DE69625690T3

DE69625690T3 - Verfahren zur vorbeugung und behandlung von allergien

Info

Publication number: DE69625690T3
Application number: DE69625690T
Authority: DE
Inventors: Erika Isolauri; Leena METSÄNIITTY; Hannu Korhonen; Seppo Salminen; Eeva-Liisa Syväoja
Original assignee: Valio Oy
Current assignee: Valio Oy
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2009-12-24
Anticipated expiration: 2016-06-13
Also published as: RO120243B1; DK0833649T3; EE03424B1; CZ291904B6; DK0833649T4; CA2224320A1; CZ399797A3; CN1154506C; AU710126B2; JP3983804B2; DE69625690T2; SK171597A3; DE69625690D1; NZ310478A; US7172756B2; NO975832D0; AU6127896A; EE9700339A; IL122577A0; WO1997000078A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysat-Formulierungen zur Suppression lebensmittelinduzierter Überempfindlichkeitsreaktionen bei Patienten, die an Lebensmittelallergie leiden. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der Hydrolysatprodukte zur Herstellung pharmazeutisch wirksamer Formulierungen zur Vorbeugung oder Behandlung von Allergien, insbesondere von Kuhmilchallergie bei Kleinkindern. Die Erfindung betrifft ferner die Entwicklung spezieller Formulierungen für allergische Kleinkinder mit beeinträchtigter Funktion der Darmbarriere.
Kuhmilchallergie (CMA) wird als eine immunvermittelte Unverträglichkeitsreaktion auf Kuhmilchproteine definiert. Die augenblickliche Behandlung der Wahl ist die vollständige Eliminierung von Kuhmilchantigenen. Bei Kleinkindern mit CMA ist es notwendig, eine Ersatzformulierung zu verwenden, wenn keine Humanmilch verfügbar ist. Für eine adäquate Ernährung mit verringerter Antigenbelastung werden hydrolysierte Formulierungen auf Basis von Molke oder Casein aus Kuhmilch verwendet. Die vorbereitende Wärmebehandlung von Kuhmilch beeinträchtigt hauptsächlich die Proteinkonformation und erleichtert ihre Hydrolyse. Anschließende enzymatische Hydrolyse mit Pepsin, Trypsin, Pankreasextrakten und Extrakten aus der Darmschleimhaut führt zu einem fortschreitenden Abbau sequenzieller Epitope und bringt die Formulierungen in ihre am wenigsten antigene und allergene Form.
In den meisten Fällen können weitgehend hydrolysierte, aus Kuhmilch stammende Formulierungen sicher verabreicht werden, und sie sind effizient und werden klinisch und metabolisch gut toleriert. Enzymatische Hydrolyse macht die Formulierungen jedoch nicht notwendig nicht-allergen, da der optimale Hydrolysegrad nicht bekannt ist und im Hydrolysat Spuren des ursprünglichen Proteins nachweisbar sind. Daher muß die Verabreichung dieser Ersatzstoffe an Kinder mit Kuhmilchallergie vorsichtig erfolgen.
Der Ansatz, allergische Entzündungen durch Antigeneliminierung zu verhindern, war nicht zufriedenstellend, insbesondere bei Patienten mit multiplen Lebensmittelallergien (Sampson et al., 1992). Diese Patienten zeigen häufig eine gesteigerte Darmpermeabilität und Dysfunktion der Abwehrbarriere des Darms (Majamaa et al., 1996, Majamaa und Isolauri, 1996). Dies erhöht das Risiko für Wachstumsstörungen und Sensibilisierung gegen multiple Lebensmittel. Zur Verbesserung der Ersatzformulierungen bei CMA zur Behandlung von Kuhmilchallergie werden dringend neue Ansätze benötigt.
Die Antigenverarbeitung im Darm bestimmt die nachfolgende Immunreaktion auf das Antigen. Im gesunden Zustand werden Antigene auf zwei funktionellen Wegen durch das Epithel absorbiert. Der Hauptweg ist degradative Reduktion der Immunogenität des Antigens. Ein Nebenweg, der für antigenspezifische Immunreaktionen wichtig ist, erlaubt den Transport von intakten Proteinen. Aberrante Antigenabsorption fördert den Sensibilisierungsprozeß (Fargeas et al., 1995).
Die differentielle Produktion von Zytokinen durch T-Helferzellen (Th-Zellen) während einer Immunreaktion hat wichtige regulatorische Wirkungen auf die Natur der Immunreaktion. Das Zytokinprofil der natürlichen Immunreaktion bestimmt den Phänotyp der anschließenden spezifischen Immunreaktion. Außer für die Kontrolle der IgE-Synthese ist IL-4 für die Entwicklung und Reifung des für allergische Entzündungen charakteristischen Th2-Phänotyps von Bedeutung.
Dieser Prozeß scheint für die Toleranzentwicklung gegenüber mit der Nahrung aufgenommenem Protein wesentlich zu sein. Orale Toleranz ist ein Zustand antigenspezifischer systemischer Nicht-Reaktivität, der durch eine lokale antigenspezifische IgA-Reaktion gekennzeichnet ist.
Vor kurzem wurde gezeigt, daß ein isolierter humaner intestinaler Stamm, Lactobacillus-Stamm GG (Lactobacillus GG, ATCC 53103), lokale IgA-Reaktionen gegen Antigene in der Ernährung beim Weg durch den Darm fördern und daher bei der Immuneliminierung helfen kann (Isolauri et al., 1993). Bislang ist nicht bekannt, ob bestimmte Stämme von Darmbakterien die Immunogenität der Lebensmittelantigene unmittelbar modifizieren und auf diese Weise Überempfindlichkeitsreaktionen herunterregulieren können.
Die mikrobielle Flora von gesundem Darm enthält Lactobazillen. Man nahm an, daß Lactobazillen im Darmtrakt wirken, indem sie auf der Darmschleimhaut mit pathogenen Mikroben um Rezeptoren und Nährstoffe konkurrieren.
Probiotika sind lebensfähige mikrobielle Präparate, die gesundheitsfördernd wirken, indem sie die natürliche Mikroflora im Darm aufrechterhalten. Ein mikrobielles Präparat kann als Probiotikum anerkannt werden, wenn seine wirksamen Mikroben und ihre Wirkungsweise bekannt sind. Die Probiotika lagern sich an die Darmschleimhaut an, kolonisieren den humanen Darmtrakt und verhindern die Adhäsion schädlicher Mikroben. Eine wesentliche Annahme ist, daß sie bis zur Darmschleimhaut gelangen und nicht im oberen Teil des Magendarmtrakts abgetötet werden. Lactobacillus GG ist eines der bekannten Bakterien mit probiotischen Eigenschaften.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder haben nun entdeckt, daß der Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) dazu verwendet werden kann, um die Effizienz von Eliminierungsdiäten bei der Vorbeugung oder Behandlung von lebensmittelinduzierten Überempfindlichkeitsreaktionen bei einem Patienten zu steigern und die orale Toleranz zu verbessern.
Ein Aspekt der Erfindung besteht darin, daß Proteinhydrolysate, die durch Hydrolyse von Proteinen mit den oben erwähnten gastrointestinalen Bakterien erhalten wurden, auch zu diesem Zweck verwendet werden können. Wir zeigen hier, daß erfindungsgemäß erhaltene Proteinhydrolysate eine immunologische Wirkung besitzen, die eine Hypoallergisierung fördert. Die Hydrolysate regulieren Überempfindlichkeitsreaktionen herunter und stärken so die Immunfunktion der Darmbarriere, d. h. sie stabilisieren die Darmschleimhautbarriere.
Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Proteinhydrolysat-Formulierung zum Herunterregulieren von Überempfindlichkeitsreaktionen und zum Stärken der Immunfunktion der Darmbarriere dar. Die Hydrolysatformulierung ist durch Hydrolysieren von Proteinen mit Enzymen, die aus dem Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) stammen, und mit Trypsin und/oder Pepsin erhältlich. Das Herstellungsverfahren für die Proteinhydrolysat-Formulierung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Alternativ läßt sich eine erfindungsgemäße Proteinhydrolysat-Formulierung erhalten, indem man Proteine mit Trypsin und/oder Pepsin hydrolysiert und dem so erhaltenen Hydrolysat ein Bakterienpräparat zugibt, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt. Das Verfahren zur Herstellung der Proteinhydrolysat-Formulierung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Bakterien werden der Hydrolysatformulierung vorzugsweise als lyophilisiertes Präparat zugegeben.
Beim Verabreichen einer solchen Hydrolysatformulierung an einen Patienten ist zu erwarten, daß die Hydrolyseenzyme der anwesenden Bakterien in vivo freigesetzt werden, wodurch derselbe Effekt wie mit einer wie oben definierten verbesserten Hydrolysatformulierung erzielt wird. Darüber hinaus stabilisieren die lebensfähigen Bakterien die Darmschleimhautbarriere und verbessern so die lokale Abwehr.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der verbesserten Proteinhydrolysat-Formulierung der Erfindung oder, alternativ, einer Proteinhydrolysat-Formulierung zusammen mit einem Bakterienpräparat, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt, zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Vorbeugung oder Behandlung von lebensmittelinduzierten Überempfindlichkeitsreaktionen bei einem gefährdeten Kleinkind.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der verbesserten Proteinhydrolysat-Formulierung der Erfindung oder, alternativ, einer Proteinhydrolysat-Formulierung zusammen mit einem Bakterienpräparat, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt, zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Behandlung von Kuhmilchallergie bei einem Patienten.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der verbesserten Proteinhydrolysat-Formulierung der Erfindung für einen Patienten oder, alternativ, eines Bakterienpräparats, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt, oder, alternativ, einer Proteinhydrolysat-Formulierung zusammen mit einem Bakterienpräparat, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt, zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur oralen Verabreichung zur Verstärkung tolerogener Immunreaktionen gegenüber Lebensmittelantigenen bei einem Patienten.
Wenn bei den wie oben definierten erfindungsgemäßen Verwendungen eine Proteinhydrolysat-Formulierung in Kombination mit Lactobacillus GG (ATCC 53103) eingesetzt wird, kann es sich bei einer solchen Formulierung um jede geeignete Proteinhydrolysat-Formulierung, bekannt oder neu, handeln. Es kann sich also entweder um ein partielles Proteinhydrolysat oder, alternativ, um eine weitgehend hydrolysierte Formulierung handeln. Die Herstellung eines für diesen Zweck geeigneten Proteinhydrolysats ist z. B. in der EP-Patentanmeldung Nr. 601 802 beschrieben.
Der Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) und seine Adhäsions- und Koloniebildungsseigenschaften sind in EP-Patent 199 535 beschrieben.
Abkürzungen

CI

Konfidenzintervall

IFN-γ

Interferon-γ

IgA

Immunglobulin A

IgE

Immunglobulin E

IL-4

Interleukin-4

LGG

Lactobacillus GG (ATCC 53103)

OKT3

anti-CD3-Antikörper

PBMC

periphere mononukleäre Blutzellen

TNF-α

Tumornekrosefaktor α

WF

Testgruppe, die weitgehend hydrolysierte Molkeformulierung erhielt

WF-GG

Testgruppe, die weitgehend hydrolysierte Molkeformulierung und LGG-Präparat erhielt

P/T-Casein = mit Pepsin und Trypsin hydrolysiertes Casein
P/T-α_s1-Casein = mit Pepsin und Trypsin hydrolysiertes α_s1-Casein

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A–1D Mitogeninduzierte proliferative Reaktionen von PBMCs in vitro auf P/T-Casein (1A), P/T-α_s1-Casein (1B), zusätzlich mit Enzymen aus LGG hydrolysiertes P/T-Casein (1C) und zusätzlich mit Enzymen aus LGG hydrolysiertes P/T-α_s1-Casein (1D). Ergebnisse sind als Mittelwert der Counts pro Minute für Kulturen ohne hydrolysiertes Produkt (PHA-RPMI 1640) und mit hydrolysiertem Produkt bei drei Konzentrationen (0,1, 10 und 1000 μg/ml) angegeben. Horizontale Linien stellen den geometrischen Mittelwert der Counts pro Minute der sechs Experimente dar, für jede einzelne Person gleich ausgezählt.
2 Klinischer Score von atopischer Dermatitis (SCORAD) bei jedem Patienten und medianer Score für Ausmaß (A), Intensität (B) und subjektiver Score (C) für atopische Dermatits vor Behandlung (0) und einen Monat später (I) bei Kleinkindern, die weitgehend hydrolysierte Molkeformulierung ohne (WF) oder mit Lactobacillus GG (WF-GG) erhielten.
3 Wirkung von Casein und von mit Lactobacillus GG abgebautem Casein auf die Produktion von IL-4 und IFN-γ durch PBMC bei atopischen Patienten (a, b) und bei nicht-atopischen gesunden Kindern (c, d). Weiße Säulen stellen die mittlere Zytokinproduktion in Kontrollkulturen dar; schwarze Säulen in Kulturen, die gereinigtes Casein enthalten; und schraffierte Säulen in Kulturen, die mit Lactobacillus GG abgebautes Casein enthalten. Sich schneidende Linien stellen das obere und untere Quartil dar. *Statistisch signifikanter paarweiser Vergleich mit Kontrollkulturen.
4 Wirkung von α_s1-Casein und von mit Lactobacillus GG abgebautem α_s1-Casein auf die Produktion von IL-4 und IFN-γ durch PBMC bei atopischen Patienten (a, b) und bei nicht-atopischen gesunden Kindern (c, d). Weiße Säulen stellen die mittlere Zytokinproduktion in Kontrollkulturen dar; schwarze Säulen in Kulturen, die α_s1-Casein enthalten; und schraffierte Säulen in Kulturen, die mit Lactobacillus GG abgebautes α_s1-Casein enthalten. Sich schneidende Linien stellen das obere und untere Quartil dar. *Statistisch signifikanter paarweiser Vergleich mit Kontrollkulturen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher. Es werden sowohl Verfahren zur Herstellung des bevorzugten Hydrolysats beschrieben als auch Experimente, die die bei den vorliegenden Untersuchungen beobachtete vorteilhafte therapeutische Wirkung beschreiben.
Experimenteller Teil
Beispiel 1 Suppression von Lymphozytenproliferation in vitro durch bovine Caseine, hydrolysiert mit Enzymen aus Lactobacillus GG
1.a. Hydrolyse von Kuhmilchproteinen
Gesamtes bovines Casein und Caseinkomponenten (α_s1-Casein) wurden aus Kuhmilch gereinigt (Syväoja, 1992). Die Hydrolyse mit der Enzymmischung aus Lactobacillus GG erfolgte getrennt mit Casein und α_s1-Casein. Die Enzyme wurden mit der modifizierten Methode von Exterkate und de Veer, 1985, isoliert. Kurz, die Enzyme wurden durch Beschallung gefrorener Bakterienzellen freigesetzt. Der Überstand der abzentrifugierten Zellen wurde abgetrennt und zur Hydrolyse von Casein und α_s1-Casein verwendet. Die Hydrolyse erfolgte 24 h bei 34°C.
Die so erhaltenen GG-Hydrolysate wurden mit Pepsin und Trypsin weiter hydrolysiert. Kurz, die Proben wurden zuerst 3 Stunden bei 37°C mit 0,1% Pepsin in 0,1 mol/l HCl, pH 2,5, hydrolysiert. Nach Einstellung des pH mit 250 mg NaHCO₃ und 2 mol/l NaOH wurde 0,1% Trypsin zu den Proben gegeben und diese wurden 5 Stunden bei 37°C, pH 8,0, hydrolysiert.
P/T-Casein- und PT-α_s1-Caseinproben wurden wie oben beschrieben durch Hydrolysieren von gereinigtem Casein und von α_s1-Caseins nur mit Pepsin und Trypsin, ohne GG-Hydrolysierung, erhalten.
1.b. Lymphozytentransformationstest
Zur mitogeninduzierten Lymphozytentransformation wurde eine Modifikation der Vollblut-Mikromethode verwendet. Sechs bis acht gesunde Individuen stellten sich als Blutspender für das Experiment zur Verfügung. Kurz, es wurde heparinisiertes venöses Blut erhalten und mit RPMI 1640-Kulturmedium (Grand Island Biological Co. NY, USA) mit Antibiotika 1:7 verdünnt. Phytohämagglutinin (PHA) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) wurde mit antibiotikahaltigem RPMI 1640 verdünnt, wobei die Endkonzentrationen in den Kulturen zwischen 5 und 1250 μg/ml lagen. Lyophilisierte Casein- und α_s1-Caseinhydrolysate wurden in RPMI 1640 bis auf Endkonzentrationen von 0,1 μg/ml (nieder), 10 μg/ml (mittel) und 1000 μg/ml (hoch) verdünnt, die sich bei Farbstoff-Ausschlußtests mit Eosin als für T-Zellen nichttoxisch erwiesen hatten.
Es wurden zwei Serien von Experimenten durchgeführt, um die mitogeninduzierten proliferativen Reaktionen peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) auf (A) mit Pepsin und Trypsin hydrolysiertes Casein (= P/T-Casein), (B) mit Pepsin und Trypsin hydrolysiertes α_s1-Casein (= P/T-α_s1-Casein), (C) zusätzlich mit Enzymen aus Lactobacillus GG hydrolysiertes P/T-Casein, und (D) zusätzlich mit Enzymen aus Lactobacillus GG hydrolysiertes P/T-α_s1-Casein zu untersuchen.
Das Experiment bestand aus vier Kontrollkulturen mit verschiedenen Verdünnungen des Kulturmediums und des Mitogens, sowie entsprechenden Testkulturen mit 25 μl hydrolysierten Produkten bei drei verschiedenen Konzentrationen. Der Test wurde wie bei Sütas et al., 1996, beschrieben durchgeführt.
Die mitogeninduzierte Proliferation von PBMCs wurde als Counts pro Minute angegeben, Hintergrund ausgeschlossen. Die Ergebnisse wurden für die Kontrollkulturen mit 125 μg/ml PHA und RPMI 1640 und für die drei Testkulturen mit 125 μg/ml PHA und hydrolysierten Produkten in niederer, mittlerer und hoher Konzentration dargestellt.
1.c. Statistische Analyse
Ein nichtparametrischer paarweiser Test (Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtest) wurde verwendet, um die Veränderung in den Counts pro Minute einer jeden Testkultur mit denen der Kontrollkulturen zu vergleichen. Der Signifikanzgrad betrug p < 0,05. Signifikante Ergebnisse von paarweisen Vergleichen wurden als Suppression oder Stimulation entsprechend der Abnahme oder Zunahme in den Counts pro Minute in den Testkulturen dargestellt.
1.d. Ergebnisse
Bei den Experimenten, die mit P/T-Casein und P/T-α_s1-Casein durchgeführt wurden, das zusätzlich mit Enzymen aus Lactobacillus GG hydrolysiert war, war die mitogeninduzierte Proliferation von PBMCs bei 0,1, 10 und 1000 μg/ml signifikant supprimiert (p = 0,03, p = 0,03 und p = 0,03) (1C und 1D), verglichen mit P/T-Casein und P/T-α_s1-Casein (1A und 1B).
Beispiel 2. Behandlung von Kleinkindern mit atopischer Dermatitis mit einer mit Milchsäurebakterien supplementierten Hydrolysatformulierung
2.a. Patienten und Versuchsaufbau
Die Untersuchung umfaßte 31 Kleinkinder im Alter von 2,5 bis 15,7 (mittleres Alter 8) Monaten, die die Hanifin-Kriterien (Hanifin, 1987) für atopisches Ekzem bei Kindern erfüllten. Sie waren auf der Basis von atopischem Ekzem und vermuteter Kuhmilchallergie an eine pädiatrische Klinik verwiesen worden. Das mittlere Alter bei Einsetzen der Symptome betrug 2,4 Monate. Die Dauer der gesamten Stillzeit betrug 5,9 Monate. Bei 26 (84%) Patienten wurde eine positive Familiengeschichte für atopische Erkrankungen (Asthma, atopisches Exzem und allergische Rhinitis) oder für Lebensmittelallergie bei Verwandten ersten Grades festgestellt. Die ekzematösen Läsionen wurden mit Erweichungsmitteln und topischen Kortikosteroiden behandelt. Kein Patient erhielt systemische Kortikosteroidtherapie. Neben atopischem Ekzem wurden bei 9 (19%) Patienten gastrointestinale Störungen wie dünner Stuhl, Erbrechen oder Diarrhöe beobachtet. Nach den Untersuchungsperioden wurden die Patienten einer Placebokontrollierten Doppelblind-Provokationen mit Kuhmilch unterzogen. Nur diejenigen, die eine positive Reaktion zeigten (27/31), wurden in die endgültige Untersuchungspopulation aufgenommen.
Die Patienten wurden einen Monat lang auf zwei Gruppen randomisiert. Eine Gruppe (WF, n = 14) erhielt weitgehend hydrolysierte Molkeformulierung (Valio Ltd., Helsinki, Finnland, EP-A-601802 ) und eine weitere Gruppe (WF-GG, n = 13) erhielt die gleiche Formulierung zusätzlich mit Lactobacillus GG-Präparat (5 × 10⁸ cfu/g) (zur Verfügung gestellt von Valio Ltd., Helsinki, Finnland). Nach der einmonatigen Therapie mit den ihnen zugeteilten Formulierungen erhielten beide Gruppen einen weiteren Monat lang eine weitgehend hydrolysierte Molkeformulierung (Valio Ltd.). Die Gesamtkonzentration an Serum-IgE, Kuhmilch-spezifisches IgE (RAST, Pharmacia, Uppsala, Schweden) und Haut-Pricktests wurden von allen Patienten vor der diätetischen Intervention bestimmt. Der Pricktest erfolgte an der volaren Partie des Unterarms, wobei ein kommerziell erhältliches Kuhmilchallergen ALK (Allergologisk Laboratorium, Horsholm, Dänemark) und eine auf normale Lebensmittelkonzentration verdünnte Testformulierung eingesetzt wurden. Es wurde eine 1 mm-Einmal-Lanzette mit Anschlag verwendet, um eine tiefere Penetration (ALK) zu verhindern, wobei Histamin-Dihydrochlorid, 10 mg pro Milliliter (ALK), als positive Kontrolle diente. Die Reaktionen wurden nach 15 Minuten abgelesen und eine Reaktion mit der Hälfte der Reaktionsstärke des Histamins oder mehr wurde unter der Bedingung als positiv vermerkt, daß der mittlere Durchmesser der Quaddel wenigstens 3 mm betrug und die negative Kontrolle gleichzeitig 0 mm war.
Fäkalproben zur Bestimmung von α-1-Antitrypsin und TNF-α wurden vor Beginn der Behandlung und 1 (entsprechend der Untersuchungsdauer) und 2 Monate später gesammelt.
Die Schwere der atopischen Dermatitis wurde entsprechend der SCORAD-Methode, etabliert durch die ”European Task Force an Atopic Dermatitis” (1993), bewertet. Kurz, es wurde das Ausmaß (Score A) der Dermatitis mit der Neunerregel bestimmt. Die Intensität (Score B) der Dermatitis war die Summe der einzelnen Scores (0–3) für Erythem, Ödem und/oder Papeln, Exkoriation, Lichenifikation und Trockenheit. Die subjektiven (Score C) Manifestationen (Bewertung 1–10), einschließlich Pruritus und Schlaflosigkeit, wurden ausgehend von den Einschätzungen der Eltern bewertet. Der SCORAD-Wert wurde mit der Berechnung A/5 + 3,5 × B + C erhalten.
Das Untersuchungsprotokoll wurde durch das Ethische Überwachungskommittee der Universitätsklinik Tampere gebilligt. Von den Eltern wurde eine schriftliche Zustimmung erhalten.
2.b. Bestimmung von α-1-Antitrypsin in Fäkalproben
Gefrorene Fäkalproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und homogenisiert. Etwa 1 g wurde in ein Glasröhrchen überführt und lyophilisiert. Die resultierende Trockenmasse wurde vermahlen und 50 mg wurden in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Es wurde 1 ml 0,15 M NaCl-Lösung zugegeben und α-1-Antitrypsin wurde durch 20-minütiges kräftiges Mischen bei Raumtemperatur auf einem Vortex-Mischer extrahiert. Die resultierende Suspension wurde 10 Minuten bei 25.000 g zentrifugiert, um die Trümmer zu entfernen, und der Überstand wurde zur Bestimmung von α-1-Antitrypsin verwendet, wobei ein Behring-BNA- Nephelometer entsprechend der Anleitung des Herstellers eingesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in mg/g Trockengewicht lyophilierte Fäzes angegeben.
2.c. Bestimmung von TNF-α in Fäkalproben
Tiefgefrorene Fäkalproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, 1:1 (W/V) in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und absitzen gelassen. Von dem Überstand wurden 0,5–1,0 ml in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und 10 Minuten bei 25.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann zur Bestimmung von TNF-α eingesetzt. Zur Bestimmung von fäkalem TNF-α wurde ein kommerziell erhältlicher Enzymimmunoassay (Human TNF-α-ELISA Kit, Endogen Inc., Boston, Massachusetts, USA) entsprechend der Anleitung für Serumproben eingesetzt.
2.d. Statistik
Aufgrund der schiefen Verteilungen der Serum IgE-Konzentrationen wurde logarithmische (in) Transformation angewandt und die Daten sind als Mittelwerte mit 95% Konfidenzintervallen (CI) dargestellt. Die Konzentrationen inflammatorischer Parameter sind mit Medianwerten mit unteren und oberen Quartilen dargestellt. Der Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtest und der Mann-Whitney-U-Test wurden für statistische Vergleiche verwendet.
2.e. Ergebnisse
2.e.1. Klinische Daten
Der Mittelwert (95% CI) für Gesamt-Serum-IgE betrug 31 (15–61) kU/l in Patienten, die die Hydrolysatformulierung erhielten. RAST für Kuhmilch war in 10/31 (37%) Patienten mit atopischem Ekzem positiv (>0,4 kU/l). Der Haut-Pricktest für Kuhmilch war bei 8/31 (30% Patienten) positiv.
Die Schwere der atopischen Dermatitis bei jedem Patienten vor Beginn der Behandlung und einen Monat später, d. h. nach der Untersuchungsdauer, ist in 2 dargestellt. Der mediane (unteres Quartil-oberes Quartil) SCORAD-Score vor Behandlung betrug 21 (14–31) in der WF-Gruppe und 26 (17–38) in der WF-GG-Gruppe (p = 0,33). Bei denen, die Lactobacillus GG erhielten, gab es nach einmonatiger Intervention eine signifikante Verbesserung des SCORAD-Scores (p = 0,008), nicht aber bei denen, die weitgehend hydrolysierte Formulierung ohne Lactobacillus GG erhielten (p = 0,89). Der SCORAD-Score war dann in der WF-Gruppe 19 (13–31) und in der WF-GG-Gruppe 15 (7–28). Die Abnahme im SCORAD-Score bei WF-GG war auf die Verringerung des Ausmaßes (Score A, p = 0,004), der Intensität (Score B, p = 0,05) und des subjektiven Scores (Score C, p = 0,01) für atopische Dermatitis zurückzuführen (2). Die Verbesserung im SCORAD-Score wurde in der WF-Gruppe nach 2 Monaten erreicht und in der WF-GG-Gruppe blieb er nach Wegfall von Lactobacillus GG unverändert. Nach 2 Monaten war der mediane (unteres Quartil-oberes Quartil) SCORAD-Score in der WF-Gruppe 14 (2–38) und in der WF-GG-Gruppe 16 (6–25).
2.e.2. Konzentrationen von α-1-Antitrypsin und TNF-α in Fäzes
Bei gesunden Kontrollen (n = 9) betrug die mediane (unteres Quartil-oberes Quartil) Konzentration von α-1-Antitrypsin 0,5 (0,5–1,7) mg/g. Die Konzentration von α-1-Antitrypsin vor der Behandlung war bei den Gruppen WF und WF-GG vergleichbar (p = 0,22). Wie in Tabelle 1 gezeigt, nahm die Konzentration von α-1-Antitrypsin in Gruppe WF-GG während der einmonatigen Untersuchungsdauer signifikant ab (p = 0,03), nicht aber in Gruppe WF (p = 0,68). Nach zwei Monaten betrug die Konzentration an α-1-Antitrypsin 1,2 (0,5–1,6) bei WF und 0,5 (0,5–0,7) bei WF-GG.

Die Konzentration an fäkalem TNF-α bei gesunden Kontrollen betrug 0 (0–0,08) pg/g. Die Konzentration an fäkalem TNF-α bei atopischen Kindern war signifikant höher, p < 0,0001 (Tabelle 1). Die Konzentration an TNF-α vor der Behandlung war bei den Gruppen WF und WF-GG vergleichbar (p = 0,57). Die Konzentration an fäkalem TNF-α nahm während der einmonatigen Untersuchungsdauer bei WF-GG signifikant ab (p = 0,003), nicht aber bei WF (p = 0,38) (Tabelle 1). In Gruppe WF wurde nach 2 Monaten eine Verringerung der TNF-α-Konzentration erreicht, während sich in Gruppe WF-GG, der ebenfalls die weitgehend hydrolysierte Formulierung ohne Lactobacillus GG gegeben wurde, eine Tendenz zu erhöhtem TNF-α nachweisen ließ. Die Konzentration an TNF-α betrug dann 84 (25–129) bei WF und 144 (20–338) bei WF-GG. Tabelle 1. Konzentrationen an fäkalem α-1-Antitrypsin und TNF-α vor Behandlung (0) und einen Monat später (I) bei Kindern, die weitgehend hydrolysierte Molkeformulierung (WF) oder die gleiche Formulierung mit Lactobacillus GG-Bakterien (WF-GG) erhielten. Daten geben den Medianwert an (unteres Quartil-oberes Quartil).

	WF	WF-GG
α-1 Antitrypsin 0 (mg/g)	1,7 (1,5–2,3)	1,4 (0,5–1,9)
α-1 Antitrypsin I (mg/g)	1,7 (1,1–2,8)	0,5 (0,5–1,0)
TNF-α 0 (pg/g)	632 (126–1880)	709 (91–1131)
TNF-α I (pg/g)	494 (147–1009)	34 (19–103)

Beispiel 3. Herunterregulierung der Zytokinproduktion durch periphere mononukleare Blutzellen bei atopischen Kindern
3.a. Patienten und Methoden
Insgesamt wurden 14 Patienten im Alter von 5–29 (Mittelwert 16) Monaten, die die Hanifin-Kriterien für atopische Dermatitis (Hanifin, 1987) erfüllten, und acht im Alter passende nichtatonische gesunde Kinder untersucht. Keines erhielt zur Zeit der Untersuchung systemische Kortikosteroide.
Aszitesflüssigkeit, die OKT3 (anti-CD3-Antikörper) enthielt, war eine freundliche Gabe von Dr. M. Kaartinen, Department of Bacteriology and Immunology, Universitiy of Helsinki, Helsinki, Finnland. Bovines Gesamtcasein war aus boviner Milch gereinigt, wie bei Syväoja (1992) beschrieben. Gereinigtes Casein wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit Enzymen aus Lactobacillus GG hydrolysiert. Gereinigtes Casein oder mit Lactobacillus GG abgebautes Casein wurden lyophilisiert und bei Raumtemperatur aufbewahrt. Vor den Experimenten wurden sie in RPMI 1640 verdünnt und sterilfiltriert (0,1 μm, Millipore Corporation, Redford, Ma, USA).
Vollmedium bestand aus RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum, 10 mM Hepes-Puffer, 2 mM L-Glutamin (Gibco Life Technologies, Paisley, UK), 50 U/ml Benzylpenicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mg/ml Gentamycin (Roussel Laboratories Ltd., Uxbridge, Middlesex, UK). Es wurde peripheres venöses Blut (5 ml) erhalten. PBMCs mit 90% Lymphoidzellen wurden durch Gradientenzentrifugation mit FicollPaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) isoliert und zu 1 × 10⁶ Zellen/ml in Vollmedium suspendiert. Kulturvertiefungen wurden mit Aszitesflüssigkeit, die anti-CD3-Antikörper in einer vorgetesteten optimalen Verdünnung enthielt, vorbeschichtet. Die Testkultur enthielt zusätzlich Verdünnungen von Casein oder von mit Lactobacillus GG abgebautem Casein in einer Endkonzentration von 1 mg/ml. Diese Experimente wurden für gereinigtes bovines α_s1-Casein oder für mit Lactobacillus GG abgebautes α_s1-Casein wiederholt. Nach 24 Stunden Inkubation in einer befeuchteten 5%igen CO₂-Atmosphäre bei 37°C wurden die Überstände gesammelt und für den Zytokin-Assay bei –70°C aufbewahrt. IL-4 und IFN-γ in den Kulturüberständen wurden mittels im Handel erhältlicher ELISA-Kits entsprechend den Herstellerangaben bestimmt (IL-4: CLB, Compact Human Interleukin-4 ELISA-Kit, Central Laboratory of The Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Niederlande; IFN-γ: EIFNG, Endogen Inc., Cambridge, MA, USA). Die Ergebnisse aus verschiedenen Versuchsläufen wurden unter Vergleich der Eichkurven abgeglichen und wurden als pg/ml angegeben. Die Empfindlichkeit des Assays für IS-4 betrug 2,3 pg/ml und für IFN-γ 5 pg/ml. Für die statistischen Vergleiche der Testkulturen mit den Kontrollkulturen wurde der Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtest verwendet. Der Signifikanzgrad betrug P < 0,05.
3.b. Ergebnisse
Bei atopischen Patienten war in Kulturen, die gereinigtes Casein enthielten, im Vergleich mit den Kontrollkulturen sowohl die IL-4- als auch die IFN-γ-Produktion erhöht, P = 0,008 bzw. P = 0,008 (3a, b). Bei Abbau mit Enzymen von Lactobacillus GG wurde kein solcher Effekt von bovinem Casein beobachtet. Umgekehrt war die IL-4-Produktion in Kulturen, die mit Lactobacillus GG abgebautes Casein enthielten, signifikant geringer als in Kontrollkulturen, P = 0,003 (3a), und die IFN-γ-Produktion in diesen Kulturen war mit den Kontrollkulturen vergleichbar, P = 0,10 (3b).
Bei gesunden Kindern war die Produktion von IL-4 und IFN-γ in Kulturen, die gereinigtes Casein enthielten, mit den Kontrollkulturen vergleichbar, P = 0,10 und P = 0,10 (3c, d). Parallel zu den Beobachtungen bei atopischen Patienten zeigten gesunde Kinder in Kulturen, die mit Lactobacillus GG abgebautes Casein enthielten, eine signifikant geringere IL-4-Produktion als in Kontrollkulturen, P = 0,01 (3c), und die IFN-γ-Produktion in diesen Kulturen blieb mit den Kontrollkulturen vergleichbar, P = 0,50 (3d). Entsprechende Ergebnisse wurden bei α_s1-Casein und bei mit Lactobacillus GG abgebautem α_s1-Casein erhalten (4).
Literaturstellen

European task force on atopic dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186: 23–31.
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Syväoja EL. Quantitative determination of the main casein components and purification of α_s2- and κ-casein from bovine milk. Milchwissenschaft 1992; 47: 563–566

Claims

Verfahren zur in vitro-Herstellung einer Proteinhydrolysat-Formulierung zum Herunterregulieren von Überempfindlichkeitsreaktionen und zum Verstärken der Immunbarriere des Darms, umfassend die Schritte der Hydrolyse von Proteinen mit Enzymen aus einem Bakterienpräparat, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt, und mit Pepsin und/oder Trypsin.
Verfahren zur in vitro-Herstellung einer Proteinhydrolysat-Formulierung zum Herunterregulieren von Überempfindlichkeitsreaktionen und zum Verstärken, der Immunbarriere des Darms, umfassend die Schritte der Hydrolyse von Proteinen mit Pepsin und/oder Trypsin und der Zugabe eines Bakterienpräparats, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt, zu dem Hydrolysat.
Orale Proteinhydrolysat-Formulierung zum Herunterregulieren von Überempfindlichkeitsreaktionen und zum Verstärken der Immunbarriere des Darms, wobei das Hydrolysat durch das in Anspruch 1 oder 2 definierte Verfahren erhältlich ist.
Verwendung einer Proteinhydrolysat-Formulierung nach Anspruch 3 zur Herstellung einer oral zu verabreichenden pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Verstärkung tolerogener Immunreaktionen gegenüber Lebensmittelantigenen bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Proteinhydrolysat-Formulierung zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Behandlung von Kuhmilchallergie bei einem Patienten verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Proteinhydrolysat-Formulierung zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Vorbeugung oder Behandlung von lebensmittelinduzierten Überempfindlichkeitsreaktionen bei einem Kleinkind verwendet wird.
Verwendung eines Bakterienpräparats, das den Stamm Lactobacillus GG (ATCC 53103) umfaßt, zusammen mit einer Proteinhydrolysat-Formulierung zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Verstärkung tolerogener Immunreaktionen gegenüber Lebensmittelantigenen bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Proteinhydrolysat-Formulierung zusammen mit dem Bakterienpräparat zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Behandlung von Kuhmilchallergie bei einem Patienten verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Proteinhydrolysat-Formulierung zusammen mit dem Bakterienpräparat zur Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Formulierung zur Vorbeugung oder Behandlung von lebensmittelinduzierten Überempfindlichkeitsreaktionen bei einem Kleinkind verwendet wird.