BRPI0713596A2

BRPI0713596A2 - indução de toleráncia às proteìnas do ovo

Info

Publication number: BRPI0713596A2
Application number: BRPI0713596-3A
Authority: BR
Inventors: Rodolphe Fritsche; Raphael Schaller
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2012-10-30
Also published as: RU2445992C2; EP2031986B1; RU2009101018A; EP2031986A1; WO2007144397A1; AU2007259231B2; PT2031986E; CN101460067A; CA2653157A1; ZA200900309B; PL2031986T3; ES2403644T3; AU2007259231A1; CN101460067B; US20100255039A1; MY180578A; MX2008015690A

Abstract

INDUçãO DE TOLERáNCIA àS PROTEìNAS DO OVO. A presente invenção refere-se ao uso de proteínas de ovo enzimaticamente hidrolisadas com um grau hidrólise entre 15 e 28% na produção de uma composição para indução de tolerância oral às proteínas de ovo em um mamífero.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA ÀS PROTEÍNAS DO OVO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de proteínas do ovo hidro- lisadas para induzir tolerância oral às proteínas do ovo intactas em mamífe- ros propensos a serem alérgicos a ovos. Antecedentes da Invenção

Alergias alimentares, das quais a mais comum é alergia ao leite de vaca, são causadas, na maioria dos casos, por uma reação das proteínas no alimento. Nos primeiros anos de vida o sistema imune ainda está se de- senvolvendo e pode falhar no reconhecimento e tolerar tais proteínas oriun- das da dieta. O resultado é que o bebê ou criança ou animal novo trata a proteína da dieta como uma substância estranha e desenvolve resposta a- lérgica a ela. Alergias alimentares podem afetar não somente seres huma- nos, mas também outros mamíferos, tais como cachorros e gatos.

Células T helper desempenham um papel central na imunidade adaptativa. Células Th1 são vitais para respostas imunes mediadas por célu- las, e as células Th2 promovem a imunidade humoral. As respostas Th1 e Th2 são contra-regulatórias, isto é, citocinas produzidas por células Th1 ini- bem a função de Th2 e vice-versa. A resposta imune distorcida Th2 tem de- monstrado ser crucial para a manutenção da gravidez bem sucedida e ela também prevalece no nascimento e durante os primeiros meses de vida. A exposição pós-natal aos antígenos microbianos elicia preferivelmente as respostas Th1, as quais têm sugerido contrabalançar a produção de citocina Th2-polarizada em neonatos. No caso de exposição microbiana inicial insufi- ciente, a produção das citocinas tipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) é ainda mais propagada, levando à produção de IgE e, conseqüentemente, à doença a- lérgica. Entretanto, esse paradigma de Th2 rapidamente provou ser insufici- ente para explicar toda a imunopatologia da doença atópica e, recentemen- te, levantou-se a hipótese de que ao invés de uma ativação Th2 aumentada, os estágios iniciais de doenças atópicas poderiam ser uma conseqüência da ativação defeituosa das células T regulatórias (Treg). Células Treg são pe- quenas populações de células T capazes de induzir a imunotolerância. Vá- rios subgrupos sobreponíveis de células Treg foram descritos (Th3, Tr1, CD4+, CD25+) expressando citocinas supressivas (IL-10, TGF-β).

O fenômeno da tolerância oral é a capacidade pela qual a admi- nistração de antígenos pela via oral pode prevenir as respostas imunes sis- têmicas subseqüentes ao mesmo antígeno dado em uma forma imunogêni- ca. Se o mecanismo de tolerância oral não se desenvolver suficientemente, ou se houver uma avaria no estado fisiológico de tolerância a certos antíge- nos, isso pode resultar no desenvolvimento de reações de hipersensibilida- de. O mecanismo pode ser explicado como se segue: após um primeiro con- tato com o alérgeno, anticorpos IgE são produzidos e migram para a superfí- cie dos mastócitos e basófilos, onde eles são ligados a receptores específi- cos. Em um segundo contato com o alérgeno, IgE da superfície são reticula- das nos mastócitos ou basófilos, levando à ativação celular e liberação de mediadores químicos, incluindo histamina. Esse fenômeno leva a efeitos patológicos, tais como vasodilatação local ou sistêmica.

Geralmente, a hipersensibilidade alimentar aparece logo depois de um bebê, criança ou animal suscetível se deparar pela primeira vez com um alimento novo. As primeiras proteínas da dieta geralmente encontradas por bebês humanos são, pelo menos, proteínas do leite de vaca e, conforme percebido acima, a alergia ao leite de vaca é a alergia alimentar mais co- mum. É geralmente aceito que bebês com alergia ao leite de vaca estabele- cida tenham um risco aumentado de desenvolver alergias a outras proteínas da dieta, tais como proteínas do ovo e cereais, porém mesmo esses bebês que tenham desenvolvido de modo bem sucedido tolerância oral às proteí- nas do leite de vaca podem desenvolver subseqüentemente alergias a ou- tras proteínas da dieta, tais como a proteínas do ovo e cereais, quando es- ses são introduzidos na dieta no desmame.

De um ponto de vista da dieta, existem duas formas de tratar uma alergia estabelecida - seja evitando o conjunto dos alimentos contendo o alérgeno ou os alimentos devem ser tratados para diminuir o seu potencial alergênico, por exemplo, por ampla hidrólise. As fórmulas infantis contendo proteínas do leite de vaca extensivamente hidrolisadas (peptídeos consistin- do em não mais do que cinco aminoácidos) são produzidas para este último propósito.

Entretanto, existe uma necessidade por produtos que auxiliem a reduzir o risco de desenvolver a alergia e promover o desenvolvimento de tolerância às proteínas intactas, particularmente em crianças consideradas como estando em risco da mesma (isto é, crianças com pelo menos um membro da família próximo o qual sofra de uma alergia). Por exemplo, foi proposto alimentar proteínas do leite de vaca parcialmente hidrolisadas para induzir tolerância oral às proteínas do leite de vaca em crianças. Fritsché et al. (J. Allergy Clin. Immunol, Vol 100, No. 2, páginas 266-273) demonstraram usando modelos animais que hidrolisados enzimáticos de proteínas do leite de vaca com um grau de hidrólise de 18% foram capazes de induzir a tole- rância oral às proteínas do leite de vaca intactas, enquanto que hidrolisados com um grau de hidrólise de 28% não foram capazes disso. Os resultados desses experimentos demonstraram que a alimentação preventiva de ratos com tal fórmula do leite de vaca moderadamente hidrolisado, cuja alergeni- cidade tenha sido reduzida em mais de 100 vezes em comparação com a fórmula-padrão, suprimiu a IgE específica e liberação de mediador dos mas- tócitos intestinais, ambos os parâmetros de uma reação alérgica tipo imedia- ta. Esse trabalho demonstrou que para as proteínas do leite de vaca é pos- sível definir um grau de hidrólise enzimática, por meio da qual a capacidade dos peptídeos de induzir a tolerância oral é mantida, enquanto que a sua alergenicidade é substancialmente reduzida.

Várias outras abordagens foram propostas para melhorar a in- dução de tolerância oral às proteínas do leite de vaca, incluindo a adminis- tração de probióticos, conforme proposto em W02003/099037, ou adminis- tração de um composto capaz de aumentar a atividade da COX-2 conforme proposto em W002/051437. Entretanto, relativamente pouca atenção tem sido prestada na indução da tolerância a outras proteínas da dieta, o que freqüentemente provoca reações alérgicas, tal como às proteínas do ovo. De fato, essa pode ser uma necessidade ainda maior, uma vez que alergia às proteínas do leite de vaca geralmente desaparece espontaneamente entre a idade de dois e cinco anos, enquanto que alergia às proteínas do ovo desa- parece de forma mais lenta e pode mesmo persistir por toda a vida. É, con- seqüentemente, um objetivo da presente invenção proporcionar um método de indução de tolerância oral às proteínas do ovo.

Sumário da Invenção

Concordantemente, a presente invenção proporciona o uso de proteínas do ovo enzimaticamente hidrolisadas com um grau de hidrólise entre 15 e 28% na produção de uma composição para indução de tolerância oral às proteínas do ovo em um mamífero.

A invenção se estende a um método de indução de tolerância oral às proteínas do ovo pelo fornecimento de uma composição a um mamí- fero necessitado do mesmo contendo uma quantidade terapêutica de proteí- nas do ovo hidrolisadas com um grau de hidrólise entre 15 e 28%.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra a antigenicidade OVA-específica residual de hidrolisados de ovo.

Figura 2 mostra a alergenicidade reduzida em um ensaio de de- sencadeamento de mastócitos funcionais.

Figura 3 mostra a capacidade de diferentes hidrolisados de pro- teína do ovo suprimir uma resposta à proteína IgE antiovo específica.

Figura 4 mostra a capacidade de diferentes hidrolisados de ovo de infra-regular o desencadeamento de mastócitos intestinais.

Figura 5 mostra que as proteínas de ovo extensivamente hidroli- sadas são incapazes de suprimir uma resposta à proteína IgE antiovo espe- cífica ou de infra-regular o desencadeamento de mastócitos intestinais. Descrição Detalhada da Invenção

Nessa especificação, os seguintes termos têm os seguintes sig- nificados:

"grau de hidrólise" ou "DH" de uma proteína significa a quantida- de de nitrogênio em grupos NH2 livres dividido pela quantidade total de ni- trogênio (grupos NH e NH2) expressa em porcentagem. "Tolerância oral" significa um estado ativo de hiporresponsivida- de imunológica aos antígenos distribuídos pela via oral.

Todas as referências às porcentagens são porcentagens em pe- so, a não ser que seja estabelecido de outra forma.

Preferivelmente, o grau de hidrólise está entre 18 e 25%, mais preferivelmente entre 23 e 25%.

A indução bem sucedida da tolerância oral às proteínas de ovo intactas usando proteínas de ovo hidrolisadas requer que um balanço seja afetado entre a antigenicidade residual das proteínas hidrolisadas e a sua capacidade de induzir a tolerância oral. Em geral, a antigenicidade residual das proteínas hidrolisadas deve ser pelo menos 100 vezes menor do que aquela das proteínas intactas.

Foi descoberto que as proteínas do ovo hidrolisadas com um grau de hidrólise entre 20 e 28% têm uma alergenicidade a qual é reduzida por um fator de pelo menos 100 em comparação com as proteínas do ovo intactas conforme medido pela técnica descrita por Fritsché et al (Int. Arch. Aller and Appl Imm., 93, 289-293, 1990).

As proteínas do ovo podem ser enzimaticamente hidrolisadas por qualquer processo adequado conhecido na técnica. Um exemplo de um processo de hidrólise adequado é uma hidrólise enzimática em dois estágios partindo do ovo integral líquido pasteurizado. O ovo líquido é aquecido até uma temperatura na faixa de 60 a 65 -C por cerca de 10 minutos, a seguir esfriado até cerca de 55 sC. Uma protease, tal como a serina endoprotease subtilisina bacteriana (vendida, por exemplo, sob a marca comercial Alcala- se®) é adicionada e a mistura é mantida em cerca de 55 qC por pelo menos duas horas para efetuar uma hidrólise parcial. A seguir, a temperatura da mistura é elevada até 70 a 75 sC e mantida nesta temperatura por cerca de 10 minutos. A mistura é novamente esfriada até cerca de 55 2C e uma outra quantidade de enzima é adicionada. A mistura é mantida em cerca de 55 sC por pelo menos mais duas horas para alcançar o grau necessário de hidróli- se. A temperatura é, a seguir, elevada até entre 85 e 95 sC e ali mantida por um período de até 30 minutos para inativar as enzimas e finalizar a hidrólise. O ovo hidrolisado líquido resultante pode ser usado nesse estado ou pode ser atomizado para produzir um produto em pó, conforme preferido.

Uma composição adequada para uso na presente invenção po- de ser qualquer produto alimentar, no qual o ovo integral é convencional- mente incorporado ao ovo integral substituído pelo ovo hidrolisado, no qual as proteínas do ovo têm um grau de hidrólise entre 20 e 28%. O ovo em pó hidrolisado produzido conforme descrito acima, por exemplo, pode ser usado no lugar do ovo em pó total em receitas tais como pudins assados, quiches, creme de caramelo. Alternativamente, o ovo em pó hidrolisado pode ser re- constituído com água e usado para preparar iguarias, tais como omeletes e ovos mexidos. Ovo em pó hidrolisado é um ingrediente particularmente ade- quado em alimentos para bebês e crianças pequenas, particularmente ali- mentos adequados para uso nos primeiros estágios do desmame. Novamen- te, o ovo em pó hidrolisado pode ser usado no lugar do pó de ovo integral convencionalmente usado para preparar tais produtos.

Conforme notado acima, alergias às proteínas da dieta não es- tão restritas aos seres humanos e o método da presente invenção também pode ser usado para induzir tolerância oral às proteínas do ovo em outros mamíferos, particularmente em animais de companhia, tais como cachorros e gatos. Proteínas do ovo hidrolisadas com um grau de hidrólise entre 15 e 28% podem, deste modo, também ser usadas para substituir ovo integral em alimentos para animais de companhia, particularmente em alimentos tencio- nados para filhotes de cachorro e gatinhos desmamando, por exemplo.

A invenção será agora adicionalmente descrita com referência aos seguintes exemplos.

Preparação de hidrolisados de ovo

O material de partida foi ovo integral líquido pasteurizado, FT/ON/0/0105 R, ABCD S/A, Avicole Bretonne Cecab Distribution (Ploèrmel, França). Exemplo 1

.30 Kg de ovo integral líquido foi aquecido a 65 sC por 10 min com agitação a 250 rpm. Depois de esfriar até 55 QC, 2% de enzimas Prota- mex® (lote PW2A1006, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Dinamarca) foram adicionados e a mistura foi mantida a 55 9C por 2 horas. Depois desta pri- meira etapa de hidrólise, 1% de enzimas Flavourzyme® 1000 L (lote 400904, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Dinamarca) foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75 qC por 10 min. A mistura foi, a seguir, esfriada até 55 5C1 mais 1% de enzimas Flavourzyme foi adicionado e a mistura foi man- tida a 55 qC por 2 horas. Depois dessa segunda etapa de hidrólise, a mistura foi aquecida a 90 qC por 30 min e, a seguir, secada por atomização para ob- ter ovo em pó hidrolisado, o qual foi condicionado em uma bolsa de alumí- nio.

Exemplo 2

.35 Kg de ovo integral líquido foram aquecidos a 65 -C por 10 min com agitação a 250 rpm. Depois de esfriar até 55 9C, 5% de enzimas Protamex® (lote PW2A1006, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Dinamarca) fo- ram adicionados e, a mistura foi mantida a 55 2C por 2 horas. Depois desta primeira etapa de hidrólise, 1% de enzimas Flavourzyme® 1000 L (lote 400904, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Dinamarca) foi adicionado e a mistu- ra foi aquecida a 75 qC por 10 min. A mistura foi, a seguir, esfriada até 559C, mais 4% de enzimas Flavourzyme foram adicionados e a mistura foi mantida a 559C por 2 horas. Depois desse segundo passo de hidrólise, a mistura foi aquecida a 90-C por 30 min e, a seguir, secada por atomização para obter ovo em pó hidrolisado, o qual foi condicionado em uma bolsa de alumínio. Exemplo 3

.30 Kg de ovo integral líquido foram aquecidos a 65 -C por 10 min com agitação a 250 rpm. Depois de esfriar até 55 sC, 10% de enzimas Alcalase® 2,4L (lote 500357, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Dinamarca) foi adicionado e a mistura foi mantida a 55 eC por 2 horas. Depois desta primei- ra etapa de hidrólise, a mistura foi aquecida a 75 -C por 10 min. A mistura foi, a seguir, esfriada até 55 eC, mais 10% de enzimas Alcalase foram adi- cionados e a mistura foi mantida a 55 9C por 2 horas. Depois dessa segunda etapa de hidrólise, a mistura foi aquecida a 90 9C por 30 min e, a seguir, se- cada por atomização para obter ovo em pó hidrolisado, o qual foi condicio- nado em uma bolsa de alumínio.

Produtos contendo ovo integral hidrolisado

Exemplo 4

Um exemplo dos ingredientes para um pudim de ovos doce con- tendo ovo hidrolisado é feito como se segue:

Ingrediente %

Leite integral (3,5% de gordura) 62,0

Água 24,3

Açúcar 5,5

Ovo em pó hipoalergênico 2,5

Amido de milho 3,0

Amido de tapioca 2,0

Flavorizante de baunilha 0,7

O pudim pode ser feito por qualquer método adequado conheci- do na técnica.

Exemplo 5

Um exemplo dos ingredientes para um pudim de ovos saboroso contendo ovo hidrolisado é feito como a seguir:

Ingrediente %

Leite integral (3,5% de gordura) 62,0

Água 21,5

Cubos de cenoura congelados 10,0

Ovo em pó hipoalergênico 1,5

Amido de milho 3,0

Amido de tapioca 2,0

O pudim pode ser feito por qualquer método adequado conheci- do na técnica.

Exemplo 6

Um exemplo dos ingredientes para um produto de massa de o- vos contendo ovo hidrolisado é feito como a seguir:

Ingrediente %

Semolina de trigo duro 70,6 <table>table see original document page 10</column></row><table>

A pasta pode ser feita por qualquer método adequado conhecido na técnica.

Antigenicidade residual de hidrolisados de ovo

A antigenicidade residual da proteína ovalbumina (OVA) nos hi- drolisados dos Exemplos 1, 2 e 3 foi determinada por inibição de ELISA com um anti-soro de proteína anti-OVA de coelho policlonal. As cavidades das placas de microtitulação foram revestidas com 100 μL de OVA a 50 μg/mL em um tampão carbonato-bicarbonato e incubados por 24 horas a 4 sC. As placas foram lavadas 4 vezes em um tampão PBS-Tween e sítios reacionais livres foram bloqueados pela adição de 200 μL/cavidade de gelatina de pei- xe (0,5% em PBS-Tween). As placas foram incubadas por 1 hora em tempe- ratura ambiente (TA) e lavadas novamente 4 vezes em PBS-Tween.

Em tubos separados, a parte 1 da preparação OVA padrão ou amostra de teste é incubada por 1 hora em TA com a parte 1 de anticorpo de proteína anti-OVA de coelho (diluída 1:20,000). Depois da incubação, 100 μί dessa mistura inibitória são adicionadas nas cavidades de microtitulação revestidas, bloqueadas e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 4 vezes em PBS-Tween. Um conjugado marcado de peroxidase anticoelho (0,1 mL de uma diluição 1:2000) foi, a seguir, adi- cionado, as placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente e lavadas 4 vezes em PBS-Tween. O substrato cromogênico (0,1 mL de O- fenilenodiamina) foi adicionado. Depois de 15 minutos de incubação, a den- sidade ótica foi lida a 492 nm em um leitor de placas de ELISA.

Os resultados estão mostrados na figura 1, da qual pode ser vis- to que a antigenicidade OVA-específica dos hidrolisados dos Exemplos 1 a 3 foi reduzida por um fator de mais de 10.000 em comparação com a proteína de ovo intacta.

Alerqenicidade residual dos hidrolisados de ovo

Um ensaio funcional in vitro de serotonina titulada liberada de mastócitos de rato sensibilizados foi usado para determinar a alergenicidade dependente de IgE de uma molécula antigênica (OVA) conforme anterior- mente descrito (Fritsché et al. J. Allergy Clin. Immunol, Vol 100, No.2, pági- nas 266-273). Resumidamente, mastócitos foram obtidos a partir de ratos Sprague-Dawley normais por lavagens peritoneais em meio Eagle modifica- do da Dulbecco contendo 10% de soro de bezerro fetal. As células foram lavadas nesse meio e mantidas de um dia para o outro a 4 sC. Depois de duas lavagens em tampão fosfato-HEPES-gelatina de peixe (PHG) pH 7,0, as células foram ressuspensas no mesmo tampão a 5 χ 105 células/mL e diluídas com um volume de soro de rato rico em anticorpos IgE anti-OVA contendo 5 μΟΐ/ηηΙ_ de serotonina H3. Depois da incubação a 37 2C por 2 ho- ras, as células foram adicionalmente lavadas três vezes em PHG e ressus- pensas em PHG em 2,5 χ 105 células/mL Mastócitos sensibilizados foram distribuídos em placas de microtitulação (0,1 mUcavidade) e misturadas até 0,05 ml_ de diluições em série de proteínas do ovo hidrolisadas produzidas de acordo com o Exemplo 2 (1/10 iniciando em 10 mg/ml_). A mistura foi in- cubada 60 minutos a 37 qC e centrifugada. Uma alíquota (0,05 mL) do so- brenadante foi misturada com 2 mL de fluido de cintilação e a liberação de 3H foi medida usando um β-contador Packard. Os resultados estão mostrados na figura 2, da qual pode ser vis-

to que o ovo hidrolisado tinha uma alergenicidade muito reduzida (25 μg de OVA/g de equivalente de proteína) e que esse valor baixo foi mantido quan- do o ovo hidrolisado foi incorporado em uma sobremesa tipo flan. Indução da tolerância oral às proteínas do ovo por alimentação com hidroli- sado de proteína do ovo

A capacidade de indução de tolerância oral dos produtos de ovo foi investigada usando um modelo de rato in vivo. Seis grupos de ratos S- prague-Dawley (6 animais/grupo) suscitados em uma dieta sem proteína de ovo foram dados diferentes proteínas de ovo líquido experimen- tais/hidrolisatos de ovo ou água (controle) ad Iibitum nas suas garrafas de bebida e uma dieta de pélete sem proteína de ovo sólida dos dias 1 ao 19 do experimento. Aos animais foram dados os seguintes produtos: grupo A, pó de ovo integral (20 g/L);

grupo B, pó de ovo hidrolisado do Exemplo 3 (120 g/L), DH 25%;

grupo C, pó de ovo hidrolisado do Exemplo 2 (120 g/L), DH 23%;

grupo D, pó de ovo hidrolisado do Exemplo 1 (120 g/L), DH 20%;

grupo E, pó de ovo hidrolisado ultrafiltrado do Exemplo 3 (120 g/L) DH 31%;

grupo F, H2O (controle).

O pó de ovo hidrolisado ultrafiltrado dado ao Grupo E foi obtido como a seguir. O substrato de ovo líquido hidrolisado obtido no exemplo 3 foi microfiltrado usando um módulo de filtração (Sefiltec, FBF 0102) com um filtro de bolsa de 100 μηι (PGF 51 E 02). Depois dessa etapa de microfiltra- ção, o permeado foi ultrafiltrado usando um módulo UF caseiro com mem- branas de 4000 Daltons (ES404, PES, 4000 MWCO, PCI Membrane Sys- tems). O permeado foi, a seguir, liofilizado.

O nitrogênio total dos hidrolisados foi determinado pelo procedi- mento Dumas (método Cario Erba). O grau de hidrólise foi medido pelo mé- todo TNBS de acordo com Adler-Nissen (J. Agric. Food. Chem. 1979 27: 1256-1262).

Todos os ratos foram imunizados no dia 5 do experimento por injeção subcutânea de 0,1 mg de ovalbumina + 0,2 mL 3% de AI(OH)3. No dia 19, todos os animais foram mortos. O sangue foi retirado e os soros fo- ram analisados para anticorpos IgE específicos (antiovalbumina) por ELISA, conforme descrito anteriormente (Fritsché R, Bonzon M. Int Arch Allergy Appl Immunol 1990;93:289-93). Em resumo, as placas de microtitulação foram revestidas com OVA por 24 horas a 4 9C. As placas foram lavadas com PBS Tween 20 e saturadas por 1 h com gelatina de peixe. Depois da adição dos soros do teste, diluição em série (1/2) e incubação por 2 h, um anti-soro de IgE anti-rato de ovelha foi adicionado. Depois de 1 h em temperatura ambi- ente, um segundo anticorpo marcado com peroxidase foi adicionado por 1 hora, seguido pelo substrato (o-fenilenodiamina). A densidade ótica de uma reunião 1:5 diluída em soros de ratos normais a 492 nm foi considerada co- mo um fundo não-específico. As concentrações dos anticorpos específicos foram expressas como diluições máximas dos soros de teste acima deste valor.

A protease de mastócitos de rato (RMCPII) é liberada no sangue após o desencadeamento mediado por IgE dos mastócitos intestinais. O de- safio oral pela liberação de RMCPII é uma medida da sensibilização ou tole- rância a IgE no nível de mastócito intestinal. Os níveis RMCPII são determi- nados com um kit ELISA comercial (Moredun Animal Health Ltd., Edinburgh, Escócia) baseando-se no princípio do teste sanduíche no qual o revestimen- to da placa é feito com um anticorpo anti-RMCPII monoclonal, seguido pela adição de soro de teste e um segundo anticorpo policlonal anti-RMCPII de ovelha acoplado com a peroxidase de rábano silvestre.

Os resultados estão mostrados nas figuras 3, 4 e 5. A partir da figura 3, pode ser visto que os hidrolisados de proteína de ovo dos exemplos 1 a 3 são capazes de suprimir uma resposta de proteína IgE antiovo especí- fica quando alimentados aos animais durante 19 dias ad Iibitum em compa- ração com o controle não-tolerado, Grupo F), o qual induziu altos níveis de anticorpos IgE anti-ovo. Mais precisamente, níveis IgE anti-OVA (expressos como Iog dos títulos de anticorpo) foram os seguintes: grupo A, 4+/- 1,1; grupo B, 4,1 +/- 0,9; grupo C, 3,3 +/- 1,1; grupo D, 4,1 +/- 2,0; grupo F, 6,1 +/- 0,3. Ao comparar os grupos, todos os grupos de A a D são significativa- mente diferentes (p < 0,05) do grupo F (controle).

A figura 4 também mostra que o desencadeamento dos mastóci- tos intestinais é infra-regulado nos grupos A, B, C e D, porém não no grupo F (controle). Os valores, expressos em μg RMCPII/mL, são os seguintes: grupo A, 0 +/- 0,0; grupo B, 0,6 +/- 1,0; grupo C, 1,2 +/- 1,7; grupo D, 0,6 +/- 0,8; grupo F1 2,8 +/- 0,7. Quando há comparação entre os grupos, todos os grupos de A até D são significativamente diferentes (p < 0,05) do grupo F (controle).

A figura 5 mostra que as proteínas de ovo extensivamente hidro- lisadas alimentadas ao grupo E não induzem tolerância oral a OVA, confor- me medido pela supressão de uma resposta de proteína IgE antiovo especí- fica ou infra-regulação do desencadeamento de mastócitos intestinais: os níveis de IgE anti-OVA e RMCPII não são diferentes dos valores obtidos pa- ra o grupo de controle.

Claims

1. Uso de proteínas de ovo enzimaticamente hidrolisadas com um grau de hidrólise entre 15 e 28% na produção de uma composição para indução da tolerância oral às proteínas de ovo em um mamífero.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero é um ser humano.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, em que a composição é um alimento de desmame para um bebê.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero é um animal de companhia, tal como um gato ou um cachorro.

5. Uso, de acordo com uma das qualquer uma das reivindica- ções 1a 4, em que o grau de hidrólise está entre 23 e 25%.