KR102182738B1 - 수면 장애 개선용 발효조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

수면 장애 개선용 발효조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수면 장애 개선용 발효조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 멜라토닌 함량이 높아 수면 장애를 효과적으로 개선하고, 불안감 및 우울감을 감소시키고, 장 건강 증진을 통해 멜라토닌 분비를 촉진할 수 있는 수면 장애 개선용 발효조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

수면 장애 개선용 발효조성물 및 이의 제조방법{Fermented composition for improving sleep disturbance and preparation method thereof}
본 발명은 수면 장애 개선용 발효조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 멜라토닌 함량이 높아 수면 장애를 효과적으로 개선하고, 불안감 및 우울감을 감소시키고, 장 건강 증진을 통해 멜라토닌 분비를 촉진할 수 있는 수면 장애 개선용 발효조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
수면 장애는 건강한 수면을 취하지 못하거나, 충분한 수면을 취하고 있음에도 낮 동안에 각성을 유지하지 못하는 상태 또는 수면리듬이 흐트러져 있어서 잠자거나 깨어 있을 때 어려움을 겪는 상태를 포함하는 매우 폭넓은 개념이다(네이버 지식백과).
수면 장애는 증상에 따라 불면증, 기면증, 하지불안증후군, 코골이, 또는 수면무호흡증 등이 다양하게 나뉠 수 있다.
수면 장애의 치료는 그 증상에 따라 다양하며, 수면위생, 인지행동치료, 약물치료 등이 알려져 있다.
한편, 멜라토닌은 뇌에서 분비되는 생체 호르몬으로 불면증 치료에 사용되는 약물이다. 기존의 뇌를 억제하여 수면을 유도하는 약물과는 다르게 멜라토닌 수용체를 활성화시켜 자연적인 수면을 유도하는 작용을 한다. 생체 리듬이 깨진 사람들 또는 멜라토닌 수치가 낮은 노인이나 불면증 환자에게 효과가 있다고 알려져 있다. 생체내 멜라토닌은 밤과 낮의 길이 등과 같은 광주기를 감지하여 합성되고, 사람의 수면-각성 리듬과 일상적, 계절적 생체리듬을 조절하며 자연적인 수면을 유도하는 작용을 한다. 이외에 항산화 및 면역을 자극하는 효능이 있다고 알려져 있다.
본 발명의 배경기술로 한국 등록 특허 제10-1020245호에 유효성분으로 감초 추출물 및 합환피 추출물을 함유하는 수면개선용 조성물 및 이의 제조방법이 기재되어 있다.
그러나 현재까지 멜라토닌 함량이 높아 수면 장애를 개선하고 불안감 및 우울감을 감소시키고 장 건강 증진을 통해 멜라토닌 분비를 촉진할 수 있는 수면 장애 개선용 발효조성물에 대해 연구는 활발하지 않은 편이다.
본 발명의 목적은 멜라토닌 함량이 높아 불안감 및 우울감을 감소시키고 장 건강 증진을 통해 멜라토닌 분비를 촉진할 수 있는 수면 장애 개선용 발효조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 멜라토닌 함량이 높고 장 건강 증진을 통해 멜라토닌 분비를 촉진할 수 있는 수면 장애 개선용 발효조성물을 고효율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 포함하는 발효유; 및 알로에를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효유는 발효유 전체 중량에 대해 1 - 10 중량부의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효유는 탈지분유 및 유산균 스타터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유산균 스타터는 케피어 스타터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효조성물 전체 중량에 대해 5 - 15 중량부의 알로에를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효조성물은 분말형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효조성물은 장의 길이를 연장할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효조성물은 수면파인 δ파를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효조성물은 불안감 또는 우울감을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본원의 발효조성물을 포함하는, 수면 장애 치료 또는 예방용 수면 장애 개선용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본원의 발효조성물을 포함하는, 수면 장애 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 식품 조성물은 멜라토닌 함량이 500pg/g 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, (1) 탈지분유에 증류수를 가하여 환원하고, 유산균 스타터 및 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 첨가하고 배양하여 발효유를 준비하는 단계; (2) 상기 발효유를 동결건조하여 발효유 동결건조 분말을 준비하는 단계; 및 (3) 동결건조 발효유 분말에 알로에 분말을 혼합하는 단계를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 단계 (1)에서 발효유 전체 중량에 대해 1 - 10 중량부의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 단계 (1)에서 상기 유산균 스타터는 케피어 스타터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 단계 (1)에서 20 - 30℃에서 20 - 28시간 배양할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효조성물은 상기 단계 (3)에서 상기 발효조성물 전체 중량에 대해 5 - 15 중량부의 알로에를 혼합할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 멜라토닌 함량을 높여 수면 장애를 효과적으로 개선하고, 불안감 및 우울감을 감소시킬 수 있다.
일 실시예에 의하면, 장의 길이를 증가시켜 장 건강을 증진하고 멜라토닌 분비를 촉진할 수 있다.
일 실시예에 의하면, 멜라토닌 함량이 높고 수면 장애를 효과적으로 개선하고, 불안감 및 우울감을 감소시키고, 멜라토닌 분비를 촉진할 수 있는 수면 장애 개선용 발효조성물을 고효율로 제조할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 사카로마이세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 50종에서 생산된 멜라토닌 함량을 비교해서 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 포도에서 분리된 미생물이 생산하는 멜라토닌 함량을 비교해서 나타낸 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 누룩에서 분리된 미생물이 생산하는 멜라토닌 함량을 비교해서 나타낸 그래프이다.
도 4는 시판 우유 및 발효유에 함유된 멜라토닌 함량을 비교해서 나타낸 그래프이다.
도 5는 시판 치즈에 함유된 멜라토닌 함량을 비교해서 나타낸 그래프이다.
도 6은 동결건조된 채소에 함유된 멜라토닌 함량을 비교해서 나타낸 그래프이다.
도 7은 발효유 분말의 미생물 수를 나타낸 그래프이다.
도 8은 발효유 분말의 멜라토닌 함량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 발효유 분말의 투여에 따른 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 발효유 분말의 투여에 따른 장의 길이 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 뇌내 전극삽입술 과정을 개략적으로 나타낸 사진이다.
도 12는 대조 발효유 분말(비교예 1)의 투여에 따른 뇌파 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 T1(비교예 2)의 발효유 분말의 투여에 따른 뇌파 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 T1(실시예)의 발효유 분말의 투여에 따른 뇌파 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 발효유 분말의 투여에 따른 신경행동 변화를 알아보기 위하여, 오픈 필드 테스트(open field test)를 한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 발효유 분말의 투여에 따른 신경행동 변화를 알아보기 위하여, 엘레베이티드 플러스 메이즈 테스트(elevated plus maze test)를 한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 개시의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다.
본 명세서에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 개시는 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예들을 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 개시를 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 개시의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 포함하는 발효유; 및 알로에를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물이 제공된다.
본원에 있어서 수면 장애는 충분한 수면 또는 숙면을 취하지 못하여 만성피로를 느끼거나 낮에 졸리거나 두통을 느끼는 등 일상생활에 지장이 되는 것을 의미한다. 본원의 수면장애는 불면증 등이 될 수 있으며, 또한 잠이 쉽게 들지 못하거나 잠이 들더라도 얕게 잠이 들고 숙면을 취하지 못하는 경우 등을 가리킨다.
본원의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)은 100여 종의 효모 중 선발된 멜라토닌 생산효율이 매우 좋은 효모 균주이다. 특히 효모배양 배지에서 배양 시 멜라토닌을 300pg/mL 이상 생산할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 본원의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220을 포함하는 발효조성물은 수면 장애 개선효과가 탁월하다.
본원에서 상기 발효유는 발효유 전체 중량에 대해 1 - 10 중량부의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 포함할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220의 함량이 상기 발효유는 발효유 전체 중량에 대해 1 중량부 미만이면 멜라토닌 생산효율이 낮을 수 있고, 10 중량부 초과이면 함량 증가에 따른 멜라토닌 생산량 증가 효과가 크지 않을 수 있다.
본원에서 상기 발효유는 탈지분유 및 유산균 스타터를 포함할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 발효유는 탈지분유에 증류수를 가하여 환원하여 이용할 수 있다.
본원에서 상기 유산균 스타터는 공지의 스타터를 이용할 수 있으나, 케피어 스타터가 적합할 수 있다. 케피어는 카프카스(Kavkaz)의 산악지대에서 음용되는 발포성 발효유로 어원은 터키어의 케프(Kef: 편안하다는 뜻)로서, 락토오스(Lactose : 젖당)를 발효시키는 효모와 젖산균이 함유된 케피어(Kefir) 씨에 유즙을 가하면 알코올, 이산화탄소, 락트산을 발생하고 특유한 향미를 낸다. 염소젖, 양젖, 우유 등으로 만드는데, 유사한 것으로 동유럽의 “우르다(Urda)”, 칠레의 “스쿠타(Skuta)” 등이 있으며, 말 젖으로 만든 “쿠미스(kumys)”는 알코올 성분이 강하다. 제조 방법은 온수에 녹인 케피어(Kefir) 씨에 일단 가열해서 식힌 우유를 넣고, 20℃에서 1주일 방치해서 술밑을 만들고, 거기에 다시 약 5배의 가열 냉각유를 첨가해서 잘 섞으면 2 - 3일 후에는 마실 수 있다. 케피어 발효유의 경우 효모와 함께 발효되면서 비타민과 필수 아미노산, 다당류 등을 생성하여 정장작용뿐만 아니라 항균작용과 면역력 증강에 도움을 줄 수 있다. 본원의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220과 케피어를 포함하는 발효조성물은 수면 장애 개선 효과뿐만 아니라 정장작용 및 항균작용, 면역력 증강에도 시너지 효과가 있다.
본원에 있어 상기 발효조성물은 발효조성물 전체 중량에 대해 5 - 15 중량부의 알로에를 포함할 수 있다. 상기 알로에는 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220와의 시너지 효과로 멜라토닌의 생산을 극대화할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 알로에 함량이 발효조성물 전체 중량에 대해 5 중량부 미만이면 멜라토닌 생산효율이 낮을 수 있고, 15 중량부 초과이면 함량 증가에 따른 멜라토닌 생산량 증가 효과가 크지 않을 수 있다.
본원에 있어, 상기 발효조성물은 분말 형태가 적합할 수 있다. 분말 형태이면 수면 장애가 있는 경우 야간에 물 등에 혼합하여 용이하게 섭취할 수 있다.
본원에 의한 상기 발효조성물은 섭취 시 장의 길이를 연장할 수 있어, 장 건강 증진 효과가 있다. 특히 본원에 의한 상기 발효조성물 섭취 후 2주 내에 장의 길이가 연장되는 효과가 있다.
본원에 의한 상기 발효조성물은 섭취 시 수면파인 δ파를 증가시킬 수 있어, 수면 장애 개선 효과가 있다.
본원에 의한 상기 발효조성물은 섭취 시 불안감 또는 우울감을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본원의 발효조성물을 포함하는, 수면 장애 치료 또는 예방용 수면 장애 개선용 약학 조성물이 제공된다.
본원의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
본원의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg당 0.1mg - 10g, 바람직하게는 10mg - 1g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본원의 발효조성물을 포함하는, 수면 장애 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본원의 식품 조성물은 멜라토닌 함량이 500pg/g 이상일 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 멜라토닌 함량이 수면 장애 개선에 적합할 수 있다.
상기 식품 조성물은 일반 식품, 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품, 운동 보조제 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본원의 발효조성물을 첨가한 것도 포함된다. 바람직하게는 본원의 식품 조성물은 수면 유도 식품, 숙면 유도 식품, 수면촉진 식품 등이 될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 건강기능식품, 기능성 식품 등이다. 본원의 발효조성물을 포함하는 식품 조성물은, 상기 발효조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 건강 유지 목적)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본원의 발효조성물을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 - 7000 중량%, 바람직하게는 0.01 - 3000 중량%의 양으로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 - 1000 중량%의 양으로 첨가할 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 발효조성물을 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
상기 발효조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 파우더 제제 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다. 이에 한정되는 것은 아니나, 간식용 치즈로 제조하는 것이 적합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, (1) 탈지분유에 증류수를 가하여 환원하고, 유산균 스타터 및 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 첨가하고 배양하여 발효유를 준비하는 단계; (2) 상기 발효유를 동결건조하여 발효유 동결건조 분말을 준비하는 단계; 및 (3) 동결건조 발효유 분말에 알로에 분말을 혼합하는 단계를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법이 제공된다.
상기 단계 (1)에서 발효유 전체 중량에 대해 1 - 10 중량부의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 첨가할 수 있다.
상기 단계 (1)에서 상기 유산균 스타터는 케피어 스타터를 포함할 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 단계 (1)에서 20 - 30℃에서 20 - 28시간 배양하는 것이 멜라토닌 함량을 증가시킬 수 있다.
상기 발효조성물은 상기 단계 (3)에서 상기 발효조성물 전체 중량에 대해 5 - 15 중량부의 알로에를 혼합할 수 있다.
본원의 상기 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법에 의하면, 고함량의 멜라토닌을 포함하는 발효조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.
실시예
재료 및 방법
1) 멜라토닌 합성 미생물 균주 분리, 선발, 및 배양
(1) 균주보존기관(KCTC, KACC) 등에서 하기 균주를 분양받았다.
KCTC에서 분양받은 균주 리스트(50종): 7917, 7924, 7929, 7931, 7950, 7955, 7962, 7157, 7164, 7171, 17298, 17572, 17798, 27134, 27139, 27184, 27209, 27211, 27393, 27398, 7933, 7952, 7957, 7964, 7147, 7159, 7161, 7926, 7921, 7914, 7296, 7246, 7234, 17801, 27153, 27146, 27141, 17795, 27136, 27395, 27143, 27148, 27155, 27162, 27167, 27213, 27218, 27220, 27225, 27232
분양받은 효모는 효모 배양배지(YPD)에서 48시간 배양(25℃, 교반)하여 1mL을 샘플링하여 원심분리(30분, 10,000rpm) 후 상등액으로 멜라토닌 함량 분석에 이용하였다.
(2) 전통발효 주류, 포도 껍질 등에서 균주들을 분리 및 선발하였다.
포도 껍질 및 누룩에서 균주를 분리하여, 효모 선택배지(Acidified potato dextrose agar)에서 배양하여 균주를 선발하였다. 선발된 균주를 효모 배양배지(YPD)에 배양하여 멜라토닌 함량을 분석하였다.
보다 구체적으로, 포도껍질에서의 균주 분리는 포도껍질 10g에 멸균증류수 90mL을 가하고 스토마커(stomacher)로 균질화한 후 선택배지(potato dextrose agar + 10% tartaric acid, pH 3.5로 조정)에 100㎕를 도말한 후 25℃에서 5일간 배양 후 콜로니 분리하고 YPD broth에 배양하여 멜라토닌 함량을 분석하였다.
또한, 누룩에서의 균주 분리는 누룩 25g에 멸균증류수 225mL을 가하고 스토마커(stomacher)로 균질화한 후 선택배지(potato dextrose agar + 10% tartaric acid, pH 3.5로 조정)에 100㎕를 도말한 후 25℃에서 5일간 배양 후 콜로니 분리하고 YPD broth에 배양하여 멜라토닌 함량을 분석하였다.
2) 멜라토닌 분석
(1) 샘플 전처리
식품 내 멜라토닌 함량 분석을 위해 하기와 같이 샘플의 전처리를 하였다.
시판 우유 및 발효유 6종과 치즈를 사용하였고, 국립축산과학원 원유로 제조한 시유, 발효유, 치즈, 및 유청 내의 멜라토닌 함량을 분석하였다.
우유는 20mL 샘플을 원심분리(10,000 rpm, 30min) 후 수용액 층을 분리하였다. 요거트는 20mL 샘플에 10mL MeOH를 넣고 균질화(homogenization) 1분, 볼텍싱(voltexing) 3분 후 원심분리(10,000 rpm, 30min)하여 수용액 층 분리하였다. 치즈는 5g의 샘플에 25mL MeOH를 넣고 균질화 1분, 볼텍싱 3분 후 원심분리(10,000 rpm, 30min)하여 수용액 층 분리하였다. 유청 및 미생물 배양액은 원심분리(10,000 rpm, 30min) 후 수용액 층 분리하였다.
채소는 샐러리, 부추, 브로콜리 등 11종의 채소에 대해 멜라토닌 함량 분석을 실시하였다. 채소는 동결건조 1g 샘플에 20mL MeOH를 넣고 균질화 1분, 볼텍싱 3분 후 원심분리(10,000 rpm, 30min)하여 0.45㎛ 필터로 여과하였다.
(2) 추출 컬럼(Extraction column, Sep Pak)
폴리스틸렌 또는 유리 튜브 (15 팔콘) 안에 컬럼을 놓았다.
컬럼에 MeOH (100%) 1mL을 넣고 원심분리 (800 rpm, 1min) 후 용출액 버렸다. 다시 컬럼에 2차 증류수 1mL를 넣고 원심분리 (800 rpm, 1min) 후 용출액 버렸다.
컬럼이 마르기 전에 샘플을 로딩하였다. 새 튜브에 컬럼을 놓고 0.5mL (standard, control, sample)을 넣고, 0.5 mL 증류수 로딩 후 원심분리(800 rpm, 5min) 후, 용출액은 버렸다.
10% MeOH의 1mL을 컬럼에 넣은 후 원심분리 (800 rpm, 5min), 용출액 버렸다(2번 반복). 새 튜브에 컬럼을 놓고 1mL MeOH (100%)을 넣은 후 원심분리 하였다(800 rpm, 5min).
컬럼을 제거한 후 샘플은 증발 원심분리(evaporator centrifuge)를 이용하여 메탄올을 없앴다.
그 후 0.15mL 증류수를 첨가 후 1분간 볼텍싱 한 후 즉시 ELISA 분석을 하였다.
(3) ELISA 분석
표준(Standard), 대조군(control), 샘플의 50uL를 각 웰에 넣었다.
그 다음, 각 웰에 멜로토닌 바이오틴(melatonin Biotin) 50uL을 넣었다.
각 웰에 멜라토닌 항혈청(melatonin Antiserum) 50uL을 넣고, 접착 호일을 덮고 조심스럽게 흔들어 준 다음, 4℃에서 14-20h 배양하였다.
배양된 용액을 버리고 세척 버퍼(wash Buffer)를 이용하여 세척하였다. 3반복 하여 완벽히 제거하였다.
실험 직전 준비해 놓은 효소 컨쥬게이터(Enzyme conjugate) 150uL를 각 웰에 분주하고, 새 접착 커버로 덮고 상온에서 2시간 오비탈 쉐이커(Orbital shaker) 배양 하였다(500 rpm).
그 후, 커버 제거 후 배양된 용액을 버리고 세척 버퍼(wash Buffer)를 이용하여 세척하였다(3번).
멀티 피펫을 이용하여 PNPP 기질액(PNPP Substrate Solution)의 200uL를 각 웰에 첨가한 후 오비탈 쉐이커 배양을 40분 하였다(상온, 500 rpm).
다음, 멀티 피펫을 이용하여 50uL의 PNPP 반응정지액(PNPP stop solution)을 각 웰에 첨가하고, 60분 안에 플레인트 리더(Plate reader)를 이용하여 405nm에서 측정하였다.
3) 발효유 분말의 제조
대조 발효유 분말(비교예 1)은 탈지분유에 증류수를 가하여 환원(12%)하고 케피어 스타터(DANISCO CHOOZIT Kefir DT, 0.005%)를 첨가하여 25℃에서 24시간 배양 후 동결건조하여 제조하였다.
실험 발효유 분말은 탈지분유에 증류수를 가하여 환원(12%)하고 케피어 스타터(DANISCO CHOOZIT Kefir DT, 0.005%)와 효모(KTCC 27220) 2%를 첨가하여 25℃에서 24시간 배양 후 동결건조하여 제조하였다.
T1(비교예 2) : 발효유 동결건조분말에 10% 바나나 분말을 혼합하여 제조하였다.
T2(실시예) : 발효유 동결건조분말에 10% 알로에 분말을 혼합하여 제조하였다.
4) SD 래트 모델에서의 수면 분석
6주령의 SD 래트(200 - 250g, 웅성)를 1주일간 사육케이지 (20×26×13cm)에 온도 20 - 24℃, 습도 55±5%가 유지되며 밤낮 주기(12:12LD) 가 자동 조절되는 실험실에서 순화 및 적응을 거친 후 뇌파(Electroencephalogram, EEG) 측정을 위해 전극 삽입 수술을 실시하였다. 실험동물 SD 래트를 이소플루란(isoflurane, Troikaa Pharmaceuticals Ltd, Gujarat, India)로 호흡 마취시키고, 정위고정기(stereotaxic instrument)에 두부를 고정시켰다. 뇌내 전극삽입술의 구체적인 과정은 도 11에 나타나 있다. 도 11의 A는 피부절개 및 결합조직 제거한 것을 나타내고, 도 11의 B는 전극 삽입부를 중심으로 4군데에 레진을 고정할 나사를 삽입한 것을 나타내고, 도 11의 C는 Bregma 0 지점에 전극을 삽입한 것을 나타내고, 도 11의 D는 레진을 도포하여 전극을 고정한 것을 나타낸 사진이다.
발효조성물을 투여 후 1주 간격으로 PowerLab(ADinstruments, New South Wales, Australia)을 이용하여 09:00부터 11:00까지 마리당 40분 동안 뇌전도(Electroencephalogram, EEG)를 측정하였다. EEG 신호는 총 5개로 분류하였으며 채널 1은 Delta wave (0.5 - 4.5 Hz), 채널 2는 Theta wave (4.5 - 8.5 Hz), 채널 3은 Alpha wave (8.5 - 12.5 Hz), 채널 4는 모든 파형을, 채널 5는 Beta wave (12.5 - 16.0 Hz)를 감지하여 데이터를 기록하였다.
5) 통계 처리
실험에서 얻은 결과는 통계프로그램인 SPSS (SPSS Inc, Chicago, USA)를 사용하여 평균값과 표준오차(Mean ± Standard error)를 계산하였으며, 측정값들의 차이는 p <0.05 수준에서 one-way ANOVA와 LSD로 유의성을 검증하였다.
결과 분석
1) 선발된 멜라토닌 합성 미생물 균주의 멜라토닌 함량 분석 결과
선발된 멜라토닌 합성 미생물 균주의 멜라토닌 함량 분석 결과를 도 1a 내지 도 3b에 나타내었다.
도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이, 분양받은 효모 배양액의 멜라토닌 함량은 130.4 - 316.4pg/mL이었다.
도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 포도에서 분리한 미생물 배양액의 멜라토닌 함량은 0 - 193.4pg/mL이었다.
도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 누룩에서 분리한 미생물 배양액의 멜라토닌 함량은 0 - 185.4pg/mL이었다.
멜라토닌 함량 분석 결과, 100 여종의 효모 중 분양받은 효모 KTCC 27220 균주의 배양액 내 멜라토닌 함량이 316.4 pg/mL로 가장 높은 것으로 확인되었다.
2) 식품 내 멜라토닌 함량 분석
식품 내 멜라토닌 함량 분석 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 시판 우유 및 발효유의 멜라토닌 함량은 13.1 - 28.7 pg/g이었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 시판치즈의 멜라토닌 함량은 74.0 - 180.5 pg/g이었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 동결건조한 채소의 멜라토닌 함량은 240.1 - 7,795.7 pg/g이었으며 달래, 샐러리, 부추, 쌈치커리, 콜리플라워, 느타리버섯, 마늘, 표고버섯, 적양배추 순으로 나타났다.
3) 발효유 내의 멜라토닌 함량 분석
발효유 분말 내의 미생물의 수 및 멜라토닌 함량을 분석하여, 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 발효유 분말 내의 미생물의 수 및 멜라토님 함량은 실시예(T2)의 발효유 분말에서 높은 것으로 나타났다. 특히, 도 8에 나타난 바와 같이, 실시예(T2)의 멜라토닌은 알로에 분말 및 효모 KTCC 27220의 시너지 효과에 유래한 것으로 판단된다.
4) 발효유 투여에 따른 변화 분석
대조 발효유 분말(비교예 1), T1 분말(비교예 2), T2 분말(실시예) 1g을 10mL에 희석하여 마우스에 마리당 1mL씩 경구투여한 후 체중, 장의 길이, 혈압, 기관의 무게, 뇌파, 신경행동 실험을 하였다.
도 9는 발효유 분말의 투여에 따른 체중 변화를 나타낸 그래프이다. 도 9에 나타난 바와 같이, 발효유 분말의 투여에 따른 체중의 유의적 변화는 관찰되지 않았다.
도 10은 발효유 분말의 투여에 따른 장의 길이 변화를 나타낸 그래프이다. 도 10에 나타난 바와 같이, 실시예(T2)의 발효유 분말을 투여 시 투여 2주차부터 장의 길이(맹장에서 항문까지의 길이)가 유의적으로 증가하여 장 건강 증진 효과를 나타내었다.
표 1은 발효유 분말의 투여 따른 혈압의 변화를 나타내고, 표 2는 발효유 분말의 투여에 따른 기관의 무게의 변화를 나타낸다. 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 발효유 분말의 투여에 따른 혈압 및 기관의 무게의 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
Figure 112018124181101-pat00001
Figure 112018124181101-pat00002
도 12 내지 도 14는 발효유 분말의 투여에 따른 뇌파 변화를 나타낸 그래프이다. 도 12 내지 도 14에 나타난 바와 같이, 실시예(T2)의 발효유 분말을 투여 시 수면파인 δ파가 유의적으로 증가하여 수면 장애 개선 효과를 나타내었다.
도 15는 발효유 분말의 투여에 따른 신경행동 변화를 알아보기 위하여, 오픈 필드 테스트(open field test)를 한 결과를 나타낸 그래프이다. 오픈 필드 테스트는 실험동물의 운동능력 및 불안감, 우울감을 측정할 수 있는 방법으로 100×100×40 cm 아크릴 테스트 영역에 실험동물을 위치시키고 20분간 적응시간을 적용한 후, 10분간 레코딩하며, 중심영역과 중심 외 영역을 이동하는 칸의 수를 측정하여 평가하였다. 중심영역에 머무르는 칸의 수가 많을수록 불안감, 우울감 감소로 평가하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 실시예(T2)의 발효유 분말을 투여 시 불안감 및 우울감이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.
도 16은 발효유 분말의 투여에 따른 신경행동 변화를 알아보기 위하여, 엘레베이티드 플러스 메이즈 테스트(elevated plus maze test)를 한 결과를 나타낸 그래프이다. 엘레베이티드 플러스 메이즈 테스트는 불안감을 평가하는 행동평가의 한 종류로 높이 90cm에 테스트 영역이 존재한다. 테스트 영역은 오픈 암(open arm)과 클로즈 암(close arm)이 십자 (+) 모양으로 구성되어 있으며 크기는 가로×세로; 100×100 cm로 이루어져 있다. 테스트는 5분의 적응시간 이후에 5분간 레코딩하여 오픈 암에 머무른 시간으로 평가하였다. 오픈 암에 머무른 시간이 길수록 불안-유사 행동이 감소하였다고 평가하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, 실시예(T2)의 발효유 분말을 투여 시 불안감이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.
상기와 같이 본원의 수면장애 개선을 위한 발효조성물은 분말 형태로 야간에 물에 타먹을 수 있고, 멜라토닌 함량을 높일 수 있어 불안감, 우울감을 감소시키며 장 건강을 증진시켜 장내 멜라토닌 분비를 증진시킬 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리 범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)를 포함하는 발효유; 및
    알로에를 유효성분으로 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발효유는 발효유 전체 중량에 대해 1 - 10 중량%의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 발효유는 탈지분유 및 유산균 스타터를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유산균 스타터는 케피어 스타터를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 발효조성물 전체 중량에 대해 5 - 15 중량%의 알로에를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    분말형태인, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    장의 길이를 연장하는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    수면파인 δ파를 증가시키는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    불안감 또는 우울감을 감소시키는, 수면 장애 개선용 발효조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 발효조성물을 포함하는, 수면 장애 치료 또는 예방용 수면 장애 개선용 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 발효조성물을 포함하는, 수면 장애 개선용 식품 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    멜라토닌 함량이 500pg/g 이상인, 식품 조성물.
  13. 하기의 단계를 포함하는 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법.
    (1) 탈지분유에 증류수를 가하여 환원하고, 유산균 스타터 및 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 첨가하고 배양하여 발효유를 준비하는 단계;
    (2) 상기 발효유를 동결건조하여 발효유 동결건조 분말을 준비하는 단계; 및
    (3) 동결건조 발효유 분말에 알로에 분말을 혼합하는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 발효유 전체 중량에 대해 1 - 10 중량%의 사카로마이세스 세르비지에 KTCC 27220(Saccharomyces cerevisiae KTCC 27220)을 첨가하는, 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 상기 유산균 스타터는 케피어 스타터를 포함하는, 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 20 - 30℃에서 20 - 28시간 배양하는, 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 단계 (3)에서 상기 발효조성물 전체 중량에 대해 5 - 15 중량%의 알로에를 혼합하는, 수면 장애 개선용 발효조성물의 제조 방법.
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CN100366721C (zh) * 2006-01-23 2008-02-06 王兴泉 以芦荟为主要中药原料的低度酒及其制造方法和应用
JP2015214518A (ja) * 2014-05-12 2015-12-03 ライオン株式会社 睡眠の質を改善する方法及び睡眠の質の改善用の経口用組成物

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