MXPA06004035A - Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos. - Google Patents

Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos.

Info

Publication number
MXPA06004035A
MXPA06004035A MXPA06004035A MXPA06004035A MXPA06004035A MX PA06004035 A MXPA06004035 A MX PA06004035A MX PA06004035 A MXPA06004035 A MX PA06004035A MX PA06004035 A MXPA06004035 A MX PA06004035A MX PA06004035 A MXPA06004035 A MX PA06004035A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
acid sequence
nucleic acid
domain
amino acid
Prior art date
Application number
MXPA06004035A
Other languages
English (en)
Inventor
Patrick Bauerle
Original Assignee
Micromet Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34486072&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MXPA06004035(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Micromet Ag filed Critical Micromet Ag
Publication of MXPA06004035A publication Critical patent/MXPA06004035A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]

Abstract

La presente invencion proporciona una construccion de enlace especifica de CD3 citotoxicamente activa que comprende un primer dominio que liga especificamente a CD3 humano y un segundo dominio de enlace derivado de Ig. Ademas, se proporciona una secuencia de acido nucleicos que codifica una construccion de enlace especifica de CD3 de la invencion. Adicionales aspectos de la invencion son vectores y celulas anfitrionas que comprenden la secuencia de acido nucleico, un proceso para la produccion de la construccion de la invencion y composicion que comprende la construccion. La invencion tambien proporciona el uso de las construcciones para la preparacion de composiciones farmaceuticas para el tratamiento de enfermedades particulares, un metodo para el tratamiento de enfermedades particulares y un equipo que comprende la construccion de enlace de la invencion.

Description

AGLUTINANTES CD3 DE-INMUNIZADOS MULTI-ESPECÍFICOS La presente invención se refiere a una estructura o construcción de enlace específica de CD3 citotóxicamente activa que comprende un primer dominio que liga específicamente a CD3 de humano y un segundo dominio de enlace derivado de Ig. Además, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción de enlace específica de CD3 de la invención, se proporciona. Adicionales aspectos de la invención son vectores y células anfitrionas que comprenden la secuencia de ácido nucleico, un proceso para la producción de la construcción de la invención y una composición que comprende la construcción. La invención también proporciona el uso de las construcciones para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades particulares, un método para el tratamiento de enfermedades particulares y un equipo que comprende la construcción de enlace de la invención. CD3 humano denota un antígeno que se expresa en células T como parte del complejo de células T multi-molecular y que consiste de tres cadenas diferentes : CD3-£, CD3-£> y CD3- . El enjambrado de CD3 en células T, por ejemplo por anticuerpos anti-CD3 inmovilizados lleva a activación de célula T similar al acoplamiento del receptor de células T pero independiente de su especificidad tipo clon; ver WO 99/54440 o Hoffman (1985) J. Immunol. 135:5-8. Anticuerpos que reconocen específicamente el antígeno CD3 se describen en la técnica previa, por ejemplo en Traunecker, EMBO J 10 (1991) , 3655-9 y Kipriyanov, Int. J. Cáncer 77 (1998), 763-772. Recientemente, se han propuesto anticuerpos dirigidos contra CD3 en el tratamiento de una variedad de enfermedades . Estos anticuerpos o construcciones de anticuerpo actúan ya sea como agentes de agotamiento de células T o como agentes mitogénicos, como se describe en EP 1 025 854. Anticuerpos híbridos de humano/roedor que ligan específicamente al complejo de antígenos CD3 humano se describen en WO 00/05268 y se proponen como agentes inmunosupresores, por ejemplo para el tratamiento de episodios de rechazo después de transplante de aloinjertos renales, sépticos y cardiacos. WO 03/04648 describe un anticuerpo bi-específico dirigido a CD3 y a un antígeno de cáncer de ovario. Además, Kufer (1997) C ncer Immunol Im unother 45:193-7 se refiere a un anticuerpo bi-específico, específico para CD3 y EpCAM para la terapia de cáncer residual mínimo . Sin embargo, anticuerpos de la técnica previa dirigidos contra CD3 se derivan de fuentes no-humanas . Esto lleva a varios problemas serios cuando se utilizan dichos anticuerpos anti-CD3 como parte de un régimen terapéutico en humanos. Un problema tal es el "síndrome de liberación de citoquina (CRS=cytokine reléase syndrome) " . CRS es un síndrome clínico que se ha observado después de la administración de las primeras pocas dosis de anticuerpo anti-CD3 y se relaciona al hecho de que muchos anticuerpos dirigidos contra CD3 son mitogénicos . Anticuerpos mitogénicos, in vitro, dirigidos contra CD3 inducen proliferación de células T y producción de citoquina. In vivo, esta actividad mitogénica lleva a la liberación a gran escala de citoquinas, incluyendo muchas citoquinas derivas de células T, dentro de las iniciales horas después de la primer inyección del anticuerpo. La capacidad mitogénica de anticuerpos CD3 específicos es dependiente de monocitos/macrófagos e involucra la producción de IL-6 e IL-1/5 por estas células. Los síntomas CRS están en el intervalo de síntomas "tipo gripe" ligera frecuentemente reportados a reacciones "tipo choque" severas menos frecuentemente reportadas (que pueden incluir manifestaciones cardiovasculares y del sistema nervioso central) . Los síntomas incluyen entre otros, dolor de cabeza, temblor, nausea/vómito, diarrea, dolor abdominal, malestar y dolencias y dolores de músculos/articulaciones, debilidad generalizada, eventos Carpió respiratorios así como eventos neuro-psiquiátricos . Ha ocurrido severo edema pulmonar en pacientes con sobre carga de fluidos y en aquellos que parecen no tener sobre carga de fluidos . Otro problema serio que complica el uso terapéutico de, en especial anticuerpos monoclonales murinos es el montaje de una respuesta inmune humoral contra estos anticuerpos, que resulta en la producción de anticuerpos anti-ratón humanos ("HAMAs") (Schroff (1985) Cáncer Res.45: 879-885, Sha ler (1985) J. Immunol . 135:1530-1535) . HAMAs típicamente se generan durante la segunda semana de tratamiento con el anticuerpo murino y neutralizan los anticuerpos murinos, bloqueando de esta manera su capacidad para ligar a la diana pretendida. La respuesta HAMA puede depender de las regiones de anticuerpo constantes murinas ("Fe") o/y la naturaleza de las regiones variables murinas ("V") . La técnica previa contiene diversos enfoques para reducir o evitar la producción de HAMAs al modificar anticuerpos monoclonales de origen no humano. Un enfoque al reducir la inmunogenicidad de estos anticuerpos por humanización tal como se describe por ejemplo en WO 91/09968 y la patente de los E.U.A. No. 6,407,213. En general, la humanización involucra substituciones de secuencias de anticuerpos no humanos por secuencias humanas correspondientes, tal como por ejemplo es el caso con injerto de CDR Otro enfoque para reducir la inmunogenicidad de estos anticuerpos es por des-inmunización, tal como por ejemplo se describe en WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415, WO 02/012899 y WO 02/069232. En general, la des-inmunización involucra el llevar a cabo substituciones de amino ácidos con epítopos de células T potenciales. De esta manera, se reduce la probabilidad de que una secuencia determinada dará lugar a epítopos de células T ante procesamiento de proteína intracelular. Aún más, WO 92/10755 describe el enfoque en donde se somete la ingeniería determinantes antigénicos en proteínas. Particularmente, las proteínas son cartografiadas por epítopos y su secuencia de amino ácidos se cambia a través de ingeniería genética. Sin embargo, los anticuerpos humanizados a menudo exhiben una afinidad de enlace disminuida con respecto a su objetivo o diana en comparación con sus anticuerpos padre no humanizados y también a menudo son algo inmunogénicos todavía en un anfitrión humano. Por lo tanto, el problema técnico de la presente invención fue el proporcionar medios y métodos para el tratamiento de y/o mejoramiento de enfermedades tumorales, desordenes proliferativos así como enfermedades relacionadas a células B por inducción de inmuno respuesta mediada por células T. Los medios y métodos anteriormente mencionados deberán superar las desventajas descritas de las terapias basadas en anticuerpos, conocidas. La solución de este problema técnico se logra al proporcionar las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones . De acuerdo con esto, la presente invención se refiere a una construcción de enlace específica de CD3 citotóxicamente activa que comprende un primer dominio que liga específicamente a CD3 humano y un segundo dominio de enlace derivado de Ig, en donde el primer dominio se des-inmuniza y comprende una región CDR-H1, región CDR-H2 y región CDR-H3 la región CDR-H3 comprende una secuencia de amino ácidos como se ilustra en SEQ ID NO.: 96, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, o 127; y en donde el primer dominio además comprende en su estructura Hl la secuencia VKK (Val-Lys-Lys) y en donde la secuencia de transición entre la estructura Hl y la región CDR-H1 comprende la secuencia Ala-Ser-Gly-Tyr- Thr-Phe (ASGYTF; SEQ ID NO. : 233) . Se encontró de manera sorprendente que las modificaciones específicas anteriormente descritas a regiones CDR reconocidas así como regiones marco y sus secuencias de transición correspondientes llevan a moléculas de enlace específicas CD3 des-inmunizadas que muestran inmunogenicidad reducida pero retienen su actividad citotóxica en comparación con secuencias no- des-inmunizadas originales. Este hallazgo fue en particular sorprendente ya que no todos los protocolos de des-inmunización posibles llevaron a construcciones funcionales bioactivas que muestran actividad citotóxica distinta; ver ejemplos anexos. Además, de manera sorprendente las moléculas de enlace CD3 citotóxicamente activas des-inmunizadas mostraron productividad incrementada. De acuerdo con esta invención, secuencias específicas de anticuerpos no-des-inmunizados se han reemplazado por/modificado a las secuencias aquí descritas anteriormente. En particular, en las regiones marco Hl, la secuencia original Leu-Ala-Arg (LAR) se ha reemplazado por la secuencia Val-Lys-Lys (VKK) . Además, la secuencia Thr-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (TSGYTF) comprendida en la región de transición del marco Hl y CDR-H1 de algunos anticuerpos específicos de CD3 no-modificados/no-des-inmunizados, se han modificado de acuerdo con la invención a Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF) (SEQ ID NO..-233) (ver Figura 14). Una construcción de enlace específica de CD3 de la invención deseada, se caracteriza porque comprende cuando menos dos especificidades de enlace en donde la segunda especificidad de enlace es derivada de Ig. Además, las construcciones deseadas se caracterizan por las secuencias de amino ácidos específicas mostrados previamente . Como se documentó en los ejemplos anexos, las construcciones como se proporcionan aquí, todavía retienen bioactividad en su forma modificada/des-inmunizada. Los ejemplos también documentan que no toda las des-inmunizaciones, determinadas por los métodos conocidos en la técnica (WO 92/10755, WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 o WO 02/012899), llevan a moléculas bioactivas; ver en particular los ejemplos 2 y 5. El término "construcción de enlace CD3 citotóxicamente activa" como se emplea aquí, se refiere a una construcción específica de CD3 capaz de ligar a complejos CD3 humano expresado en células T y capaz de inducir eliminación/lisis de células diana u objetivo. El enlace de aglutinantes específicos CD3 del complejo CD3 de enlace CD3/CD3 (por ejemplo anticuerpos, derivados de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos) lleva a la activación de células T como se conoce en la técnica; ver WO 99/54440. De acuerdo con esto, una construcción de la invención tiene que ser capaz de eliminar/lisar células diana in vivo y/o in vitro. Células diana correspondientes comprenden células que expresan una molécula de superficie, que se reconoce por el segundo dominio de enlace derivado de Ig de las construcciones de la invención. Estas moléculas de superficie se caracterizan a continuación. La citotoxicidad puede detectarse por métodos conocidos en la especialidad y métodos como se ilustra a continuación y en los ejemplos anexos. De acuerdo con esto, estos métodos comprenden entre otros, ensayos fisiológicos in vitro. Estos ensayos fisiológicos pueden supervisar la muerte celular, por ejemplo por pérdida de la integridad de la membrana celular (por ejemplo ensayo de yoduro de propidio basado en FACS, ensayo de influjo de azul tripano, ensayo de liberación de enzima fotométrica (LDH) , ensayo de liberación de slCr radiométrico, ensayos de desprendimiento de europio fluorométrico y desprendimiento de CalceinAM) . Adicionales ensayos comprenden supervisar la viabilidad celular, por ejemplo por ensayos MTT, XTT, WST-1 y alamarBlue, ensayo de incorporación 3H-Thd radiométrico, actividad de ensayo clonogénico que mide la actividad de división celular y ensayo de Rhodamine123 fluoro étrica que mide el gradiente transmembrana mitocondrial . Además, puede supervisarse la apoptosis por ejemplo por ensayo de exposición de fosfatidilserina basada en FACS. Prueba TÚNEL basada en ELISA, ensayo de actividad de caspasa (fotométrico, fluorométrico o basado en ELISA) o analizar la morfología de célula cambiada (encogimiento, zeiosis o formación de burbujeo aparente en membrana) . Se prefiere que la actividad citotóxica se analice por medidas basadas en FACS de liberación de colorantes basados en fluorescencia. En este ensayo, células etiquetadas de fluorescencia, que transportan una molécula que liga al segundo dominio, de la construcción de enlace CD3 biespecífica citotóxicamente activa de la invención (de preferencia células NALM-6 para CD19 y células Kato para el antígeno EpCAM) , se incuban con PBMCs aislados de donadores aleatorios o con una línea de células T estandarizada en la presencia de la construcción de enlace CD3 biespecífica citotóxicamente activa de la invención. Después de incubar, la liberación del colorante de las células diana fluorescentes en el sobrenadante, se determina por un espectrofluorimetro . Una construcción de enlace CD3 biespecífica desinmunizada citotóxicamente activa de la presente invención se caracteriza al comparar valores obtenidos por medición de la bioactividad de una construcción similar que no está des-inmunizada o no tiene especificidad para las células diana. El término "liga/interactúa con" como se emplea en el contexto con la presente invención, define un enlace/interacción de al menos dos "sitios-deinteracción-antígeno" entre sí. El término "sitios-deinteracción-antígeno" define, de acuerdo con la presente invención, un motivo de un polipéptido que muestra la capacidad de interacción específica con un antígeno específico o un grupo de antígenos específicos. El enlace/interacción también se entiende que defina un "reconocimiento específico" . El término "reconocimiento específico" significa de acuerdo con esta invención que la molécula anticuerpo es capaz de interactuar específicamente con y/o ligar a cuando menos dos amino ácidos de cada una de moléculas diana humanas como se define aquí. Anticuerpos pueden reconocer, interactuar y/o ligar con diferentes epítopos en la misma molécula objetivo. Dicho término se refiere a la especificidad de la molécula de anticuerpo, es decir aceptabilidad para discriminar de la ..molécula anticuerpo, es decir a su capacidad para discriminar entre regiones específicas de la molécula diana humana como se define aquí. El término interacción del sitio-de-interacción-de-antígeno con su antígeno específico puede resultar en un inicio de una señal, por ejemplo debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. De esta manera, un motivo específico en la secuencia de amino ácidos del sitio-de-interacción-de- antígeno y el enlace antígeno entre si como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria, así como el resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura. El término "interacción específica" como se emplea de acuerdo con la presente invención, significa que la construcción de enlace específico CD3 de la invención no o esencialmente no tiende a reacción cruzada con (poli) péptidos de estructuras similares. De acuerdo con esto, la construcción de la invención liga específicamente con/interactúa con CD3 humano y es capaz, debido a su segundo dominio derivado de Ig para interactuar con otros compuestos específicos selectos, antígenos, marcadores de superficie anular, marcadores de tumor, etc. Ejemplos específicos de estas moléculas contra el segundo dominio derivado de Ig se dan a continuación . La reactividad cruzada de un panel de construcciones bajo investigación, puede probarse por ejemplo al estimar el enlace del panel de construcciones de cadena sencilla bi-especificas bajo condiciones convencionales (ver por ejemplo Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 and Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 ) al (poli) péptido de interés de (poli) péptidos más o menos cercanamente relacionados (en sentido estructural y/o funcional) . Solo aquellas construcciones (es decir anticuerpos, scFvs bi-específicos y semejantes) que ligan a el (poli) péptido/proteína de interés pero no o esencialmente no ligan a ningún otro de los otros (poli) péptidos que de preferencia se expresan por el mismo tejido que el (poli) éptido de interés, por ejemplo por las células del tejido cardiaco, se consideran específicos para el (poli)péptido/proteína de interés y se seleccionan para adicionales estudios de acuerdo con el método que aquí se proporciona e ilustra en los ejemplos anexos. Estos métodos pueden comprender, entre otros, estudios de enlace, estudios de bloqueo y competencia con moléculas cercanamente relacionadas sencillo estructural y/o funcional . Estos estudios de enlace también comprenden análisis FACS resonancia plasmón de superficie (SPR, por ejemplo con BIAcoreMR) , ultra centrifugación analítica, calorimetría de titulación isotérmica, anisotropía de fluorescencia, espectrocospia de fluorescencia o por ensayos de enlace de ligando radio etiquetado. Además, ensayos fisiológicos, como ensayos citotóxicos (como se ilustra en los ejemplos) y los ensayos anteriormente mencionados pueden realizarse. De acuerdo con esto, ejemplos para la integración específica de un sitio-de-interacción-de- antígeno con un antígeno específico pueden comprender la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende particularmente la interacción de ligandos que inducen una señal al ligar a su receptor específico. Ejemplos para ligandos correspondientes comprenden citoquinas que interactúan/ligan con/a sus receptores de citoquina específicos . También particularmente comprendido por dicha definición es el enlace de un sitio-de-interacción-de-antígeno con antígenos tales como antígenos de la familia selectina, integrinas y de la familia de factores de crecimiento como EGF. Otro ejemplo de la interacción, que está comprendido particularmente por dicha definición, es la interacción del determinante antigénico (epítopo) con el sitio de enlace antigénico de un anticuerpo. El término "que liga a/interactúa con" se refiere no solo a un epítopo lineal sino también se refiere a un epítopo de conformación, un epítopo estructural o un epítopo discontinúo que consiste de dos regiones de las moléculas diana humanas o sus partes. En el contexto de esta invención, un epítopo de conformación se define por dos o más secuencias de amino ácido discretas separadas en la secuencia primaria que se reúnen en la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega a la proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553-6) . El término "epítopo discontinúo" significa en el contexto de la invención, epítopos no lineales que se ensamblan a partir de residuos de porciones distantes de la cadena polipéptido. Estos residuos se reúnen en la superficie cuando la cadena polipéptido se pliega en una estructura tridimensional para constituir un epítopo de conformación/estructural . Las construcciones de la presente invención también se prevén que ligan específicamente con/interactúan con uno o varios epítopos de conformación/estructurales compuestos de y/o que comprenden las dos regiones del complejo CD3 humano aquí descrito o sus partes como se describe a continuación. De acuerdo con esto, la especificidad puede determinarse experimentalmente por métodos conocidos en la técnica y los métodos como se describen e ilustran aquí. Estos métodos incluyen pero no están limitados a técnicas Western, pruebas ELISA, RÍA, ECL, IRMA y exploraciones de péptido . El término "segundo dominio de enlace derivado de Ig" se refiere a un "dominio derivado de inmunoglobulina", específicamente a un anticuerpo o sus fragmentos, a anticuerpos de cadena sencilla, a anticuerpos sintéticos, a fragmentos de anticuerpos tales como Fab, un F(ab2)', fragmentos Fv o scFv, etc, o un derivado químicamente modificado de cualquiera de estos . Estas moléculas de anticuerpos pueden derivarse de especies diferentes o pueden ser de origen quimérico. Más preferiblemente (como se documenta a continuación) , el segundo dominio derivado de Ig comprendido en la construcción de enlace especifica CD3 de la invención es un scFv. Anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo (todos derivados Ig) para emplearse de acuerdo con la invención o sus cadenas de inmunoglobulina correspondientes pueden ser adicionalmente modificados utilizando técnicas convencionales conocidos en la especialidad, por ejemplo al utilizar una o varias eliminaciones de amino ácido, inserciones, substituciones, adiciones, y/o recombinaciones, y/o cualesquiera otras modificaciones conocidas en la técnica ya sea solos o en combinación. Métodos para introducir estas modificaciones en la secuencia de ADN subyacentes a la secuencias de amino ácido de una cadena inmunoglobulina son bien conocidos por la persona con destreza en la técnica; ver por ejemplo Sambrook (1989), loe. cit . El término "dominio derivado de Ig" particularmente se refiere a las construcciones (poli) péptido que comprenden al menos un CDR. Fragmentos o derivados de los dominios derivados Ig discretos definen (poli)péptidos que son partes de las moléculas de anticuerpo anteriores y/o que se modifican por métodos químicos/bioquímicos o biológicos moleculares . Métodos correspondientes se conocen en la técnica y se describen entre otros en manuales de laboratorio (ver Sambrook y colaboradores; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ° edición 1989 y 3o edición 2001; Gerhardt y colaboradores; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual : The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions : A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002) . El término "des-inmunizado" como se emplea aquí, se refiere al primer dominio anteriormente identificado de la construcción de enlace CD3 de la invención, en donde el primer dominio se modifica en comparación con una construcción de tipo silvestre original al hacer no inmunogénica a la construcción de tipo silvestre o menos inmunogénica en humano. Construcciones del tipo silvestre de acuerdo con la invención se refieren a anticuerpos o sus partes (como marcos y/o CDRs) de origen no humano. Ejemplos correspondientes son anticuerpos o sus fragmentos como se describe en la patente de los E.U.A. No. 4,361,549 o WO 99/54440. El término "des-inmunizado" también se refiere a construcciones, que muestran la reducida propensión a generar epítopos de célula T. De acuerdo con esta invención, el término "propensión reducida a generar epítopos de células T" , se refiere a la remoción de epítopos de célula T que llevan a activación de célula T específica. Además, una propensión reducida a generar epítopos de células T significa substitución de amino ácidos que contribuyen a la formación de epítopos de células T, es decir substitución de amino ácidos, que son esenciales para formación de un epítopo de células T. En otras palabras, la propensión reducida para generar epítopos de células T se refiere a reducida inmunogenicidad o a reducida capacidad para inducir proliferación de célula T independiente de antígenos. Además, la propensión reducida para generar epítopos de célula T se refiere a des-inmunización, lo que significa pérdida o reducción de epítopos de célula T potenciales de secuencias de amino ácidos que inducen proliferación de células T independiente de antígeno. De acuerdo con la invención, una región de enlace CD3, que tiene propensión reducida a generar epítopos de células T es menos o preferiblemente no inmunogénica en comparación con una molécula no des-inmunizada pero que aún ha retenido su capacidad para ligar a CD3 , es decir una construcción de anticuerpo baja o no inmunogénica de enlace a CD3. El término "epítope de célula T" se refiere a cortas secuencias de péptido que pueden liberarse durante la degradación de péptido, polipéptidos o proteína dentro de células y subsecuentemente presentadas por moléculas deL complejo de mayor ist©compatibilidad (MHC) a fin de disparar la activación de células T; ver entre otros WO 02/06651 . Para péptidos presentados por MHC clase II esta activación de células T puede entonces dar lugar a una respuesta de anticuerpo por estímulo directo de células T para producir los anticuerpos. De acuerdo con esto, un primer dominio des-inmunizado que liga específicamente a CD3 humano comprende al menos el CDR-H3 anteriormente mencionado ubicado entre un marco H3 y H4 , en donde el primer dominio de enlace muestra una propensión reducida para generar epítopos de células T en comparación con un primer dominio no-des-inmunizado que comprende (wt) -CDR-H3 tipo silvestre sin cambio ubicado entre el marco H3 y H4. Además, el primer dominio des-inmunizado comprende al menos en la región de transición del marco Hl y CDR- Hl el motivo de secuencia anteriormente mencionado que proporciona una propensión reducida a generar epítopos de células T en comparación con un primer dominio no-desinmunizado que comprende la región de transición wt-Hl sin cambio del marco Hl y CDR-H1. "Propensión reducida a generar epítopos de células T" y/o "des-inmunización" puede medirse por técnicas conocidas en la especialidad. De preferencia, la des-inmunización de proteínas puede probarse in vitro por un ensayo de proliferación de células T. En este ensayo, PBMCs de donadores que representan > 80 % de alelos HLA-DR en el mundo se supervisan para proliferación en respuesta ya sea a péptidos de tipo silvestre o des-inmunizados . Idealmente la proliferación de células solo se detecta al cargar las células que presentan antígenos con péptidos tipo silvestre. En forma alterna, se puede probar la desinmunización al expresar tretámeros HLA-DR que representan todos los haplotipos . Estos tetrámeros pueden probarse para enlace de péptido o cargarse con péptidos substituidos por células que presentan antígeno en ensayos de proliferación. Para probar si se presentan péptidos des-inmunizados en haplotipos HLA-DR el enlace por ejemplo de péptidos etiquetados por fluorescencia en PBMCs puede ser medido. Además, puede probarse la des-inmunización al determinar si anticuerpos contra las moléculas des-inmunizadas se han formado después de administración en pacientes . Un método particularmente preferido es un ensayo de proliferación de células T, como se muestra entre otros en el ejemplo 6 anexo. De preferencia, moléculas derivadas de anticuerpo se des-inmunizan en las regiones marco y la mayoría de las regiones CDR no se modifican a fin de generar propensión reducida para inducir epitopo de célula T, de manera tal que la actividad de enlace de las regiones CDR no es afectada. Incluso eliminación de un epitopo de célula T resulta en inmunogenicidad reducida. De preferencia, la molécula se des-inmuniza en la región CDR2 de la cadena VL, mas preferidamente en la región CDR2 de la cadena VH aun mas preferible en la región CDR1 de la cadena VL, aun mas preferible en la región CDR1 de la cadena VH, mas preferiblemente en la región marco (FR) de la cadena VL y mas preferiblemente en la región marco (FR) de la cadena VH. El termino "CDR" como se emplea aquí se refiere a "región para determinación de complementariedad", que es bien conocida en la especialidad. Las CDR son partes de inmunoglobulina y receptores de células T que determinan la especificidad de las moléculas y hacen contacto con ligando específico. Las CDRs son la parte más variable de la molécula y contribuyen a la diversidad de estas moléculas. Hay tres regiones CDR, CDRl, CDR2 y CDR3 en cada dominio V. CDR-H ilustra una región CDR de una cadena pesada variable y CDR-L se refiere a una región CDR de una cadena ligera variable. H significa la cadena pesada variable y L significa la cadena ligera variable. Las regiones CDR de una reacción derivada Ig pueden determinarse como se escribe en Kabat (1991) . Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta edición, publicación NIH numero 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol.
Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883. En general, CDR-L1 consiste de 10 a 17 residuos aminoácido, empieza aproximadamente en el residuo aminoácido 24 de la región VL completa de una secuencia derivada Ig y el residuo Cys precede a CDR-L1. De preferencia, el residuo Trp sigue a CDR-L1. CDR-L2 empieza de preferencia 16 residuos aminoácido después de CDR-L1 y de preferencia consiste de 7 residuos. De preferencia, los residuos aminoácido Ile-Tyr, pero también, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe, preceden a CDR-L2. CDR-L3 empieza, de preferencia 33 residuos aminoácidos después de CDR-L2 y de preferencia consiste de 7 a 11 residuos. CDR-L3 sigue, de preferencia el residuo Cys y de preferencia los residuos Phe-Gly-Xaa-Gly siguen directamente a CDR-L3. CDR-H1 consiste de preferencia de 10 a 12 residuos y empieza de preferencia aproximadamente en el residuo 26 desde el inicio de la región VH. De preferencia, el residuo Trp sigue CDR-Hl. CDR-H2 empieza de preferencia 15 residuos aminoácidos después del fin de CDR-Hl y de preferencia consiste en 16 a 19 residuos. De preferencia, los residuos Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala siguen a CDR-H2. CDR-H3 empieza 33 residuos aminoácidos después de CDR-H2 y tiene una longitud de 3 a 25 residuos aminoácidos. CDR-H3 sigue la secuencia Cys-Xaa-Xaa (de preferencia Cys-Ala-Arg) y los residuos Trp-Gly-Xaa-Gly siguen a CDR-H3. La estructura de las regiones CDR se ha descrito desde http: //www.bioinf . org.uk/abs/ . Las regiones CDR-Hl y CDR-H2 anteriormente descritas se derivan de moléculas de anticuerpo que son capaces de ligar específicamente con/interactuar con/ CD3 humano. Este anticuerpo especifico CD3 se conoce en la técnica y comprende en particular los anticuerpos monoclonales 0KT-3, TR-66 o X35-3, VIT3 , BMA030 (BW264/56) , CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, Flll-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, 0KT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 o WT-31. Todos los anticuerpos anti-CD3 anteriormente mencionados son específicos de humano y de acuerdo con esta invención es posible combinar diversas regiones CDR, en particular regiones CDRH de los anticuerpos . En una modalidad más preferida, las regiones CDR-Hl y CDR-H2 del dominio especifico CD3 con propensión reducida a generar epitopos de células T, se derivan de la construcción de anticuerpo descrita en WO 99/54440. Aun mas se prefiere (y como se ilustra en los ejemplos anexos) las regiones CDR-Hl y CDR-H2 así como la región CDR-H3 se derivan de un anticuerpo/derivado de anticuerpo con especificidad para la molécula CD3 descrita por Traunecker (1991), EMBO J. 10, 3655-3659. De acuerdo con esta invención las regiones CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 se derivan de anticuerpos/derivado de anticuerpo y semejantes que son capaces de reconocer específicamente la cadena CD3-£ de humano en el contexto de otras subunidades TCR, por ejemplo en células de ratón transgénicas para la cadena CD3-£ humana. Estas células de ratón transgénicas expresan la cadena CD3-£ humana en una conformación nativa o casi nativa. De acuerdo con esta invención, una región marco se refiere a una región en el dominio V (dominio VH o VL) de inmuno globulina y receptores de células T que proporcionan un andamio de proteínas para las regiones para determinación de complementariedad hipervariable (CDRs) que hacen contacto con el antígeno. En cada dominio V, hay cuatro regiones marco designadas FR1, FR2, FR3 y FR4. El marco 1 abarca la región desde el extremo N hasta del dominio V hasta el inicio de CDRl, el marco 2 se refiere a la región entre CDRl y CDR2 , el marco 3 abarca la región entre CDR2 y CDR3 y el marco 4 significa la región desde el fin de CDR3 hasta el extremo C del dominio V; ver entre otros Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5ta edición. De esta manera, las regiones marco abarcan todas las regiones fuera de las regiones CDR en los dominios VH o VL. Además, el termino "secuencia de transición entre un marco y una región CDR" se refiere a una unión directa entre el marco y la región CDR. En particular, el termino "secuencia de transición entre un marco y una región CDR" significa la secuencia ubicada directamente N- y C- terminal de las regiones CDR o aminoácidos que circundan a las regiones CDR. De acuerdo con esto, marcos también pueden comprender secuencias entre diferentes regiones CDR. La persona con destreza en la técnica fácilmente esta en posición para deducir de una secuencia dada las regiones marco, las CDRs así como las secuencias de transición correspondientes; ver Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta edición., la publicación NIH no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883. Una construcción de enlace especifica de CD3 citotóxicamente activa preferida de la invención además comprende en el primer dominio un marco H3 que comprende la secuencia Met-Glu-Leu-Ser (MELS; SEQ ID NO.:234). Aun más se prefiere una construcción de la invención que comprende en el primer dominio un marco H3 que comprende la secuencia Ile-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEQ ID NO. : 235) . De acuerdo con la presente invención, el primer dominio de la construcción de la invención específicamente liga con/interactúa con CD3 humano y tiene una propensión reducida para generar epitopos de células T, comprende regiones CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 como aquí se define y en una modalidad preferida marcos de VH (los marcos 1, 2, 3, 4) como se definió anteriormente, en particular como se ilustra en cualquiera de las SEQ ID NOs.: 152 o 153, 156 o 157, 160 o 161 y/o 164 o 165. Por lo tanto, la construcción de las especificaciones CD3 de la invención comprende un primer dominio que liga específicamente con CD3 humano y comprende una región marco 1 como se ilustra en SEQ ID NO.: 152 o 153, una región marco 2 como se ilustra en SEQ ID NO. : 156 o 157, con una región marco 3 como se ilustra en SEQ ID NO. : 160 o 161 y/o una región marco 4 como se ilustra en SEQ ID NO.: 164 o 165. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la construcción de enlace especifica CD3 des-inmunizada citotóxicamente activa comprende en su primer dominio (a) , un CDR-Hl como se ilustra en SEQ ID NO. : 88; y inciso (b) un CDR-H2 como se ilustra en SEQ ID NO. : 90 O 92. De acuerdo con esto, las regiones CDR-Hl y CDR-H2 modificadas llevan a propensión reducida para generar epitopos de células T y se derivan de un anticuerpo específico de cadena CD3-£. Mas preferiblemente de acuerdo con esta invención los anticuerpos (padre) deberán ser capaces de ligar específicamente epitopos que reflejan la estructura nativa o casi nativa o un epitopo de conformación de CD3 humano presentado en contexto del complejo TCR. De preferencia, la construcción de enlace específica de CD3 de la invención comprende una región VH como se ilustra en SEQ ID NO.: 74 o 76. SEQ ID NO.: 74 muestra una región pesada variable des-inmunizada ilustrativa y similarmente SEQ ID NO.: 76 muestra una región pesada variable des-inmunizada ilustrativa. De preferencia, la construcción de enlace específica de CD3 de la invención comprende un CDR-L1 como se ilustra en SEQ ID NO.: 98 o 100, un CDR-L2 como se ilustra en SEQ ID NO.:102 y/o un CDR-L3 como se ilustra en SEQ ID NO. : 104. La construcción de enlace específica de CD3 de la invención comprende, en una modalidad preferida, una región VL en su porción especifica CD3 , en donde la reacción VL se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 78 , SEQ ID NO.: 80, SEQ ID NO.: 82 y SEQ ID NO.: 112. VL1 como se caracteriza en SEQ ID NO.: 78, VL2 como se caracteriza en SEQ ID NO. :80 y VL 3 como se caracteriza en SEQ ID NO.: 82 se refieren a regiones VL totalmente des-inmunizadas de acuerdo con esta invención y pueden emplearse en diversas combinaciones con las regiones VH anteriormente descritas. Sin embargo, también se prevé que la región VL no des-inmunizada puede ser combinada, de acuerdo con la invención, con regiones VH des-inmunizadas definidas anteriormente. Una región VL no des-inmunizada correspondiente de preferencia empleada en una construcción de enlace CD3 citotóxicamente activa de la invención, se ilustra en SEQ ID NO.: 112. De acuerdo con esto, no solo la parte de cadena pesada del "primer dominio" anteriormente descrito de la construcción CD3 de la invención puede ser modificada para tener una propensión reducida para generar epitopos de células T. También se prevé que el dominio comprenda las partes de cadena ligera variable correspondientes SEQ ID NOs.: 78, 80, y 82, por ejemplo ilustran las regiones de VL1, VL2 y VL3 de la parte de la CD3 de una construcción descrita en WO 99/54440. Como se menciono anteriormente, la construcción de enlace especifico de CD3 de la invención, más preferidamente, comprende un segundo dominio derivado de Ig que es un scFv. De acuerdo con esto, en una modalidad más preferida de la presente invención, una construcción de anticuerpo de cadena sencilla vía específica desinmunizada se proporciona con una especificidad para CD3 humano y una especificidad adicional que esta mediada por un segundo scFv, dirigido contra/capaz de interactuar con una adicional molécula/compuesto. Estas adicionales moléculas/compuestos pueden comprender moléculas de superficie celular, marcador de tumor, antígenos de tumor, y semejantes. Estos adiciónales compuestos/moléculas se ejemplifican a continuación y construcciones especificas también se dan y proporcionan en los ejemplos anexos. El termino "construcción de anticuerpo de cadena sencilla vía especifica" se refiere a una construcción que comprende dos dominios de enlace derivados de anticuerpo, de preferencia scFvs . Uno de los dominios de enlace consiste de regiones variables (o sus partes) de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o su derivado, capaz de ligar específicamente a/interactuar con antígeno CD3 humano (molécula diana 1) . El segundo dominio de enlace consiste de regiones variables (o sus partes) de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o su derivado, capaz de ligar específicamente a/interactuar con otro antígeno (humano) (molécula diana 2) como se define a continuación. De acuerdo con esto, el segundo dominio de enlace es de acuerdo con esta invención, el segundo dominio derivado Ig descrito anteriormente que comprende un si.tio-de-interacción-de~antígeno con especificidad para una molécula de superficie celular y/o marcador especifico de tumor. Los dos dominios/regiones en la construcción bio-especifica, de preferencia en la construcción de anticuerpo de cadena sencilla vía especifica, de preferencia se conectan covalentemente entre si como una sola cadena. Esta conexión puede efectuarse ya sea directamente (dominio 1 [especifico para antígeno CD3 humano, que comprende una propensión reducida para generar epítopos de célula T y que comprende regiones CDR o regiones CDR y regiones marco como se definió anteriormente] -dominio 2 [especifico para una molécula de superficie celular y/o un marcador especifico de tumor] o dominio 1 [especifico para una molécula de superficie celular y/o un marcador especifico de tumor] -dominio 2 [especifico para antígenos CD3 humano, que comprende una propensión reducida para generar epítopos de células T y que comprende regiones CDR o regiones CDR y regiones marco como se definió anteriormente] ) o a través de una secuencia enlazadora polipéptido adicional (dominio 1-secuencia enlazadora-dominio 2) . En el caso de que se utilice un enlazador, este enlazador de preferencia es de una longitud y secuencia suficientes para asegurar que cada uno del primer y segundo dominios pueden, independientemente entre si, retener sus especificidades de enlace diferenciales . Como se menciono anteriormente y como se documenta en los ejemplos anexos, de preferencia la construcción de las específicas CD3 que comprenden al menos dos dominios como se define aquí es una "construcción de anticuerpo de cadena sencilla vía específica", más preferiblemente una Fv de cadena sencilla vía especifica (scFv) . Se prevé particularmente que dicha construcción se emplee en el contexto de una composición farmacéutica. Moléculas de cadenas sencillas vía específicas se conocen en la especialidad y se describen en WO 99/54440, Mack, J. Immunol . (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, ufer, C ncer Immunol . Immunother. , (1997), 45, 193-197, Lóffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, J.
Immunol., (2001), 166, 2420-2426. Un formato molecular particularmente preferido de la invención proporciona una construcción de polipéptido en donde el dominio de enlace específico CD3 de la construcción de la invención comprende al menos una región VH y una VL como se definió anteriormente. Vale la pena notar que además de una región de VH como se define aquí y que tiene reducida propensión para generar epitopos de células T, la construcción de enlace especifica puede comprender adicionales regiones/dominios con reducida propensión para generar epitopos de célula T. Como se menciono anteriormente, también la región VL y/o los marcos correspondientes pueden comprender tramos de aminoácidos que se han sometido a ingeniería de acuerdo con esta invención para tener la propensión reducida para generación de epítopo de célula T . La orientación intramolecular del dominio VH y VL, que están enlazadas entre si por un dominio enlazador, en el formato scFv no es decisiva para las construcciones de cadena sencilla vía especificas descritas. .De esta manera, scFvs con ambos arreglos posibles (dominio VH-enlazador-dominio-VL; dominio VL- enlazador-dominio-VH) son modalidades particulares de la construcción de cadena sencilla vía especifica descrita. Un dominio específico CD3 puede ubicarse N- o C-terminal en la molécula vía específica. Regiones VH y VL de cada dominio pueden disponerse en diferentes ordenes (VH~VL o VL-VH) . El termino "cadena sencilla" (como se emplea de acuerdo con la presente invención, significa que el primer y segundo dominios de la construcción de cadena sencilla vía especifica están enlazados covalentemente, de preferencia en la forma de una secuencia de aminoácido co-lineal codificada por una sola molécula de ácido nucleico. Vale la pena notar que la construcción de la invención puede comprender, además del primer dominio aquí definido y el segundo dominio derivado Ig (uno o varios dominios adicionales, por ejemplo para el aislamiento y/o preparación de construcciones producidas de manera recombinante . Vale la pena notar que de acuerdo con esta invención, no solo el primer dominio anteriormente descrito que liga específicamente a CD3 humano de la construcción CD3 de la invención puede tener reducida propensión para generar epitopos de células T. También se prevé que el segundo dominio derivado Ig y/o (a) regiones enlazadoras de conexión se modifican, por ejemplo humanizan y/o desinmunizan. Como se menciono anteriormente, los enfoques de desinmunizacion se ilustran particularmente en WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 o WO 02/012899 y los ejemplos anexos. Estos enfoques involucran el llevar a acabo sustituciones de aminoácidos dentro de epitopos de células T potenciales. De esta manera, se reduce la probabilidad de que una secuencia determinada de lugar a epitopos de células T ante procesamiento de proteína intracelular. Además WO 92/10755 describe un enfoque en donde se someten a ingeniería determinantes antihigiénicos en proteínas. Particularmente, las proteínas son cartografiadas por epítopo y su secuencia de aminoácido se cambia a través de ingeniería genética. . Además, "enfoque de humanización" son bien conocidas en la técnica y en particular descritos para moléculas de anticuerpos, por ejemplo moléculas derivadas de Ig. El termino "humanizado" se refiere a formas humanizadas de anticuerpos o sus fragmentos no humanos (por ejemplo murinos) (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFvs, u otras secuencias parciales de enlace de antígeno de anticuerpos) que contienen alguna porción de la secuencia derivada de anticuerpo no humano. Anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas en donde residuos de una región de determinación de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina humana, se reemplazan por residuos de un CDR de una especie no -humana tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad de enlace deseada. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y en general dos dominios variables en donde todo o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todo o sustancialmente todo de las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado en forma óptima también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana; ver entre otros Jones et al., Nature 321:522-525 (1986), Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la especialidad. En general un anticuerpo humanizado tiene uno o mas aminoácidos introducidos en el desde una fuente que no es humana a fin de semejar mas cercanamente un anticuerpo humano, mientras que aun retienen la actividad de enlace original del anticuerpo. Métodos para humanización de moléculas de anticuerpos/anticuerpos se detallan adicionalmente en Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); y Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988). Ejemplos específicos de anticuerpos humanizados, como por ejemplo anticuerpos dirigidos contra EpCAM, son conocidos en la especialidad, ver por ejemplo (LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology (Abstract) . 1997, 1562 and Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology (Abstract) , 1997, 847) . De acuerdo con esto, en el contexto de esta invención, se proporcionan en particular construcciones de anticuerpo de cadena sencilla vía especificas que se des-inmuniza y puede ser empleada sucesivamente en composiciones farmacéuticas . Como se menciono anteriormente, el segundo dominio derivado Ig de la construcción de enlace específica de CD3 descrita anteriormente, puede comprender un sitio-de-interacción-de-antígeno con la especificidad para una molécula de superficie celular. El termino "molécula de superficie celular" como se emplea aquí, también denota moléculas que se presentan en la superficie de las células . El termino "molécula de superficie celular" se refiere a moléculas que se presentan en la superficie de células y comprenden dominios o epitopos accesibles (in Vitro o in vivo) a dominios de enlace derivados de Ig, de preferencia anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, o derivados. Como se ilustro anteriormente, mas preferiblemente el dominio derivado Ig es un scFv. Ejemplos de estas moléculas de superficie celular son membranas y proteínas transmembrana, moléculas adaptadas a las proteínas o superficie celular como etc . De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la invención, la molécula de superficie celular es un marcador específico de tumor. En el contexto de esta invención, el termino "marcador especifico de tumor" se refiere a moléculas que están presentes y/o ubicadas en la superficie de células de tumor o que se expresan en forma ubicua pero que solo son accesibles para enlace de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos en la superficie de las células de tumor. Ejemplos de marcadores de tumor se dan aquí a continuación y comprenden aunque no están limitados a , EpCAM, CD19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina) , MUC2 , MUC3 , MUC4 , MUC5AC, MUC5B, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, CD44v6, Wue-1, Antígeno de célula de plasma (ver WO 01/47953), IgE (ligado a membrana) , Sulfato Proteoglicano Condroitína de Melanoma (MCSP=Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan) , STEAP, mesotelina, Antígeno de célula madre de próstata (PSCA=Prostate Stem Cell Cntigen) , sTn (antígeno Tn sialilado) , antígeno de activación de fibroblastos, (FAP=fibroblast activation antigen) EGFRvIII, Iga, lq ß , MT-MMPs, antígeno Cora, EphA2, L6 y C0-29.
El segundo dominio derivado de Ig de la construcción de enlace especifica de CD3 de la invención también puede comprender un sitio de interacción-antígeno con una especificidad para una molécula seleccionada del grupo que consiste en EpCAM, CCR5, CD19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina) , MUC2 , MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5E, MUC7, /5hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangleosido GD3, 9-0-Acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GMl, Poly SA, GD2, Carboanhidrasa IX (MN/CA IX) , CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh) , Wue-1, antígeno de célula de plasma, IgE (ligado a membrana) , Sulfato Protogliocan Condritina de Melanoma (MCSP) , CCR8 , TNF-précursor alfa, STEAP, mesotelina, antígeno A33, Antígeno de célula madre de próstata (PSCA) , Ly-6; desmogleina 4, neoepitopo de E~caderina, Receptor de acetilicolina fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 y Receptor tipo II de sustancia inhibitoria de muelerina (MIS=Muellerian Inhibitory Substance) , sTn (Antígeno Tn sialilado) , antígeno de activación de fibroblastos (FAP=fibroblast activation antigen) , endosialina, EGFRvIII, L6, SAS, CD63 , TAG72 , TF-antígeno, antígeno Cora, CD7, CD22, Iga .. CD79a) , Ig/J (CD79b) , G250, gplOO, MT-MMPs, F19-antígeno, CO-29 y EphA2. Las construcciones que aquí se proporcionan son particularmente útiles en un ambiente medico. Por ejemplo, enfermedades tumorales y/o linfomas, de preferencia linfoma de celula-B-no-Hodgkin' s puede tratarse con una construcción des-inmunizada (bio-específica) de la invención dirigida contra CD3 y CD20 humanos (CD3xCD20 o CD20xCD3) . Enfermedades auto inmunes pueden tratarse por la administración de construcciones des-inmunizadas (bio-específicas) dirigidas contra CD3 y CD30 o CD19 humano (es decir CD3xCD30 o CD30xCD3 o CD3xCD19 o CD19xCD3) . Artritis reumatoide, así como otras enfermedades inflamatorias pueden tratarse con una construcción des-inmunizada (bio-específica) de la invención dirigida contra CD3 y CCR5 (CD3xCCR5 o CCR5xCD3) . Una construcción de enlace especifico CD3 desinmunizada como se define aquí y que comprende un segundo dominio derivado de Ig dirigido a/enlazado con TNF-precursor alfa también puede emplearse en tratamiento o prevención de desordenes inflamatorios . Construcciones CD3 como se proporcionan aquí y comprenden un segundo dominio deriva de Ig dirigido contra/que liga con/interactúa con EpCAM, CD19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina) , MUC2 , MUC3 , MUC4 , MUC5AC, MUC5B, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, CD44v6, Wue-1, Antígeno Celular de Plasma (ver WO 01/47953), IgE (ligado a membrana) , Sulfato Protogliocan Condritina de Melanoma (MCSP) , STEAP, mesotelina, Antígeno de célula madre de próstata (PSCA) , sTn (Antígeno Tn sialilado) , FAP (Antígeno de activación de fibroblastos) (FAP=fibroblast activation antigen) , EGFRvIII, Iga, lq ß , MT-MMPs, antígeno Cora, EphA2, L6 y CO-29 pueden ser particularmente útiles en la intervención medica de enfermedades tumorales como, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de la piel (melanoma) , canceres del tracto genitourinario, por ejemplo cáncer de ovarios, cáncer endometrial, cáncer de servix, y cáncer de riñon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres de ductos biliares, cáncer esofágico, cáncer de las glándulas salivales y cáncer de glándula tiroides u otras enfermedades tumorales como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas, u ostiosarcomas. La administración de construcciones de enlaces CD3 también se indica para enfermedad residual mínima, de preferencia para tumores sólidos tempranos, tumores sólidos avanzados o tumores sólidos metastáticos . Como también se ilustra en los ejemplos anexos, una construcción de enlace especifica CD3 particularmente preferida de la invención comprende el primer dominio definido anteriormente con propensión reducida para generar epitopos de células T y un segundo dominio derivado de Ig que comprende un sitio de interacción de antígeno con una especificidad para copiar. Una molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM, también denominada antígeno 17-1A, KSA, EGP40, GA733-2, ksl-4 o esa) es una glicoproteína integrada a membrana de 40-kDa de 314 aminoácidos con expresión especifica en ciertos epitelios y en muchos carcinomas de humano (revisado por Balzar, J. Mol. Med. 1999, 77, 699-712) . EpCAM se descubrió y clono subsecuentemente a través de su reconocimiento por el anticuerpo monoclonal murino 17-lA/edrecolomab (Goettlinger, Int J Cáncer. 1986; 38, 47-53 y Simón, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1990; 87, 2755-2759) . EpCAM sirve para adherir las células epiteliales en una forma orientada y altamente ordenada (Litvinov, J Cell Biol. 1997, 139, 1337-1348). Ante transformación maligna de células epiteliales, las células de tumor de crecimiento rápido abandonan el alto orden celular de los epitelios. Consecuentemente, la distribución superficial de EpCAM se vuelve menos restringida y la molécula mejor expuesta a células de tumor y accesible para enlace de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o derivados de anticuerpo en la superficie de las células de tumor. Debido a su origen de células epiteliales, las células de tumor de la mayoría de los carcinomas aun expresan EpCAM en su superficie.
In vivo, la expresión de EpCAM se relaciona a proliferación epitelial incrementada y se correlaciona en forma negativa con diferenciación celular (para una revisión ver Balzar, 1999, J. Mol. Med. 77, 699-712). La expresión de EpCAM esencialmente se ve con todos los principales carcinomas (revisado por Balzar, J Mol Med. 1999, 77, 699-712 o documentado, entre otros, en De Bree, Nucí Med Co mun. 1994, 15, 613-27; Zhang, Clin Cáncer Res. 1998, 4, 295-302). Debido a su amplia expresión, EpCAM se refiere como a un antígeno "pan-carcinoma" . En muchos casos, se observaron células de tumor que expresan EpCAM en un grado muy superior que su epitelio padre o formas menos agresivas de esos cánceres. Por ejemplo, la expresión EpCAM incrementada representa un evento temprano en el desarrollo de cáncer de próstata (Poczatek, J Urol . , 1999, 162, 1462-1644). Además, en la mayoría tanto de adenocarcinomas y escamosos de cervix, una expresión EpCAM fuerte se correlaciona con una proliferación incrementada y la desaparición de marcadores para diferenciación terminal (Litvinov, Am. J. Pathol. 1996, 148, 865-75). En cáncer de pecho, la sobre-exprésion de EpCAM en células de tumor es un pronosticador de supervivencia (Gastl, Lancet . 2000, 356, 1981-1982) . EpCAM es un marcador para la detección de células de tumor diseminadas en pacientes que sufren de carcinoma de células escamosas de la cabeza, cuello y pulmón (Chaubal, Anticancer Res 1999, 19, 2237-2242, Piyathilake, Hum Pathol. 2000, 31, 482-487). Epitelio escamoso normal, como se encuentra en la epidermis, cavidad oral, epiglotis, faringe, laringe y esófago no expresa significativamente EpCAM (Quak, Hybridoma, 1990, 9, 377-387) . EpCAM se ha mostrado que se expresa en la mayoría de NSCLC primario, metastásico y diseminado (células de cáncer pulmonar que no son de células pequeñas (Passlick, Int J Cáncer, 2000, 87, 548-552)), en adenocarcinomas gástricos y de unión gastro-esofágico (Martin, J Clin Pathol 1999, 52, 701-4) y en líneas celulares derivadas de carcinomas colorectal, carcinomas pancreáticos y de pecho (Szala, Proc Nati Acad Sci U S A 1990, 87, 3542-6, Packeisen, Hybridoma, 1999, 18, 37-40) . En una modalidad más preferida, la construcción de enlace específica de CD3 de la invención que comprende un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/enlace con EpCAM, comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 y 325; (b) una secuencia de amino ácidos codificada o una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 y 324; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado de código genético a una secuencia nucleótido de (b) . De acuerdo con esto, la presente invención proporciona, en una modalidad particularmente preferida para construcciones CD3 específicas que comprende una parte de enlace/interacción CD3 ("anti-CD3") que tiene propensión reducida a generar epítopos de células T y una parte de cadena sencilla adicional (un dominio derivado de Ig) que interactúa específicamente con/liga con EpCAM ("anti-EpCAM") . Las siguientes tablas 1A, IB, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A y 5B se refieren a configuraciones preferidas de estas construcciones de enlace CD3 y EpCAM. EpCAM 3-1, EpCAM 3-5, EpCAM 4-1, EpCAM 4-7 y EpCAM 5-10 se relacionan a anticuerpos de cadena sencilla específicos contra EpCAM aislado por exhibición fago en W099/25818. Cada construcción de proteína en las Tablas 1A, 2A, 3A, 4A y 5A comprende 7 distintos módulos de proteína, denotados A-G. Los módulos de proteína A-G se enlazan directa y covalentemente entre sí en una sola cadena polipéptido contigua por enlaces péptido en el orden A-B-C-D-E-F-G, con módulo de proteína A en el extremo N y módulo de proteína G en el extremo C. Módulos de proteína A, C, E y G denotan dominios variables de anticuerpo que ya pueden ser dominios VH o VL de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 o EpCAM humano. Los módulos B, D y F son enlazadores que conectan los dominios VH y VL. Si el módulo de proteína A es un dominio de anticuerpo VH, entonces el módulo de proteína C es un dominio de proteína VL y viceversa. Si el módulo de proteína E es un dominio de anticuerpo VH, entonces el módulo de proteína G es un dominio de proteína VL, y viceversa. Dominios VH des-inmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 74 o 76. Dominios de anticuerpos VL des- inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 78, 80 o 82. El dominio de proteína VH de anticuerpo EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humano es como se establece en SEQ ID NO. : 137, 141, 145, 149 y 133, respectivamente. El dominio de proteína VL del anticuerpo EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 139, 143, 147, 151 y 135, respectivamente. Pares de dominios variables de anticuerpo denotados por los pares de módulo de proteína A/C y E/G se unen por módulos de proteína de enlace adicionales, en donde el módulo de proteína B sirve para enlazar directamente el par de módulo A/C y el módulo de proteína F sirve para enlazar directamente el par de módulo E/G. Cuando cualquiera del par de módulo A/C o E/G es un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH des-inmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de proteína B o F, respectivamente tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 3. Cuando ya sea el par de módulo A/C o E/G es un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno EpCAM, el módulo de proteína B o F, respectivamente, tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 168. El módulo D conecta los grupos de módulos ABC y EFG. La combinación de módulo de proteína A-B-C y la combinación de módulos de proteína E-F-G cada uno constituyen respectivamente un fragmento scFv de un anticuerpo que tiene especificidad para cualquiera del antígeno CD3 humano o para el antígeno EpCAM. Si los módulos A y C muestran la secuencia de enlace CD3 , los grupos respectivos de módulos de proteína A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de proteína D, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO. : 176. Por otra parte, si los módulos A y O muestran la secuencia de enlace EpCAM, los grupos respectivos de módulos de proteína A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de proteína D, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO.: 174. De esta manera, una serina adicional puede insertarse después de la cadena VL para propósitos de clonación. Sin embargo, la persona con destreza en la especialidad también puede utilizar el enlazador como se ilustra en SEQ ID NO.: 174 a fin de enlazar un dominio VL con el dominio V subsecuente en lugar de SEQ ID NO.: 176. El módulo de proteína D sirve para conectar el extremo C terminal del módulo de proteína C con el extremo N-terminal del módulo de proteína E . Cada construcción de ácido nucleico en las Tablas IB, 2B, 3B, 4B y 5B comprende 7 módulos de ácido nucleico distintos, denotados A-G. Los módulos de ácido nucleico A-G están enlazados directa y covalentemente entre sí en una cadena nucleótido contigua sencilla por enlaces fosfato glicósido en el orden A-B-C-D-E-F-G, con módulo de ácido nucleico A en el extremo 5 ' y módulo de ácido nucleico G en el extremo 3 ' de una construcción de ácido nucleico respectiva. Módulos de ácido nucleico A, C, E y G denotan regiones de codificación para dominios variables de anticuerpo que ya pueden ser dominios de anticuerpo VH o VL que tienen especificidad para el antígeno CD3 o EpCAM humano. Si el módulo de ácido nucleico A codifica un dominio de anticuerpo VH, entonces, el módulo de ácido nucleico C codifica un dominio de proteína VL, y viceversa. Si el módulo de ácido nucleico E codifica un dominio de anticuerpo VH, entonces el módulo de ácido nucleico G codifica un dominio de proteína VL, y viceversa. Las moléculas de ácido nucleico que codifican dominios de anticuerpos VH des-inmunizados tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs . : 73 o 75. Moléculas de ácido nucleico que codifican dominios de anticuerpo VL des-inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias establecidas en SEQ ID NOs.: 77, 79 o 81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VH del anticuerpo EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humano es como se establece en SEQ ID NO. : 136, 140, 144, 148 y 132 respectivamente. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VL del anticuerpo EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 138, 142, 146, 150 y 134, respectivamente. Pares de ácidos nucleicos que codifican dominios variables de anticuerpo denotados por los pares de módulo de ácido nucleico A/C y E/G se unen por módulos de ácido nucleico de enlace adicionales, en donde el módulo de ácido nucleico B sirve para enlazar directamente el par de módulos A/C y el módulo de ácido nucleico F sirve para enlazar directamente el par de módulo E/G. Cuando cualquier par de módulo A/C o E/G denota ácido nucleico que codifica un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH des-inmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente tiene la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO. : 202. Cuando cualquiera del par de módulo A/C o E/G denota ácido nucleico que codifica un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno EpCAM humano, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente tiene la secuencia de nucleótido como se establece en SEQ ID NO.: 201. La combinación de módulos de ácido nucleico A- B-C y la combinación de módulos de ácido nucleico E-F-G cada uno respectivamente constituyen un fragmento scFv de un anticuerpo que tiene especificidad ya sea para el antígeno CD3 humano o para el antígeno EpCAM. Si los módulos A y C comprenden secuencias de enlace CD3 , los grupos respectivos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de ácido nucleico D, que tiene la secuencia de nucleótidos como sé establece en SEQ ID NO.: 175. Si los módulos A y C comprenden secuencias de enlace EpCAM, los grupos respectivos de los módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de ácido nucleico D, que tiene la secuencia de nucleótido como se establece en SEQ ID NO. : 173. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el codón adicional que codifica una serina (en SEQ ID NO.:175) puede insertarse para propósitos de clonación. La persona con destreza puede enlazar la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena VL directamente con el dominio V subsecuente con el enlazador como se ilustra en SEQ ID NO.: 173 sin que el codón adicional que codifica serina en el extremo 5 ' del enlazador. El módulo de ácido nucleico D sirve para conectar el extremo 3 ' del módulo de ácido nucleico C con el extremo 5 ' del módulo de ácido nucleico E . Tabla 1A Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 3-1 de cadena sencilla: secuencia de amino ácidos .
Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B C D E F G 1 80 3 74 176 137 168 139 2 74 3 80 176 137 168 139 3 80 3 74 176 139 168 137 4 74 3 80 176 139 168 137 139 168 137 174 74 3 80 6 137 168 139 174 74 3 80 7 139 168 137 174 80 3 74 8 137 168 139 174 80 3 74 9 80 3 76 176 137 168 139 76 3 80 176 137 168 139 11 80 3 76 176 139 168 137 12 76 80 176 L39 168 137 13 139 168 137 174 76 3 80 14 137 168 139 174 76 3 80 15 139 168 137 174 80 3 76 16 137 168 139 174 80 3 76 Tabla 1A (continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad Dominio (N -> C) 1 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(3-l) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3-l) HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(3-l) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3-l) HLLH 5 EPCAM (3-1) CD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM (3-1 ) XCD3 (VH5/VL2 ) HLHL 7 EPCAM (3-1 )xCD3 (VL2/ VH5) LHLH 8 EPCAM (3 -1 ) CD3 (VL2/ VH5 ) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(3-l) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3-l) HLHL 11 CD3 (VL2/VH7)xEPCAM(3-l) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3-l) HLLH 13 EPCAM (3-1) CD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM (3-1) XCD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM (3-1) xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 EPCAM (3-1) XCD3 (VL2/ VH7) HLLH Tabla IB Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 3-1 de cadena sencilla: secuencia de nucleótidos .
Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B D E 1 79 202 73 175 136 201 138 2 73 202 79 175 136 201 138 3 79 202 73 175 138 201 136 4 73 202 79 175 138 201 136 138 201 136 173 73 202 79 6 136 201 138 173 73 202 79 7 138 201 136 173 79 202 73 8 136 201 138 173 79 202 73 9 79 202 75 175 136 201 138 75 202 79 175 136 201 138 11 79 202 75 175 138 201 136 12 75 202 79 175 138 201 136 13 138 201 136 173 75 202 79 14 136 201 138 173 75 202 79 138 201 136 173 79 202 75 16 136 201 138 173 79 202 75 Tabla IB (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad Dominio (N -> C) 1 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(3-l) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3-l) HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(3-l) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3-l) HLLH 5 EPCAM (3-1) CD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM(3-l)xCD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM(3-l)xCD3 (VL2/ VH5) LHLH EPCAM (3-1) CD3 (VL2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(3-l) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3-l) HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(3-l) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3-l) HLLH 13 EPCAM(3-l)xCD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM(3-l)xCD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM(3~l)xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 EPCAM (3 -1 ) CD3 (VL2/ VH7) HLLH Tabla 2A Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 3-5 de cadena sencilla: secuencia de amino ácidos Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción B D E G 1 80 74 176 141 168 143 2 74 80 176 141 168 143 3 80 74 176 143 168 141 4 74 80 176 143 168 141 5 143 168 141 174 74 80 6 141 168 143 174 74 3 80 7 143 168 141 174 80 3 74 8 141 168 143 174 80 3 74 9 80 3 76 176 141 168 143 76 3 80 176 141 168 143 11 80 3 76 176 143 168 141 12 76 3 80 176 143 168 141 13 143 168 141 174 76 3 80 14 141 168 143 174 76 3 80 143 168 141 174 80 3 76 16 141 168 143 174 80 3 76 Tabla 2A (Continua) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio - > C) 1 CD3 (VL2/VH5)xEPCAM(3-5) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3-5) HLHL 3 CD3 (VL2/VH5)xEPCAM(3-5) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3-5) HLLH 5 EPCAM(3-5)xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM (3-5 )xCD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM(3-5)xCD3 (VL2/VH5) LHLH 8 EPCAM (3-5) XCD3 (VL2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/VH7)xEPCAM(35) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3-5) HLHL 11 CD3 (VL2/VH7)xEPCAM(3-5) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3-5) HLLH 13 EPCAM (3-5) xCD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM(3-5)xCD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM (3-5) XCD3 (VL2/VH7) LHLH 16 EPCAM (3-5) CD3 (VL2/ VH7) HLLH Tabla 2B Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 3-5 de cadena sencilla: secuencia de nucleótidos Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B C D E G 79 202 73 175 140 201 142 2 73 202 79 175 140 201 142 3 79 202 73 175 142 201 140 4 73 202 79 175 142 201 140 142 201 140 173 73 202 79 6 140 201 142 173 73 202 79 7 142 201 140 173 79 202 73 8 140 201 142 173 79 202 73 9 79 202 75 175 140 201 142 75 202 79 175 140 201 142 11 79 202 75 175 142 201 140 12 75 202 79 175 142 201 140 13 142 201 140 173 75 202 79 14 140 201 142 173 75 202 79 142 201 140 173 79 202 75 16 140 201 142 173 79 202 75 Tabla 2B (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 Arreglo de des-inmunizada / Dominio Especificidad (N -> C) CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(3- LHHL 5) CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3- HLHL 5) CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(3- LHLH 5) CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(3- HLLH 5) 5 EPCAM(3-5)xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM(3-5)xCD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM(3-5)xCD3 LHLH (VL2/VH5) EPCAM (3-5) CD3 (VL2/VH5) HLLH CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(3- LHHL 5) 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3- HLHL 5) 11 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(3- LHLH 5) 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(3- HLLH 5) 13 EPCAM(3-5)xCD3 LHHL (VH7/VL2) 14 EPCAM (3-5) CD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM (3-5) XCD3 LHLH (VL2/VH7) 16 EPCAM (3 -5 ) CD3 (VL2/VH7 ) HLLH Tabla 3A Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 4-1 de cadena sencilla: secuencia de amino ácidos Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B C D E G 1 80 74 176 145 168 147 2 74 80 176 145 168 147 3 80 74 176 147 168 145 4 74 80 176 147 168 145 5 147 168 145 174 74 3 80 6 145 168 147 174 74 3 80 7 147 168 145 174 80 3 74 8 145 168 147 174 80 3 74 9 80 3 76 176 145 168 147 76 3 80 176 145 168 147 11 80 3 76 176 147 168 145 12 76 3 80 176 147 168 145 13 147 168 145 174 76 3 80 14 145 168 147 174 76 3 80 147 168 145 174 80 3 76 16 145 168 147 174 80 3 76 Tabla 3A (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 Arreglo de des-inmunizada / Dominio Especificidad (N -> C) 1 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(4- LHHL 1) 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4- HLHL 1) 3 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(4- LHLH 1) 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4- HLLH 1) 5 EPCAM (4-1 )xCD3 LHHL (VH5/VL2) 6 EPCAM (4-1) CD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM(4-l)xCD3 (VL2/ LHLH VH5) 8 EPCAM(4-l)xCD3 (VL2/ HLLH VH5) 9 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4- LHHL 1) 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4- HLHL 1) 11 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4- LHLH 1) 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4- - HLLH 1) 13 EPCAM (4-1) CD3 LHHL (VH7/VL2) 14 EPCAM(4-l)xCD3 (VH7/VL2) HLHL EPCAM (4 - 1 ) CD3 (VL2/ LHLH VH7 ) 16 EPCAM (4-1) xCD3 (VL2/ HLLH VH7) Tabla 3B Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 4-1 de cadena sencilla: secuencia de nucleótidos Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B C D E F G 1 79 202 73 175 144 201 146 2 73 202 79 175 144 201 146 3 79 202 73 175 146 201 144 4 73 202 79 175 146 201 144 146 201 144 173 73 202 79 6 144 201 146 173 73 202 79 7 146 201 144 173 79 202 73 8 144 201 146 173 79 202 73 9 79 . 202 75 175 144 201 146 75 202 79 175 144 201 146 11 79 202 75 175 146 201 144 12 75 202 79 175 146 201 144 13 146 201 144 173 75 202 79 14 144 201 146 173 75 202 79 15 146 201 144 173 79 202 75 16 144 201 146 173 79 202 75 Tabla 3B (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad Dominio (N -> C) 1 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(4-l) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4-l) HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(4-l) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4-l) HLLH 5 EPCAM(4-l)xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM (4-1) CD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM (4-1 )xCD3 (VL2/ VH5) LHLH 8 EPCAM (4-1) xCD3 ( L2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4-l) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4-l) HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4-l) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4-l) HLLH 13 EPCAM (4-1) CD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM (4-1) CD3 (VH7/VL2 ) HLHL 15 EPCAM(4-l)xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 EPCAM (4- 1 ) xCD3 (VL2/ VH7) HLLH Tabla 4 Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 4-7 de cadena sencilla: secuencia de amino ácidos Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción B D 1 80 74 176 149 168 151 2 74 80 176 149 168 151 3 80 74 176 151 168 149 4 74 80 176 151 168 149 5 151 168 149 174 74 80 149 168 151 174 74 80 7 151 168 149 174 80 74 8 149 168 151 174 80 74 9 80 76 176 149 161 151 10 76 80 176 149 168 151 11 80 76 176 151 168 149 12 76 80 176 151 168 149 13 151 168 149 174 76 3 80 14 149 168 151 174 76 3 80 15 151 168 149 174 80 3 76 16 149 168 151 174 80 3 76 Tabla 4A (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio -> C) 1 CD3 ( VL2/ VH5)xEPCAM(4-7) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4-7) HLHL 3 CD3 ( VL2/ VH5)xEPCAM(4-7) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4-7) HLLH 5 EPCAM(4-7)xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM(4-7)xCD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM(4-7)xCD3 (VL2/ VH5) LHLH EPCAM (4-7 ) CD3 (VL2/ VH5 ) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4-7) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4-7) HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4-7) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4-7) HLLH 13 EPCAM (4-7) xCD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM(4-7)xCD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM(4-7)xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 EPCAM (4-7) xCD3 (VL2/ VH7) HLLH Tabla 4B Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 4-7 de cadena sencilla: secuencia de nucleótido Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B D E 1 79 202 73 175 148 201 150 73 202 79 175 148 201 150 79 202 73 175 150 201 148 73 202 79 175 150 201 148 150 201 148 173 73 202 79 6 148 201 150 173 73 202 79 7 150 201 148 173 79 202 73 8 148 201 150 173 79 202 73 9 79 202 75 175 148 201 150 75 202 79 175 148 201 150 11 79 202 75 175 150 201 148 12 75 202 79 175 150 201 148 13 150 201 148 173 75 202 79 14 148 201 150 173 75 202 79 150 201 148 173 79 202 75 16 148 201 150 173 79 202 75 Tabla 4B (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio -> C) 1 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(4-7) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4-7) HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(4-7) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(4-7) HLLH 5 EPCAM(4-7)xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM(4-7)xCD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM(4-7)xCD3 (VL2/ VH5) LHLH 8 EPCAM ( 4 - 7 ) CD3 ( VL2 / VH5 ) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4-7) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4-7) HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7)xEPCAM(4-7) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2)xEPCAM(4-7) HLLH 13 EPCAM (4-7) CD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM (4-7) xCD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM(4-7)xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 EPCAM (4-7) CD3 (VL2/ VH7) HLLH Tabla 5A Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 5-10 de cadena sencilla: secuencia de amino ácido Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B D 80 74 176 133 168 135 2 74 3 80 176 133 168 135 3 80 3 74 176 135 168 133 4 74 3 80 176 135 168 133 135 168 133 174 74 3 80 6 133 168 135 174 74 3 80 7 135 168 133 174 80 3 74 8 133 168 135 174 80 3 74 9 80 3 76 176 133 168 135 76 3 80 176 133 168 135 11 80 3 76 176 135 168 133 12 76 3 80 176 135 168 133 13 135 168 133 174 76 3 80 14 133 168 135 174 76 3 80 135 168 133 174 80 3 76 16 133 168 135 174 80 3 76 Tabla 5A (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio -> C) 1 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(5-10) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(5-10) HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5)xEPCAM(5-10) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2)xEPCAM(5-10) HLLH 5 EPCAM (5-10 )xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM (5-10) xCD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM(5-10)xCD3 (VL2/ VH5) LHLH 8 EPCAM (5-10) CD3 (VL2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM(5-10) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM(5~10) HLHL 11 CD3 (VL2/VH7) xEPCAM(5-10) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (5-10) HLLH 13 EPCAM (5-10 )xCD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM (5-10) XCD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM (5-10 )xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 EPCAM (5-10 ) xCD3 (VL2/ VH7) HLLH Tabla 5B Construcción CD3 anti-humano desinmunizada que comprende regiones variables anti-EpCAM 5-10 de cadena sencilla: secuencia de nucleótido Construcción SEQ ID NO: en porción de construcción A B C D E F G 1 79 202 73 175 132 201 134 2 73 202 79 175 132 201 134 3 79 202 73 175 134 201 132 4 73 202 79 175 134 201 132 134 201 132 173 73 202 79 6 132 201 134 173 73 202 79 7 134 201 132 173 79 202 73 8 132 201 134 173 79 202 73 9 79 202 75 175 132 201 134 75 202 79 175 132 201 134 11 79 202 75 175 134 201 132 12 75 202 79 175 134 201 132 13 134 201 132 173 75 202 79 14 132 201 134 173 75 202 79 134 201 132 173 79 202 75 16 132 201 134 173 79 202 75 Tabla 5B (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio > C) 1 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM(5-10) LHHL 2 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM(5-10) HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM(5-10) LHLH 4 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM(5-10) HLLH 5 EPCAM (5-10 )xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 EPCAM (5-10 )xCD3 (VH5/VL2) HLHL 7 EPCAM (5-10 )xCD3 (VL2/ VH5) LHLH EPCAM (5-10) xCD3 (VL2/ VH5 ) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM(5-10) LHHL 10 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM(5-10) HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM(5-10) LHLH 12 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM(5-10) HLLH 13 EPCAM ( 5-10)xCD3 (VH7/VL2) LHHL 14 EPCAM(5-10) CD3 (VH7/VL2) HLHL 15 EPCAM (5-10 )xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 EPCAM(5-10)xCD3 (VL2/ VH7) HLLH Más preferiblemente, la invención proporciona construcciones de anticuerpos biespecíficas que comprenden un enlace de especificidad a CD3 y EpCAM y que tiene la SEQ ID NO. :30, 31 (construcción 2 de la Tabla 1A y IB), SEQ ID NO.: 48, 49 (construcción 5 de la Tabla 1A, IB), SEQ ID NO.: 64, 65 (construcción 2 de la Tabla 2A, 2B) , SEQ ID NO.: 54, 55 (construcción 5 de la Tabla 2A, 2B) , S?Q ID NO. : 66 , 67 (construcción 2 de la Tabla 3A, 3B) , SEQ ID NO.: 32, 33 (construcción 2 de la Tabla 4A, 4B) , SEQ ID NO.-.34, 35 (construcción 4 de la Tabla 4A, 4B) , SEQ ID NO. : 60, 61 (construcción 5 de la Tabla 4A, 4B) , SEQ ID NO.: 36, 37 (construcción 2 de la Tabla 5A, 5B) , SEQ ID NO.: 38, 39 (construcción 4 de la Tabla 5A, 5B) o SEQ ID NO.: 62, 63 (construcción 5 de la Tabla 5A, 5B) .
De acuerdo con las construcciones que aquí se proporcionan anteriormente, construcciones de enlace CD3 y EpCAM particularmente preferidas de la invención, comprenden al menos el primer dominio anteriormente descrito con propensión reducida a generación de epítopo de célula T y especificidad para CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que es específico para EpCAM, se ilustran en SEQ ID Nos.: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63 , 65 , 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 y 325. Moléculas de ácido nucleico correspondientes que codifican las construcciones de enlace CD3 y EpCAM preferidas como se define aquí, comprenden SEQ ID Nos.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 y 324. De acuerdo con esto, la presente invención también proporciona construcciones de enlace específicas CD3 que comprenden un primer dominio que liga específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida para generar epítopos de célula T y que comprende un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de enlazar a EpCAM, seleccionado del grupo que consiste de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257,.259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 o 325; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 o 324; (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (b) ; (d) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo condiciones de hibridización estrictas. La presente invención también proporciona construcciones de enlace específicas de CD3 que comprenden un primer dominio que liga específicamente a CD3 humano y tienen propensión reducida para generar epítopos de célula T y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de ligar a EpCAM, que comprenden una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) previamente, es decir a una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 o 324 bajo estrictas condiciones de hibridización. El término "hibridización" como se emplea aquí, se refiere a secuencias de ácido nucleico/polinucleótidos que son capaces de hibridizar a los polinucleótidos que codifican las construccións desinmunizadas como aquí se define. Por lo tanto, los polinucleótidos pueden ser útiles como sondas en análisis de técnica Northern o Southern de preparaciones de ARN o ADN, respectivamente o pueden utilizarse como cebadores oligonucleótido en análisis PCR dependiente de su tamaño respectivo. De preferencia, los polinucleótidos de hibridización comprenden cuando menos 10, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos de longitud mientras que un polinucleótido de hibridización de la presente invención a utilizarse como sonda, de preferencia comprende al menos 100, más preferiblemente al menos 200, o en particular al menos 500 nucleótidos de longitud. Es bien conocido en la especialidad como realizar experimentos de hibridización con moléculas de ácido nucleico, es decir la persona con destreza en la técnica sabe que condiciones de hibridización tiene que utilizar de acuerdo con la presente invención. Estas condiciones de hibridización se refieren en los libros de texto estándar tales como Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. Se prefiere de acuerdo con las presentes invenciones polinucleótidos que son capaces de hibridizar a los 'polinucleótidos de la invención o sus partes, bajo estrictas condiciones de hibridización. "Condiciones estrictas de hibridización" se refieren es decir a una incubación durante la noche a 42 grados C en una solución que comprende formamida al 50%, 5x SSC (NaCl a 750 mM , citrato de sodio a 75 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, dextran sulfato al 10%, y ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado 20 µg/ml, seguido por lavado de los filtros en 0.1 x SSC en aproximadamente 65 grados C. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que hibridizan a los polinucleótidos de la invención a menores condiciones de hibridización. Cambios en la severidad de hibridización y detección de señal se logran primordialmente a través de la manipulación de concentración de formamida (menores porcentajes de formamida resultan en menor severidad) ; condiciones de sal o temperatura. Por ejemplo, condiciones de menor severidad incluyen una incubación durante la noche a 37 grados C en una solución que comprende 6X SSPE (20X SSPE = NaCl 3M; NaH2P04 0.2M; EDTA 0.02M, pH 7.4), SDS 0.5%, formamida al 30%, 100 //g/ml de ADN bloqueado de esperma de salmón; seguido por lavados a 50 grados C con 1 X SSPE, SDS 0.1%. Además, para lograr aún menor severidad, lavados realizados siguiendo estricta hibridización, pueden realizarse a superiores concentraciones de sal (por ejemplo 5X SSC) . Vale la pena notar que variaciones en las condiciones anteriores pueden lograrse a través de la inclusión y/o substitución de reactivos de bloqueo alternos utilizados para suprimir fondo en los experimentos de hibridización. Reactivos de bloqueo típicos incluyen reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y formulaciones de propiedad comercialmente disponibles. La inclusión de reactivos de bloqueo específicos puede requerir modificación de las condiciones de hibridización anteriormente descritas, debido a problemas con la compatibilidad. Las moléculas de ácido nucleico descritas pueden ser, por ejemplo ADN, cADN, ARN o ADN o ARN producido sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérica producida en forma recombinante que comprende cualquiera de sus polinucleótidos. ya sea solos o en combinación. Las construcciones de enlace CD3 y EpCAM desinmunizadas que se proporcionan en esta invención son particularmente útiles en entornos médicos, por ejemplo en la prevención, tratamiento y/o mejora de enfermedades tumorales, en particular cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de la piel (melanoma) , cánceres del tracto genitourinario, por ejemplo cáncer de ovarios, cáncer del endometrio, cáncer de cervix y cáncer de riñon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres del ducto biliar, cáncer de esófago, cáncer de las glándulas salivales y cáncer de la glándula tiroide. En particular, las construcciones des-inmunizadas que ligan CD3 y EpCAM pueden emplearse para el tratamiento de cáncer epitelial, de preferencia adenocarcinomas o enfermedad residual mínima, más preferiblemente tumor sólido temprano, tumor sólido avanzado o tumor sólido metastásico. En una modalidad más particularmente preferida de la construcción de enlace específica de CD3 aquí descrita, la construcción comprende un segundo dominio derivado de Ig que comprende un sitio de interacción de antígeno con una especificidad por CCR5. El receptor de quimiocina CCR5 es un miembro de una gran familia de siete receptores de dominio de transmembrana acoplados a proteína G que ligan las quimiocinas pro-inflamatorias RANTES, MlPl-a, MIP1-/J y MCP-2. Quimiocinas actúan en concierto con moléculas de adhesión para inducir la extravasación de leucocitos y para dirigir su migración a sitios de lesión de tejido. CCR5 se expresa en una minoría de células T y monocitos y además es el co-receptor principal para cepas HIV-1 M-tróficas que predominan temprano en el curso de una infección HIV. El virus de inmunodeficiencia humano (HIV) no puede entrar a células humanas a menos de que primero ligue a dos moléculas clave en la superficie celular, CD4 y un co-receptor. El co-receptor que inicialmente se reconoce es CCR5, posteriormente en el ciclo de vida del virus otro receptor de quimiocina CXCR4 se vuelve el co-receptor para HIV-1 (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996) ) . Las cepas HIV-1 que provocan la mayorías de las transmisiones de los virus por contacto sexual se denominan virus M-trópicos. Estas cepas HIV-1 (también conocidas como virus primarios que no inducen sincitia (NSI - non-syncytia inducing) ) pueden replicar en células T CD4+ primarias y macrófagos y utilizan el receptor de quimiocina CCR5 (y menos a menudo CCR3) como su co-receptor. Los virus T-trópicos (en ocasiones denominados virus primarios que inducen sincitia (SI - syncytia inducing) ) también pueden replicar en células T CD4+ primarias pero además pueden infectar líneas de célula T CD4+ establecidas in vitro, que lo hacen mediante el receptor de quimiocina CXCR4 (fusina) . Muchas de las cepas T-trópicas pueden utilizarse CCR5 además de CXCR4, y algunos pueden entrar a macrófagos por CCR5 , al menos bajo ciertas condiciones in vitro (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)). Si otros co-receptores contribuyen a patogénesis HIV-1 no está resuelto, pero la existencia de otro co-receptor para algunas cepas T-trópicas puede ser inferida de estudios in vitro. Debido que cepas HIV-1 M trópicas están implicadas en aproximadamente 90% de las transmisiones sexuales de HIV, CCR5 es el co-receptor predominante para el virus en pacientes; transmisión (o establecimiento sistémico) de cepas que utilizan CXCR4 (T-trópicas) es rara (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Sa son, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang, Nature Med. 2, 1240 (1996)) . Sin embargo, una vez que los virus SI evolucionan in vivo (o si se transmiten) , son especialmente virulentos y provocan avance de la enfermedad más rápido (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Schuitemaker, J. Virol. 66 , 1354 (1992); Connor, J. Virol. 67, 1772 (1993); Richman, J. Infect . Dis. 169, 968 (1994); R. I. Connor et al., J. Exp. Med. 185, 621 (1997); Trkola, Nature 384, 184 (1996)). Lo números e identidad de moléculas co-receptoras en las células diana, y la capacidad de las cepas HIV-1 a entrar probablemente a células mediante los co-receptores diferentes, parecen ser determinantes críticos del avance de la enfermedad. Estos factores son influencias principales en ambos aspectos dependientes de anfitrión o huésped y de virus de la infección HIV-1. Por ejemplo, un defecto homozigoto (delta 32) en CCR5 se correlaciona fuertemente con la resistencia a infección a HIV-1 in vivo e in vitro. Individuos que son heterozigotos por un alelo CCR5 defectuoso son los mejor débilmente protegidos contra infección y solo tienen un avance de la enfermedad modestamente frenado (Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang y colaboradores, Nature Med. 2, 1240 (1996) ) . Sin embargo, otros factores pueden influenciar el nivel de expresión de CCR5 en células T CD4+ más activadas, y de esta manera afectan la eficiencia de la infección HIV-1 in vitro (Trkola, Nature 384, 184 (1996); Bleul, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 94, 1925 (1997)). Para esclerosis múltiple se mostró que CCR5 y CXCR3 se expresan de manera predominante en células T que infiltran lesiones del cerebro desmielinadas o desmielinizante, así como en la sangre periférica de pacientes afectados . La eliminación de las células T bloqueará el brazo de células T de esta enfermedad autoinmune . Una alta expresión de CCR3 y CCR5 también se observa en células T y células B de nodos linfáticos derivados de pacientes con enfermedad de Hodgkin. Diabetes tipo I se considera como una enfermedad autoinmune mediada por células T. La expresión del receptor CCR5 en el páncreas se asocia con el avance de diabetes tipo I en modelos de animal relevantes (Cameron (2000) J. Immunol . 165, 1102-1110). En particular, la expresión CCR5 estaba asociada con el desarrollo de insulinitis y diabetes del tipo I espontánea . Varios anticuerpos que ligan específicamente a CCR5 (humano) se conocen en la técnica y comprenden, MC-1 (Mack (1998) J. Exp. Med. 187, 1215-1224 or MC-5 (Blanpain (2002) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 56:52-64, Kraft (2001) J Biol Chem. 14 ,-276:34408-18) . Los anticuerpos CCR-5, en particular MC-1 y MC-5 pueden servir como una fuente para un segundo dominio derivado de Ig de la construcción específica de CD3 de la invención. De acuerdo con esto, en una modalidad preferida, la invención se refiere a una construcción bi-específica que comprende al menos dos dominios, en donde el primer dominio proporciona la especificidad a CD3 humano y tiene propensión reducida para genera epítopos de célula T y con lo que el segundo dominio derivado de Ig se deriva de un anticuerpo específico para CCR5 (humano) . Más preferiblemente, dicha construcción es un scFV de cadena sencilla como se define aquí . MC-1 se mostró que liga específicamente a la primer parte del segundo bucle extracelular de CCR5 humano y no reacciona en forma cruzada con CCR5 derivado de los macacos rhesus como se ilustra en los ejemplos anexos. Por lo tanto, se prefiere que la construcción específica de CD3 de esta invención comprenda, por ejemplo los dominios VL y VH de un anticuerpo (es decir un segundo dominio derivado de Ig) específico para CCR5, de preferencia el CCR5 humano y los dominios VH y VL de un anticuerpo específico para el antígeno CD3. Este anticuerpo específico para CCR5 humano es el anticuerpo CCR5 anti-humano murino MC-1, descrito inter alia, in Mack (1998), J. Exp. Med. 187, 1215-1224 y en los ejemplos anexos. Sin embargo, se prevé que otros anticuerpos anti-CCR5, como MC-5 (como se caracteriza en los ejemplos anexos y describe en Blanpain (2002) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 56:52-64 and Kraft (2001) J Biol Chem. 14 ; 276 : 34408-18 pueda emplearse en el contexto de esta invención. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, se proporcionan construcciones de enlace específico a CD3 , que comprenden un dominio desinmunizado dirigido contra/que liga con/interactúa con CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que liga específicamente con/interacción con CCR5. Estas construcciones se ilustran en las Tablas 6A y 6B . Los módulos A-G en las Tablas 6A y 6B pueden definirse como se mencionó anteriormente para las Tablas 1-5. Dominios VH des-inmunizados de anticuerpos tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 74 o 76.
Dominios de anticuerpos VL des-inmunizados tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 78, 80 o 82. El dominio de proteína VH del anticuerpo CCR5 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 129. El dominio de proteína VL del anticuerpo CCR5 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 131. Cuando cualquiera del par de módulos A/C o E/G es un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH des-inmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de proteína B o F, respectivamente tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 3. Cuando cualquiera del par de módulo A/C o E/G es un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno EpCAM, el módulo de proteína B o F, respectivamente tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 168. Los grupos respectivos de módulos de proteína A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de proteína D, que tiene la secuencia como se estableció en SEQ ID NO. : 174. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, puede introducirse una serina adicional para propósitos de clonación (enlazador como se ilustra en SEQ ID NO.:176) entre el dominio VL y subsecuente V. Moléculas de ácido nucleico codifican dominios de anticuerpos VH des-inmunizados que tienen especificidad para antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 73 o 75. Moléculas de ácido nucleico que codifican dominios de anticuerpos VL des-inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs. : 77, 79 o 81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VH del anticuerpo CCR5 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 128. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VL del anticuerpo CCR5 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 130. Cuando cualquier par de módulo A/C o E/G denota ácido nucleico que codifica un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH des-inmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se establece en SEQ ID NO.: 202. Cuando cualquiera del par de módulo A/C o E/G denota ácido nucleico que codifica un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CCR5, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente tiene una secuencia de ácidos nucleicos como se establece en SEQ ID NO.: 201. Los grupos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de proteína D, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO.: 173. Un enlazador alterno SEQ ID NO.: 175 puede también ser empleado para conjugar el dominio VL con un dominio subsecuente V (incluyendo un codón adicional que codifica un residuo serina para propósitos de clonación) . Tabla 6A Construcciones CD3 anti-humano des-inmunizadas que comprenden regiones variables anti~CCR5 de cadena sencilla: secuencia de amino ácido SEQ ID NO: en porción de construcción Construcción A B C D E F G 1 80 3 74 174 129 168 131 2 74 3 80 174 129 168 131 80 3 74 174 131 168 129 4 74 3 80 174 131 168 129 5 131 168 129 174 74 3 80 6 129 168 131 174 74 3 80 7 131 168 129 174 80 3 74 8 129 168 131 174 80 3 74 9 80 3 76 174 129 168 131 10 76 3 80 174 129 168 131 11 80 3 76 174 131 168 129 12 76 3 80 174 131 168 129 13 131 168 129 174 76 3 80 14 129 168 131 174 76 3 80 15 131 168 129 174 80 3 76 16 129 168 131 174 80 76 Tabla 6 (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio C) 1 CD3 (VL2/ VH5) xCCR5 LHHL 2 CD3 (VH5/VL2) xCCR5 HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5) xCCR5 LHLH 4 CD3 (VH5A 2) xCCR5 HLLH 5 CCR5xCD3 (VH5?/L2) LHHL CCR5xCD3(VH5?/L2) HLHL 7 CCR5xCD3 (VL2/ VH5) LHLH 8 CCR5xCD3( VL2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7) xCCR5 LHHL 10 CD3 (VH7 VL2) XCCR5 HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7) xCCR5 LHLH 12 CD3 (VH7 VL2) xCCR5 HLLH 13 CCR5xCD3 (VH7?/L2) LHHL 14 CCR5xCD3(VH7/VL2) HLHL 15 CCR5xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 CCR5xCD3(VL2/ VH7) HLLH Tabla 6B Construcción CD3 anti-humano des-inmunizados que comprenden regiones variables anti-CCR5 de cadena sencilla : secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO : en porción de construcción Construcción A B D E 1 79 202 73 173 128 201 130 2 73 202 79 173 128 201 130 3 79 202 73 173 130 201 128 4 73 202 79 173 130 201 128 130 201 128 173 73 202 79 6 128 201 130 173 73 202 79 7 130 201 128 173 79 202 73 8 128 201 130 • 173 79 202 73 9 79 202 75 173 128 201 130 75 202 79 173 128 201 130 11 79 202 75 173 130 201 128 12 75 202 79 173 130 201 128 13 130 201 128 173 75 202 79 14 128 201 130 173 75 202 79 15 130 201 128 173 79 202 75 16 128 201 130 173 79 202 75 Tabla 6A (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des - Arreglo de inmunizada / Especif icidad (N Dominio - > C) 1 CD3 (VL2/ VH5) xCCR5 LHHL 2 CD3 (VH5/VL2) xCCR5 HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5) xCCR5 LHLH 4 CD3 (VH5?/L2) xCCR5 HLLH 5 CCR5xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 CCR5xCD3(VH5?/L2) HLHL 7 CCR5xCD3 (VL2/ VH5) LHLH CCR5xCD3(VL2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7) xCCR5 LHHL 10 CD3 (VH7? L2) xCCR5 HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7) xCCR5 LHLH 12 CD3 (VH7/VL2) xCCR5 HLLH 13 CCR5xCD3 (VH7? L2) LHHL 14 CCR5xCD3(VH7/VL2) HLHL 15 CCR5xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 CCR5xCD3 (VL2/ VH7) HLLH De preferencia, las construcciones comprenden una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 206, 208, 210, 212, 214 o 216; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por un ácido nucleico como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. : 205, 207, 209, 211, 213 o 215; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de (b) ; (d) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra de complementariedad de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo condiciones de hibridización estrictas. Las construcciones de enlace CCR5 y CD3 SEQ ID NO. : 206, 208, 210 representan la construcción 5 y SEQ ID NO.: 212, 214 y 216 representan la construcción 13 de la Tabla 6 y tienen las tres regiones VL diferentes (VL1 (SEQ ID NO.: 78), VL2 (SEQ ID NO.: 80), o VL3 (SEQ ID NO. : 82) . La presente invención también proporciona construcciones de enlace específicas CD3 que comprenden un primer dominio que liga específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida para generar epítopos de célula T y que comprende un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de ligar a CCR5, que comprende una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) anteriormente, es decir a una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. : 205, 207, 209, 211, 213 o 215 bajo estrictas condiciones de hibridización. Los términos "hibridización" y "condiciones estrictas" se han descrito previamente. Las definiciones y modalidades correspondientes aplican aquí mutatis mutandis .
Las construcciones de enlace CD3 y CCR5 desinmunizadas que se proporcionan aquí son particularmente útiles en la intervención médica de enfermedad viral, en particular infecciones HIV y SIDA, o de enfermedades autoinmunes y/o . enfermedades inflamatorias, como artritis reumatoide. En otra modalidad, la presente invención proporciona construcciones de enlace específicas CD3 como se definió previamente, en donde el segundo dominio derivado de Ig de la construcción de la invención comprende un sitio de interacción-antígeno con la especificidad para CD19. CD19 ha demostrado ser una diana médica muy útil. CD19 se expresa en todo el linaje de célula B desde la célula pro B a la célula madura B, no se muda, se expresa uniformemente en todas las células de linfoma, y está ausente de células madre (Haagen, Clin Exp Immunol 90 (1992), 368-75; Uckun, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) , 8603-7) . La terapia en combinación que emplea tanto un antígeno dirigido contra CD19 como un anticuerpo inmunoregulatorio adicional, se ha descrito para el tratamiento de malignidades de célula B (WO 02/04021, US2002006404, US2002028178) y enfermedades autoinmunes (WO 02/22212, US2002058029) . WO 00/67795 describe el uso i. a. de anticuerpos dirigidos contra CD19 para el tratamiento de formas indolentes y agresivas de linfomas de células B, así como formas agudas y crónicas de leucemias linfáticas. WO 02/80987 describe el uso terapéutico de inmunotoxinas con base en anticuerpos contra el antígeno CD19 para el tratamiento de enfermedades tales como linfoma no-Hodgkin de célula B, linfoma Hodgkin o leucemias de células B (por ejemplo leucemia linfática aguada de célula B (B-ALL) , (por ejemplo linfoma de célula pilosa) leucemia linfática aguda precursora de célula B (pre-B-ALL) , leucemia linfática crónica de célula B (B-CLL) ) . En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, se proporcionan construcciones de enlace específicas a CD3 , que comprenden un dominio desinmunizado dirigido contra/que enlaza a/interactúa con CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que liga específicamente con/interactúa con CD19. Estas construcciones se ilustran en las Tablas 7A y 7B . Los módulos A-G en Tablas 7A y 7B pueden definirse como se mencionó anteriormente para las Tablas 1-5. Dominios de anticuerpos VH des-inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 74 o 76. Dominios de anticuerpos VL des-inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 78, 80 o 82. El dominio de proteína VH del anticuerpo CD19 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 114. El dominio de proteína VL del anticuerpo CCR5 humano es como se estable en SEQ ID NO. : 116. Cuando cualquiera del par de módulo A/C o E/G es un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH des-inmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de proteína B o F, respectivamente tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO. : 3. Cuando cualquier par de módulo A/C o E/G es un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD19, el módulo de proteína B o F, respectivamente, tiene la secuencia de amino' ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 168. Los grupos respectivos de módulos de proteínas A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de proteína D, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO. : 174. Sin embargo, como se mencionó anteriormente pueden introducirse una serina adicional para propósitos de clonación (enlazador como se ilustra en SEQ ID NO. : 176) entre el dominio VL y subsecuente V. Moléculas de ácido nucleico que codifican dominios de anticuerpo VH des-inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece SEQ ID NOs.: 73 o 75. Moléculas de ácido nucleico que codifican dominios de anticuerpos VL des-inmunizados que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 77, 79 o 81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VH del anticuerpo CD19 humano es como establece en la secuencia SEQ ID NO.: 113. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VL del anticuerpo CCR5 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 115. Cuando cualquier par de módulos A/C o E/G denota ácido nucleico que codifica un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH des-inmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, módulo de ácido nucleico B o F respectivamente, tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 202. Cuando cualquier par de módulos A/C O E/G denota un ácido nucleico que codifica un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD19, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se establece en SEQ ID NO.: 201. Los grupos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de proteína D, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO.: 173.
Un enlazador alterno SEQ ID NO.: 175 también puede emplearse para conjugar el dominio VL con un dominio V subsecuente (incluyendo un codón adicional que codifica un residuo serina para propósitos de clonación) . Tabla 7A Construcciones de CD3 anti-humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-CD19 de cadena sencilla: secuencia de amino ácido SEQ ID NO: en porción de construcción Construcción A B C D E F G 1 80 3 74 174 114 168 116 2 74 3 80 174 114 168 116 3 80 3 74 174 116 168 114 4 74 3 80 174 116 168 114 116 168 114 174 74 3 80 6 114 168 116 174 74 3 80 7 116 168 114 174 80 3 74 8 114 168 116 174 80 3 74 9 80 3 76 174 114 168 116 76 3 80 174 114 168 116 11 80 3 76 174 116 168 114 12 76 3 80 174 116 168 114 13 116 168 114 174 76 3 80 14 116 174 76 3 80 15 114 174 80 3 76 16 114 168 116 174 80 3 76 Tabla 7A (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio > C) 1 CD3(VL2/VH5)xCD19 LHHL 2 CD3(VH5/VL2)xCD19 HLHL 3 CD3(VL2/VH5)xCD19 LHLH 4 CD3(VH5?/L2)xCD19 HLLH 5 CD19xCD3 (VH5?L2) LHHL 6 CD19xCD3(VH5/VL2) HLHL 7 CD19xCD3(VL2/VH5) LHLH 8 CD19xCD3(VL2/VH5) HLLH 9 CD3(VL2/VH7)xCD19 LHHL 10 CD3(VH7/VL2)xCD19 HLHL 11 CD3(VL2/VH7)xCD19 LHLH 12 CD3 (VH7A L2) xCD19 HLLH 13 CD19xCD3 (VH7?/L2) LHHL 14 CD19xCD3(VH7A L2) HLHL 15 CD19xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 CD19xCD3(VL2/ VH7) HLLH Tabla 7B Construcciones CD3 anti-humano des inmunizadas que comprenden regiones variables anti-CD19 de cadena sencilla : secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO : en porción de construcción Construcción A B D 1 79 202 73 173 113 201 115 2 73 202 79 173 113 201 115 3 79 202 73 173 115 201 113 4 73 202 79 173 115 201 113 115 201 113 173 73 202 79 6 113 201 115 173 73 202 79 7 115 201 113 173 79 202 73 8 113 201 115 173 79 202 73 9 79 202 75 173 113 201 115 LO 75 202 79 173 113 201 115 11 79 202 75 173 115 201 11c 12 75 202 79 173 115 201 112 13 115 201 113 173 75 202 79 14 113 201 115 173 75 202 79 115 201 113 173 79 202 75 16 113 201 115 173 79 202 75 Tabla 7B (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especiticidad (N Dominio •> C) 1 CD3(VL2/VH5)xCD19 LHHL 2 CD3(VH5?/L2)xCD19 HLHL 3 CD3(VL2/VH5)xCD19 LHLH 4 CD3(VH5/VL2)xCD19 HLLH 5 CD19xCD3(VH5?L2) LHHL 6 CD19xCD3(VH5?/L2) HLHL 7 CD19xCD3(VL2/VH5) LHLH 8 CD19xCD3(VL2/VH5) HLLH 9 CD3(VL2/VH7)xCD19 LHHL 10 CD3 (VH7? L2) xCD19 HLHL 11 CD3 (VL2/VH7) xCD19 LHLH 12 CD3 (VH7/VL2) xCD19 HLLH 13 CD19xCD3 (VH7?/L2) LHHL 14 CD19xCD3(VH7/VL2) HLHL 15 CD19xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 CD19xCD3(VL2/ VH7) HLLH En una modalidad más preferida, la presente invención proporciona una construcción de enlace específica de CD3 des-inmunizada que comprende un dominio de enlace CD3 como se define anteriormente y un segundo dominio derivado de Ig que liga específicamente con/interactúa con CD19, de preferencia CD19 humano, en donde la construcción de enlace específica de CD3 comprencia una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407 o 409; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 189, 191, 193, 195, 197,199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 o 408; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (b) ; (d) y una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo estrictas condiciones de hibridización. Construcciones de enlace CD19 y CD3 preferidas de acuerdo con la invención son SEQ ID NO. :190, 192, 194 que representan la construcción 5 y SEQ ID NO.:196, 198 y 200 que representan la construcción 13 de la Tabla 7 y que tienen las tres regiones VL diferentes (VL1 (SEQ ID NO.: 78), VL2 (SEQ ID NO. : 80) , o VL3 (SEQ ID NO. : 82) ) . La presente invención también permite construcciones de enlace específicas CD3 que comprenden un primer dominio que liga específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida para generar epítopos de célula T y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de ligar a CD19, que comprende una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) previamente, es decir a una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NOs.: 189, 191, 193, 195, 197,199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 o 408, bajo condiciones de hibridización estricta. Los términos "hibridización" y "condiciones estrictas" se han descrito previamente. Las definiciones y modalidades correspondientes aplicana quí mutatis mutandis. Las construcciones de enlace CD3 y CD19 desinmunizadas previamente descritas, son particularmente útiles en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un desorden inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto-contra-anfitrión, enfermedades de anfitrión-contra-injerto o malignidades de célula B, en particular linfoma no-Hodgkin de célula B, linfoma Hodgkin o leucemias de células B (por ejemplo leucemia linfática aguda de célula B (B-ALL) , (por ejemplo linfoma de célula filosa) leucemia linfática aguda de precursor de célula B (pre-B-ALL) , leucemia linfática crónica de célula B (B-CLL) ) . En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a una construcción de enlace específica de CD3 como se definió anteriormente, que comprende un primer dominio que liga específicamente a CD3 humano y que tiene una propensión reducida para generar epítopos de célula T y un segundo dominio, en donde el segundo dominio es derivado Ig y comprende un sitio de interacción de antígeno con una especificidad para CD20. CD20 es una de las proteínas de superficie celular presentes en linfocitos-B . Antígeno CD20 se encuentra en linfocitos B maduros y pre-B malignos incluyendo aquellos en más de 90% de los linfomas no-Hodgkin de célula B NHL) . El antígeno está ausente en células madre hematopoyéticas, linfocitos B activados (células de plasma) y tejido normal. Varios anticuerpos primordialmente de origen murino se han descrito: 1F5 (Press y colaboradores, 1987, Blood 69/2, 584-591), 2B8 / C2B8, 2H7, 1H4 (Liu y colaboradores, 1987, J Immunol 139, 3521-3526; Anderson y colaboradores, 1998, Patente de los E.U.A. No. 5,736,137; Haisma y colaboradores, 1998, Blood 92, 184-190; Shan y colaboradores, 1999, J. Immunol 162, 6589-6595) . CD20 se ha descrito en estrategias inmuno terapéuticas para el tratamiento de malignidades de células de plasma utilizando vacunación con scFv que codifican ADN enlazado a proteína portadora (Treon y colaboradores, 2000, Semin Oncol 27(5), 598) y en tratamiento inmunoterapéutico utilizando anticuerpos CD20 (IDEC-C2B8) se han mostrado eficaces en el tratamiento de linfoma de célula B no-Hodgkin. Anticuerpos CD20 han demostrado eficacia y tolerabilidad en linfoma no-Hodgkin, logrando velocidades de respuesta de 73% y 48% en linfoma no-Hodgkin no tratado, o de recaída/intratable, respectivamente (Montserrat, 2003, Semin Oncol 30(lsuppl2), 34-39). Además, anticuerpos CD20 se han empleado ampliamente para tratar relapso o neoplasmas de célula B de etapa avanzada con una eficacia aproximada de 50%. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, se proporcionan construcciones de enlace específicas CD3 , que comprenden un dominio desinmunizado dirigido contra/que liga a/interactúa con CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que liga específicamente con/interactúa con CD20. Estas construcciones se ilustran en las Tablas 8A y 8B. Los módulos A-G en las Tablas 8A y 8B pueden definirse como se mencionó anteriormente para las Tablas 1-5. Dominios de anticuerpos VH des-inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 74 o 76. Dominios de anticuerpos VL desinmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionarse de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 78, 80 o 82. El dominio de proteína VH del anticuerpo CD20 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 170. El dominio de proteína VL del anticuerpo CD20 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 172. Cuando cualquiera del par de módulos A/C o E/G es un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH des-inmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de proteína B o F, respectivamente tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 3. Cuando cualquiera de par de módulo A/C o E/G es un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD20, el módulo de proteína B o F, respectivamente, tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO.: 168. Los grupos respectivos del módulo de proteína A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de proteína D, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO.: 174. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, una serina adicional puede introducirse para propósitos de clonación (enlazador como se ilustra en SEQ ID NO. :176) entre el dominio VL y subsecuente V. Moléculas de ácido nucleico que codifican dominios de anticuerpos VH des-inmunizados que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionar de las secuencias como se establece en SEQ ID NOs.: 73 o 75. Moléculas de ácido nucleico que codifican dominios de anticuerpos VL des-inmunizados con especificidad para el antígeno CD3 humano, pueden seleccionar de las secuencias establecidas en SEQ ID NOs. : 77, 79 o 81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VH del anticuerpo CD20 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 169. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio de proteína VL del anticuerpo CD20 humano es como se establece en SEQ ID NO.: 171. Cuando cualquiera del par de módulo A/C o E/G denota un ácido nucleico que codifica un par de dominios de proteína VH/VL o VL/VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente tiene la secuencia de amino ácidos como se establece en SEQ ID NO. : 202. Cuando, ya sea el par de módulo A/C o E/G denota un ácido nucleico que codifica un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD20, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se establece en SEQ ID NO.: 201. Los grupos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de ácido nucleico D, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO.: 173. Un enlazador alterno SEQ ID NO.: 175 también puede utilizarse para conjugar el dominio VL con un dominio V subsecuente (incluyendo un codón adicional que codifica un residuo serina para propósitos de clonación) .
Tabla 8A Construcciones CD3 anti-humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-CD20 de cadena sencilla: secuencia de amino ácido SEQ ID NO: en porción de construcción Construcción A B C D E F G 1 80 3 74 174 170 168 172 2 74 3 80 174 170 168 172 3 80 3 74 174 172 168 170 4 74 3 80 174 172 168 170 5 172 168 170 174 74 3 80 170 168 172 174 74 80 7 172 168 170 174 80 74 8 170 168 172 174 80 74 9 80 76 174 170 168 172 76 80 174 170 168 172 11 80 76 174 172 168 170 12 76 80 174 172 168 170 13 172 168 170 174 76 3 80 14 170 168 172 174 76 3 80 15 172 168 170 174 80 3 76 16 170 168 172 174 80 3 76 Tabla 8A (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio -> C) 1 CD3 (VL2/ VH5) xCD20 LHHL 2 CD3 (VH5/VL2) xCD20 HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5) xCD20 LHLH 4 CD3 (VH5?/L2) xCD20 HLLH 5 CD20xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 CD20xCD3(VH5/VL2) HLHL 7 CD20xCD3 (VL2/ VH5) LHLH 8 CD20xCD3(VL2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/ VH7) xCD20 LHHL 10 CD3 (VH7/VL2) xCD20 HLHL 11 CD3 (VL2/ VH7) xCD20 LHLH 12 CD3 (VH7/VL2) xCD20 HLLH 13 CD20xCD3 (VH7/VL2) LHHL 14 CD20xCD3(VH7/VL2) HLHL 15 CD20xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 CD20xCD3(VL2/ VH7) HLLH Tabla 8B Construcciones CD3 anti-humano des inmunizadas que comprenden regiones variables anti-CD19 de cadena sencilla : secuencia de nucleótido SEQ ID NO : en porción de construcción Construcción A B D E G 79 202 73 173 169 201 171 73 202 79 173 169 201 171 79 202 73 173 171 201 169 4 73 202 79 173 171 201 169 5 171 201 169 173 73 202 79 6 169 201 171 173 73 202 79 7 171 201 169 173 79 202 73 8 169 201 171 173 79 202 73 9 79 202 75 173 169 201 171 75 202 79 173 169 201 171 11 79 202 75 173 171 201 169 12 75 202 79 173 171 201 169 13 171 201 169 173 75 202 79 14 169 201 171 173 75 202 79 15 171 201 169 173 79 202 75 16 169 201 171 173 79 202 75 Tabla 8B (Continúa) Construcción construcción anti-CD3 des- Arreglo de inmunizada / Especificidad (N Dominio -> C) 1 CD3 (VL2/VH5) xCD20 LHHL 2 CD3 (VH5/VL2) xCD20 HLHL 3 CD3 (VL2/ VH5) xCD20 LHLH 4 CD3 (VH5/VL2) xCD20 HLLH 5 CD20xCD3 (VH5/VL2) LHHL 6 CD20xCD3(VH5/VL2) HLHL 7 CD20xCD3 (VL2/ VH5) LHLH 8 CD20xCD3(VL2/ VH5) HLLH 9 CD3 (VL2/VH7) xCD20 LHHL 10 CD3 (VH7A/L2) xCD20 HLHL 11 CD3(VL2/VH7)xCD20 LHLH 12 CD3 (VH7/VL2) xCD20 HLLH 13 CD20xCD3 (VH7?/L2) LHHL 14 CD20xCD3(VH7/VL2) HLHL 15 CD20xCD3 (VL2/ VH7) LHLH 16 CD20xCD3(VL2/ VH7) HLLH Más preferiblemente, las construcciones de enlace CD3 y CD20 desinmunizadas de la presente invención comprenden una secuencia de amino ácidos que se elige del grupo que consiste de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 218, 220, 222, 224, 226, o 228; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 217, 219, 221, 223, 225 o 227; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (b) ; (d) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo condiciones estrictas de hibridización. La presente invención también proporciona construcciones de enlace específicas CD3 que comprenden un primer dominio que liga específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida para generar epítopos de célula T y comprende un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de ligar a CD20, que comprende una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) previamente, es decir a una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 217, 219, 221, 223, 225 o 227, bajo estrictas condiciones de hibridización. Los términos "hibridización" y "condiciones estrictas" se han descrito previamente. Las definiciones y modalidades correspondientes aplican aquí mutatis mutandis. Las construcciones de enlace CD3 y CD20 desinmunizadas aquí descritas se prevén para utilizar en el tratamiento, prevención y/o mejora de desórdenes relacionados a célula B, de preferencia en la intervención médica de linfoma, más preferiblemente en el tratamiento de linfoma de no-Hodgkin. La invención también proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de enlace específica de CD3 de la invención. Es evidente para la persona con destreza en la técnica que pueden agregarse secuencias regulatorias a las molécula de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, promotores, mejoradores de transcripción y/o secuencias que permiten expresión inducida del polinucleótido de la invención pueden emplearse. Un sistema inducible conveniente por ejemplo es una expresión de gen regulada por tetraciclina como se describe por ejemplo por Gossen and Bujard (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551) y Gossen y colaboradores, (Trends Biotech. 12 (1994) , 58-62) , o un sistema de expresión de gen inducible por dexametasona como se describe por ejemplo por Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519. Además, se prevé que para adicionales propósitos que molécula de ácido nucleico pueden contener por ejemplo enlaces tioéster y/o análogos nucleótidos. Estas modificaciones pueden ser útiles para estabilización de la molécula de ácido nucleico contra endo- y/o exonucleasas en la célula. Las moléculas de ácido nucleico pueden transcribirse por un vector apropiado que contiene un gen quimérico que permite la transcripción de la molécula de ácido nucleico en la célula. En este aspecto, también habrá de entenderse que este polinucleótido puede emplearse para enfoques de "hacer blanco de gen" o "terapéutica de gen" . En otra modalidad las moléculas de ácido nucleico se etiquetan. Métodos para la detección de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo técnicas Southern and Northern, PCR o extensión de cebador. Esta modalidad puede ser útil para métodos de supervisión para verificar introducción exitosa de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente durante los enfoques de terapia de genes . La o las moléculas de ácido nucleico pueden ser una molécula de ácido nucleico quimérica producida en forma recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas ya sea solas o en combinación. De preferencia, la molécula de ácido nucleico es parte de un vector. La presente invención por lo tanto también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en la presente invención. Se conocen muchos vectores convenientes por aquellos con destreza en biología molecular, la selección de los cuales dependerá de la función deseada e plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores empleados convencionalmente en ingeniería genética. Métodos que son conocidos por aquellos con destreza en la técnica pueden emplearse para construir diversos plásmidos y vectores; ver por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y colaboradores, (loe cit . ) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989) , (1994) . En forma alterna, los polinucleótidos y vectores de la invención pueden ser reconstituidos en liposomas para suministro a las células diana. Como se discute con mayor detalle a continuación, un vector de clonación se utiliza para aislar secuencias individuales de ADN. Secuencias relevantes pueden ser transferidas en vectores de expresión en donde la expresión de un polipéptido particular se requiere. Vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT. De preferencia, el vector comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia regulatoria enlazada operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica construcciones de anticuerpo de una sola cadena biespecíficas aquí definidas . Estas secuencias regulatorias (elementos de control) se conocen por la persona con destreza y pueden incluir un promotor, un cassette de spl, codón de inicio de traducción, sitio de traducción e inserción para introducir un inserto en el vector. De preferencia, la molécula de ácido nucleico se enlaza operativamente con las secuencias de control de expresión permitiendo expresión en células eucarióticas o procarióticas. Se prevé que el vector es un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica construcciones de anticuerpo de una sola cadena biespecíficas aquí definidas . El término "secuencia regulatoria" se refiere a secuencias de ADN, que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias de codificación a las cuales se ligan. La naturaleza de estas secuencias de control difiere, dependiendo del organismo huésped o anfitrión.
En procariotas, las secuencias de control en general incluyen promotor, sitios de enlace ribosomal y terminadores . En eucariotas generalmente las secuencias de control incluyen promotores , terminadores y en algunos casos mejoradores, transactivadores o factores de transcripción. El término "secuencia de control" se pretende que incluya como mínimo, todos los componentes de los cuales la presencia es necesaria para expresión, y también puede incluir componentes adicionales ventajosos. El término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Una secuencia de control "enlazada operativamente" a una secuencia de codificación se liga de manera tal que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control . En caso en que la secuencia de control sea un promotor, es evidente para una persona con destreza en la técnica que de preferencia se utiliza ácido nucleico de doble hebra. De esta manera, el vector descrito de preferencia es un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una construcción que puede emplearse para transformar un anfitrión selecto y permite la expresión de una secuencia de codificación en el anfitrión selecto.
Vectores de expresión pueden por ejemplo ser vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. La expresión comprende transcripción de la molécula de ácido nucleico de preferencia en un ARNm de traducción. Elementos regulatorios que aseguran expresión en procariotas y/o células eucarióticas son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica. En el caso de células eucarióticas comprenden promotores normales asegurando inicio de transcripción y opcionalmente señales poli-A se aseguran terminación de transcripción y estabilización de la transcripción. Elementos regulatorios posibles permiten expresión en células huésped procarióticas comprenden por ejemplo el promotor PL, lac, trp o tac en E. coli , y ejemplos de elementos regulatorios permiten expresión en células anfitrionas eucarióticas son el promotor A0X1 o GAL1 en levadura o el promotor CMV-, SV40 , RSV- (virus sarcoma Rous) , mejorador CMV, mejorador SV40 o una globina introna en células de mamíferos y otros animales. Además elementos que son responsables por el inicio de transcripción tales como elementos regulatorios también pueden comprender señales de terminación de transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, corriente abajo del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión empleado secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimiento celular o secretarlo en el medio, pueden agregarse a la secuencia de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos descrita y son bien conocidas en la especialidad; ver también por ejemplo el Ejemplo 1 anexo. La o las secuencias líder se ensamblan en una fase apropiada con secuencias de traducción, inicio y terminación, y de preferencia una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o su porción en el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión incluyendo un péptido de identificación N-terminal que imparte características deseadas por ejemplo estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado; ver arriba. En este contexto, vectores- de expresión convenientes son conocidos en la técnica tales como el vector de expresión ADNc Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pCDM8 , pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogene) , pEF-DHFR, pEF-ADA or pEF-neo (Raum y colaboradores, Cáncer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) o pSPORTl (GIBCO BRL) . De preferencia, las secuencia de control de expresión serán sistemas promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar células anfitrionas eucarióticas, pero las secuencias de control para anfitriones procarióticos también pueden utilizarse. Una vez que el vector se ha incorporado en el anfitrión apropiado, el anfitrión se mantiene bajo condiciones adecuadas para expresión a alto nivel de las secuencias de nucleótido y según se desee, la recolección y purificación del polipéptido de la invención puede seguir; ver por ejemplo los ejemplos anexos. Un sistema de expresión alterno que puede utilizarse es un sistema de insecto. En dicho sistema, virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) se utiliza como un vector para expresar genes ajenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia de codificación de una molécula de ácido nucleico descrita puede clonarse en una región no esencial del virus, tal como el polihedrina, y colocarse bajo control del promotor polihedrina. Inserción exitosa de la secuencia de codificación hará inactivo al gen polihedrina y producirá virus recombinante que carece de la cubierta de proteína de revestimiento. Los virus recombinantes luego se utilizan para infectar células de S . frugiperda o larvas de Trichoplusia en donde la proteína de la invención se expresa (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).
Elementos regulatorios adicionales pueden incluir mejoradores de transcripción así como de traducción. Ventajosamente, los vectores anteriormente descritos de la invención comprenden un marcador seleccionable y/o de marcado. Genes marcadores seleccionables útiles para la selección de células transformadas y por ejemplo tejido de plantas y plantas, son bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad y comprenden por ejemplo, resistencia antimetabolito como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a aminoglicósidos neomicina, canamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Marsh, Gene 32 (1984) , 481-485) . Genes de selección adicionales se han descrito, es decir trpB, que permite a células utilizar indol en lugar de triptofano; hisD, que permite a células a utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) , 8047) ; mannosa-6-fosfato isomerasa que permite a células utilizar mannosa (WO 94/20627) y ODC (ornitina decarboxilasa) que confiere de resistencia al inhibidor ornitina decarboxilasa, 2- (difluorometil) -DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o deaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995) , 2336-2338) .
Marcadores de registro útiles también se conocen por aquellos con destreza en la especialidad y están comercialmente disponibles. Ventajosamente, el marcador es un gen que codifica luciferasa y (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact . 178 (1996) , 121) , proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o /5-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta modalidad es particularmente útil para supervisión simple y rápida de células, tejidos y organismos que contienen un vector descrito. Como se describió anteriormente, la molécula de ácido nucleico descrita puede utilizarse sola o como parte de un vector para expresar la construcción específica de CD3 codificada en células, por ejemplo para purificación pero también para propósitos de terapia de genes . Los vectores o moléculas de ácido nucleico que contienen la o las secuencias de de ADN que codifican cualquiera de las construcciones CD3 (biespecíficas) anteriormente descritas, se introducen en las células que a su vez producen el polipéptido de interés. La terapia de genes, que se basa en introducir genes terapéuticos en células por técnicas ex-vivo o in-vivo es una de las aplicaciones más importantes de transferencia de genes. Vectores convenientes, métodos o sistemas para suministro de genes para terapia de genes in-vitro o in-vivo se describen en la literatura y se conocen por la persona con destreza en la especialidad; ver por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699 ; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998) , 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996) , 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; E.U.A. 5,589,466; o Schaper, Current Opinión in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Los vectores y moléculas de ácido nucleico descritos pueden diseñarse para introducción directa o para introducción mediante liposomas, o vectores virales por ejemplo adenoviral, retroviral (en la célula) . De preferencia, la céula es una célula de línea germinal, célula embriónica o célula huevo o derivado de estas, más preferiblemente la célula es una célula madre. Un ejemplo de una célula madre embriónica puede ser, entre otros, una célulamadre como se describe en Nagy, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428. De acuerdo con lo anterior, la presente invención se refiere a métodos para derivar vectores, particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos empleados convencionalmente en ingeniería genética, que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de polipéptido por una construcción de anticuerpo de una sola cadena viaespecífica aquí definida. De preferencia, el vector es un vector de expresión y/o un gen de transferencia o vector de diana. Vectores de expresión, derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus herpes, o virus de papiloma bovino, pueden emplearse para suministrar los polinucleótidos o vector descritos a poblaciones de células diana. Métodos que son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica pueden emplearse para construir vectores recombinantes; ver por ejemplo las técnicas descritas en Sambrook et al. (loe cit . ) , Ausubel (1989, loe cit . ) u otros libros de texto estándar. En forma alterna, los vectores y moléculas de ácido nucleico descritos pueden reconstituirse en liposomas para suministro a células diana. Los vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención, pueden ser transferidos a la célula anfitriona por métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo del anfitrión celular. Por ejemplo, la transección de cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procarióticas, mientras que el tratamiento de fosfato de calcio o electroporación puede emplearse para otros anfitriones celulares; ver Sambrook, supra. El vector descrito puede, entre otros ser pEF-DHFR, pEF-ADA o pEF-neo . Los vectores pEF-DHFR, pEF-ADA y pEF-neo se han descrito en la técnica, por ejemplo en Mack et al. (PNAS (1995) 92, 7021-7025) y Raum et al. (Cáncer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150). La invención también proporciona un anfitrión transformado o transfectado por un vector como se describe aquí . El anfitrión puede producirse al introducir al menos uno de los vectores anteriormente descritos, o al menos uno de las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas en el anfitrión. La presencia del vector como mínimo o la molécula de ácido nucleico como mínimo en el anfitrión puede mediar la expresión de un gen que codifica las construcciones de anticuerpo de cadena sencilla vía específicas anteriormente descritas. El vector o molécula de ácido nucleico descrito que se introduce en el anfitrión ya pueden integrarse en el genoma del anfitrión o puede mantenerse extra-cromosomalmente . El anfitrión puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. El término "procariota" se pretende que incluye todas las bacterias que pueden transformarse o transectarse con moléculas de ADN o ARN para expresión de una proteína de la invención. Anfitriones procarióticos pueden incluir bacterias gram negativas así como gram positivas tales como por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término "aucariótico" se pretende que incluya células de levadura, de plantas superiores, insectos y de preferencia de mamíferos . Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, la proteína codificada por el polinucleótido de la presente invención puede ser glicosilada o puede no ser glicosilada. En especial se prefiere el uso de un plásmido o un virus que contiene la secuencia de codificación del polipéptido de la invención y fusionada genéticamente un elemento FLAG N-terminal y/o etiqueta His C-terminal. De preferencia, la longitud de la etiqueta FLAG es aproximadamente 4 a 8 amino ácidos, más preferiblemente 8 amino ácidos . Un polinucleótido anteriormente descrito puede emplearse para transformar o transfectar el anfitrión utilizando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Además, métodos para preparar genes fusionados, enlazados operativamente y que los expresan por ejemplo en células de mamífero y bacterias, son bien conocidos en la especialidad (Sambrook, loe cit.) . De preferencia, el anfitrión es una bacteria, una célula de insecto, fungal, de planta o animal. Se prevé particularmente que el anfitrión descrito puede ser una célula de mamífero, más preferiblemente una célula de humano o una línea celular humana . Células anfitrionas particularmente preferidas comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mieloma como SP2/0 o NS/0. Como se ilustra en los ejemplos anexos, particularmente se prefieren células CHO como anfitriones . En una modalidad adicional, la presente invención de esta manera se refiere a un proceso para la preparación de una construcción específica de CD3 descrita anteriormente que comprende cultivar una célula y/o el anfitrión de la invención, bajo condiciones adecuadas para la expresión de la construcción y aislar la construcción de la célula o medio de cultivo.
Los anfitriones transformados pueden desarrollarse en fermentadores y cultivarsde de acuerdo con técnicas conocidas en la especialidad para lograr crecimiento óptimo de células. El polipéptido de la invención puede entonces aislarse del medio de crecimiento, lisado celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y purificación por ejemplo de los polipéptidos expresados microbialmente de la invención puede ser por cualesquiera medios convencionales tales como por ejemplo separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como aquellas que involucran el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos por ejemplo contra una etiqueta del polipéptido de la invención o como se describe en los ejemplos anexos. Además, la invención proporciona una composición que comprende una construcción de enlace específico-CD3 (humano) como se define aquí o una construcción de enlace específico-CD (humano) como se produce por el proceso descrito anteriormente, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector o un anfitrión de la invención. La composición opcionalmente también puede comprender un compuesto proteinaseo capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes. Más preferiblemente, la composición es una composición farmacéutica que además comprende opcionalmente formulaciones convenientes de portador, estabilizantes y/o excipientes. De acuerdo con esta invención, el término "composición farmacéutica" se refiere a una composición para administración a un paciente, de preferencia un paciente humano. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intra-arterial, intratecal o por inyección directa al tejido o tumor. Se prevee particularmente que la composición farmacéutica se administre a un paciente por infusión o inyección. La administración de las composiciones convenientes puede efectuarse por formas diferentes, por ejemplo por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La composición farmacéutica de la presente invención además puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de portadores farmacéuticos convenientes son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas amortiguadas con fosfato, agua, emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Composiciones que comprenden estos portadores pueden formularse por métodos convencionales bien conocidos .
Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis conveniente. El régimen de dosis se determinará por el médico a cargo y factores clínicos. Como es bien conocido en las técnicas médicas, dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial del cuerpo, edad, el compuesto particular a administrarse, sexo, tiempo y ruta de administración, salud general, y otras drogas que se administran en forma concurrente. En general, el régimen como una administración regular de la composición farmacéutica deberá estar en el rango de 1 µ g a 5 g unidades por día. Sin embargo, una dosis más preferida para infusión continua puede estar en el intervalo de 0.01 mg a 2 mg, de preferencia 0.01 mg a 1 mg, más preferiblemente de 0.01 mg a 100 mg, aún más preferible 0.01 mg a 50 mg y en especial 0.01 mg a 10 mg por unidades por kilogramo de peso corporal por hora. Dosis particularmente preferidas se describen aquí a continuación. El avance puede supervisarse por estimado periódico. Dosis variarán, pero una dosis preferida para administración intravenosa de ADN es de aproximadamente 106 a 1012 copias de la molécula de ADN. Las composiciones de la invención pueden administrarse en forma local o sistemática. La administración en general será parenteral, por ejemplo intravenosa; ADN también puede administrarse dirigido al sitio diana, por ejemplo por suministro dialítico a un sitio diana interno o externo o por catéter a un sitio en una arteria. Preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo salino y medio amortiguado. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa, y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen fluido y reabastecimiento de nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer), y semejantes. Conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes tales como por ejemplo anti-microbianos, anti-oxidantes, agentes quelantes y gases inertes y semejantes. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender portadores proteínaceos, como, por ejemplo albúmina de suero o inmunoglobulina, de preferencia de origen humano. Se prevé que la composición farmacéutica de la invención pueda comprender, además de las construcciones de anticuerpo de cadena sencilla bia-específicas proteinaceas o moléculas o vectores de ácido nucleico que codifican las mismas (como se describe en esta invención) , adicionales agentes biológicamente activos, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Estos agentes pueden ser drogas que actúan en el sistema gastrointestinal, drogas que actúan como citostáticos, drogas que evitan hiperuricemia, drogas que inhiben inmunorreacciones (por ejemplo corticoesteróides) drogas que actúan en el sistema circulatorio y/o agentes tales como moléculas co-estimuladoras de célula T o citocinas conocidas en la especialidad. Indicaciones posibles para administración de la o las composiciones de la invención son enfermedades tumorales especialmente cánceres/carcinomas epiteliales tales como cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel (melanoma) cánceres del tracto genitourinario (por ejemplo cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de cerviz y cáncer de riñon, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres de los ductos biliares, cáncer de esófago, cáncer de las glándulas salivales y cáncer de glándulas tiroides u otras enfermedades tumurales como tumoresen hematológicos, gliomas, sarcomas y osteosarcomas . La administración de la o las composiciones de la invención se indica especialmente para enfermedad residual mínima, de preferencia tumores sólidos tempranos, tumores sólidos avanzados o tumores sólidos metastásicos, que se caracterizan por la recurrencia local y no local del tumor provocada por la supervivencia de células sencillas . La invención además prevé los protocolos de coadministración con otros compuestos, por ejemplo moléculas capaces de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes, para proliferación celular o para estímulo celular. La molécula puede ser por ejemplo una señal de activación primaria adicional para células T (por ejemplo una molécula co-estimulatoria adicional: moléculas de la familia B7, Ox40L, 4.1 BBL) , o una adicional citocina: interlucina (por ejemplo IL-2) o compuesto que acopla NKG-2D. La composición de la invención como se describe anteriormente también puede ser una composición de diagnóstico que además comprende opcionalmente medios y métodos para detección. Las construcciones específicas-CD3 que aquí se proporcionan son también adecuadas para uso en inmuno- ensayos en donde pueden utilizarse en fase líquida o ligarse a un portador de fase sólida. Ejemplos de inmunoensayo que pueden utilizar el plipéptido de la invención son ensayos competitivos y no competitivos, ya sea en un formato directo o indirecto. Ejemplos de estos inmunoensayos son el ensayo inmunosolvente enlazado con enzima (ELISA), inmuno ensayo de enzima (EIA), radioinmunoensayo (RÍA) , el emparedado (ensayo inmunométrico) y ensayo de técnica Western. Las construcciones de enlace específicas CD3 de la invención pueden ligarse a muy diferentes portadores y emplearse para aislar células ligadas específicamente a los polipéptidos. Ejemplos de portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polivinil cloruro, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador ya puede ser soluble o insoluble, por ejemplo como perlas, para los propósitos de la invención. Hay muy diferentes etiquetas y métodos para etiquetado conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ejemplos de los tipos de etiquetas que pueden emplearse en la presente invención incluyen enzimas, radio isótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminicentes; ver también las modalidades discutidas anteriormente. En una modalidad más preferida de la presente invención, el uso de una molécula de enlace específica de CD3 de la invención, de un vector o de un anfitrión de la invención para la preparación de una composición farmacéutica se prevé. La composición farmacéutica puede emplearse en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un desorden inmunológico, una enfermedad aunto-inmune, una enfermedad infecciosa, enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto-contra-anfitrión, o enfermedades de anfitrión-contra-injerto. Además, de acuerdo con la invención, las construcciones desinmunizadas que comprenden dominios de enlace CD19 y CD3 , de preferencia SEQ ID NO.: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407 o 409, pueden utilizarse para el tratamiento de desórdenes inmunológicos (diversas malignidades de célula B) o enfermedades autoinmune, las construcciones desinmunizadas que comprenden los dominios de enlace CCR5 y CD3, de preferencia SEQ ID NO.:206, 208, 210, 212, 214 o 216, pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades virales (HIV) , enfermedades autoinmune y/o enfermedades inflamatorias (como artritis reumatoide) , las construcciones desinmunizadas comprenden dominios de enlace CD20 y CD3 , de preferencia SEQ ID NO.:218, 220, 222, 224, 226, 228, pueden utilizarse para el tratamiento tumorales, de preferencia linfoma, más preferiblemente linfoma de célula B no-Hodgkin y las construcciones desinmunizadas que comprenden dominios de enlace EpCAM y CD3, de preferencia SEQ ID NO.:31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65 , 61 , 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 o 325 pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades tumorales, de preferencia cánceres epiteliales. La invención también se refiere a un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumorosa o tumoral, una enfermedad inflamatoria, un desorden inmunológico, un desorden autoinmune, una enfermedad infecciosa, enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto-contra- anfitrión o enfermedades de anfitrión-contra-injerto, que comprende la administración de una molécula de enlace específica de CD3 (biespecífica) de la invención o una molécula de enlace específica de CD3 (biespecífica) como se produce por el proceso aquí descrito, de una molécula de ácido nucleico, un vector o un anfitrión de la invención a un sujeto que requiere dicha prevención, tratamiento o mejora. De preferencia, el sujeto es un humano . El método para la prevención, tratamiento o mejora también, además, comprender la administración de un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmune. El compuesto proteináceo puede administrarse en forma simultánea o no-simultánea con la molécula de enlace CD3 , una molécula de ácido nucleico, un vector o un anfitrión de la invención. El compuesto proteináceo puede, entre otros, ser seleccionado del grupo que consiste de una molécula coestimulatoria adicional :moléculas de familia B7, Ox40L, 4.1 BBL), o una citocina: interieucina (por ejemplo IL-2) o compuestos de acoplamiento NKG-2D. Finalmente, la invención proporciona un equipo que comprende la molécula de enlace específica de CD3 , una molécula de ácido nucleico, un vector o un anfitrión de la invención.
El equipo es particularmente útil en la preparación de una composición farmacéutica de la presente invención, y entre otros, puede consistir de un recipiente útil para inyecciones o infusiones . Ventajosamente, el equipo de la presente invención además comprende, opcionalmente (a) amortiguador (s) , soluciones de almacenamiento y/o restantes reactivos o materiales requeridos para realizar propósitos médicos o científicos. Además, partes del equipo de la invención pueden empacarse individualmente en ampolletas o botellas o en combinación en recipientes o unidades de múltiples recipientes . El equipo de la presente invención puede ser empleado ventajosamente, entre otros, para llevar a cabo el método de la invención y pueden emplearse en una variedad de aplicaciones aquí referidas, por ejemplo como herramientas de investigación o herramientas médicas . La fabricación de los equipos de preferencia sigue procedimientos estándar que son conocidos por la persona con destreza en la técnica. Estas y otras modalidades se describen y abarcan por la descripción y ejemplos de la presente invención. Adicional literatura referente a cualquiera de los anticuerpos, métodos, usos y compuestos a emplearse de acuerdo con la presente invención, pueden recuperarse de bibliotecas públicas y bases de datos, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública "Medline", disponible en Internet, que puede utilizarse por ejemplo bajo http : //www .ncbi .nlm. nih. gov/PubMed/medline .html . Adicionales bases de datos y direcciones, tales como http: //www.ncbi .nlm.nih.gov/, http: //www. infobiogen. fr/, http : //www . fmi . ch/biology/research_tools . html , http://www.tigr.org/, se conocen por la persona con destreza en la técnica y también pueden obtenerse utilizando por ejemplo http://www.lycos.com. Las Figuras muestran: La Figura 1. ADN y secuencias de amino ácido del cassette anti-CD3 no-desinmunizado (SEQ ID NOs.: 1 y 2) . La Figura 2. A) Secuencias de amino ácidos de las cadenas pesadas VH2 (SEQ ID NO.: 70), VH3 (SEQ ID NO.: 72), VH5 (SEQ ID NO.: 74) y VH7 (SEQ ID NO.: 76) y cadenas ligeras VL1 (SEQ ID NO. : 78) , VL2 (SEQ ID NO. : 80) y VL3 (SEQ ID NO. : 82) , respectivamente, B) Secuencias nucleótido de las cadenas pesadas VH2 (SEQ ID NO.: 69), VH3 (SEQ ID NO.: 71), VH5 (SEQ ID NO.: 73) y VH7 (SEQ ID NO. : 75) y cadenas ligeras VL1 (SEQ ID NO. : 77), VL2 (SEQ ID NO.: 79) y VL3 (SEQ ID NO.: 81), respectivamente, C) Secuencias de amino ácidos de CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas del anti-CD3 no- desinmunizado (SEQ ID NO.: 84, 90, 96, respectivamente), VH2 (SEQ ID NO.: 86, 94, 96, respectivamente), VH3 (SEQ ID NO.: 86, 94, 96, respectivamente), VH5 (SEQ ID NO.:88, 92, 96, respectivamente) y VH7 (SEQ ID NO.: 88, 90, 96, respectivamente) y de las cadenas ligeras del anti-CD3 no-desinmunizado (SEQ ID NO.: 98, 102, 104, respectivamente), cadenas VL1 (SEQ ID NO.: 100, 102, 104, respectivamente), VL2 (SEQ ID NO.:100, 102, 104, respectivamente) y VL3 (SEQ ID NO.:98, 102, 104, respectivamente) y D) Secencias nucleótido de CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y el anti-CD3 no-desinmunizado (SEQ ID NO.: 83, 89, 95, respectivamente), VH2 (SEQ ID NO.: 85, 93, 95, respectivamente), VH3 (SEQ ID NO.: 85, 93, 95, respectivamente), VH5 (SEQ ID NO.: 87, 91, 95, respectivamente) y VH7 (SEQ ID NO.: 87, 89, 95, respectivamente) y de las cadenas ligeras del anti-CD3 no-desinmunizado (SEQ ID NO.:97, 101, 103, respectivamente), cadenas VL1 (SEQ ID NO.: 99, 101, 103, respectivamente), VL2 (SEQ ID NO.: 99, 101, 103, respectivamente) y VL3 (SEQ ID NO.: 97, 101, 103, respectivamente) . La Figura 3. A) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: 4) B) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO. : 5) C) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO. : 6) D) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO. : 7) E) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO. : 8) F) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.: 9). La Figura 4. A) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: 10) B) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO. : 11) C) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.: 12) D) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.: 13) E) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO. : 14) F) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.: 15). La Figura 5. A) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO. : 16) B) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO. : 17) C) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 18) D) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH5xVL2) (SEQ ID NO.: 19) E) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO.: 20) F) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO.: 21). La Figura 6. A) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 22) B) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH7xVLl) (SEQ ID NO. : 23) C) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO. : 24) D) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH7xVL2) (SEQ ID NO. : 25) E) Secuencia de nucleótido de anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO . : 26) F) Secuencia de amino ácidos de anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 27). La Figura 7. Enlace de construcciones anti-CD19 biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: el anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.: 178), anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO.: 180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.: 182), antí-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.: 184), anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.: 186), anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.: 188), anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.: 190), anti-CD3 (VH5/VK2) (SEQ ID NO.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198), anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 200) A) CD3 y B) CD19. El enlace se mide por ensayo basado en FACS utilizando PBMCs enriquecido con CD3 (A) o células NALM positivas CD19 (B) . CD3 y un anticuerpo Ig anti-ratón etiquetado FITC secundario se utiliza como un control negativo en (A) y CD19 y un anticuerpo Ig anti-ratón etiquetado FITC secundario se utiliza como un control negativo en (B) . Construcciones anti-CD19xanti-CD3 y anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 se emplearon como controles . MFI indica intensidad de fluorescencia promedio . - La Figura 8 : Un patrón de elución representativo de una variante desinmunizada de una fracción de proteína anti-CD19xanti-CD3 de una columna HCIC a 280 nm. La línea inferior muestra una etapa principal a 700 ml indica el gradiente teórico del amortiguador de elución que contiene acetato 20 mM, pH3.5. Alta adsorción a 280 nm se debió a proteína no ligada en el flujo pasante de la columna. La flecha en 810,98 ml indica la fracción anti-CD3 desinmunizada eluída. La Figura 9 : Un patrón de elución representativo de una variante desinmunizada de fracción de proteína anti-CD19xanti-CD3 de una columna Ni-Chelating His TrapR a 280 nm. La línea inferior muestra una primer etapa a 85 ml y una segunda etapa principal a 90 mi indica el gradiente teórico del amortiguador de elución (línea punteada). La flecha en 93,16 ml indica la fracción de proteína que contiene la construcción antiCD19 x antiCD3. La Figura 10: Un patrón de elución de proteína representativo de una columna de filtración en gel Sephadex S200. Se recolectaron fracciones de tiempo de retención 0-130 ml . El pico de proteína a 80.44 ml corresponde a un peso molecular de aproximadamente 52 kD y contiene la construcción antiCD19 x antiCD3 desinmunizada . La Figura 11: A) Análisis SDS-PAGE de variantes desinmunizadas de fracciones de proteína anti-CD19xanti- CD3. Pista M: Marcador de peso molecular Pista 1: HCIC flujo pasante; pista 2: sobrenadante de cultivo celular; pista 3: eluato HCIC; pista 4: IMAC flujo pasante; pista 5: lavado IMAC; pista 6: eluato IMAC; pista 7: eluato de filtración en gel; B) Análisis de técnica Western de variantes desinmunizadas purificadas de fracciones de proteína anti-CD19xanti-CD3. Análisis de técnica Western de proteína biespecífica purificada se realiza con anticuerpos dirigidos contra His-Tag (PentaHis, Qiagen) Ig anti-ratón cabra etiquetado con fosfatasa alcalina. Pista M: Marcador de peso molecular Pista 1: HCIC flujo pasante; pista 2: sobrenadante de cultivo celular; pista 3: eluato HCIC; pista 4: IMAC flujo pasante; pista 5: lavado IMAC; pista 6: eluato IMAC; pista 7: eluato de filtración en gel . Las Figura_12. Enlace de las construcciones anti-CD19 biespecíficas purificadas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.: 190), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) y anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 200) a A) CD3 y B) CD19 comparado con la construcción anti-CD19xanti-CD3 tipo silvestre. El enlace se mide por ensayo basado en FACS utilizando CD3 enriquecidos con PBMCs (A) o células NALM CD19-positivas (B) . Un anticuerpo secundario con células positivas CD3 se utiliza como un control negativo en (A) y un anticuerpo secundario con células CD19 positivas se utiliza como un control negativo en (B) . Construcciones anti-CD19xanti-CD3 y anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 se utilizan como controles . El ensayo se realizó con concentraciones de 1 µ g/ml and 5 µ g/ml . MFI indica intensidad de fluorescencia promedio. La Figura 13. Ensayo de citotoxicidad de construcciones anti-CD19 biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.: 198) y anti-CD3 (VH7/VK3) (SEQ ID NO . : 200) comparadas con control. La Figura 14. Alineamiento de secuencia de regiones pesadas variables del anticuerpo CD3 no-desinmunizado, VH5 (SEQ ID NO.: 74), VH7 (SEQ ID NO.: 76), VH2 (SEQ ID NO.: 70) y VH3 (SEQ ID NO.: 72). Región marco 1 (FR1) , región para determinación de complementariedad 1 (CDRl) , Región marco 1 (FR1) , región para determinar de complementariedad 2 (CDR2) , Región marco 3 (FR3), región para determinación de complementariedad 3 (CDR3) y Región marco 4 (FR4) se han ilustrado. La secuencia LAR y VKK en FR1, la secuencia ASGYTF y ASGYTA en la transición de la región marco 1 a la región CDRl y la secuencia LTTDK, ITTDK y MTTDT como FR3 en la secuencia MQLS, MELS y LQMN en FR3 se han colocado en caja. Alineamiento se llevó a cabo utilizando el programa AlingnX de Vector NTI Advance (Informax, Inc., USA). La Figura 15. Análisis de enlace de construcciones anti EpCAM biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizado: anti-CD3 (VH5/VL2)x5-10 (SEQ ID NO.: 37) (A), anti-CD3 desinmunizado (VH5/VL2)x4-7 (SEQ ID NO.: 33), (B) anti-CD3 desinmunizado (VH5/VL2)x3-l (SEQ ID NO.:31) (C) , anti-CD3 desinmuniado (VH5/VL2)x4-7 (VL-VH) (SEQ ID NO.: 35) (D) y anti-CD3 desinmunizado (VH5/VL2) X5-10 (VL-VH) (SEQ ID NO.: 39) (E) en células Jurkat positivas CD3 y Kato III positivas EpCAM con un ensayo basado en FACS . Un cambio a la derecha muestra enlaces. En células Jurkat, la línea punteada indica el cambio del control negativo (solo anticuerpo secundario) , línea punteada muestra el enlace de un anticuerpo de control anti-EpCAM-anti-CD3 , la línea sólida muestra la construcción biespecífica de interés . En el ensayo de enlace utilizando células Kato III EpCAM-positivas en lugar de anticuerpo monoclonal a CD3 , un anticuerpo monoclonal a EpCAM se utiliza como un control positivo. La Figura 16. Análisis de enlace de construcciones anti EpCAM biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 49) (A) y 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO. : 63) (B) en células Jurkat CD3-positivas y en células Kato EpCAM-positivas con un ensayo basado en FACS. Un cambio a la derecha muestra enlace. La Figura 17. Ensayo de citotoxicidad de construcciones EpCAM con partes anti-CD3 desinmunizadas (di anti-CD3) en la posición N-terminal anti-CD3 (VH5/VL2)x3-l (SEQ ID NO.:31), anti-CD3 (VH5/VL2 )x-5-10 (SEQ ID NO.:37) y anti-CD3 (VH5/VL2)x4-7 (SEQ ID NO.:33) comparadas con las construcciones no-desinmunizadas correspondientes. El clon de célula T CB15 y células CHO-EpCAM se emplearon en la proporción E:T de 5:1. Células de CHO-EpCAM se tiñieron con colorante PKH26 y las células se contaron después de incubación de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico con análisis FACS. La Figura 18. Ensayo de citotoxicidad de construcciones EpCAM con partes anti-CD3 parts desinmunizadas en la posición C-terminal 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID N0.:49) y 5-10xantí-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 63) comparada con las construcciones de tipo silvestre no-desinmunizadas correspondientes . El ensayo de citotoxicidad se llevó a cabo idéntico a la Figura 17. Los siguientes ejemplos ilustran la invención: En los siguientes ejemplos, una cantidad de anticuerpos CD3 anti-humano de cadena sencilla se han sometido a ingeniería para mostrar reducida inmunogenicidad en humanos. Los diferentes anticuerpos CD3 anti-humano des-inmunizados comprenden 12 combinaciones de 4 diferentes regiones VH (VH2 (SEQ ID NO.:69, 70), VH3 (SEQ ID NO.:71, 72), VH5 (SEQ ID NO.:73, 74) y VH7 (SEQ ID NO.:75, 76)) y 3 diferentes regiones VL (VL1 (SEQ ID NO.: 77, 78), VL2 (SEQ ID NO.: 79, 80) y VL3 (SEQ ID N0.:81, 82)) unidades en conjunto. Las secuencias de amino ácido y ácido nucleico de las regiones VH y VL anteriormente mencionadas se ilustran en las Figuras 3-6. De manera ilustrativa, los anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 des-inmunizados se combinaron con un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD19 o con un anticuerpo de cadena sencilla anti-EpCAM para formar un producto biespecífico. Ejemplo 1. Clonación y expresión de construcciones anti-CD3 desinmunizadas 1.1. Transferencia de ADNc que codifica anticuerpo de cadena sencilla El ADN que codifica el anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3, que se desinmunizó, se refiere aquí como el cassette anti-CD3. Este cassette anti-CD3 consiste de un enlazador SGGGGS (SEQ ID N0.:176), la región anti-CD3 VH (SEQ ID NO.:110), un enlazador GS 14 de amino ácido (enlazador VEGGSGGSGGSGGSGGVD (SEQ ID NO.:68)), y las regiones de cadena sencilla anti-CD3 VL (SEQ ID N0.:112) seguido por 6 residuos histidina. El ADN anteriormente mencionado se clonó en el vector p-PCR- Script-Amp SK(+) (Stratagene) en el sitio Srf1. El ADN y la secuencia de amino ácidos del cassette anti-CD3 se ilustran en SEQ ID NO. :1, SEQ ID NO. :2 y la Figura 1. 1.2 Análisis de computadora de secuencias para epítopos de célula T inmunogénicos y diseño de secuencias de anticuerpo de cadena sencilla desimmunizado. La secuencia de amino ácidos del cassette anti- CD3 (SEQ ID NO.: 2) se analiza por programa de threading de péptido para identificar epítopos de células T potenciales con el método como se describe en WO 98/52976. SEQ ID NO . 3 muestra la secuencia enlazadora desinmunizada y SEQ ID NO.: 68 la secuencia enlazadora original . 1.3 Construcción de secuencias de anticuerpo de cadena sencilla desinmunizadas. Las versiones desinmunizadas del cassette anti-CD3 se construyeron por el método de recombinación PCR de superposición. El cassette anti-CD3 (SEQ ID N0.:1, 2) en pPCR-S-Amp SK+ se emplea como la plantilla o patrón para mutagénesis a las secuencias desinmunizadas requeridas. Conjuntos de pares cebadores mutagénicos se sintetizaron que abarcan las regiones a alterar. Las secuencias desinmunizadas producidas, incluyendo 4 diferentes regiones VH y 3 VL diferentes se clonaron como Notl a fragmentos Hindlll en el vector pPCR-S-Amp SK+ y toda la secuencia ADN se confirmó correcto. Las 4 regiones diferentes VH y 3 diferentes VK se unieron en todas las combinaciones (un total de 12) , ya sea por PCR o utilizando un sitio BstEll único en el extremo 3 ' de la región VH. Toda la secuencia de ADN de cada combinación se confirma correcta. Las diferentes regiones VH desinmunizadas (SEQ ID NO.:70, 72, 74 y 76) y regiones VL (SEQ ID NO.:78, 80 y 82) con las secuencias no- desinmunizadas originales correspondientes (VH:SEQ ID NO. : 110; V : SEQ ID NO.: 112) de las construcciones anti- CD3 se resumen en la Tabla 9. Tabla 9. SEQ ID NOs.: De regiones VH y VL desinmunizadas Tabla 9 (continúa) 1.4 Transferencia de genes de anticuerpo de cadena sencilla desinmunizado en vector de expresión. Los cassette anti-CD3 des-inmunizados se cortaron de pPCR-S-Amp-SK-t- con BspEl y Salí y clonaron en el vector de expresión pEF que comprende VLCD19-VHCD19- VHCD3-VLCD3. La parte CD3 del vector pEF-DHFR se reemplace con cada uno de los cassette anti-CD3 desinmunizadodos del sitio BspEl al sitio Salí resultando en las siguientes 12 construcciones: pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NOs.: 177, 178) pEF anti-CD19xantí-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NOs.: 179, 180) pEF antÍ-CD19xanti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NOs.: 181, 182) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NOs.: 183, 184) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NOs.: 185, 186) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NOs.: 187, 188) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NOs.: 189, 190) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NOs.: 191, 192) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NOs.: 193, 194) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NOs.: 195, 196) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NOs.: 197, 198) pEF anti-CD19xantí-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NOs.: 199, 200). Las construcciones además comprenden un líder de cadena pesada igG murino a fin de permitir la secreción de la proteína. Las secuencias de ADN de los cassette anti-CD3 des-inmunizados en el vector de expresión se confirmaron utilizando los cebadores de secuenciado (SEQ ID NO. : 28 y 29) . El ADN y secuencias de amino ácido de los 12 cassette anti-CD3 desinmunizado en el vector pEF desde el sitio BspEl al sitio Salí se ilustran en SEQ ID NOs.: 177-200. 1.5 Producción de construcciones de anticuerpo Después de transformación del vector en E. coli K12, en ADNs de grado de transfección de los diferentes vectores de expresión se prepararon. Proteínas secretadas se produjeron en células CHO-dhfr. Para producción transitoria los sobrenadantes de cultivo celular se cosecharon 2 días después de transfección, para la generación de células transfectadas estables, se pusieron células en medio de selección dos días después de transfección. Después de cinco pasos, se obtuvieron recolectados estable. Subsecuentemente, se identificaron ciónos sencillos en diluciones limitantes . Para facilitar el proceso de purificación, se células se adaptaron a medio libre de suero. Construcciones de anticuerpo se purificaron de aproximadamente 1 litro de sobrenadante . Los niveles de producción se probaron en ELISA.
No se observaron diferencias principales en los niveles de anticuerpo secretado entre diferentes construcciones que comprenden construcciones anti-CD19 y anti-CD3 desinmunizadas . Ejemplo 2: Ensayos de Enlace A fin de analizar la eficacia de enlace de las construcciones desinmunizadas con CD3 y CD19, se realizó un ensayo basado en FACS. Inicialmente, sobrenadantes crudos se probaron para ligar en PBMCs enriquecidos con CD3 o células NALM-6 CD19-positivas . Se incubaron células con sobrendantes no diluidos por 30 minutos a 8 grados C. Ante dos etapas de lavado, las células se etiquetaron con un anticuerpo anti-His (Qiagen) bajo las mismas condiciones. Después de etapas de lavado adicionales el ligado de las construcciones se detecta con un anticuerpo anti-ratón oveja conjugado FITC (Sigma) . Se analizaron células con un citómetro FACS Calibur (B&D) . Como controles, sobrenadantes de las células transfectadas anti-CD19xanti-CD3 y GFP se incluyeron. CD3 y un anticuerpo secundario se utiliza como un control negativo y muestra una intensidad de fluorescencia promedio (MFI) de aproximadamente 3.5. Las construcciones anti-CD19xanti-CD3 que comprenden anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.:190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO.:194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.:196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.:198) y anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.:200) tuvieron MFI de cuando menos 90, de esta manera ligando aproximadamente 25 veces más fuertemente. El control positivo que fue una construcción anti-CD19xanti-CD3 no desinmunizada alcanzó un MFI de aproximadamente 60 m strando que las construcciones desinmunizadas que comprenden anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.:190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO.:194), antí-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.:198) y antí-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.:200) ligaron CD3 con eficacia extremadamente alta. En un segundo experimento, las siguientes construcciones que comprenden anti-CD19 y anti-CD3: anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.:178), anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO.:180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.:182, anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO..-184), antÍ-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.:186) y anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.:188), mostraron enlaces similar como el control negativo (MFI ca. 6) . El ensayo de enlace basado en FACS también se llevó a cabo para CD19. En este experimento CD19 y un anticuerpo secundario fue como un control negativo. En este experimento, todas las construcciones ensayadas lograron un MFI de menos 80 mientras que el MFI del control negativo fue aproximadamente 3. De esta manera, las construcciones que comprenden anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.:190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO.:194), antí-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO..-196), antÍ-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.:198) y antí-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 200) resultaron ligan por igual CD3 y CD19 como el anti-CD19xanti-CD3 (SEQ ID NO.:204) no modificado. Sin embargo, las construcciones anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NO.:178), anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NO.:180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NO.:182), antí-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NO.:184), anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NO.:186), anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NO.:188) perdieron completamente la capacidad de enlace anti-CD3, mientras que el enlace CD19 se retuvo completamente (Figura 7) . De esta manera, se demostró que las cadenas pesadas desinmunizadas dominaron la especificidad y fuerza de enlace. Como resultado, las construcciones anti-CD3 con grupos VH5 y VH7 se purificaron y analizaron por actividad de citotoxidad. Ejemplo 3. Expresión y purificación de las variantes que muestran alta afinidad de enlace. Las proteínas anti-CD19xanti-CD3 desinmunizadas anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.:190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NO..-194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.:198) y anti~CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.:200) se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO) . A fin de purificar las construcciones de cadena sencilla biespecíficas que comprenden una parte anti-CD3 desinmunizada, células CHO-CD19 se desarrollaron en botellas giratorias con medio DMEM modificado con HiClone CHO (HiQ)R por 7 días antes de cosechar. Las células se retiraron por centrifugación y el sobrenadante que contiene la proteína expresada se almacena a -20 grados C. Ákta FPLC SystemR (Pharmacia) y Unicorn SoftwareR se utilizaron para cromatografía. Todos los productos químicos fueron grado de investigación y adquirieron de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt) . Cromatografía de inducción de carga hidrofóbica se realiza en medio MEP HypercelR cargado en una columna XK16/60 (Pharmacia) que se equilibró con amortiguador Al (20 mM Tris pH 7.2). 500 ml de un sobrenadante de cultivo celular se aplica a la columna (10 ml) con un gasto de flujo de 3 ml/min. Muestras no ligadas se lavó con arrastre con amortiguador Al y la proteína ligada se eluye con amortiguador Bl al 100% (acetato 20 mM pH 3.5) . Fracciones de proteína eluídas se recolectaron para mayor purificación . Se realizó IMAC, utilizando una columna HisTrapR (Pharmacia) que se cargó con NÍS04 de acuerdo con el protocolo de los fabricantes . La columna se equilibró con amortiguador A2 (NaP 20 mM pH 7.5, NaCl 0.4 M) y la muestra se diluyó 2 : 1 con amortiguador A2 para obtener un pH de 7. La muestra se aplicó a la columna (2 ml) con un gasto de flujo de 1 ml/min y la columna se lavó con amortiguador A2 para retirar la muestra no ligada. Proteína ligada se eluye utilizando un gradiente de 2 etapas de amortiguador B2 (NaP 20 mM pH 7.5, NaCl 0.4 M, Imidazol 0.5M) Etapa 1: amortiguador B2 al 20% en 10 volúmenes de columna; Etapa 2: amortiguador B2 al 100% en 10 volúmenes de columna. Fracciones de proteína eluida se recolectaron para mayor purificación. Cromatografía de filtración en gel se realiza en una columna Sephadex S200 HiPrepR (Pharmacia) equilibrada con PBS (Gibco) . Muestras de proteína eluida (gasto de flujo 1 ml/min) se sometieron a SDS-Page y Técnica Western para detección (Figura 11) . La columna se calibró previamente para determinación de peso molecular (equipo marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200) . Las variantes desinmunizadas de proteína anti-CD19xanti-CD3 se aislaron en un proceso de purificación de tres etapas incluyendo cromatografía de inducción de carga hidrofóbica (HCIC) (Figura 8) , cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) (Figura 9) y filtración en gel (Figura 10) . La construcción biespecífica tuvo un peso molecular de 52 kDa bajo condiciones nativas como se determina por filtración en gel en PBS. La proteína biespecífica purificada se analizó con SDS-PAGE bajo condiciones de reducción utilizando geles Bis Tris 4-12% (Invitrogen) . Preparación, muestra y aplicación fueron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El peso molecular se determina por la norma de proteína MultiMarkMR (Invitrogen) . El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo Invitrogen) . La pureza de la proteína aislada fue >95% (Figura lia) y la molécula tuvo un tamaño de 52 kD. Además, las variantes desinmunizadas de la proteína anti-CD19xanti-CD3 se detectaron específicamente por Técnica Western. La Técnica Western se realizó con una membrana Optitran BA-S83R y el Invitrogen Blot ModuleR de acuerdo con el protocolo de los fabricantes . Los anticuerpos empleados fueron Penta His (Quiagen) y Ig-anti-ratón-cabra etiquetado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) , la solución de tinción fue líquido BCIP/NBT (Sigma) . La señal principal se muestra que corresponde a la banda principal en SDS-PAGE a 52kD (Figura 11b) . Se determinaron concentraciones de proteínas utilizando el colorante de ensayo de proteína (MicroBCAR Pierce) y IgG (Biorad) como proteína estándar. Un compendio de los rendimientos finales de variantes de proteína purificadas se da en la Tabla 10, mostrando la alta productividad de todas las construcciones y muy buen rendimiento de construcción con anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.:190) de 924.8 µ g . Tabla 10. Rendimientos de proteína de las construcciones anti-CD19-anti-CD3 des-inmunizadas La productividad de las construcciones CD19xanti-CD3 (VH5/ VL2) y CD19xanti-CD3 ( H7/VL2) se comparó con las construcciones no-desinmunizadas correspondientes . Los resultados se ilustran en la Tabla 11. Tabla 11. Rendimientos de la construcción biespecífica desinmunizada comparada con la construcción no-desinmunizada correspondiente Tabla 11 Claramente demuestra que las construcciones biespecíficas comprenden el dominio de enlace CD3 desinmunizado tienen productividad muy superior (al menos tres veces) que la construcción no- desinmunizada correspondiente. Ejemplo 4. Ensayos de enlace basados en FACS de las construcciones anti-CD3. El enlace de las construcciones de anticuerpo purificadas selectas que comprende anti-CD19 y anti-CD3 se detecta como se describió anteriormente en el Ejemplo 2 a diversas concentraciones . En el ensayo de enlace CD3 , el anticuerpo secundario de control negativo (anti- His, conjugado FITC) , que se incubó con células positivas CD3 , mostró un MFI de aproximadamente 2.5 y el anticuerpo de cadena sencilla biespecífico antiCD19xanti-CD3 desinmunizado de control positivo de aproximadamente 70 a una concentración de 1 µg/ml y 50 a 5 µg/ml (Figura 12A) .
A la concentración de 1 µg/ml, el anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.: 190), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO. :198) los anticuerpos biespecíficos des-inmunizados anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.:200) mostraron valores MFI de 10-20; anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.:190) que tienen más alto (20). A 5 µg/ml anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NO.:198) alcanzó un MFI de' 25, mientras que anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NO.:196), anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.:200) y anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NO.: 190) tuvieron un MFI de al menos 40 de esta manera mostrando la misma eficacia de enlace que el control positivo no-desinmunizado. A una concentración de 5 µg/ml las construcciones de fuerte enlace con VH5/VL1 parte anti-CD3 desinmunizado (SEQ ID NO.:190), VH7/VL1 (SEQ ID NO.:196), VH7/VL2 (SEQ ID NO.:198), VH7/VL3 (SEQ ID NO.:200) ligado a CD3 así como el anti-CD19xanti-CD3 no desinmunizado (SEQ ID NO.: 204). Todas las construcciones de anticuerpo ligadas a CD19 con alta eficacia, que fue de aproximadamente 200 MFI, mientras que la construcción anti-CD19xanti-CD3 no desinmunizada (SEQ ID NO.:204) mostró 80 MFI . No se observaron diferencias para CD19 las concentraciones probadas para las diferentes construcciones (Figura 12B) . Ejemplo 5. Ensayos de Citotoxicidad Anti-CD19xanti-CD3 media la .citotoxicidad dependiente de célula T con células objetivo CD19-positivas . Esto se analizó in vitro para la determinación de la potencia biológica de anti-CD19xanti-CD3. Para estos propósitos, células diana NALM-6 CD19-positivas etiquetadas con fluorescencia se incubaron con PBMC aislado de donadores aleatorios o células CB15 (línea de célula T estandarizada) como células efectoras en la presencia de anti-CD19xanti-CD3. Después de incubar por 4 h a 37 grados C en un incubador humidificado, la liberación del colorante fluorescente de las células diana en el sobrenadante se determina en un espectrofluorímetro. Las células diana incubadas sin anti-CD19xanti-CD3 y células diana totalmente lisadas por la adición de saponina al final de la incubación sirven como controles negativo y positivo, respectivamente. La citotoxicidad específica mediada a una cierta concentración anti-CD19xanti-CD3 puede calcularse con la siguiente fórmula: RFU (Muestra) - RFU Promedio citotoxicidad (control) específica % = x 100 RFU promedio (lisis total) - RFU Promedio (control) La respuesta de dosis se analiza a partir de 0.4 pg/ml anti-CD19xanti-CD3 a 100 ng/ml anti-CD19xanti-CD3 para especificar el valor EC50. Aunque el valor EC50 describe la potencia biológica de anti-CD19xanti-CD3 , el valor absoluto variará significativamente dependiendo de la fuente de las células efectoras. De esta manera, una potencia relativa se calcula en comparación con un material de referencia anti-CD19xanti-CD3 basado en la siguiente fórmula: Muestra EC50 Potencia relativa = Referencia EC50 Las actividades citotóxicas de las construcciones que comprenden anti-CD19 y anti-CD3 des-inmunizados se ilustran en la Figura 13. anti-CD19xanti-CD3 no desinmunizado purificado se utiliza como control. Los valores EC50 de las construcciones desinmunizadas estuvieron en un intervalo de 21.9-81.6 pg/ml mientras que el EC50 de la construcción anti-CD19xanti-CD3 no desinmunizada fue 22.7 pg/ml. De esta manera, todas las construcciones desinmunizadas revelaron valores EC50 comparables con la molécula no-desinmunizada.
Ejemplo 6. Ensayo de proliferación de célula T Veinte donadores sanos se seleccionaron para monitoreo en ensayos de células T con base en tipado HLA-DR (Tabla 12) . Esto permite la supervisión de péptidos en el ensayo de célula T contra más de 80% de alelos DR expresados en la población mundial . Tabla 12: Haplotipos HLA DR de 20 donadores sanos empleados para probar la inmunogenicidad de péptidos obtenidos de anti-CD3 scAb no-des-inmunizados y des-inmunizados .
Alotipo HLA DR 1 DRB1*07, DRB1*15, DRB4*01, DRB5 2 DRB1*03, DRB1*04, DRB3, DRB4*01 3 DRB1*04, DRB1*07 y DRB4*01 4 DRB1*07, DRB1*11, DRB4*01 5 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01 6 DRB1*01, DRB1*04, DRB4*01 7 DRB1*03, DRB1*07, DRB3, DRB4*01 • 8 DRB1*07, DRB1*11, DRB3, DRB4*01 9 DRB1*12. DRB1*15, DRB3, DRB5 0 DRB1*01, DRB1*09, DRB4*01 1 DRB1*03, DRB1*15, DRB3, DRR5 12 DRB1*10, DRB1*13, DRB3 13 DRB1*03, DRB1*15, DRB3, DRB5 14 DRB1*04, DRbl*15, DRB4*01, DRB5 15 DRB1*04, DRB1*13, DRB3, DRB4*01 16 DRB1*01, DRB1*13, DRB3 17 DRB1*01, DRB1*04, DRB4*01 18 DRB1*07, DRB1*13, DRB3, DRB4*01 19 DRB1*07, DRB1*16, DRB4*01, DRB5 20 DRB1*04, DRB1*15, DRB4*01, DRB5 6.1 Ensayo de Proliferación de Células T Se obtuvieron péptidos de Pepscan (Holanda) a una pureza mayor a 90%. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los 20 donadores sanos selectos (Tabla 12) se emplearon para supervisar péptidos individuales en pozos triplicados a 1 y 5 µ M . Dos péptidos de control positivos (C32 y C49) y hemocianina de erizo de mar (KLH) se incluyeron en el ensayo. Después de 7 días de incubación de células y péptidos, un pulso de 18 horas con 3H-timidina a I Ci/pozo se empleó para estimar la proliferación de célula T. Estos datos se expresan como índice de estímulo en donde: índice de estímulo = CPM de péptido de prueba / CPM de control sin tratar.
Un epítopo de célula T se define como un péptido que da un índice de estímulo (SI) mayor a 2. Los resultados de dos corridas independientes indican que 5 de los 22 péptidos de enlace MHC en la secuencia anti-CD3 no desinmunizada tuvieron la capacidad por inducir proliferación de célula T humana (SI>2) . En contraste, ningunas de las moléculas desinmunizadas correspondientes inducen proliferación de célula T. La Tabla 13 resume en los resultados de ensayo de proliferación de célula T mostrando valores SI Promedio de 2 corridas independientes . Los datos también mostraron un efecto dependiente de concentración con lo que cada una de moléculas de enlace no-desinmunizadas mostraron SI's > 2 en solo una de las dos concentraciones (1 µm o 5 µm) empleadas. La diferencia en respuesta a diferentes concentraciones se explica por el hecho de que péptidos individuales tendrán ' concentraciones óptimas en las cuales inducen proliferación de célula T. Si esta concentración se excede, entonces la proliferación puede disminuir (altas concentraciones de péptido pueden tener un efecto inhibitorio en la proliferación de célula T) . Esto explica porque, en algunos casos, se ve proliferación a la menor concentración y no a la mayor. Por la experiencia, la proliferación de célula T se observará en una o dos de las concentraciones de péptido empleadas si un péptido contiene un epítopo de célula T. Estos datos demuestran que la desinmunización ha retirado exitosamente epítopos de célula T de anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO. :19) y anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID N0.:25). El hecho de que aproximadamente 75% de péptidos de enlace MHC de la secuencia anti-CD3 no-desinmunizada no induce proliferación de célula T, puede explicarse ya sea por tolerancia del sistema inmune humano a estos péptidos o una incapacidad del repertorio de célula T humano para reconocer estos péptidos particulares. Tabla 13 : Compendio de datos que comparan péptido de ratón positivos (SI>2) y péptidos desinmunizados correspondientes.
Ejemplo 7. Alineamiento de homología de anti- CD3 (VH5), anti-CD3 (VH7) , anti-CD3 (VH2) y anti-CD3 (VH3) con el anti-CD3 VH no desinmunizado La región pesada variable del anticuerpo CD3 no-desinmunizado, VH5 (SEQ ID NO.: 74), VH7 (SEQ ID NO.:76), VH2 (SEQ ID NO.:70) y VH3 (SEQ ID NO.:72) se alineó utilizando el programa AlingnX de Vector NTI Advance (Informax, Inc., USA). El algoritmo Clustal W empleado se describe en Nucleic Acid Research, 22 (22) : 4673-4860, 1994. El alineamiento se ilustra en la Figura 14. Del alineamiento puede verse que las regiones variables VH5 y VH7, que muestran enlaces sorprendentemente bueno, tienen la secuencia ASGYTF en la región de transición del marco 1 a CDRl. Además, las regiones VH no muestran enlace (VH2 (SEQ ID NO.:70) y VH3 (SEQ ID NO.: 72)) comprenden la secuencia ASGYTA en la transición del marco 1 a CDRl. De esta manera, para obtener una construcción que tiene propensión reducida para generar epítopos de célula T y enlace a CD3 , la construcción tiene que comprender la secuencia ASGYTF en la transición de marco 1 a CDRl. De manera sorprendente, las regiones pesadas variables que ligan a CD3 y que muestran propensión reducida para generar epítopos de célula T comprenden la secuencia ASGYTF anteriormente mencionada muestran buen enlace . Ejemplo 8. Clonación de construcciones que comprenden anti-CD3 y anti-EpCAM desinmunizado A fin de demostrar que el polipéptido anti-CD3 desinmunizado de la invención puede ser parte de una construcción funcional con otras dianas, una cantidad de construcciones biespecíficas que comprenden anti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizadas (SEQ ID NO. : 19) y anticuerpos de cadena sencilla anti-EpCAM diferentes (3-1 (SEQ ID NO.:137, 139), 3-5 (SEQ ID NO.: 141, 143), 4-1 (SEQ ID NO. -.145, 147), 4-7 (SEQ ID NO..-149, 151), 5-10 (SEQ ID NO.:133, 135)) se generaron. 8.1 Clonación de enlazadores EpCAM C-terminal que comprenden parte anti-CD3 desinmunizada (SEQ ID NOs.: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39) 8.1.1 Amplificación del anti-CD3 desinmunizado a partir de la construcción anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO. :192) El anti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizado E-terminal se obtiene por PCR utilizando (CD19 x anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO: 192) desinmunizado como plantilla y los siguientes cebadores (DI CD3 5-2 VH BsrGI AGGTGTACACTCCGACGTCCAACTGGTGCAGTCAG (SEQ ID NO.: 40), DI CD3 5-2 VL BspEl AATCCGGATTTGATCTCCACCTTGGTCCCG (SEQ ID NO. :41) . 8.1.2. Clonación y expresión de las construcciones desinmunizadas anti-CD3xanti-EpCAM desinmunizado en orientación VHCD3-VLCD3 x VHEpCAM-VLEpCAM El producto PCR anteriormente mencionado que contiene el anti-CD3 desinmunizado se escindió con las enzimas de restricción BsrGl y BspEl y subsecuentemente clonó en el vector bluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA) , que contiene la secuencia de amino ácidos de una señal secretoria eucariótica (péptido líder) como un fragmento EcoRI/BsrGI . Después de escisión de esta construcción con EcoRI y BspEl, el fragmento DNA resultante que comprende anti-CD3 scFv respectivo con el péptido líder se clonó en el plásmido escindido con EcoRl/BspEI que contiene el anti EpCAM scFv 3-1, 4-7, o 5-10 en la posición C-terminal en el vector pEF-DHFR. Después de confirmación de la codificación de secuencia para la cadena sencilla biespecífica por secuenciado (Sequiserve, Vaterstetten) el plásmido se transfecta en células CHO deficientes DHFR para expresión eucariótica. Expresión de proteína eucariótica en células CHO o deficientes en DHFR se realizó como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566). 8.1.3. Clonación y expresión de las construcciones anti-CD3xanti-EpCAM desinmunizadas en orientación VHCD3-VLCD3 x VLEpCAM-VHEpCAM Anti-EpCAM 4-7 en orientación VL-VH que contiene el enlazador estándar de 15 amino ácidos (SEQ ID NO. :168) se obtiene por PCR. La región 4-7 VH y la región 4-7 VL se amplifican por separado por los siguientes cebadores (4-7 VL: 4-7 VL BspEl FOR CTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC (SEQ ID NO.: 117), 4-7 VL GS15 REV GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCA CCACCTTTGATCTCAAGCTTGGTCCCC (SEQ ID NO.:118); 4-7 VH: 4-7 VH GS15 FOR GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAG (SEQ ID NO.: 42), 4-7 VH Salí REV TTTTAAGTCGACCTAATGATGATGAT-GATGATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO. : 43) ) . Secuencias complementarias superpuestas introducidas en los productos PCR se emplearon para formar la secuencia de codificación de un enlazador de 15 amino ácidos (G4S1)3 (código de amino ácido de una sola letra) (enlazador estándar) (SEQ ID NO. :168) durante la PCR de fusión subsecuente. Esta etapa de amplificación se realiza con el par de cebador 4-7 VL BspEl FOR y 4-7 VH Salí REV (SEQ ID Nos. 42 y 43) . Anti-EpCAM 5-10 en orientación VL-VH que contiene el enlazador estándar de 15 amino ácidos ((G4S1)3) se obtiene por PCR. La región 5-10 VH y la región 5-10 VL se amplificaron por separado por los siguientes cebadores (5-10 VL: 5-10 VL BspEl FOR CTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCAT (SEQ ID NO.:44), 5-10 VL GS15 REV GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCAAGCTTGGTCCCAG; (SEQ ID NO. -.45) 5-10 VH: 5-10 VH GS15 FOR GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGCAGCTGCTCGAGC (SEQ ID NO.:46), 5-10 VH Salí REV TTTTAAGTCGACCTAATGATGATGATGATGATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO.:47) . Secuencias complementarias de superposición introducidas en los productos PCR se emplearon para formar la secuencia de codificación de un enlazador de 15-amino ácidos (G4S1)3 (código de amino ácido de una sola letra) (enlazador estándar) (SEQ ID NO. :168) durante la PCR de fusión subsecuente. Esta etapa de amplificación se realiza con el par cebador 5-10 VL BspEl FOR y 5-10 VH Salí REV. Los productos PCR 5-10 VL-VH y 4-7 VL-VH) se clonaron en el vector pEF-DHFR que comprende la construcción anti-CD3 (VH5/VL2) . Después de confirmación de la codificación de secuencia para la cadena sencilla biespecífica por secuenciado, el plásmido se transfectó en células CHO deficientes DHFR para expresión eucariótica. Expresión de proteína eucariótica en células CHO deficientes en DHFR se realiza como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566) . 8.1.4. Enlace de construcciones anti-CD3xanti-EpCAM desinmunizadas a EpCAM y CD3 El enlace de moléculas de cadena sencilla biespecíficas con la parte anti-CD3 en orientación N-terminal a EpCAM y CD3 se confirmó por análisis FACS. Para este propósito, la línea celular de cáncer gástrico humano positiva EpCAM Kato III (ATCC HTB-103) se empleó. El enlace de la parte anti-CD3 se demostró en células Jurkat (ATCC TIB 152) . Se cultivaron células de acuerdo con las recomendaciones del proveedor de una cantidad de 200000 células se incuba con 10 µg/ml de la construcción en 50 µl PBS con FCS al 2% (suero bovino fetal) . El enlace de la construcción se detecta con un anticuerpo anti-His (Penta-His Antibody, obtenido de Qiagen, Hilden, FRG) a 2 µg/ml en PBS con FCS al 2%. Como una segunda etapa, F(ab')2 purificada por afinidad conjugada con R-Ficoeritrina derivada de IgG anti-ratón cabra, diluida 1:100 en 50 µl de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburg, FRG) se empleó. Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG) . Resultados del análisis FACS se ilustran en la Figura 15. Todas las construcciones que comprenden la parte anti-CD3 desinmunizada mostraron más fuerte enlace que el anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti- EpCAM (M79)xanti-CD3 no desinmunizado en células Kato III positivas EpCAM. 8.2 Clonación de enlazadores EpCAM N-terminal que comprenden parte anti-CD3 desinmunizada 8.2.1 Clonación de las construcciones anti-EpCAM x anti- CD3 8.2. 1. 1 Clonación de construcción 3 -lxanti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizada (SEQ ID NO. : 48, 49) : La construcción 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizada (SEQ ID NO. : 48) se deriva de la construcción no-desinmunizada anti-EpCAM (3-l)xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 3-1 se ilustran en SEQ ID NO.:137 y 139. Los plásmidos pEF-DHFR-3-lx anti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 192) se digirieron con BspEl y Salí (Biolabs) para el aislamiento del vector y el inserto anti-CD3 (VH5/VL2) , respectivamente. El vector digerido con BspEI-SalI, se desfosforila y purifica en gel de agarosa al 0.7%, mientras que el inserto se purificó en gel de agarosa al 1.5%. El fragmento purificado (BspEl-Salí) subsecuentemente se clonó en los sitios correspondientes del vector pEF-DHFR. La construcción final 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:48, 49) se verificó por digestiones de restricción y por secuenciado de ADN de todo el inserto. Clonación de la construcción 3-lxanti-CD3 no desinmunizada: Para la clonación de la construcción 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) la construcción no-deisnmunizada correspondiente se generó como sigue . 3-1 C~terminal en orientación VH-VL se obtiene or PCR para la construcción de 3-1 x molécula anti-CD3 no desinmunizado. Fragmentos I y II que comprenden 3-1 VH-VL en dos partes se amplificaron por PCR utilizando pares cebadores me 91a (SEQ ID NO.: 53) /me 90 (SEQ ID NO.: 52) y me 83 (SEQ ID NO.: 50) /me 84 (SEQ ID NO.: 51), respectivamente. PCR de inicio en caliente se realizó utilizando el Expand High Fidelity System of Roche Diagnostics. 20 ciclos (94 grados C/30 seg; 60 grados C/1 min; 72 grados C/1 min) se emplearon para amplificación seguido por un ciclo de 3 min a 72 grados C. Los fragmentos PCR I y II se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1.5%. Los fragmentos se mezclaron (1 ng de cada uno) y emplearon como una plantilla para la siguiente reacción PCR realizada con el par cebador me 91a (SEQ ID NO. : 53) y me 84 (SEQ ID NO. : 51) para amplificación del fragmento III que comprende todo el 3-1. PCR se realizó como se describió anteriormente, pero con la temperatura de fijación de 68 grados C. El fragmento III se purificó en un gel de agarosa y digirió con BsrGI y BspEl (Biolabs) , purificó y subsecuentemente clonó en los sitios correspondientes de la construcción pEF-DHFR-anti EpCAM (M79) X anti-CD3. La región clonada se verificó por digestiones de restricción y por secuenciado de ADN. Secuencias de los cebadores empleados : Me 83: 5 " - GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAG GTG CAG CTG CTC GA CAG TCT G -3' (SEQ ID NO . : 50) Me 84: 5'- GTG CTC CGG AGG AGA CGG TGA CCG TGG TCC CTT GGC CCC AG -3' (SEQ ID NO. : 51) Me 90: 5 " - CCG GAG CCG CCG CCG CCA GAA CCA CCA CCA CCT TTG ATC TCA AGC TTG GTC CC -3' (SEQ ID NO . : 52) Me 91a: 5 " - GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT CAT GAC CCA GTC TCC ATC TTA TCT TGC TGC -3 " (SEQ ID NO . : 53) 8.2.1.2 Clonación de la construcción 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:54, 55): El 3-5 C-terminal en orientación VH-VL se obtiene por PCR para la construcción de la molécula 3-5 xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo 3-5 anti-EpCAM se ilustran en SEQ ID NO.: 141 y 143. Los plásmidos pEF-DHFR-3-5xanti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 192) se digirieron con EcoRI y BspEl (Biolabs) para el aislamiento del inserto (3-5) y el vector, respectivamente. El vector desfoforilado (digerido con EcoRI y BspEl) y el inserto se purificaron por electroforesis de gel agarosa. El fragmento purificado (EcoRI-BspEI) subsecuentemente se clonó en los sitios correspondientes del vector pEF-DHFR. La construcicón final 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:54) se verifica por digestiones de restricción. Clonación de la construcción 3-5xanti-CD3 no desinmunizado : Para clonación de la construcción 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) , la construcción no desinmunizada correspondiente se genera como sigue . Los fragmentos I y II que comprenden 3-5 en dos partes se amplificaron por PCR de acuerdo con las condiciones descritas para 3-lxanti-CD3 utilizando pares cebadores me 81 (SEQ ID NO.: 56) /me 90 (SEQ ID NO.: 52) y me 83 (SEQ ID NO. : 50) /me 84 (SEQ ID NO . : 51) respectivamente . Fragmentos de gel de agarosa que comprenden fragmentos PCR I y II se reamplificaron con el par cebador me 81 (SEQ ID NO.: 56) y me 84 (SEQ ID NO.: 51) para amplificación del fragmento III que comprende todo 3-5. PCR se realiza como se describió anteriormente. El fragmento III se purifica en un gel de agarosa y digiere con BssHII y BspEl (Biolabs) , purifica y subsecuentemente clona en los sitios correspondientes del vector de clonación pEF-DHFR. La región clonada se verifica por digestiones de restricción y por secuenciado de ADN. Secuencia del cebador Me81 (Seq ID NO. :56) : Me 81: 5'- GGA TGC GCG CGA GCT CGT GAT GAC CCA GAC TCCA CTC TCC -3 " 8.2.1.3 Clonación de la construcción 4-lxanti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizada (SEQ ID NO. :57, 58): El 4-1 C-terminal en orientación VH-VL se obtiene por PCR para la construcción de la molécula 4- lxanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo 4-1 anti-EpCAM se muestran en SEQ ID N0.:145 y 147. Los plásmidos pEF-DHFR-4-lxanti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 192) se digirieron con EcoRI y BspEl (Biolabs) para el aislamiento del inserto (4-1) y el vector respectivamente. El vector desfoforilado (digerido con EcoRI y BspEl) y el inserto se purificaron por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento purificado (EcoRI-BspEl) subsecuentemente se clonó en los sitios correspondientes del vector. La construcción final 4-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:57) se verifica por digestión de restricción. Clonación de la construcción 4-lxanti-CD3 no desinmunizada : Para clonar la construcción 4-lxanti-CD3 (VH5/VL2) la construcción no desinmunizada correspondiente se genera como sigue . Los fragmentos I y II que comprenden 4-1 en dos partes se amplificaron por PCR utilizando pares cebadores me 91a (SEQ ID NO.: 53) /me 90 (SEQ ID NO.: 452) y me 83 (SEQ ID NO.: 50) /me 84 (SEQ ID NO.: 51) con las condiciones anteriormente mencionadas, respectivamente. Fragmentos de gel de agarosa que comprenden los fragmentos PCR I y II se reamplificaron con el par cebador me 92a (SEQ ID NO.: 59) y me 84 (SEQ ID NO.: 51) para amplificación del fragmento III que comprende todo el 4-1. PCR se realiza como se describe anteriormente, pero el fijado se realizó a 68 grados C. El gragmento III se purifica en un gel de agarosa y digiere con BsrGI y BspEl (Biolabs) , purifica y subsecuentemente clona en los sitios correspondientes de la construcción de vector de clonación pEF-DHFR-anti EpCAM (M79) X anti-CD3. La región clonada se verifica por digestiones de restricción y por secuenciado de ADN. Secuencia del cebador Me92a (SEQ ID NO. : 59) : Me 92a: 5'- GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT GAT GAC AC GTCTCC ATC CTC C -3' 8.1.2.4 Clonación de la construcción 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizada (SEQ ID NO.:60, 61): El 4-7 C-terminal en orientación VH-VL se obtiene por PCR para la construcción de 4-7 xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 4-7 se ilustran en SEQ ID NO.: 149 y 151. Los plásmidos pEF-DHFR-4-7xanti-CD3 y pEF anti-CD3 VH5/VL2 (SEQ ID NO.:192) se digirieron con EcoRI y BspEl (Biolabs) para el aislamiento del inserto (4-7) y el vector respectivamente. El vector desfosforilado (digerido con EcoRI y BspEl) y el inserto se purificaron por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento purificado (EcoRI-BspEl) subsecuentemente se clonó en los sitios correspondientes del vector pEF-DHFR. La construcción final 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:60) se verifica por digestiones de restricción. Clonación de la construcción no desinmunizada 4-7xanti-CD3 : Para clonación de la construcción 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) se generó la construcción no-desinmunizada correspondiente como sigue. Los fragmentos I y II que comprenden 4-7 en dos partes, se amplificaron por PCR utilizando pares cebadores me 81 (SEQ ID NO.:56) /me 90 (SEQ ID NO.:52) y me 83 (SEQ ID NO.:50) /me 84 (SEQ ID NO.: 51) con las condiciones anteriormente mencionadas, respectivamente. Fragmentos de gel de agarosa que comprenden fragmentos PCR I y II se reamplificaron con el par cebador me 81 (Seq ID NO.:56) y me 84 (Seq ID N0.:51) para amplificación del fragmento III que comprende todo el 4-7 cadena VH y VL. PCR se realiza como se describe anteriormente. El fragmento III se purifica en un gel de agarosa y digiere con BssHII y BspEl (Biolabs) , purifica y subsecuentemente clona en los sitios correspondientes del vector de clonación pEF-DHFR. La región clonada se verifica por digestiones de restricción y por secuenciado de ADN. 8.1.2.5 Clonación de la construcción 5-10x anti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizada (SEQ ID NO.: 62, 63): El 5-10 C-terminal en orientación VH-VL se obtiene por PCR para la construcción de la molécula 5-10 xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 5-10 se ilustran en SEQ ID NO.: 133 y 135. Los plásmidos pEF-DHFR-5-10xanti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.: 192) se digirieron con EcoRI y BspEl (Biolabs) para el aislamiento del inserto (5-10) y el vector respectivamente. El vector desfosforilado (digerido con EcoRI y BspEl) y el inserto se purificaron por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento purificado (EcoRI-BspEl) subsecuentemente se clona en los sitios correspondientes del vector pEF-DHFR. La construcción final 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO..- 62) se verifica por digestiones de restricción y por secuenciado de ADN. Clonación de la construcción 5-10xanti-CD3 no-desinmunizada : Para clonar la construcción 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) , la construcción no-desinmunizada correspondiente se genera como sigue . Los fragmentos I y II que comprenden 5-10 en dos partes se amplificaron por PCR utilizando pares cebadores me 92a (SEQ ID NO.: 59) /me 90 (SEQ ID NO.: 52) y me 83 (SEQ ID NO. : 50) /me 84 (SEQ ID NO. : 51) con las condiciones anteriormente mencionadas, respectivamente. Fragmentos de gel de agarosa que comprenden fragmentos PCR I y II se reamplificaron con el par cebador me 92a SEQ ID NO.: 59) y me 84 (SEQ ID NO.: 51) para amplificación de fragmento III que comprende todo el 5-10. PCR se realiza como se describió anteriormente pero el fijado se realiza a 68 grados C. El fragmento III se purifica en un gel de agarosa y digiere con BsrGI y BspEl (Biolabs) , purifica y subsecuentemente clona en los sitios correspondientes del vector de clonación pEF-DHFR-anti EpCAM (M79) x anti-CD3. La región clonada se verifica por digestiones de restricción y por secuenciado de ADN. 8.2.2 Expresión de moléculas anti EpCAMx desinmunizada-anti-CD3 con anti-EpCAM en la posición N-terminal : Células CHO que carecen del gen DHFR se mantuvieron en medio MEM alfa (Life Technologies, cat.no: 32561) suplementadas con suero bovino fetal al 10% (Life Technologies, termo inactivadas a 65 grados C por 30 minutos) y con HT (Hypoxanthin and Thymidine; Life Technologies) . Las células se transfectaron con pEF-DHFR-3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO. : 48) y pEF-DHFR- 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:62), utilizando Lipofectamina 2000 kitR (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones que se proporcionan por el fabricante. Después de 48 horas, se realizó selección en el medio de selección (medio alfa MEM que contiene suero bovino fetal dializado al 10% termo inactivado (Life Technologies) . Después de 3-4 semanas del sobrenadante de cultivo celular se recolecta y centrifuga a 4 grados C por 10 minutos a 300 g para retirar células y desechos celulares . El sobrenadante que contiene el anticuerpo biespecífico se almacena a -20 grados C hasta mayor análisis . 8.2.3 Ensayos de enlace de variantes anti-EpCAMxanti-CD3 biespecíficas : 250000 células Jurkat (para enlace CD3) y células Kato (para enlace EpCAM) se incubaron independientemente con sobrenadantes de cultivo celular (50 µl) que contiene una construcción biespecífica (pEF- DHFR-3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (Nr.50, SEQ ID NO.: 48) y pEF-DHFR-5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (Nr.54) (SEQ ID NO.:62), respectivamente) por 45 minutos a 4 grados C.
Posteriormente, las células se lavaron dos veces en amortiguador FACS (salino amortiguado con fosfato que contiene suero bovino fetal al 1% (FCS) y azida de sodio 0.05%) e incubó con anticuerpo anti-His ratones (Dianova, DIA910) por 60 minutos a 4 grados C. Se realizaron etapas de lavado como con anterioridad. Las células finalmente se incubaron ya sea con anticuerpo conjugado-FITC-Ig anti-ratón cabra (BD 550003) o con IgG anti-ratón conjugado con PE (Sigma, P8547) . Después de etapas de lavado, 10000 eventos se analizaron utilizando FACS Calibur (B&D) . Los resultados de los ensayos de enlace se muestran en la Figura 16. Las construcciones 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO.:49) y 5-.10xanti-CD3 (SEQ ID NO.: 63) mostraron fuerte enlace CD3 en células Jurkat y a CD19 en células Kato. Ejemplo 8.3. Purificación de construcciones anti EpCAM biespecíficas con la parte anti-CD3 desinmunizada Las construcciones que comprenden una región anti-CD3 desinmunizada y una región específica EpCAM se purificaron con un proceso de purificación de dos etapas que incluye cromatografía de afinidad de metal inmovilizada (IMAC - immobilized metal affinity chromatography) y filtración de gel . La cromatografía de afinidad de metal (IMAC) y filtración de gel se llevaron a cabo como se demuestra en el Ejemplo 3.2.
Se realizó adicionalmente cromatografía de intercambio de cationes de alta resolución en una columna MiniS (Amersham) , equilibrada con amortiguador MES 20mM pH 5.5. La muestra se diluyó 1:3 con el mismo amortiguador antes de cargar en la columna. Proteína ligada se eluye con un gradiente 0-30% de NaCl 1M en amortiguador de equilibrio. Las fracciones de proteína eluídas se probaron en un ensayo de bioactividad. La Tabla 14 muestra los rendimientos de las construcciones EpCAM desinmunizadas purificadas . Todas las construcciones pudieron ser producidas eficientemente. De manera sorprendente, la construcción 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NO . : 63 ) tuvo un rendimiento extremadamente bueno de 2200 µg/1. Tabla 14. Rendimientos de construcciones EpCAM desinmunizadas Ejemplo 8.4 Ensayos de citotoxicidad de las construcciones anti-EpCAM biespecíficas con la parte anti-CD3 desinmunizada A fin de confirmar la alta bioactividad de los anticuerpos biespecíficos de la invención, un ensayo basado en FACS se llevó a cabo. Células CHO se transfectaron con molécula de adhesión de célula epitelial (EpCAM) . Un clon de célula derivado de esta transfección referido como células CHO-EpCAM, se utiliza para los experimentos . Para la prueba de cototoxicidad, células CHO- EpCAM (1.5x107) se lavaron libre de suero dos veces con PBS e incubaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich Co.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de teñir, se lavaron células dos veces con RPMI/FCS al 10%. Se contaron células y mezclaron con células efectoras CB15. El clon de célula T positivo CD4 CB15 se fue amablemente suministrado por el Doctor Fickenscher, University of Erlangen/Nuernberg, Alemania. Se cultivaron células como se recomienda por los proveedores . La suspensión de célula resultante que contiene 400.000 células objetivo y 2 x 106 efectoras por ml . 50 µl de la mezcla se emplearon por pozo en una placa de fondo redondo de 96 pozos. Se diluyeron anticuerpos en RPMI/FCS al 10% a una concentración requerida y 50 µl de estta solución se agregan a la suspensión celular. Se incuba una reacción estándar por 16 h a 37 grados C/C02 al 5%. Se agrega yoduro de propidio a una concentración final de 1 µg/ml . Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente se analizaron células por FACS. Se utilizó fluorescencia PKH26 para identificación positiva de las células diana. Se midió citotoxicidad como proporción de Pl positivo sobre todas las células diana. Curvas de respuesta de dosis sigmoidales típicamente tuvieron valores R2 >0.97 como se determina por Prism Software (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) . Los resultados de los ensayos de citotoxicidad se ilustran en las Figuras 17 y 18. Ejemplo 8.5. Comparación de la productividad de moléculas biespecíficas que comprenden una parte de enlace EpCAM y una parte de enlace CD3 desinmunizado en células CHO. A fin de determinar la productividad de la proteína de construcción desinmunizada L ELISA se realizó. Los datos de productividad se calcularon a partir de cultivos de lote 8.5.1 Cultivo Celular Líneas de células CHO que producen (CHO-DHFR-) desinmunizado y (CHO-DHFR- o CH0-K1) no desinmunizado se cultivaron en medio HyQ PF CHO LS + 4 mM L-Glutamina en un incubador de C02 al 37 grados C y C02 a 5%. Los números de células y la viabilidad se determinaron utilizando Azul Tripano . La densidad celular se ajustó a 1-20105 célula/ml. Se transfirieron células a matraces de centrifugado y de esta manera se ajustaron a condiciones de un cultivo agitado. Ajustes de parámetro operacional fueron 80 rpm, 37 grados C y C02 al 5% con gasificación en un incubador de C02. El volumen de cultivo estuvo en el intervalo de 100-500 ml y densidad celular a inoculación en el intervalo de 1-20105 células/ml. En cuanto a la sub-cultivo en matraces T, se centrifugaron y resuspendieron cultivos en medio pre-calentado fresco en cada pasaje. La densidad celular se ajusta a 1-20105 células/ml. Para análisis de datos de productividad (Tabla 15) se cultivaron células hasta 14 días (d) sin ninguna adición o intercambio de medio. Números y viabilidad de células se determinaron diariamente utilizando tinción con Azul Tripano . Concentraciones de producto en el sobrenadante se analizaron por L ELISA de proteína. 8.5.2 L ELISA de Proteína Enlace cuantitativo de las moléculas biespecíficas se llevó a cabo con placas de microtitulación revestidas rProtein L. rProtein L es una forma recombinante de la Proteína L de enlace a inmunoglobulina producida por Peptostreptococcus magnus . Tiene cuatro dominios de enlace y enlaza a inmunoglobulina a través de la cadena ligera (kappa) . Moléculas biespecíficas, que contiene dominios variables de dos cadenas ligeras diferentes, respectivamente anticuerpos padre, también se ligan por rProtein L. Placas de microtitulación se revistieron con rProtein L en amortiguador PBS (2 µg rProtein L/ml de amortiguador PBS) durante la noche a 2-8 grados C. Después de revestir, se bloquearon sitios de adsorción restantes con amortiguador de bloqueo (BSA al 2% en amortiguador PBS) . Después, las placas se congelaron y almacenaron a <18 grados C. Antes de uso, las placas se descongelaron y lavaron con amortiguador de lavado (Tween 20 0.05% en amortiguador PBS) para retirar la mezcla de la solución de revestimiento y amortiguador de bloqueo. Diluciones seriales de sobrendante de cultivo celular libre de células en BSA al 1% + Tween 20 0.01% en PBS (amortiguador de dilución) fueron analizadas. Anti-EpCAM (M79) xanti-CD3 biespecíficos se empleó como control positivo en diluciones comparables . La incubación se realizó durante la noche a 2-8 grados C . Después de lavar IgG anti-ratón conejo (1:5,000 en amortiguador de dilución) se agregó e incubó por 60 min a temperatura ambiente. IgG anti-conejo cabra etiquetado con fosfatasa alcalina se agrega (1:1,000 en amortiguador de dilución; 60 min a temperatura ambiente) después de lavar. Solución de substrato pNPP se agrega y la reacción se detiene por adición de NaOH 3M. Se midió absorbancia con un lector de ELISA a 405 nm (filtro de referencia 492 nm) . Tabla 15. Productividad de una construcción anti-EpCAM des-inmunizado Construcción M79xanti-anti-CD3 5-10xant?-CD3 (VH5/VL2) Línea celular CHO-K1 CHO-dhfr- CHO-dhfr-básica Productividad 0.2-0.6 1-3 15-20 pg/cell per específica pg/célula pg/célula día por día por día Densidad 3x10b 1.2- 1.5x10" c/ml celular máxima c/ml 1.8xl06 c/ml Tiempo de 17-20 h 25-30 h 25-30 h duplicación De esta manera, la construcción 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) de la invención demostró una productividad específica muy superior (cuando menos cinco veces superior) que el anticuerpo de enlace EpCAM y CD3 no desinmunizado y específico de la técnica previa.

Claims (41)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una construcción de enlace específica de CD3 citotóxicamente activa que comprende un primer dominio que liga específicamente con CD3 humano y un segundo dominio de enlace derivado de Ig, en donde el primer dominio está desinmunizado y comprende una región CDR-Hl , una región CDR-H2 y una región CDR-H3 , la región CDR-H3 comprende una secuencia de amino ácidos como se ilustra en SEQ ID NO.: 96, 108,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, o 127; y en donde el primer dominio además comprende en su marco Hl la secuencia de VKK en donde la secuencia de transición entre el marco Hl y la región CDRH1 comprende la secuencia Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEQ ID NO . : 233). 2. La construcción de enlace específica de CD3 citotóxicamente activa de la reivindicación 1, caracterizada porque comprende en el primer dominio, un marco H3 que comprende la secuencia Met-Glu-Leu-Ser
  2. (MELS; SEQ ID NO . : 234) . 3. La construcción de enlace específica de
  3. CD3 citotóxicamente activa de la reivindicación 1 o 2 , caracterizada porque comprende en el primer dominio, un marco H3 que comprende la secuencia Ile-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEQ ID NO . : 235) .
  4. 4. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el primer dominio que liga específicamente con CD3 humano comprende un marco Hl como se ilustra en SEQ ID NO. : 152 o 153.
  5. 5. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el primer dominio que liga específicamente a CD3 humano comprende un marco H2 como se ilustra en SEQ ID NO. : 156 o 157.
  6. 6. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el primer dominio que liga específicamente a CD3 humano comprende un marco H3 como se ilustra en SEQ ID NO. : 160 o 161.
  7. 7. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el primer dominio que liga específicamente a CD3 humano comprende un marco H4 como se ilustra en SEQ ID NO.: 164 o 165.
  8. 8. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la construcción comprende (a) un CDR-Hl como se ilustra en SEQ ID NO. : 88; y (b) un CDR-H2 como se ilustra en SEQ ID NO. : 90 o 92.
  9. 9. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la construcción comprende una región VH como se ilustra en SEQ ID NO.: 74 o 76. 10. La construcción de enlace específica de
  10. CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la construcción comprende un CDR-L1 como se ilustra en SEQ ID NO.: 98 o 100.
  11. 11. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la construcción comprende un CDR-L2 como se ilustra en SEQ ID NO.: 102.
  12. 12. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la construcción comprende un CDR-L3 como se ilustra en SEQ ID NO.:104.
  13. 13. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque comprende una región VL en su porción específica de CD3 , en donde la región VL se elige del grupo que consiste de SEQ ID NO.: 78, SEQ ID NO.: 80, SEQ ID NO.: 82 y SEQ ID NO.: 112.
  14. 14. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 , caracterizada porque el segundo dominio derivado de Ig es un scFv.
  15. 15. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque el segundo dominio derivado de Ig y/o (a) que conecta una o varias regiones enlazadoras es o son humanizados y/o des-inmunizados.
  16. 16. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque el segundo dominio derivado de Ig comprende un sitio-de-interacción-antígeno con especificidad para una molécula de superficie celular.
  17. 17. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la molécula de superficie celular es un marcador específico de tumor.
  18. 18. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17 , caracterizada porque el segundo dominio de enlace derivado de Ig comprende un sitio de interacción-de-antígeno con una especificidad para una molécula seleccionada del grupo que consiste de EpCAM, CCR5 , CD19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA,, MUC-1 (mucina) , MUC2 , MUC3 , MUC4 , MUC5ñC, MUC5B, MUC7 , ßhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliósido GD3, 9-0-Acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GMl, Poli SA, GD2, Carboanhidrasa IX (MN/CA IX) , CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh) , Wue-1, Antígeno de Células de Plasma, IgE (ligado a membrana) , Condroitina Sulfato Proteoglicano de Melanoma (MCSP) , CCR8, alfa precursor-TNF, STEAP, mesotelina, Antígeno A33, Antígeno de Células Madre de Próstata (PSCA) , Ly-6; desmogleina 4, neo-epítopo de E-caderina, Receptor de Acetilcolina Fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 y Receptor tipo II de Substancia Inhibitoria Muelleriana (MIS) I, sTn (antígeno Tn sialilado, TAG72) , antígeno de activación de fibroblastos (FAP - fibroblast activation antigen) , endosialina, EGFRvIII, L6, SAS, CD63 , TAG72 , antígeno TF, antígeno Cora, CD7, CD22, Iga, Ig/J, G250, gplOO, MT-MMPs, antígeno F19, C0-29 y EphA2.
  19. 19. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque el segundo dominio de enlace derivado de Ig comprende un sitio de interacción-de-antígeno con una especificidad por EpCAM.
  20. 20. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la construcción de enlace específica de CD3 comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. : 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257,.259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 y 325; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66 , 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 y 324; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (b) ; (d) y una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridizan con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo condiciones de hibridización severas.
  21. 21. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque el segundo dominio de enlace derivado de Ig comprende un sitio-de-interacción-antígeno con una especificidad pr CCR5.
  22. 22. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la construcción de enlace específica de CD3 comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 206, 208, 210, 212, 214 o 216; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 205, 207, 209, 211, 213 o 215; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado ' del código genético a una secuencia de nucleótido de (b) ; (d) y una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que - hibridizan con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo condiciones de hibridización estrictas.
  23. 23. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque el segundo dominio de enlace derivado de Ig comprende un sitio de interacción-de-antígeno con una especificidad por CD19.
  24. 24. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con la reivindicación 23 , caracterizada porque la construcción de enlace específica de CD3 comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 190, 192, 194, 196, 198,200, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, ' 351, 353, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407 o 409; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO.: 189, 191, 193, 195, 197, 199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 o 408; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (b) ; (d) y una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo condiciones de hibridización estrictas .
  25. 25. La construcción de enlace específica de CD3 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque el segundo dominio de enlace derivado de Ig comprende un sitio de interacción-de-antígeno con una especificidad para CD20.
  26. 26. La construcción de enlace específica de CD3 de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la construcción de enlace específica de CD3 comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo de (a) una secuencia de amino ácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. : 218, 220, 222, 224, 226, o 228; (b) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. : 217, 219, 221, 223, 225 o 227; y (c) una secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de (b) ; (d) y secuencia de amino ácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza con la hebra complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en (b) bajo condiciones de hibridización estrictas.
  27. 27. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una construcción de enlace específica de CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.
  28. 28. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 27.
  29. 29. El vector de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque además comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia regulatoria que está enlazada operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 27.
  30. 30. El vector de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el vector es un vector de expresión.
  31. 31. Un anfitrión transformado o transfectado con un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30.
  32. 32. Un proceso para la producción de una construcción de enlace específica de CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, el proceso se caracteriza porque comprende cultivar un anfitrión de la reivindicación 31, bajo condiciones que permiten expresión de la construcción de polipéptido y recuperar la construcción de polipéptido producida a partir del cultivo .
  33. 33. Una composición que comprende una construcción de enlace específica de CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, o como se produce por el proceso de la reivindicación 32, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27, un vector de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 o un anfitrión de la reivindicación 31 y opcionalmente un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmune.
  34. 34. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque es una composición farmacéutica que además comprende, opcionalmente, formulaciones adecuadas de portador, estabilizantes y/o excipientes .
  35. 35. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque es una composición de diagnóstico que además comprende opcionalmente medios y métodos para detección.
  36. 36. Uso de una construcción de enlace específica de CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o como se produce por el proceso de la reivindicación 32, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27, un vector de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 o un anfitrión de la reivindicación 31 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un desorden inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto-contra-anfitrión o enfermedades de anfitrión-contra-injerto.
  37. 37. Un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un desorden inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto-contraanfitrión o enfermedades de anfitrión-contra-in erto, que comprende la administración a un sujeto que requiere dicha a prevención, tratamiento o mejora, de una construcción de enlace específica de CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o como se produce por el procedimiento de la reivindicación 32, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27, un vector de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 o un anfitrión de la reivindicación 31 .
  38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el sujeto es un humano .
  39. 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 o 38, caracterizado porque además comprende la administración de un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes .
  40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el compuesto proteináceo se administra simultánea o no-simultáneamente con una construcción de enlace específica de CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o como se produce por el proceso de la reivindicación 32, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27, un vector de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 o un anfitrión de la reivindicación 31.
  41. 41. Un equipo que comprende una construcción de enlace específica de CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o como se produce por el proceso de la reivindicación 32, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27, un vector de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 o un anfitrión de la reivindicación 31.
MXPA06004035A 2003-10-16 2004-10-15 Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos. MXPA06004035A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03023581 2003-10-16
PCT/EP2004/011646 WO2005040220A1 (en) 2003-10-16 2004-10-15 Multispecific deimmunized cd3-binders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA06004035A true MXPA06004035A (es) 2006-08-31

Family

ID=34486072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA06004035A MXPA06004035A (es) 2003-10-16 2004-10-15 Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos.

Country Status (24)

Country Link
US (2) US8076459B2 (es)
EP (2) EP1673398B1 (es)
JP (2) JP4948174B2 (es)
KR (2) KR20120125634A (es)
CN (1) CN100453556C (es)
AT (1) ATE493441T1 (es)
AU (1) AU2004283850C1 (es)
BR (1) BRPI0415457A (es)
CA (1) CA2542239C (es)
CY (1) CY1112891T1 (es)
DE (1) DE602004030811D1 (es)
DK (1) DK1673398T3 (es)
ES (1) ES2358427T3 (es)
HK (1) HK1086846A1 (es)
HR (1) HRP20110187T1 (es)
IL (2) IL174902A (es)
MX (1) MXPA06004035A (es)
NO (1) NO340900B1 (es)
NZ (1) NZ546173A (es)
PL (1) PL1673398T3 (es)
RU (1) RU2401843C2 (es)
SI (1) SI1673398T1 (es)
WO (1) WO2005040220A1 (es)
ZA (1) ZA200601699B (es)

Families Citing this family (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
CN101282745B (zh) 2005-07-25 2015-04-29 新兴产品开发西雅图有限公司 用cd37-特异性和cd20-特异性结合分子减少b-细胞
EP1976886B1 (en) 2005-12-16 2014-12-17 Amgen Research (Munich) GmbH Means and methods for the treatment of tumorous diseases
AU2013202375B2 (en) * 2005-12-16 2016-10-27 Amgen Research (Munich) Gmbh Means and Methods for the Treatment of Tumorous Diseases
CN101426521A (zh) * 2005-12-21 2009-05-06 医疗免疫有限责任公司 EPHA2 BiTE分子及其应用
JP5399712B2 (ja) 2005-12-21 2014-01-29 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 可溶性ｃｅａに対する抵抗性を有する医薬組成物
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
WO2008079466A1 (en) * 2006-12-20 2008-07-03 Mmr Information Systems, Inc. Antibodies and methods for making and using them
AU2013202392B2 (en) * 2006-12-20 2016-02-25 Mmrglobal, Inc. Antibodies and methods for making and using them
DE202007016718U1 (de) * 2007-02-21 2008-04-03 K.L. Kaschier- Und Laminier Gmbh Airbagdeckelscharnier mit kraftaufnehmendem System
US20100183615A1 (en) * 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
TR201816277T4 (tr) * 2007-04-03 2018-11-21 Amgen Res Munich Gmbh Çapraz-tür-spesifik bağlama alanı.
US8940298B2 (en) * 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
US20100291113A1 (en) * 2007-10-03 2010-11-18 Cornell University Treatment of Proliferative Disorders Using Antibodies to PSMA
SI2132228T1 (sl) 2008-04-11 2011-10-28 Emergent Product Dev Seatle CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
WO2010037835A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
CA2738565C (en) 2008-10-01 2023-10-10 Micromet Ag Cross-species-specific psmaxcd3 bispecific single chain antibody
PT2352763E (pt) 2008-10-01 2016-06-02 Amgen Res (Munich) Gmbh Anticorpos biespecíficos de cadeia única com especificidade para antigénios-alvo com elevado peso molecular
PL2344539T3 (pl) * 2008-11-07 2015-07-31 Amgen Res Munich Gmbh Leczenie pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej
SI2982696T1 (sl) * 2008-11-07 2019-06-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Zdravljenje akutne limfoblastne levkemije
ES2712732T3 (es) * 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
SG179027A1 (en) 2009-09-18 2012-04-27 Micromet Ag Dosage regimen for administering an epcamxcd3 bispecific antibody
CN102753194B (zh) 2009-12-02 2015-07-08 伊麦吉纳博公司 靶向人前列腺特异性膜抗原的j591微抗体和双抗体
TWI653333B (zh) * 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
SG189929A1 (en) * 2010-10-29 2013-06-28 Immunogen Inc Novel egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof
WO2012066058A1 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
US9249217B2 (en) 2010-12-03 2016-02-02 Secretary, DHHS Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules
US10239952B2 (en) * 2011-04-01 2019-03-26 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-WT1/HLA bi-specific antibody
JP2014518615A (ja) 2011-04-22 2014-08-07 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー 前立腺特異的膜抗原結合タンパク質および関連組成物ならびに方法
DE102011118022B4 (de) * 2011-06-30 2018-01-18 Gemoab Monoclonals Gmbh Antikörper gegen das Prostata-spezifische Stammzellenantigen und dessen Verwendung
CN102337298B (zh) * 2011-08-19 2013-11-06 黄开红 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
AU2012350429A1 (en) 2011-12-09 2013-07-11 Amgen Research (Munich) Gmbh Prevention of adverse effects caused by EpCAMxCD3 bispecific antibodies
CN108034006A (zh) * 2012-01-13 2018-05-15 乌利班-马克西姆利安大学 双抗原诱导的双功能互补作用
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
ES2680151T3 (es) 2012-03-01 2018-09-04 Amgen Research (Munich) Gmbh Moléculas de unión de polipéptidos de larga duración
CA2876133C (en) * 2012-06-07 2017-06-06 Duke University Human bispecific egfrviii antibody engaging molecules
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
US20150231241A1 (en) * 2012-08-14 2015-08-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
AU2013306390B2 (en) 2012-08-24 2018-07-05 The Regents Of The University Of California Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JP6499079B2 (ja) 2012-11-13 2019-04-10 バイオエヌテック アーゲーＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ クローディンを発現するガン疾患を処置するための剤
ES2681948T3 (es) * 2013-03-05 2018-09-17 Baylor College Of Medicine Células de acoplamiento para inmunoterapia
KR20210054067A (ko) 2013-06-14 2021-05-12 싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디. 유형 b 아데노바이러스에 대한 투여 요법 및 제형
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
CN104342453A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 深圳先进技术研究院 含基因工程抗体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
CA3178299A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tem8 antibodies and their use
WO2015059303A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes
CN106414500B (zh) * 2013-11-07 2020-04-10 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 抗-wt1/hla双特异性抗体
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
EP3102681B1 (en) 2014-02-07 2023-10-04 McMaster University Trifunctional t cell-antigen coupler and methods and uses thereof
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
WO2015144852A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Delenex Therapeutics Ag Binding members to tnf alpha
IL278350B (en) 2014-04-03 2022-06-01 Igm Biosciences Inc J-chain qualified
EP2930188A1 (en) * 2014-04-13 2015-10-14 Affimed Therapeutics AG Trifunctional antigen-binding molecule
US9212225B1 (en) 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
BR112017001579A2 (pt) 2014-07-25 2017-11-21 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd3 ativáveis, anticorpos anti-cd3 multiespecíficos, anticorpos anti-cd3 ativáveis multiespecíficos e métodos de uso dos mesmos
TW201609812A (zh) 2014-07-31 2016-03-16 安美基研究（慕尼黑）公司 最佳化之跨物種特異性雙特異性單鏈抗體構築體
EP3875481A1 (en) 2014-11-14 2021-09-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
MX2017006312A (es) 2014-11-17 2017-08-21 Regeneron Pharma Metodos para el tratamiento tumoral utilizando el anticuerpo biespecifico cd3xcd20.
NZ732073A (en) * 2014-12-08 2019-04-26 1Globe Biomedical Co Ltd Soluble universal adcc-enhancing synthetic fusion gene and peptide technology and its use thereof
EP3261665A1 (en) 2015-02-24 2018-01-03 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
ES2874558T3 (es) 2015-03-04 2021-11-05 Igm Biosciences Inc Moléculas de unión a CD20 y usos de las mismas
CA2980005A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to gp120 and their use
TW202311292A (zh) 2015-04-17 2023-03-16 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄｈ３與ｃｄ３之雙特異性抗體構築體
EP3466967A1 (en) 2015-05-18 2019-04-10 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EA201792581A1 (ru) 2015-05-29 2018-07-31 Амфивена Терапьютикс, Инк. Способы применения биспецифических cd33- и cd3- связывающих белков
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
US11254744B2 (en) 2015-08-07 2022-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
US11713358B2 (en) 2015-08-28 2023-08-01 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
UA126278C2 (uk) 2015-09-21 2022-09-14 Аптево Рісьорч Енд Девелопмент Ллс Поліпептиди, які зв'язують cd3
EP3356401B1 (en) * 2015-09-30 2020-06-24 IGM Biosciences, Inc. Binding molecules with modified j-chain
EP3355913A1 (en) 2015-09-30 2018-08-08 IGM Biosciences A/S Binding molecules with modified j-chain
WO2017062748A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
WO2017070943A1 (zh) * 2015-10-30 2017-05-04 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 双特异性抗体、其制备方法和用途
EP4011911A1 (en) 2015-11-03 2022-06-15 The United States of America as represented by The Secretary Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
EP3377103B1 (en) 2015-11-19 2021-03-17 Revitope Limited Functional antibody fragment complementation for a two-components system for redirected killing of unwanted cells
WO2017097723A2 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment method
KR20180108590A (ko) 2015-12-17 2018-10-04 싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디. 항-tcr-복합체 항체 또는 단편을 암호화하는 바이러스
JOP20170017B1 (ar) 2016-01-25 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh تركيب صيدلي يتضمن تركيبات جسم مضاد ثنائي الاختصاص
EP3411404B1 (en) 2016-02-03 2022-11-09 Amgen Research (Munich) GmbH Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
DK3411402T3 (da) 2016-02-03 2022-02-07 Amgen Res Munich Gmbh Bcma- og cd3-bispecifikke t-celle-engagerende antistofkonstruktioner
SG11201807548SA (en) * 2016-03-08 2018-09-27 Maverick Therapeutics Inc Inducible binding proteins and methods of use
WO2017167350A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Horst Lindhofer Multispecific antibodies for use in the treatment of a neoplasm of the urinary tract
JOP20170091B1 (ar) 2016-04-19 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh إعطاء تركيبة ثنائية النوعية ترتبط بـ cd33 وcd3 للاستخدام في طريقة لعلاج اللوكيميا النخاعية
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
KR20190053835A (ko) 2016-06-21 2019-05-20 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
KR20190022752A (ko) 2016-06-27 2019-03-06 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 암 치료 조합
BR112019000166A2 (pt) 2016-07-06 2019-10-01 Celgene Corp anticorpos com baixa imunogenicidade e usos dos mesmos
US11242376B2 (en) 2016-08-02 2022-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
IL264902B2 (en) 2016-08-29 2023-11-01 Akamis Bio Ltd Adenovirus with bispecific T cell activator
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
KR20230035706A (ko) 2016-09-14 2023-03-14 테네오원, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
ES2875959T3 (es) 2016-10-07 2021-11-11 Tcr2 Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reprogramación de receptores de linfocitos T mediante el uso de proteínas de fusión
CA3044593A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
KR20230052309A (ko) 2016-12-21 2023-04-19 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US11021535B2 (en) 2017-02-10 2021-06-01 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
KR20190141243A (ko) 2017-05-05 2019-12-23 암젠 인크 개선된 저장 및 투여를 위한 이중특이적 항체 구축물을 포함하는 약제학적 조성물
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
JP2020521791A (ja) 2017-06-02 2020-07-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療のためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体及び抗ｃｄ２０／ｃｄ３０二重特異性抗体
SG11201912774RA (en) 2017-06-20 2020-01-30 Teneobio Inc Anti-bcma heavy chain-only antibodies
GB201710836D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
GB201710835D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Antibodies
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
JP7079171B2 (ja) 2017-08-03 2022-06-01 アムジエン・インコーポレーテツド インターロイキン－２１ムテイン及び治療方法
MX2020002667A (es) 2017-09-08 2020-08-03 Maverick Therapeutics Inc Proteinas de unión condicionalmente activadas restringidas.
CA3075046A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Amgen Inc. Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
CN107501412A (zh) * 2017-10-11 2017-12-22 深圳精准医疗科技有限公司 突变型双特异性抗体及其应用
CA3078637A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University T cell-antigen coupler with y182t mutation and methods and uses thereof
MX2020003856A (es) 2017-10-13 2020-08-13 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union a antigenos de maduracion de celulas b.
GB201717966D0 (en) * 2017-10-31 2017-12-13 Xenikos Bv Immunotoxins, formulations thereof and their use in medicine
EP3724229A1 (en) 2017-12-11 2020-10-21 Amgen Inc. Continuous manufacturing process for bispecific antibody products
TW201940518A (zh) 2017-12-29 2019-10-16 美商安進公司 針對ｍｕｃ１７和ｃｄ３之雙特異性抗體構建體
EP3724223A1 (en) 2018-01-02 2020-10-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
JOP20200172A1 (ar) 2018-01-12 2020-07-12 Amgen Inc الأجسام المضادة لـ pd-1 وطرق العلاج
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
AU2019226034A1 (en) 2018-02-21 2020-10-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 Env and their use
CR20200571A (es) 2018-06-01 2021-01-18 Novartis Ag Moléculas de únion contra bcma y usos de las mismas
AU2019281019A1 (en) * 2018-06-07 2020-11-26 Oncoone Research & Development Gmbh Anti-oxMIF/anti-CD3 antibody for cancer treatment
EP3817770A2 (en) 2018-07-02 2021-05-12 Amgen Inc. Anti-steap1 antigen-binding protein
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
TW202021616A (zh) 2018-07-30 2020-06-16 美商安進公司 結合至ｃｄ３３和ｃｄ３的雙特異性抗體構建體之延長投與
EP3830122A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for bcma-cd3 bispecific antibodies
AR114541A1 (es) 2018-08-03 2020-09-16 Amgen Res Munich Gmbh Constructos de anticuerpos para cldn18.2 y cd3
MA53495A (fr) 2018-08-31 2021-12-08 Regeneron Pharma Stratégie de dosage permettant d'atténuer le syndrome de libération de cytokines pour des anticorps bispécifiques cd3/c20
CN110872356B (zh) * 2018-09-03 2023-06-13 广西慧宝源健康产业有限公司 双特异性抗体及其使用方法
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
MA53732A (fr) 2018-09-28 2022-01-05 Amgen Inc Anticorps dirigés contre bcma soluble
TW202021986A (zh) 2018-10-11 2020-06-16 美商英伊布里克斯公司 5t4單域抗體及其治療性組合物
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020076977A2 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
AU2019356564A1 (en) 2018-10-11 2021-04-29 Amgen Inc. Downstream processing of bispecific antibody constructs
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
SG11202103232WA (en) 2018-10-23 2021-05-28 Amgen Inc Automatic calibration and automatic maintenance of raman spectroscopic models for real-time predictions
BR112021008486A2 (pt) 2018-11-01 2021-10-26 Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd Anticorpo biespecífico e seu uso
EP3891181A4 (en) * 2018-12-04 2022-08-17 Novartis AG BINDING MOLECULES AGAINST CD3 AND USES THEREOF
EP3883609A2 (en) 2018-12-20 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
TW202043253A (zh) 2019-01-28 2020-12-01 美商安進公司 藉由將藥物物質和藥物產品過程整體化的生物製劑製造之連續製造過程
WO2020181140A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Maverick Therapeutics, Inc. Constrained conditionally activated binding proteins
EP3962523A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
KR20220008866A (ko) * 2019-05-14 2022-01-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. EpCAM 결합 단백질 및 사용 방법
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
US20220259329A1 (en) 2019-06-07 2022-08-18 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
AU2020290573A1 (en) 2019-06-13 2021-11-04 Amgen Inc. Automated biomass-based perfusion control in the manufacturing of biologics
UY38748A (es) 2019-06-14 2021-01-29 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
EP3994173A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies that bind egfrviii and their use
WO2021041300A2 (en) * 2019-08-23 2021-03-04 Ab Therapeutics, Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
AU2020345787A1 (en) 2019-09-10 2022-03-24 Amgen Inc. Purification method for bispecific antigen-binding polypeptides with enhanced protein L capture dynamic binding capacity
US20220389099A1 (en) 2019-11-04 2022-12-08 Amgen Inc. Methods for treating leukemia
EP3819312A1 (en) 2019-11-10 2021-05-12 Amgen, Inc Dosing regimen for anti-dll3 agents
EP3819007A1 (en) 2019-11-11 2021-05-12 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for anti-bcma agents
US20220396599A1 (en) 2019-11-13 2022-12-15 Amgen Inc. Method for Reduced Aggregate Formation in Downstream Processing of Bispecific Antigen-Binding Molecules
CA3164129A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Amgen Inc. Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
BR112022013725A2 (pt) 2020-01-13 2022-10-11 Aptevo Res & Development Llc Formulações para agentes terapêuticos proteicos
EP4090348A4 (en) * 2020-01-13 2024-05-15 Univ California METHODS FOR TREATING VIRAL INFECTIONS
EP4090368A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Aptevo Research and Development LLC Methods and compositions for preventing adsorption of therapeutic proteins to drug delivery system components
EP4093771A1 (en) 2020-01-22 2022-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
US20230071627A1 (en) 2020-02-03 2023-03-09 Amgen Inc. Multivariate Bracketing Approach for Sterile Filter Validation
WO2021183861A1 (en) 2020-03-12 2021-09-16 Amgen Inc. Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecifc antibodies binding to cds x cancer cell and tnfalpha or il-6 inhibitor
WO2021188851A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Amgen Inc. Antibodies against mucin 17 and uses thereof
EP4186564A1 (en) 2020-04-29 2023-05-31 Teneoone, Inc. Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
AU2021275049A1 (en) 2020-05-19 2022-12-22 Amgen Inc. MAGEB2 binding constructs
TW202210101A (zh) 2020-05-29 2022-03-16 美商安進公司 與ｃｄ３３和ｃｄ３結合的雙特異性構建體的減輕不良反應投與
AU2021283933A1 (en) 2020-06-04 2023-01-05 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
AU2021340708A1 (en) 2020-09-11 2023-04-13 Amgen Inc. Materials and methods to reduce protein aggregation
CA3194771A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific t-cell engaging molecules for the treatment of cancer
WO2022060878A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for treating prostate cancer
US20220168407A1 (en) 2020-11-05 2022-06-02 Dcprime B.V. Use of tumor-independent antigens in immunotherapies
KR20230104256A (ko) 2020-11-06 2023-07-07 암젠 인크 증가된 선택성의 다중표적화 이중특이적 항원 결합 분자
AU2021374036A1 (en) 2020-11-06 2023-06-08 Amgen Inc. Polypeptide constructs selectively binding to cldn6 and cd3
TW202233678A (zh) 2020-11-06 2022-09-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 具有增強的剪切特徵的多肽
CA3199931A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Amgen Inc. Polypeptide constructs binding to cd3
WO2022103781A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Amgen Inc. Methods for administering a bcma x cd3 binding molecule
JP2023550148A (ja) 2020-11-20 2023-11-30 シンシア・イノベーション・インコーポレイテッド がん免疫治療に用いられる武装二重ｃａｒ－ｔ組成物及び方法
IL303205A (en) 2020-12-03 2023-07-01 Amgen Inc IMMUNOGLOBULINE constructs with multiple binding domains
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
EP4291306A1 (en) 2021-02-09 2023-12-20 University of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
EP4291226A1 (en) 2021-02-09 2023-12-20 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Antibodies targeting the spike protein of coronaviruses
CA3208770A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Amgen Inc. Parallel chromatography systems and methods
EP4305048A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Amgen Inc. Methods for purification of recombinant proteins
CA3215594A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Agnieszka KIELCZEWSKA Mageb2 binding constructs
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
TW202244059A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
AU2022269312A1 (en) 2021-05-06 2023-10-19 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
CN117651717A (zh) 2021-05-18 2024-03-05 克里斯蒂安-阿尔伯特基尔大学 共刺激多特异性抗体
WO2022246244A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Aptevo Research And Development Llc Dosing regimens for protein therapeutics
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
WO2023044272A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
TW202326113A (zh) 2021-10-27 2023-07-01 美商安進公司 使用光譜學進行的基於深度學習的預測
CA3237018A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
CA3233696A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
WO2023087255A1 (zh) * 2021-11-19 2023-05-25 武汉友芝友生物制药股份有限公司 双特异性抗体及其应用
WO2023110918A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Cdr-Life Ag Dual mhc-targeting t cell engager
WO2023154824A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
WO2023164474A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Amgen Inc. Cancer treatment targeting dll3
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023218027A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Amgen Research (Munich) Gmbh Multichain multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity
WO2023230626A2 (en) * 2022-05-27 2023-11-30 Bighat Biosciences, Inc. Ph-selective anti-cd3 antibodies and use of the same
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024056758A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Cdr-Life Ag Mage-a4 peptide dual t cell engagers
WO2024059675A2 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Amgen Inc. Bispecific molecule stabilizing composition
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2024077044A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Amgen Inc. Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof
WO2024082269A1 (zh) * 2022-10-21 2024-04-25 武汉友芝友生物制药股份有限公司 双特异性抗体在免疫细胞治疗方面的应用
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4361549A (en) 1979-04-26 1982-11-30 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells, and methods of preparing same
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CA2095852C (en) 1990-12-05 2001-05-08 Uffe Lovborg Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
JP3854306B2 (ja) * 1991-03-06 2006-12-06 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング ヒト化及びキメラモノクローナル抗体
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5885573A (en) * 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
JP3626187B2 (ja) 1993-06-07 2005-03-02 バイカル インコーポレイテッド 遺伝子治療に適するプラスミド
CA2225460A1 (en) 1995-06-23 1997-01-09 Winston Campbell Patterson Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
AU736549B2 (en) 1997-05-21 2001-08-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method for the production of non-immunogenic proteins
DE19725586C2 (de) * 1997-06-17 1999-06-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper
PT1032660E (pt) 1997-11-17 2009-12-28 Micromet Ag Processo de identificação dos domínios do sítio de ligação que retêm a capacidade de ligação a um epítope
AU761587B2 (en) 1998-04-21 2003-06-05 Amgen Research (Munich) Gmbh CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
GB9815909D0 (en) 1998-07-21 1998-09-16 Btg Int Ltd Antibody preparation
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
DE19905048A1 (de) 1999-02-08 2000-08-10 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verwendung depletorisch oder mitogen wirkender Antikörper in der Immuntherapie
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
DE19962583A1 (de) 1999-12-23 2001-06-28 Mueller Hermelink Hans Konrad Antikörper gegen Plasmazellen
JP2004502742A (ja) 2000-07-12 2004-01-29 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション Ｂ細胞を消滅させる抗体及び免疫調節抗体を併用するｂ細胞悪性疾患の治療関連出願
GB0018901D0 (en) 2000-08-03 2000-09-20 Biovation Ltd Peptides presented by cells
MXPA03002262A (es) 2000-09-18 2003-10-15 Idec Pharma Corp Terapia de combinacion para tratamiento de enfermedades autoinmunes usando una combinacion de anticuerpos inmunorreguladores/supresores de celulas b.
KR100899970B1 (ko) 2001-02-19 2009-05-28 메르크 파텐트 게엠베하 Ｔ-세포 에피토프의 동정 방법 및 감소된 면역원성을 갖는분자의 제조를 위한 용도
HUP0303171A2 (hu) * 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Csökkentett immunogenitású mesterséges fehérjék
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US20040136908A1 (en) 2001-04-09 2004-07-15 Olson William C. Anti-cd19 immunotoxins
CN1195779C (zh) 2001-05-24 2005-04-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 抗人卵巢癌抗人cd3双特异性抗体
US7820166B2 (en) * 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
CN100509850C (zh) * 2003-05-31 2009-07-08 麦克罗梅特股份公司 用于治疗b细胞相关疾病的包含双特异性抗cd3、抗cd19抗体构建体的药物组合物
US7235641B2 (en) * 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
US20090022738A1 (en) 2009-01-22
CA2542239C (en) 2014-12-30
NZ546173A (en) 2009-04-30
US8076459B2 (en) 2011-12-13
KR101229731B1 (ko) 2013-03-07
NO20062117L (no) 2006-07-03
PL1673398T3 (pl) 2011-05-31
AU2004283850B2 (en) 2011-04-07
JP2007537714A (ja) 2007-12-27
ZA200601699B (en) 2007-05-30
IL208795A0 (en) 2010-12-30
HK1086846A1 (en) 2006-09-29
HRP20110187T1 (hr) 2011-04-30
EP1673398B1 (en) 2010-12-29
AU2004283850A1 (en) 2005-05-06
CN100453556C (zh) 2009-01-21
BRPI0415457A (pt) 2006-12-05
CA2542239A1 (en) 2005-05-06
JP4948174B2 (ja) 2012-06-06
CN1867586A (zh) 2006-11-22
EP2292664B1 (en) 2016-11-23
ES2358427T3 (es) 2011-05-10
DE602004030811D1 (de) 2011-02-10
AU2004283850C1 (en) 2011-11-03
WO2005040220A1 (en) 2005-05-06
ATE493441T1 (de) 2011-01-15
NO340900B1 (no) 2017-07-10
SI1673398T1 (sl) 2011-05-31
RU2401843C2 (ru) 2010-10-20
EP2292664A3 (en) 2011-03-16
KR20060101485A (ko) 2006-09-25
KR20120125634A (ko) 2012-11-16
US20130224205A1 (en) 2013-08-29
JP2012110340A (ja) 2012-06-14
CY1112891T1 (el) 2016-04-13
DK1673398T3 (da) 2011-04-18
RU2006116459A (ru) 2007-12-10
EP1673398A1 (en) 2006-06-28
EP2292664A2 (en) 2011-03-09
US9102736B2 (en) 2015-08-11
JP5599079B2 (ja) 2014-10-01
IL174902A0 (en) 2006-08-20
IL174902A (en) 2013-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8076459B2 (en) Multispecfic deimmunized CD3-binders
EP1716178B1 (en) Less immunogenic binding molecules
US8790645B2 (en) Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for EpCAM
ZA200508279B (en) Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for epcam

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration
HC Change of company name or juridical status