MX2014004220A - Bacteria para usarse como un probiotico para aplicaciones nutricionales y medicas. - Google Patents

Abstract

Un primer aspecto de la invención se refiere a la especie bacteriana Roseburia hominis para usarse para: • regular el sistema inmune de un sujeto; • tratar un trastorno inmune; • tratar un trastorno intestinal; • mejorar la microbiota intestinal; • regular el sistema inmune innato de un sujeto; • regular el sistema inmune adaptable de un sujeto; • regular el apetito de un sujeto; promover Tregs y tolerancia inmune; • promover la salud intestinal en un sujeto; y/o • mantener homeostasis inmune en un sujeto. Otros aspecto más de la invención se refiere a composiciones que comprenden Roseburia hominis.

Description

BACTERIA PARA USARSE COMO UN PROBIÓTICO PARA APLICACIONES NUTRICIONALES Y MÉDICAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a la especie bacteriana Roseburia hominis y a diversos usos nutricionales y terapéuticos de la mismas.

Antecedentes de la Invención El intestino humano, aunque inicialmente estéril en el útero, inmediatamente después del nacimiento se expone a una gran variedad de microbios maternos y ambientales. La colonización subsecuente y la sucesión de eventos en el intestino permanecen dinámicos durante los primeros años de vida, después de lo cual la microbiota madura y es relativamente estable (1). La microbiota del intestino humano contiene más de 500 diferentes filotipos que pertenecen esencialmente a dos divisiones bacterianas principales, los Bacteriodetos y los Firmicutos (2). Las relaciones simbióticas exitosas surgen de la colonización bacteriana del intestino humano que han producido una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras, y otras benéficas. Las actividades metabólicas incrementadas del intestino colonizado aseguran que los componentes en la dieta, que de otra forma no son digeribles, son degradados con subproductos liberados que proporcionan una importante fuente de nutrientes para el receptor. Similarmente, la importancia inmunológica de la microbiota del intestino es bien reconocida y ejemplificada en animales libres de gérmenes quienes tienen un sistema inmune dañado que es reconstituido funcionalmente después de la introducción de bacterias comensales (3-5).

En gran contraste con la producción de IgA intestinal de secreción que se ve influenciado por la colonización microbiana per se (6, 7), el desarrollo y diferenciación de célula T parece requerir la colonización de microorganismos comensales específicos. Las especies de Clostridium, en particular las bacterias filamentosas segmentadas que forman esporas (SFB), parecen ser un conductor importante para la maduración de Th1, Th17 intestinal y Tregs (8, 9). Los estudios recientes, sin embargo han mostrado actualmente que otras bacterias en el intestino incluyendo las de la flora de Schaedler alteradas pueden inducir a la generación de novo de Tregs, en tanto que la monocolonización con Bacteroides fragilis puede corregir el desequilibrio Th1/Th2 en ratones libres de gérmenes, promoviendo la expansión de Tregs (5, 10).

La presente invención busca aclarar otras bacterias del intestino residentes que pueden modular la actividad metabólica en el intestino y/o desempeñar un papel importante en procesos inmunor reguladores.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se centra en la actividad de la especie bacteriana Roseburia hominis, un miembro de la Firmicutes phylum. Los estudios por parte del solicitante han demostrado que las especies bacterianas desempeñan una parte importante en actividad de inmunorregulación y metabólica en el intestino, así como tener un efecto en los genes del apetito y saciedad. Los roles de los genes bacterianos que participan en la colonización y adaptación al intestino de múrido, así como los genes huésped que responden a la colonización por parte de esta bacteria, se describen con mayor detalle más adelante.

Los aspectos de la presente invención, junto con las modalidades preferidas, se establecen en los dibujos adjuntos.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en regular el sistema inmune de un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en el tratamiento de un trastorno seleccionado de un trastorno inflamatorio, un trastorno inmune y un trastorno intestinal.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse para promover la salud del intestino, restaurando la homeostasis inmune.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en mejorar la microbiota intestinal en un sujeto. Ótro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseb u ría hominis para utilizarse en la regulación del sistema inmune innato de un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en la regulación del sistema inmune de adaptación de un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en promover Tregs y con la tolerancia inmune de un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en regular el apetito en un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con el uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un medicamento para regular el sistema inmune de un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con el uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un suplemento nutricional o medicamento para tratar un trastorno seleccionado de un trastorno inflamatorio, un trastorno inmune y un trastorno intestinal en un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con el uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un suplemento nutricional o medicamento para mejorar la microbiota intestinal en un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con el uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un suplemento nutricional o medicamento para regular el sistema inmune innato de un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con el uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un suplemento nutricional o medicamento para regular el sistema inmune de adaptación de un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con el uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un suplemento nutricional o medicamento para regular el apetito en un sujeto.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un método para tratar un trastorno seleccionado de un trastorno inflamatorio, un trastorno inmune y un trastorno intestinal en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad nutricional o farmacéuticamente efectiva de la especie bacteriana Roseburia hominis.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un método para mejorar la microbiota intestinal en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con el método para regular el sistema inmune innato de un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un método para regular el sistema inmune de adaptación de un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un método para regular el apetito en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para el uso en medicina.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con una composición farmacéutica que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis y un excipiente, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un suplemento nutricional que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis y un excipiente, transportador o diluyente nutricionalmente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con una composición probiótica que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un producto alimenticio, producto para alimentos, suplemento nutricional, suplemento de dieta o aditivo de alimentos que comprénde la especie bacteriana Roseburia hominis.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un proceso para producir una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, comprendiendo los procesos mezclar en adiciones la especie bacteriana Roseburia hominis con un excipiente, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con un proceso para producir un suplemento nutricional de acuerdo con la presente invención, en donde el proceso comprende mezclar en adiciones la especie bacteriana Roseburia hominis con un excipiente, transportador o diluyente nutricionalmente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en mantener la homeostasis inmune en un sujeto.

Descripción Detallada de la Invención Tal como se mencionó anteriormente, un aspecto de la presente invención se refiere a Roseburia hominis para utilizarse en uno o más de: ? tratar un trastorno inmune; • tratar un trastorno intestinal; • mejorar la microbiota intestinal; • regular el sistema inmune innato de un sujeto; • regular el sistema inmune de adaptación de un sujeto. ? promover Tregs y la tolerancia inmune; • regular el apetito en un sujeto; • promover la salud del intestino en un sujeto; y/o • mantener la homeostasis inmune en un sujeto.

Roseburia hominis Roseburia hominis, un anaerobo comensal del intestino recientemente descrito que pertenece al grupo filogenético XlVa dentro de Firmicutes phylum, pertenece a un grupo dominante de bacterias en el intestino humano, y también es un productor de butirato importante (11). El solicitante de la presente invención ha aclarado la secuencia del genoma completo y la anotación para esta bacteria. Los estudios adicionales investigaron las respuestas de transcriptoma tanto bacterianas como de huésped en ratones libres de gérmenes monocolonizados con R. hominis. Se describieron anteriormente los desempeños de los genes bacterianos que participan en la colonización y adaptación al intestino de múrido, así como los genes huésped que responden a la colonización por parte de esta bacteria.

Los experimentos por parte del solicitante han mostrado que la actividad de Roseburia hominis es altamente específica.

Los estudios han mostrado que son muy diferentes los genomas importantes de la especie Roseburia, lo que indica una funcionalidad diversa. De hecho, los experimentos han mostrando que las bacterias de Clostridium Cluster XlVa, incluyendo las especies bacterianas Roseburia intestinalis, Roseburia hominis y Eubacterium rectale (las cuales todas son productoras de butirato) inducen en forma sorprendente a efectos muy diferentes y distintos en células de intestino.

En una modalidad preferida, las especies bacterianas en la cepa depositada bajo los términos del Tratado de Budapest en la$ Recolecciones Nacionales de Bacterias Industriales, Alimenticias y Marinas (NCIMB) en NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, RU, AB21 9YA, 21 de Octubre de 2004 a nombre de Rowett Research Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Greenburn Road, Aberdeen, AB21 9SB, Escocia, RU, bajo el numeró de acceso NCIMB 14029T Roseburia hominis A2-183T (DSM ¿ 16839T).

La especie bacteriana es preferentemente Roseburia hominils tal como se describe en la Publicación de Duncan, S. H., Aniinov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B., & Flint, H. J. (2006) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2437-2441.

En una modalidad preferida, la especie bacteriana está en la forrea de una población de bacterias vivas, una población de bacterjas liofilizadas, una preparación bacteriana no viable o los componentes celulares de la misma. Preferentemente, cuando la especie bacteriana está en la forma de una preparación bacteriana no viable, se selecciona de bacterias exterminadas con calor, bacterias irradiadas y bacterias lisadas.

Bn una modalidad preferida, la especie bacteriana está en la forrna de una bacteria viva o los componentes celulares de la misma.

Bn una modalidad preferida, la especie bacteriana está en forma aislada. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "aislado" significa aislado de su ambiente nativo.

Bn una modalidad preferida, la especie bacteriana está en forma biológicamente pura. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "biológicamente puro" se refiere a un cultivo de laboratorio que está sustancialmente libre de otras especies del organismo. Preferentemente, la especie bacteriana está n la forma de un cultivo de una sola especie del organismo.

L|a presente invención también comprende el uso de mutantes de la especie bacteriana o cepas aquí descritas. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "muíante" incluye cepas bacterianas derivadas que tienen al menos el 93% de homología, preferentemente al menos el 96% de homología, más preferentemente el 98% de homología con la secuencia de polínucleótido de una cepa referenciada, aunque Tal como se utiliza en la presente invención, el término "mutaciones" incluye mutaciones naturales o inducidas que comprenden al menos alteraciones de base individual que incluyen eliminaciones, inserciones, transversiones y otras modificaciones conocidas para los expertos en la técnica, incluyendo modificación genética introducida en un nucleótido de origen o secuencia de aminoácido, mientras mantiene al menos el 50% de homología con la secuencia de origen. Preferentemente, la secuencia que comprende la mutación o mutaciones tiene al menos el 60%, más preferentemente al menos el 75%, más preferentemente aún el 85% de homología con la secuencia de origen. Tal como se utiliza en la presente invención, la "homología" de secuencia puede determinarse utilizando técnicas estándar conocidas para los expertos en la técnicai. Por ejemplo, la homología puede determinarse en en de Tal como se utiliza en la presente invención el término "homólogo" se refiere a una cepa bacteriana que tiene una secuencia de nucleótido que tiene un grado de identidad de secuencia u homología de secuencia con la secuencia de nucleótido de la cepa bacteriana de origen (en lo sucesivo referida como una "secuencia(s) homologa"). Aquí, el término "homólogo" significa una etjtidad que tiene una cierta homología con la secuencia de nucleóltido en cuestión. Aquí, el término "homología" puede igualaj-se con "identidad". É n este contexto, una secuencia homóloga se toma para incluir una secuencia de nucleótido que puede ser al menos el 50, 60, 70, 75, 80, 85 o 90% idéntica, preferentemente al menos el 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de nucleótido de la cepa bacteriana de origen (la secuencia objetivo).

Las comparaciones de homología se pueden conducir en forma visual, o más normalmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencia fácilmente disponibles. Estos prograhrias de computadora comercialmente disponibles pueden calculsir el porcentaje de homología entre dos o más secuencias.

El porcentaje de homología se puede calcular con secuencias contiguas, es decir una secuencia se alinea con la otra secuencia, y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se llama una alineajción "sin saltos". Normalmente, dichas alineaciones sin salto ¡se llevan a cabo únicamente en un número de residuos relati jámente bajo.

Aunque este es un método muy simple y consistente, falla en tomar en consideración que, por ejemplo, en pares de secuencias de otra forma idénticos, una inserción o eliminación originará que los siguientes residuos de aminoácido sean puestos fuera de la alineación, dando como resultado potencialmente una gran reducción en el porcentaje de homología cuando se lleva a cabo una alineación global.

F'or consiguiente el cálculo del porcentaje de homología máximo requiere primero la producción de una alineación óptima, tomando en consideración penalidades por salto. Un programa de cómputo adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el Vector NTI (Invitrogen Corp.). Los ejemplos de software que pueden desempeñar las comparaciones de secuencia incluyen pero no se limitan a el paquete BLAST (consultar la Publicación de Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology (Protocolos Cortos en Biología Molecular) 4o Edición - Capítulo 18), BLAST 2 (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 77(1): 187-8), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y AlignX por ejem idl o. Al menos BLAST, BLAST 2 y FASTA están disponibles para búsqueda fuera de línea y en línea (ver por ejemplo, Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7-60). Preferentemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótido con al menos 20 nucleótidos contiguos, con al menos 30 nucleótidos contiguos, con al menos 40 nucleótidos contiguos, con al menos 50 nucleótidos contiguos, con al menos 60 nucleótidos contiguos, con al menos 100 nucleótidos contiguos.

Preferentemente, el grado de identidad con respecto a la secuencia de nucleótido puede determinarse con respecto a la secuencia completa.

La identificación tradicional de las bacterias sobre las bases de características fenotípicas, generalmente no es tan precisa como la identificación con base en métodos genotípicos. La comparación de la secuencia del gen 16S rARN bacteriano, ha surgido como una técnica genética preferida y permite que se identifiquen nuevas cepas mediante la comparación de secuencias con secuencias de ADN bacteriano conocidas utilizando BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cqi). La secuerjcia de gen 16S rARN es universal en las bacterias, y por lo tan o las relaciones pueden medirse a través de muchas diferentes bacterias. En general, la comparación de la secuepcia 16S rARN permite la diferenciación entre organismos en el hivel de género a través de todos los filos mayores de las bacterias, además de clasificar las cepas en múltiples niveles, incluyendo el nivel de especie y subespecie. La secuencia de gen 1SS rARN ha sido determinada para un gran número de cepas GenBank, el banco de datos más grande de las secuencias de nucleótido, tiene aproximadamente 20 millones de secuencias depositadas, de las cuales aproximadamente 90,000 son de los genes 16S rARN. Esto significa que existen muchas secuencias depositadas previamente contra las cuales se puede comparar la secuencia de una cepa desconocida.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "identidad 16S rARN" se refiere al porcentaje de identidad con una cespa bacteriana conocida. En una modalidad preferida, la cepa bacteriana tiene una identidad de 16S rARN de al menos 99.5% con la cepa depositada bajo el número de acceso anterior.

La presente invención también comprende cepas mutantes, que se pueden obtener de la cepa depositada antes mencionada, y las cepas que exhiben una homología de ADN-ADN de al menos el 70% y/o una identidad de 16S ARN de al menos el 99.5% con la cepa depositada bajo el número de acceso anterior.

Dentro del contexto de la presente invención, el término "homo ogía de ADN-ADN" se refiere a que tan cercanamente están relacionadas entre sí dos o más hebras de ADN separsdas, con base en su secuencia de nucleótido. Normalmente, esto se mide en términos de su porcentaje de identidad. En una modalidad preferida, la cepa bacteriana tiene una homología de ADN-ADN de al menos el 70% con la cepa depositada bajo el número de acceso anterior.

En una modalidad altamente preferida, la cepa bacteriana tiene una homología de ADN-ADN de al menos 70% y una identidad de 16S rARN de al menos 99.5% con la cepa depositada bajo el número de acceso anterior.

Aplicaciones Terapéuticas Otro aspecto de la presente invención se refiere a la especie bacteriana R. hominis para utilizarse en medicina.

Más particularmente, la especie bacteriana Roseburia hominis es para utilizarse en el tratamiento de un trastorno seleccionado de un trastorno inflamatorio, un trastorno inmune y un trastorno intestinal en un sujeto.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "medicamento" comprende medicamentos tanto para uso humano como animal en medicina humana y veterinaria. Además, el término "medicamento" tal como se utiliza en la presente invención, significa cualquier sustancia, que proporciona un efecto terapéutico y/o benéfico. El término "medicamento" tal como se utiliza en la presente invención, no se limita necesariamente a sustancias, que necesitan Aprobación de Mercado, pero pueden incluir sustancias que, se pueden utilizar en cosméticos, nutracéuticos, alimentos (incluyendo alimentos y bebidas por ejemplo), cultivos probióticos, suplementos nutricionales y remedios naturales. Ademáis, el término "medicamento" tal como se utiliza en la presente invención, comprende un producto diseñado para incorporación en alimento de un animal, por ejemplo alimento para ganado y/o alimento para mascotas. ?f n una modalidad preferida de la presente invención, el trastorno se selecciona de síndrome de intestino irritable (IBS), colitis, trastorno de intestino inflamatorio (IBD), incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, pouchitis, dispepsia funcional, constipación funcional, diarrea funcional (incluyendo diarrea asociada con antibióticos, diarrea por viajes y diarrea pediátrica) dolor abdominal funcional, inflamación funcional, Síndrome de Dolor Epigástrico, Síndrome de Distención Postprandial, enfermedad de reflujo gastrointestinal (GERD), enfermedades autoinmunes tales como diabetes, artritis, esclerosis múltiple y alergias de psoriasis, enfermedades atópicas por ejemplo, dermatitis atópica, enterocolitis necrot zante, otras infecciones y combinaciones de las mismas.

En una modalidad particularmente preferida, el trastorno es un trastorno inflamatorio. Preferentemente, la expresión de los genes proinflamatorios está desregulada en el huésped. A continuación se presentan detalles adicionales de estos estud os.

Más preferentemente, el trastorno inflamatorio es colitis, incluso más preferentemente, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y pouchitis.

[En una modalidad particularmente preferida el trastorno intestinal es IBS. La patofisiología precisa de IBS permanece para ser aclarada. Los estudios recientes han descrito inflamación de mucosa y alteraciones en la microbiota intestinal en pacientes IBS, y una correlación de la enfermedad con infecciones intestinales.

E: n una modalidad particularmente preferida, el trastorno intestinal es IBD. Preferentemente, la expresión de genes de barreras incrementa el sujeto receptor. Se presentan más adelarte detalles adicionales de estos estudios. sujete . La regulación inmune mediante la especie bacteriana es conocida como altamente específica de la especie (8). En particular, el efecto regulador inmune de las bacterias de Clust€>r XlVa y VI es muy complicado, e independiente de la producción de butirato (41). lEn una modalidad preferida, se modula el sistema inmune innato del sujeto.

(En otra modalidad preferida, el sistema inmune de adaptación del sujeto se modula hacia la regulación inmune (y no le activación inmune, reduciendo de esta forma la inflamación).

Otro aspecto de la presente invención, se relaciona con la especie bacteriana Roseburia hominis para mejorar la microbiota intestinal en un sujeto.

La microbiota intestinal se refiere a microorganismos que viven en el tracto digestivo de los animales receptores. Estos microc rganismos llevan a cabo una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras benéficas. Tal como se utiliza en la presente invención, la "mejora microbiota intestinal" se refiere a incrementar el número y/o tipo de microorganismos presentes en el intestino de un receptor, y/o incrementar la actividad de los microorganismos en términos de sus funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras benéficas.

Preferentemente, Roseburia hominis coloniza el colon y/o el íleon, más preferentemente el colon.

E:n una modalidad preferida, Roseburia hominis regula la expres ión de al menos un gen de movilización o quimiotaxis.

Más preferentemente, Roseburia hominis regula la expresión de al menos un gen de movilización o quimiotaxis. Más preferentemente, aún el gen de movilización o quimiotaxis se selecciona de MobA y MobL.

En otra modalidad preferida, Roseburia hominis regula la expresión de al menos un gen seleccionado de FlaA1, FlaA2, Fla3 y FlaB.

Los anticuerpos de suero específico de las proteínas tipo FLA, están presentes en enfermedad inflamatoria del intestino. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la Roseburia hominis es para utilizarse en el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino.

En otra modalidad preferida, Roseburia hominis regula la expresión de uno o más de los siguientes: acetil-CoA acetiltransferasa , deshidrogenasa de 3-hidroxiacil-CoA, deshidrogenasa de butirol-CoA, subunidad beta de flavoproteína de transferencia de electrones y subunidad alfa de flavoproteína de transferencia de electrones.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la especia bacteriana Roseburia hominis para regular el sistema inmuníi innato de un sujeto.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "sistema inmune innato" también conocido como el sistema inmune no específico, comprende las células y mecanismos que propoicionan al huésped una defensa inmediata contra infección por ot os organismos en una forma no específica. Esto significa que léis células del sistema innato reconocen y responden a patógenos en una forma genérica, aunque a diferencia del sistema inmune de adaptación, no confieren inmunidad a largo plazo D protectora para el huésped.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a. Muchos de estos genes son genes de barrera y antimicrobianos del intestino, y por lo tanto trabajan para reducir la invasividad de los patógenos del intestino, y también para reducir los números de patógenos viables.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la especie bacteriana Roseburia hominis para regular el sistema inmune de adaptación de un sujeto.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "sistema inmune de adaptación", también conocido como el "sistema inmune específico" se refiere a células sistémicas, altaménte especializadas y procesos que eliminan o impiden el crecimiento patogénico. La respuesta inmune de adaptación proporciona al sistema inmune los vertebrados con la capacidad de reconocer y recordar patógenos específicos (para generar inmunidad), y para montar ataques más fuertes cada vez que se encuentra el patógeno.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "regular el sistema inmune de adaptación" significa inducir la actividad del sistema inmune de adaptación, y/o promover los mecanismos homeostáticos inmune incrementando el nivel de actividad relativo al nivel de actividad de línea de base. Preferentemente, el sistema inmune de adaptación se modulada hacia | la regulación inmune (y la activación no inmune, reduciendo por consiguiente la inflamación).

Los defectos y los trastornos asociados con el sistema inmune de adaptación, relacionados particularmente con la función de las células T, están asociados con muchas Ein una modalidad particularmente preferida, la Roseburia hominis regula la expresión de al menos uno de los genes seleccionados de Ly6g6c y Ly6g6e en el colon ascendente. El agotamiento de Ly6g6c e Iy6g6e incrementa el riesgo de infección, tanto en el intestino como en el tracto respiratorio, y se asocia con enfermedades tales como neutropenia aa. Por lo tanto, En una modalidad preferida, la Roseburia hominis se utiliza para tratar neutropenia.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en el mante limiento de homeostasis inmune en un sujeto. Tal como se uti iza en la presente invención "mantener la homeostasis inmune" se refiere a la autorregulación del sistema inmune del cuerpo para mantener la tolerancia oral o estabilidad inmune en res puesta a las condiciones cambiantes. La tolerancia oral se refiere! a la respuesta inmune normal a las bacterias en alimen|tos y comensales en un intestino saludable. Estas se pierdeh en la enfermedad coelíaca y las enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn collitis ulcerativa. Por lo tanto, en una modalidad particularmente preferida, la Roseburia hominis es para utilizarse en el tratamiento de enfermedad coelíaca y enfermedades inflamatorias del intestino, tal como la enfermledad de Crohn y colitis ulcerativa.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse para regular el apetito en un sujeto. 'al como se utiliza en la presente invención, el término "reguljar el apetito" se refiere a la capacidad de modular (es decir, incrementar o disminuir) el deseo de comer de un receptor. Preferentemente, la Roseburia hominis ejerce un efecto estimulador en el apetito del receptor, desactivando la expresión de los genes relacionados con la supresión del apetito. Preferentemente, la Roseburia hominis desactiva la expresión de, al menos un gen seleccionado de Agt, Cartpt, Cok, Cxcl12 y Gcg. Más preferentemente, la Roseburia hominis desac iva, la expresión de las hormonas de saciedad Cck y Gcg.

La especie bacteriana de acuerdo con la presente invención, también se puede utilizar en aplicaciones profilácticas. En aplicaciones profilácticas, las especies bacterianas o composiciones de acuerdo con la presente invención se administran a un paciente susceptible a, o de otra forma a el riesgo de una enfermedad particular en una cantidad que es; suficiente para al menos parcialmente reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad. Dicha cantidad se define como "una dosis profilácticamente efectiva". Las cantidades precisas dependen del número de factores específicos del paciente, tal como oí estado de salud y el peso del paciente.

Breve Descripción de las Figuras La presente invención se describe en forma adicional a en las regiones dirigidas por los cebadores. Los rastros en el mapa del genoma, comenzando en el rastro externo 0, son los siguientes: rastro 0 - (azul) Experimentos PCR de tiempo real indicaron las marcas numeradas; rastro 1 - (azul pálido) Directo CDS; rastro 2 - (azul pálido) Inverso CDS, rastro 3 - (azul) rARN; rastro 4 - (verde) tARN; rastro 5 - (rojo) STS marca las región es dirigidas por PCR de tiempo real; gráfica 1: GC contenido; gráfica 2 - tendencias GC. (B) anotación funcional del genoma R. hominis.

La Figura 3, identifica las transcripciones expresadas en forma diferencial en R. hominis después de la colonización y la adaptación al intestino de múrido. (A) Se aisló el ARN bacteriano de contenidos del ciego de ratón, marcados ya sea con dCTP-Cy3 o dCTP-Cy5 durante síntesis de cADN he hibridados para rebanadas de microformación que incorporan un cambio de tinta. Los datos se consideraron significativos cuando hubo un cambio de >2 y P<0,05. Se descubrieron mediante análisis de microformación 50 genes expresados en forma diferencial (in vivo vs. in vitro). (B) Validación PCR de tiempo real de genes implicados en la transferencia de conjugación/movilización. (C) Validación de PCR de tiempo real de genes implicados en Movilidad y Quimiotaxis. (D) Manchado Western de contenido de intestino ascendente inmuno-manchados con anticuerpos Fla2 14d purificados por afinidad (columna 1: escalera, columnas 2-6: contenido en intestinos de animales 1 a 5, columnas 7-8: vacías, columnas 9-10: biomasa de R. hominis (control positivo)). La imagen de R. hominis muestra los flagelos (flechas negras) y (E) La validación PCR de tiempo real de los genes implicados en el metabolismo de butirato. (F) Análisis de PCR de tiempo real de R. hominis las transcripciones in vitro durante la exposición de las células epiteliales intestinales humanas. Los resultados PCR de tiempo real son promedio de los triplicados, * P<0,05 , ** P<0,01 *** P<0,001.

La Figura 4, identifica las transcripciones expresadas en forma diferencial en el intestino de múrido después de mono-asociación con R. hominis. (A) Análisis de microformación Affymetrix de ratones colonizados con genes R. hominis expresados en forma diferencial en forma relativa a GF. Las gráficas de barras representan el número de genes más altos y más bajos expresados después de 14 y 28 días. (B) Mapa térmico generado a partir de genes expresados en forma diferencial con significancia funcional - entre GF y ratones colonizados con R. hominis a los 14 días y 28 días. Las columnas representan formaciones individuales, y las filas representan los genes específicos de interés. La calificación Z ilustra una medida de la distancia, en desviaciones estándar, fuera del promedio. El valor relativo de cada gen se ilustra mediante intensidad de color, en donde el color verde, indica la expresión más alta y el rojo ilustra la expresión más baja. (C) La validación PCR de tiempo real de los genes mostrados como significativamente diferente entre ratones GF y colonizados con R. hominis. Los resultados PCR de tiempo real son promedio de los triplicados, * P<0,05 , ** P<0,01 *** P<0,001.

La Figura 5, muestra la expresión y localización de los marcadores de células T en colón. La inmunofluorescencia y el análisis de células propias de la lámina marcadas con la etiqueta anti-Ly6G (A), anti-CD3 (B) y anti-CD11b (C) en la propia lámina de ratones GF y ratones R. hominis tratados con * P<0,05.

La Figura 6, muestra los efectos anti-inflamatorios de R. hominis en un modelo experimental de la colitis. Los ratones IL-10KO fueron dosificados tres veces a la semana durante 14 semanas. (A) Los ratones IL-10KO no tratados tenían una fuerte elevación de todos los genes en comparación con los ratones tipo natural, mientras que la expresión de gen diferencial fue menor en animales tratados con R. hominis. Los resultados PC de tiempo real son promedios de triplicados, * P<0,05 , ** P<0,01 *** P<0,001. (B) Los pesos corporales de animales IL-10KO no tratados y animales IL-10KO tratados con R. hominis, al final del estudio. (C) Colon ascendente (manchados con hematoxilina/eosina) de animales IL-10KO y IL-10KO animales tratados con R. hominis. Magnificación original x100.

La Figura 7, muestra análisis PCR de tiempo real de los niveles de mARN de IL-10, IL-17 e IFN-?. El PCR de tiempo real se llevó a cabo en tejido del colon ascendente para la medición de los marcadores de células T. Los resultados de PCR de tiempo real son un promedio de los triplicados, * P<0,05 , ** P<0.01.

La Figura 8, muestra los efectos de la mono-asociación de ratones GF con R. hominis en composición de peso corporal. Se llevó a cabo análisis de carcasa de lípidos y de peso corporal en seco. (A) Los pesos de la carcasa en seco de ratones asociados con R. hominis fueron significativamente más pesados en comparación con los animales GF. (B) El análisis de lipidos de carcasa adicional mostró que la adiposidad total fue también significativamente mayor en animales tratados con R. hominis a los 14 días.

La Figura 9, ilustra una comparación de los datos de expresión de gen de tres cepas de bacterias del Cluster XlVa (Firmicutes), es decir: Roseburia hominis, E.rectale y Roseburia intestinalis.

La Figura 10, muestra que Roseburia hominis induce A20, un regulador negativo de señalización NF-kB con una potente actividad anti-inflamatoria, mientras que otras cepas bacterianas no tienen efecto. La porción de flagelina de Roseburia hominis (FLA1 de R. hominis) induce también A20 a diferencia de la de Eubacterium rectale, una bacteria relacionada. Con más detalle, la figura 10 muestra la inducción de multiplicidad de A20 para E. rectale, R. hominis, FLA de E. rectale, FLA1 de R. hominis, EAV9, FLA de SV1400 en forma relativa a los controles.

La Figura 11, muestra la Distribución de Categoría del Subsistema de R. hominis A2-183 tal como se determinada mediante RAST, que muestra los subsistemas funcionales y el número de genes en cada subcategoría.

La Figura 12, muestra la Distribución de Categoría del Subsistema de R. inulinivorans DSM 16841 A2-183 tal como se determina mediante RAST, que muestra los subsistemas funcionales y el número de genes en cada subcategoría.

La Figura 13, muestra la Distribución de Categoría del Subsistema de R. intestinalis L1-82 tal como se determina mediante RAST, que muestra los subsistemas funcionales y el número de genes en cada subcategoría.

La Figura 14, muestra la Distribución de Categoría del Subsistema para R. intestinalis M50/1 tal como se determina mediante RAST, que muestra los subsistemas funcionales y el número de genes en cada subcategoría.

La Figura 15, muestra la Distribución de Categoría del Subsistema para Eubacterium rectale ATCC 33656 tal como se determina mediante RAST, que muestra los subsistemas funcionales y el número de genes en cada subcategoría.

Descripción Detallada de la Invención R. hominis coloniza preferentemente el colon Se inocularon ratones libres de gérmenes (GF) C3H/HeN adultos saludables con tres alimentaciones forzadas de R. hominis en días consecutivos. La colonización exitosa se logró utilizando un medio de inoculación que contiene 3% de ácido ascórbico y 2% de cisteína para proteger las bacterias de la exposición al oxígeno. El análisis del tejido del intestino mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) reveló que R. hominis colonizó tanto el íleon como el colon, aunque se descubrió en números mucho más altos en el colon. Las bacterias también se encontraron cercanamente asociadas con la mucosa colónica (Fig. 1A). La colonización se validó y cuantificó en forma adicional mediante PCR utilizando cebadores específicos de R. hominis con números que se aproximan a 1x1010 bacterias/g materia fecal (Fig. 1B y 1C). La materia fecal de los animales GF probó negativa para la presencia de cualquier bacteria.

El genoma R. hominis revela genes únicos que promueven interacciones de huésped La secuencia del genoma completo de R. hominis A2-183 fue aclarada (Fig. 2A, la cual está representada por un cromosoma simple 3.592, de 125-pb (Fig. 2B). La anotación automatizada y manual del genoma utilizando la plataforma RAST reveló la presencia de cuatro operones ribosomales, 66 ARNs y 3.273 proteínas anticipadas. El grupo más grande de genes perteneció a los Carbohidratos de la Categoría del Subsistema (271 genes), que codifican proteínas implicadas en el metabolismo de los carbohidratos, seguido de Metabolismo de Proteína (197) y Aminoácidos y Derivados (175) (Fig. 2B). Otras categorías funcionales importantes incluyen Movilidad y Quimiotaxis (49) y Letargo y Esporulación (12). El análisis genómico comparativo estableció que lo más cercano y relativo en términos de estructura y función genómica entre los genomas bacterianos completos es Eubacterium rectale (12), que en forma no sorprendente proporcionó la asociación taxonómica cercana de estos organismos (11, 13). La reconstrucción comparativa de estos dos genomas con 1,095 genes reveló que difirieron por aproximadamente el 25% de los genes. En particular, estas diferencias comprendieron los genes que codifican funciones importantes para la interacción con el receptor. Por ejemplo, los genes de Movilidad y Quimiotaxis que codifican las proteínas de ensamble fimbrial tipo IV de PilB y PilC estuvieron presentes en E. rectale pero ausentes en R. hominis mientras que la proteína de varilla de cuerpo basal flagelar FlgC, la proteína de complejo de cuerpo basal-gancho flagelar FliE, la proteína de flagelina FlaB y la proteína de cambio de motor flagelar FliG, fueron únicas para R. hominis. Los dos genomas bacterianos también difirieron en 42 genes de carbohidratos, que reflejan sus requerimientos nutricionales divergentes.

R. hominis responde al ambiente del intestino activando los genes de movilización y quimiotaxis Para determinar los genes expresados en forma diferencial por R. hominis en respuesta a la asociación con el huésped y la dieta, se construyó una microformación utilizando 6.000 fragmentos de PCR de la biblioteca de secuenciación con tamaño de inserto pequeño. Se llevó a cabo validación de PCR de tiempo real subsecuente en 42 genes expresados en forma diferencial los cuales se agruparon en regiones específicas del genoma R. hominis tal como se ilustra en la Fig. 2B. Para distinguir entre los efectos del ambiente del intestino y de los componentes de la dieta, se aisló el ARN bacteriano de cuatro diferentes condiciones experimentales: (i) in vivo, del ciego de ratones monoasociados; (ii) in vitro, de bacterias crecidas en medios de cultivo; (iii) in vitro, de bacterias crecidas en la presencia de los componentes en la dieta; y (iv) de las bacterias incubadas en la superficie de células del confluente Caco-2 y HT-29.

Se identificaron cincuenta genes expresados en forma diferencial (in vivo vs. in vitro) (Fig. 3A). El descubrimiento más sorprendente fue una activación extremadamente muy alta de genes in vivo implicados en la transferencia de la conjugación/movilización, los genes tipo el mobA y mobL (Fig. 3B). La presencia de tales genes en los estudios de transcripción fue sorprendente ya que los genes identificables no se asignaron a los Fagos, Profagos, Elementos Transposables y Plásmidos en Característica de Categoría del Subsistema. Esta diferencia en la detección y la asignación del gen, es probablemente debido a las limitaciones reconocidas de la anotación de la Categoría del Subsistema. El efecto estimulador de compuestos en la dieta fue mucho menos pronunciada, lo que sugiere que el ambiente en el intestino per se es un inductor importante de los g-enes implicados en transferencia de gen horizontal.

Otros subsistemas inducidos en el ambiente del intestino incluyeron Transporte de Membrana, en particular el transporte de magnesio, y la Movilidad y Quimiotaxis que incluye múltiples proteínas de quimiotaxis que aceptan metilo y genes del operón flagelares (Fig. 3C). R. hominis posee múltiples genes de flagelina flaA1, flaA2, flaA3 y flaB y crece de manera interesante en el ambiente del intestino de los ratones que promueve la expresión de flagelina en esta bacteria tal como se muestra mediante manchado western de las bacterias aisladas de ratones colonizados in vivo R. hominis utilizando anticuerpos de flagelina específicos (Fig. 3D). Esto es consistente con los reportes previos que indican que únicamente ciertos subconjuntos de Firmicutes producen flagela in vivo (14).

En forma no sorprendente, la expresión de los genes del metabolismo catabólico en R. hominis en el ambiente del intestino, se vio en su mayoría afectada por los compuestos en la dieta (Fig. 3E). Los genes implicados incluyeron acetiltransferasa de acetil-CoA, deshidrogenasa de 3-hidroxiacil-CoA, deshidrogenasa de butiril-CoA y carboxicinasa de fosfoenolpiruvato [ATP]. Aunque la regulación de estos genes en su mayoría fue transmitida por la dieta, en el último punto de muestreo también se pudo apreciar el efecto del huésped. Inesperadamente, el ambiente del huésped desactivó algunos genes que participan en el metabolismo de las sustancias derivadas del huésped tal como glucuronato, que es común en cadenas de carbohidrato de proteoglicanos de mucosa.

Para investigar en forma adicional los efectos de la adaptación del huésped en el transcriptoma de R. hominis, se llevó a cabo estimulación in vitro de las células epiteliales intestinales humanas (Caco-2 y HT-29). Esto mostró que el gen de transferencia de conjugación/movilización mobA/mobL proteinl, que fue inducido por adaptación al intestino de ratón, también incrementó en ambas lineas celulares (Fig. 3F). En forma consistente con los datos in vivo, el gen de flagelina MotA fue activado en células Caco-2. Los genes implicados en el metabolismo butirato mostraron diferencias entre las dos líneas celulares, con una desactivación observada en células Caco-2 y activación en células HT-29.

R. hominis afecta las trayectorias de célula T mayormente en el colon La colonización de ratones GF con R. hominis se correlacionó con la expresión incrementada del gen en el intestino, la cual fue más alta en el colon (Fig. 4A). La expresión diferencial fue más profunda 28 días después de la colonización, con 159 genes activados y 143 genes desactivados. El número de genes expresados en forma diferencial en el íleon a los 14 días fue similar a la del colon ascendente, con 79 genes activados y 119 genes desactivados. La expresión diferencial en el íleon fue muy baja, a los 28 días, consistente con los niveles de colonización reducidos. La respuesta transcriptómica difirió en los dos puntos de tiempo, tal como se muestra mediante separación clara de transcripciones significativas mediante análisis de mapa térmico (Fig. 4B). En la Fig. 4C se muestra la validación PCR de tiempo Real Positiva de los datos Affymetrix.

La mayor parte de las trayectorias se afectaron a los 14 días en el íleon y el colon ascendente agrupado en las categorías de diferenciación celular, regulación de ciclo celular y remodelado de tejido.

De manera importante, la respuesta inmune fue el grupo de la trayectoria mayor inducido a los 28 días en el colon ascendente. Las 36 trayectorias afectadas en forma significativa en esta categoría en su mayoría estuvieron implicadas en la función de célula T e incluyeron la trayectoria de señalización IL-10, la trayectoria ICOS en la célula auxiliar T y la regulación de la función de la célula T mediante CTLA-4. Los genes implicados en estas trayectorias mostraron tanto activación como desactivación, en tanto que estas trayectorias fueron significativamente afectadas por la presencia de R. hominis, los efectos funcionales netos precisos en la diferenciación de célula T requiere de investigación adicional. Sin embargo, IL-10, CD3 i e IL-13 incrementados y la expresión cambiada de IFN-? se confirmó mediante PCR de tiempo Real (Fig. 7), lo que sugiere que la colonización R. hominis puede favorecer las trayectorias de diferenciación de células Treg y Th2. Se aplicó el análisis de Ontología de Gen para obtener información adicional con respecto a la clasificación funcional de genes de regulación en forma diferencial. El proceso GO para la polimerización de actina' (GO:0030041) (Arpc3, Capg, Cdc42ep5 y Rhoc) se activó a los 28 días en el colon en ratones colonizados con R. hominis (Fig. 8). La polimerización de actina en la sinapsa inmune se requiere para activación de célula T y la función efectora. La inducción de gen se confirmó en forma adicional mediante PCR de tiempo Real (Fig. 4C). En general, estos datos indican que R. hominis afecta en forma activa la respuesta inmune de adaptación en el colon influenciando en forma positiva la activación de célula T.

Relacionada con estos resultados fue la inducción de los miembros de la familia Ly6 en el colon ascendente. En particular, el producto de gen anclado mediante GPI de Ly6g6c fue activado 25 veces, y el gen relacionado Ly6g6e fue activado al doble a los 28 días. La mayor parte de las células hematopoyéticas expresan uno o más miembros de la familia Ly6 incluyendo neutrófilos y células dendríticas plasmacitoides. Además, se ha propuesto el desempeño posible de Ly6 en la activación, diferenciación y maduración de célula T (15).

La inmunocitoquímica confirmó la presencia incrementada de células Ly6G*, CD11b+ y CD3+ en ratones colonizados por R. hominis (Fig. 5). En forma consistente con los datos que muestran que las trayectorias de célula T dominadas principalmente por las respuestas Treg, fue un incremento estadísticamente significativo en células T CD3+ FoxP3 + positivas dobles en el colon de ratones inoculados con R. hominis. Claramente la colonización de R. hominis, como una especie bacteriana simple, indujo un incremento significativo en una población de células CD3* FoxP3 + , particularmente el colon de estos ratones.

R. hominis, modula los genes de respuesta inmune innatos tanto en el íleon como en el colon y atenúa colitis en ratones IL10KO Los genes implicados en inmunidad innata y función de barrera del intestino fueron significativamente inducidos por la presencia de R. hominis en el colon ascendente. La respuesta inmune innata del proceso GO (GO:0045087) fue activada e incluyó los genes Tlr5, Tlr1 y Vnn1 relacionados con TLR. La activación de Tlr5 fue interesante, debido particularmente a la inducción correspondiente de genes flagelares y la presencia de proteína de flagelina en R. hominis durante la colonización de intestino, y pueden inferir un desempeño para esta trayectoria de señalización innata en transmitir otras respuestas inmune innatas y de adaptación. El acoplamiento entre la señalización TLR5 y las respuestas de célula T CD4* ha sido mostrado recientemente para patógenos flagelado (16). Similarmente, se ha mostrado el desempeño de TLR2 en facilitar la colonización de Bacteroides fragilis, propagación y homeostasis inmune Treg (17).

Otros genes inmune innatos afectados en el colon por R. hominis incluyeron los péptidos antimicrobianos Defb37, Pla2g3, Muc16 e Itln y los genes de la función de barrera del intestino Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3 y Mag¡3. Los genes inmune innatos que muestran activación en el íleon en respuesta a R. hominis incluyeron Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Ig$f8 y Tcfe2a. En forma interesante, Pcgf2 regula en forma negativa la expresión de diferentes citocinas, quimiocinas, y receptores de quimiocina y pueden desempeñar un papel importante en controlar las respuestas inflamatorias en tejidos de intestino en respuesta a esta bacteria comensal. En forma interesante, hemos mostrado la regulación negativa de la trayectoria NF-KB (GO:0043124) mediante R. hominis, el cual, igual que B. thetaiotaomicron (19), puede contribuir a la homeostasis inmune desregulando esta cascada inflamatoria.

Se utilizó un modelo de ratón de eliminación IL-10 para probar la eficacia terapéutica de R. hominis, debido al control de las trayectorias inflatorias así como los efectos positivos en la inducción Treg en ratones monoasociados. Los ratones fueron dosificados (~50 µ?, 1010CFU) tres veces a la semana desde el destete a los 20 días de edad durante un período de 14 semanas. La expresión genética del panel de bioma rcadores proinflamatorios mostró que los ratones IL-10KO no tratados tuvo una fuerte elevación de todos los genes investigados en comparación con ratones tipo natural, con una inducción de gen que fluctúa de 4 a 49 veces (Fig. 6A). La inducción de gen proinflamatoria fue significativamente menor en ratones tratados con R. hominis en comparación con ratones no tratados, lo que indica fuertes beneficios terapéuticos para la administración oral de R. hominis. Los pesos corporales de animales tratados con R. hominis también fueron más pesados al final del estudio en comparación con animales no tratados, y este efecto fue estadísticamente significativo en machos (Fig. 6B). Finalmente, el análisis histológico notó la presencia de inflamación severa en el colon ascendente de IL-10KO no tratados en tanto que los animales tratados con R. hominis tuvieron una mucosa colónica de apariencia relativamente saludable.

La colonización de R. hominis influencia los genes de saciedad y composición corporal También fueron evidentes las acciones metabólicas significativas de R. hominis en ratones monoasociados. Los procesos GO 'la regulación negativa de respuesta de alimento' (GO:0032096), 'regulación negativa del apetito' (GO:0032099), y "regulación de secreción de catecolamina' (GO:0050433) todas fueron desactivadas en el colon ascendente después de colonización con R. hominis. Estos datos infieren que R. hominis ejerce un efecto simulador en el apetito del huésped. Los genes implicados en estos procesos fueron Agt, Cartpt, Cck y Cxcl12, con cambios en la multiplicación que fluctúan de 2 a 12 veces. Cck, en particular, desempeña un papel importante en la digestión y saciedad como un supresor del hambre. Gcg también mostró desactivación en este sitio del intestino.

Para establecer si estos cambios de gen tuvieron relevancia fisiológica en relación con la ingesta de alimentos y composición corporal, se llevaron a cabo análisis de peso de carcasa seca y composición. En forma interesante, los pesos de carcasa seca de ratones asociados con R. hominis significativamente más pesados en comparación con animales GF, y las diferencias fueron más discernibles a los 14 días. El análisis de lípido de carcasa adicional mostró que la adiposidad total fue significativamente mayor en animales tratados con R. hominis a los 14 días. Estos descubrimientos son consistentes con datos recientes que revelan el desempeño de Firmicutes en recolección de energía a través de fermentación en la dieta, aunque también soportan la indicación de que la bacteria intestinal puede de hecho modular el eje de cerebro-intestino y las hormonas que regulan el intestino.

Discusión La coevolución a largo plazo del mutualismo de microbio huésped ha llevado probablemente la selección de las especies bacterianas funcionalmente importantes en el intestino, cuya mayoría no están altamente representadas en otros ecosistemas. Actualmente, existe información limitada con respecto a la contribución de los miembros individuales de la comunidad microbiana, para las funciones intestinales, particularmente, en relación con el desarrolló del sistema inmune de la mucosa.

El trabajo reciente utilizando el modelo de colonización reversible basado en E. coli (HA 107) ha demostrado que se requieren bacterias vivas en números que alcanzan 108 CFUs por gramo de contenido para los efectos de inducción inmune en IgA (20). Recientemente, las funciones específicas de SFB y Bacteroides fragilis han sido investigadas en el intestino de ratones para definir sus contribuciones individuales a la biología de célula T y ambas de estas bacterias han mostrado ser inductores potentes de células Tregs y Th17 (5, 8, 9). Los efectos de miembros individuales del grupo Firmicutes XlVa no se ha reportados previamente, aunque se ha observado su presencia en ASF, que también afecta la diferenciación de célula T (10).

El solicitante ha demostrado en la presente invención la primera monoasociación exitosa del intestino de ratón libre de gérmenes con una bacteria anaeróbica, R. hominis, que es un miembro del Firmicutes phylum. La sensibilidad de oxígeno extrema de bacteria tipo Roseburia requiere técnicas de cultivo anaeróbico estrictas, que hacen difícil llevar a cabo la caracterización funcional. El solicitante estableció la monocolonización estable de R. hominis en ratones libres de gérmenes y produjo la secuencia genómica anotada total para descubrir su organización metabólica, fisiología y propiedades simbióticas. Se describió que las respuestas de transcripción de R. hominis después de colonización puede ser atribuida tanto al ambiente en el intestino del huésped como a la dieta. Los efectos llevados por huésped dominaron la respuesta de R. hominis después de monoasociación . Éstos incluyen transferencia de gen incluida, transporte de membrana, subsistemas de quimiotaxis y movilidad. La fuerte activación de los genes implicados en la transferencia de movilización soporta la visión de que el ambiente en el intestino es altamente conducido al intercambio horizontal de genes entre miembros de la microbiota intestinal. Por lo tanto, en este ambiente puede acelerar la diseminación de genes importantes para supervivencia, colonización y función bacteriana dentro del ecosistema del intestino.

El desempeño de movilidad y el aparato flagelar en la colonización de huéspedes está bien elaborado para bacterias patogénicas pero se conoce menos con respecto al desempeño de las proteínas flagelares en bacterias comensales. Los experimentos in vivo revelaron un efecto estimulador del ambiente intestinal del huésped en la expresión de genes de flagelina. Las señales de flagelina son percibidas por los receptores (24) del huésped TLR5 y muchas estructuras de flagelina patogénicas inducen fuertes respuestas proinflamatorias (24). La señalización de TLR5 en respuesta por comensales flagelares residentes puede ser importante para la homeostasis, ya que la eliminación de TLR5 da como resultado colitis espontánea en ratones (25). La expresión incrementada de flagelina R. hominis in vivo por consiguiente es de interés potencial. Otro trabajo ha mostrado que los mutantes de flagelina E. coli tienen una ventaja de colonización con respecto a las cepas flageladas tipo natural, posiblemente debido a la ausencia de reconocimiento mediante señalización para TLR5 (26, 27). El solicitante ha mostrado que en ciertas Firmicutes, la activación de flagelina es una respuesta natural a la colonización del intestino. La proteína de flagelina R. hominis permanece expresada in vivo y se correlaciona con colonización sostenida, la ausencia de sobre inflamación y expansión de células T de fenotipo regulador. Por lo tanto, las estructuras de flagelina comensales a través de TLR5 pueden ayudar a respuestas de tolerancia inmune directas. Datos adicionales con base en TLR5KO y mutantes de flagelina de R. hominis aclararan en forma adicional la importancia de las flagelinas comensales en relación a la homeostasis inmune, aunque el efecto protector observado de R. hominis en ratones IL-10 KO soporta esta hipótesis, no obstante otras porciones de señalización tal como butirato también pueden contribuir a la regulación inmune.

Un desempeñó claro fue establecido para R. hominis en la promoción de función de la barrera de intestino e inmovilidad innata en el colon de ratón. Las uniones ajustadas, uniones de salto y uniones adherentes operan para limitar la translocación bacteriana a la capa subepitelial (28). Tanto la enfermedad de Crohn como la colitis ulcerativa están caracterizadas por pérdida de la función de barrera y la integridad de unión ajustada. En forma interesante, la disbiosis de la microbiota de intestino IBD está asociada con una reducción en Firmicutes (1, 29). La observación de que R, hominis incrementa en forma activa la expresión de los genes de barrera sugiere que su perdida en pacientes IBD puede ser funcionalmente significativa. La activación de los complejos de unión ajustada no solo es la prerrogativa de R. hominis; otros comensales, tales como Bacteroides thetaiotaom icron y Lactobacillus acidophilus, también incrementan la función de la barrera en la mucosa (18, 30), infiriendo oportunidades probióticas con estas bacterias en humanos IBD.

Los efectos de R. hominis en el sistema inmune del intestino fueron intrigantes. Los efectos más fuertes se observaron en el colon ascendente y los genes tales como Ly6g6c fueron fuertemente activados, así como las trayectorias implicadas en la regulación y diferenciaciones de células T y en la polimerización de actina en la sinapsa inmune, fueron implicadas en activación de célula T, y funciones efectoras. Aunque la expresión de los genes Treg en respuesta a la colonización R. hominis no fue muy fuerte, la mayor parte de las trayectorias de célula T afectadas incluyó las relacionadas con IL-10, ICOS y CTLA-4, que todas están implicadas en soportar la diferenciación de Treg. En forma importante, el solicitante tuvo la capacidad de demostrar incrementos significativos en células CD3 + FoxP3+ en los colons de estos ratones. Estos descubrimientos complementan los datos recientes en otras especies de Clostridium que conducen la diferenciación de Treg. Claramente, R. hominis puede promover la expansión de célula T en la mucosa e impacta en la diferenciación de célula T.

Fue interesante observar los fuertes efectos inmunes en el colon en comparación con el íleon, especialmente a los 28 días después de la monocolonización con R. hominis. Los datos transcriptómicos a los 14 días sugieren que se puede iniciar cierta imprimación inmune en el íleon en este punto de tiempo. Los efectos en los diferentes subconjuntos de célula T en el colon ascendente en 28 días por lo tanto pueden reflejar un tráfico y residencia de células del íleon al nodo linfático mesentérico hasta el colon.

Un efecto biológico adicional interesante de la colonización R. hominis, fue la regulación de genes que influencian las respuestas a los alimentos y el control de apetito. En particular, se redujeron en forma significativa las hormonas de saciedad Cck y Gcg. Los efectos de Cck en la ingesta de alimentos son transmitidos a través de una trayectoria aferente vaga. Esta es la trayectoria neural principal mediante la cual la información con respecto a los nutrientes ingeridos llega al sistema nervioso central para influenciar tanto la función del intestino como el comportamiento de alimentación. Cck actúa en el sistema vagal para disminuir la expresión de moléculas que estimulan el apetito y alimentación, y para incrementar la expresión de moléculas que inhiben la alimentación y disminuyen el apetito (Npy2r y Cartpt, ambos desactivados dos veces en el estudio actual). No se ha reportado enlace entre Cck, Gcg y bacterias comensales, sin embargo, ambos ácidos grasos y proteínas son potentes inductores de Cck y Gcg (31). R. hominis produce ácidos grasos de cadena corta tal como butirato con colas alifáticas con menos de seis carbonos; esta actividad metabólica ha sido reportada para reducir el efecto estimulador en el Cck de plasma observado con ácidos grasos de cadena más larga (32). En forma interesante, el análisis de peso de carcasa reveló que tanto el peso corporal y el contenido de lípidos de hecho fue incrementado en forma significativa con R. hominis, en forma consistente con los incrementos de peso corporal observados en la convencionalización de ratones libres de gérmenes (33). Permanece la necesidad de entender si este es un efecto directo de una reducción en las hormonas de saciedad, tal como se aprecia en este estudio, ya que no se ha reportado previamente la implicación de Cck y Gcg. Sin embargo, es importante reconocer que se ha mostrado previamente un enlace entre la colonización de microbiota y la energía recolectada de la dieta, en parte a través de la liberación de SCFAs, (34). Debido a que R. hominis es un productor de butirato mayor, este mecanismo es probable que también contribuya a la eficiencia metabólica observada después del tratamiento con R. hominis.

En síntesis, la monoasociación del intestino de múrido con R. hominis indujo fuertes eventos de expresión de gen bidireccional consistentes con los cambios en los transporte de membrana bacteriana, la quimiotaxis y la movilidad de esta bacteria adaptada al intestino y una activación concomitante del sistema inmune innato y de adaptación del huésped. Esta bacteria metabólicamente activa también ejerció efectos importantes en los genes de apetito y saciedad, que se correlacionaron con una ganancia de peso corporal incrementada en ratones colonizados.

Composiciones Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende una especie bacteriana tal como se describe anteriormente y un excipiente, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable, Los excipientes, diluyentes, y transportadores adecuados se describen a continuación .

La composición puede ser cualquier composición, aunque preferentemente es una composición que será administrada en forma oral, enteral o por vía rectal. Por ejemplo, la composición puede ser una composición comestible. El término "Comestible" significa un material que está probado para el consumo humano o animal.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición probiótica que comprende una especie bacteriana tal como se describió anteriormente.

Tal como se usa en la presente invención, el término "probiótico" significa preparaciones de células microbianas o los componentes de las células microbianas con un efecto beneficioso en la salud o el bienestar del húesped. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. "Probiotics: how should they be defined" (Probióticos: como se deben definer) Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).

Preferentemente, la composición probiótica es una composición administrable en forma oral de bacterias metabólicamente activas, es decir, vivas y/o liofilizadas, o exterminadas por calor en forma no viable, radiadas o lisadas. Esta composición probiótica puede contener otros ingredientes. La composición probiótica de la presente invención puede administrarse en forma oral, es decir, en la forma de una tableta, cápsulas o polvo. Los productos encapsulados se ven favorecidos por R. hominis ya que es un anaerobio. Otros ingredientes, (tal como la vitamina C, por ejemplo), se pueden incluir como agentes depuradores de oxígeno. Los substratos como prebióticos tal como éstos, mejoran la colonización y supervivencia in vivo. Alternativamente, la composición probiótica de la presente invención puede administrase en forma oral como un producto alimenticio o nutricional, tal como la leche o un producto lácteo fermentado a base de suero de leche, o como un producto farmacéutico.

Una dosis diaria adecuada de la bacteria probióticas es de aproximadamente 1 x 103 hasta aproximadamente 1 x 1011 de unidades de formación de colonias (CFU), más preferentemente de aproximadamente 1 x 107 hasta aproximadamente 1 x 1010 CFU, más preferentemente, de aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 1 x 1010 CFU.

En una modalidad preferida, la composición contiene las especies bacterianas y/o componentes celulares de las mismas, como ingredientes activos, en una cantidad de desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 1 x 1011 CFU/g, respecto al peso de la composición, preferentemente desde aproximadamente 1 x 108 hasta aproximadamente 1 x 1010 CFU/g. La dosis puede ser de 1 g, 3 g, 5 g, y 10 g.

Normalmente, un probiótico se combina opcionalmente con al menos un compuesto prebiótico adecuado. Un prebiótico normalmente es un carbohidrato no digerible, normalmente es un carbohidrato no digerible tal como un oligo o polisacárido, o un alcohol de azúcar, el cual no se degrada o absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos incluyen productos comerciales tales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.

Preferentemente, la composición de la presente invención incluye un prebiótico en una cantidad desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 30% en peso, respecto a la composición del peso total, preferentemente del 5 al 20% en peso. Los carbohidratos preferidos se seleccionan de: fructo-oligosacáridos (o FOS), f ructo-oligosacá ridos de cadena corta, inulina, isomalto-oligosacáridos, pectinas, xilo-oligosacáridos (o XOS), quitosan-oligosacáridos (o COS), beta-glucanos, almidones resistentes y modificados por goma arábiga, polidextrosa, D-tagatosa, fibra de acacia, carob, avenas y fibras cítricas. Los prebióticos particularmente preferidos son los fructo-oligosacáridos de cadena corta (por simplicidad mostrados más adelante como FOSs-c.c); los FOSs-c.c, no son carbohidratos digeribles, generalmente obtenidos mediante la conversión de remolacha e incluyen una molécula de sacarosa a la cual se enlazan tres moléculas de glucosa.

Alimentos/productos alimenticios Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a productos alimenticios, suplementos dietéticos, nutracéuticos, fórmulas nutricionales, bebidas y medicamentos que contienen una especie bacteriana tal como se definió anteriormente, y el uso de los mismos.

En una modalidad preferida, la composición comprende además al menos otro tipo de otra bacteria de grado alimenticio, en donde la bacteria de grado alimenticio se selecciona preferentemente del grupo que consiste en una bacteria de ácido láctico, bif idobacteria , propionibacteria o mezclas de los mismos.

En un aspecto de la presente invención, se refiere a un producto alimenticio que comprende la especie bacteriana definida anteriormente. El término "producto alimenticio" pretende cubrir todos los productos consumibles que pueden ser sólidos, gelificados o líquidos. Los productos alimenticios adecuados pueden incluir, por ejemplo, productos alimenticios funcionales, composiciones alimenticias, alimentos para mascotas, alimentos para ganado, alimentos para la salud, productos alimenticios y similares. En una modalidad preferida, el producto alimenticio es un alimento para la salud.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "producto alimenticio funcional" significa un alimento que tiene la capacidad de proporcionar no únicamente un efecto nutricional, sino que también tiene la capacidad de suministrar un efecto benéfico adicional al consumidor. Por consiguiente, los alimentos funcionales son alimentos ordinarios que tienen componentes o ingredientes (tal como los aquí descritos) incorporados en los mismos que imparten al alimento un beneficio funcional específico-por ejemplo médico o fisiológico-además de un efecto puramente nutricional.

Los ejemplos de productos alimenticios específicos que son aplicables a la presente invención incluyen productos a base de leche, postres listos para comerse, polvos para reconstitución por ejemplo con leche o agua, bebidas de leche chocolate, bebidas de malta, platillos listos para comerse, platillos o bebidas instantáneas para humanos o composiciones alimenticias que representan una dieta completa o parcial proyectada para mascotas o ganado.

En una modalidad preferida la composición de acuerdo con la presente invención es un producto alimenticio proyectado para humanos, mascotas o ganado. La composición puede estar proyectada para animales seleccionado del grupo que consiste en perros, gatos, cerdos, ganado, caballos, cabras, ovejas o aves de corral. En una modalidad preferida, la composición es un producto alimenticio proyectado para especies adultas, en particular adultos humanos.

En la presente invención, "el producto a base de leche" significa cualquier producto a base de leche o suero de leche líquido o semisólido que tiene un contenido de grasa diverso. El producto a base de leche puede ser por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche descremada, leche entera, leche recombinada de leche pulverizada y suero sin cualquier procesamiento, o un producto procesado tal como yogurt, leche cortada, requesón, leche agria, leche completa, leche entera agria, mantequilla de leche y otros productos de leche agria. Otro grupo importante incluye bebidas de leche, tal como bebidas de suero de leche, leches fermentadas, leches condensadas, leches para bebes o niños, leches con sabor, helados; alimentos que contienen leche tal como dulces.

Un aspecto de la presente invención se refiere a productos alimenticios o alimento para animales que comprenden la especie bacteriana definida anteriormente.

Las composiciones de la presente invención pueden ser -o pueden agregarse a - suplementos alimenticios, también nutridos en la presente invención como suplementos dietéticos o nutricionales o aditivos alimenticios. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un suplemento dietético o aditivo alimenticio que comprende una o más cepas bacterianas de acuerdo con la presente invención.

La especie bacteriana y composiciones probióticas de acuerdo con la presente invención, también se pueden utilizar en nutrición para animales (por ejemplo nutrición para cerdo), particularmente en el período de destete temprano y período de engorda de crecimiento. Los probióticos se espera que incrementen la función inmune, reduzcan y prevengan enfermedades infecciosas, alteren en forma benéfica la composición de la microbiota y mejoren el crecimiento y desempeño de los animales, por ejemplo, a través de una eficiencia de conversión alimenticia incrementada.

Eluyentes, Excipientes y Transportadores Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere también a composiciones, más preferentemente composiciones farmacéuticas o suplementos nutricionales, que comprende la especie bacteriana definida anteriormente, y el uso de la misma. La especie bacteriana generalmente se administra en mezcla en adiciones con un transportador, excipiente o diluyente farmacéutica o nutricionalmente aceptable, particularmente para terapia humana. Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso en humanos o animales en medicina humana y veterinaria.

Los ejemplos de dichos excipientes adecuados para las diversas diferentes formas de composiciones farmacéuticas aquí descritas se pueden encontrar en la Publicación de "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (Manual de Excipientes Farmacéuticos), 2o Edición, (1994), Editado por A Wade y PJ Weller.

Los transportadores o diluyente estables para uso terapéutico son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas y se describen por ejemplo en la Publicación de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ciencias Farmacéuticas de Remington), Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edición 1985).

Los ejemplos de transportadores adecuados incluyen, lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, sorbitol y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

La elección del transportador, excipiente o diluyente farmacéutico puede se lleva a cabo con respecto a la ruta de administración proyectada y a la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender o además del transportador, excipiente o diluyente, cualquier enlazador(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) de solubilización adecuado.

Los ejemplos de enlazadores adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidro, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa de sodio o polietilenglicol.

Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, y similares.

Los conservadores, estabilizadores, tintas e incluso agentes saborizantes se pueden proporcionar en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservadores incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.

También se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión .

Los transportadores, diluyentes y excipientes nutricionalmente aceptables incluyen los adecuados para consumo humano o animal y que se utilizan como estándar en la industria alimenticia. Los transportadores, diluyentes y excipientes nutricionalmente aceptables típicos serán familiares para los expertos en la técnica.

Administración Las composiciones de la presente invención se pueden adaptar para ruta de administración oral, rectal, vaginal, parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal, intrabronquial, subcutánea, intradérmica, intravenosa, nasal, bucal o sublingual. Preferentemente las composiciones de la presente invención se adaptan para ruta de administración oral, rectal, vaginal, parenteral, nasal, bucal o sublingual.

Para administración oral, se hace uso en particular de tabletas comprimidas, pildoras, tabletas, geles, gotas y cápsulas.

Otras formas de administración comprenden soluciones o emulsiones que se pueden inyectar en forma intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, o intramuscular, y que se preparan de soluciones estériles o esterilizables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de supositorio, óvulos, suspensiones, emulsiones, lociones, ungüentos, cremas, geles, rocíos, soluciones, o polvos.

Un medio alternativo de administración transdérmica es a través del uso o en parche cutáneo. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede incorporar en una crema que consiste en una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. La cepa bacteriana puede también incorporarse en un ungüento que consiste en una base de cera blanca o de parafina blanda blanca con estabilizadores y conservadores según se requiera.

Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en la forma de partes separadas que contienen una dosis unitaria, o un múltiplo o subunidad de una dosis unitaria.

Dosificación Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una dosis adecuada de una de las composiciones de la presente invención para administrar a un sujeto sin experimentación indebida. Normalmente, un médico determinará la dosificación real que será la más adecuada para un paciente individual, y dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad de la cepa bacteriana específica empleada, la estabilidad metabólica y longitud de acción de la cepa, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, rango de excreción, combinación de fármacos, la severidad de la condición particular, el individuo que pasa por la terapia. Las dosificaciones aquí descritas son de ejemplo de casos promedio. Por supuesto puede haber casos individuales en donde se ameriten rangos de dosificación superiores o inferiores, y los mismos están dentro del alcance de la presente invención.

La dosis diaria efectiva normal en humanos es desde aproximadamente 1 x 103 hasta aproximadamente 1 x 1011, más preferentemente, desde aproximadamente 1 x 107 hasta aproximadamente 1 x 1011, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 1 x 1010 de CFU.

Combinaciones En una modalidad particularmente preferida, las composiciones de la presente invención de administran en combinación con uno o más de otros agentes activos. En dichos casos, las composiciones de la presente invención se pueden administrar en forma consecutiva, simultánea o en secuencias con el uno o más agentes activos.

La presente invención se describe en forma adicional a manera de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Materiales y Métodos Condiciones de Crecimiento Bacteriano Se creció en forma anaeróbica R. hominis A2-183T ( = DSM 16839T=NCIMB 14029T) en YCFA sintético o un medio M2GSC complejo. El cultivo se inoculó a partir de una reserva congelada en tubos de Hungate y se incubó durante la noche a una temperatura de 37°C. Las bacterias se crecieron posteriormente en placas de agar de M2GSC durante 48 horas en una estación de trabajo anaeróbica ACS-MG-1000 (Don Whitley Scientific) bajo el 80% de N2, 10% de C02, y el 10% de H2 a una temperatura de 37 C. El efecto de la mucina se investigó agregando 0.5% (p/v) de mucina de estómago de porcino tipo III (Sigma-Aldrich) al medio YCFA.

Para la colonización de ratones libres de gérmenes, se creció durante la noche R. hominis en un medio de cultivo YCFA, a una temperatura de 37°C. El cultivo se giró y el pelet se resuspendió en un mL de medio YCFA, suplementado con 2% de cisteína (p/v, Sigma-Aldrich) y 3% de ácido ascórbico (p/v, Sigma-Aldrich).

Experimentos Animales Se llevaron a cabo experimentos en animales libres de gérmenes en la instalación de reproducción de roedores INRA gnotobiotic en Jouy-en-Josas (ANAXE plataforma, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, Francia). Se aprobaron todos los experimentos en animales a través del comité ético local. Se asignaron dieciocho ratones macho C3H/HeN libres de gérmenes en los grupos de control (N = 8) y de tratamiento (N = 10) y se enjaularon en forma individual en aisladores de plástico. Los ratones se alimentaron ad libitum con una dieta comercial esterilizada (R03-40; UAR). El día 0, a los animales en el grupo de tratamiento se les proporcionaron 100 pL de cultivo de R. hominis mediante alimentación forzada, mientras que a los animales de control se les administraron 100 µL· de medio YCFA. En los días 14 y 28, se sacrificaron cuatro animales de control y cinco animales tratados con R. hominis. Los experimentos C57/BL6 IL-10KO se llevaron a cabo en el Rowett Institute of Nutrition and Health (Instituto Rowett de Nutrición y Salud) (Aberdeen, Scotland, RU). Se analizaron ratones tipo natural (N = 8), IL-10KO (N=12) y IL-10KO + R. hominis (N = 11) 14 semanas desde el comienzo del experimento. En síntesis, se administró R. hominis 3 veces a la semana 109 cfu/d ía .

El íleon, colon ascendente y colon descendente se dividieron en cuatro partes iguales y se transfirieron a un ARNIater (Ambion), formalina amortiguada neutral (Sigma-Aldrich) o nitrógeno líquido. Se transfirieron el ciego completo y el colon transversal a ARNIater. También se evaluó la histopatolog ía en los ratones IL-10KO.

Experimentos de cultivo de tejido Todos los reactivos de cultivo celular, a menos que se especifique de otra forma, fueron suministrados por Sigma-Aldrich. Se sembraron células 2 x105 Caco-2 o HT29 en 1.5 mL de un medio DMEM (alto contenido de glucosa, HEPES) suplementado con suero de bobino fetal desactivado por calor (Gibco), penicilina, estreptomicina, amfotericina B y L-glutamina, en compartimentos superiores de una placa de transdepósito de seis depósitos (Corning). Los compartimentos inferiores contenían 3.0 ml_ del mismo medio. Las células se incubaron a una temperatura de 37°C en 5% de una atmósfera C02 hasta 3 días después de la confluencia, se lavaron con solución de Hanks para eliminar los antibióticos y FCS y se retiraron en DMEM suplementado con L-glutamina, selenita de sodio y transferrina durante 24 horas sin antibióticos. Los insertos del transdepósito se transfirieron posteriormente a una caja de cultivo anaeróbico dentro de la estación de trabajo anaeróbica a una temperatura de 37°C. El compartimento superior de cada inserto se llenó con un medio de células DMEM anaeróbico, en tanto que el compartimento inferior se llenó con DMEM oxigenado.

Se recolectó el cultivo R. hominis A2-183 en la fase exponencial mediante centrifugación en 3,500 x g durante 5 min. El pelet se lavó y se resuspendió en 0.8 mL de DMEM anaeróbico. Se agregaron cien microlitros de suspensión bacteriana (108 CFU/mL) a los depósitos experimentales. Los depósitos de control recibieron la cantidad de medio sin células bacterianas. El control adicional incluyó células bacterianas incubadas sin células Caco-2 o HT29.

Se recolectaron las células bacterianas y eucarióticas después de 2 horas y 4 horas de incubación. Se aspiraron las bacterias tanto adherentes como no adherentes y se almacenaron en ARNIater. La viabilidad de las células R. hominis se probó revistiendo sobre placas YCFA. Las células Caco-2 o células HT-29 se recolectaron en los depósitos y también se almacenaron en ARNIater.

Construcción de Biblioteca R. hominis El ADN cromosomal R. hominis para la construcción de biblioteca de tamaño pequeño y pirosecuenciación se aisló utilizando un Equipo de Aislamiento de ADN Microbiano UltraClean™ (Mo Bio Laboratories Inc) y el ADN de alto peso molecular de las bibliotecas de fósmido se aisló utilizando un Equipo de Purificación de ADN Wizard Genomic (Promega). Se revisó la integridad del ADN mediante electroforesis de gel.

El ADN se derramó en forma mecánica utilizando un equipo de Nebulizador (Invitrogen) y se fraccionó mediante electroforesis de gel. Los fragmentos de ADN del tamaño deseados se cortaron del gel y se purificaron utilizando el Sistema de Limpieza de Gel SV y PCR Wizard® (Promega). Se llevó a cabo la reparación del extremo con un Equipo de Reparación de Extremo ADN (Lucigen). Los fragmentos de 1.5-3.5 kb se clonaron utilizando el equipo LCAmp CloneSmart® (Lucigen) y se construyó una biblioteca de 4 a 8 kb utilizando el vector pJA2Z®-OC (Lucigen). Se construyeron bibliotecas de fósmido utilizando el Equipo de Producción de la Biblioteca de Fósmido CopyControl™ (Epicentre Biotechnologies). Las colonias se recogieron utilizando un recogedor de colonias automático (BioRobotics BioPick, Genomic Solutions) y se archivaron en placas de microtitulación de 384 depósitos que contienen 70 µ?_ del medio 2xLB suplementado con 10% de glicerol y antibiótico correspondiente. Las células se crecieron durante la noche a una temperatura de 37°C con agitación y se almacenaron a una temperatura de -80°C.

Secuenciación, ensamble y anotación Se generaron mediante PCR plantillas para secuenciación de bibliotecas de tamaño pequeño, utilizando 1 µ?-de biomasa de clon y los cebadores SL1 y SR2 que rodean el sitio de clonación de pSMART-LCAmp. Los productos PCR se purificaron utilizando placas de filtro de limpieza PCR Multiscreen ( illipore). El ADN recombinante de los clones pJAZZ®-OC se aisló utilizando el Sistema de Purificación de ADN de Plásmido Wizard® SV 96 (Promega). El ADN de fósmido se aisló utilizando el Equipo de Purificación de ADN FosmidMAX™ (Epicentre). Las lecturas del extremo de los fragmentos de ADN de las bibliotecas R. hominis WGS con diferentes tamaños de inserto, se obtuvieron utilizando secuenciadores de ADN CEQ8000 (Beckman Coulter) y ABI 3770 (Applied Biosystems). El ADN genómico de R. hominis también se secuenció utilizando los secuenciadores 454 GS20 (454 Life Sciences) y 454 FLX (Roche). Se ensamblaron los datos Sanger y 454 con la versión 3 MIRA (http://cheyreux.org/proiects mira.html; (35). Se utilizó el conducto de anotación RAST (http://rast.nmpdr.orq;(36)) para la anotación automática y manual del genoma y para análisis genómicos comparativos. La secuencia genómica anotada de R. hominis A2-183 se presentó GenBank bajo el número de acceso CP003040.

Análisis de Microformacion Microformacion bacteriana Se aisló el ARN bacteriano de contenidos del ciego de ratón utilizando el miniequipo de RNeasy, y se procesó en forma adicional con el equipo MIC ROBEnrich™ (Ambion), el equipo de enriquecimiento de mARN bacteriano MICROBExpress™ (Ambion), y el equipo de amplificación de ARN MessageAmp™ de bacteria-ll (Applied Biosystems). Se marcó el ARN ya sea con dCTP-Cy3 o dCTP-Cy5 durante la síntesis de cADN (Equipo de marcado de cADN de Primera hebra CyScribe; Amersham). Los productos marcados se purificaron utilizando el equipo de purificación CyScribe GFX (Amersham). Los productos PCR amplificados de 6000 clones en la biblioteca RA8 se formaron por duplicado en portaobjetos de microscopio recubiertos con aminosilano (Corning) utilizando MicroGrid II TAS (BioRobotics). Los fragmentos amplificados de los genes de mantenimiento rpoD y gyrA se distribuyeron en forma aleatoria en la formación como controles. La hibridación de microformacion se llevó a cabo en la estación de hibridación GeneTAC (Genomic Solutions). Se intercambió el etiquetado de tinta por una segunda hibridación, y también se etiquetó una purificación de ARN separada y se hibridó dos veces, para asegurar la capacidad de reproducción y para obtener sus resultados estadísticamente significativos. En total, se hibridaron cuatro rebanadas para cada composición, para un total de 12 manchas de hibridación por clon amplificado. Se midió la fluorescencia en dos canales utilizando un GeneTAC LS IV (Genomic Solutions) con el software GeneTac Integrator versión 3.0.1. Se transformaron en forma logarítmica las intensidades del manchado y se aplicó normalización de Loess para eliminar las diferencias en las eficiencias de etiquetado e hibridación de sonda. Se utilizaron pruebas-t de una muestra en los valores de proporción-logaritmo para probar la expresión diferencial. Los datos se consideraron importantes cuando el cambio de multiplicación fue de >2 y P<0.05.

Análisis de Microformación de Ratones Se eliminó el tejido de colon ascendente y del íleon del ARNIater y se lisó en Trizol (Invitrogen). Se aisló el ARN utilizando los pasos de cloroformo/isopropanol estándar. El ARN total se purificó en forma adicional con el equipo RNeasy (Qiagen), incluyendo un paso de digestión de ARNse-libre ADNse I (Qiagen). Se determinó la integridad de ARN utilizando el Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). Se procesó el ARN total en cARN etiquetado con biotina utilizando el Equipo de Etiquetado Objetivo de un Ciclo (Affymetrix). Se llevó a cabo la hibridación para la Formación de Genoma de Ratón GeneChip (Affymetrix) en una estación GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix) en el Institute of Medical Sciences Microarray Core Facility (Instalación del Centro de M icroformación del Instituto de Ciencias Médicas) (Universidad de Aberdeen, RU). Los pedazos se escanearon con un Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Se llevó a cabo el análisis de calidad de imagen utilizando el Software Gene Chip Operating (GCOS) (Affymetrix). Se llevó a cabo análisis de datos adicional con los paquetes de software libremente disponibles R (http://www.r-proiect.org) y Bioconductor (http://www.bioconductor.org). La prueba-F moderada proporcionada por el paquete Bioconductor limma se utilizó parta probar la expresión diferencial. Los datos se consideraron significativos cuando P<0.05 utilizando el método de descubrimiento de falso Benjamini y Hochberg. El análisis estadístico se llevó a cabo por separado para cada uno de los dos puntos de tiempo. Todos los genes expresados en forma diferencial (P<0.05) se importaron en el software analítico MetaCore (GeneGo, St Joseph, MI) para generar mapas de trayectoria. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento de trayectoria integrado utilizando las trayectorias canónicas basadas en el conocimiento y las trayectorias metabólicas endógenas. La clasificación de las trayectorias integradas relevantes estuvo basada en valores-p calculados utilizando distribución hipergeométrica. Los valores-P representaron la probabilidad de un número de genes determinado a partir de la lista de entrada, para corresponder con un cierto número de genes en el mapa mediante oportunidad, considerando los números de genes en el experimento versus los números de genes en el mapa dentro del conjunto total de todos los genes en los mapas. Se llevó a cabo la interpretación funcional de los datos a base de Ontología de Gen (GO) utilizando DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov), una versión expandida de programa original accesible en la web (37). Se asignaron transcripciones significativamente diferentes (P<0.05) en la categoría GO de "Proceso Biológico" para descubrir patrones de expresión de gen significativamente enriquecidos para los términos GO específicos.

Se presentaron datos de microformación al National Center for Biotechnoíogy Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) Omnibus de Expresión Genética (número de acceso GSE25544: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo).

Análisis RT-PCR Se designaron cebadores PCR bacterianos utilizando la herramienta en línea Primer3Plus (38) y se compraron en Sigma-Aldrich . Se llevó a cabo análisis PCR de tiempo real utilizando un Sistema PCR de Tiempo Real 7500 (Applied Biosystems) con la Mezcla Maestra PCR Verde SYBR (Applied Biosystems). Se llevó a cabo PCR como se indica a continuación: un ciclo a una temperatura de 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a una temperatura de 95°C durante 15 segundos y a una temperatura de 60°C durante 1 minuto, finalizando con un paso de disociación. Todas las muestras se corrieron por triplicado. Se utilizó el GyrA como un gen de referencia de normalización debido a su baja variación entre las muestras.

Para expresión del gen huésped, se transcribieron en forma inversa en cADN, 2 µg de ARN eucariótico total aislado del íleon y colon ascendente, utilizando el Equipo de Transcripción Inverso de cADN con Alta Capacidad (Applied Biosystems) con cebadores aleatorios. Se llevó a cabo análisis PCR de tiempo real utilizando un Sistema PCR de Tiempo Real Rápido 7500 (Applied Biosystems) con el equipo PCR Verde QuantiFast SYBR (Qiagen) y los Ensayos de Cebador QuantiTect (Qiagen). Las condiciones de ciclado PCR fue como se indican: un ciclo a una temperatura de 95°C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a una temperatura de 95°C durante 10 s y a una temperatura de 60°C durante 30 s, finalizando con un paso de disociación. Todas las muestras se corrieron por triplicado. Se seleccionó Hprt como un gen de referencia durante normalización debido a su baja variación entre las muestras. Todos los datos RT-PCR se analizaron en una escala logarítmica con base 2 a través de la prueba del t estudiante permitiendo variaciones no iguales con un corte de significancia de P<0.05. Las diferencias se volvieron a transformar para calcular los cambios en la multiplicación.

Manchado Western Se produjeron anticuerpos policlonales de conejo inmunopurificados contra Roseburia hominis Fla2, tal como se describe en la Publicación de Duck et al (39). En síntesis, se inmunizaron conejos hembra blancos de Nueva Zelanda con péptido sintético en adyuvante de Freund completo y se reforzaron varias veces. Para R. hominis fla2 se utilizaron el péptido 261-275 (C-AQYNDDAKSVLEILK-COOH) y el péptido 58-71 (C-GLNKASRNSQDGIS-CONH2). Después de la inmunización, los anticuerpos se purificaron en una columna de inmunoafinidad preparada acoplando los péptidos a 1 ml_ de cuentas de sefarosa activadas.

Para el manchado western, se suspendieron los contenidos del intestino del colon ascendente en amortiguador de laemmli que contiene 8M de urea. Se diluyó la biomasa de R. hominis (control positivo) en el mismo amortiguador. Se cargaron treinta µ?_ de cada muestra en depósitos de un gel NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) y se elecroforaron, seguido de procesamiento adicional utilizando el Sistema de Inmunodetección Quimioluminiscente WesternBreeze (Invitrogen). Se diluyó el anticuerpo Fla2 1:1000 en diluyente de anticuerpo y se incubó durante la noche a una temperatura de 4°C, seguido de 1 hora a temperatura ambiente con anticonejo conjugado con fosfatasa alcalina. La detección se logró utilizando el sistema de imágenes Fuji LAS3000.

Análisis de carcasa de lípido y peso corporal en seco Se pesó la carcasa de ratón destrozada, se liofilizó hasta tener un peso constante y posteriormente se molió para análisis. Se determinó el contenido de lípido mediante extracción (1:100 p/v) con cloroformo/meta nol (2:1 v/v) tal como se describió previamente (40).

Análisis FISH Se llevó a cabo el análisis FISH en secciones de tejido de intestino utilizando una sonda bacteriana general Eub338 y una sonda específica de R. hominis A2-183 diseñada recientemente.

Los tejidos fijados en formalina amortiguado en neutral se incrustaron en Technovit 8100 (Heraeus Kulzer). Se cortaron secciones de dos mieras utilizando un micrótomo rotatorio (Leica/Reichert Autocut). Se tomaron tres secciones por rebanada en 100 µ??, 200 µ?p y 300 µ?? en el tejido, dando como resultado nueve secciones por animal.

Las rebanadas se deshidrataron mediante incubación consecutiva en 50% (v/v), 80% y 96% de etanol y se secaron a temperatura ambiente. Las sondas 16S rARN FISH utilizadas fueron una sonda bacteriana general Eub338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT; Cy3) y la sonda específica de R. hominis A2-183 recientemente diseñada (GTAC ATTAC ATACTCTGTC AGTG; FITC), la cual se probó extensamente para especificidad contra un panel de aislados bacterianos intestinales. Se aplicó a la muestra deshidratada una sonda de diez microlitros (30 ng/pL) en 100 µ?_ de amortiguador de hibridación y se incubó a una temperatura específica de la sonda. Las rebanadas se lavaron en amortiguador de lavado a una temperatura de 50°C durante 30 minutos, se bañaron en agua enfriada con hielo para eliminar el amortiguador de lavado residual y se secaron bajo un flujo de aire comprimido. Se llevó a cabo el contramanchado con 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Vector Laboratories Inc.) y las rebanadas se montaron con un Medio de Montaje Vectashield para fluorescencia (Vector Laboratories Inc) para prevenir el desvanecimiento. Las bacterias se visualizaron utilizando el microscopio de fluorescencia Leica DM RBE (Leitz GMBH) y se fotografiaron con una cámara Penguin 600CL (Pixera) y el software Viewfinder 3.0 (Studio Lite). Las imágenes de alta magnificación (x63) se recuperaron utilizando el sistema Apochromatics (Leica).

Inmunofluor es cencía La inmunolocalización de los marcadores de célula T se revisó en criosecciones en secuencias (8 m). Las secciones se fijaron ya sea en metanol enfriado previamente durante 30 minutos a una temperatura de -20°C (Ly6G FITC, CD3 FITC, CD11b FITC, todos en 1:50 (BD Biosciences)), o para FoxP3 de marcado doble (1:500, Abeam) con CD3 FITC (1: 100, BD Biosciences) fijado en 1% de paraformaldehído (PFA) durante 2 minutos a temperatura ambiente seguido de 3 minutos en 0.01% Tritón X en PBS. Todas las secciones se bloquearon con 10% de BSA (Sigma) que contienen el 10% de suero pre-inmune relevante en PBS (pH 7.4). Los tejidos fijados con metanol se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incubaron con anticuerpos secciones fijadas con PFA durante la noche a una temperatura de 4°C. Se visualizó FoxP3 utilizando el anticuerpo de anticonejo de cabra Alexa 594 (1:1000, Molecular Probes). Las secciones se marcaron con contador con DAPI y se montaron con Vectashield (Vector Laboratories). Para cuantificación de células positivas, se revisó un mínimo de cinco campos de división de cada sección, utilizando el software de generación de imágenes y las configuraciones del microscopio descritas anteriormente.

Histología Se fijaron las muestras de tejido durante tres horas en fijación de Carnoy (60% (v/v) de etanol, 30% (v/v) de cloroformo y 10% (v/v) de ácido acético glacial) a temperatura ambiente con agitación constante. Las muestras se transfirieron al 70% de etanol y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se orientaron para seccionado transversal y se incrustaron en una resina de curación en frío utilizando Technovit 8100 (Heraeus Kulzer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tejido incrustado se montó sobre Histoblocs utilizando Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Se cortaron secciones de cuatro mieras utilizando un microtomo rotatorio (Leica Autocut) adaptado con una cuchilla de vidrio (TAAB Laboratories Equipment Ltd.)- Las secciones de tejido se mancharon utilizando métodos de haemotoxilina/eosina estándares y se revisaron con un microscopio Zeiss Axioskop equipado con objetivos con x10 y x20. Las imágenes se tomaron utilizando una cámara Qlmaging y el software Image Pro Plus. Comparación de Genomas de Especies y Cepas relacionadas con Roseburia El solicitante produjo una secuencia de genoma completo de R. hominis A2-183, la cual estuvo representada por un cromosoma simple 3,592, de 125-pb. La anotación automática y manual del genoma utilizando la plataforma RAST reveló la presencia de cuatro operones ribosomales, 66 ARNs y 3,273 proteínas anticipadas. La Distribución de Categoría de Subsistema para R. hominis A2-183, R. inulinivorans DSM 16841, R. intestinalis L1 -82, R. intestinalis M50/1 y Eubacterium rectale ATCC 33656 se muestra en las figuras 11 a 15, respectivamente.

Esta información ilustra las diferencias en el número de genes (presentados en corchetes) en cada subsistema funcional. Estos genes son muy importantes para transmitir la respuesta de huésped a cada bacteria individual. De manera importante estos genes, tanto en número como en función, son diferentes entre las diversas cepas. Los resultados se resumen a continuación: R. hominis A2-183 Pared Celular y Cápsula (57) Transporte en Membrana (24) Motilidad y Quimiotaxis (49) Regulación y Señalización Celular (16) Letargo y Esporulación (12) Carbohidratos (27 ) E. rectale ATCC 33656 Pared Celular y Cápsula (41) Transporte de Membrana (13) Movilidad y Quimiotaxis (16) Regulación y Señalización celular (9) Letargo y Esporulación (6) Carbohidratos (172) R. ¡ntestinalis L1-82 Pared Celular y Cápsula (35) Transporte de Membrana (36) Movilidad y Quimiotaxis (15) Regulación y Señalización celular (10) Letargo y Esporulación (17) R. ¡ntestinalis M50/1 Pared Celular y Cápsula (28) Transporte de Membrana (37) Movilidad y Quimiotaxis (17) Regulación y Señalización celular (10) Letargo y Esporulación (17) Carbohidratos (201 ) R. ¡nulinovorans DSM 16841 Pared Celular y Cápsula (69) Transporte de Membrana (26) Movilidad y Quimiotaxis (14) Regulación y Señalización celular (9) Letargo y Esporulación (17) Carbohidratos (160) El porcentaje de identidad de secuencia de >3000 genes encontrados en el contig 1, señala las diferencias entre el genoma bacteriano de R. hominis y las bacterias de E. rectale, R. intestinalis y R. inulinivorans Se llevaron a cabo comparaciones entre los genomas de diversas especies Roseburia y las especies relacionadas Eubacterium rectale, la más cercana en forma relativa a R. hominis.

Genoma de referencia R. hominis 585394.12 Genoma E. rectale ATCC336556 515619.3 R. intestinalis L1 -82166486.4 R. intestinalis M50/1166486.5 R. ¡nulinovorans DSM16841 622312.3 El porcentaje de identidad de los genes potenciales entre los diversos genomas Roseburia, fluctúa del 0% hasta aproximadamente el 90% de identidad de secuencia. Muchos genes son hipotéticos y varían entre las cepas. Están presentes un gran número de genes en los genomas R. hominis que están ausentes de los genomas de otras especies Roseburia.

Roseburia hominis tiene 924 genes que no se encuentran en los otros genomas de otras especies Roseburia (0% de identidad) lo que indica que casi el 25% de su genoma es único para R. hominis. Asimismo, la baja homología entre otros genes (<10 a 70%) indica que las funciones de muchos otros genes también es probable que difieran.

La información proporciona una evidencia convincente de que estas bacterias son muy diferentes desde una perspectiva funcional y del genoma y no pueden agruparse sino por su relación filogenética, la cual está basada generalmente en el gen conservado 16S, cuyo gen ribosomal es una pieza conservada del ADN procariótico encontrado en todas las bacterias. Se utilizan las secuencias del gen 16S rARN para filogenia bacteriana y estudios de taxonomía (marcador genético compartido).

La funcionalidad en relación con la respuesta e inmunidad del huésped, es específica de la cepa bacteriana La figura 9, ilustra una comparación de los datos de expresión de gen de tres cepas de bacterias del grupo XlVa (Firmicutes), es decir Roseburia hominis, E. rectale y Roseburia intestinalis. Los datos indican los números de genes únicos expresados a través de las cepas bacterianas filogenéticamente relacionadas después de la exposición a células epiteliales humanas. Se determinó la expresión genética utilizando las microformaciones humanas Affymetrix que contienen 56,000 genes. Esta diferencia refleja las diferencias en sus genomas respectivos. [Estos experimentos son similares a los descritos en cualquier otra parte de la especificación utilizando microformaciones de ratón, aunque se utilizaron microformaciones humanas específicas. La Formación GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 es la primera formación de expresión de genoma humano completa y es la más integral. La microformación Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array (HG-U133 Plus 2.0) comprende 1,300,000 características de oligonucleótido únicas que cubren aproximadamente 47,000 transcripciones y variantes, lo cual a su vez, representa aproximadamente 39,000 de los genes humanos mejor caracterizados. Las líneas celulares utilizadas para evaluar las respuestas de señalización inducidas mediante diferentes bacterias comensales incluyen la línea de célula de colon humano, las células Caco-2 y HT-29, y las bacterias que incluyen R. hominis, E. rectale y R. intestinalis, cuando se compararon contra Salmonella enteritidis , un patógeno entérico. Diferencias funcionales en la bacteria del grupo Cluster XlVa - comparación entre R. hominis y E. rectale La figura 10 muestra que Roseburia hominis induce A20, un regulador negativo de la señalización NF-KB con potente actividad antiinflamatoria mientras que otras cepas bacterianas no tienen efecto. La porción de flagelina de Roseburia hominis también induce A20, a diferencia de Eubacterium rectale, una bacteria relacionada.

Los reactivos de cultivo celular, a menos que se especifique en otra parte, cuando fueron suministrados mediante las líneas celulares Sigma-Aldrich . Caco-2 (ECACC Cat No. 860102002) y HT29 (ATCC) cultivadas en medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementados con 10% de Suero de Bovino Fetal (FBS) (Gibco.RU), 200 mM de L-glutamina y 1% de antibióticos/antimicóticos, se sembraron en una placa de transdepósito de seis depósitos (Corning). Las células se incubaron a una temperatura de 37°C en una atmósfera C02 al 5% hasta 3 días después de la confluencia, se lavaron con solución de Hanks para eliminar los antibióticos y FCS y se retiró en DMEM suplementado con L-glutamina, selenito de sodio y transferina durante 24 horas sin antibiótico. Posteriormente los insertos de transdepósito fueron transferidos a una caja de cultivo anaeróbico dentro de la estación de trabajo anaeróbica a una temperatura de 37°C. El compartimento superior de cada inserto se llenó con un medio celular DMEM anaeróbico, en tanto que el compartimento inferior se llenó con DMEM oxigenado.

Se recolectaron Roseburia hominis A2-183 y E. rectale ATCC336556 en un medio de cultivo YCFA y M2 estándar y Salmonella enteric serovar enteritidis cultivado en caldo LB, en una fase experimental mediante centrifugación en 3,500xg durante 5 minutos. El pelet se lavó y resuspendió en DMEM anaeróbico. Se agregaron a los depósitos experimentales cien microlitros de suspensión de bacterias (108 CFU/mL). Los depósitos de control recibieron alguna cantidad de medios en células bacterianas. El control adicional incluyó células bacterianas incubadas sin células Caco-2 o HT29.

Se recolectaron células bacterianas y eucarióticas después de 2 y 4 horas de incubación. Se aspiraron las bacterias tanto adherentes como no adherentes y se almacenaron en ARNIater. Se recolectaron células Caco-2 o células HT-29 de los depósitos y también se almacenaron en ARNIater.

Ensayo de Luciferasa para determinación de expresión de gen de luciferasa A20 Se utilizó el reactivo de transfeccion Fugene® 6 (Roche, RU) para la transfeccion de células HT29 con los plásmidos que llevan el gen reportero de luciferasa bajo el control del promotor A20 pLuc-A20 y pLuc-A20A NF-?? (mutado en 3 nucleótidos en la región promotora A20) y el gen reportero GFP bajo el control del promotor A20 pC AGG S-G F P\A20 y pLuc-GL2\NF-kB. Después de 48 horas, las células se estimularon con las bacterias vivas R. hominis, E. rectale y S. enteritidis y las flagelinas recombinantes; S. enteritidis y R. hominis (Fia 1) (100 ng/ml) durante 9, 12 y 24 horas. Las flagelinas recombinantes se generaron utilizando secuencias de longitud total clonadas en vectores adecuados y expresadas en E. coli JM109, BL21 y Rosetta. Se determinaron las actividades de Luciferasa (Luciérnaga - f-Luc y renilla -r-Luc) utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo® (Promega, RU) y un Lector Multimarca Envision 2102. Se obtuvo la actividad de reportero de reportero de luciferasa relativa mediante normalización para el control de renilla.

Varias modificaciones y variaciones de los aspectos descritos de la presente invención podrán ser apreciados por los expertos en la técnica sin apartarse de la esencia y alcance de la misma. Aunque la presente invención ha sido descrita en relación con modalidades preferidas específicas, deberá quedar entendido que la misma, tal como se reivindica no debe ser limitada indebidamente a dichas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la presente invención, los cuales son obvios para los expertos en los campos relevantes, están proyectadas para estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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Claims (38)

REIVINDICACIONES

1. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en regular el sistema inmune de un sujeto.

2. Una especie bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, para utilizarse para regular el sistema inmune de adaptación de un sujeto.

3. Una especie bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1 para utilizarse en regular el sistema inmune innato de un sujeto.

4. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en el mantenimiento de homeostasis inmune en un sujeto.

5. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en el tratamiento de trastorno inmune en un sujeto.

6. Una especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el trastorno inmune se selecciona de colitis ulcerativa, pouchitis, otras condiciones autoinmune que incluyen artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, alergias que incluyen enfermedad coliaca, dermatitis atópica y rinitis.

7. La especie de bacteria Roseburia hominis para utilizarse en el tratamiento de un trastorno seleccionado de trastorno inflamatorio, un trastorno autoinmune y un trastorno intestinal en un sujeto.

8. Una especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el trastorno se selecciona de síndrome de intestino irritable (IBS), colitis, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, pouchitis, dispepsia funcional, constipación funcional, diarrea funcional (incluyendo diarrea asociada con antibióticos, diarrea de viajero y diarrea pediátrica), dolor abdominal funcional, inflamación funcional, Síndrome de Dolor Epigástrico, Síndrome de Distención Postprandial, enfermedad de reflujo gastrointestinal (GERD), enfermedades autoinmune tales como diabetes, artritis, esclerosis múltiple y alergias por psoriasis, enfermedades atópicas por ejemplo dermatitis atópica, enterocolitis necrotizante, otras infecciones y combinaciones de los mismos.

9. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse para mejorar la microbiota intestinal en un sujeto.

10. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse para regular el apetito en un sujeto.

11. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse para promover la salud intestinal en un sujeto.

12. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse para promover las células Tregs y los mecanismos de tolerancia en el sistema inmune de un sujeto.

13. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, la cual regula la inducción y/o expresión de al menos un gen de movilización o quimiotaxis.

14. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con la reivindicación 13, que activa la expresión de al menos un gen de movilización o quimiotaxis, y en donde el gen se selecciona de MobA y MobL.

15. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que regula al menos un gen seleccionado de FlaA1, Fla2, FlaA3, y FlaB.

16. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual regula la expresión de al menos uno de los siguientes: acetiltransferasa de acetil-CoA, deshid rogenasa de 3-hidroxiacil-CoA, deshidrogenasa de butiril-CoA, subunidad beta de flavoproteína de transferencia de electrones, subunidad alfa de flavoproteína de transferencia de electrones.

17. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual desactiva la expresión de al menos un gen seleccionado de Agt, Cartpi, Cck, Cxc¡12 y Gcg.

18. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que activa al menos un gen de respuesta inmune en el colon o íleon.

19. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que activa la respuesta inmune de adaptación mediante la regulación de la inducción y/o expresión de genes asociados con regulación de célula T.

20. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que activa la expresión de al menos un gen seleccionado de Ly6g6c y Ly6g6e en el colon ascendente.

21. La especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que regula la expresión de al menos un gen seleccionado de Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a.

22. El uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un medicamento para regular el sistema inmune de un sujeto.

23. El uso de una especie bacteriana de acuerdo con la reivindicación 22, en la preparación de un medicamento para regular el sistema inmune de un sujeto.

24. El uso de una especie bacteriana de acuerdo con la reivindicación 22, en la preparación de un medicamento para regular el sistema inmune de adaptación de un sujeto.

25. El uso de la especie bacteriana Roseburia hominis, en la preparación de un medicamento para mantener la homeostasis inmune en un sujeto.

26. El uso de la especie bacteriana Roseburia hominis en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno inmune en un sujeto.

27. Un método para regular el sistema inmune de un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

28. Un método para activar el sistema inmune innato de un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

29. Un método para activar el sistema inmune de adaptación de un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

30. Un método para tratar un trastorno inmune en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente efectiva de la especie bacteriana Roseburia hominis.

31. Una especie bacteriana para utilizarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 21, o un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 27 a la 30, o un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 22 a la 26, en donde el sujeto es un mamífero, preferentemente un humano.

32. La especie bacteriana Roseburia hominis para utilizarse en medicina.

33. Una composición farmacéutica que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, trasportador o diluyente.

34. Un suplemento nutricional que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis y un excipiente, transportador o diluyente nutricionalmente aceptable.

35. Una composición probiótica que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

36. Un alimento, producto alimenticio, suplemento de dieta, suplemento nutricional o aditivo de alimentos que comprende la especie bacteriana Roseburia hominis.

37. Un proceso para producir una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el proceso comprende administrar la especie bacteriana Roseburia hominis con un excipiente, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

38. Un proceso para producir un suplemento nutricional de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el proceso comprende mezclar en adiciones la especie bacteriana Roseburia hominis con un excipiente, transportador o diluyente nutricionalmente aceptable.