BRPI0618569A2

BRPI0618569A2 - promoção de toleráncia oral com proteìnas glicadas

Info

Publication number: BRPI0618569A2
Application number: BRPI0618569-0A
Authority: BR
Inventors: Sophie Pecquet; Lionel Jean Rene Bovetto; Francois Morgan
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2006-11-14
Publication date: 2011-09-06
Also published as: RU2008123860A; CN101325880A; US20090258107A1; RU2440129C2; EP1951064B2; AU2006313660B2; WO2007054587A1; EP1951064A1; EP1951064B1; CA2629485A1; JP2009515929A; TW200735781A; AU2006313660A1; CN101325880B

Abstract

PROMOçãO DE TOLERáNCIA ORAL COM PROTEìNAS GLICADAS. A presente invenção refere-se a um método de promoção de tolerância oral a proteínas em um animal compreendendo administração deformas glicadas das ditas proteínas ao animal; proteínas glicadas para uso na promoção de tolerância oral em um animal; um produto alimentício compreendendo proteínas glicadas para uso no mesmo; e um método para fabricação do dito produto alimentício.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS GLICADAS, PROTEÍNAS DO SORO GLICADAS, FÓRMULA PARA LAC- TANTE, USO DE FORMAS GLICADAS DE PROTEÍNAS, PRODUTO ALI- MENTÍCIO E MÉTODO DE PRODUÇÃO DO MESMO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método de promoção de tolerância oral em um animal compreendendo administrar proteínas glicadas ao animal; proteínas glicadas para uso na promoção de tolerância oral em um animal; um produto alimentício compreendendo proteínas glicadas para uso no mesmo e um método para fabricação do dito produto alimentício. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O leite materno é recomendado para todos os bebês. No entan- to, em alguns casos, alimentação no seio é inadequada ou não é bem suce- dida ou não-recomendada por razões médicas ou escolhas da mãe em não amamentar no seio. Fórmulas para Iactantes têm sido desenvolvidas para essas situações. A maioria das fórmulas para Iactantes é baseada em leite de vaca. No entanto, alergia ao leite de vaca ou hipersensibilidade ao leite de vaca é comum em bebês. Geralmente ela desaparece por volta da idade de dois ou três anos, mas ela pode ocasionalmente ser por toda a vida. Ela é a doença mais comum em lactantes, com uma incidência de 0,5 a 3% em Iactan- tes nascidos no tempo certo e 3 a 5% em intantes prematuros. Esta alergia causa brotoejas, urticária, vermelhidão em torno da boca, nariz escorrendo, espirro, eólica, diarréia, vômito, anafilaxia e mais geralmente problemas digesti- vos. Ela poderia ser associada com alguns casos de morte súbita infantil.

Hipersensibilidade ao leite deve ser distinguida de intolerância à lactose, que é intolerância a leite como um resultado de deficiência congêni- ta da enzima lactase.

Alergia ao leite de vaca é causada, na maioria dos casos, por uma reação às enzimas α-lactalbumina e β-lactoglobulina na fração do soro. Ela pode ser também causada por caseína e/ou albumina, que são proteínas lácticas potencialmente alergênicas também presentes no leite de vaca. Nos primeiros meses de vida o sistema imunológico está ainda se desenvolvendo e pode falhar em reconhecer e tolerar tais proteínas de dieta. O resultado é que o bebê trata a proteína de dieta como uma substância estranha e de- senvolve alergia a ela. Crianças podem também desenvolver alergias a ou- tras proteínas da dieta se seu sistema imunológico não reconhecer e tolerar essas proteínas.

Existem dois tipos de resposta imune: mediada por célula (ou Th1), que é importante para ataque por bactérias e vírus, e humoral (ou Th2), que está implicada em reações alérgicas. Antes do Iactante nascer, seu corpo é estéril e o curso de Th 1 é inativo. O curso de Th2, no entanto, é ativo antes do nascimento porque ele é necessário para prevenir que o bebê inicie uma resposta imune à sua mãe. Imediatamente assim que o Iactante nasce, ele é exposto a várias bactérias, ambas benignas e prejudiciais, e o curso de Th1 é ativado para lidar com este ataque furioso. Conforme cada substância estranha potencial é encontrada no intestino, ela é absorvida pelo tecido linfóide associado ao intestino através de células M e encontra células T puras. Se o curso de Th1 estiver operando corretamente, o corpo vai gerar uma resposta imune consistindo em anticorpos específicos ou linfócitos T especificamente sensibilizados. Essas células T que se tornam especializa- das em antígenos de dieta inócuos no futuro vão agir como um mecanismo supressor para prevenir hipersensibilidade se desenvolvendo através do curso de Th2. Este mecanismo é conhecido como tolerância oral.

No entanto, se o anticorpo gerado pela resposta imune for um anticorpo IgE, ele vai responder à exposição adicional ao antígeno gerando uma reação inflamatória, que é a alergia. O mecanismo deste tipo de alergia pode ser explicado como segue: os anticorpos IgE aparecem sobre a super- fície de células, incluindo basófilos em circulação. Quando a interação alér- geno/IgE acontece, as células apresentando o par IgE/alérgeno geram e li- beram mediadores químicos, incluindo histamina. Este fenômeno domina em efeitos patológicos, tal como vasodilatação local ou sistêmica.

O curso de Th1 é estimulado pela presença de bactérias. Se um recém-nascido ou bebê muito novo não encontra bactérias suficientes como pode acontecer em países desenvolvidos com altos padrões de higiene, o curso de Th1 pode não funcionar bem. Em tais casos, a única resposta do sistema imunológico será uma resposta de Th2 e uma alergia ao antígeno em questão vai se desenvolver. Isto é apenas uma causa de falha em de- senvolver tolerância oral; pode haver outras. Certamente há idéia de ser uma predisposição genética.

Então, o fenômeno de tolerância oral é a habilidade através da qual administração de antígenos por via oral pode prevenir respostas imunes sistêmicas subseqüentes ao mesmo antígeno dado em uma forma imunogê- nica. Um mecanismo similar é acreditado prevenir respostas de hipersensibi- lidade à flora bacteriana normal do intestino, que são também essenciais para vida e são uma fonte de antígenos prejudiciais. Se o mecanismo de tolerância oral não se desenvolver suficientemente em um lactante, ou se houver um colapso no estado fisiológico de tolerância a certos antígenos, isto pode resultar no desenvolvimento de reações de hipersensibilidade.

Geralmente, hipersensibilidade ao leite aparece quando um Iac- tante suscetível encontra leite de vaca pela primeira vez. A partir de um pon- to de vista de dieta existem dois modos de tratar uma alergia estabelecida ou alimentos contendo o alérgeno devem ser evitados completamente ou os alimentos devem ser tratados para diminuir sua alergenicidade, por exemplo, através de hidrólise. Ambos fórmula para lactante e cereais contendo proteí- nas extensivamente hidrolisadas (peptídeos consistindo em não mais do que cinco aminoácidos) são fabricados para este último propósito.

No entanto, existe a necessidade de produtos que ajudem a re- duzir o risco de desenvolver a alergia e promover o desenvolvimento de tole- rância a proteínas intactas, particularmente em crianças imaginadas estar sob risco do mesmo (por exemplo, se elas tiverem pelo menos um membro da família sofrendo uma alergia). Por exemplo, foi proposto alimentar proteí- nas parcialmente hidrolisadas para induzir tolerância oral em bebês. Uma abordagem alternativa para a indução e manutenção de tolerância oral é descrita no WO 03/099037, a saber o uso de alimentos contendo bactérias probióticas. Exemplos de bactérias probióticas incluem várias espécies de Lactobacilli e Bifidobacteria. Foi constatado que administração de probióticos pode ajudar a induzir tolerância oral em lactantes. Um objetivo da presente invenção é prover uma abordagem adi- cional para a promoção de tolerância oral.

Fórmulas para Iactantes freqüentemente contêm proteínas que são todas de interesse particular a partir de um ponto de vista nutricional, contendo todos os aminoácidos essenciais e sendo rapidamente e facilmen- te digeridas.

Quando proteínas do soro são aquecidas na presença de açú- cares de redução, os grupos amino livres das proteínas vão reagir com os açúcares resultando em glicação das proteínas. Se tais reações forem dei- xadas acontecer sem verificação, o resultado pode ser uma redução subs- tancial em valor nutricional e um pouco de coloração marrom pode ser tam- bém observada. As séries complexas de reações que podem acontecer são conhecidas coletivamente como a reação Maillard. Na verdade, é até imagi- nado que reações do tipo Maillard possam ocorrer, embora muito Ientamen- te, em produtos alimentícios contendo os grupos químicos necessários em temperatura ambiente. Embora a reação Maillard seja geralmente imaginada como indesejável e etapas são então realizadas para controlá-la durante o processamento de gêneros alimentícios relevantes, mais recentemente foi compreendido que, cuidadosamente controlada, glicação de proteínas do soro poderia oferecer a oportunidade de manipular as propriedades das pro- teínas de várias maneiras.

O primeiro produto irreversível resultante de interação não- enzimática de um grupo glicosila e os grupos a- e ε- amino de proteínas é conhecido como um composto Amadori. Todos os compostos Amadori ge- ram furosina quando submetidos à hidrólise ácida e deste modo um método de monitoramento da progresso de glicação de proteínas do leite com base em medição de produtos de furosina foi desenvolvido. Com esta ferramenta a o subseqüente desenvolvimento de técnicas de espectrometria de massa, se tornou teoricamente possível monitorar o progresso da reação Maillard. Glicação pode ser realizada em solução ou no estado sólido.

O WO 00/18249 descreve um processo para a glicação no esta- do sólido de materiais contendo proteína do soro em pó compreendendo ajuste da atividade de água do pó para 0,3 a 0,8 e permitir que a glicação prossiga em uma temperatura de 30 a 75° C por entre 1 hora e 80 dias. É reivindicado que o pó resultante tenha propriedades funcionais aumentadas, tal como estabilidade ao calor, atividade emulsificante, atividade antioxidante e capacidade de ligação de enterotoxina aumentadas. O pó pode ser usado como um aditivo para aumentar a funcionalidade e teor nutricional de gêne- ros alimentícios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de promo- ção de tolerância oral a proteínas em um mamífero compreendendo adminis- trar formas glicadas das ditas proteínas ao mamífero. As proteínas glicadas são administradas enteralmente, por exemplo, através da incorporação em um produto alimentício. Tal produto é simples de fabricar e administrar e tem valor nutricional.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a proteínas glicadas para uso na promoção de tolerância oral às proteínas não-glicadas em um mamífero.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um produto ali- mentício compreendendo proteínas glicadas para uso na promoção de tole- rância oral às proteínas não-glicadas em um mamífero.

De preferência, as proteínas glicadas são proteínas do soro gli- cadas. Um exemplo de um produto alimentício compreendendo proteínas do soro glicadas é uma fórmula para bebê ou lactante.

Alternativamente, o produto alimentício pode ser alimento para animal de estimação seco, úmido ou líquido compreendendo proteínas gli- cadas.

De preferência as proteínas do soro glicadas compreendem β- lactoglobulina glicada, e de preferência a glicação é lactosilação, isto é, o açúcar de redução é lactose. Uma vez que esses componentes estão pre- sentes em muitos ingredientes de alimento, por exemplo, isolato de proteína do soro, concentrado de proteína do soro ou leite em pó desnatado, é sim- ples adaptar os processos para a produção desses produtos para incluir uma etapa de lactosilação. Esses produtos contendo proteína do soro são am- plamente usados como ingredientes de alimento valiosos pelas propriedades funcionais de suas proteínas bem como suas boas propriedades nutricionais.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produção de um produto alimentício conforme acima descrito compreenden- do submeter as proteínas contidas no produto a um processo de glicação. Glicação pode ser realizada ou em solução ou no estado sólido.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma fórmula para lactante contendo proteínas glicadas, de preferências proteínas do soro glicadas.

FIGURAS

A Figura 1 mostra hiporresponsividade de IgE anti-β- lactoglobulina em nove grupos de camundongos alimentados com tipos dife- rentes de proteína do soro ou β-lactoglobulina com extensões diferentes de lactosilação.

A Figura 2 mostra a hiporresponsividade de IgGI anti-β- lactoglobulina nos mesmos nove grupos de camundongos da Figura 1.

A Figura 3 mostra a hiporresponsividade de IgE anti-β- lactoglobulina em cinco grupos de camundongos alimentados com tipos dife- rentes de proteína do soro ou β-lactoglobulina com extensões diferentes de lactosilação.

A Figura 4 mostra hiporresponsividade de IgGI anti-β- lactoglobulina nos mesmos cinco grupos de camundongos que a Figura 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com a invenção, proteínas, tal como β-lactoglobulina de proteína do soro, que são antígenos para os quais alérgenos podem ser desenvolvidos, podem ser glicados e administrados a um mamífero a fim de promover tolerância oral aos ditos antígenos. Outras proteínas que podem ser usadas incluem a α-lactalbumina de proteína do soro, caseína e albumi- na.

Por promoção de tolerância oral se quer dizer ambos a indução e manutenção de tolerância oral juntas ou separadamente. A alergia ou hipersensibilidade alimentar mais comum é alergia ao leite de vaca ou hipersensibilidade ao leite de vaca, uma vez que na mai- oria dos casos este é o primeiro produto alimentício deparado pelos Iactan- tes. Deste modo, a discussão aqui é mais centrada nesta alergia. No entan- to, o escopo do presente pedido de patente não é limitado a esta alergia, mas pretende se relacionar à promoção de tolerância oral com relação a ou- tras proteínas de dieta tal como noz (por exemplo, amendoim), proteínas do trigo e ovo, que são também geralmente associadas com alergia em crian- ças. Por exemplo, de acordo com a invenção, proteínas do soro glicadas podem ser administradas a um mamífero a fim de promover tolerância oral a proteínas do trigo, proteínas do ovo glicadas podem ser administradas a um mamífero a fim de promover tolerância oral a proteínas do ovo e proteínas de noz glicadas podem ser administradas a um mamífero a fim de promover tolerância oral a proteínas de noz.

Proteínas glicadas são de preferência preparadas submetendo as proteínas a um processo de glicação, de preferência um processo de gli- cação do estado sólido. De acordo com Morgan (J. Agric. Food Chem. (1999) 47(11):4543-8), processos no estado sólido resultam em menos mu- dança conformacional da molécula de proteína. Ainda, processos no estado sólido são mais fáceis de monitorar e controlar permitindo que efeitos inde- sejáveis, tal como agregação de proteína e reações Maillard avançadas, se- jam evitados.

O processo de glicação pode compreender um tratamento com calor suave (50-80Q C) dos pós de proteína/açúcar com um Aw ajustada (0,2- 0,7) por até cerca de 72 horas. O processo geral é muito simples, bem adap- tado ao equipamento industrial existente e tem um custo de energia baixo. O processo geral pode compreender ajuste e equilíbrio da atividade de água (Aw) dos pós, tratamento com calor do pó umidificado; e opcionalmente es- friamento e/ou secagem do pó.

Em um aspecto preferido da invenção, proteínas glicadas são incorporadas a um produto alimentício. No contexto da presente invenção, o termo produto alimentício pretende compreender qualquer matéria consumi- vel. Então, ele pode ser um produto pretendido para consumo por seres hu- manos, em particular fórmulas para lactante, fórmulas para bebê, fórmulas de acompanhamento de lactante e bebê e similar.

De acordo com o Artigo 1,2 do European Commission Directive 91/321/EEC de 14 de maio de T991 sobre fórmula de lactante e fórmula de acompanhamento uma criança de menos de 12 meses de vida é considera- da um lactante. Uma fórmula para lactante é um gênero alimentício que é pretendido para a nutrição completa de Iactantes durante os primeiros seus meses de vida.

No entanto, proteínas glicadas podem ser também incluídas em produtos alimentícios não especificamente pretendidos para nutrição de lac- tante ou bebê, mas não obstante consumidos por este grupo, por exemplo, leite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, sorvetes, produtos à base de cereal fermentado ou produtos à base de leite, dentre outros.

O termo produto alimentício também compreende produtos a serem consumidos por outros mamíferos, por exemplo, animais de estima- ção, tais como cachorros, gatos, coelhos, porquinhos-da-índia, camundon- gos, ratos ou outros mamíferos domesticados, tal como animais de fazenda, por exemplo, gado, cavalos, porcos, ovelha, cabras, búfalos, camelos e simi- lar. Nesse sentido, animais de estimação refere-se de preferência a animais de companhia. Deste modo, as proteínas glicadas acima mencionadas po- dem ser também incorporadas em produtos alimentícios de animais de esti- mação a fim de promover tolerância oral. Produtos alimentícios de animal de estimação adequados incluem produtos em pedaço, croquetes, produtos para mastigar, produtos úmidos, tal como alimentos em lata e fórmulas líqui- das, tal como leite para gatinhos ou cachorrinhos.

Alimento para animal de estimação é alimento adequado para consumo por animais de estimação e de preferência gênero alimentício que é adequado para a nutrição completa de animais de estimação.

Por definição, conforme o grau de glicação aumenta, a qualida- de nutricional da proteína glicada é progressivamente reduzida. Para proteí- nas do soro, isto pode ser estimado através da medição da % de Iisina blo- queada. Glicação limitada dessas proteínas não resulta em efeitos prejudici- ais notáveis em seu valor nutricional, mas o grau de glicação e a proporção de proteína glicada usada em um produto particular devem ser ambos tidos em mente quando da formulação do produto. Por exemplo, uma fórmula pa- ra Iactante deve de preferência não conter mais de cerca de 15% de Iisina bloqueada. Se proteínas glicadas forem usadas na fórmula, este alvo pode ser atingido ou através de glicação de todas as proteínas para este grau má- ximo desejado ou usando uma mistura de proteínas mais altamente glicadas e proteínas não-tratadas para respeitar no geral o alvo para Iisina bloqueada.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, um método de produção de tal produto alimentício é provido, compreendendo submeter proteína a um processo de glicação, de preferência um processo de glicação no estado sólido.

A invenção também provê uma fórmula para Iactante contendo proteínas glicadas, tal como proteínas do soro glicadas. A fórmula para Iac- tante pode ser de uma composição padrão com as proteínas nela glicadas ou substituídas com proteínas glicadas de escolha. Conforme acima discuti- do, uma fórmula para Iactante contendo proteínas do soro glicadas deve de preferência não conter mais do que cerca de 15% de Iisina bloqueada e este alvo deve ser atingido ou através de glicação de todas as proteínas na fór- mula para seu grau desejado máximo ou usando uma mistura de proteínas mais altamente glicadas e proteínas não-tratadas com relação geral ao alvo para Iisina bloqueada.

As proteínas glicadas devem de preferência ser consumidas como um substituto para a proteína não-glicada até que tolerância à proteína tenha sido estabelecida. Por exemplo, apenas proteínas do ovo glicadas de- vem ser consumidas até que tolerância à proteína do ovo tenha sido estabe- lecida, ponto onde ovo comum pode ser consumido sem medo de uma rea- ção alérgica. Similarmente, uma fórmula para Iactante contendo proteínas glicadas deve ser alimentada a um bebê até que o desmame esteja comple- to e a criança tenha atingido a idade de comer comidas normais, por exem- pio, entre 3 e 5 anos. EXEMPLOS

Os exemplos que seguem são ilustrativos dos produtos e méto- dos de fabricação dos mesmos que se encaixam no escopo da presente in- venção. Eles não devem ser considerados de modo algum Iimitativos da in- venção. Mudanças e modificações podem ser feitas com relação à invenção. Isto é, a pessoa versada na técnica vai reconhecer muitas variações possí- veis nesses exemplos cobrindo uma ampla faixa de composições, ingredien- tes, métodos de processamento e misturas e pode ajustar os níveis de ocor- rência natural dos compostos da invenção para uma variedade de aplica- ções.

EXEMPLO 1: GLICACÃO DE PROTEÍNAS DO SORO EM CONDIÇÕES LÍQUIDAS

β-lactoglobulina (BLG) foi obtida da Davisco (USA). A pureza de (90%) foi avaliada através de RP-HPLC. Lactose foi obtida da Fluka.

4% de BLG (aproximadamente 2,2 mM) e 7% de monoidrato de lactose (aproximadamente 200 mM) foram dissolvidos em tampão de fosfato a 20 mM, pH 6,8. Após filtragem em filtros de acetato de celulose de 0,22 mm (Millipore), misturas de proteína e Iactose foram postas em frascos com cavidade tampada e aquecidas em um banho de água a 60° C por 0,24 ou 72 horas para atingir níveis baixos de lactosilação que não induzem efeitos prejudiciais notáveis sobre o valor nutricional das proteínas. Teoricamente essas condições permitiram a ligação de 2-3 moléculas de Iactose por mo- nômero de β-lactoglobulina em um total de 14 resíduos de Iisina possíveis (Morgan e outros, 1999, J. Agri. Food Chem., 47, 83-91). Todos os experi- mentos foram realizados em condições anaeróbicas e estéreis através da redução do headspace para 1-2 ml em um frasco de 300 ml. Após aqueci- mento, as frações diferentes não foram dialisadas, mas foram imediatamente secas com congelamento para prevenir gelação.

A β-lactoglobulina nativa controle (BLG controle) foi hidratada por 6 horas em temperatura ambiente, esfriada em um banho de água gela- da, então Iactose foi adicionada para atingir a mesma concentração de 7% que a BLG glicada.

Como um controle adicional a mesma solução de BLG purifica- da foi incubada sem lactose, esfriada, então lactose em pó foi adicionada e dissolvida para atingir a concentração de 7%. Imediatamente após a solução ter sido seca com congelamento.

Ainda dois isolatos de proteína do soro (WPI) foram testados:

- Davisco WPI BIPRO que é virtualmente depletado em lactosil β-globulina (controlado pela espectrometria de massa), e

- Lacprodan 80 da Arla Foods que continha um nível alto de formas de lactosil β-globulina (caracterizado por espectrometria de massa).

Lisina bloqueada foi determinada pelo ensaio de furosina. Uma alíquota da proteína (ca. de 20 mg de proteína) foi hidrolisada com 60 ml de ácido clorídrico a 6M por 24 horas a 1102 C em uma aparelho de refluxo. Após transferência quantitativa para 100 ml de volume com água, uma alí- quota de 10 ml foi evaporada até secar e ressuspensa mais em 3 ml de HCI a 0,02 M. Análise foi então realizada injetando 10 μΙ em um analisador de aminoácido Hitachi L-8500 equipado com tampões de citrato de sódio e co- luna para análise de hidrolisato de proteína. Lisina e furosina foram quantifi- cadas no mesmo cromatograma através de comparação com padrões exter- nos após derivatização pós-coluna com reagente ninidrina. A porcentagem de lisina bloqueada foi calculada a partir do teor de lisina e furosina no hidro- lisato ácido supondo que durante hidrólise cerca de 40% de ε- desoxifructolisina (lisina bloqueada) são retransformados em lisina, parte é transformada em piridosina e cerca de 32% em furosina (Finot e outros, (1981) Prog. Food Nutr. Sci., 5, 345-355). Todos os resultados são valores médios resultantes de duas medições independentes.

Os resultados são mostrados na tabela 1 abaixo. TABELA 1

<table>table see original document page 13</column></row><table>

+Grupo de camundongo ao qual a proteína foi alimentada no

Exemplo 2.

*Este valor muito alto é devido a um problema durante a Iiofiliza- ção.

EXEMPLO 2: INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA ORAL EM CAMUNDONGOS

Para testar a indução de tolerância oral, o protocolo de camun- dongo padrão descrito por Pecquet e outros (1999, Immunology 96:278-285) foi usado. Os camundongos foram alimentados com tipos diferentes de pro- teínas do soro de BLG1 lactosilados ou não, conforme descrito no Exemplo 1. Cinco dias depois, os camundongos foram provocados através de inje- ções subcutâneas de BLG (100 mg de β-lactoglobulina/camundongo) diluí- das em uma solução de Al(OH)3). Três semanas mais tarde, os camundon- gos foram sacrificados e as amostras de sangue foram coletadas a fim de avaliar a indução de tolerância oral através da medição dos títulos de IgE e IgG1 específicos de BLG nos grupos diferentes.

Os camundongos foram tratados de acordo com os grupos que seguem:

Grupo A: Água

Grupo B: BLG controle liofilizada com lactose (nenhuma incuba- ção) Grupo C: BLG + Iactose T O

Grupo D: BLG controle, 24 h de incubação então Iiofilizada com lactose

Grupo E: BLG + lactose, 24 h de incubação então liofilização Grupo F: BLG controle, 72 h de incubação então Iiofilizada com lactose

Grupo G: BLG + lactose, 72 h de incubação então liofilização Grupo H: WPI (Isolato de proteína do soro) baixa lactosilação (Bipro)

Grupo I: WPI com alta lactosilação (Lacprodan)

Os resultados apresentados na Figura 1 mostram que a alimen- tação dos camundongos com BLG Iactosilada (grupo E) e proteínas do soro com alta lactosilação (grupo 1) melhorou mais a hiporresponsividade de IgE anti-BLG específica quando comparado com o grupo que tinha sido alimen- tado com BLG nativa (grupo B) e com proteínas do soro com baixa lactosila- ção (grupo H), ambos grupos BeH sendo controles positivos.

É de observação que o grupo B (42% de Iisina bloqueada) não produziu a melhor resposta, apesar das proteínas alimentadas terem a taxa mais alta de lactosilação. Uma explicação disto poderia ser que a reação de lactosilação não foi controlada. Ainda, isto poderia ser devido ao fato de que lactosilação excessiva mascara epitopos críticos na proteína. Do mesmo modo, os resultados do grupo G não são melhores do que os resultados do grupo I apesar do mesmo nível de lisina bloqueada nas proteínas alimenta- das a ambos grupos. Isto pode ser porque a lactosilação de BLG dada ao grupo G foi realizada no estado líquido e consequentemente não foi bem- controlada. Lactosilação no estado líquido sendo difícil controlar pode levar à ocorrência de algum fenômeno indesejado, incluindo agregação de proteína e reação "Maillard" avançada. Por outro lado, a lactosilação de proteínas do soro dadas ao grupo I aconteceu no estado seco com melhor controle (ape- nas reação "Maillard" inicial).

Um perfil similar foi observado com IgGI específico anti-BLG, outro isotipo produzido sob a regulagem de células Th1, mostrando a ener- gia dessas células devido à indução de tolerância oral. Conforme mostrado na Figura 2, os grupos E e I representam o título mais baixo de lgG1 anti- BLG, indicando que a lactosilação das proteínas nesses dois grupos melhora a hiporresponsividade em comparação com os grupos que foram alimenta- dos com as mesmas proteínas com menos lactosilação, isto é, grupos B e H, respectivamente.

EXEMPLO 3: GLICACÂO EM ESTADO SECO

Concentrado de proteína do soro Prolacta 75 (WPC) foi com- prado da Lactalis Industrie (Retiers, França). De acordo com o fabricante, ele contém 76,4% de proteína, 15,3% de lactose, 3,2% de cinza, 0,42% de cál- cio e 5% de água.

O WPC foi lactosilado com glicação em estado sólido. Resumi- damente, a atividade de água (Aw) foi ajustada para cerca de 0,44 pondo o pó em uma câmara fechada com K2CO3 saturado. Absorção de água e Aw foram monitoradas durante esta fase. Quando a Aw requerida foi atingida, o pó foi vedado em bolsas opacas. O pó foi então mantido pelo menos por 48 horas a 15° C para permitir que água se equilibrasse dentro da matriz. Glica- ção de proteína foi induzida através de incubação do pó a 60° C por 3 horas e 8 horas em tubos de aço inoxidável vedados (16 mm de diâmetro interno, ~30 g de pó) em um aparelho de aquecimento de túbulo feito em casa. Ativi- dade de água foi checada no final do período de glicação, e quaisquer mu- danças foram observadas. O pó foi então armazenado hermeticamente a 15° C.

Espectrometria de massa (MALDI) foi usada para detectar for- mas lactosiladas de proteínas e para quantificar o número médio de lactose ligada por monômero de proteína na Prolacta 75 (não-glicada e glicada).

Grau de glicação foi avaliado através da determinação de grupo amino conforme acima descrito.

Grupos amino livres foram determinados usando método orto- ftaldialdeído (OPA). A determinação de OPA foi realizada misturando 200 ml da solução de proteína (1,5 g/l em 50 mmols/l de tampão de fosfato de sódio pH 7,8), 2 ml de solução de redução (480 mg de N-acetil-L-cisteína dispersa em 200 ml de 0,1 mols/l de tampão de borato de sódio pH 9,3) e 50 ml de uma solução de SDS a 20% (p/p). Após mistura e incubação por 10 minutos a 509 C, 50 ml de reagente de OPA (preparado dispersando 170 mg de OPA em 5 ml de metanol) foram adicionados. A mistura foi incubada mais 30 mi- nutos a 509 C e então esfriada para temperatura ambiente por 30 minutos antes da leitura da absorbância a 340 nm usando um espectrofotômetro Uvi- kon 810 (Flowspek, Basel, Suíça). A curva de calibragem foi obtida usando um padrão L-Ieucina em uma faixa de concentração de 10 a 200 mmol/l em mistura final. Para se obter o sinal da reação, dois "blanks" foram subtraídos. "blank" 1 (sinal de proteína) foi obtido com metanol ao invés de reagente de OPA. "blank" 2 foi obtido substituindo a solução de proteína pelo tampão de fosfato de sódio. Produtos e reagentes usados foram respectivamente: ácido bórico, N-acetil-L-cisteina, OPA da Fluka (Chemie GmbH, Buchs, Suíça), monoidrato de fosfato de diidrogeno de sódio, metanol, hidróxido de sódio da Merck (Darmstadt, Alemanha) e L-Ieucina da Sigma (St. Louis, MO, USA).

Cromatografia de exclusão de tamanho foi usada para checar a presença de proteína agregada na Prolacta 75 (não-glicada e glicada). A- mostras de proteína foram diluídas com uma quantidade adequada de tam- pão de eluição para dar uma concentração de proteína equivalente a 1 g/l com base na concentração de proteína de partida. A coluna era uma TSK 2000SW (Tosohaas), eluída com fosfato a 1,0M pH 6,8 + NaCI 0,15M a 0,5 ml/min. A densidade óptica foi registrada a 214 ou 280 nm. A coluna foi cali- brada com padrões MW contendo α-lactalbulmina e β-lactoglobulina nativas.

Os resultados das caracterizações químicas são mostrados na

Tabela 2 abaixo. TABELA 2

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Uma boa correlação foi encontrada entre os vários métodos u- sados para caracterizar lactosilação de proteína. As condições usadas para lactosilação de proteína (glicação no estado seco) não levaram à formação de agregados de proteína (conforme mostrado através de cromatografia de exclusão de tamanho).

EXEMPLO 4: INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA ORAL EM CAMUNDONGOS

A fim de medir o efeito de lactosilação, a indução de tolerância oral foi realizada no modelo de camundongo conforme acima descrito. Os camundongos foram alimentados com a preparação diferente de proteínas não-glicadas e glicadas Prolacta preparada no Exemplo 3. Camundongos foram então provocados em um nível sistêmico com a β-lactoglobulina (BLG) e três semanas mais tarde a indução de tolerância oral à BLG foi medida através da avaliação do nível de IgE e IgGi específico de BLG no soro dos camundongos.

Os camundongos foram tratados de acordo com os grupos que seguem:

Grupo A: Lacprodan

Grupo B: Prolacta não-glicada 75

Grupo C: Prolacta glicada 75 (Lis bloqueada: 19%)

Grupo D: Prolacta Glicada 75 (Lis bloqueada: 31%)

Grupo E: Controle (Água)

Os resultados são mostrados na Figura 3. Do mesmo modo que os resultados apresentados no Exemplo 2, uma pessoa pode observar que os camundongos tolerizados com a Prolacta Iactosilada (grupos CeD) mos- tram uma hiporresponsividade a IgE específico de BLG melhor do que os grupos alimentados com Prolacta não-lactosilada ou alimentados com Lac- prodan. Os títulos de IgGI anti-BLG mostrados na Figura 4 indicam o mes- mo tipo de resposta a tolerogênica, os títulos dos grupos CeD sendo os menores.

Concluindo, esses dados mostram que a lactosilação de proteí- nas do soro melhora a hiporresponsividade tolerogênica específica (IgE e IgGI), quando comparado com proteínas não-lactosiladas.

EXEMPLO 5: FÓRMULA PARA LACTANTE CONTENDO PROTEÍNAS DO SORO GLICADAS

A composição desta fórmula Iactante é dada abaixo:

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A fonte de proteína é um concentrado de proteína do soro Pro- Iacta 75 glicado através do processo descrito no Exemplo 3 acima para um teor de Iisina bloqueada de 11%. A fórmula de Iactante é preparada mistu- rando junto a fonte de proteína, a fonte de carboidrato e a fonte de gordura.

Emulsificantes podem ser incluídos na mistura se desejado. Água que foi submetida à osmose reversa é então misturada para formar uma mistura líquida.

A mistura líquida é termicamente tratada para reduzir as cargas ao rapidamente aquecê-la para uma temperatura na faixa de cerca de 80s C a cerca de 110e C por cerca de 5 segundos a cerca de 5 minutos. A mistura líquida é então rapidamente esfriada para entre 60Q C e 859 C. A mistura lí- quida é então homogeneizada em dois estágios, primeiro em cerca de 7 MPa a cerca de 40 MPa e então em cerca de 2 MPa a cerca de 14 MPa no segundo estágio. A mistura homogeneizada é esfriada mais e vitaminas e minerais sensíveis ao calor são adicionados. O pH e o teor de sólidos da mistura homogeneizada são padronizados neste ponto.

A mistura homogeneizada é então transferida para um secador de pulverização e convertida em pó tendo um teor de umidade de menos do que cerca de 5% em peso.

Claims

1. Uso de formas glicadas de proteínas, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma fórmula para Iactante de administração enteral para a promoção de tolerância oral a proteínas em um mamífero.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as proteínas glicadas são administradas oralmente.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as proteínas glicadas são um componente de um produto alimentício.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é uma fórmula para bebê ou lactante.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é um alimento para animal de estimação.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as proteínas são proteínas do soro.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as proteínas do soro glicadas são proteínas do soro lactosiladas.

8. Uso de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que as proteínas do soro compreendem β-lactoglobulina.

9. Proteínas glicadas caracterizadas pelo fato de que são para o uso na promoção de tolerância oral à proteínas não-glicadas em um mamífe- ro.

10. Proteínas glicadas de acordo com a reivindicação 9, caracte- rizada pelo fato de que são proteínas do soro.

11. Proteínas do soro glicadas de acordo com a reivindicação -10, caracterizadas pelo fato de que são proteínas do soro lactosiladas.

12. Proteínas do soro glicadas de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizadas pelo fato de que compreendem β-lactoglobulina.

13. Produto alimentício caracterizado pelo fato de que compre- ende proteínas glicadas para uso na promoção de tolerância oral às proteí- nas não-glicadas em um mamífero.

14. Produto alimentício de acordo com a reivindicação 13, carac- terizado pelo fato de que as proteínas glicadas são proteínas do soro.

15. Produto alimentício de acordo com a reivindicação 14, carac- terizado pelo fato de que as proteínas do soro glicadas são lactosiladas.

16. Produto alimentício de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que as proteínas do soro compreendem β- lactoglobulina.

17. Produto alimentício de acordo com qualquer uma das reivin- dicações de 13 a 16, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é uma fórmula para bebê ou lactante.

18. Produto alimentício de acordo com a reivindicação 13, carac- terizado pelo fato de que é um alimento para animal doméstico.

19. Método de produção de um produto alimentício, como defini- do em qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende submeter proteínas contidas no produto a um processo de glicação de estado sólido.

20. Fórmula para lactante, caracterizada pelo fato de que con- tém proteínas glicadas.

21. Fórmula para lactante, caracterizada pelo fato de que con- tém proteínas do soro glicadas.