RU2174012C2 - Способы профилактики или лечения аллергии - Google Patents
Способы профилактики или лечения аллергииInfo
- Publication number
- RU2174012C2 RU2174012C2 RU98100444A RU98100444A RU2174012C2 RU 2174012 C2 RU2174012 C2 RU 2174012C2 RU 98100444 A RU98100444 A RU 98100444A RU 98100444 A RU98100444 A RU 98100444A RU 2174012 C2 RU2174012 C2 RU 2174012C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lactobacillus
- atcc
- protein hydrolyzate
- treatment
- colonizing
- Prior art date
Links
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims description 30
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 title abstract 8
- 201000005794 allergic hypersensitivity disease Diseases 0.000 title 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 98
- 229940039696 Lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 98
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 60
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims abstract description 54
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000000529 probiotic Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims abstract description 40
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims abstract description 34
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 28
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 18
- 201000010859 milk allergy Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 claims abstract 14
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 28
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims description 28
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims description 28
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 22
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 claims description 22
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 claims description 14
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 claims description 8
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 claims description 6
- 230000002496 gastric Effects 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 abstract description 44
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 230000000172 allergic Effects 0.000 abstract description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 2
- 230000001747 exhibiting Effects 0.000 abstract 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 110
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 98
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 98
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 98
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 80
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 32
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 description 32
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 32
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 30
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 20
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 20
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 20
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 20
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 18
- 229940024142 alpha 1-Antitrypsin Drugs 0.000 description 18
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 18
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 108090001124 Immunoglobulin E Proteins 0.000 description 14
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 14
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 14
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 101700001948 F2R Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 12
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 10
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002609 media Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 8
- 108090001122 Immunoglobulin A Proteins 0.000 description 8
- 210000004347 Intestinal Mucosa Anatomy 0.000 description 8
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 8
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 6
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 6
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 6
- 230000002009 allergen Effects 0.000 description 6
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 6
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 6
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 6
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 6
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 6
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 4
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 4
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 4
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 210000003567 Ascitic Fluid Anatomy 0.000 description 4
- 229940064701 Corticosteroid nasal preparations for topical use Drugs 0.000 description 4
- 229960001334 Corticosteroids Drugs 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920000903 Polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 4
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 4
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 4
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N [(1R)-1-phenylethyl] N-(2-aminoethyl)-N-[(3-methoxy-4-phenylmethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound C1([C@@H](C)OC(=O)N(CCN)CC=2C=C(C(=CC=2)OCC=2C=CC=CC=2)OC)=CC=CC=C1 URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 4
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 4
- 201000004624 dermatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000406 dermatitis Toxicity 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 4
- 230000001235 sensitizing Effects 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 229940083878 topical for treatment of hemorrhoids and anal fissures Corticosteroids Drugs 0.000 description 4
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 4
- 206010000059 Abdominal discomfort Diseases 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000006673 Asthma Diseases 0.000 description 2
- 206010052737 Atopic disease Diseases 0.000 description 2
- 229940021722 Caseins Drugs 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 206010049796 Excoriation Diseases 0.000 description 2
- 210000000245 Forearm Anatomy 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004931 Histamine Dihydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N Histamine dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NCCC1=CN=CN1 PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940099472 Immunoglobulin A Drugs 0.000 description 2
- 206010022437 Insomnia Diseases 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 229940028885 Interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 2
- 206010024438 Lichenification Diseases 0.000 description 2
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 2
- 208000009793 Milk Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 210000004251 Milk, Human Anatomy 0.000 description 2
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108090000393 Muromonab-CD3 Proteins 0.000 description 2
- 101700083447 OCT3 Proteins 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 description 2
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 210000003819 Peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 2
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 2
- 101710019780 SLC22A3 Proteins 0.000 description 2
- 102100017016 SLC22A3 Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 2
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 201000008286 diarrhea Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 235000020883 elimination diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 2
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 2
- 230000002550 fecal Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 200000000028 growth disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000002443 helper T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 2
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 2
- 230000004605 intestinal mucosal barrier Effects 0.000 description 2
- 230000003870 intestinal permeability Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006213 negative regulation of lymphocyte proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000474 nursing Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 230000024833 regulation of cytokine production Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 2
Images
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способов получения белкового гидролизата подавляющей регуляции аллергических реакций, способов профилактики или лечения аллергии. Сущность изобретения включает способы получения белкового гидролизата посредством гидролиза белков ферментами, выделяемыми из бактериальных препаратов, содержащих пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протезную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103) пепсином и/или трипсином, а также получение белкового гидролизата, включающей гидролиз белков пепсином и/или трипсином и добавления в гидролизат бактериального препарата, содержащего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, имеющие вышеуказанные характеристики штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103), а также способы профилактики и лечения вызванных пищей аллергических реакций у грудного ребенка, лечения аллергии к коровьему молоку у пациента, стимуляции, вызывающих иммунологическую толерантность иммунных реакций с использованием полученного белкового гидролизата. Технический результат заключается в усилении активности целевого продукта и повышении эффективности лечения. 5 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.
Description
Изобретение относится к способам и средствам подавления вызванных пищевыми продуктами аллергических реакций у пациентов, страдающих пищевой аллергией. В частности, изобретение предоставляет способы профилактики или лечение аллергии, особенно аллергии к коровьему молоку у детей грудного возраста. Изобретение также относится к разработке специальных композиций для страдающих аллергией детей грудного возраста с нарушенной барьерной функцией кишечника.
Аллергия к коровьему молоку (АКМ) определяется как иммунологически опосредованная неблагоприятная реакция на белки коровьего молока. В настоящее время способом лечения выбора является полное устранение антигенов коровьего молока. Когда нет материнского молока, у детей грудного возраста с АКМ необходимо использовать замещающую композицию. Гидролизованные композиции, основанные на сыворотке или казеине, полученных из коровьего молока, используются для обеспечения адекватного питания со сниженной антигенной нагрузкой. Предварительная тепловая обработка коровьего молока главным образом воздействует на конформацию белков и облегчает их гидролиз. Последующий ферментативный гидролиз пепсином, трипсином, экстрактами поджелудочной железы и экстрактами из слизистой оболочки кишечника вызывает прогрессирующее разрушение последовательных эпитопов и очищает композиции в минимально антигенную и аллергенную форму.
В большинстве случаев экстенсивно гидролизованные композиции, полученные из коровьего молока, могут безопасно внедряться в практику, и они эффективны, а также хорошо переносятся клинически и метаболически. Однако ферментативный гидролиз необязательно делает композицию неаллергенной, поскольку оптимальная степень гидролиза неизвестна, и в гидролизате выявляются следы исходного белка. Поэтому назначание этих заменителей детям с аллергией к коровьему молоку должно производиться с осторожностью.
До сих пор, подход к прекращению аллергического воспаления с помощью устранения антигена был неудовлетворительным, особенно у пациентов с множественной пищевой аллергией (Sampson et al., 1992). У этих пациентов часто выявляется повышенная кишечная проницаемость и нарушение защитной барьерной функции кишечника (Majamaa et al., 1996, Majamaa and Isolauri, 1996). Это усиливает опасность нарушений роста и сенсибилизации к множеству продуктов питания. Срочно необходимы новые подходы к лечению аллергии к коровьему молоку для улучшения заместительных композиций при АКМ.
Обработка антигена в кишечнике определяет последующую иммунную реакцию на антиген. В норме антигены всасываются через эпителий по двум функциональным путям. Главный путь представляет собой деградационное снижение иммуногенности антигена. Второстепенный путь обеспечивает возможность транспорта интактных белков, что имеет принципиальное значение для антиген-специфических иммунных реакций. Аберрантное всасывание антигена усиливает процесс сенсибилизации (Fargeas et al., 1995).
Дифференциальная выработка цитокинов Т-хелперными (Th) клетками во время иммунной реакции оказывает важное регулирующее влияние на природу иммунного ответа. Цитокиновый профиль естественного иммунного ответа определяет фенотип последующего иммунного ответа. Кроме регуляции синтеза lgE, IL4 играет ключевую роль для развития и созревания фенотипа Th2, характерного для аллергического воспаления.
Как оказывается, этот процесс является ключевым для развития устойчивости к поступившему с пищей белку. Устойчивость при пероральном поступлении представляет собой состояние антиген-специфической системной ареактивности, характеризуемой местной антиген-специфической реакцией IgA.
Недавно было показано, что выделенный из кишечника человека штамм Lactobacillus штамм GG (Lactobacillus GG, АТСС 53103), стимулирует местные реакции IgA против пищевых антигенов, встречаемых при энтеральном прохождении и могут поэтому помогать при иммунной ликвидации (Isolauri et al., 1993). В настоящее время пока не известно, могут ли конкретные штаммы кишечных бактерий непосредственно изменять иммуногенность пищевых антигенов и, следовательно, подавлять аллергические реакции.
Молочные бактерии включены в микробную флору здорового кишечника. Было высказано предположение, что молочные бактерии действуют в кишечном тракте путем конкуренции с патогенными микробами на слизистой оболочке кишечника за рецепторы и питательные вещества.
Пробиотики представляют собой ценные микробные препараты, которые укрепляют здоровье путем сохранения естественной микрофлоры в кишечнике. Микробные препараты могут быть признаны как пробиотические, если известны их функционирующие микробы и механизм их действия. Пробиотики прикрепляются на слизистой оболочке кишечника, образуют колонии в кишечном тракте человека и предотвращают прикрепление вредных микробов. Ключевое предположение состоит в том, что они попадают в слизистую оболочку верхних отделов кишечника и не разрушаются в верхней части желудочно-кишечного тракта.
Lactobacillus GG представляет собой одну из известных бактерий, имеющих пробиотические характеристики.
Описание изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что определенные бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности Lactobacillus, и особенно бактерии, имеющие пробиотические характеристики, могут использоваться для повышения эффективности элиминационной диеты и для повышения устойчивости при пероральном поступлении, при профилактике или лечении пищевых аллергических реакций у пациента.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что определенные бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности Lactobacillus, и особенно бактерии, имеющие пробиотические характеристики, могут использоваться для повышения эффективности элиминационной диеты и для повышения устойчивости при пероральном поступлении, при профилактике или лечении пищевых аллергических реакций у пациента.
Один аспект изобретения состоит в том, что для указанной цели могут также использоваться белковые гидролизаты, полученные с помощью гидролиза указанных выше бактерий желудочно-кишечного тракта. Мы показываем здесь, что гидролизаты белка, полученные в соответствии с этим изобретением, оказывают иммунологическое воздействие, способствующее гипоаллергенности. Гидролизаты оказывают подавляющее регулирующее влияние на аллергические реакции, способствуя таким образом барьерной функции кишечника, т.е., стабилизируя барьер слизистой оболочки кишечника.
Настоящее изобретение предоставляет усовершенствованную композицию гидролизата белка, оказывающую подавляющее регулирующее влияние на аллергические реакции и способствующую иммунной барьерной функции кишечника. Композицию гидролизата можно получить с помощью гидролиза белков ферментами, полученными из пробиотических бактерий желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103), и трипсином и/или пепсином.
Альтернативно, композиция белкового гидролизата изобретения может быть получена с помощью гидролиза белков трипсином и/или пепсином и добавления в полученный таким образом гидролизат бактериального препарата, включающего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (ATCC 53103). Бактерии добавляются в композицию гидролизата предпочтительно в виде лиофилизированного препарата.
При введении такой композиции гидролизата пациенту следует ожидать, что in vivo будут высвобождаться гидролизирующие ферменты присутствующих бактерий, посредством чего достигается такой же эффект, как с помощью определенной выше усовершенствованной композиции гидролизата. Кроме того, жизнеспособные бактерии стабилизируют барьер слизистой оболочки кишечника, усиливая местную защиту.
Один из вариантов реализации данного изобретения представляет собой способ профилактики или лечения вызванных пищей аллергических реакций у грудного ребенка, причем этот способ включает этап введения грудному ребенку с риском развития такой реакции усовершенствованной композиции белкового гидролизата изобретения или, альтернативно, композиции белкового гидролизата вместе с бактериальным препаратом, включающим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103).
Еще одним вариантом реализации этого изобретения является способ лечения аллергии к коровьему молоку у пациента, включающий пероральное введение пациенту усовершенствованной композиции белкового гидролизата изобретения или, альтернативно, введение композиции белкового гидролизата вместе с бактериальным препаратом, включающим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103).
Изобретение также предоставляет способ стимуляции вызывающих иммунологическую толерантность иммунных реакций на пищевые антигены у пациента, включающий оральное введение усовершенствованной композиции белкового гидролизата изобретения пациенту или, альтернативно, бактериального препарата, включающего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103 или, альтернативно, композиции белкового гидролизата вместе с бактериальным препаратом, включающим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС СС 53103).
Когда в определенных выше способах изобретения композиция белкового гидролизата используется в комбинации с выбранными пробиотическими бактериями как определено выше, такая композиция может быть любой подходящей известно или новой композицией белкового гидролизата. Поэтому она может быть или частичным белковым гидролизатом, или, альтернативно, экстенсивно гидролизованной композицией. Препарат белкового гидролизата, подходящий для этой цепи, раскрыт, например, в заявке на патент ЕР N 601802.
Предпочтительной бактерией для использования в композициях и способах изобретения является Lactobacillus GG (АТСС 53103).
В этом описании и в прилагаемой формуле изобретения фразу "бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103)" следует понимать как определяющую бактерии, чьи адгезионные и колонизирующие характеристики сравнимы с таковыми штамма LGG, например, как определено в патенте ЕР 199535. Предполагается, что эти бактерии имеют такой же вид ферментной системы как LGG, что значит, что ферменты, полученные из таких бактерий, способны разлагать белки для выработки продуктов гидролиза с такими же эффектами, как эффекты продуктов, полученных с использованием ферментов, полученных из LGG.
Сокращения
ДИ - доверительный интервал
IFN-γ - γ-интерферон
IgA - Иммуноглобулин А
IgE - Иммуноглобулин E
IL-4 - Интерлейкин-4
LGG - Lactobacillus GG (ATCC 53103)
OKT3 - антитело против CD3
МПКК - мононуклеарные клетки периферической крови
TNF-α - фактор некроза опухоли α
WF - испытуемая группа, получающая экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию
WF-GG - испытуемая группа, получающая экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию и препарат LGG
П/Т-казеин = казеин, гидролизованный пепсином и трипсином
П/Т-αs1-казеин = αs1-казеин, гидролизованный пепсином и трипсином
Краткое описание чертежей
Фиг. 1A-1D. Вызванные митогеном пролиферативные реакции МКПК in vitro на П/Т-казеин = (1A), П/T-αs1-казеин (1B), П/Т-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из LGG (1С) и П/Т-αs1-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из LGG (ID). Результаты выражены в виде среднего количества в минуту для культур без гидролизованного продукта (PHA-RPMI 1640) и с гидролизованным продуктом при трех концентрациях (0,10 и 1000 мкг/мл). Горизонтальные линии представляют геометрическую среднюю величину количеств в минуту по шести экспериментам, одинаково рассчитанную для каждого индивидуума.
ДИ - доверительный интервал
IFN-γ - γ-интерферон
IgA - Иммуноглобулин А
IgE - Иммуноглобулин E
IL-4 - Интерлейкин-4
LGG - Lactobacillus GG (ATCC 53103)
OKT3 - антитело против CD3
МПКК - мононуклеарные клетки периферической крови
TNF-α - фактор некроза опухоли α
WF - испытуемая группа, получающая экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию
WF-GG - испытуемая группа, получающая экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию и препарат LGG
П/Т-казеин = казеин, гидролизованный пепсином и трипсином
П/Т-αs1-казеин = αs1-казеин, гидролизованный пепсином и трипсином
Краткое описание чертежей
Фиг. 1A-1D. Вызванные митогеном пролиферативные реакции МКПК in vitro на П/Т-казеин = (1A), П/T-αs1-казеин (1B), П/Т-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из LGG (1С) и П/Т-αs1-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из LGG (ID). Результаты выражены в виде среднего количества в минуту для культур без гидролизованного продукта (PHA-RPMI 1640) и с гидролизованным продуктом при трех концентрациях (0,10 и 1000 мкг/мл). Горизонтальные линии представляют геометрическую среднюю величину количеств в минуту по шести экспериментам, одинаково рассчитанную для каждого индивидуума.
Фиг. 2. Клиническая балльная оценка атопического дерматита (SCORAD) у каждого пациента и медиана балльной оценки для степени (А), интенсивности (В) и субъективной балльной оценки (С) атопического дерматита перед лечением (О) и через один месяц (Т) у грудных детей, получающих экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию без Lactobacillus GG (WF) или такую же композицию с Lactobacillus GG (WF-GG).
Фиг. 3. Влияние казеина и казеина после разложения под действием Lactobacillus GG на выработку IL-4 и IFN-γ МКПК у пациентов с атопией (а, b) и у не страдающих атопией здоровых детей (с, d). Белые столбики представляют медиану выработки цитокина в контрольных культурах; черные столбики - в культурах, содержащих очищенный казеин; в заштрихованные столбики - в культурах, содержащих казеин после разложения под действием Lactobacillus GG. Взаимно пересекающиеся линии представляют верхние и нижние квартили. Статистически достоверное попарное сравнение с контрольными культурами.
Фиг. 4. Влияние αs1-казеина и αs1-казеина после разложения под действием Lactobacillus GG на выработку IL-4 и IFN-γ МКПК у пациентов с атопией (а, b) и у не страдающих атопией здоровых детей (с, d). Белые столбики представляют медиану выработки цитокина в контрольных культурах; черные столбики - в культурах, содержащих очищенный αs1-казеин; и заштрихованные столбики - в культурах, содержащих αs1-казеин после разложения под действием Lactobacillus GG. Взаимно пересекающиеся линии представляют верхние и нижние квартили. Статистически достоверное попарное сравнение с контрольными культурами.
Следующие примеры далее иллюстрируют изобретение. Описаны способы получения усовершенствованного гидролизата, а также эксперименты, показывающие благоприятный терапевтический эффект, наблюдающийся в настоящих исследованиях.
Экспериментальные исследования
Пример 1. Подавление пролиферации лимфоцитов in vitro бычьими казеинами, гидролизованными ферментами, полученными из Lactobacillus GG.
Пример 1. Подавление пролиферации лимфоцитов in vitro бычьими казеинами, гидролизованными ферментами, полученными из Lactobacillus GG.
1a. Гидролиз белков коровьего молока
Общий казеин и компоненты казеина (αs1-казеин) очищали из коровьего молока (Syvaoja, 1992). Гидролиз ферментной смесью, полученной из Lactobacillus GG, применялся отдельно для казеина и αs1-казеина. Ферменты выделяли с использованием модифицированного способа Exterkate и de Veer, 1985. Вкратце, ферменты высвобождались с помощью обработки ультразвуком замороженных бактериальных клеток. Надосадочную жидкость центрифугированных клеток отделяли и использовали для гидролиза казеина и αs1-казеина. Гидролиз проводили в течение 24 ч при 34oC.
Общий казеин и компоненты казеина (αs1-казеин) очищали из коровьего молока (Syvaoja, 1992). Гидролиз ферментной смесью, полученной из Lactobacillus GG, применялся отдельно для казеина и αs1-казеина. Ферменты выделяли с использованием модифицированного способа Exterkate и de Veer, 1985. Вкратце, ферменты высвобождались с помощью обработки ультразвуком замороженных бактериальных клеток. Надосадочную жидкость центрифугированных клеток отделяли и использовали для гидролиза казеина и αs1-казеина. Гидролиз проводили в течение 24 ч при 34oC.
Полученные таким образом гидролизаты GG далее подвергали гидролизу пепсином и трипсином. Вкратце, сначала образцы подвергали гидролизу с использованием 0,1% пепсина в 0,1 моль/л HCl в течение 3 часов при 37oC, pH 2,5. После доводки pH с помощью 250 мг NaHCO3 и 2 моль/л NaOH в образцы добавляли 0,1% трипсин, и их подвергали гидролизу в течение 5 часов при 37oC, pH 8,0.
Образцы П/Т-казеина и П/Т-αs1-казеина получали как описано выше только с использованием пепсина и трипсина с помощью гидролиза очищенного казеина и αs1-казеина без гидролиза GG.
1.b. Тест трансформации лимфоцитов
Использовали модификацию микрометода определения вызванной митогеном трансформации лимфоцитов цельной крови. В качестве доноров крови для эксперимента использовали от шести до восьми здоровых лиц-добровольцев. Вкратце, гепаринизированную венозную кровь получали и разводили 1:7 питательной среды RPM1 1640 (Grand Island Biological CO. NY, USA), содержащей антибиотики. Фитогемагглютинин (ФГГА) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) разводили RPM1 1640, содержащей антибиотики с диапазонами конечных концентраций в культурах от 5 до 1250 мкг/мл. Лиофилизированные гидролизаты казеина и αs1-казеина разводили в RPM1 1640 до их конечных концентраций 0,1 мкг/мл (низкая), 10 мкг/мл (средняя) и 1000 мкг/мл (высокая) как доказано нетоксических для Т клеток в исследованиях исключения красителя с эозином.
Использовали модификацию микрометода определения вызванной митогеном трансформации лимфоцитов цельной крови. В качестве доноров крови для эксперимента использовали от шести до восьми здоровых лиц-добровольцев. Вкратце, гепаринизированную венозную кровь получали и разводили 1:7 питательной среды RPM1 1640 (Grand Island Biological CO. NY, USA), содержащей антибиотики. Фитогемагглютинин (ФГГА) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) разводили RPM1 1640, содержащей антибиотики с диапазонами конечных концентраций в культурах от 5 до 1250 мкг/мл. Лиофилизированные гидролизаты казеина и αs1-казеина разводили в RPM1 1640 до их конечных концентраций 0,1 мкг/мл (низкая), 10 мкг/мл (средняя) и 1000 мкг/мл (высокая) как доказано нетоксических для Т клеток в исследованиях исключения красителя с эозином.
Было проведено две серии экспериментов для исследования вызванных митогеном пролиферативных реакций мононуктоеарных клеток периферической крови (МКПК) на (А) казеин, гидролизованный пепсином и трипсином (= П/Т-казеин), (В) αs1-казеин, гидролизованный пепсином и трипсином (=П/Т-αs1-казеин), (С) П/Т-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из Lactobacillus GG, и (D) П/Т-αs1-казеин, дополнительно гидролизованный ферментами, полученными из Lactobacillus GG.
Эксперименты состояли из четырех контрольных культур с различными разведениями питательной среды и митогена, а так же соответствующих испытуемых культур с 25 мкл гидролизованных продуктов в трех различных концентрациях. Количественное определение проводили, как описано у Sutas et al., 1996. Вызванная митогеном пролиферация МКПК выражалась в виде импульсов в минуту с исключением фона. Результаты были представлены для контрольных культур, содержащих 125 мкг/мл ФГА и RPM1 1640, и для трех испытуемых культур, содержащих 125 мкг/мл ФГА, и гидролизованные продукты в низкой, средней и высокой концентрациях.
1.с. Статистический анализ
Для сравнения изменения количества импульсов в минуту каждой из испытуемых культур с изменениями контрольных культур использовали непараметрический парный критерий (согласованный ранговый критерий Уилкоксона). Уровень достоверности был p<0,05. Статистически достоверные результаты парных сравнений были представлены, как подавление или стимуляция в соответствии со снижением или увеличением количеств импульсов в минуту в испытуемой культуре.
Для сравнения изменения количества импульсов в минуту каждой из испытуемых культур с изменениями контрольных культур использовали непараметрический парный критерий (согласованный ранговый критерий Уилкоксона). Уровень достоверности был p<0,05. Статистически достоверные результаты парных сравнений были представлены, как подавление или стимуляция в соответствии со снижением или увеличением количеств импульсов в минуту в испытуемой культуре.
1.d. Результаты
В экспериментах, проведенных с П/Т-казеином и с П/Т-αs1-казеином, дополнительно гидролизованными ферментами, полученными из Lactobacillus GG, вызванная митогеном пролиферации МКПК была значительно подавлена при 0,1, 10 и 1000 мкг/мл (p = 0,03, p = 0,03 и p = 0,03) (фиг. 1C и 1D), в сравнении с П/Т-казеином и с П/T-αs1-казеином (фиг. 1A и 1B).
В экспериментах, проведенных с П/Т-казеином и с П/Т-αs1-казеином, дополнительно гидролизованными ферментами, полученными из Lactobacillus GG, вызванная митогеном пролиферации МКПК была значительно подавлена при 0,1, 10 и 1000 мкг/мл (p = 0,03, p = 0,03 и p = 0,03) (фиг. 1C и 1D), в сравнении с П/Т-казеином и с П/T-αs1-казеином (фиг. 1A и 1B).
Пример 2. Лечение грудных детей с атопическим дерматитом композицией белкового гидролизата с добавкой молочнокислых бактерий
2а. Пациенты и структура исследования
Исследование включало 31 грудного ребенка в возрасте от 2,5 до 15,7 месяцев (средний возраст 8 месяцев), отвечающих критериям Hanifin (Hanifin, 1987) атопической экземы у детей. Они были направлены в педиатрическую клинику на основании атопической экземы и подозрения на аллергию к коровьему молоку. Средний возраст в начале симптомов был 2,4 месяца. Общая продолжительность грудного вскармливания составила 5,9 месяцев. Наличие в семейном анамнезе заболеваний атопических заболеваний (астма, атопическая экзема и аллергический ринит) или пищевая аллергия у родственников первой степени была отмечена у 26 (84%) пациентов. Экзематозные поражения лечили смягчающими средствами и кортикостероидами для местного применения. Ни один пациент не получал системной кортикостероидной терапии. Кроме атопической экземы, у 9 пациентов (19%) наблюдались желудочно-кишечные расстройства, такие как частый жидкий стул, рвота или диарея. После периодов обследования пациентов подвергали двойному слепому плацебо-контролируемому исследованию с применением провокационной пробы с коровьим молоком. В окончательную популяцию исследования были включены только пациенты, имеющие положительную реакцию (27/31).
2а. Пациенты и структура исследования
Исследование включало 31 грудного ребенка в возрасте от 2,5 до 15,7 месяцев (средний возраст 8 месяцев), отвечающих критериям Hanifin (Hanifin, 1987) атопической экземы у детей. Они были направлены в педиатрическую клинику на основании атопической экземы и подозрения на аллергию к коровьему молоку. Средний возраст в начале симптомов был 2,4 месяца. Общая продолжительность грудного вскармливания составила 5,9 месяцев. Наличие в семейном анамнезе заболеваний атопических заболеваний (астма, атопическая экзема и аллергический ринит) или пищевая аллергия у родственников первой степени была отмечена у 26 (84%) пациентов. Экзематозные поражения лечили смягчающими средствами и кортикостероидами для местного применения. Ни один пациент не получал системной кортикостероидной терапии. Кроме атопической экземы, у 9 пациентов (19%) наблюдались желудочно-кишечные расстройства, такие как частый жидкий стул, рвота или диарея. После периодов обследования пациентов подвергали двойному слепому плацебо-контролируемому исследованию с применением провокационной пробы с коровьим молоком. В окончательную популяцию исследования были включены только пациенты, имеющие положительную реакцию (27/31).
Пациентов методом рандомизации на один месяц делили на две группы. Одна группа (WF, n = 14) получала экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию (Valio Ltd, Helsinki, Finland, ЕР-А-601802) и другая группа (FW-GG, n = 13) получали такую же композицию с дополнительным препаратом Lactobacillus GG (5 x 10 Кое/г) (поставляемым Valio Ltd, Helsinki, Finland). По истечении одномесячной терапии композициями, назначаемыми их группе, обе группы в течение еще одного месяца получали экстенсивно гидролизованную сывороточную композицию (Valio Ltd). Перед пищевым воздействием у всех пациентов определяли общую концентрацию IgЕ в сыворотке, специфической IgЕ коровьего молока (радиоаллергосорбентный тест RAST, Pharmacia, Uppsala, Sweden) и с помощью прокола проводили кожную аллергическую пробу. Пробу с помощью прокола проводили на ладонной поверхности предплечья с использованием имеющегося в продаже аллергена коровьего молока ALK (Allergologisk Laboratorium, Horsholm, Denmark) и испытуемой композиции, разведенной до нормальной концентрации для кормления. Использовали ланцет длиной 1 мм с одним острием и козырьком для предотвращения проникновения (ALK) с применением в качестве положительного контроля гистамина дигидрохлорида 10 мг на миллилитр (ALK). Реакции определяли через 15 минут, и реакцию, составляющую половину и более размера реакции на гистамин, регистрировали как положительную при условии, что средний диаметр волдыря был по меньшей мере 3 мм, а отрицательный контроль в то же самое время составлял 0 мм.
Перед началом лечения и через 1 (соответствующий периоду исследования) и 2 месяца брали образцы кала для определения α-1 антитрипсина и TNF-α (фактор опухолевого некроза).
Балльную оценку тяжести атопического дерматита проводили в соответствии с методом SCORAD, установленным European Task Force on Atopic Dermatitis (1993). Вкратце, степень (балльная оценка А) дерматита оценивали с использованием правила девяток. Интенсивность (балльная оценка В) дерматита представляла сумму отдельных балльных оценок (0-3) эритемы, отека и/или папул, экскориации, лихенификации и сухости. Субъективные (балльная оценка С) проявления (оцениваемые в баллах от 1 до 10), включая зуд и потерю сна, оценивались по оценкам родителей. SCORAD получали с помощью расчета: A/5+3.5 x В+С.
Протокол исследования был утвержден Обзорным комитетом по этике университетского госпиталя Тампере. У родителей получали информированное согласие.
2.b. Определение α-1 антитрипсина в образцах кала
Замороженные образцы кала оттаивают при комнатной температуре и гомогенизируют. Приблизительно 1 г переносят в стеклянную трубку и лиофилизируют. Полученный в результате сухой материал измельчают и 50 мг переносят в трубку Ерреndorf. Добавляют один мл раствора 0,15 М NaCl и α-1 антитрипсин экстрагируют с помощью энергичного смешивания во встряхивающем смесителе в течение 20 минут при комнатной температуре. Полученную в результате суспензию центрифугируют при 25000 g в течение 10 минут для удаления остатков органических веществ, и надосадочную жидкость используют для определения α-1 антитрипсина с использованием нефелометра Behring BNA в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены в виде мг/г сухой массы лиофилизированного кала.
Замороженные образцы кала оттаивают при комнатной температуре и гомогенизируют. Приблизительно 1 г переносят в стеклянную трубку и лиофилизируют. Полученный в результате сухой материал измельчают и 50 мг переносят в трубку Ерреndorf. Добавляют один мл раствора 0,15 М NaCl и α-1 антитрипсин экстрагируют с помощью энергичного смешивания во встряхивающем смесителе в течение 20 минут при комнатной температуре. Полученную в результате суспензию центрифугируют при 25000 g в течение 10 минут для удаления остатков органических веществ, и надосадочную жидкость используют для определения α-1 антитрипсина с использованием нефелометра Behring BNA в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены в виде мг/г сухой массы лиофилизированного кала.
2.с. Определение TNF-α в образцах кала
Глубоко замороженные образцы кала оттаивают при комнатной температуре, суспензируют 1: 1 (мас./об.) в физиологическом солевом растворе и дают выпасть в осадок. 0,5-1,0 мл надосадочной жидкости переносят в трубку Eppendorf и центрифугируют при 25000 g в течение 10 минут. Затем надосадочную жидкость используют для определения TNF-α. Для определений TNF-α в кале используют имеющийся в продаже набор для ферментной иммунопробы (Human TNF-α ELISA Kit, Endogen Inc. , Boston, Massachusetts, USA) в соответствии с инструкциями для образцов сыворотки.
Глубоко замороженные образцы кала оттаивают при комнатной температуре, суспензируют 1: 1 (мас./об.) в физиологическом солевом растворе и дают выпасть в осадок. 0,5-1,0 мл надосадочной жидкости переносят в трубку Eppendorf и центрифугируют при 25000 g в течение 10 минут. Затем надосадочную жидкость используют для определения TNF-α. Для определений TNF-α в кале используют имеющийся в продаже набор для ферментной иммунопробы (Human TNF-α ELISA Kit, Endogen Inc. , Boston, Massachusetts, USA) в соответствии с инструкциями для образцов сыворотки.
2.d. Статистика
По причине асимметричного распределения концентрации IgE в сыворотке, использовали логарифмическое (ln) преобразование, и данные представляли в виде средних величин с 95% доверительным интервалом (ДИ). Концентрации воспалительных параметров представлены медианами с нижней и верхней квартилями. При статистических сравнениях использовали согласованный ранговый критерий Уилкоксона и U-критерий Mann-Whitney.
По причине асимметричного распределения концентрации IgE в сыворотке, использовали логарифмическое (ln) преобразование, и данные представляли в виде средних величин с 95% доверительным интервалом (ДИ). Концентрации воспалительных параметров представлены медианами с нижней и верхней квартилями. При статистических сравнениях использовали согласованный ранговый критерий Уилкоксона и U-критерий Mann-Whitney.
2.с. Результаты
2.е.1. Клинические данные
У пациентов, получающих композицию гидролизата, средний уровень (95% ДИ) общего IgЕ сыворотки составил 31 (15-61)кЕД\л. RAST на аллергию к коровьему молоку был положительным (> 0,4 кЕД/л) у 10 из 31 (37%) пациентов с атопической экземой. Кожная проба на аллергию к коровьему молоку с помощью прокола была положительной у 8 из 31 (30%) пациентов.
2.е.1. Клинические данные
У пациентов, получающих композицию гидролизата, средний уровень (95% ДИ) общего IgЕ сыворотки составил 31 (15-61)кЕД\л. RAST на аллергию к коровьему молоку был положительным (> 0,4 кЕД/л) у 10 из 31 (37%) пациентов с атопической экземой. Кожная проба на аллергию к коровьему молоку с помощью прокола была положительной у 8 из 31 (30%) пациентов.
Результаты оценки тяжести атопического дерматита у каждого пациента перед началом лечения и через месяц, т.е. после периода исследования, представлены на фиг. 2. Перед лечением медиана (нижняя квартиль - верхняя квартиль) балльной оценки SCORAD составила 21 (14-31) в группе WF и 26 (17-38) в группе WF-GG (р = 0,33). У пациентов, получавших Lactobacillus GG, через месяц после вмешательства было значительное улучшение балльной оценки SCORAD (p = 0,008), но не у пациентов, получавших экстенсивно гидролизованную композицию без Lactobacillus GG (p = 0,89). Затем балльная оценка SCORAD в группе WF составила 19 (13-31) и в группе WF-GG 15 (7-28). Уменьшение балльной оценки SCORAD в группе WF-GG было вследствие снижения степени (балльная оценка A, p = 0,004), интенсивности (балльная оценка В, p = 0,05) и субъективной балльной оценки (балльная оценка C, p= 0,01) атопического дерматита (фиг. 2). В группе WF улучшение балльной оценки SCORAD было достигнуто за 2 месяца, а в группе WF-GG она оставалась неизменной после прекращения введения Lactobacillus GG. Через 2 месяца медиана (нижняя квартиль - верхняя квартиль) балльной оценки SCORAD составила 14 (2-38) в группе WF и 16 (6-25) в группе WF-GG.
2.е.2. Концентрация α-1 антитрипсина и TNF-α в кале
У здоровых пациентов контрольной группу (n = 9) медиана (нижняя квартиль - верхняя квартиль) концентрации α-1 антитрипсина была 0,5 (0,5-1,7) мг/г. Перед лечением концентрации α-1 антитрипсина была сравнима в группах WF и WF-GG (p = 0,22). Как показано в таблице 1, в течение одномесячного периода исследования концентрация α-1 антитрипсина значительно снизилась в группе WF-GG (p = 0,33), но не в группе WF (p = 0,68). Через два месяца концентрация α-1 антитрипсина в группе WF была 1,2 (0,5-1,6) и 0,5 (0,5-0,7) в группе WF-GG.
У здоровых пациентов контрольной группу (n = 9) медиана (нижняя квартиль - верхняя квартиль) концентрации α-1 антитрипсина была 0,5 (0,5-1,7) мг/г. Перед лечением концентрации α-1 антитрипсина была сравнима в группах WF и WF-GG (p = 0,22). Как показано в таблице 1, в течение одномесячного периода исследования концентрация α-1 антитрипсина значительно снизилась в группе WF-GG (p = 0,33), но не в группе WF (p = 0,68). Через два месяца концентрация α-1 антитрипсина в группе WF была 1,2 (0,5-1,6) и 0,5 (0,5-0,7) в группе WF-GG.
У здоровых пациентов контрольной группы концентрация TNF-α в кале была 0(0-0,08) пкг/г. Концентрация TNF-α в кале была значительно выше у детей с атопией, p>0,0001 (см. таблицу). Перед лечением концентрация TNF-α была сравнима в группах WF и WF-GG (p = 0,57). Концентрация TNF-α кале значительно снизилась в группе WF-GG (р = 0,003), но не в группе WF (p= 0,38) в течение одномесячного периода исследования (см. таблицу). Снижение концентрации TNF-α было достигнуто за 2 месяца в группе WF, в то время как в группе WF-GG у пациентов, которым также вводили экстенсивно гидролизованную композицию без Lactobacillus GG, была выявлена тенденция к увеличению концентрации TNF-α. Затем концентрация TNF-α в группе WF была 84(25-129) и 144 (20-338) в группе WF-GG.
Пример 3. Подавляющая регуляция выработки цитокина мононуклеарными клетками периферической крови у детей с атопией
3.а. Пациенты и методы
Всего исследовали 14 пациентов в возрасте 5-29 (в среднем 16) месяцев, отвечающих критериям Hanifin (Hanifin, 1987) атопического дерматита и восемь подобранных по возрасту детей без атопии. Во время исследования ни один из них не получал системных кортикостероидов.
3.а. Пациенты и методы
Всего исследовали 14 пациентов в возрасте 5-29 (в среднем 16) месяцев, отвечающих критериям Hanifin (Hanifin, 1987) атопического дерматита и восемь подобранных по возрасту детей без атопии. Во время исследования ни один из них не получал системных кортикостероидов.
Асцитическая жидкость, содержащая ОКТ3 (антитело против CD3) была любезно преподнесена доктором М.Kaartinen из Отделения бактериологии и иммунологии Хельсинского университета, Хельсинки, Финляндия. Общий коровий казеин очищают из коровьего молока, как описано Syvaoja (1992). Очищенный казеин гидролизуют ферментами, полученными из Lactobacillus GG, как описано в примере 1. Очищенный казеин или казеин после разложения под воздействием Lactobacillus GG лиофилизируют и хранят при комнатной температуре. Перед экспериментами их разводят RPM1 1640 и применяют стерилизационную фильтрацию (0,1 мкм, Millipore corporation, Bedford, MA, USA).
Полный состав питательной среды включал RPM1 1640 с 10% плодной бараньей сыворотки, 10 мМ буфера Hepes, 2 mML-глютамина (Gibco Life Technologies, Paisley, UK), 50 ЕД/мл бензилпенициллина (Sigma, St. Louis, МО, USA), 10 мг/мл гентамицина (Roussel Laboratories Ltd, Uxbridge, Middlesex, UK). Получают периферическую венозную кровь (5 мл). МКПК, содержащие 90% лимфоидных клеток, выделяют с помощью градиентного центрифугирования на FicollPaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и суспендируют при концентрации 1 х 106 клеток/мл в полной питательной среде. Ячейки для культур предварительно покрывают асцитической жидкостью, содержащей антитело против CD3 в предварительно испытанном оптимальном разведении. Испытуемая культура дополнительно содержит разведение казеина или казеина после разложения под воздействием Lactobacillus GG в конечной концентрации 1 мг/мл. Эти эксперименты повторяют для очищенного бычьего αs1-казеина или GG αs1-казеина после разложения под воздействием Lactobacillus. Через 24 ч инкубации в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37oC надосадочную жидкость собирают и хранят при -70oC для количественных определений цитокина. IL-4 и IFN-γ в надосадочной жидкости культур определяют с помощью имеющихся в продаже наборов ELISA в соответствии с инструкциями производителя (IL-4; CLB, Compact Human lnterleukin-4 ELISA kit. Central Laboratory оf The Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, The Netherlands; IFN-γ, EIFNG, Endogen Inc., Cambridge MA, USA). Результаты различных определений уравнивают с использованием сравнения стандартных кривых и выражают в виде пкг/мл. Чувствительность количественных определений IL-4 - 2,3 пкг/мл и IFN-γ - 5 пкг/мл. При сравнении испытуемых культур с контрольными культурами используют согласованный ранговый критерий Уилкоксона. Уровень достоверности - p<0,05.
3.b. Результаты
У пациентов с атопией, в сравнении с контрольными культурами, выработка и IL-4, и IFN-γ была увеличена в культурах, содержащих очищенный казеин, p = 0,008 и p = 0,008, соответственно (фиг. 3a, b). При разложении под воздействием ферментов Lactobacillus GG такое влияние бычьего казеина не наблюдалось. Напротив, казеина, разложенного под воздействием Lactobacillus GG, было значительно меньше, чем в контрольных культурах, р = 0,003 (фиг. 3а), а выработка IFN-γ в этих культурах была сравнима с контрольными культурами, р = 0,10 (фиг. 3b).
У пациентов с атопией, в сравнении с контрольными культурами, выработка и IL-4, и IFN-γ была увеличена в культурах, содержащих очищенный казеин, p = 0,008 и p = 0,008, соответственно (фиг. 3a, b). При разложении под воздействием ферментов Lactobacillus GG такое влияние бычьего казеина не наблюдалось. Напротив, казеина, разложенного под воздействием Lactobacillus GG, было значительно меньше, чем в контрольных культурах, р = 0,003 (фиг. 3а), а выработка IFN-γ в этих культурах была сравнима с контрольными культурами, р = 0,10 (фиг. 3b).
У здоровых детей выработка IL-4 и IFN-γ в культурах, содержащих очищенный казеин, была сравнима с контрольными культурами, p = 0,10 и p = 0,10 (фиг. 3c, d). Аналогично данным, полученным у пациентов с атопией, выработка IL-4 в культурах, содержащих казеин, разложенного под воздействием Lactobacillus GG, была значительно меньше, чем в контрольных культурах, p = 0,01 (фиг. 3c), а выработка IFN-γ в этих культурах оставалась сравнимой с контрольными культурами, p = 0,50 (фиг. 3d). Аналогичные результаты были получены с αs1-казеином и αs1-казеином, разложенным под воздействием Lactobacillus GG (фиг. 4).
References
1. European task force on atopic dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186: 23-31.
1. European task force on atopic dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186: 23-31.
2. Exterkate F and de Veer G. Partial isolation and degradation of caseins by cell wall proteinase(s) of Streptococcus cremoris. Appl Environ Microbiol 1985; 49: 328-32.
3. Fargeas MJ, Theodorou V, More J, Wal JM, Fioramonti J, Bueno L. Boosted systemic immune and local responsiveness after intestinal inflammation in orally sensitized guinea pigs. Gastroenterology 1995; 109:53-62.
4. Hanifin JM. Epidemiology of atopic dermatitis. Monogr Allergy 1987; 21:116-131.
5. Isolauri E, Majamaa H, Arvola T, Rantala I, Virtanen E, Arvilommi H. Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105:1643-1650.
6. Majamaa H, Isolauri E. Evaluation of gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic eczema. J Allergy Clin Immunol 1996, in press.
7. Majamaa H, Miettinen A, Laine S, Isolauri E. Intestinal inflammation in children with atopic eczema: faecal eosinophil cationic protein and tumor necrosis factor-a as noninvasive indicators of food allergy. Clin Exp. Allergy 1996; 26:181-187.
8. Sampson НА, James MJ and Bernhisel-Broadbent J. Safety of an amino acid-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 1992; 90:463-465.
9. Sutas Y, Soppi E, Korhonen H, Syvaoja EL, Saxelin M, Rokka T, Isolauri E. Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG derived enzymes. J Allergy Clin Immunol 1996, in press.
10. Syvaoja EL. Quantitative determination of the main casein components and purification of as2- and k-casein from bovine milk. Milchwissenschaft 1992; 47:563-566е
Claims (8)
1. Способ получения белкового гидролизата для подавляющей регуляции аллергических реакций и для укрепления иммунного барьера кишечника, включающий этапы гидролиза белков ферментами, выделяемыми из бактериальных препаратов, содержащих пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacillus, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103) и пепсином и/или трипсином.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферменты получены из бактериального препарата, содержащего Lactobacillus GG (АТСС 53103).
3. Способ получения белкового гидролизата для подавляющей регуляции аллергических реакций и для укрепления иммунного барьера кишечника, включающий этапы гидролиза белков пепсином и/или трипсином, и добавления в гидролизат бактериального препарата, содержащего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103).
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что бактериальный препарат содержит Lactobacillus GG (АТСС 53103).
5. Способ профилактики или лечения, вызванных пищей аллергических реакций у грудного ребенка, включающий введение грудному ребенку с риском развития такой реакции белкового гидролизата, приготовленного по любому из пп.1 - 4, или белкового гидролизата совместно с бактериальным препаратом, содержащим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103).
6. Способ лечения аллергии к коровьему молоку у пациента, включающий введение пациенту белкового гидролизата по любому из пп.1 - 4, или белкового гидролизата совместно с бактериальным препаратом, содержащим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103).
7. Способ стимуляции, вызывающих иммунологическую толерантность иммунных реакций на пищевые антигены у пациента, включающий оральное введение белкового гидролизата по любому из пп.1 - 4, или бактериального препарата, содержащего пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103), или белкового гидролизата совместно с бактериальным препаратом, содержащим пробиотические бактерии желудочно-кишечного тракта, в частности, Lactobacilli, которые имеют адгезионные и колонизирующие характеристики и протеазную ферментную систему, которые аналогичны таковым штамма Lactobacillus GG (АТСС 53103).
8. Способ по любому из пп.5 - 7, отличающийся тем, что бактериальный препарат содержит Lactobacillus GG (АТСС 53103).
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI952926 | 1995-06-14 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98100444A RU98100444A (ru) | 2000-01-27 |
RU2174012C2 true RU2174012C2 (ru) | 2001-09-27 |
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2445992C2 (ru) * | 2006-06-15 | 2012-03-27 | Нестек С.А. | Индукция толерантности к белкам яиц |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2445992C2 (ru) * | 2006-06-15 | 2012-03-27 | Нестек С.А. | Индукция толерантности к белкам яиц |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0833649B2 (en) | Methods of preventing or treating allergies | |
Majamaa et al. | Probiotics: a novel approach in the management of food allergy | |
Eslami et al. | Probiotics function and modulation of the immune system in allergic diseases | |
Brouwer et al. | No effects of probiotics on atopic dermatitis in infancy: a randomized placebo‐controlled trial | |
Sütas et al. | Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG–derived enzymes | |
Ishida et al. | Effect of milk fermented with Lactobacillus acidophilus strain L-92 on symptoms of Japanese cedar pollen allergy: a randomized placebo-controlled trial | |
JP5865283B2 (ja) | 乳児仙痛を低減するための選択された乳酸菌の使用 | |
Lodinová-Žádníková et al. | Prevention of allergy in infants of allergic mothers by probiotic Escherichia coli | |
Halken et al. | Safety of a new, ultrafiltrated whey hydrolysate formula in children with cow milk allergy: a clinical investigation | |
US9707258B2 (en) | Bioconversion of milk with Bifidobacterium breve for treatment of allergic manifestions in infants | |
Isolauri | Intestinal involvement in atopic disease | |
Inuo et al. | Tolerability of partially and extensively hydrolysed milk formulas in children with cow's milk allergy | |
Andrade et al. | Efficacy of probiotics in children and adolescents with atopic dermatitis: A randomized, double-blind, placebo-controlled study | |
US6506388B1 (en) | Immunomodulator, immunomodulator food | |
Sundh et al. | Salivary antimicrobial proteins in patients with Crohn's disease | |
Duan et al. | Comparison of sensitization between [beta]-lactoglobulin and its hydrolysates | |
Yamashita et al. | Intake safety of Lactobacillus helveticus SBT2171 and its effects on nasal and ocular symptoms associated with mites and house dust: An open-label study and a randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel group study | |
RU2174012C2 (ru) | Способы профилактики или лечения аллергии | |
AU710126C (en) | Methods of preventing or treating allergies |