KR101987678B1 - 피부염 치료용 비피도박테리움 롱검 kacc 91563 및 이를 함유하는 치즈 - Google Patents
피부염 치료용 비피도박테리움 롱검 kacc 91563 및 이를 함유하는 치즈 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주를 유효성분으로 포함하는, 피부염 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면, 아토피성 피부염 및 접촉성 피부염과 같은 질환(mast cell-mediated disease)의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 피부염 치료용 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 및 이를 함유하는 치즈에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 아토피 피부염 치료 또는 예방 효과가 우수한 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 및 이를 함유하는 크박치즈에 관한 것이다.
피부는 외부를 덮고 있는 기관으로, 대다수의 사람들은 피부를 인체의 표면으로만 생각하지만, 피부는 체내의 모든 기관 중 가장 큰 기관이다. 피부는 평균 약 20m2의 면적을 차지하며, 모근, 기름샘, 땀샘, 신경수용체 및 신경이 분포되어 있다.
사람의 피부는 보호막으로써 기능을 할 뿐 아니라, 인체의 내부로 물이 침투하는 것을 막고, 체온을 조절하며, 해로운 박테리아가 인체에 침입할 수 없도록 1차 면역 장벽을 형성한다.
그러나 이러한 피부의 장벽기능은 피부 내·외의 다양한 자극으로 인해, 피부가 손상되어, 건조해지거나, 피부의 염증반응을 발생시킨다. 또한, 이때 발생하는 초기 염증 반응을 효과적으로 제어하지 못할 경우, 심각한 피부염 등으로 악화될 수 있다.
상기 피부염은 보통 습진(eczema)과 같은 의미로 사용되기도 하며, 임상적으로 가려움, 홍반, 부종 및 진물 등의 증상을 보이며, 조직학적으로 표피의 해면화, 염증세포의 침윤과 진피의 혈관증식 및 확장되거나, 혈관 주위의 염증세포의 침윤을 보이게 된다.
상기 피부염에는 크게는 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 및 지루성 피부염 등으로 나뉘며, 피부염을 겪는 사람들의 고통은 가려움증, 홍반, 부종 및 진물 등에 의한 고통에 한정되지 않고, 외부의 시선 등으로 인한 사회적 적응을 곤란하게 하는 정신적 고통까지 겪게 한다.
종래에는 피부염 치료를 위한 다양한 의약품 및 연고제 등이 제공되고 있으나, 여러 의약품을 복용하고 있거나, 의약품에 대한 부담을 가진 사람들에게는 이러한 접근이 어려울 수 있다.
종래 다양한 유산균 제제가 제안되어 있으며, 한국등록특허 제10-1250463호에는 신생아 분변에서 분리한 내산소성 비피도박테리움 롱검 비피더스 유산균 및 이를 이용한 프로바이오틱 조성물이 게재되어 있다.
본 발명의 목적은 아토피 피부염 등 피부염 치료 또는 예방 효과를 가진, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비피도박테리움 롱검 KACC 91563을 유효성분으로 포함하는 아토피 예방 또는 개선용 크박치즈를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 롱검 KACC 91563을 유효성분으로 포함하는 크박치즈의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주를 유효성분으로 포함하는, 피부염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주는 0.5x109 내지 6.0x109 CFU/ml를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 피부염은 IgE에 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 피부염은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 따른 기재의 조성물을 포함하는, 피부염 예방 또는 개선용 치즈를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 치즈에 포함된 비피더스 균수는 107 CFU/g 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 살균유에 본 발명에 따른 조성물을 접종하는 접종단계; 살균유에 렌넷을 혼합한 발효하는 발효단계; 커드가 형성되면 성형하는 성형단계; 및 숙성실에서 숙성하는 숙성단계;를 포함하는, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 접종단계는 살균유에 총 중량에 대하여, 조성물을 0.001 내지 0.005 중량부로 접종할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 렌넷은 원유 10kg을 기준으로, 50㎕/10ml 내지 200㎕/10ml를 추가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 발효단계는 28℃ 내지 38℃에서 정치하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 성형단계에서 pH가 3.8 내지 5.8가 되면 커드를 커팅하여 성형할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 숙성단계는 10℃ 내지 20℃에서 6시간 내지 24시간을 정치하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 숙성단계 이후에 유청을 뺀 후 균질화하여 치즈를 완성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주를 유효성분으로 하여 피부염을 효과적으로 예방, 치료 및 개선을 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주를 유효성분으로 하여, IgE로부터 유도되는 염증을 효과적으로 예방, 치료 및 개선할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 크박치즈와 같은 식품을 이용하여, 아토피 피부염 및 접촉성 피부염을 예방, 치료 및 개선할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 크박치즈를 경제적이고 손쉽게 제조할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 KACC 91563의 경구투여의 DNCB(dinitrochlorobenzene)에 의한 알러지성 접촉성 피부염의 육안 병변에 대한 효과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염에 의한 귀 두께 및 긁는 횟수 감소된 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염에 의한 조직 병변의 완화효과를 나타낸 도면(a) 및 그래프(b)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염에 의한 혈청 내 IgE 감소의 결과는 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염 병변내 비만세포(mast cell) 수 감소를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염 병변 내 비만세포(mast cell) 관련인자 GATA1, GATA2, cKit, MCCPA 및 MCCP5 유전자 발현 감소를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염에 의한 귀 두께 및 긁는 횟수 감소된 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염에 의한 조직 병변의 완화효과를 나타낸 도면(a) 및 그래프(b)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염에 의한 혈청 내 IgE 감소의 결과는 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염 병변내 비만세포(mast cell) 수 감소를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 경구 투여 시 아토피 피부염 병변 내 비만세포(mast cell) 관련인자 GATA1, GATA2, cKit, MCCPA 및 MCCP5 유전자 발현 감소를 나타낸 그래프이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 이용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 기재된 약어는 다음과 같다.
DC: 수지상세포(Dendritic cell)
BMMC: 골수유래 비만세포(Bone marrow derived mast cell)
EV: 세포 밖 소포체(Extracellular vesicle)
ESBP: 패밀리 5 세포 밖 용질- 결합 단백질
(Family 5 extracellular solute-binding protein)
ASBP : ABC 트랜스포터 기질-결합 단백질
(ABC transporter substrate-binding protein)
TEM: 투과전자현미경(Transmission electron microscopy)
FISH: 형광동소혼성화(Fluorescence in situ hybridization)
OVA: 오브알부민(Ovalbumin)
MLN: 장관막림프절(Mesenteric lymph node)
HFP: 고배율시야(high-power field)
MCPt-1: 비만세포 프로테아제-1(Mast cell protease-1)
DLS: 동적광산란(Dynamic light scattering)
GST: 글루타티온 S-전이효소(Glutathione S-transferase)
TUNEL: 인-시튜 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼레이즈-매개된 닉 말단 표지(In situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end-labeling)
i.p.: 복강내(intraperitoneally)
i.g.: 위내(intragastrically)
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주를 유효성분으로 포함하는, 피부염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드는 이에 한정되는 것은 아니나, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주 뿐 아니라, 이로부터 유도되는 비피도박테리움 롱검 KACC 91563으로부터 분리된 ESBP(Extracellular Solute Binding Protein)일 수 있다[NCBI-ProteinID: AEI97295].
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주는 0.5x109 내지 6.0x109 CFU/ml를 포함할 수 있다.
상기 균주는 이에 한정하는 것은 아니나, 상기 균주는 0.5x109 내지 6.0x109 CFU/ml일 수 있고, 1.0x109 내지 5.5x109 CFU/ml가 더 적합할 수 있고, 4.0x109 내지 5.5x109 CFU/ml가 더 적합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 피부염은 IgE에 유도되는 것일 수 있다.
Ig E(Immunoglobulin E)는 제1형 과민반응에 중요한 역할을 하며, 제1형 과민반응이란 알레르기에 의한 천식, 비염, 알레르기와 일부 만성두드러기, 및 아토피 피부염 등을 의미한다.
본 발명의 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주를 유효성분으로 하는 조성물의 경우, 아토피 피부염을 감소시킬 뿐 아니라, 혈청 내의 Ig E의 수 및 비만세포의 수를 효과적으로 억제할 수 있다.
B. longum KACC 91563이 신생아로부터 분리가 되었고, 아토피 반응에서 중요한 효과를 발휘하는 세포인 비만세포(혹은 T세포 비의존적인 면역반응)를 표적으로 작용하기 때문에 식품을 이용하여 아토피를 치료하는 방법으로서의 상기 균주의 이용은 다른 종으로부터 분리된 균주보다 더욱 안전하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 피부염은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염일 수 있다.
아토피성 피부염은 발병 원인은 아직 확실하게 알려져 있지 않은 상태로, 주로 유아기 혹은 소아기에 시작되는 만성적이고, 재발성의 염증성 피부질환으로 가려움증(소양증), 피부 건조 등을 동반한다. 현재 상기 피부염은 세계적으로 증가하는 추세이며 유병률이 인구의 20%라는 보도가 있을 정도로 만연하다.
접촉성 피부염은 접촉에 의해 생기는 모든 피부염을 말하며, 접촉물질 자체의 자극에 의하여 생기는 원발성 접촉성 피부염과 접촉 물질에 대한 알레르기 반응이 있는 사람에게만 생기는 알레르기성 접촉성 피부염으로 구분된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물을 경구 투여함으로써, 상기 피부염에 대한 저감효과를 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 따른 기재의 조성물을 포함하는, 피부염 예방 또는 개선용 치즈를 제공한다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 치즈는 크박치즈일 수 있다. 크박치즈란 유산균을 접종하여 발효를 통해 생산된 치즈로, 독일권의 나라들에서 즐겨 먹는 치즈이다. 크박치즈는 우유 단백질이 산에 의해 응고되는 원리를 적용하여 만들게 되며, 우유 단백질은 약 pH 4.6 정도가 되면 음전하를 잃으면서 응집되는 특징이 있다. 최근에는 순수 산에 의한 응고와 미량의 단백질 분해 효소인 렌넷을 사용하여 보다 나은 질감의 크박치즈를 만들고 있다. 크박치즈의 부드러운 치즈의 식감은 치즈의 향을 부담이 있는 사람들에게도 선호가 높다. 본 발명에 따른 크박치즈의 관능평가에서 비피도박테리움 롱검 KACC 91563이 함유된 크박치즈가 조직감 및 맛이 더욱 우수하여, 전체 기호도가 높은 것으로 나타났다.
본 발명의 균주를 크박치즈에 사용하는 경우, 균주 단독으로 사용하거나 상기 ESBP를 분리하여 사용할 수 있다.
본 발명의 균주는 이에 한정한 것은 아니나, 요구르트, 요거트, 응유, 발효제품, 아이스크림, 발효 시리얼성 제품, 유(乳)성 분말 등의 발효성 제품에 응용할 수 있으나, 크박치즈가 가장 적합하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 치즈에 포함된 비피더스 균수는 107CFU/g 이상일 수 있다.
크박치즈에 포함된 비피더스 균수는 이에 한정하는 것은 아니나, 107CFU/g 이상일 수 있고, 4.007 내지 4.507CFU/g가 적합할 수 있고, 상기 균수가 포함된 경우, 조직감 및 맛이 더욱 우수할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 살균유에 본 발명에 따른 조성물을 접종하는 접종단계; 살균유에 렌넷을 혼합한 발효하는 발효단계; 커드가 형성되면 성형하는 성형단계; 및 숙성실에서 숙성하는 숙성단계;를 포함하는, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 스타터는 이에 한정하는 것은 아니나, CHN-11(Hansen)일 수 있고, 본 발명의 조성물은 동결건조된 비피도 박테리움 롱검 KACC 91563을 사용할 수 있다. 접종시에는 냉각시킨 살균유에 접종하는 것이 더 적합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 접종단계는 살균유에 총 중량에 대하여, 조성물을 0.001 내지 0.005 중량부로 접종할 수 있다.
살균유에 접종되는 균주의 양은 식품학적 유효량으로 첨가될 수 있으며, 식품학적 유효량은 본 발명의 조성물의 식품학적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니나, 살균유에 총 중량에 대하여, 조성물을 0.001 내지 0.005 중량부가 적합할 수 있으며, 과도하게 많이 넣을 경우, 소화기관의 부담감을 초래하거나, 조직감 및 맛을 떨어뜨릴 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 렌넷은 원유 10kg을 기준으로, 50㎕/10ml 내지 200㎕/10ml를 추가하는 것일 수 있다.
렌넷이란 단백질 분해효소로서, 치즈와 물을 분리하기 위해 사용하며, 상기 접종한 살균유에 렌넷을 추가한 후 정치하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 발효단계는 28℃ 내지 38℃에서 정치하는 것일 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니나, 상기 발효온도에서 정치할 경우, 조직감 및 맛이 더 우수할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 성형단계에서 pH가 3.8 내지 5.8가 되면 커드를 커팅하여 성형할 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니나, pH는 4.0 내지 5.8이 적합할 수 있고, pH 4.5 내지 pH 5.0이 더 적합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 숙성단계는 10℃ 내지 20℃에서 6시간 내지 24시간을 정치하는 것일 수 있다.
상기 숙성단계는 원하는 조직감에 따라 조절할 수 있으나, 숙성단계의 온도는 10℃ 내지 20℃가 적합할 수 있으며, 15℃ 내지 20℃가 더 적합할 수 있다. 숙성시간은 이에 한정되는 것은 아니나, 6시간 미만으로 정치하는 경우, 크박치즈가 제대로 형성되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 숙성단계 이후에 유청을 뺀 후 균질화하여 치즈를 완성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 크박치즈에 사용된 B. longum KACC 91563이 신생아로부터 분리가 되었으므로, 아토피 또는 접촉성 피부염의 저감 및 개선 등의 치료용 크박치즈로서 더욱 안전하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 재료 및 방법
마우스(Mice)
알레르기 실험 동물은 6주 내지 8주 연령의 BALB/c 야생형(wild-type) 마우스가 포스텍 생마우스동(POSTECH mouse facility)에서 제공되었다. 모든 실험은 포스텍의 동물실험 운영 위원회(the Animal Care and Use Committee)로부터 승인된 실험절차에 따라 SPF(specific pathogen-free conditions) 시설에서 수행되었다.
아토피 피부염 유발모델
마우스의 등을 귀 하단부에 4%(w/w) 수산화알루미늄 액 0.05 ml와 황산 알루미늄 칼륨 면역증강제(aluminum potassium sulfate adjuvant (Sigma-Aldrich, A-7210; 1 mg))와 함께 오브알부민 등급 V (OVA; 50 μg, grade V; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo)를 마우스의 복강 내 주사를 통해 한번 주입하고, 3일째 되는 날 100μl의 인산완충용액을 등에 도포하고 증발을 막기 위하여 Tegadum(2cm)을 부착하였다. 나머지 군들은 100μl의 인산완충용액과 0.1 mg 오브알부민을 등에 도포하고 증발을 막기 위하여 Tegadum(2cm)을 부착하였다. 나머지 군들은 100μl의 인산완충용액과 0.1mg 오브알부민을 같은 방법으로 도포하고 부착하였다. 3일이 지난 후 부착한 패치를 떼어내고 2주일간의 잠복기를 두었다. 2주일 후 두 번째 피부자극을 위해 대조군은 50μl의 인산완충용액을 복강주사 하였으며 다른 군들은 50μg 오브알부민을 50μl의 인산완충용액에 녹여서 복강주사 하였다. 3일 후 첫 번째 패치를 부착하였던 것과 동일한 방법으로 등 피부에 두 번째 패치를 부착하였다가 3일 후 패치를 떼어내었다.
접촉성 피부염 유발모델
황산 알루미늄 칼륨 면역증강제(aluminum potassium sulfate adjuvant (Sigma-Aldrich, A-7210; 1mg))와 함께 DNCB(2,4-Dinitrochlorobenzene)를 마우스의 복강 내 주사를 통해 한번 주입하고, 2주 후에 다시 한 번 주입하여 마우스에 식품 접촉성 피부염을 유도하였다. 상기 주입 2주 후에, DNCB (10mg 또는 50mg)를 격일로 경구 투여하였다(도 5의 (b) 참조). 마우스들은 DNCB 경구 투여 전에 3~4시간 전에 금식을 실시하였다. 접촉성 피부염의 정도는, DNCB 경구 투여 후 1시간 동안 마우스를 육안으로 병변 발생(diarrhea occurrence)을 관찰하여 평가하였다.
유산균 투여(Administration of
probiotics
)
비피도박테리움 롱검(B. longum) KACC 91563은 농촌진흥청(Rural Development Administration, RDA) 국립축산과학원(National Institute of Animal Science, NIAS)으로부터 제공되었다. 상기 유산균들은 건강한 한국인 영아의 분변으로부터 분리되었고, 37℃에서 12시간 동안 배양되었다. 또한, 배양된 박테리아는 탈지유(skim milk)를 보호제로 하여 동결 건조되었으며, 구강을 통한 위관영양법(intragastric gavage)으로 매일 투여되었다(5 x 109c.f.u/mouse). 일부 실험에 있어서, 분말의 마우스 사료와 함께 혼합된 동결 건조된 박테리아는 3일마다 공급된 신선한 사료와 함께 경구 위관영양 실험법(the oral gavage experiment) 때와 동일한 박테리아 수(c.f.u)로 제공되었다.
아토피 피부염 병변 내 비만세포 정량(Quantification of mast cell in the small intestine)
오브알부민 투여를 끝낸 후, 마우스를 희생시키고 소장을 분리하였다. 소장의 공장(Jejunum) 조직의 파라핀 분획은 제조업체의 지침에 따라 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스테라아제(naphthol AS-D chloroacetate esterase (Sigma-Aldrich, 91C))로 염색되었다.
비만세포는 마우스당 최소 3개의 다른 분획에서 수를 측정하였다(배율, x400).
TUNEL
분석(In situ terminal
deoxynucleotidyl
transferase
-mediated nick end labeling assay)
골수 유래 비만세포는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) KACC 91532의 세포밖 소포체(2 μg/mL), 또는 전체 박테리아와 함께 2시간 동안 개별적으로 배양되었다. 비만세포는 세척되고, 세포의 슬라이드는 세포원심분리기(cytospin)를 이용하여 준비되었다. 제조업체의 지침에 따라 사멸 세포(Apoptotic cells)는 DeadEndTM 형광 검출기 TUNEL 시스템 (DeadEndTM Fluorometric TUNEL system, Promega)을 이용하여 염색되었다. 세포의 이미지는 DAPI로 염색된 후, Axio Scope. A1 형광 현미경(Axio Scope. A1 fluorescent microscopy (Carl Zeiss))을 이용하여 획득되었다.
ELISA
장관막림프절(MLN) 세포는 100 μg/ml의 오브알부민(OVA)을 포함한 배지의 37℃에서 72시간 동안 배양되었다. 제조업체 지침에 따라, 배양 상청액(culture supernatants) 내 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-17A(IL-17A) 및 인터페론 감마(IFN-γ)의 농도는 eBioscience의 ELISA 키트를 이용하여 측정되었다. 또한, 혈청 내의 비만세포 프로테아제-1(MCPt-1) 및 오브알부민-특이적인 IgE(OVA-specific IgE)는 제조업체의 지침에 따라, ELISA 키트(MCPt-1 ELISA kit from eBioscience and OVA-specific IgE ELISA kit from Chondrex)를 이용하여 측정되었다.
결과
마우스 모델에서
비피도박테리움
롱검
KACC
91563의 피부염
저감효과
건강한 한국인 신생아의 분변 샘플에서 비피도박테리움 롱검 KACC 91563을 분리하였다. 투과전자현미경(TEM) 분석에 따르면, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563는 각각 막대 모양(rod-shaped) 및 구형(round-shaped)의 박테리아였다.
두 종류의 미생물상(microbiota)이 마우스의 장으로 직접 도달할 수 있을지 불명확하였으므로, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563는 2주간 경구 투여하였으며, 분변 샘플 내의 박테리아는 형광동소혼성화(FISH)를 통해 관찰하였다. 그 결과 비피도박테리움 롱검 KACC 91563가 검출되었다. 따라서, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563는 소화되지 않고, 마우스의 장까지 도달할 수 있다는 것을 보여준다.
아토피 및 접촉성 피부염에 대한 비피도박테리움 롱검 KACC 91563의 효과를 평가하기 위하여, BALB/c 마우스에서 알레르기 항원(allergen) 유도 식품 아토피 피부염 모델 및 접촉성 피부염 마우스 모델을 채택하였다. 아토피 피부염 모델 및 접촉성 피부염이 유도되는 동안, 혐기적 조건(anaerobic condition)에서 배양된 비피도박테리움 롱검 KACC 91563을 매일 경구로 투여하였으며, 이를 통하여, 귀 두께 감소 및 긁는 횟수가 감소하고(도 2 참조), 조직병변이 완화되었다(도 3 참조). 또한, 피부염에 의한 혈청 내 Ig E도 감소함이 나타났다(도 4 참조). 결론적으로, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563는 아토피 피부염 및 접촉성 피부염 증상을 저감 및 치료하는 기능이 있다는 것을 보여준다(도 1 참조).
비피도박테리움
롱검
KACC
91563에 의한
비만세포수에
대한 감소 효과
비만세포는 식품 알레르기 반응 동안 중요한 효과기 세포(effector cell)이므로, 본 발명자는 비피도박테리움 롱검 KACC 91563의 투여가 장 내 비만세포의 수를 감소시키는지를 조사하였다. 또한, 아토피 피부염 모델에 있어서, 비만세포관련 인자 GATA1, GATA2, cKit, MCCPA 및 MCCP5 유전자의 유전자 발현 감소량을 측정하였다.
피부염 병변 내 비만세포는 클로로아세테이트 에스테라아제(chloroacetate esterase) 활성에 의해 염색되었고, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563은 상기 비만세포의 수를 현저하게 감소시킨다는 것을 발견하였다(도 5 참조).
비피도박테리움 롱검 KACC 91563이 비만세포의 기본적인 수에 영향을 줄 가능성을 배제하기 위하여, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563을 안전하게 정착(stable colonization) 할 수 있도록 충분한 시간인 한 달 동안, 경구로 투여하였다. 또한, 비피도박테리움 롱검 KACC 91563는 아토피 피부염 병변 내 비만세포의 관련인자 GATA1, GATA2, cKit, MCCPA 및 MCCP5 유전자의 유전자 발현이 감소시켜, 비만세포 수를 감소시키고, 이를 통해 아토피 피부염을 완화시키고 치료할 수 있다는 것을 보여준다(도 6 참조).
비피도박테리움
롱검
(
B.
longum
)
KACC
91563으로부터 분리된
ESBP의
피부염
저감
효과
본 발명자들은 비피도박테리움 롱검(B. longum) KACC 91563으로부터 유래된 ESBP 및 ASBP의 GST-표지된 재조합(recombinant) 단백질을 대장균에서 발현시키고, 글루타티온 세파로오스 비드를 이용하여 분리하였다.
상기 ESBP 및 ASBP이 피부염을 저감시키는지 확인하기 위해, 1번째와 5번째의 오브알부민(OVA) 경구 투여 전에 분리된 단백질을 2번 복강 내로 주사하였다. ASBP가 아닌 ESBP만이 투여 용량에 비례하여 조직 병변을 완화시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비피도박테리움 롱검(B. longum) KACC 91563과 같이 재조합 ESBP 단백질도 피부염 병변 내 비만세포의 수를 감소시켰다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 롱검(B. longum) KACC 91563 균주 단독 또는 이로부터 분리된 단백질 ESBP는 피부염 마우스 모델에서 아토피 피부염 또는 접촉성 피부염 증상을 저감시키는 기능을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
B. longum KACC 91563이 신생아로부터 분리가 되었고, 알레르기 반응에서 중요한 효과를 발휘하는 세포인 비만세포를 표적으로 작용하기 때문에 피부염을 치료하는 방법으로서의 유산균의 이용은 상당히 안전하다 할 것이다.
B. longum KACC 91563이 생산하는 ESBP는 B. longum의 다른 스트레인이 생산하는 ESBP와 상동성이 낮아 다른 스트레인은 염증 억제효과를 기대하기 어렵다. 표 1은 본 발명에 따른 B. longum KACC 91563 스트레인과 B. longum의 다른 스트레인과의 상동성 정도를 나타낸 것이다.
실시예
:
B.
longum
KACC
91563가 함유된
크박치즈의
제조
대조구 및 처리구의 균주를 냉각시킨 살균유에 각각 0.002%를 접종하였다. 접종 후, 렌넷 100ul/10ml(원유 10kg 기준)을 떨어뜨리고 섞어준 후 정치하였다. 이 때, 발효온도는 33℃를 유지해 주었다. pH 4.8이 되면 커드 상태 확인 후, 커드를 얇고 넓게 커팅하여 천에 담았다. 치즈 숙성실(15℃)에서 하룻밤 정치하여 유청을 뺀 후, 균질화하여 크박치즈를 완성시켰다. 표 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 크박치즈의 일반성분을 대조구와 대비하여 나타낸 것이다.
표 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 크박치즈의 미생물 수 및 pH를 대조구와 대비하여 나타낸 것이다.
*C: 대조구(스타터), T: 처리구(스타터+비피도박테리움 롱검 KACC 91563)
표 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 크박치즈의 관능 분석 특성을 대조구와 대비하여 나타낸 것이다.
*C: 대조구(스타터), T: 처리구(스타터+비피도박테리움 롱검)
본 발명의 B. longum KACC 91563 균주 및 이로부터 분리된 ESBP는 아토피성 피부염, 또는 접촉성 피부염의 예방 또는 개선용 식품 제조에 이용될 수 있다. 본 발명의 비피도박테리움 롱검(B. longum) KACC 91563 균주 및 이로부터 분리된 ESBP는 비만세포를 타겟으로 하는 피부염에 대한 크박치즈와 같은 신규한 유제품으로 이용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (13)
- 비피도박테리움 롱검 KACC 91563 균주를 0.5x109 내지 6.0x109 CFU/ml로 포함하는, 피부염 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 피부염은 IgE에 유도되는, 피부염 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부염은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염인, 피부염 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈.
- 제5항에 있어서,
상기 치즈에 포함된 비피더스 균수는 107CFU/g 이상인, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈. - 살균유에 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 접종하는 접종단계;
살균유에 렌넷을 혼합한 발효하는 발효단계;
커드가 형성되면 성형하는 성형단계; 및
숙성실에서 숙성하는 숙성단계;
를 포함하는, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 접종단계는 살균유에 총 중량에 대하여, 조성물을 0.001 내지 0.005 중량부로 접종하는 것인, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 렌넷은 원유 10kg을 기준으로, 50㎕/10ml 내지 200㎕/10ml를 추가하는 것인, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 발효단계는 28℃ 내지 38℃에서 정치하는 것인, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 성형단계에서 pH가 3.8 내지 5.8가 되면 커드를 커팅하여 성형하는, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 숙성단계는 10℃ 내지 20℃에서 6시간 내지 24시간 정치하는 것인, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 숙성단계 이후에 유청을 뺀 후 균질화하여 치즈를 완성하는 단계를 더 포함하는, 피부염 예방 또는 개선용 크박치즈 제조방법.
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|---|---|---|---|---|
| JP5273695B2 (ja) * | 2005-03-03 | 2013-08-28 | 株式会社明治 | ビフィズス菌を有効成分とするアレルギー予防および／または治療剤 |
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