Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MISTURASIMBIÓTICA".
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se a preparações que compreendem umamistura probiótica e uma prebiótica que é especificamente destinada a acen-tuar eficiência e a eficácia do probiótico e a produtos alimentícios que com-preendem essa preparação.
Antecedentes da Invenção
O cólon humano é colonizado com uma ampla faixa de bactériasque apresentam tanto efeitos positivos quanto negativos sobre fisiologia in-testinal, bem como apresentando outras influências sistêmicas. Grupos pre-dominantes de bactérias encontrados no cólon incluem bacterióides, bifido-bactérias, eubactérias, clostrídios e lactobacilos. As bactérias presentes a-presentam atividades flutuantes na resposta a disponibilidade do substrato,potencial redox, pH, tensão e distribuição de O2 no cólon. Em geral bactériasintestinais podem ser divididas em espécies que poderão potencialmenteexercer efeitos nocivos ou benéficos sobre o hospedeiro. Efeitos patogêni-cos (que poderão ser causados por clostrídios ou bacterióides, por exemplo)incluem diarréia, infecções, dano hepático, carcinogênese e putrefação in-testinal. Efeitos promotores de saúde poderão ser causados pela inibição decrescimento de, e colonização por, bactérias nocivas, estimulação de fun-ções imunes, aperfeiçoando digestão e absorção de nutrientes essenciais esíntese de vitaminas. Um aumento nos números e/ou atividades de espéciesbacterianas tais como Bifidobacterium e Lactobacillus que poderão apresen-tar propriedades promotoras de saúde é desejável.
No passado recente; certas cepas de bactérias têm atraído a-tenção considerável porque elas mostraram exibir propriedades valiosas pa-ra o homem se ingeridas. Em particular, cepas específicas do gênero Laeto-bacilli e Bifidobacteria têm mostrado ser capaz de colonizar pelo menostransitoriamente a mucosa intestinal, reduzir a capacidade de bactérias pa-togênicas aderir-se ao epitélio intestinal, apresentar efeitos imunomodulado-res e auxiliar na manutenção de bem-estar. Tais bactérias são comumentechamadas probióticas.Têm-se realizado estudos extensivos para identificar novas ce-pas probióticas. Por exemplo, EP 0 199 535, EP 0 768 375, WO 97/00078,EP 0 577 903 e WO 00/53200 descrevem cepas específicas de Iactobacilose bifidobactérias e seus efeitos benéficos.
Um probiótico poderá ser definido como um suplemento alimen-tício microbiano vivo que beneficamente afeta o animal hospedeiro aperfei-çoando seu equilíbrio intestinal microbiano. Certas cepas de Lactobacilos eBifidobactérias tais como, por exemplo, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116, Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Bifidobaeterium Iaetis BB12 ®,Bifidobaeterium Iongum ATCC BAA-999 Lactobacillus reuterí ATCC 55730 eBifidobaeterium breve M-16V ® têm demonstrado apresentar essas proprie-dades. Tais Iactobacilos e bifidobactérias probióticas são comumente adicio-nados a alimentos humanos, tais como produtos lácteos fermentados. Sabe-se que probióticos geralmente apresentam um efeito profilático e terapêuticosobre infecções patogênicas do trato gastrointestinal tais como aquelas cau-sadas por espécies Clostridia e Salmonella, por exemplo. Na EP 904 784 éproposto usar uma combinação de três diferentes tipos de probióticos para otratamento de distúrbios gastrintestinais. Mais recentemente, sugeriu-se quealgumas cepas probióticas poderão ser também eficazes na prevenção etratamento de infecções do trato respiratório superior (British Medicai Journal2001,322:1-5).
Até lactentes especificamente são envolvidos, imediatamenteantes de nascimento, pensa-se que o trato gastrointestinal de um bebê sejaestéril. Durante o processo de nascimento, encontra-se bactérias do tratodigestivo e pele da mãe e começa a tornar-se colonizada. Existem grandesdiferenças com relação à composição da microbiota intestinal na resposta àalimentação do lactente. A flora fecal de lactentes no aleitamento inclui po-pulações apreciáveis de bifidobactérias com alguns lactobacilos, visto quelactentes alimentados com fórmula apresentam mais microbiota complexa,com bifidobactérias, bacterióides, clostrídios e estreptococos todos usual-mente presentes. Após desmame, um padrão de microbiota intestinal queparece com padrão adulto torna-se estabelecido.
Leite materno é recomendado para todos os bebês. Contudo,em alguns casos amamentação é inadequada ou malsucedida por razõesmédicas ou a mãe escolhe não amamentar. Fórmulas para Iactentes sãodesenvolvidas para essas situações.
Têm-se proposto adicionar probióticos a fórmulas infantis paraestimular que ocorra colonização intestinal e promover colonização com as"boas" bactérias - bifidobactérias e Iactobacilos - em vez das bactérias noci-vas - patógenos tais como clostrídios, etc. Tipicamente, um mínimo de107cfu/ g de fórmula é adicionado embora geralmente quantidades maioressejam preferidas, por exemplo, até 1012cfu/g de fórmula.
Uma outra abordagem para promover os números e/ou ativida-des de bactérias benéficas no cólon é a adição de prebióticos a gêneros ali-mentícios. Um prebiótico é um ingrediente alimentício não-digerível que be-neficamente afeta o hospedeiro seletivamente estimulando o crescimentoe/ou atividade de um ou um número limitado de bactérias no cólon, e assimaperfeiçoa saúde do hospedeiro. Tais ingredientes são não-digeríveis nosentido de que eles não são quebrados e absorvidos no estômago ou intes-tino delgado e desse modo passa intacto para o cólon onde eles são seleti-vamente fermentados pelas bactérias benéficas. Exemplos de prebióticosincluem certos oligossacarídeos, tais como fructooligossacarídeos (FOS) egalactooligossacarídeos (GOS).
Sabe-se que leite humano contém uma maior quantidade de oli-gossacarídeos indigeríveis do que a maior parte de outros leites animais. Defato, oligossacarídeos indigeríveis representam o terceiro maior componentesólido (após Iactose e lipídeos) no leite materno, ocorrendo sob uma concen-tração de 12-15 g/l no colostro e 5-8 g/l no leite maduro. Oligossacarídeosde leite humano são muito resistentes à hidrólise enzimática, indicando queesses oligossacarídeos poderão exibir funções essenciais não diretamenterelacionadas a seu valor calorífico.
À medida que a composição de leite humano torna-se melhorentendida, é também proposto adicionar prebióticos a fórmula infantil. Váriasfórmulas infantis suplementadas com prebióticos tais como misturas de fruc-tooligossacarídeos e galactooligossacarídeos, por exemplo são comercial-mente disponíveis. Contudo, tais misturas aproximam-se apenas grosseira-mente da mistura de oligossacarídeos no leite humano. Mais de 100 diferen-tes componentes de oligossacarídeos são detectados no leite humano, al-guns dos quais não são até agora detectados nos leites animais tal comoleite bovino de modo algum ou são detectados apenas em pequenas quanti-dades. Exemplos de classes de oligossacarídeo de leite humano que estãopresentes no leite bovino e colostro apenas em quantidades muito pequenasou não, de modo algum são oligossacarídeos sialilados e fucosilados.
Fórmulas infantis contendo tanto probióticos quanto prebióticossão também propostas na procura contínua de produzir fórmulas infantis quereplicam tão atentamente quanto possível a composição e eficácia de leitehumano. Por exemplo, no WO 2005/000748 é proposto suplementar fórmulainfantil com uma mistura de uma cepa de Bifidobacteríum breve, galactooli-gossacarídeos e fructooligossacarídeos (inulina). Reivindica-se que essamistura, a qual é descrita como um simbiótico, regula a população de Bifido-15 bacteríum no cólon de Iactentes que consumem a fórmula suplementadapara uma população maior "tal como infantil", isto é, menor em espécies Bi-fidobacteríum catenulatum, Bifidobacteríum pseudocatenulatum e Bifidobac-teríum. adolescentis e maior em espécies Bifidobacteríum infantis, Bifidobac-teríum breve e Bifidobacteríum iongum. A mistura é também relatada ser útil20 para a prevenção ou tratamento de uma condição imune.
Contudo, uma necessidade permanece para preparações quecompreendem uma mistura probiótica e uma prebiótica especificamente des-tinada a acentuar a eficiência e a eficácia do probiótico.
Sumário da invenção25 Verificou-se agora surpreendentemente que uma mistura prebió-
tica que compreende 5-70% em peso de oligossacarídeos N-acetilados, se-lecionados do grupo compreendendo
GalNAcals3Gaipi,4Gk e Galpl,6GaINAcal,3Galpl ,4Glc, 20-90% em peso de ou-tros oligossacarídeos neutros e Ga!pi,6Gái,Galp 1,6Gaipi ,4Glc GaÍpl,6Gaipi,6Glc, Gaipl,3Galpl,3Gle, Gatpi 3Galpl,4G!c,Galpl,6Galpl,ôGaiPMGlc, Galp 1,SGaip l,3Gaipi,4GIe Galp 1,3Gaip 1,6Gaip 1,4Glc
5-50% em peso de pelo menos um oligossacarídeos sialilado é selecionadoNeuAca2,3GaipU4Glc e NeuAco2,6Galpl,4Gic é altamente eficaz em acentuaros efeitos benéficos e eficiência de bactérias probióticas co-administradascom a mistura prebiótica.
Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a presente invenção propor-ciona uma preparação que compreende uma mistura de cepa bacterianaprobiótica e uma prebiótica que compreende 5-70% em peso de pelo menosum oligossacarídeo N-acetilado selecionado do grupo compreendendoGalNAcaÍ,3Galpl,4Glc e GaljH,6GalNAcal,SGalpMGlc, 20-90% em peso depelo menos um oligossacarídeos neutros selecionado do grupo compreen-dendo Galpl,6Gal, Gaipi,6Galpl,4Glc Gaipi ,6Gaipi ,6Glc, Galpl^GalpUGlciGalp 1,3Galp 1,4G1c, Galp 1 t6Gaipi ,6Galp 1,4Glc. Galpl ,6Galp UGalpMGlcGalp 1,3Gaipi(6Gaip 1,4Gic e 2-50% em peso de oligossacarídeo sialilado se-lecionado do grupo compreendendo NeuAca2,3Gaipi,4G1c eNeuAca2,6Gaip í 34G1c>
Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona ouso de uma mistura de cepa bacteriana probiótica e uma prebiótica quecompreende 5-70% em peso de pelo menos oligossacarídeo N-acetiladosselecionado do grupo compreendendo GalNAcai,3Gaipi,4Glc eGaip 1.6GalNAcal ,3Galp 1,4Glc} 20-90% em peso de outros oli-gossacarídeos neutros selecionado do grupo compreendendoGaipi ,6GalJ51,6Glc> GalpUGaipi^Gic, Gaip 1,3 Galp l,4Glc,GalpljeGalpl^Gaipi^Glc, GaJpl5óGalpl,3Galpl,4Glc eGall,3Gaipi»3Gatpl,4Glc e 2-50% em peso de pelo menos um oligossaca-rídeo sililado selecionado do grupo compreendendo NeuAcct2,3Gaipt,4G!ceNeuAcot2,6Galpl»4Glc na fabricação de um medicamento para a prevençãoe/ou tratamento de infecções patogênicas do trato gastrointestinal.
Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona o usode uma mistura de cepa bacteriana probiótica e uma prebiótica que compre-ende 5-70% em peso de oligossacarídeos N-acetilados, selecionado do gru-po compreendendo Galplf6Gal, Gaipl,6Galpl,4Glc eGal β1, 6GalfM ,60 le> Galpl,3Galpl,3Glc, Gaip 1,3 Galp l,4Glc,Galpl,6GalpÍ,6Gaipi ,4G1C, Gaipi ,6Galpl,3Gaipi,4Glc Galpl,3Galpl ,6Galp l,4Glce Gal^l,SGalpljSGaipi^GLc20-90% em peso de outros oligossacarídeosneutros selecionado do grupo compreendendo NeuAca2,3Gal£l,4Glc: e
NeuAca2,6Galpl,4Glc e 2-50% em peso de oligossacarídeos selecionado dogrupo compreendendo NeuAca2,3Gal£l,4G]e e NeuAco2,6GalpÍ,4Glcna fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de umacondição imune.
Em um quarto aspecto, a presente invenção proporciona o usode uma mistura de cepa bacteriana probiótica e uma prebiótica que compre-ende 5-70% em peso de oligossacarídeos N-acetilados,
GalNAcal 33Galpl,4Glc e 1,SGalNAcaUGaipi}4GIc,20-95% em peso de pelo menos um oligossacarídeos neutrosGalpl^Gal1 Galpl,6Gaipi,4Glc
Galpl,ÓGalpl,6Gic, GaipijSGaipi^Glc, Gaipi,3Gaipi,4Glc,Galp 1 ,éGaipi,6Gaipi,4Glc, Gaipi,6Galpl,3Galpl,4Glc Gaipi,3Gaipi,6GaipL,4Glce G^Pl»3Galpl,3Gaipi,4Glc e 2-50% em peso de pelo menos um oligossa-carídeo sialilado selecionado do grupo compreendendo
NeuAca2,3GaipiJ4Glc e NeuAcfl2,6Gaipi,4Glc. na fabricação de um medi-camento para a prevenção ou tratamento de infecções do trato respiratóriosuperior.
Em um quinto aspecto, a invenção proporciona um método paraa prevenção ou tratamento de infecções patogênicas do trato gastrointestinalem um indivíduo com necessidade deste, método este que compreende ad-ministrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica de uma preparação quecompreende uma mistura de cepa bacteriana probiótica e uma prebióticaque compreende 5-70% em peso de pelo menos um oligossacarídeo N-acetilado selecionado do grupo compreendendo GalNAcal,3Gaipi,4GlceGaip 1,6GalNAca 1,3Gaip 1,4GIc,20-90% em peso de pelo menos um oligossa-carídeo neutro selecionado do grupo compreendendo Ga*Pi.60ai. Gaipi,6Gaipi,4GicGalp L6Ga]01,6Glc} Galpl,3Gaipi,3Glc, Gaipi t3Galp1,4 Glc1Gaip 1 ,ÓGaipi,6Gaipl ,4Gle, Gaip i,6Galpl,3Gaipi,4Gic GaI01,3Gal{il,6Gal01 ,4Glce 2-50% em peso de pelo menos um oligossacarídeos sialilado selecionadodo grupo compreendendo
NeuAca2,3Galpl,4Glc e NeuAca2,6Galpl,4Glc.
Em um sexto aspecto, a invenção proporciona um método paraa prevenção ou tratamento de uma condição imune em um indivíduo comnecessidade deste, método este que compreende administrar ao indivíduouma quantidade terapêutica de uma preparação que compreende uma mis-tura de cepa bacteriana probiótica e uma prebiótica que compreende 5-70%em peso de oligossacarídeos N-acetilados, selecionado do grupo compreen-dendo
GalNAcaUGalpMGlc and Gaipi.óGafNAcotUGaipi^lc,
20-95% em peso de pelo menos um oligossacarídeo neutro selecionado dogrupo compreendendo Gaipi,6Gais Gaipi,6Gaipi?4Giç e 2-50% em peso de pelomenos um oligossacarídeo ácidosialilado selecionado do grupo compreen-dendo
NeuÀceü^Galpl^Ic e NeuAca2t6Gaipi,4Glc.
Em um sétimo aspecto, a invenção proporciona um método paraa prevenção ou tratamento de uma infecção do trato respiratório superior emum indivíduo com necessidade deste, método este que compreende admi-nistrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica de uma preparação quecompreende uma mistura de cepa bacteriana probiótica e uma prebióticaque compreende 5-70% em peso de pelo menos um oligossacarídeo N-acetilado selecionado do grupo compreendendo GaiNAcaMGalp i,4GiceGatpι,6GaiNAcat,3Gaipι ,4Gic, 20-95% em peso de pelo menos um oligossaca-rídeo neutro selecionado do grupo compreendendoGaIpl,6Gal, Galpl,6Galpl,4Gte GaipL6Gaipi,6Glc, GaipUGaipUGIc,Gaipi,3GaIpí,4Glc, Galpl.óGalpI.éGalpMGlc,Galpl,6Gaipi,3GalpI,4GicGalpl,3Galpl,6Galpi,4Glc e Galp IjXraipi ,3Gaipi,4Glce 2-50% em peso de pelo menos um oligossacarídeo sialilado selecionadodo grupo compreendendo NeuAca2,3Gal3MGlc e NeuAca2s6Gaip1,4Glc.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1 mostra o efeito protetor da preparação da invençãocontra toxina A de Clostridium difficile comparado com o efeito protetor dadopelos componentes da preparação isolada;
Figura 2 mostra o efeito protetor contra toxina A de Clostridiumdifficile conferido pelas cepas bacterianas probióticas usadas na Figura 1 emcombinação com vários diferentes prebióticos conhecidos no estado da técnica.
Descrição detalhada da invenção
A figura 3 compara a contagem de Bifidobacterium breve nointestino delgado de camundongo gnobiótico engordado com uma microbiotainfantil humana e alimentado a preparação da invenção com a contagem deBifidobacterium breve em camundongos alimentados com os componentesda preparação sozinhos;
A figura 4 compara a contagem de Staphylococci nas fezes decamundongo gnobiótico engordado com uma microbiota infantil humana ealimentado a preparação da invenção com a contagem de Staphylococci emcamundongos alimentados os componentes da preparação sozinhos;
A figura 5 compara a contagem de Clostridium perfrigens no in-testino delgado de camundongo gnobiótico engordado com uma microbiotainfantil humana e alimentado com a preparação da invenção com a conta-gem de Clostridium perfrigens em tais camundongos alimentados os compo-nentes da preparação sozinhos; e
A figura 6 compara a atividade metabólica relativa de Bifidobae-terium Iongum residente durante um período de duas semanas em camun-dongo livre de germes engordado com uma microbiota infantil humana e ali-mentado a preparação da invenção com a atividade metabólica relativa deBifidobaeterium Iongum residente em camundongos alimentados os compo-nentes da preparação sozinhos.
No presente relatório descritivo, as seguintes palavras são da-das uma definição que devem ser levadas em conta quando se lê e interpre-ta a descrição, exemplos e reivindicações:"Bebê": criança inferior à idade de 12 meses;
"microbiota bifidogênica intestinal" significa em bebês uma mi-crobiota intestinal que é dominada por Bifidobactéria tal como Bifidobacteriabreve, Bifidobactéria infantis e Bifidobactéria Iongum excluindo populaçõesapreciáveis de tais espécies como Bacteróides, Clostridia e Streptococci eque é geralmente comparável à encontrada em bebês amamentados.
"Fórmula infantil": gêneros alimentícios pretendidos para anutrição completa de bebês durante os primeiros quatro a seis meses devida e como um complemento para outros gêneros alimentícios até a idadede 12 meses.
"Oligossacarídeo N-acetilado" significa um oligossacarídeotendo um resíduo N-acetila.
"NCC" designa Coleta de Cultura da Nestlé.
"Oligossacarídeo neutro" significa um oligossacarídeo semcarga ou sem resíduo N-acetila.
"Bactéria probiótica": significa preparações de células microbia-nas ou componentes de células microbianas com um efeito benéfico na saú-de ou bem-estar do hospedeiro. (Salminen S., Ouwehand A. Benno Y. e ou-tros "Probiotics: como deveriam ser definidos" Trend Food Sei. Technol.1999:10 107-10);
"Prebiótica": significa um ingrediente alimentício não-digerívelque beneficamente afeta o hospedeiro mediante seletivamente estimulandoo crescimento e/ou atividade de uma ou um número limitado de bactérias nocólon e desse modo aperfeiçoa saúde do hospedeiro. (Gibson e Roberfroid" Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Con-cept of Prebiotics" J. Nutr. 125:1401 - 1412)
"Oligossacarídeo": significa um carboidrato que apresenta umgrau de polimerização (DP) que variam de 2 a 20 inclusive, mas não incluin-do, lactose; e
"Oligossacarídeo sialilado" significa um oligossacarídeo tendoum resíduo de ácido siálico com carga associada.
Preferencialmente, a mistura prebiótica compreende 10-70% empeso de oligossacarídeos N-acetilados, 20-80% em peso de oligossacarí-deos neutros e 10-50% de oligossacarídeos sialilados. Mais preferencial-mente, a mistura prebiótica compreende 15-40% em peso de oligossacarí-deos N-acetilados, 40-60% em peso de outros oligossacarídeos neutros e15-30% em peso de oligossacarídeos sialilados. Uma mistura prebiótica par-ticularmente preferida compreende 30% em peso de oligossacarídeos N-acetilados, 50% em peso de outros oligossacarídeos neutros e 20% em pesode oligossacarídeos sialilados.
Alternativamente a mistura pode compreender conveniente-mente de 5 a 20% em peso do(s) oligossacarídeo(s) N-acetilado(s) especifi-cado(s), de 60 a 95% em peso do(s) oligossacarídeo(s) neutro(s) especifi-cado(s) e de 2 a 30% em peso do(s) oligossacarídeo(s) silalidado(s) especi-ficado(s).
Oligossacarídeos N-acetilados são caracterizados pela presençade um resíduo N-acetil e incluem N-acetil-lactosamina, N-acetil-galactosaminil glicose e N-acetil-galactosil lactose.
A mistura prebiótica da invenção poderá ser preparada de umou mais leites animais. O leite poderá ser obtido de qualquer mamífero, emparticular de vacas, cabras, búfalos, cavalos, elefantes, camelos ou ovelha.
Alternativamente, a mistura prebiótica poderá ser preparada pormeio de aquisição e mistura dos componentes individuais. Por exemplo, ga-lacto-oligossacarídeos sintetizados, tais comoGalpljGGalβl,4GIc Gaipi.ÔGaipi.óGlc, GaipUGalpMGIci Gaipis$Gaipif6Gaipi,4Gtc,Galp 1,6Galp 1 ,JGaip 1,4Gíc e Gaipi,3Gaipi,6Ga1pl,4Glc.
são comercialmente disponíveis sob as marcas registradas Vivi-nal® e Elix'or®. Outros fornecedores de oligossacarídeos são Dextra Labo-ratories, Sigma-Aldrich Chemie GmbH e Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Al-ternativamente, glicosiltransferase específicas tais como galactosietransfera-se podem ser usadas para produzir oligossacarídeos neutros.
Alternativamente, oligossacarídeos N-acetilados poderão serpreparados pela ação de glicosaminidase e/ou galactosaminidase sobre N-acetil-glicose e/ou N-acetil galactose. Igualmente, N-acetil-galactosil transfe-rases e/ou N-acetil-galactosil transferases poderão ser usadas para essafinalidade. Oligossacarídeos N-acetiládos poderão ser produzidos por meiode tecnologia de fermentação usando enzimas respectivas (recombinantesou naturais) e/ou fermentação microbiana. No último caso, os micróbios po-derão expressar suas enzimas naturais e substratos ou poderão ser projeta-dos por engenharia para produzir substratos e enzimas respectivas. Culturasmicrobianas únicas ou culturas mistas poderão ser usadas. Formação deoligossacarídeos N-acetilados pode ser iniciada por substratos aceitantespartindo de qualquer grau de polimerização (DP) de DP = 1, progressiva-mente.
Uma outra opção é a conversão química de ceto-hexoses (porexemplo, fructose) livres ou ligadas a um oligossacarídeo (por exemplo, Iac-tulose) para N-acetilexosamina ou uma N-acetilexosamina contendo oligos-sacarídeo (por exemplo, lactosamina) conforme descrito in Wrodnigg, T.M.;Stutz, AE. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38:827-828.
Oligossacarídeos sialilados 3'sialil-lactose e 6'sialil-lactose pode-rão ser isolados por meio de tecnologia cromatográfica ou filtração de umafonte natural tais como leites animais. Alternativamente, eles poderão sertambém produzidos por biotecnologia usando sialiltransferases específicaspor tecnologia de fermentação à base de enzima (enzimas recombinantes ounaturais) ou por meio de tecnologia de fermentação microbiana. No últimocaso, micróbios poderão expressar suas enzimas naturais e substratos oupoderão ser projetados por engenharia para produzir substratos e enzimasrespectivas. Culturas microbianas únicas ou culturas mistas poderão ser u-sadas. Formação de oligossacarídeo sialilado pode ser iniciada por substra-tos aceitantes partindo de qualquer grau de polimerização (DP) de DP = 1progressivamente.
A cepa bacteriana poderá ser selecionada de qualquer cepa quesatisfaça a definição de um probiótico e apresenta vida útil aceitável em re-lação ao produto para que a preparação da invenção seja incorporada. Porexemplo, fórmulas infantis são exigidas permanecer estáveis e eficazes poraté 36 meses. Naturalmente, a preparação da invenção não precisa ser in-corporada em um outro produto tal como um gênero alimentício, mas poderáser ingerida como é, ou misturada com um excipiente adequado na forma deum pó ou cápsula ou prensada para comprimidos, por exemplo.A cepa bacteriana probiótica é preferencialmente, um Iactobaciloou uma bifidobactéria. Preferencialmente, são usadas cepas que produzemapenas ácido láctico L (+). Exemplos de espécies Lactobacillus preferidassão Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei e Lactobacillus reuteri.Cepas particularmente preferidas são Lactobacillus rhamnosus ATCC53103, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus reuteri ATCC55730 e Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116. Exemplos de espécies Bifi-dobacterium preferidas são Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve eBifidobacterium longum. Cepas particularmente preferidas são: a cepa de B.lactis vendida pela empresa Christian Hansen da Dinamarca sob a marcaregistrada BB12 e Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 obtenível de Mo-rinaga Milk Industry Co. Ltd. do Japão sob a marca registrada BB536.
A preparação da invenção poderá proporcionar entre 102e 1010cfu de bactérias probióticas para cada grama da mistura prebiótica.
Em um aspecto preferido da invenção, a preparação descrita a -cima é incorporada em um produto alimentício. No contexto da presente in-venção, o termo "produto alimentício" é pretendido abranger qualquer mate-rial consumível. Portanto, poderá ser um produto pretendido para consumopor seres humanos, em particular fórmula infantil, leite fermentado, e simila-res. Contudo, consumo da preparação não é restrito a bebês e crianças. Emparticular, a preparação da invenção
pode ser incorporada em leite desidratado ou misturas de cere-ais.
Se a preparação da invenção deve ser incorporada em fórmulainfantil ou outra composição nutricional à base de leite, a composição poderáser preparada em qualquer maneira adequada conhecida no estado da téc-nica. Por exemplo, uma fórmula infantil poderá ser preparada misturandojuntamente a fonte de proteína, quaisquer carboidratos de outra maneira Iac-tose e a fonte de gordura em proporções apropriadas. Emulsificantes pode-rão ser adicionados se desejados. Vitaminas e minerais poderão ser adicio-nados nesse ponto, mas são usualmente adicionados posteriormente paraevitar degradação térmica. Quaisquer vitaminas lipofílicas, emulsificantes esimilares, poderão ser dissolvidos na fonte de gordura antes de mistura. Á-gua, preferencialmente água que foi submetida à osmose reversa, poderáem seguida ser misturada em, para formar uma mistura líquida.
A mistura líquida poderá em seguida ser termicamente tratadapara reduzir cargas bacterianas. Por exemplo, a mistura líquida poderá serrapidamente aquecida até uma temperatura na faixa de aproximadamente80°C a aproximadamente 110°C por cerca de 5 segundos a cerca de 5 mi-nutos. Isso poderá ser realizado por meio de injeção de vapor ou por troca-dor térmico, por exemplo, um trocador térmico de placa.
A mistura líquida poderá em seguida ser resfriada a aproxima-damente 60°C a aproximadamente 85°C, por exemplo, por resfriamento ins-tantâneo. A mistura líquida poderá, então, ser homogeneizada, por exemplo,em dois estágios sob aproximadamente 7 MPa a aproximadamente 40 MPano primeiro estágio e aproximadamente 2 MPa a aproximadamente 14 MPano segundo estágio. A mistura homogeneizada poderá em seguida ser adi-cionalmente resfriada para adicionar quaisquer componentes sensíveis acalor tais como vitaminas e minerais. O pH e teor de sólidos da mistura ho-mogeneizada é convenientemente padronizada nesse ponto.
A mistura homogeneizada é transferida para um aparelho de se-cagem adequado, tal como um secador por atomização ou secador por con-gelamento, e convertida em pó. O pó deve apresentar um teor de umidadede menos aproximadamente 5% em peso.
A preparação da invenção poderá ser produzida em progresso eadicionada diretamente a composição nutricional por meio de mistura seca.Preferencialmente, contudo, os componentes individuais da preparação sãoadicionados separadamente à composição nutricional em cujo caso, a mistu-ra prebiótica é preferencialmente adicionada na fase líquida imediatamenteantes de secagem e a cepa bacteriana probiótica é preferencialmente adi-cionada à composição seca por meio de mistura seca.
A cepa bacteriana probiótica selecionada poderá ser cultivadade acordo com qualquer método adequado conhecido no estado da técnicae preparada para adição a fórmula infantil por meio de secagem por conge-lamento ou secagem por atomização, por exemplo. Alternativamente, cepasbacterianas podem ser adquiridas de fornecedores especialistas tais comoChristian Hansen e Morinaga anteriormente preparadas em uma forma ade-quada para adição a produtos alimentícios tal como fórmula infantil.
Se a mistura prebiótica foi preparada de um leite animal, por e-xemplo, conforme descrita abaixo, e é pretendida adicioná-la a uma fórmulainfantil, poderá ser conveniente adicioná-la sem primeiro remover toda a Iac-tose. Como uma fórmula infantil contém um componente carboidrato que éfreqüentemente total ou parcialmente constituído por lactose, será visívelaquele versado na técnica que a quantidade de carboidrato na fórmula infan-til necessitará ser ajustada para levar em conta o carboidrato adicional queserá adicionado com a mistura prebiótica. A concentração final da prepara-ção inventiva no produto alimentício ou fórmula para bebê ou infantil é prefe-rencialmente de 0,3 a 6,0%, preferencialmente de 0,75 a 4,0% em peso dematéria seca. Isso corresponde a uma concentração de 0,2 a 8 gramas porlitro, preferencialmente de 1 a 5 g/l de fórmula reconstituída. Contudo, essasquantidades não devem ser consideradas como Iimitativas e devem ser a-daptadas à população-alvo, por exemplo, com base no peso e idade ou saú-de do bebê ou criança. Preferencialmente, a fórmula ou alimentação conten-do a mistura de oligossacarídeo da invenção é alimentada ao bebê em cadaalimentação.
Além da preparação da invenção, um produto alimentício talcomo uma fórmula infantil poderá compreender um ou mais oligossacarídeosadicionais que são adicionados separadamente até um teor de oligossacarí-deo de 10 g/l de fórmula reconstituída ou líquida.
Embora sejam preferidos para suplemento produtos alimentíciosespecificamente direcionados no sentido de nutrição infantil ou para bebê,poderá também ser benéfico para suplemento produtos alimentícios não es-pecificamente direcionados, ou direcionados à população adulta. Por exem-plo, as misturas de oligossacarídeos da invenção podem ser incorporadasem produtos de nutrição para cuidados da saúde e produtos nutricionais pa-ra os idosos. Tais produtos alimentícios poderão incluir misturas para bebi-das à base de leite; iogurtes, produtos fermentados à base de leite, e sorve-tes, bem como produtos à base de cereal, entre outros.
Surpreendentemente, verificou-se que a mistura prebiótica naspreparações da invenção sinergicamente acentua as propriedades antipato-gênicas e imunomoduladoras do probiótico para produzir um efeito terapêu-tico que é notadamente superior à mistura de, por exemplo, o mesmo probió-tico com um único prebiótico. As preparações da invenção e produtos ali-mentidos contendo-as são desse modo adequadas para a prevenção e tra-tamento de infecções gastrintestinais causadas por patógenos, particular-mente patógenos bacterianos, bem como infecções do trato respiratório su-perior tal como otite média. Produtos alimentícios contendo preparações deacordo com a invenção são desse modo especialmente adequados para po-pulações vulneráveis tais como bebês e idosos.
Adicionalmente, as preparações da invenção são adequadas pa-ra reforço de defesas imunes, por exemplo, aumentando resposta a vacinase reduzindo a duração e gravidade de infecções, bem como para a preven-ção e tratamento de condições relacionadas ao malfuncionamento do siste-ma imune em bebês e crianças jovens tais como hipersensibilidade a ali-mentos, eczema, rinite alérgica, dermatite atópica e outras doenças atópicas.
Outra vantagem das preparações da invenção é que elas pro-movem o estabelecimento de uma microbiota bifidogênica intestinal em be-bês aumentando a atividade metabólica relativa da espécie Bifidibactéria quedomina tais microbiotas intestinais em bebês.
A invenção será agora ilustrada como referência aos seguintesexemplos.
Exemplo 1
200.000 litros de permeado de ultrafiltração de soro de leite sãopré-concentrados a 22% (p/p) de sólidos totais (ST), pasteurizados sob a-proximadamente 75°C por cerca de 30 segundos e em seguida concentra-dos por evaporação sob 60°C para alcançar um ST de 59% (p/p). O líquido éresfriado em um cristalizador sob uma taxa de 2°C por hora por um períodode 24 horas para cristalizar a lactose. Lactose cristalizada é lavada em se-guida removida por um "wringei". O líquido restante é clarificado por meio deum decantador. Os 77.000 litros sob 17,7% de ST obtidos do clarificador sãoreconcentrados por meio de evaporação a 60°C para alcançar um ST de55% (p/p) e submetidos a uma segunda etapa de cristalização de Iactosesob as mesmas condições como antes. Os 29.000 litros sob 20,5% de ST delicor desse modo obtido são desmineralizados por uma combinação de ele-trodiálise e troca iônica de uma maneira conhecida intrinsecamente produ-zindo 28.500 litros de um licor desmineralizado a 90% sob 17,3 % de ST.
Esse licor que contém aproximadamente 1,5 gramas de uma mistura de a-proximadamente 30% em peso GalNAcai,3Gaipif4Gic eGaipl,6GalNAcal^GaipL,4Gtc, 50% em peso de Galfl 1.6Gaipi,4Gk eGaipi pJGalpI^lce 20% em peso de NeuAca2,3Galpl,4Glc e NeuAco2,6Galpl ,4Glc,poderá ser adicionado diretamente a um produto alimentício tal como umafórmula infantil ou poderá ser adicionalmente concentrado de uma maneiraconhecida intrinsecamente aquele versado no estado da técnica.
Por exemplo, uma Iactose que permanece no licor poderá serhidrolisada para glicose e galactose e esses monossacarídeos poderão serremovidos por nanofiltração ou, se desejado, a galactose poderá ser pelomenos parcialmente polimerizada, por exemplo, pela ação de β-galactosidase para produzir galacto-oligossacarídeos que também serãoretidos pela membrana de nanofiltração.
Exemplo 2
Em 100 kg da mistura prebiótica produzida de acordo com o ex-emplo 1a 50% TS são aquecidos a 609C em um tanque padrão e o pH éajustado para 6 a 6,5. 4,5 mg de Iactase F (Amano, Japão) são adicionadospor grama de S T e a mistura é mantida a 60SC durante três horas. Em se-guida a temperatura é elevada a 110°C durante 11 segundos por injeçãodireta de vapor para inativar a enzima. O líquido resultante contém aproxi-madamente 100 gramas por Iitor de uma mistura de cerca de 10 % em pesode GaINAcaI,3Galp1,4Glc e Gaipi,6GalNAca1,3Galp1,4Glc, 87 % em pesode Galpl,6Gaipi,6Glc, Gaipi,6Galp1,4Glc e Galpl ,3Galp1,4Glc e 3 % empeso de NeuAcoc2,3Galp1,4Glc e NeuAccx2,6Galp1,4Glc. Pode ser adicio-nado diretamente a um produto alimentar tal como uma fórmula infantil ouconcentrado como descrito acima.Exemplo 3
Um exemplo da composição de uma fórmula infantil contendouma preparação de acordo com a presente invenção é dada abaixo.
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Exemplo 4
Experimentos in vitro foram realizados para comparar a eficáciade preparações de acordo com a invenção usando duas diferentes cepas debactérias probióticas com a eficácia de misturas das mesmas bactérias pro-bióticas e outras prebióticas na prevenção de infecção patogênica. Toxina AClostridium difficile foi selecionada como uma toxina representativa de bacté-rias patogênicas.
Monocamadas de células epiteliais intestinais T84 crescidas emplacas Transwell foram incubadas com (i) um probiótico isolado, (ii) um pre-biótico isolado, ou (iii) uma combinação de probiótico e prebiótico. Após umapré-incubação de 2 horas a 37°C, 5% de CO2, as células T84 foram desafia-das com toxina A de C. difficile sob uma concentração de 100 ng/ml. Resis-tência elétrica transepitelial (RET), que funcionou como um marcador paraavaliar proteção contra a ação de toxina A, foi monitorada sob intervalos re-gulares de até 24 horas. Calculou-se um escore de proteção normalizada.
As cepas bacterianas probióticas foram L. paracasei (CNCM I-2116) e L rhamnosus (ATCC 53103). Ambas as cepas foram usadas sobconcentrações finais de 10® cfu/l.
Os prebióticos usados foram a mistura prebiótica descrita nesterelatório sob 1 g/l; fructooligossacarídeos (Raftilose P95, Orafti, Bélgica);galactooligossacarídeos (Vivinal GOS, DOMO, Os Países Baixos) e sialilac-tose (Kyowa Hakko Kogyo, Japão) sob 10 g/l..
Os resultados são mostrados nas Figuras 1 e 2. A Figura 1 com-para os resultados obtidos com o probiótico isolado, a mistura prebiótica iso-lada e a preparação da invenção para as duas cepas probióticas. A Figura 2compara os resultados obtidos com as mesmas cepas probióticas conformeusadas na Figura 1 e fructooligossacarídeos sob 20 g/l; galactooligossacarí-deos sob 20 g/l e sialil-lactose sob 10 g/l. Usou-se Iactose (Sigma) sob 20 g/lcomo um controle.
A partir da Figura 1, poderá ser observado que as preparaçõesda invenção apresentavam um efeito sinérgico significativo contra toxina Ade C. difficile comparadas com aquelas proporcionadas pelos componentesindividuais (isto é, mistura prebiótica e cepa probiótica) isolados. A partir daFigura 2, poderá ser observado que um efeito comparável não foi obtidoquando as mesmas cepas bacterianas probióticas foram testadas em com-binação com fructooligossacarídeos, galactooligossacarídeos, ou sialil-lactose individualmente. Poderá ser observado que proteção moderada foiobtida usando L. rhamnosus em combinação com sialil-lactose, mas apenassob 10 g/l e não sob 1 g/l quando com a preparação da invenção.
Exemplo 5
Experimentos in vivo foram realizados para comparar os efeitosda microbiota intestinal de suplementação com a mistura prebiótica sozinha,com um Bifidobacterium Iactis probiótico sozinho e com uma preparação d eacordo com a invenção em um modelo animal gnotobiótico de microbiotainfantil humana.
Camundongos livres de germes foram engordados com ummodelo de microbiota infantil humana e a microbiota foi permitida a se esta-belecer em duas semanas. Os camundongos foram então divididos emquatro grupos: um primeiro grupo recebeu 3% em peso da mistura prebióticasozinha em seu alimento, um segundo grupo recebeu Bifidobacterium IactisCNCM I-3446 (NCC 2818) em sua água potável, um terceiro grupo recebeuo alimento com complemento prebiótico e a água com complemento pro-biótico e um quarto grupo de controle. A microbiota fecal foi monitorada du-rante o curdo do estudo (duas semanas) ao final do período, o qual os ani-mais foram sacrificados e a microbiota do intestino delgado também foi in-vestigada.Os resultados são mostrados nas Figuras 3, 4 e 5. A partir des-sas figuras, pode-se observar que uma microbiota bifidogênica intestinal,conforme evidenciado pelas contagens de Bifidobacterium breve no intestinodelgado (Figura 3) e contagens reduzidas de Staphylococci e Clostridiumperfringens nas fezes (Figuras 4 e 5), é sinergisticamente promovida pelapreparação de acordo com a invenção em comparação aos seus compo-nentes individuais.
Exemplo 6
Experimentos in vivo foram realizados para comparar os efeitosno estabelecimento e na atividade metabólica de Bifidobacterium Iongum notrato gastrintestinal de camundongos livres de germes da suplementaçãocom a mistura prebiótica sozinha, com uma cepa Lactobacillus rhamnosusprobiótica e com uma preparação de acordo com a invenção.
Os camundongs livres de germes foram engordados com ummodelo de microbiota infantil humana e o estabelecimento da microbiota foimonitorado com o tempo pela contagem de placas e pela avaliação dosníveis de 16S rRNA indicando atividade metabólico. 16S rRNA foi amplifi-cado por reação em cadeia de polimerase, os produtos foram separados emum gel de gradiente de desnaturação e quantificados em relação aos níveisde 16S rRNA constantes de E.coli que serviu como padrão interno. Os se-guintes tratamentos foram comparados - dieta controle e bebida controle(água); dieta controle complementada com 3% da mistura prebiótica e águapotável; dieta controle e Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 (NCC4007) na água; dieta controle suplementada com 3% da mistura prebiótica eLactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 na água.
Os resultados são mostrados na Figura 6. A preparação deacordo com a invenção aumentou sinergisticamente a atividade metabólicageral do Bifidobacterium Iongum residente durante o estabelecimento deuma microbiota infantil humana em camundongos livres de germes. As con-tagens de B. Iongum residentes em microbiotas de bebês humanos apresen-taram níveis similares após 14 dias no grupo de controle e nos grupos quereceberam a mistura probiótica e prebiótica sozinhos, enquanto a atividademetabólica relativa foi sinergistica e significativamente aumentada no grupoque recebeu a preparação de acordo com a invenção (A Figura 6D com-parada com as 6A, B, C).