Au fost determinate IL-4 și IFN-γ în supernatanții de cultură cu truse ELISA disponibile comercial, conform cu instrucțiunile producătorului (IL-4: CLB, Compact Human lnterieukin-4 ELISA kit, Central Laboratory of The Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, The Netherlands; IFN-y, EIFNG, Endogen Inc., Cambridge, MA, USA). Rezultatele din serii diferite s-au egalizat folosind compararea curbelor standard și au fost exprimate ca pg/ml. Sensibilitatea analizelor

RO 120243 Β1 pentru IL-4 a fost de 2,3 pg/ml și pentru IFN-y, 5 pg/ml. A fost utilizat testul Wilcoxon în com- 1 parările statistice ale culturilor de testare fața de culturile de control. Nivelul de importanță a fost P< 0,05. 3

3.b. Rezultate

La pacienții atopici, producerea ambelor IL-4 și IFN-Y, a fost mărită în culturi cu con- 5 ținut de caseină purificată când s-a comparat cu culturile de control, P = 0,008 și P = 0,008, respectiv (fig. 3a,b). Nu s-a observat un astfel de efect al caseinei de bovine când s-a degra- 7 dat cu enzime de Lactobacillus GG. în schimb, producerea de IL-4 în culturile cu conținut de caseină degradată cu Lactobacillus GG a fost semnificativ mai scăzuta decât în culturile de 9 control, P = 0,003 (fig.3a) și producerea de IFN-y, în aceste culturi a fost comparabili cu cea din culturile de control, P = 0,10 (fig.3b). 11

La copii sănătoși, producerea de IL-4 și IFN-γ, în culturi conținând caseină purificată a fost comparabilă cu cea a culturilor de control, P = 0,10 și P = 0,10 (fig. 3c,d).în paralel cu 13 constatările la pacienții atopici, la copiii sănătoși, producerea de IL-4 a fost semnificativ mai scăzută în culturile conținând caseină degradată cu Lactobacillus GG decât în culturile de 15 control, P = 0,01 (fig. 3c) și producerea de IFN-γîn aceste culturi, a rămas comparabilă cu cea a culturilor de control, P = 0,50 (Fig. 3d). 17

Rezultate paralele s-au obținut cu caseină-a_s1 și cu caseină-a_s1 degradată cu Lactobacillus GG (fig. 4). 19

Claims

1. Procedeu de preparare in vitro a unei formule de hidrolizat proteic, pentru diminua- 23 rea controlată a reacțiilorde hipersensibilitate și pentru stimularea barierei imunitare a intestinului, care cuprinde etapele de hidroliza a proteinelor, cu ajutorul enzimelor derivate dintr-un 25 preparat bacterian cuprinzând tulpina Lactobacillus GG (ATCC 53103) și cu pepsină și/sau tripsină. 27

2. Procedeu de preparare in vitro a unei formule de hidrolizat proteic, pentru diminuarea controlată a reacțiilorde hipersensibilitate și pentru stimularea barierei imunitare a intesti- 29 nului care cuprinde etapele de hidroliza a proteinelor cu pepsină și/sau tripsină și adăugarea la hidrolizat a unui preparat bacterian cuprinzând tulpina Lactobacillus GG (ATCC 53103). 31

3. Formulă orală de hidrolizat proteic pentru diminuarea controlată a reacțiilor de hipersensibilitate și pentru stimularea barierei imunitare a intestinului, hidrolizat carese poate 33 obține prin metoda definită în revendicarea 1 sau 2.

4. Utilizare a formulei de hidrolizat proteic, conform revendicării 3 pentru prepararea 35 unei formule active farmaceutic, în vederea administrării orale pentru stimularea răspunsurilor imune de toleranță la antigeni alimentari la un pacient. 37

5. Utilizare conform revendicării 4, în care formula de hidrolizat proteic este utilizată pentru prepararea unei formule active farmaceutic pentru tratarea alergiei la lapte de vacă 39 a unui pacient.

6. Utilizare conform revendicării 4, în care formula de hidrolizat proteic este utilizată 41 pentru prepararea unei formule active farmaceutic pentru prevenirea sau tratarea reacțiilor de hipersensibilitate induse de alimente la un sugar. 43

7. Utilizare a unui preparat bacterian, care cuprinde tulpina Lactobacillus GG (ATCC

53103), împreună cu o formulă de hidrolizat proteic, pentru prepararea unei formule active 45 farmaceutic pentru stimularea răspunsurilor imune de toleranță la antigeni alimentari a un pacient. 47

RO 120243 Β1

1

8. Utilizare conform revendicării 7, în care formula de hidrolizat proteic împreună cu preparatul bacterian este utilizat pentru prepararea unei formule active farmaceutic pentru 3 tratarea alergiei la lapte de vacă a unui pacient.

9. Utilizare conform revendicării 7, în care formula de hidrolizat proteic împreună cu

5 preparatul bacterian este utilizat pentru prepararea unei formule activ efarmaceutic pentru prevenirea sau tratarea reacțiilor de hipersensibilitate induse de alimente la un sugar.