PL185123B1

PL185123B1 - Sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu białkowego i zastosowanie mieszanki hydrolizatu białkowego

Info

Publication number: PL185123B1
Application number: PL96324010A
Authority: PL
Inventors: Isolauri┴Erika; Metsäniitty┴Leena; Korhonen┴Hannu; Salminen┴Seppo; Syväoja┴Eeva-Liisa
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2003-02-28
Also published as: EE9700339A; MY113912A; AU710126B2; RO120243B1; EE03424B1; WO1997000078A1; US6506380B1; JP3983804B2; CN1154506C; CZ291904B6; AU6127896A; SK284245B6; BG63153B1; MX9710109A; US20030113340A1; CN1187772A; US7172756B2; NO975832D0; PL324010A1; FI952926A0

Abstract

1. Sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu bialkowego do regulacji w dól reakcji nadwrazliwosci i do poprawy czynnosci jelitowej bariery immunologicznej, znamienny tym, ze bialka hydrolizuje sie za pomoca enzymów pochodzacych z preparatu bakteryjnego, za- wierajacego szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103) i trypsyne i/lub pepsyne. 2. Sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu bialkowego do regulacji w dól reakcji nadwrazliwosci i do poprawy czynnosci jelitowej bariery immunologicznej, znamienny tym, ze bialka hydrolizuje sie pepsyna i/lub trypsyna i do hydrolizatu dodaje sie preparat bakteryj- ny zawierajacy szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103). 3. Zastosowanie mieszanki hydrolizatu bialkowego wytworzonego na drodze hydrolizy bialka za pomoca enzymów pochodzacych z preparatu bakteryjnego, zawierajacego szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103) i trypsyne i/lub pepsyne albo na drodze hydrolizy bialka pe- psyna i/lub trypsyna, do którego to hydrolizatu dodano preparat bakteryjny zawierajacy szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103), do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia spowodowanych pokarmem reakcji nadwrazliwosci u niemowlecia. 185123 B1 PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu białkowego i zastosowanie mieszanki hydrolizatu białkowego.

Mieszanki hydrolizatu białkowego wytworzone sposobem według wynalazku znajdują zastosowanie do hamowania wywołanych przez pokarm reakcji nadwrażliwości u chorych z alergiami pokarmowymi. Tak więc, mieszanki te służą do zapobiegania i leczenia alergii, szczególnie alergii na mleko krowie u niemowląt. Sposobem według wynalazku wytwarza się mieszanki specjalne dla niemowląt z uszkodzeniem bariery jelitowej.

Alergię na mleko krowie (CMA) definiuje się jako immunologiczną niepożądaną reakcję na białko mleka krowiego. Obecnie leczeniem z wyboru jest całkowita eliminacja antygenów mleka krowiego. U niemowląt z CMA niezbędne jest stosowanie mieszanki zastępczej, jeżeli mleko kobiece jest niedostępne. W celu zapewnienia dostatecznego odżywienia z ograniczonym ładunkiem antygenów, stosuje się mieszanki hydrolizowane, oparte na serwatce lub kazeinie pochodzących z mleka krowiego. Wstępna obróbka cieplna mleka krowiego zmienia głównie konformację białek i ułatwia ich hydrolizę. Późniejsza hydroliza enzymatyczna pepsyną, trypsyną, wyciągami z trzustki i wyciągami ze śluzówki jelitowej powoduje stopniowe zniszczenia sekwencyjnych epitopów i oczyszcza mieszankę do postaci zawierającej mniej antygenów i alergenów.

W większości przypadków można bezpiecznie wprowadzać mieszanki wytworzone z mleka krowiego poddanego intensywnej hydrolizie; są one skuteczne oraz dobrze tolerowane klinicznie i metabolicznie. Hydroliza enzymatyczna nie zawsze jednak pozbawia mieszankę właściwości alergennych, ponieważ nie wiadomo, jaki zakres hydrolizy jest optymalny i w hydrolizacie wykrywa się ślady pierwotnego białka. Tak więc, u dzieci z alergią na mleko krowie należy zachować ostrożność przy wprowadzaniu takich namiastek.

185 123

Sposoby ograniczania zapalenia alergicznego poprzez eliminację antygenu nie są wystarczające, zwłaszcza u chorych z alergią na wiele pokarmów (Sampson i wsp., 1992). U chorych tych często dochodzi do zwiększenia przepuszczalności jelitowej i zaburzeń czynności obronnej bariery jelitowej (Majamaa i wsp., 1996, Majamaa i Isolauri, 1996). Powoduje to zwiększenie ryzyka zaburzeń wzrostu i uwrażliwienia na wiele pokarmów. Niezbędne są pilnie nowe sposoby leczenia alergii na mleko krowie w celu ulepszenia mieszanek stosowanych jako namiastki wCMA.

Przemieszczanie antygenu jelitowego determinuje późniejszą odpowiedź immunologiczną na ten antygen. W warunkach zdrowia antygeny sąwchłaniane przez nabłonek poprzez dwa szlaki czynnościowe. Główny szlak jest szlakiem rozpadu, poprzez który dochodzi do zmniejszenia immunogenności antygenu. Szlak poboczny umożliwia transport nienaruszonych białek, który ma kluczowe znaczenie w antygenowo swoistej odpowiedzi immunologicznej. Zaburzenia wchłaniania antygenu zwiększają proces uwrażliwienia (Fargeas i wsp., 1995).

Na rodzaj odpowiedzi immunologicznej istotny wpływ regulujący wywiera różnicowe wytwarzanie cytokin przez komórki T pomocnicze (T-helper - Th) w czasie reakcji immunologicznej. Profil cytokin naturalnej odpowiedzi immunologicznej determinuje fenotyp późniejszej swoistej odpowiedzi immunologicznej. Poza kontrolą wytwarzania IgE, IL-4 ma kluczowe znaczenie w rozwoju i dojrzewaniu fenotypu Th2, charakterystycznego dla zapalenia alergicznego.

Jak się wydaje, proces ten ma kluczowe znaczenie w rozwoju tolerancji na białko przyjęte drogąpokarmową. Tolerancja doustna stanowi stan swoistego antygenowo układowego braku odpowiedzi, którego cechą charakterystycznąjest miejscowa antygenowo-swoista odpowiedź IgA.

W japońskim opisie patentowym nr JP-52079083 ujawniono sposób zapobiegania alergii pokarmowej za pomocą preparatów otrzymanych przez hydrolizę białek przez enzymy bakterii kwasu mlekowego i pankreatyny. W opisie tym stwierdzono, że nie sąpotrzebne żadne specjalne szczepy bakterii kwasu mlekowego i zaleca się normalną handlowo dostępną bakterię kwasu mlekowego, którą stosuje się w nabiale. Rozwiązanie według niniejszego wynalazku różni się od rozwiązania według JP-52079083 tym, że nie stosuje się w nim dowolnej bakterii kwasu mlekowego lub jej mleczarskich szczepów, ale szczególną probiotyczną bakterię żołądkowo-jelitową, która nieoczekiwanie okazała się szczególnie korzystna w zapobieganiu i leczeniu reakcji nadwrażliwości.

W publikacji międzynarodowego zgłoszenia w WO 95/14485 ujawniono kompozycje zawierające żywe bakterie, korzystnie, mieszaninę żywych bakterii do leczenia i zapobiegania zaburzeń alergicznych przez poprawę bakteryjnej flory jelitowej. Rozwiązanie to nie dotyczy jednak hydrolizatów białkowych razem ze szczególnie użyteczną bakterią, ani osiągniętemu dzięki nim efektowi zwiększonej tolerancji.

Ostatnio udowodniono, że izolowany ludzki bakteryjny szczep jelitowy, szczep Lactobacillus GG (Lactobacillus GG, ATCC 53103) powoduje wzmożenie miejscowych odpowiedzi IgA przeciwko antygenom pokarmowym w jelitach, może zatem wspomagać eliminację immunologiczną (Isolauri i wsp., 1993). Nie wiadomo na razie, czy konkretne szczepy bakterii jelitowych mogą bezpośrednio modyfikować immunogenność antygenów pokarmowych i w związku z tym powodować „regulację w dół” (down-regulation) reakcji nadwrażliwości.

Lactobacilli są częścią flory bakteryjnej zdrowych jelit. Uważa się, że Lactobacilli działają w przewodzie pokarmowym poprzez współzawodnictwo o receptory i substancje odżywcze z drobnoustrojami chorobotwórczymi na śluzówce jelitowej.

Probiotyki stanowią żywe preparaty drobnoustrojów ułatwiające zachowanie zdrowia poprzez podtrzymywanie naturalnej mikroflory jelitowej. Preparat drobnoustrojów można zakwalifikować jako probiotyk, jeżeli znane są drobnoustroje w nim działające i ich sposób działania. Probiotyki przywierajądo śluzówki jelitowej, kolonizująprzewód pokarmowy człowieka i zapobiegają przywieraniu drobnoustrojów szkodliwych. Istotnym założeniem jest to, aby docierały one do śluzówki jelit i nie ulegały zniszczeniu w górnych odcinkach przewodu pokarmowego. Lactobacillus gG stanowi jedna ze znanych bakterii o właściwościach probiotycznych.

185 123

Stwierdzono, że pewne bakterie przewodu pokarmowego, zwłaszcza Lactobacilli, i zwłaszcza bakterie o właściwościach probiotycznych, można stosować w celu zwiększenia skuteczności diet eliminacyjnych i do zwiększenia doustnej tolerancji, w celu zapobiegania lub leczenia spowodowanych pokarmami reakcji nadwrażliwości u chorego.

Pierwszą cechę niniejszego wynalazku stanowi to, że do tego celu można stosować hydrolizaty białkowe, wytworzone poprzez hydrolizę białek z wyżej wspomnianymi bakteriami przewodu pokarmowego. Hydrolizaty białkowe wytworzone sposobem według niniejszego wynalazku wykazują działanie immunologiczne zmniejszające alergenność. Hydrolizaty powodują regulację w dół nadwrażliwości, poprawiając w ten sposób czynność jelitowej bariery immunologicznej, tzn. stabilizując jelitową barierę śluzówko wą.

Sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu białkowego do regulacji w dół reakcji nadwrażliwości i do poprawy czynnościjelitowej bariery immunologicznej, według wynalazku polega na tym, że białka hydrolizuje się za pomocąenzymów pochodzących z preparatu bakteryjnego, zawierającego szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103) i trypsynę i/lub pepsynę.

Inny sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu białkowego do regulacji w dół reakcji nadwrażliwości i do poprawy czynności jelitowej bariery immunologicznej, polega na tym, że białka hydrolizuje się pepsyną i/lub trypswiąi do hydrolizatu dodaje się preparat bakteryjny zawierający szczep Lactobacillus GG (AtCC 53103).

Wynalazek dotyczy także zastosowania mieszanki hydrolizatu białkowego wytworzonego na drodze hydrolizy białka za pomocąenzymów pochodzących z preparatu bakteryjnego, zawierającego szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103) i trypsynę i/lub pepsynę albo na drodze hydrolizy białka pepsyną i/lub trypsyną, do którego to hydrolizatu dodano preparat bakteryjny zawierający szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103), do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia spowodowanych pokarmem reakcji nadwrażliwości u niemowlęcia.

Korzystnie, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wytwarzany lek służy do leczenia reakcji nadwrażliwości u niemowlęcia, którąjest alergia na mleko krowie.

Korzystnie, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, wytwarzanym lekiemjest lek do podawania doustnego do wzmacniania wywołujących tolerancję odpowiedzi immunologicznych na antygeny pokarmowe u chorego.

Tak więc, sposobem według wynalazku wytwarza się ulepszoną mieszankę z hydrolizatem białkowym powodującą regulację w dół nadwrażliwości i poprawiającą w ten sposób czynność jelitowej bariery immunologicznej. Mieszankę hydrolizatową wytwarza się poprzez hydrolizę białek z enzymami pochodzącymi z probiotycznych bakterii przewodu pokarmowego, zwłaszcza Lactobacilli, wykazujących właściwości przywierania i kolonizacji i posiadających układ enzymów, proteaz, podobny do układu szczepu Lactobacillus GG (ATCC 53103), i z trypsyną i/lub pepsyną.

Zamiast tego, mieszankę z hydrolizatem białkowym można wytworzyć poprzez hydrolizę białek z trypsyną i/lub pepsyną, i dodanie do w ten sposób wytworzonego hydrolizatu preparatu bakteryjnego zawierającego probiotyczne bakterie przewodu pokarmowego, zwłaszcza Lactobacilli, które wykazują właściwości przywierania i kolonizacji i posiadają układ enzymów, proteaz, podobny do układu szczepu Lactobacillus GG (ATCC 53103). Bakterie dodaje się do mieszanki z hydrolizatem, korzystnie, w postaci preparatu liofilizowanego.

Przy podawaniu takiej mieszanki hydrolizatowej choremu, należy oczekiwać, że enzymy hydrolityczne bakterii uwolnią się in vivo, przez co osiągnie się taki sam skutek, jak przez zastosowanie wyżej opisanej ulepszonej mieszanki hydrolizatowej. Ponadto, żywe bakterie stabilizują śluzówkową barierę jelitową, pobudzając miejscowe mechanizmy obronne.

Mieszanki wytworzone sposobem według wynalazku służą do zapobiegania lub leczenia wywołanych przez pokarm reakcji nadwrażliwości u niemowlęcia. Zapobieganie to lub leczenie polega na podawaniu zagrożonemu niemowlęciu ulepszonej mieszanki z hydrolizatem białkowym, lub zamiast tego mieszanki z hydrolizatem białkowym wraz z preparatem bakteryjnym zawieraj ącym probiotyczne bakterie przewodu pokarmowego, zwłaszcza Lactobacilli które wykazują właściwo185 123 ści przywierania i kolonizacji i posiadają układ enzymów, proteaz, podobny do układu szczepu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Mieszanki wytworzone sposobem według wynalazku służą do leczenia alergii na mleko krowie u chorego. Leczenie to polega na podawaniu choremu ulepszonej mieszanki z hydrolizatem białkowym, lub zamiast tego mieszanki z hydrolizatem białkowym wraz z preparatem bakteryjnym zawierającym probiotyczne bakterie przewodu pokarmowego, zwłaszcza Lactobacilli, które wykazują właściwości przywierania i kolonizacji i posiadają układ enzymów, proteaz, podobny do układu szczepu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Mieszanki wytworzone sposobem według wynalazku służą do pobudzania zwiększających tolerancję odpowiedzi immunologicznych u chorego. Pobudzanie to polega na doustnym podawaniu choremu ulepszonej mieszanki z hydrolizatem białkowym, lub zamiast tego preparatu bakteryjnego zawierającego probiotyczne bakterie jelitowe, zwłaszcza Lactobacilli, które wykazują właściwości przywierania i kolonizacji i posiadająukład enzymów, proteaz, podobny do układu szczepu Lactobacillus GG (ATCC 53103), lub zamiast tego, mieszanki z hydrolizatem białkowym wraz z preparatem bakteryjnym zawierającym probiotyczne bakterie jelitowe, zwłaszcza Lactobacilli, które wykazująwłaściwości przywierania i kolonizacji i posiadają układ enzymów, proteaz, podobny do układu szczepu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Mieszankę z hydrolizatem białkowym stosuje się w połączeniu z dobranąbakteriąprobiotycznąjak to zdefiniowano powyżej, taka mieszanka może stanowić dowolną odpowiednią mieszankę z hydrolizatem białkowym, znaną lub nową. Może ona zatem stanowić częściowy hydrolizat białkowy, lub zamiast tego mieszankę poddaną intensywnej hydrolizie. Preparaty hydrolizatu białkowego odpowiednie do tego celu opisano np. w europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 601802.

Korzystną bakterię do zastosowania w sposobie według niniejszego wynalazku stanowi Lactobacillus GG (ATCC 53103).

W niniejszym opisie i załączonych zastrzeżeniach określenie „bakterie, zwłaszcza Lactobacilli, które wykazująwłaściwości przywierania i kolonizacji i posiadająukład enzymów, proteaz, podobny do układu szczepu Lactobacillus GG (ATCC 53103)” należy rozumieć jako definicję bakterii, których właściwości przywierania i kolonizacji są porównywalne z właściwościami szczepu LGG, np. jak to zdefiniowano w opisie patentowym nr EP-199535. Uważa się także, że bakterie te posiadają ten sam typ układu enzymatycznego, co LGG, co oznacza, że enzymy pochodzące z tych bakterii są zdolne do powodowania rozpadu białek i wytwarzania produktów hydrolizy o takim samym działaniu, jak produkty wytworzone z użyciem enzymów pochodzących z LGG.

Skróty

CI przedział ufności

IFN-γ interferon γ

IgA immunoglobulina A

IgE immunoglobulina E

IL-4 interleukina 4

LGG Lactobacillus GG (ATCC 53103)

OKT3 przeciwciało przeciwko CD3

PBMC komórki jednojądrzaste krwi obwodowej

TNF-α czynnik martwicy nowotworu c

WF grupa badana otrzymuj ąca Mieszankę Serwatkowąpoddaną intensywnej hydrolizie

WF-GG grupa badana otrzymująca Mieszankę Serwatkowąpoddaną intensywnej hydrolizie i preparat LGG

Kazeina P/T = kazeina poddana hydrolizie pepsyną i trypsyną

Kazeina P/T-cgi = kazeina cg, poddana hydrolizie pepsyną i trypsyną

185 123

Krótki opis rysunków

Figury 1A-1D

Pobudzane mitogenem odpowiedzi proliferacyjne PBMC in vitro na kazeinę P/T (1A), kazeinę P/T-c, , (IB), kazeinę P/T poddaną dodatkowo hydrolizie enzymami pochodzącymi z LGG (1C) i kazeinę P/T-ο.; poddaną dodatkowo hydrolizie enzymami pochodzącymi z LGG (ID). Wyniki przedstawiono j ako średniązliczeń na minutę dla hodowli bez produktu poddanego hydrolizie (PHA-RPMI1640) i z produktem poddanym hydrolizie, w trzech stężeniach (0,1,10 i 1000 pg/ml). Linie poziome oznaczają średnią geometryczną zliczeń na minutę z sześciu doświadczeń, wyliczonych w ten sam sposób dla każdego osobnika.

Figura 2

Wynik w klinicznej skali atopowego zapalenia skóry (SCORAD) u poszczególnych chorych i średni wynik w zakresie wielkości zajętego obszaru (A), intensywności (B) i subiektywnej oceny punktowej (C) dla atopowego zapalenia skóry przed leczeniem (0) i w miesiąc później (I) u niemowląt otrzymujących mieszankę serwatkową poddaną intensywnej hydrolizie, z dodatkiem Lactobacillus GG (WF-GG) lub bez tego dodatku (WF).

Figura 3

Wpływ kazeiny i kazeiny uległej rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG na wytwarzanie lL-4 i IFN-y przez PBMC u chorych z atopią (a, b) i u zdrowych dzieci bez atopii (c, d). Białe kolumny przedstawiają średnie wytwarzanie cytokin w hodowlach kontrolnych; czarne kolumny - w hodowlach zawierających oczyszczonąkazeinę; a zakreskowane kolumny - w hodowlach zawierających kazeinę uległą rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG. Linie przecinające oznaczają kwartyle górny i dolny. Statystycznie znamienne parowane porównanie z hodowlami kontrolnymi.

Figura 4

Wpływ kazeiny c, , i kazeiny C,) uległej rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG na wytwarzanie IL-4 i IFN-y przez PBMC u chorych z atopią (a, b) i u zdrowych dzieci bez atopii (c, d). Białe kolumny przedstawiają średnie wytwarzanie cytokin w hodowlach kontrolnych; czarne kolumny - w hodowlach zawierających oczyszczoną kazeinę ο,; a zakreskowane kolumny - w hodowlach zawierających kazeinę uległą rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG. Linie przecinające oznaczają kwartyle górny i dolny. * Statystycznie znamienne parowane porównanie z hodowlami kontrolnymi.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. Opisano sposoby wytwarzania ulepszonego hydrolizatu, jak również doświadczenia wykazujące korzystne działanie terapeutyczne obserwowane w niniejszych badaniach.

Część doświadczalna

Przykład 1

Supresja proliferacji limfocytów in vitro przez kazeiny bydlęce hydrolizowane enzymami pochodzącymi z Lactobacillus GG

La. Hydroliza białek mleka krowiego

Z mleka krowiego oczyszczono całkowitą kazeinę bydlęcą i komponenty kazeiny (kazeinę c,) (Syvaoja, 1992). Hydrolizę mieszaniną enzymów pochodzących z Lactobacillus GG zastosowano oddzielnie do kazeiny i kazeiny C, ,. Enzymy izolowano zmodyfikowanym sposobem Exterkate i de Veer, 1985. Pokrótce, enzymy uwolniono poprzez sonikację zamrożonych komórek bakteryjnych. Oddzielono nadsącz odwirowanych komórek i zastosowano go do hydrolizy kazeiny i kazeiny c,,. Hydrolizę prowadzono przez 24 godziny w temperaturze 34°C.

Tak wytworzone hydrolizaty GG poddawano dalszej hydrolizie pepsyną i trypsyną. Pokrótce, próbki poddawano hydrolizie najpierw 0,1% pepsyną w 0,1 mol/1 HCl przez 3 godziny w temperaturze 37°C, pH 2,5. Po wyrównaniu pH 250 mg NaHCO₃ i 2 mol/l NaOH, do próbek dodano 0,1% trypsynę i całość hydrolizowano przez 5 godzin w temperaturze 37°C, pH 8,0.

Próbki kazeiny P/T i kazeiny c,, P/T wytworzono poprzez hydrolizę oczyszczonej kazeiny i kazeiny C, , tylko pepsyną trypsyną, jak to opisano powyżej, bez hydrolizy GG.

185 123

1.b. Test transformacji limfocytów

Zastosowano modyfikację mikrometody do krwi pełnej do pobudzonej mitogenem transformacji limfocytów. W każdym doświadczeniu uczestniczyło, jako dawcy krwi, 6-8 zdrowych ochotników; Pokrótce, uzyskano heparynizowaną krew żylnąi rozcieńczono ją stosunku 1:7 pożywkąhodowlanąRPMI 1640 (Grand Island Biological Co., NY, Stany Zjednoczone), zawierającą antybiotyki. Stosując RPMI 1640 zawierającą antybiotyki dokonano rozcieńczenia fitohemaglutyniny (PHA) (Difco Laboratories Detroit, Mich., Stany Zjednoczone) do uzyskania końcowego stężenia wynoszącego 0,1 pg/ml (niskie), 10 pg/ml (średnie) i 1000 Emug/ml (wysokie), co do których udowodniono nietoksyczność dla komórek T w testach ekskluzj i barwnika, z użyciem eozyny.

Przeprowadzono dwie serie doświadczeń w celu zbadania pobudzanych mitogenami odpowiedzi proliferacyjnych komórekjednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na (A) kazeinę hydrolizo wanąpepsytąi trypsyną(= kazeina ος, P/T), (B) kazeinę o© hydrolizowanąpepsyną i trypsyną (- kazeina P/T), (C) kazeinę P/T dodatkowo hydrolizowaną enzymami pochodzącymi z Lactobacillus GG, i (D) kazeinę ©j P/T dodatkowo hydrolizowaną enzymami chodzącymi z Lactobacillus GG.

Doświadczenie składało się z czterech hodowli kontrolnych z różnym rozcieńczeniem pożywki hodowlanej i mitogenu, jak również z odpowiadających hodowli testowych z 25 pl produktów hydrolizy w trzech różnych stężeniach. Test przeprowadzono tak, jak to opisali Sutas i wsp., 1996.

Pobudzaną mitogenem proliferację PBMC wyrażono jako zliczenia na minutę, po wykluczeniu tła. Przedstawiono wyniki dla hodowli kontrolnych zawierających 125 pg/ml PHA i RPMI 1640 i dla trzech hodowli testowych zawierających 125 pg/ml PHA i produkty hydrolizy w stężeniu niskim, średnim i wysokim.

.c. Analiza statystyczna

W celu porównania zmiany wartości zliczeń na minutę każdej z hodowli testowych z wartościami dla hodowli kontrolnych zastosowano test nieparametryczny parzysty (test oznaczonych szeregów Wilcoxona). Poziom znamienności wynosił p <0,05. Znamienne wyniki porównań parzystych przedstawiono jako hamowanie lub pobudzenie zależnie od spadku lub wzrostu wartości zliczeń na minutę w hodowli testowej.

.d. Wyniki

W doświadczeniach przeprowadzonych z kazeiną P/T i kazeiną CĘj P/T poddanych dodatkowej hydrolizie enzymami pochodzącymi z Lactobacillus GG stwierdzono istotne hamowanie pobudzanej mitogenem proliferacji PbMc w 0,1,10 i 1000 pg/ml (p=0,03,p=0,03 i p=0,03) (Fig. 1C i ID) w porównaniu z kazeiną P/T i kazeinąo,i (Fig· 1A i 1B).

Przykład 2

Leczenie niemowląt z atopowym zapaleniem skóry mieszanką z hydrolizatem białkowym uzupełnioną bakteriami kwasu mlekowego

2.a. Pacjenci i plan badania

Badanie obejmowało 31 niemowląt, w wieku 2,5-15,7 miesięcy (średni wiek 8 miesięcy), spełniających kryteria Hanifina (Hanifin, 1987) wyprysku atopowego u dzinci· Niemowlęta zostały skierowane do kliniki pediatrycznej z powodu wyprysku atopowego i podejrzenia alergii na mleko krowie. Średni wiek wystąpienia pierwszych objawów wynosił 2,4 miesiąca. Całkowity czas trwania karmienia piersią wynosił 5,9 miesiąca. U 26 (84%) chorych stwierdzano w wywiadzie rodzinnym występowanie chorób atopowych (dychawica oskrzelowa, wyprysk alergiczny i alergiczny nieżyt nosa) lub alergii pokarmowej u krewnych pierwszego stopnia. Zmiany alergiczne na skórze leczono środkami zmiękczającymi i kortykosteroidami o działaniu miejscowym. Żadne z dzieci nie otrzymywało kortykosteroidów ogólnie. U 9 (19%) chorych oprócz wyprysku alergicznego występowały zaburzenia żołądkowo-jelitowe, takie jak luźne stolce, wymioty lub biegunka. Po okresie badania chorych przydzielono do podwójnie ślepej, kontrolowanej placebo próby narażenia na działanie mleka krowiego. Do ostatecznej populacji badanej włączono tylko tych chorych, u których wystąpiła reakcja dodatnia (27/31). Chorych dobierano losowo do

185 123 dwóch grup najeden miesiąc. Jedna grupa (WF, n=14) otrzymywała intensywnie hydrolizowaną mieszankę serwatkową (Valio Ltd, Helsinki, Finlandia, EP-A-601802), a grupa druga (WF-GG, n=13) otrzymywała tę samą mieszankę z dodatkiem preparatu Lactobacillus GG (5x10⁸ cfu/g) (dostarczonego przez Valio Ltd, Helsinki, Finlandia). Po jednomiesięcznym leczeniu każdej z grup przydzielonym jej rodzajem mieszanki obu grupom podawano intensywnie hydrolizowaną mieszankę serwatkową (Valio Ltd) przez jeszcze jeden miesiąc. U wszystkich chorych przed zmianą diety oznaczono całkowite IgE w surowicy, IgE skierowane swoiście przeciwko mleku krowiemu (RAST, Pharmacia, Uppsala, Szwecja) i wykonano testy skórne. Testy skórne wykonano na wewnętrznej stronie przedramienia, stosując dostępny w handlu alergen mleka krowiego ALK (Allergologisk Laboratorium, Horsholm, Dania) i mieszankę testową rozcieńczoną do prawidłowego stężenia pokarmowego. Stosowano jednoostrzowy lancet z grzebieniem ochronnym zapobiegającym głębszej penetracji (ALK), przy czym jako kontrolę dodatnią stosowano 10 mg na mililitr dichlorowodorku histaminy (ALK). Po 15 minutach odczytywano reakcję; jako dodatnią odnotowywano odpowiedź o wielkości równej, co najmniej połowie wielkości dla histaminy, pod warunkiem, że średnia średnica bąbla wynosiła co najmniej 3 mm, a kontroli ujemnej w tym samym czasie - 0 mm.

Przed rozpoczęciem leczenia oraz po 1 miesiącu (co odpowiada okresowi badania) i 2 miesiącach pobrano próbki kału dla oznaczenia antytrypsyny α-l i TNF-α.

Nasilenie atopowego zapalenia skóry oceniano w punktach metodą SCORAD, zatwierdzonąprzez Europejską Grupę Roboczą d.s. Atopowego Zapalenia Skóry (1993). Pokrótce, oceniano wielkość obszaru zajętego przez zapalenie skóry (wartość A) stosując regułę dziewiątek. Intensywność zapalenia skóry (wartość B) stanowiła sumę punktacji (0-3) rumienia, obrzęku i/lub grudek, zadrapań naskórka, liszajowacenia i suchości. Objawy subiektywne (wartość C) (1-10 punktów), w tym świąd i skrócenie czasu snu, punktowano według oceny rodziców. SCORAD otrzymano obliczając: A/5+3.5xB+C.

Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Szpitala Uniwersyteckiego w Tampere. Od rodziców uzyskano świadomą zgodę na udział ich dzieci w badaniu.

2.b. Oznaczenie antytrypsyny α-1 w próbkach kału

W temperaturze pokojowej rozmrożono zamrożone próbki kału i dokonano ich homogenizacji. Około 1 gprzeniesiono do rurki szklanej i poddano liofilizacji. Powstałą substancję suchą utarto na proszek i 50 mg przeniesiono do rurki Eppendorfa. Dodano 1ml 0,15 M roztworu NaCl i wyekstrahowano antytrypsynę α-1 poprzez energiczne mieszanie w mieszaczu Vortex przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Powstałą zawiesinę odwirowano przy 25000 g przez 10 minut dla usunięcia resztek, i nadsącz zastosowano do oznaczenia antytrypsyny α-1 w nefelometrze Behring BNA według instrukcji producenta. Wyniki podano jako mg/g suchej masy liofilizowanego kału.

2.c. Oznaczenie TNF-α w próbkach kału

W temperaturze pokojowej rozmrożono głęboko zamrożone próbki kału, zawieszono je w stosunku 1:1 (stężenie masowe) w soli fizjologicznej i pozostawiono do sedymentacji. 0,5-1,0 ml nadsączu przeniesiono do rurki Eppendorfa i odwirowano przy 25000 g przez 10 minut. Nadsącz zastosowano następnie do oznaczenia TNF-α. Do oznaczenia TNF-α w kale zastosowano dostępny w handlu immunotest enzymatyczny (Human TNF-α ELISA Kit, Endogen Inc., Boston, Massachusetts, Stany Zjednoczone), według instrukcji dla próbek surowicy.

2.d. Statystyka

Z powodu skośnej dystrybucji stężenia IgE w surowicy zastosowano transformację logarytmiczną (ln) i dane przedstawiono jako średniąz 95% przedziałem ufności (CI). Stężenie parametrów zapalnych przedstawiono z medianami z dolnym i górnym kwartylem. Do porównań statystycznych zastosowano test oznaczonych szeregów Wilcoxona i U-test Manna-Whitneya.

2.e. Wyniki

2.e.l Dane kliniczne

U chorych otrzymujących mieszankę z hydrolizatem średni (95% CI) poziom całkowitej IgE w surowicy wynosił 31 (15-61) kU/1. U 10/31 (37%) chorych z wypryskiem alergicznym

185 123

RAST dla mleka krowiego był dodatni (> 0,4 kU/1). U 8/31 (30%) chorych test skórny na mleko krowie był dodatni.

Na figurze 2 przedstawiono nasilenie atopowego zapalenia skóry dla poszczególnych chorych przed rozpoczęciem leczenia i miesiąc później, tzn. po okresie badania. Mediana (dolny kwartyl - górny kwartyl) wyniku SCORAD przed leczeniem wynosiła 21 (14-31) w grupie WF i 26 (17-38) w grupie WF-GG (p=0,33). Po jednym miesiącu leczenia stwierdzano istotnąpoprawę wyniku SCORAD u chorych otrzymujących Lactobacillus GG (p=0,008), natomiast poprawy takiej nie stwierdzano u chorych otrzymujących intensywnie hydrolizowanąmieszankę bez Lactobacillus GG (p=0,89). U tych chorych wynik SCORAD wynosił 19 (13-31) w grupie WF i 15 (7-28) w grupie WF-GG. Spadek wyniku SCORAD w grupie WF-GG był spowodowany zmniejszeniem zajętego obszaru (wynik A, p=0,04), intensywności (wynik B, p=0,05) i wyniku subiektywnej oceny (wynik C, p=0,01) atopowego zapalenia skóry (Fig. 2). W grupie WF poprawę wyniku SCORAD uzyskano po 2 miesiącach, natomiast w grupie WF-GG pozostał on niezmieniony po odstawieniu Lactobacillus GG. Po 2 miesiącach, mediana (dolny kwartyl - górny kwartyl) wyniku SCORAD w grupie WF wynosiła 14 (2-38), a w grupie WF-GG 16 (6-25).

2.e.2. Stężenie antytrypsyny ad i TNF-α w kale

Mediana (dolny kwartyl - górny kwartyl) stężenia antytrypsyny a-1 u zdrowych osobników kontrolnych (n=9) wynosiła 0,5 (0,5-1,7) mg/g. Pomiędzy grupami WF i WF-GG przed leczeniem stężenie antytrypsyny a-1 było porównywalne (p=0,22). Jak to wskazano w tabeli 1, w czasie miesiąca badania stężenie antytrypsyny atl istotnie spadło w grupie WF-GG (p=0,03), lecz nie w grupie WF (p=0,68). Po dwóch miesiącach stężenie antytrypsyny ad w grupie WF wynosiło 1,2 (0,5-1,6), a w grupie WF-GG 0,5 (0,5-0,7).

U zdrowych osobników kontrolnych stężenie TNF-a w kale wynosiło 0 (0-0,08 pg/g). U dzieci zatopią stężenie TNF-aw kale było znamiennie wyższe, p <0,0001 (Tabela 1). Pomiędzy grupami WF i WF-GG przed leczeniem stężenie TNF-α było porównywalne (p=0,57). W czasie miesiąca badania uzyskano zmniejszenie stężenia TNF-α w grupie WF, natomiast w grupie WF-GG, która również otrzymywała intensywnie hydrolizowaną mieszankę bez Lactobacillus GG stwierdzono trend do zwiększonego poziomu TNF-α. Stężenie TNF-α wynosiło zatem 84 (25-129) w grupie WF i 144 (20-338) w grupie WF-GG.

Tabela 1

Stężenie antytrypsyny α-1 i TNF-α w kale przed leczeniem (0) i miesiąc później (I) u niemowląt otrzymujących intensywnie hydrolizowaną mieszankę serwatkową (WF) lub tę samą mieszankę zawierającą bakterię Lactobacillus GG (WF-GG). Dane oznaczają medianę (dolny kwartyl - górny kwartyl)

	WF	WF-GG
Antytiypsynaa-1 0 (mg/g)	1,7 (1,5-2,3)	1,4 (0,5-1,9)
Antytrypsynaa-11 (mg/g)	1,7 (1,1-2,8)	0,5 (0,5-1,0)
TNF-α 0 (pg/g)	632 (126-1880)	709(91-1131)
TNF-α I (pg/g)	494 (147-1009)	34(19-103)

Przykład 3

Regulacja w dół wytwarzania cytokin przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej u dzieci z atopią

3.a. Pacjenci i metody

Badano w sumie 14 chorych w wieku 5-29 (średnio 16) miesięcy, spełniających kryteria Hanifma wyprysku alergicznego (Haniftn, 1987) i ośmioro zdrowych dzieci bez atopii, w tym samym wieku. W czasie badania żadne z dzieci nie otrzymywało kortykosteroidów ogólnie.

Płyn puchlinowy zawierający OKT3 (przeciwciało przeciwko CD3) stanowił dar dr. M. Kaartinen z Zakładu Bakteriologii i Immunologii Uniwersytetu w Helsinkach, Finlandia. Z mleka bydlęcego oczyszczono całkowitą kazeinę bydlęcą sposobem opisanym przez Syvaoja (1992). Oczyszczoną kazeinę hydrolizowano enzymami pochodzącymi z Lactobacillus GG

185 123 według opisu z przykładu 1. Oczyszczoną kazeinę lub kazeinę uległą rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG liofilizowano i przechowywano w temperaturze pokojowej. Przed doświadczeniami rozcieńczano je w RPMI 1640 i poddawano, wyjałowieniu filtracyjnemu (0,1 pm, Millipore Corporation, Bedford, MA, Stany Zjednoczone).

Pełna pożywka hodowlana składała się z RPMI 1640 z 10% płodową surowicą cielęcą, 10 mM bufora Hepes, 2 mM L-glutaminy (Gibco Life Technologies, Paisley, Wielka Brytania), 50 U/ml benzylopenicyliny (Sigma, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone), 10 mg/ml gentamycyny (Roussel Laboratories Ltd, Uxbridge, Middlesex, Wielka Brytania). Pobrano próbki żylnej krwi obwodowej (5 ml). Izolowano PBMC zawierające 90% komórek limfatycznych poprzez odwirowanie gradientowe FicollPaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja) i zawieszono je w stężeniu 1 x 10⁶komórek w pełnej pożywce hodowlanej. Zagłębienia do hodowli poddano wstępnemu opłaszczeniu przez płyn puchlinowy zawierający przeciwciała anty-CD3 w uprzednio oznaczonym optymalnym rozcieńczeniu. Pożywka hodowlana zawierała dodatkowo rozcieńczenie kazeiny lub kazeiny uległej rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG w ostatecznym stężeniu 1 mg/ml. Doświadczenia te powtórzono dla oczyszczonej bydlęcej kazeiny Oj! lub kazeiny 0(, uległej rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG. Po 24 godzinach inkubacji w nawilżanej 5% atmosferze CO₂ w temperaturze 37°C zebrano nadsącze i przechowywano je w temperaturze -70°C do testów cytokinowych. W nadsączach z hodowli oznaczono poziom IL-4 i IFN-γ za pomocą dostępnych w handlu zestawów ELISA, według instrukcji producenta (IL-4: CLB, Compact Human Interleukin-4 ELISAkit, Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Holandia; IFN-γ, EIFNG, Endogen Inc., Cambridge, MA, Stany Zjednoczone). Za pomocą porównania krzywych standardowych dokonano wyrównania wyników z poszczególnych serii doświadczeń i wyrażono je w pg/ml. Czułość testów wynosiła 2,3 pg/ml dla IL-4 i 5 pg/ml dla IFN-γ. Do statystycznego porównania hodowli badanych z hodowlami kontrolnymi zastosowano test oznaczonych szeregów Wilcoxona. Poziomznamienności wynosiłp<0,05.

3.b. Wyniki

U chorych z atopią w hodowlach zawierających oczyszczoną kazeinę w porównaniu z hodowlami kontrolnymi stwierdzano zwiększenie wytwarzania zarówno IL-4, jak i IFN-γ; odpowiednio, p=0,008 i p=0,008 (Fig. 3a, b). Przy spowodowaniu rozpadu enzymami Lactobacillus GG nie stwierdzano takiego działania kazeiny bydlęcej. Przeciwnie, wytwarzanie IL-4 w hodowlach zawierających kazeinę uległą rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG było znamiennie nmiejsze, niż w hodowlach kontrolnych, p=0,003 (Fig. 3a), a wytwarzanie IFN-γ w tych hodowlach było porównywalne z hodowlami kontrolnymi, p=0,10 (Fig. 3b).

U dzieci zdrowych wytwarzanie IL-4 i IFN-γ w hodowlach zawierających oczyszczonąkazeinę było porównywalne z hodowlami kontrolnymi, p=0,10 i p=0,10 (Fig. 3c, d). Podobnie jak w przypadku chorych z atopią, wytwarzanie IL-4 u dzieci zdrowych było znamiennie mniejsze w hodowlach zawierających kazeinę uległą rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG, niż w hodowlach kontrolnych, p=0,01 (Fig. 3c), a wytwarzanie IFN-γ w tych hodowlach pozostawało porównywalne z wytwarzaniem w hodowlach kontrolnych, p=0,50 (Fig. 3d). Podobne wyniki uzyskano dla kazeiny 0(, i kazeiny 0(, uległej rozpadowi pod wpływem Lactobacillus GG (Fig. 4).

Piśmiennictwo

European task force on atopic dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186:23-31.

Exterkate F i de Veer G. Partial isolation and degradation of caseins by cell wall proteinase (s) of Streptococcus cremoris. Appl Environ Microbiol 1985; 49:328-32.

Fargeas MJ, Theodorou V, More J, Wal JM, Fioramonti J, Bueno L. Boosted systemic immune and local responsiveness after intestinal inflammation in orally sensitized guinea pigs. Gastroenterology 1995; 109:53-62.

Hanifm JM. Epidemiology of atopic dermatitis. Monogr Allergy 1987; 21:116-131.

185 123

Isolauri E, Majamaa H, Arvola T, Rantala I, Virtanen E, Arvilommi H. Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105:1643-1650.

Majamaa H, Isolauri E. Evaluation of gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic eczema. J Allergy Clin Immunol 1996, w druku.

Majamaa H, Miettinen A, Laine S, Isolauri E. Intestinal inflammation in children with atopic eczema: faecal eosinophil cationic protein and tumor necrosis factor-α as noninvasive indicators of food allergy. Clin Exp. Allergy 1996; 26:181-187.

Sampson hA, James Mj i Bemhisel-Broadbent J. Safety of an amino acid-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 1992; 90:463-465.

Sutas Y, Soppi E, Korhonen H, Syvaoja EL, Saxelin M, Rokka T, Isolauri E. Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG derived enzymes. J Allergy Clin Immunol 1996, w druku.

Syvaoja EL. Quantitative determination of the main casein components and purification of o© - and K-casein from bovine milk. Milchwissenschaft 1992; 47:563-566.

185 123

BEZ ATOPII

Fig .4

185 123

(a) (b) '- DZIECI -¹

Z ATOPIA

Fig.3

185 123

Fig . 2

WYNIK · A

GRUPA WF

GRUPA WF-GG

185 123 cpm

1C cpm

1D

120 000

100 000-80 000'

000

000'

000

Fig'. 1C - 1D

125 000

100 000 -t²

-^W3—

4®*5 e³“ *

4^3

000-- ^w5

000

U

3^W5

000-6®®4

000

PHA+

RPMI

1640

1-1 I-1

PHA+ PHA+ PHA+

0,1 pg/ml 10 pg/ml 1000 pg/ml i-kazeina-1

I_I

PHA+

RPMI

1640

0,1 pg/ml 10 pg/ml 1000 pg/ml

KAZEINAcZ_gl

185 123 cpm

1A

120 000'

100 000 -80 000-60 000

000 ₁OO₂ °3 _04_

O₅O₆ °7

Oo

O, O, o₃ _t02 o₅ o₆ °7 o₈

Ol θθ

O„

Mb

O,

--R

6/ o„

000 o-L-e

J L.

cpm

1B

O₂

1C8?

-O₅O₆ θ8⁷

Fig .

1A - 1B

PHA+ PHA+ PHA+ PHA+ RPMI 0,1 pg/ml 10 pg/ml 1000 pg/ml 1640 .

KAZEINAPHA+ PHA+ PHA+ PHA+ RPMI 0,1 pg/ml 10 pg/ml 1000 pg/ml

1640 , , .

¹-KAZEINA c<_sl-¹

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4.00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu białkowego do regulacji w dół reakcji nadwrażliwości i do poprawy czynności jelitowej bariery immunologicznej, znamienny tym, że białka hydrolizuje się za pomocą enzymów pochodzących z preparatu bakteryjnego, zawierającego szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103) i trypsynę i/lub pepsynę.
2. Sposób wytwarzania mieszanki hydrolizatu białkowego do regulacji w dół reakcji nadwrażliwości i do poprawy czynności jelitowej bariery immunologicznej, znamienny tym, że białka hydrolizuje się pepsyną i/lub trypsynąi do hydrolizatu dodaje się preparat bakteryjny zawierający szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103).
3. Zastosowanie mieszanki hydrolizatu białkowego wytworzonego na drodze hydrolizy białka za pomocąenzymów pochodzących z preparatu bakteryjnego, zawierającego szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103) i trypsynę i/lub pepsynę albo na drodze hydrolizy białka pepsyną i/lub trypsyną, do którego to hydrolizatu dodano preparat bakteryjny zawierający szczep Lactobacillus GG (ATCC 53103), do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia spowodowanych pokarmem reakcji nadwrażliwości u niemowlęcia.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że reakcją nadwrażliwości u niemowlęcia jest alergia na mleko krowie.
5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wytwarzanym lekiem jest lek do podawania doustnego do wzmacniania wywołujących tolerancję odpowiedzi immunologicznych na antygeny pokarmowe u chorego.