CZ399797A3

CZ399797A3 - Způsob výroby proteinového hydrolyzátového prostředku pro tlumení hypersensitivních reakcí a podporu imunitní bariéry ve vnitřnostech

Info

Publication number: CZ399797A3
Application number: CZ973997A
Authority: CZ
Inventors: Erika Isolauri; Leena Matsäniitty; Hannu Korhonen; Seppo Salminen; Eeva-Liisa Syväoja
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 1998-06-17
Also published as: AU6127896A; WO1997000078A1; ZA965088B; NO321504B1; PL185123B1; MX9710109A; NO975832L; ES2191103T3; AU710126B2; EE03424B1; CN1154506C; US6506380B1; PL324010A1; KR19990022914A; SK171597A3; FI952926A; DK0833649T4; EP0833649A1; CZ291904B6; JPH11510791A

Description

Předkládaný vynález se týká způsobů a prostředků pro potlačování hypersensitivních reakcí vyvolaných jídlem u pacientů, kteří trpí alergií na jídlo. Konkrétně, vynález poskytuje způsoby prevence nebo léčení alergií, zejména alergie na kravské mléko u dětí. Vynález se také týká vývoje konkrétního prostředku pro alergické děti s narušenou bariérovou funkcí vnitřností.

Dosavadní stav techniky

Alergie na kravské mléko (cow’s milk allergy - CMA) je definována jako imunitou způsobená nepříznivá reakce na proteiny z kravského mléka. Současný způsob léčení spočívá v úplném odstranění antigenů z kravského mléka. U dětí s CMA je nezbytně nutné, pokud je lidské mléko nedostupné, použít náhradní prostředek. Hydrolyzovaný prostředek, založený na kaseinu nebo syrovátce odvozené od kravského mléka se používá pro poskytnutí odpovídající výživnosti se sníženým antigenním zatížením. Předběžná tepelná úprava kravského mléka většinou ovlivní konformaci proteinů a snadnost jejich hydrolýzy. Následná enzymatická hydrolýza pepsinem, trypsinem, extrakty ze slinivky a extrakty z intestinální sliznice vnitřností způsobí progresivní rozklad postupných epitopů a upraví prostředek do méně antigenní a alergenní formy.

Ve většině případů lze hydrolyzované prostředky odvozené z kravského mléka bezpečně podávat a tyto prostředky jsou účinné a klinicky a metabolicky dobře tolerované. Enzymatická hydrolýza, ale nezbytně nezpůsobí, že je prostředek nealergenní, protože optimální rozsah hydrolýzy není znám a v hydrolyzátu byly detekovány stopy původních proteinů. Proto • · · · ·· ···· v· · · • · · · · · · · · · * • · · · · ♦ ·· ···· · • · · v··· « · » ♦ ·««· · · ·« 99 99 musí být podávání těchto substituentů dětem s alergií na kravské mléko obezřetné.

Dosažení kontroly alergického zánětu eliminací antigenu nebylo uspokojivé, zejména u pacientů s několikanásobnou alergií na jídlo (Sampson a kol., 1992).

Tito pacienti často vykazují zvýšenou průchodnost a narušenou funkci intestinální obranné bariéry (Majamaa a kol., 1996, Majamaa a Isolauri,

1996). Tím se zvyšuje riziko vzniku poruch a přecitlivělosti na různá jídla. Proto je potřeba pro léčení alergie mléko dosáhnout nových pokroků, které by zlepšily na kravské náhražkové prostředky při CMA.

Intestinální antigenní manipulace stanovuje následnou imunitní reakci na antigen. Za normálního stavu se antigeny absorbují přes epithel dvěma funkčními cestami. Hlavní cesta je degradativní, cesta umožňuje která snižuje imunogenicitu antigenu. Druhá transport intaktních proteinů, který je nutný pro antigenně-specifické imunitní reakce.

Nevhodný způsob (Faergaes absorpce

1995).

zvyšuje proces přecitlivělosti

Diferenciální produkce cytokinů pomocí T-pomocných (T-helper

Th) buněk během imunitní reakce má důležitý regulační vliv na povahu imunitní reakce. Cytokinový profil přirozené imunitní reakce určuje fenotyp následné specifické imunitní reakce.

Vedle kontrolované syntézy IgE, je IL-4 zásadní pro rozvoj a maturaci fenotypu Th2, charakteristického pro alergický zánět.

Tento proces se jeví být trávené proteiny. Orální zásadní pro rozvoj tolerance na tolerance je stav antigenně specifické systemické nereaktivnosti, vyznačující se tím, že dochází k místní antigenně-specifické IgA reakci.

O izolovaném lidském intestinálním kmenu, Lactobacillus kmen GG (Lactobacillus GG, ATCC 53103) bylo nejnověji

9999 prokázáno, že podporuje místní IgA reakce proti antigenům, na které naráží během vstupu, a proto pomáhá v eliminaci imunity (Isolauri a kol., 1993). Dosud není známo, zda konkrétní kmeny intestinálních baktérií mohou přímo upravovat imunogenicitu antigenů z jídla a následně tlumit hypersensitivni reakce.

Lactobacilli patří do mikrobiální flóry zdravých střev. Předpokládá se, že Lactobacilli působí v intestinálním traktu soutěžením o receptory a výživu proti patogenním mikrobům na intestinální sliznici.

Probiotika jsou mikrobiální preparáty schopné samostatné existence, které podporují zdraví udržováním přirozené mikroflóry ve vnitřnostech. Mikrobiální preparát lze pokládat za probiotikum pokud funkční mikroby, které obsahuje, a způsob jejich účinku jsou známy. Probiotika působí na intestinální sliznici, kolonizují lidksý intestinální trakt a brání působení škodlivých mikrobů. Zásadním předpokladem je, že působí na sliznici vnitřností a nepoškozují horní část gastrointestinálního traktu. Lactobacillus GG je jednou ze známých bakterií, která má probiotické charakteristiky.

Podstata vynálezu

Předkladatelé vynálezu zjistili, že určité bakterie gastrointestinálního traktu, zejména Lactobacilli, a zejména bakterie, které mají probiotické charakteristiky, lze použít pro zlepšení účinnosti odbourávání potravy a pro zlepšení orální tolerance, v prevenci nebo léčení hypersensitivnich reakcí u pacienta vyvolaných jídlem.

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je, že proteinové hydrolyzáty získané hydrolýzou proteinů uvedenou gastrointestinální bakterií, lze také použít pro daný účel.

Prokázali jsme, že proteinové hydrolyzáty získané podle předkládaného vynálezu mají imunologický vliv na podporu ·♦ ·♦<· hypoalergenicity.

Hydrolyzáty tlumí hypersensi tivní reakce a tím zlepšují imunitní bariérovou funkci vnitřností tj.

stabilizují vnitřnostní sliznicovou bariéru.

Předkládaný vynález poskytuje zlepšený proteinový hydrolyzátový prostředek, který tlumí hypersensitivní reakce a zlepšuje imunitní bariérovou funkci vnitřností. Hydrolyzátový prostředek lze získat hydrolýzou proteinů enzymy odvozenými od probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhezivní a kolonizační vlastnosti, a proteasovým enzymovým systémem, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103) a trypsinem a/nebo pepsinem.

Alternativně lze proteinový hydrolyzátový prostředek podle předkládaného vynálezu získat hydrolýzou proteinů trypsinem a/nebo pepsinem, a přidáním, k takto získanému hydrolyzátu, bakteriálního přípravku, který obsahuje probiotickou gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103). Bakterie jsou přidávány do hydrolyzátového prostředku s výhodou jako lyofilizovaný preparát.

Při podávání takového hydrolyzátového prostředku pacientovi, je třeba očekávat, že hydrolyzující enzymy přítomných bakterií se uvolňují in vivo, a tak se dosahuje stejného účinku jako se zlepšeným hydrolyzátovým prostředkem, který již byl definován. Navíc, bakterie schopné samostatné existence stabilizují vnitřnostní sliznicovou bariéru a tím zlepšují lokální obranyschopnost.

Provedením předkládaného vynálezu je způsob prevence nebo léčeni hypersensitivních reakcí u dětí vyvolaných jídlem, přičemž tento způsob zahrnuje krok podávání zlepšeného proteinového hydrolyzátového prostředku podle předkládaného vynálezu rizikovým dětem nebo alternativně proteinového hydrolyzátového prostředku spolu s bakteriálním přípravkem, φφ ····

• φφ •φ · φφφφφ který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které máji adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103) .

Dalším provedením předkládaného vynálezu je způsob léčení alergie na kravské mléko u pacientů, který zahrnuje podávání zlepšeného proteinového hydrolyzátového prostředku podle předkládaného vynálezu pacientovi nebo alternativně podávání proteinového hydrolyzátového prostředku spolu s bakteriálním přípravkem, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Vynález také poskytuje způsob podpory tolerogennich imunitních reakcí na antigeny z jídla u pacienta, který zahrnuje orální podávání zlepšeného proteinového hydrolyzátového prostředku podle předkládaného vynálezu pacientovi nebo alternativně bakteriálního přípravku, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103) nebo, alternativně, proteinový hydrolyzátový prostředek spolu s bakteriálním přípravkem, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Ve způsobech podle předkládaného vynálezu tak, jak již byly uvedeny, pokud se proteinový hydrolyzátový prostředek používá v kombinaci s vybranou probiotickou bakterií, jejíž definice již byla uvedena, pak takový prostředek může být jakýkoliv vhodný proteinový hydrolyzátový prostředek, známý nebo nový.

Může se tak jednat o částečný proteinový hydrolyzát nebo ·· ··♦· alternativně o silně hydrolyzovaný prostředek. Příprava proteinového hydrolyzátu vhodného pro tyto účely jep opsána např. v E.P. patentové přihlášce č. 601 802.

Preferovaná bakterie, která se používá v prostředcích a způsobech podle předkládaného vynálezu je Lactobacillus GG (ATCC 53103) .

V předkládaném popisu a připojených nárocích znamená fráze bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103)’’, že definuje bakterii, která má adhezivní a kolonizační vlastnosti, které jsou srovnatelné s kmenem LGG, např. jak je definováno v EP patentu 199535. O těchto bakteriích se také předpokládá, že mají stejný druh enzymového systému jako LGG, což znamená, že enzymy odvozené od takových bakterií jsou schopné odbourávat proteiny, čímž vznikají hydrolyzační produkty se stejnými účinky jako ty, kterých se dosáhne použitím enzymů odvozených od LGG.

Zkratky

Cl	interval spolehlivosti (confidence interval)
IFN-γ	interferon - γ
IgA	imunoglobulin A
IgE	imunoglobulin E
IL-4	interleukin - 4
LGG	Lactobacillus GG (ATCC 53103)
OKT3	anti - CD3 protilátka
PBMC	jednojaderné buňky periferní krve (peripheral blood mononuclear cells)
TNF-a	tumorní nekrosní faktor a
WF	testovací skupina, která obdržela silně hydrolyzovaný syrovátkový prostředek

·· ♦· • · ·

WF-GG testovací skupina, která obdržela silně hydrolyzovaný syrovátkový prostředek a LGG přípravek

P/T-kasein - kasein hydrolyzovaný pepsinem a trypsinem

P/T-a_SL-kasein = a_SL - kasein hydrolyzovaný pepsinem a trypsinem

Stručný popis obrázků

Obr. 1A až ID

Mitogenem vyvolané proliterativní reakce PBMC in vitro na P/T-kasein (ΙΑ) , P/T-a_slj-kasein (IB) , P/T-kasein navíc hydrolyzovaný LGG odvozenými enzymy (1C) a P/T-a_sl-kasein navíc hydrolyzovaný LGG odvozenými enzymy (ID) . Výsledky jsou vyjádřeny jako střední hodnota počtu za minutu pro kultury bez hydrolyzovaného produktu (PHA-RPMI 1640) a s hydrolyzováným produktem ve třech koncentracích (0,1 pg/ml, 10 pg/ml a 1000 pg/ml). Horizontální linie představují geometrický průměr počtu za minutu u šesti experimentů, vyčísleno stejně pro každý zvlášť.

Obr. 2

Klinické hodnocení atopické dermatitidy (SCORAD) u každého pacienta a střední skóre rozsahu (A) , intenzity (B) a subjektivního hodnocení (C) pro atopickou dermatitidu před léčením (0) a o jeden měsíc později (I) u děti, které obdržely silěn hydrolyzovaný syrovátkový prostředek bez (WF) a nebo s Lactobaclllus GG (WF-GG).

Obr. 3

Vliv kaseinu a Lactobacillem GG odbourávaného kaseinu na produkci IL-4 a IFN-γ v PBMC u atopických pacientů (a, b) a u neatopických zdravých dětí (c, d). Bílé sloupečky představují střední produkci cytokinu v kontrolních kulturách; černé sloupečky, v kulturách, které obsahují čištěný kasein; a šrafované sloupečky, v kulturách obsahujících Lactobacillem • 4 ♦ ·»· • 4 >4

4 4 4 • · 44 ··· 4 4 • 4· · • 4 44 • ·· •44

4 • 4

4444 • 4· • 4 44

4444

4 4

44

GG odbourávaný kasein. Průsečníkové čáry představují horní a dolní kvartil.

* Statisticky významné párové srovnání proti kontrolním kulturám.

Obr. 4

Vliv a_a-kaseinua Lactobacillem GG odbourávaného a_SL-kaseinu na produkci IL-4 a IFN-γ v PBMC u atopických pacientů (a, b) a u neatopických zdravých dětí (c, d). Bílé sloupečky představují střední produkci cytokinu v kontrolních kulturách; černé sloupečky, v kulturách, které obsahují a_SL-kasein; a šrafované sloupečky, v kulturách obsahujících Lactobacillem GG odbourávaný a_SL-kasein. Průsečníkové čáry představují horní a dolní kvartil.

* Statisticky významné párové srovnání proti kontrolním kulturám.

Následující příklady dále ilustrují vynález. Jsou v nich popsány způsoby přípravy zlepšeného hydrolyzátu, stejně jako experimenty, které prokazují užitečný terapeutický účinek pozorovaný v předkládaných studiích.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Potlačení lymfocytové proliferace ín vitro hovězími kaseiny hydrolyzovanými enzymy odvozenými od Lactobacillu GG

1.a. Hydrolýza proteinů z kravského mléka

Celkový hovězí kasein a kaseinové složky (a_SL-kasein) byly přečištěny z kravského mléka (Syváoja, 1992). Zvlášť na kaseinu a na a_SL-kaseinu byla provedena hydrolýza směsí enzymů odvozenou od Lactobacillus GG. Enzymy byly izolovány upraveným způsobem podle Exterkate a de Veer, 1985. Stručně řečeno se enzymy uvolní působením ultrazvuku na zmražené bakteriální buňky. Supernatant odstředěných buněk byl oddělen a použit pro ·· ···· hydrolýzu kaseinu a a_SL-kaseinu. Hydrolýza byla prováděna při teplotě 34 °C po dobu 24 hodin.

Takto získané hydrolyzáty byly dále hydrolyzovány pepsinem a trypsinem. Stručně řečeno byly vzorky nejprve hydrolyzovány 0,1% pepsinem v 0,1 mol/1 HC1 po dobu 3 hodin za teploty 37 °C při pH 2,5. Po úpravě pH pomocí 250 mg NaHCO₃ a 2 mol/1 NaOH, ke vzorkům byl přidán 0,1% trypsin a vzorky byly hydrolyzovány po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C, pH 8,0.

P/T kaseinové a P/T-oc_SL-kaseinóvé vzorky byly získány hydrolýzou čištěného kaseinu a a_SL-kaseinu pouze pepsinem a trypsinem způsobem, který již byl popsán, bez GG-hydrolýzy.

l.b. Test transformace lymfocytu

Pro transformaci lymfocytu upravený mikrozpůsob úplné dobrovolníků bylo využito experiment. Stručně řečeno odebrána a zředěna v poměru (Grand Island Biological Co.

vyvolanou mitogenem byl použit krve. Šest až osm zdravých jako dárci krve pro tento heparinizovaná žilní krev byla 1 : 7 RPMI 1640 kulturním médiem NY, USA) obsahujícím antibiotika.

Fytohemagglutinin (PHA) (Difco Laboratories, Detroit, Mích., USA) byl zředěn RPMI 1640 obsahujícím antibiotika s rozsahem finálních koncentrací v kulturách 5 pg/ml až 1250 pg/ml. Lyofilizované hydrolyzáty kaseinu a a_SL-kaseinu byly zředěny RPMI 1640 na finální koncentrace 0,1 pg/ml (nízká), 10 pg/ml (střední) a 1000 pg/ml (vysoká), která je netoxická na T buňky, jak bylo prokázáno při studiích vylučování barviva s eosinem.

Byly provedeny dvě sady experimentů pro prozkoumání proliferativních reakcí jednojaderných buněk periferní krve (PBMC) vyvolaných mitogenem na (A) kasein hydrolyzovaný pepsinem a trypsinem (= P/T-kasein) , (B) a_SL-kasein hydrolyzovaný pepsinem a trypsinem (- P/T-a_SL-kasein) , (C) * · · · · ·

P/T-kasein dále hydrolyzovaný enzymy odvozenými od Lactobacillus GG a (D) P/T-a_SL-kasein dále hydrolyzovaný enzymy odvozenými od Lactobacillus GG.

Experiment sestává ze čtyř kontrolních kultur o různém zředění kulturního média a mitogenu, stejně jako odpovídající testovací kultury s 25 μΐ hydrolyzovaných produktů při třech různých koncentracích. Test byl proveden postupem popsaným v Sůtas a kol., 1996.

Mitogenem vyvolaná proliferace PBMC byla vyjádřena jako počet za minutu s vyloučením pozadí. Výsledky byly uvedeny pro kontrolní kultury obsahující 125 gg/ml PHA a RPMI 1640 a pro tři testovací kultury obsahující 125 pg/ml PHA a hydrolyzované produkty při nízkých, středních a vysokých koncentracích.

l.c. Statistická analýza

Pro srovnání změn hodnot v počtech za minutu u každé z testovacích kultur s počty za minutu kontrolních kultur byl použit neparametrický párový test (Wilcoxonův test značeného pořadí). Hladina významnosti byla p < 0,05. Významné výsledky párového srovnání byly uvedeny jako potlačení nebo stimulace podle zvýšení nebo snížení hodnot v počtech za minutu u testovací kultury.

1.d. Výsledky

V experimentech provedených s P/T-kaseinem a P/T-a_SL-kaseinem navíc hydrolyzovaných enzymy odvozenými od Lactobacillus GG, byla mitogenem vyvolaná proliferace PBMC znatelně potláčena při 0,1 ^g/l, 10 gg/l a 1000 gg/l (p = 0,03, p = 0,03 a p = 0,03) (obr. IC a obr. ID) ve srovnání s P/T-kaseinem a P/T-a_SL-kaseinem (obr. 1A a obr. IB) .

• · 4 · · · s atopickou dermati tidou •44 • 44 •4>

444444

4φ ·· 44 •*444 • 444 •4 44444 • 4 44

4·»4

Přiklad 2

Léčení dětí pro tei novým hydro1 y zá tovým prostředkem doplněným mléčnou kyselinovou bakterii

2.a. Pacienti a organizace studie

Studie zahrnuje 31 dětí ve věku 2,5 měsíce až

15,7 měsíce (hlavní věk 8 měsíců), která splňují

Hanitinovo kriterium (Hanifin,

1987) pro atopický ekzém u dětí.

Děti byly doporučeny na pediatrickou kliniku na základě atopického ekzému a očekávané alergie na kravské mléko. Střední věk počátku symptomů byl 2,4 měsíce. Celkové trvání kojení bylo

5,9 měsíce. Pozitivní přítomnost atopického onemocnění (astma, atopický ekzém a alergická rýma) nebo alergie na jídlo u nejbližších příbuzných byla zaznamenána u 26 (84 %) pacientů. Ekzemické léze byly léčeny emolienty á povrchovými kortikosteroidy. Žádný z pacientů nebyl podroben systemické kortikosteroidové terapii. Vedle atopického ekzému byl u (19 %) pacientů pozorovány gastrointestinální poruchy, jako je průjem nebo zvracení. Po proběhnutí prvotní studie byly pacienti podrobeni dvojitě slepému placebem kontrolovanému působení kravského mléka. Pouze ti, kteří měli pozitivní reakci (27/31) byli zahrnuti do populace pro konečnou studii. Pacienti byli náhodně rozděleni na dobu jednoho měsíce do dvou skupin. Jedna skupina (WF, n = 14) obržela silně hydrolyzovaný syrovátkový prostředek (Valio Ltd., Helsinki, Finsko, EP-A-601802) a druhá skupina (WF-GG, n = 13) obržela stejný prostředek obsahující navíc Lactobacillus GG přípravek (5 x 10⁸ cfu/g) (dodávaný Valio Ltd., Helsinki, Finsko). Po jednom měsíci podávání příslušného prostředku, obě skupiny dále dostávaly po dobu jednoho měsíce silně hydrolyzovaný syrovátkový prostředek (Valio Ltd.). U všech pacientů byla před léčením stanovena celková sérová koncentrace IgE, specifického IgE na kravské mléko (RAST, Pharmacia, Uppsala,

·· ··»· ·· •· ~· • * · ·* • · ·« ·· ·· »· • · ·.

•9· ·· · ·* • ·· • · ··

Švédsko) a byly provedeny testy svědění kůže. Test svědění byl proveden na předloktí pomocí komerčně dostupného alergenu kravského mléka ALK (Allergologisk Laboratořium, Hbrsolm, Dánsko) a testovaný prostředek byl naředěn na normální koncentraci pro požívání. Byla použita 1 mm jehla se zábranou proti hlubšímu zapíchnutí (ALK) s dihydrochloridem histaminu v množství 10 mg na mililitr (ALK) jako pozitivní kontrola. Reakce byly zaznamenány po 15 minutách a reakce odpovídající polovině velikosti reakce na histamin nebo větší byly zanamenány jako pozitivní, za předpokladu, že střední hodnota průměru vyrážky byla přinejmenším 3 mm a zároveň negativní kontroly byla 0 mm.

Vzorky stolice pro stanovení a-1 antitrypsinu a TŇF-α byly sbírány před začátkem studie, v době, která odpovídá době trvání studie a o dva měsíce později.

Prudkost atopické dermatitidy byla hodnocena podle SCORAD způsobu, zavedeného Europeán Task Force on Atopic Dermatitis (1993). Stručně řečeno se rozsah (hodnocení A) dermatitidy stanovuje pomocí pravidla devítin. Intenzita (hodnocení B) dermatitidy je součtem jednotlivých hodnocení (0 až 3) erythemu, edému, exkoriace, lichenifikace a suchosti. Subjektivní (hodnocení C) projevy (hodnoceno 1 až 10) zahrnující svědění a nespavost byly stanoveny podle pozorování rodičů. SCORAD byl získán výpočtem:

A/5 + 3,5 x B + C

Záznamy o studii byly ověřeny Ethical Review Committee of Tampere University Hospital. Od rodičů byl získán souhlas.

2.b. Stanovení a-1 antitrypsinu ve stolici

Zamražená stolice byla ponechána roztát za laboratorní teploty a homogenizována. Do skleněné zkumavky byl převeden g a byl lyofilizován. Výsledný suchý materiál byl rozemlet a mg bylo převedeno do Eppendorfovy zkumavky. Byl přidán 1 ml

44·· • 4 4· • ··

44»

4Φ

44···· • ·· • · · • ·4 4 • · • 4 44 • 44« • · ·4 • ·44 ··· 4· • 44 • ·44

0,15 Μ NaCl a α-1 antitrypsin byl extrahován prudkým mícháním ve Vortexove mixeru po dobu 20 minut za laboratorní teploty. Získaná suspenze byla odstředbvána po dobu 10 minut při 25 000 g, aby se odstranil balast, a supernatant byl použit pro stanovení a-1 antitrypsinu pomocí Behringova BNA nefelometru podle návodu výrobce. Výsledky jsou uvedeny ve formě mg/g suché hmotnosti lyofilizované stolice.

2.c. Stanovení TNF-α ve stolici

Zamražená stolice byla ponechána roztát za laboratorní teploty, suspendována v poměru 1 : 1 (hmotnost / objem) ve fyziologickém roztoku chloridu sodného a byla ponechána se usadit. Ze supernatantu bylo 0,5 ml až 1,0 ml převedeno do Eppendorfo vy zkumavky a odstřeďováno po dobu 10 minut při 25 000 g. Supernatant pak byl použit pro stanovení TNF-α. Pro stanovení TNF-α ve stolici byl použit komerční imunoenzymový test (Human TNF-α ELISA sada, Endogen Inc., Boston, Massachusetts, USA) podle návodu pro sérové vzorky.

2.d. Statistika

Z důvodu nerovnoměrné distribuce sérových koncentrací IgE byla provedena logaritmizace (ln) a data jsou prezentována jako střední hodnota s 95% intervalem spolehlivosti (Cl) . Koncentrace zánětlivých parametrů je uváděna jako střední hodnota s dolním kvartilem a horním kvartilem. Pro statistické srovnání byl použit Wilcoxonův test značeného pořadí a Mannův - Whitneyův U-test.

2.e. Výsledky

2.e.l Clinická data

Střední hodnota (95% Cl) celkového sérového IgE byl 31 kU/1 (15 kU/1 - 61 kU/1) u pacientů, kteří dostávali hydrolyzátový prostředek. RAST pro kravské mléko byl pozitivní (> 0,4 kU/1) ···· · · · · · · ♦ • · · · · · ·· · · · · · -I -/1 « · · «··· · · ♦

J.‘i ·· ···· ·· · · fc· o · u 10/31 (37 %) pacientů s atopickým ekzémem. Test svědění na kravské mléko byl pozitivní u 8/31 (30 %) pacientů.

Prudkost atopické dermatitidy u každého pacienta před léčbou a o jeden měsíc později, tj. po proběhnuti studie, je uvedena v obrázku 2. Střední hodnota (dolní kvartil - horní kvartil) SCORAD hodnocení byla 21 (14 - 31) u skupiny WF a 26 (17 - 38) u skupiny WF-GG před provedením studie (p = 0,33). Po jedno měsíci léčení došlo k znatelnému zlepšení SCORAD hodnocení u skupiny dostávající Lactobacillus GG (p — 0,008), ale ne u těch, kteří dostávali silně hydrolyzovaný prostředek bez Lactobacillu GG (p = 0,89). SCORAD hodnocení pak bylo (13 - 31) u skupinmy WF a 15 (7 - 28) u skupiny WF-GG.

Sníženi SCORAD hodnocení u WF-GG bylo způsobeno zmenšením rozsahu (hodnocení A, p — 0,004), intenzity (hodnocení B, p = 0,05) a subjektivního hodnocení (hodnocení C, p = 0,01) u atopické dermatitidy (obr. 2). Zlepšení SCORAD hodnocení bylo dosaženo po dvou měsících u skupiny WF a u skupiny WF-GG zůstalo nezměněno i po skončení podávání Lactobacillu GG. Po dvou měsících byla střední hodnota (dolní kvartil - horní kvartil) SCORAD hodnocení u skupiny WF 14 (2 - 38) a u skupiny

WF-GG 16 (6 - 25).

2.e.2 Koncentrace a-1 antitrypsinu a TNF-α ve stolici

U zdravé kontroly (n =9) byly střední hodnoty (dolní kvartil - horní kvartil) koncentrace a-1 antitrypsinu 0,5 mg/g (0,5 mg/g - 1,7 mg/g). Koncentrace a-1 antitrypsinu byla srovnatelná mezi skupinami WF a WF-GG před léčením (p = 0,22). Jak je uvedeno v tabulce 1, koncentrace a-1 antitrypsinu se během jednoho měsíce trvání studie znatelně snížila u skupiny WF-GG (p — 0,03), ale ne u skupiny WF (p = 0,68).

Koncentrace TNF-α ve stolici byla u zdravé kontroly 0 pg/g (0 pg/g - 0,08 pg/g) . Koncentrace TNF-α ve stolici byla u atopických dětí znatelně vyšší, p < 0,0001 (tabulka 1).

• · • ·

Koncentrace TNF-α byla srovnatelná mezi skupinami WF a WF-GG před léčením (p - 0,57). Koncentrace TNF-α ve stolici se během jednoho měsíce trvání studie znatelně zvýšila u WF-GG (Ρ = 0,003), ale ne u WF (p = 0,38) (tabulka 1) . Snížení koncentrace TNF-α bylo u skupiny WF dosaženo po dvou měsících, zatímco u skupiny WF-GG, která také dostávala silně hydrolyzovaný prostředek bez Lactóbacillu GG, byla zjištěna tendence ke zvyšování koncentrace TNF-α. Koncentrace TNF-α pak byla 84 (25 - 129) u WF a 144 (20 - 338) u WF-GG.

Tabulka 1

Koncentrace a-1 antitrypsinu a TNF-α ve stolici před léčením (0) a o jeden měsíc později (I) u dětí, které obdržely silně hydrolyzovaný syrovátkový prostředek (WF) nebo tentýž prostředek obsahující bakterii Lactobacillus GG (WF-GG). Data udávají střední hodnotu (dolní kvartíl - horní kvart!1).

	WF	WF-GG
a-1 antitrypsin 0 (mg/g)	17(1,5-2,3)	1,4 (0,5-1,9)
a-1 antitrypsin I (mg/g)	17(1,1 -2,8)	0,5(0,5-1,0)
TNF-a 0 (pg/g)	632 (126-1880)	709 (91 -1131)
TNF-a 1 (pg/g)	494 (147 -1009)	34(19-103)

Příklad 3

Tlumení produkce cytokinu jednojadernými buňkami periferní krve u atopických dětí

3.a. Pacienti a metody

Dohromady bylo studováno 14 pacientů ve věku 5 měsíců až 29 měsíců (střední věk 16 měsíců), kteří splňují Hanifinovo kriterium pro atopickou dermatitidu (Hanifin, 1987) a osm neatopických zdravých děti stejného věku. Žádné z dětí v době studie neobdrželo systemicky kortikosteroidy.

OKT3 (anti-CD3-protilátka) obsahující ascitovou tekutinu byl darem od Dr. M. Kaartinena, katedra bakteriologie a imunologie, Univerzita v Helsinkách, Finsko. Celkový hovězí • · ·· · · · · · · ·· ·· ···· · · · · · · · • · · ·· · · · · · • · · · · · ·· ···· · • · · · · · · · · · • · ···· · · · · · · · · kasein byl přečištěn z kravského mléka, 1992. Čištěný kasein byl hydrolyzován

Lactobacillus

GG postupem popsaným v kasein nebo kasein naštěpený lyof ili zovány a skladovány za jak popisuje Syváoja, enzymy odvozenými od příkladu 1. Čištěný

Lactobacillem GG byly laboratorní teploty. Před experimenty byl naředěny RPMI

1640 a byla použita sterilizace přes filtr (0,1 μπι, Millipore,

Bedford, MA, USA).

Kulturní médium sestávající z RPMI 1640 bylo doplněno 10% sérem telecích zárodků, 10 mM pufrem Hepes, mM L-glutaminem (Gibco

Li fe

Technologies,

Paisley,

U/ml benzylpenicillinem (Sigma, St. Louis,

MO,

USA) mg/ml gentamycinem (Roussel Laboratories

Uxbridge,

Middlesex,

UK) . Byla odebrána periferní žilní krev (5 ml) . PBMC obsahující % lymfoidních buněk byly izolovány

FicollPaque (Pharmacia

Biotěch,

Uppsala, ods třeďováním a suspendovány při

Sweden) gradientovým x 10^€ buněk/ml v kompletním kulturním médiu. Kulturní jamky byly předem pokryty anti-CD3 protilátkou obsahující ascitovou tekutinu v předem vyzkoušeném optimálním zředění. Testovací kultura dále obsahovala kasein nebo Lactobacillem GG odbourávaný kasein ve finální koncentraci 1 mg/ml. Tyto experimenty byly opakovány s čištěným hovězím odbourávaným

Lactobacillem GG.

a_SL-kaseinem nebo a_?L-kaseinem

Po 24 hodinách inkubace v humidifikované 5%

C0₂ atmosféře při °C, byl supernatant odebrán a skladován při -70 °C pro cytokinové testy. IL-4 a

IFN-γ byly v uspernatantech kultur stanovovány komerčně dostupnou

ELISA sadou podle návodu výrobce (IL-4: CLB,

Compact

Human sada

ELISA, Centrál Laboratory of the

Netherlands Red Cross

Blood Transfusion Service,

Amsterdam,

Holandsko; IFN-γ: EIFNG,

Endogen lne., Cmabridge,

MA, USA) .

Výsledky různých pokusů byly srovnány pomocí standardních křivek a byly vyjádřeny jako pg/ml. Citlivost testů pro IL-4 • · • · • · · · · · · · ···· · , _ · ·· · · · · · · · ·· ···· ·· ·· ·· ·· byla 2,3 pg/ml a pro IFN-γ, 5 pg/ml. Pro statistické porovnáni testovaných kultur s kontrolními kulturami byl použit Wilcoxonův test značeného pořadí. Hladina významnosti byla p < 0,05.

3.b. Výsledky

U atopických pacientů byla produkce IL-4 i IFN-γ ve srovnání s kontrolními kulturami zvýšena v kulturách obsahujících čištěný kasein, p = 0,008 a p = 0,008 (obr. 3a a obr. 3b). Žádný takový vliv hovězího kaseinu nebyl pozorován po jeho odbourání enzymy Lactobacillus GG. Naopak byla produkce IL-4 v kulturách obsahujících kasein odbouraný Lactobacillem GG znatelně nižší než u kontrolních kultur, p — 0,003 (obr. 3a) a produkce IFN-γ byla v těchto kulturách srovnatelná s kontrolními kulturami, p = 0,10 (obr. 3b).

U zdravých děti byla produkce IL-4 i IFN-γ v kulturách obsahujících čištěný kasein srovnatelná s kontrolními kulturami , p = 0,10 a p = 0,10 (obr. 3c a obr. 3d) . Stejně jako u atopických produkci IL-4 v pacientů měly zdravé děti znatelně nižší kulturách obsahujících kasein odbouraný

Lactobacillem

GG oproti kontrolním kulturám, p = 0,01 (obr. 3c) a produkce IFN-γ v těchto kulturách zůstala srovnatelná s kontrolními kulturami, p = 0,50 (obr. 3d).

Stejné výsledky byly získány i s a_SL-kaseinem a Lactobacillem

GG odbouraným a_SL-kaseinem (obr. 4) .

Reference

European task force on atopics dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186: 23-31.

• · • ·

Exterkate F. a De Veer G. Partial isólation and degradation of caseins by cell wall proteinase(s) of Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol. 1985; 49: 328-32.

Fargeas M.J., Theodorou V., More J. , Wal J.M. , Fioramonti J. , Bueno L. Boosted systemic immune and local responsiveness after intestínal inflammation in orally sensitized guinea pigs . Gastroenterology 1995; 109: 53-62.

Hanifin, J.M. Epidemiology of atopic dermatitis. Monografie Alergy 1987; 21: 116-131.

Isolauri E., Majamaa Η., Arvola T,, Rantala I., Virtaneh E., Arvilommi H., Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability ihduced by gow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105: 1643-1650.

Majamaa H., Isolauri E. Evaluation of gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic eczema. J. Allergy Clin. Immunol, 1996, v tisku.

Majamaa H., Miettinen, A., Laine S., Isolauri E. Intestinal inflammation in children with atopic eczema: faecal eosinophil cationic protein and tumor necrosis factor-α as noninvasive indicators of food allergy. Clin. Exp. Allergy 1996; 26: 181-187.

Sampson H.A., James, M.J. a Bernhisel-Broadbent J. Safety of an amino acid - derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 1992; 90: 463-465.

Sutas Y., Soppi E., Korhonen H., Syváoja E.L., Saxelin Μ. , Rokka T., Isolauri E., Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG derived enzymes. J. Allergy Clin. Immunol. 1996, v tisku.

Syvaoja E.L. Quantitative determination of the main casein components and purification of a_SL- and κ-casein from bovine milk. Milchwissenschaft 1992; 47: 563-566.

• · · · * · · · · · · · ·· ···· ·· « ···· • · · ·· · · · ···· · • · · »··· ··· ig ,* ···· ·· ·· «· ··

Průmyslová využitelnost

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné pro výrobu léků pro léčení nebo prevenci alergií na jídlo, zejména alergie na kravské mléko.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby proteinového hydrolyzátového prostředku pro tlumení hypersensitivních reakcí a podporu imunitní bariéry ve vnitřnostech, vyznačující se t i m, že sestává z kroků hydrolýzy proteinů enzymy odvozenými od bakteriálního přípravku, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhezivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103) a pepsinem a/nebo trypsinem.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že enzymy jsou odvozeny od bakteriálního přípravku, který obsahuje Lactobacillus GG (ATCC 53103).
3. Způsob výroby proteinového hydrolyzátového prostředku pro tlumení hypersensitivních reakcí a podporu imunitní bariéry ve vnitřnostech, vyznačující se ti m, že sestává z kroků hydrolýzy proteinů pepsinem a/nebo trypsinem, a přidáním, bakteriálního přípravku, k takto získanému hydrolyzátu, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103).
4. Způsob podle nároku 3, v y z n ač tím, že bakteriální přípravek obsahuje

Lactobacillus

GG (ATCC 53103).
5. Proteinový hydrolyzátový prostředek pro tlumení hypersensitivních reakcí a podporu imunitní bariéry ve vnitřnostech, vyznačující se tím, že hydrolyzát se získává způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 .
6. Způsob prevence nebo léčení hypersensitivních reakcí u dětí vyvolaných jídlem, vyznačující se tím, • · - · · · · ···· · · ♦ · ···· ♦ · · · · ··

1« ···· · · ·· • * ·· · · · · · · ·· • · · · · » · · ··

22. · ···· ·♦ ♦ · «· ·· že se rizikovým dětem podává proteinový hydrolyzátový prostředek podle nároku 5.
7. Způsob léčení alergie na kravské mléko u pacientů, vyznačující se tím, že se pacientům podává proteinový hydrolyzátový prostředek vyrobený podle nároku 1.
8. Způsob podpory tolerogenních imunologických reakcí na antigeny z jídla u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání proteinového hydrolyzátového prostředku podle nároku 5.
9. Způsob prevence nebo léčení hypersensitivních reakcí u dětí vyvolaných jídlem, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání proteinového hydrolyzátového prostředku podle nároku 1 spolu s bakteriálním přípravkem, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103).
10. Způsob léčení alergie na kravské mléko u pacientů, vyznačující se t i m, že zahrnuje podávání proteinového hydrolyzátového prostředku spolu s bakteriálním přípravkem, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103).
11. Způsob podpory tolerogenních imunitních reakcí na antigeny z jídla u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podávání bakteriálního přípravku, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103) nebo proteinový hydrolyzátový prostředek spolu s bakteriálním přípravkem, který obsahuje probiotické gastrointestinální bakterie, «· · · · · ···· · · ♦· ···* · * · · ♦ * · • · · · · · ♦ · · · · · · « · · · · · · · · ·

22 ·· ........ *· ·* zejména Lactobacilli, které mají adhesivní a kolonizační vlastnosti a proteasový enzymový systém, který je podobný kmenu Lactobacillus GG (ATCC 53103).
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11, vyznačující se tím, že bakteriální přípravek obsahuje Lactobacillus GG (ATCC 53103).