CN111902153A - 用于治疗或预防癌症的组合疗法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种包含细菌菌株的组合疗法，用于治疗或预防癌症。

Description

用于治疗或预防癌症的组合疗法

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防癌症的组合疗法的领域：包含细菌菌株的组合物与PD-L1抑制剂的组合，用于治疗或预防癌症。

背景技术

人们认为人的肠在子宫内是无菌的，但在出生后立即暴露于多种多样的母体和环境微生物。此后，微生物定植和演替的动态期发生，其受诸如分娩方式、环境、饮食、及宿主基因型的因素影响，所有这些因素皆影响肠道微生物群的组成，特别是在生命早期。随后，微生物群稳定，且变得像成人一样[1]。人肠道微生物群含有多于500-1000种不同的演化型，其基本上属于两个主要细菌分类(拟杆菌门(Bacteroidetes)及厚壁菌门(Firmicutes))[2]。由人肠的细菌定植引起的成功共生关系已产生广泛多种代谢、结构、保护和其他有益功能。定植的肠的代谢活动增强确保否则难消化的膳食组分降解，同时伴有副产物的释放，由此提供用于宿主的重要营养源。类似地，肠道微生物群的免疫学重要性为公认的，且在免疫系统受损的无菌动物中例证，所述免疫系统在引入共生细菌后在功能上复原[3-5]。

已在胃肠病症诸如炎症性肠病(IBD)中记录微生物群组成的显著变化。例如，在IBD患者中，梭菌(Clostridium)集群XIVa细菌的水平降低，而大肠杆菌(E.coli)的数目增加，提示肠内共生生物(symbiont)与致病生物(pathobiont)的平衡的偏移[6-9]。令人感兴趣地，此微生物生态失调也与T效应细胞群中的失衡有关。

鉴于某些细菌菌株可对动物肠具有潜在的积极作用，已提出将各种菌株用于治疗各种疾病(参见，例如[10-13])。也已提出将某些菌株(包括大多数乳杆菌(Lactobacillus)和双叉杆菌(Bifidobacterium)菌株)用于治疗各种与肠无直接关联的炎症性及自身免疫疾病(参见[14]和[15]的综述)。然而，不同疾病与不同细菌菌株之间的关系，以及具体细菌菌株对肠及在全身水平下且对任何具体类型疾病的确切作用尚未充分表征。例如，某些肠球菌属(Enterococcus)物种参与引起癌症[16]。相比之下，物种鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)的菌株也已公开用于治疗和预防癌症[54]。

由于癌症的各种性质，开发不同治疗模式以便治疗不同的患者组。已证实有效的一种治疗模式为使用免疫检查点抑制剂(ICI)。ICI为抑制癌细胞防止宿主免疫细胞攻击癌细胞的能力的化合物。ICI可为例如已针对跨膜受体程序性细胞死亡1蛋白(称为PDCD1、PD-1、PD1或CD279)与其配体、即PD-1配体1(称为PD-L1、PDL1或CD274)之间的相互作用开发的治疗性抗体。

尽管用ICI治疗癌症患者当有效时可产生长效且显著的临床作用，但仍有相当大百分比的患者对ICI治疗无反应或仅有部分反应。因此，在本领域中需要预防和治疗癌症的新型和改进的治疗模式，且尤其是可改善PD-L1抑制剂的治疗效果的治疗模式。

发明内容

本发明涉及用于治疗和预防癌症的新颖组合疗法。具体来说，本发明涉及改进的疗法，其中物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株和PD-L1抑制剂的顺序和/或部分同时施用产生比用所述细菌菌株或PD-L1抑制剂单独的治疗更有效的癌症治疗。

包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物一般来说在疗法中是有效的，且尤其有效治疗或预防癌症，如在下文及[54]中所示。本发明进一步部分地基于在施用PD-L1抑制剂和包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物两者之后实现的意外效果。如本文所用，术语“本发明的组合”、“本发明的治疗组合”及“治疗组合”可互换使用并且指代以下治疗组合：(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与(b)PD-L1抑制剂。应理解，治疗组合的情境中的术语“组合”不指代有必要在相同组合物中和/或同时施用的组合的组分(a)和(b)。根据优选实施方案，治疗组合的(a)与(b)是在单独的组合物中。根据一些实施方案，本文提供本发明的组合，用于治疗或预防受试者的癌症的方法中。根据一些实施方案，本文提供一种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用本发明的治疗组合。

根据一些实施方案，在治疗组合的情境中细菌组合物的施用使得能够治疗对在无细菌组合物下施用的免疫检查点抑制剂的治疗无反应或显示反应不足的癌症患者。根据一些实施方案，对ICI疗法无反应或部分反应的患者可为ICI初次治疗的(即，其先前未曾接受ICI疗法)或其可在先前成功施用ICI之后变为无反应者或部分反应者。

不希望受理论或机制的约束，此效果可经由调节改善PD-L1抑制剂的效率的介质，诸如经由增加浸润肿瘤的CD8⁺T细胞或增加浸润肿瘤的CD8⁺T细胞与FoxP3+细胞的比率实现。

根据一方面，本文提供了一种治疗组合，用于治疗或预防受试者的癌症的方法中，其中所述治疗组合包含：

(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与

(b)PD-L1抑制剂。

根据一些实施方案，本文提供了一种包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防受试者的癌症的方法中，其中所述组合物与PD-L1抑制剂组合使用。

根据一些实施方案，本文提供了一种包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的第一组合物，其是与包含PD-L1抑制剂的第二组合物组合用于治疗或预防受试者的癌症的方法中，任选地其中所述第一组合物在首次施用所述第二组合物之前和/或与施用所述第二组合物同时施用，任选地其中所述受试者对使用免疫检查点抑制剂单独的先前治疗无反应。

根据另一方面，本文提供了一种治疗或预防有此需要的受试者的癌症的方法(在本文中也称为“本发明的方法”)，所述方法包括：(a)向所述受试者施用包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；及(b)向所述受试者施用PD-L1抑制剂。

根据另一方面，本文提供了一种试剂盒，其包含：(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；和(b)包含PD-L1抑制剂的组合物。

根据一些实施方案，癌症选自由下列各病组成的组：乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤(诸如非霍奇金氏淋巴瘤)、肝细胞瘤及神经内分泌癌。根据一些实施方案，所述治疗组合是用于治疗或预防肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、肝细胞瘤、神经内分泌癌或结肠癌的方法中。根据一些实施方案，癌症是选自由下列各病组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌及头颈癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合或方法在癌症治疗中用于减小肿瘤尺寸或防止肿瘤生长。根据一些实施方案，本发明的治疗组合或方法用于以下至少一者：减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长、预防转移或预防血管生成。

根据一些实施方案，术语“组合物”、“细菌组合物”及“本发明的组合物”可互换使用并且是指包括在本发明的治疗组合中的组合物，其包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株。根据一些实施方案，包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物不含来自任何其他物种的细菌或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种的细菌。根据一些实施方案，鹑鸡肠球菌的密切相关菌株也可用作治疗组合的一部分，诸如具有与鹑鸡肠球菌的细菌菌株的16srRNA序列至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％相同的16s rRNA序列的细菌菌株。优选地，细菌菌株具有与SEQ ID NO:1或2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％相同的16s rRNA序列。优选地，序列同一性是针对SEQ ID NO:2。优选地，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列。

因此，本发明的治疗组合可包含含有细菌菌株的组合物，所述细菌菌株具有与鹑鸡肠球菌的细菌菌株的16s rRNA序列(任选地与SEQ ID NO:2)至少95％相同的16s rRNA序列，所述组合物是用于治疗或预防癌症的方法中。鹑鸡肠球菌在一些实施方案中，组合物中的细菌菌株不为鹑鸡肠球菌的，但为密切相关的菌株。

在某些实施方案中，本发明的组合物用于经口施用。本发明菌株的经口施用可有效用于治疗癌症，特别是当作为本发明的治疗组合的一部分施用时。再者，经口施用对于患者及开业者是方便的且容许递送至和/或部分或完全定植于肠。根据一些实施方案，用作本发明的治疗组合的一部分的PD-L1抑制剂是静脉内施用的。根据一些实施方案，治疗组合的细菌组合物与PD-L1抑制剂各自存在于单独的组合物中，其各自可能包含适于其施用模式的载剂和/或赋形剂。在某些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。在某些实施方案中，PD-L1抑制剂是在包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂的组合物中。

在某些实施方案中，本发明的细菌组合物包含已冻干的细菌菌株。冷冻干燥是用于制备容许递送细菌的稳定组合物的有效和适宜技术。根据一些实施方案，在组合物中的细菌菌株能够部分或完全定植于肠。

在某些实施方案中，细菌组合物是包含在食物产品内。在某些实施方案中，细菌组合物是包含在疫苗内。

根据一些实施方案，细菌组合物包含鹑鸡肠球菌的单一菌株。根据一些实施方案，细菌组合物包含鹑鸡肠球菌细菌菌株作为微生物聚生体(consortium)的一部分。优选地，细菌组合物包含在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌菌株。

根据一些实施方案，PD-L1抑制剂选自由下列各物组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐单抗(Durvalumab)及其组合。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂选自由下列各物组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、BMS-936559、LY3300054、CK-301、3D-2-02-0015、SHR-1316、FAZ053及其组合。

根据本发明方法的一些实施方案，在向受试者首次施用PD-L1抑制剂之前向受试者施用细菌组合物。根据本发明方法的一些实施方案，在首次施用PD-L1抑制剂之前至少一周、两周、三周或四周向受试者施用细菌组合物。应理解，在本发明方法的情境下，PD-L1抑制剂的首次施用是指作为本发明的治疗组合的一部分的首次施用。在施用本发明的治疗组合之前，可能已向受试者施用PD-L1抑制剂，而在施用PD-L1抑制剂期间/之前不施用本发明的细菌组合物。根据一些实施方案，在施用本发明的治疗组合与先前施用PD-L1抑制剂单独或细菌组合物单独之间过去了至少一周、两周、三周或四周。

根据本发明方法的一些实施方案，与向受试者施用PD-L1抑制剂至少部分同时向受试者施用细菌组合物。在细菌组合物与PD-L1抑制剂的施用时间的情境下，至少部分同时施用是指可完全(例如，两种组分都在12个月的过程中施用)或部分(例如，一种组分在12个月的过程中施用且第二种组分在8个月的过程中施用，其可与12个月时期完全或部分重迭)重迭地施用。应理解，两种组分的同时施用不意味着两种组分必须使用相同的给药方案施用。根据本发明方法的一些实施方案，在向受试者首次施用PD-L1抑制剂之前和/或与施用PD-L1抑制剂至少部分同时向所述受试者施用细菌组合物。根据某些实施方案，在首次施用PD-L1抑制剂之前至少一周、两周、三周或四周向受试者施用细菌组合物，接着在至少两周、四周或六周期间至少部分同时施用细菌组合物与PD-L1抑制剂。

根据一些实施方案，物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株与PD-L1抑制剂是在单独的组合物中，优选其中细菌组合物被调配用于经口施用，而PD-L1抑制剂是在被调配用于静脉内施用的制剂中。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合是用于治疗或预防对使用免疫检查点抑制剂单独的先前治疗无反应的受试者的癌症。如本文所用，对免疫检查点抑制剂的治疗无反应的受试者是指根据RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumours)准则或根据irRECIST(immune-related Response Evaluation Criteria In Solid Tumours)准则无反应的受试者。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合是用于治疗或预防受试者的癌症，其中PD-L1抑制剂或细菌组合物单独不能在受试者中提供有效的癌症治疗或预防。根据一些实施方案，受试者中的癌症的有效治疗包括以下至少一者：减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长和/或预防转移，至将造成受试者中的癌症的完全或部分缓解的程度。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合能够减小肿瘤尺寸和/或减慢肿瘤生长和/或预防转移和/或预防血管生成至比PD-L1抑制剂或细菌组合物单独更高的程度。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合是用于治疗受试者的癌症，以使得受试者的癌症完全缓解，优选在比使用PD-L1抑制剂或细菌组合物单独的治疗所实现的更短的时段内。

本发明还提供了一种包含PD-L1抑制剂的组合物，其是用于治疗或预防先前接受施用包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株(优选在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株)的组合物的受试者的癌症的方法中。

本发明还提供了一种组合物，其包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株，优选在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株，其是用于治疗或预防被诊断为需要用PD-L1抑制剂治疗的受试者的癌症的方法中。

附图说明

图1A：乳腺癌的小鼠模型-肿瘤体积。

图1B：上图：在EMT6肿瘤中的坏死区域(未治疗n＝6，媒介物n＝6，MRx0518 n＝8)。下图：EMT6肿瘤中的分裂细胞的百分比。P＝0.019(未治疗n＝4，计数的细胞总数＝37201，载体n＝6，计数的细胞总数＝64297，MRx0518 n＝6，计数的细胞总数＝33539)。

图1C：乳腺癌的小鼠模型-免疫细胞浸润。散布图表示来自各治疗组的个别动物的不同免疫标志物的细胞计数。

图1D：乳腺癌的小鼠模型-肿瘤溶解产物中的细胞因子产生。柱表示来自各治疗组的总蛋白的平均值pg/ml。*p<0.05，介于各组之间，使用单向ANOVA，继之以Dunnett多重比较检验。

图1E：乳腺癌的小鼠模型-血浆中的细胞因子产生。柱表示来自各治疗组的平均值pg/ml(+/-SEM)。

图1F：用针对CD8α的抗体免疫标记(下图)并用DAPI对比染色(上图)的来自媒介物、MRx0518及CTLA-4治疗的小鼠的回肠低温切片的代表性图像。

图1G：定量每视野具有多于3个CD8α+细胞的动物研究子集的绘图，这些细胞是取自用媒介物、MRx0518或CTLA-4治疗的小鼠的回肠隐窝区。

图2：肺癌的小鼠模型-肿瘤体积。

图3A：肝癌的小鼠模型-肝脏重量。

图3B：肾癌的小鼠模型-肿瘤体积。

图4A：未成熟的树突细胞(无细菌)中的细胞因子水平(pg/ml)。

图4B：添加LPS之后的未成熟的树突细胞中的细胞因子水平(pg/ml)。

图4C：添加MRX518之后的未成熟的树突细胞中的细胞因子水平(pg/ml)。

图4D：添加MRX518和LPS之后的未成熟的树突细胞中的细胞因子水平(pg/ml)。

图5A：THP-1细胞(无细菌)中的细胞因子水平。

图5B：添加细菌沉积物之后的THP-1细胞中的细胞因子水平。

图5C：添加MRX518单独或与LPS组合之后的THP-1细胞中的细胞因子水平。

图6：描绘在各种治疗之后的增殖CD8+细胞的百分比的条形图(NCD-无细胞分裂，1RCD-一次细胞分裂，2RCD-两次细胞分裂，3RCD-三次细胞分裂，4RCD-四次细胞分裂)。

图7A：下文所述的实施例6中使用的不同组的治疗方案的示意图。

图7B：在带有由EMT-6细胞形成的肿瘤的小鼠中的平均肿瘤体积。小鼠是未治疗的或用以下治疗：YCFA媒介物(Vehicle)、在YCFA培养基中的MRx518细菌(MRx518)、抗PD1抗体及YCFA培养基(抗PD1)、抗CTLA-4抗体及YCFA培养基(抗CTLA-4)、MRx518与抗PD1抗体的组合或MRx518与抗CTLA-4抗体的组合。

具体实施方式

细菌菌株

本发明的组合物包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株。这些实施例论证包含此物种的细菌的治疗组合适用于治疗或预防癌症。

根据一些实施方案，本文提供了一种治疗组合，其是用于治疗或预防受试者的癌症的方法中，其中所述治疗组合包含：

(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与

(b)PD-L1抑制剂

根据一些实施方案，包含具有与鹑鸡肠球菌的细菌菌株的16s rRNA序列至少95％相同的16s rRNA序列的细菌菌株的组合物可用于本发明的治疗组合和方法中。根据某些实施方案，本发明还提供了一种组合物，其包含具有与SEQ ID NO:2至少95％相同的16s rRNA序列的细菌菌株，其与PD-L1抑制剂组合用于治疗或预防癌症。在一些实施方案中，组合物中的细菌菌株不为鹑鸡肠球菌，但为密切相关的菌株。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含具有与SEQ ID NO:2至少95％相同的16srRNA序列的细菌菌株，例如，其为鹑鸡肠球菌，且不含任何其他细菌属。在某些实施方案中，本发明的组合物包含具有与SEQ ID NO:2至少95％相同的16s rRNA序列的细菌菌株的单一菌株，例如，其为鹑鸡肠球菌，且不含任何其他细菌菌株或物种。

鹑鸡肠球菌形成球菌细胞，大部分为成对的或短链。其为不动的且在血液琼脂或营养琼脂上的菌落为环形且光滑的。鹑鸡肠球菌与蓝斯费氏D群抗血清反应。鹑鸡肠球菌的模式菌株为F87/276＝PB21＝ATCC 49573＝CCUG 18658＝CIP 103013＝JCM 8728＝LMG13129＝NBRC 100675＝NCIMB 702313(旧称NCDO 2313)＝NCTC 12359[17]。鹑鸡肠球菌的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为AF039900(本文公开为SEQ ID NO:1)。示例性鹑鸡肠球菌菌株描述于[17]中。

在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌细菌在实施例中进行测试并且在本文中也称为菌株MRX518。MRX518与MRx0518可互换使用。所测试的MRX518菌株的16S rRNA序列提供于SEQ ID NO:2中。菌株MRX518是在2015年11月16日由4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)的国际寄存机构NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB219YA,Scotland)寄存为“肠道球菌物种”并且分配登录号NCIMB42488。

菌株MRX518的基因组包含染色体和质粒。菌株MRX518的染色体序列提供于WO2017/085520的SEQ ID NO:3中。菌株MRX518的质粒序列提供于WO2017/085520的SEQ IDNO:4中。使用PacBio RS II平台生成这些序列。

还预期与实施例中测试的菌株密切相关的细菌菌株有效用于本发明的治疗组合中的癌症治疗或预防。在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与鹑鸡肠球菌的细菌菌株的16s rRNA序列至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％相同的16s rRNA序列。优选地，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与SEQ ID NO:1或2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％相同的16s rRNA序列。优选地，序列同一性是针对SEQ ID NO:2。优选地，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列。

作为在登录号42488下寄存的细菌的生物型的细菌菌株也预期在本发明的治疗组合的情境下有效用于治疗或预防癌症。生物型为具有相同或极其相似的生理和生物化学特征的密切相关的菌株。

作为在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌的生物型且适用于本发明的治疗组合中的菌株可通过为在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌的其他核苷酸序列测序来鉴别。例如，可为大体上整个基因组测序并且用于本发明的治疗组合中的生物型菌株可在至少80％其整个基因组上(例如在至少85％、90％、95％或99％上，或在其整个基因组上)具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。例如，在一些实施方案中，生物型菌株在至少98％其基因组上具有至少98％序列同一性或在99％其基因组上具有至少99％序列同一性。用于鉴别生物型菌株中的其他合适的序列可包括hsp60或重复序列，诸如BOX、ERIC、(GTG)₅、或REP或[18]。生物型菌株可具有与在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌的相应序列拥有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株MRX518的相应序列拥有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列并且包含与SEQ ID NO:2至少99％相同(例如，至少99.5％或至少99.9％相同)的16S rRNA序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株MRX518的相应序列拥有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列并且具有SEQ IDNO:2的16S rRNA序列。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3拥有序列同一性的染色体。在优选实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少90％序列同一性(例如，至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的染色体。举例来说，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株可具有以下染色体：与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在70％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在80％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在90％的WO2017/085520的SEQID NO:3上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在100％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ IDNO:3在70％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在80％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在90％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在100％的WO2017/085520的SEQ IDNO:3上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在70％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在80％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在90％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在95％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在100％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在90％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少99.5％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在95％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少99.5％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQID NO:3在98％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少99.5％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在100％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少99.5％序列同一性。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4拥有序列同一性的质粒。在优选实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少90％序列同一性(例如，至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的质粒。举例来说，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株可具有以下质粒：与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在70％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在80％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在90％的WO2017/085520的SEQ IDNO:4上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在100％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少90％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在70％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在80％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在90％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在100％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少95％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在70％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在80％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ IDNO:4在90％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少98％序列同一性、或与WO2017/085520的SEQ ID NO:4在100％的WO2017/085520的SEQ ID NO:4上拥有至少98％序列同一性。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株可具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3拥有序列同一性的染色体及与WO2017/085520的SEQ ID NO:4拥有序列同一性的质粒。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有拥有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3(例如如上所述)的序列同一性的染色体，及拥有与SEQ ID NO:1或2(例如如上所述)的任一者的序列同一性的16S rRNA序列，优选具有与SEQ ID NO:2至少99％相同的16s rRNA序列，更优选地，其包含SEQ ID NO:2的16S rRNA序列，且任选地包含具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4(如上所述)的序列同一性的质粒。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有拥有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3(例如如上所述)的序列同一性的染色体，且任选地包含拥有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4(如上所述)的序列同一性的质粒，且有效用于治疗或预防癌症。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有拥有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3(例如如上所述)的序列同一性的染色体，及拥有与SEQ ID NO:1或2(例如如上所述)的任一者的序列同一性的16S rRNA序列，且任选地包含具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4(如上所述)的序列同一性的质粒，并且有效用于治疗或预防癌症。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列至少99％、99.5％或99.9％相同的16s rRNA序列(例如，其包含SEQ IDNO:2的16S rRNA序列)及与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在至少90％的WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少95％序列同一性的染色体，且任选地包含拥有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4(如上所述)的序列同一性的质粒，并且其有效用于治疗或预防癌症。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株具有与由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列至少99％、99.5％或99.9％相同的16s rRNA序列(例如，其包含SEQ IDNO:2的16S rRNA序列)及与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在至少98％(例如在至少99％或至少99.5％)WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少98％序列同一性(例如至少99％或至少99.5％序列同一性)的染色体，且任选地包含拥有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4(如上所述)的序列同一性的质粒，并且其有效用于治疗或预防癌症。

在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株为鹑鸡肠球菌且具有与由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列至少99％、99.5％或99.9％相同的16s rRNA序列(例如，其包含SEQ ID NO:2的16S rRNA序列)及与WO2017/085520的SEQ ID NO:3在至少98％(例如在至少99％或至少99.5％)WO2017/085520的SEQ ID NO:3上拥有至少98％序列同一性(例如至少99％或至少99.5％序列同一性)的染色体，且任选地包含拥有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4(如上所述)的序列同一性的质粒，并且其有效用于治疗或预防癌症。

或者，作为在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌的生物型且适用于本发明的治疗组合中的菌株可通过使用登录号NCIMB 42488寄存物及限制片段分析和/或PCR分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(FAFLP)和重复DNA元件(rep)-PCR指纹分析、或蛋白质谱、或部分16S或23s rDNA测序来鉴别。在优选实施方案中，此类技术可用于鉴别其他鹑鸡肠球菌菌株。

在某些实施方案中，作为在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌的生物型且适用于本发明的治疗组合中的菌株为提供与在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌相同的模式的菌株，当通过扩增核糖体DNA限制分析(ARDRA)所分析时，例如当使用Sau3AI限制酶时(关于示例性方法和指导，参见例如[19])。或者，生物型菌株被鉴定为具有与在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌相同的碳水化合物发酵模式的菌株。在一些实施方案中，使用API 50CHL板(bioMérieux)确定碳水化合物发酵模式。在一些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株为：

(i)对于以下中的至少一种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种或所有)的发酵呈阳性：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡糖、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、蔗糖、D-海藻糖、龙胆二糖、D-塔格糖及葡萄糖酸钾；和/或

(ii)作为以下中的至少一种(例如，至少2、3、4种或所有)的发酵的中间体：D-甘露糖醇、甲基-αD-吡喃葡糖苷、D-乳糖、淀粉及L-海藻糖；

优选地如通过API 50CHL分析(优选使用来自bioMérieux的API50CHL板)所确定。

适用于本发明的组合物和方法中的其他鹑鸡肠球菌菌株(诸如在登录号NCIMB42488下寄存的细菌的生物型)可使用任何适当方法或策略(包括实施例中所述的测定)来鉴别。例如，用于本发明的治疗组合中的菌株可通过以下步骤来鉴别：在厌氧性YCFA中培养和/或向II型胶原诱发的关节炎小鼠模型施用细菌，接着评估细胞因子水平。具体来说，与在登录号NCIMB 42488下寄存的细菌具有相似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可适用于本发明的治疗组合中。有用的菌株将与NCIMB 42488菌株具有相当的免疫调节活性。具体来说，生物型菌株将对癌症疾病模型引发与实施例中所示的作用相当的作用，这可通过使用实施例中所述的培养和施用方案来鉴别。根据一些实施方案，可用于本发明的治疗组合中的生物型菌株为当在本发明的治疗组合或方法中施用时能够对癌症疾病模型引发与实施例中所示相同的作用的菌株。

在一些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株为：

(i)对以下中的至少一种(例如，至少2、3、4、5、6、7种或所有)呈阳性：甘露糖发酵、谷氨酸脱羧酶、精氨酸芳基酰胺酶、苯丙氨酸芳基酰胺酶、焦谷氨酸芳基酰胺酶、酪氨酸芳基酰胺酶、组氨酸芳基酰胺酶及丝氨酸芳基酰胺酶；和/或

(ii)作为以下中的至少一种(例如至少2种或所有)的中间体：β-半乳糖苷酶-6-磷酸、β-葡萄糖苷酶及N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶；和/或

(iii)对以下中的至少一种(例如，至少2、3、4、5、6种或所有)呈阴性：棉子糖发酵、脯氨酸芳基酰胺酶、亮氨酰甘氨酸芳基酰胺酶、亮氨酸芳基酰胺酶、丙氨酸芳基酰胺酶、甘氨酸芳基酰胺酶及谷氨酰基谷氨酸芳基酰胺酶，

优选如通过碳水化合物、氨基酸及硝酸盐代谢的测定且任选地碱性磷酸酶活性的测定所确定，更优选地如通过Rapid ID 32A分析(优选使用来自bioMérieux的Rapid ID32A系统)所确定。

在一些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株为：

(i)对以下中的至少一种(例如，至少2、3种或所有4种)呈阴性：甘氨酸芳基酰胺酶、棉子糖发酵、脯氨酸芳基酰胺酶及亮氨酸芳基酰胺酶，例如，如通过碳水化合物、氨基酸及硝酸盐代谢的测定所确定，优选如通过Rapid ID 32A分析(优选使用来自bioMérieux的Rapid ID 32A系统)所确定；和/或

(ii)对L-海藻糖的发酵呈阳性的中间体，优选地如通过API 50CHL分析(优选使用来自bioMérieux的API 50CHL板)所确定。

在一些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株为胞外ATP生产者，例如产生6-6.7ng/μl(例如，6.1-6.6ng/μl或6.2-6.5ng/μl或6.33±0.10ng/μl)ATP的菌株，如使用ATP测定试剂盒(Sigma-Aldrich,MAK190)所测量。细菌胞外ATP可具有多效性作用，包括激活T细胞受体介导的信号传导(Schenk等人,2011)、促进肠Th17细胞分化(Atarashi等人,2008)以及通过激活NLRP3炎性体诱导促炎介质IL-1β的分泌(Karmarkar等人,2016)。因此，作为胞外ATP生产者的细菌菌株在本发明的治疗组合和方法的情境中适用于治疗或预防癌症。

在一些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株包含以下三个基因中的一个或多个：移动因子蛋白；木糖ABC转运蛋白，即通透酶组分；及FIG00632333：假设蛋白。例如，在某些实施方案中，用于本发明的治疗组合中的细菌菌株包含编码以下各物的基因：移动因子蛋白和木糖ABC转运蛋白，即通透酶组分；移动因子蛋白和FIG00632333：假设蛋白；木糖ABC转运蛋白，即通透酶组分和FIG00632333：假设蛋白；或移动因子蛋白、木糖ABC转运蛋白，即通透酶组分和FIG00632333：假设蛋白。

本发明的治疗组合的尤其优选菌株为在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌菌株。这为实施例中测试的示例性MRX518菌株且显示有效用于治疗疾病。根据一些实施方案，本发明提供作为本发明的治疗组合的一部分的细菌组合物，其包含在登录号NCIMB42488下寄存的鹑鸡肠球菌菌株或其衍生物的细胞。在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株的衍生物可为子菌株(子代)或由原始培养(亚克隆)的菌株。

包含在本发明的治疗组合中的组合物的菌株的衍生物可例如在基因水平下被修饰，而不会消除生物活性。具体来说，本发明的治疗组合的衍生菌株具有治疗活性。衍生菌株将与原始NCIMB 42488菌株具有相当的免疫调节活性。具体来说，衍生菌株当与PD-L1抑制剂组合时将对癌症疾病模型引发与实施例中所示的作用相当的作用，这可通过使用实施例中所述的培养和施用方案来鉴别。NCIMB 42488菌株的衍生物通常将为NCIMB 42488菌株的生物型。

提及在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌菌株的细胞涵盖具有与在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株相同的安全性和治疗功效特征的任何细胞，并且此类细胞是由本发明的治疗组合所涵盖。因此，在一些实施方案中，提及在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌菌株的细胞仅是指在NCIMB 42488下寄存的MRX518菌株且不指代未在NCIMB42488下寄存的细菌菌株。在一些实施方案中，提及在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌菌株的细胞是指具有与在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株相同的安全性和治疗功效特征的细胞，但其不为在NCIMB 42488下寄存的菌株。

在优选实施方案中，在本发明的组合物中的细菌菌株为活的并且能够部分或完全定植于肠。

治疗癌症

在优选实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防癌症。这些实施例论证施用本发明的治疗组合可造成肿瘤生长的减慢。

在某些实施方案中，用本发明的治疗组合的治疗造成肿瘤尺寸减小或肿瘤生长减慢。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于减小肿瘤尺寸或减慢肿瘤生长。本发明的治疗组合可有效用于减小肿瘤尺寸或减慢其生长。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于患有实体肿瘤的患者中。在某些实施方案中，本发明的治疗组合在癌症的治疗中用于减少或预防血管生成。本发明的治疗组合可对免疫或炎症系统有作用，这些系统在血管生成中发挥重要作用。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于预防转移。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防乳腺癌。这些实施例论证本发明的治疗组合可有效用于治疗乳腺癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合在乳腺癌的治疗中用于减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长或减少血管生成。在优选实施方案中，癌症为乳腺癌。在优选实施方案中，癌症为IV期乳腺癌。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防肺癌。这些实施例论证本发明的治疗组合可有效用于治疗肺癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合在肺癌的治疗中用于减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长或减少血管生成。在优选实施方案中，癌症为肺癌。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防肝癌。这些实施例论证本发明的治疗组合可有效用于治疗肝癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合在肝癌的治疗中用于减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长或减少血管生成。在优选实施方案中，癌症为肝细胞瘤(肝细胞癌)。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防结肠癌。这些实施例论证本发明的治疗组合对结肠癌细胞有作用并且可有效用于治疗结肠癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合在结肠癌的治疗中用于减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长或减少血管生成。在优选实施方案中，癌症为结肠直肠腺癌。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防肾癌(在本文中也称为“肾脏癌症”)。这些实施例论证本发明的治疗组合对肾癌细胞有作用并且可有效用于治疗肾脏癌症。在某些实施方案中，本发明的治疗组合在肾脏癌症的治疗中用于减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长或减少血管生成。在优选实施方案中，癌症为肾细胞癌或移行细胞癌。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防黑色素瘤。根据一些实施方案，本发明的治疗组合对黑素细胞有作用并且可有效用于治疗黑色素瘤。在某些实施方案中，本发明的治疗组合在黑色素瘤的治疗中用于减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长或减少血管生成。

在一些实施方案中，癌症为肠的。在一些实施方案中，癌症为不为肠的身体的一部分。在一些实施方案中，癌症不为肠癌。在一些实施方案中，癌症不为结肠直肠癌。在一些实施方案中，癌症不为小肠癌。在一些实施方案中，治疗或预防发生在除肠以外的部位处。在一些实施方案中，治疗或预防发生在肠处以及除肠以外的部位处。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防癌。这些实施例论证本发明的治疗组合可有效用于治疗许多类型的癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防非免疫原性癌。这些实施例论证本发明的治疗组合可有效用于治疗非免疫原性癌。

在本发明的治疗组合的情境中，本发明的细菌组合物对癌症的治疗作用可通过促炎机制介导。实施例2、4及5论证许多促炎细胞因子的表达可在施用MRX518之后增加。炎症可具有癌症抑制效应[20]且促炎细胞因子诸如TNFα经研究作为癌症疗法[21]。实施例中所示的基因诸如TNF的上调可表明本发明的细菌组合物可经由相似机制适用于治疗癌症。CXCR3配体(CXCL9、CXCL10)和IFNγ诱导型基因(IL-32)的上调可表明本发明的细菌组合物引发IFNγ型反应。IFNγ为可刺激杀肿瘤活性的有效的巨噬细胞活化因子[22]，并且CXCL9和CXCL10例如还具有抗肿瘤作用[23-25]。因此，在某些实施方案中，本发明的细菌组合物当在本发明的治疗组合的情境中使用时是用于在癌症治疗中促进炎症。在优选实施方案中，本发明的组合物当在本发明的治疗组合的情境中使用时是用于在癌症治疗中促进Th1炎症。Th1细胞产生IFNγ且具有有效的抗癌效应[20]。在某些实施方案中，本发明的组合物当在本发明的治疗组合的情境中使用时是用于治疗早期癌症，诸如未转移的癌症或0期或1期癌症。促进炎症对早期癌症可更为有效[20]。在某些实施方案中，本发明的组合物当在本发明的治疗组合的情境中使用时是用于促进炎症以增强PD-L1抑制剂的效果。在某些实施方案中，癌症的治疗或预防包含提高一种或多种细胞因子的表达水平。例如，在某些实施方案中，癌症的治疗或预防包含提高IL-1β、IL-6及TNF-α中的一或多者的表达水平，例如IL-1β与IL-6、IL-1β与TNF-α、IL-6与TNF-α、或IL-1β、IL-6及TNF-α的所有三者。已知IL-1β、IL-6及TNF-α中任一者的表达水平的提高指示癌症治疗中的功效。

实施例4和5论证当如本文所述的细菌菌株与脂多糖(LPS)组合使用时，在IL-1β中存在协同增加。已知LPS引发促炎效应。因此，在某些实施方案中，癌症的治疗或预防包含使用如本文所述的细菌菌株与上调IL-1β的试剂的组合。在某些实施方案中，癌症的治疗或预防包含使用如本文所述的细菌菌株与LPS的组合。因此，本发明的治疗组合可另外包含上调IL-1β的试剂。因此，本发明的细菌组合物可另外包含LPS。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗先前接受化学疗法的患者。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗不耐受化学疗法治疗的患者。本发明的治疗组合可尤其适用于此类患者。在其他实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗对免疫检查点抑制剂的先前治疗无反应的癌症患者。在其他实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗对PD-1抑制剂的先前治疗无反应的癌症患者。不希望受理论或机制约束，咸信本发明的细菌组合物能够经由与PD-L1抑制剂不同的机制刺激受试者的免疫系统，由此提供治疗对免疫检查点抑制剂无反应的患者的补充机制。

根据一些实施方案，使用本发明的治疗组合的癌症治疗比单独使用PD-L1抑制剂更有效，如通过RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumours)准则或irRECIST(immune-related Response Evaluation Criteria In Solid Tumours)准则所测量。根据一些实施方案，使用本发明的治疗组合的癌症治疗比单独使用细菌组合物更有效，如通过RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumours)准则或irRECIST(immune-related Response Evaluation Criteria In Solid Tumours)准则所测量。根据一些实施方案，使用本发明的治疗组合的癌症治疗与PD-L1抑制剂单独或细菌组合物单独的治疗相比产生协同的临床作用，如通过RECIST(Response Evaluation Criteria InSolid Tumours)准则或irRECIST(immune-related Response Evaluation Criteria InSolid Tumours)准则所测量。

根据一些实施方案，治疗组合的PD-L1抑制剂为抗体。根据一些实施方案，治疗组合的PD-L1抑制剂为靶向PD-L1的抗体。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于预防复发。在本发明的治疗组合的情境中，细菌组合物可适于长期施用。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于预防癌症的进展。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗小细胞肺癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗鳞状细胞癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗腺癌。在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗腺肿瘤、类癌瘤、或未分化癌。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗肝胚细胞瘤、胆管癌、胆管细胞囊腺癌或由病毒感染引起的肝癌。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗浸润性导管癌、原位乳管癌或浸润性小叶癌。

在另外的实施方案中，本发明的治疗组合是用于治疗或预防急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、类癌瘤、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性脊髓增生病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、神经胶质瘤、儿童期视觉通路和下丘脑、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposisarcoma)、肾细胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、咽癌、垂体腺瘤、浆细胞瘤形成、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。

根据一些实施方案，所述治疗组合是用于治疗或预防选自由下列各病组成的组的癌症：黑色素瘤、NSCLC、膀胱癌及头颈癌。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合包含另外的抗癌剂。根据一些实施方案，另外的抗癌剂选自：靶向抗体免疫疗法、CAR-T细胞疗法、溶瘤病毒、或抑制细胞生长药物。

施用模式

优选地，向胃肠道施用本发明的细菌组合物以便能够实现本发明的细菌菌株递送至和/或部分或完全定植于肠。一般而言，本发明的细菌组合物是经口施用，但其可直肠、鼻内或经由颊内或舌下途径施用。

在某些实施方案中，本发明的细菌组合物可作为泡沫剂、喷雾剂或凝胶来施用。

在某些实施方案中，本发明的细菌组合物可作为栓剂(诸如直肠栓剂，例如呈可可油(可可脂)、合成硬脂肪(例如，suppocire、witepsol)、甘油-明胶、聚乙二醇或皂甘油组合物的形式)来施用。

在某些实施方案中，本发明的细菌组合物经由管(诸如鼻胃管、口胃管、胃管、空肠管(J管))、经皮内窥镜胃造口术(PEG)或口(诸如提供胃、空肠的进入的胸壁口及其他合适进入口)来向胃肠道施用。

本发明的细菌组合物可施用一次，或其可作为治疗方案的一部分依次施用。在某些实施方案中，本发明的细菌组合物有待每天施用。

在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随着对患者肠道微生物群的评估。如果未实现本发明的细菌组合物的菌株的递送和/或用本发明的细菌组合物的菌株进行的部分或完全定植以致于未观察到功效，那么重复治疗，或者如果递送和/或部分或完全定植成功且观察到功效，那么可停止治疗。根据一些实施方案，在首次施用本发明的治疗组合的PD-L1抑制剂之前向受试者施用本发明的细菌组合物。根据一些实施方案，在施用细菌组合物之后且在首次施用PD-L1抑制剂之前评估受试者的肠道微生物群，以便仅在实现组合物中的细菌菌株的菌株的递送和/或部分或完全定植之后施用PD-L1抑制剂。在某些实施方案中，可向怀孕动物(例如哺乳动物，诸如人)施用本发明的治疗组合以降低在其子宫内的儿童中发展和/或在所述儿童出生后发展的癌症的可能性。

本发明的治疗组合可向已诊断患有癌症或已鉴别为处于癌症的风险中的患者施用。所述治疗组合也可作为预防措施来施用，以防止在健康患者中发展癌症。

本发明的治疗组合可向已被鉴别为具有异常肠道微生物群的患者施用。例如，患者可具有减少的或不存在鹑鸡肠球菌的定植。

本发明的细菌组合物可作为食物产品诸如营养补充剂施用。

通常，本发明的治疗组合是用于治疗人，但其可用于治疗包括单胃哺乳动物(诸如家禽、猪、猫、狗、马或兔)的动物。本发明的治疗组合可适用于增强动物的生长和表现。如果向动物施用细菌组合物，那么可使用口服管饲法。

根据一些实施方案，PD-L1抑制剂是静脉内施用。根据一些实施方案，静脉内施用的PD-L1抑制剂是在组合物中，所述组合物任选地还包含至少一种药学上相容的载剂或赋形剂。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂是大致每周、每两周、每三周或每四周，优选每三周静脉内施用。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合的细菌组合物和PD-L1抑制剂是使用不同施用途径来施用。根据一些实施方案，细菌组合物是经口施用，而本发明的治疗组合的PD-L1抑制剂是使用不同途径来施用。根据一些实施方案，治疗组合的PD-L1抑制剂是静脉内施用，而细菌组合物是经口施用。

根据一些实施方案，在向受试者首次施用PD-L1抑制剂之前向所述受试者施用细菌组合物。根据一些实施方案，在向受试者首次施用PD-L1抑制剂之前向所述受试者施用细菌组合物；其中施用细菌组合物直至实现组合物中的细菌菌株的菌株的递送和/或部分或完全定植。根据一些实施方案，在向受试者首次施用PD-L1抑制剂之前向所述受试者施用细菌组合物；其中施用细菌组合物直至发生生物标志物的充分调节，以使得PD-L1抑制剂能够治疗先前对ICI治疗无反应的癌症患者。根据一些实施方案，在首次施用PD-L1抑制剂之前至少一周、两周、三周或四周向受试者施用细菌组合物。根据一些实施方案，在首次施用PD-L1抑制剂之前约两周向受试者施用细菌组合物。根据一些实施方案，在首次施用PD-L1抑制剂之前至少一周、两周、三周或四周向受试者施用细菌组合物，且不与PD-L1抑制剂的施用同时向受试者施用。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合中的细菌组合物的首次施用是在PD-L1抑制剂的首次施用之前。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂的首次施用是在施用细菌组合物之后不超过约1、2、3、4、5、6或7天进行。

根据本发明的方法及治疗组合的一些实施方案，在向受试者施用PD-L1抑制剂的至少部分同时向所述受试者施用细菌组合物。根据一些实施方案，在第一时间段向受试者施用细菌组合物，继之在第二时间段向受试者施用PD-L1抑制剂；其中在所述第二时间段的至少一部分任选地进一步向受试者施用细菌组合物，任选地贯穿整个第二时间段。根据某些实施方案，在第一时间段(诸如但不限于约两周)向受试者施用细菌组合物，继之在第二时间段(诸如但不限于约三周)向受试者施用PD-L1抑制剂。根据某些实施方案，在第一时间段(诸如但不限于约两周)向受试者施用细菌组合物，继之在第二时间段(诸如但不限于约三周)向受试者施用PD-L1抑制剂；其中在所述第二时间段的至少一部分进一步向受试者施用细菌组合物，优选贯穿整个第二时间段。

根据一些实施方案，细菌组合物与PD-L1抑制剂是不在相同的频率下施用。在一非限制性实例中，PD-L1抑制剂是每三周静脉内施用，而细菌组合物是每天或每隔一天经口施用。根据一些实施方案，在第一时间段向受试者施用细菌组合物，继之在第二时间段向受试者施用PD-L1抑制剂；其中在所述第二时间段的至少一部分期间任选地进一步向受试者施用细菌组合物；且其中细菌组合物的施用频率在第一时间段与第二时间段上是不同的。

本发明的治疗组合的细菌组合物

一般来说，包含在本发明的治疗组合中的组合物包含细菌。在本发明的优选实施方案中，细菌组合物是以冷冻干燥形式配制。例如，本发明的细菌组合物可包含颗粒剂或明胶胶囊，例如硬明胶胶囊，其含有本发明的细菌菌株。

优选地，本发明的细菌组合物包含冻干的细菌。细菌的冻干是一种良好确立的程序，且相关指导可在例如参考文献[26-28]中获得。

或者，本发明的细菌组合物可包含活的、活性细菌培养物。

在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株未被灭活，例如未被热灭活。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株未被杀灭，例如未被热杀灭。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株未被减毒，例如未被热减毒。例如，在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株未被杀灭、灭活和/或减毒。例如，在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株为活的。例如，在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株为有活力的。例如，在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株能够部分或完全定植于肠。例如，在一些实施方案中，本发明的细菌组合物中的细菌菌株为有活力的且能够部分或完全定植于肠。

在一些实施方案中，细菌组合物包含活细菌菌株与已被杀灭的细菌菌株的混合物。

在优选实施方案中，本发明的治疗组合的细菌组合物被封装以使细菌菌株能够递送到肠。封装保护细菌组合物免受降解直至经由例如用化学或物理刺激(诸如压力、酶活性或物理崩解(其可由pH值变化触发))破裂来在目标位置处递送。可使用任何适当封装方法。示例性封装技术包括包埋在多孔基质内、附着或吸附在固体载剂表面上、通过絮凝或用交联剂进行自聚集、及机械容纳在微孔膜或微胶囊后面。关于可适用于制备本发明的组合物的封装的指导可在例如参考文献[29]和[30]中获得。

细菌组合物可经口施用且可为片剂、胶囊或粉剂的形式。封装产品为优选的，因为鹑鸡肠球菌为厌氧菌。可包括其他成分(例如，诸如维生素C)作为氧清除剂和益生元底物以改善活体内递送和/或部分或完全定植和存活。或者，本发明的益生菌组合物可作为食物或营养产品(诸如基于乳或乳清的发酵乳产品)或作为药物产品经口施用。

细菌组合物可被配制成益生菌。

本发明的细菌组合物包括治疗有效量的本发明的细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者发挥有益作用。治疗有效量的细菌菌株可足以实现递送至和/或部分或完全定植于患者的肠。

细菌用于例如成年人的合适的日剂量可为约1x10³至约1x10¹¹个菌落形成单位(CFU)；例如，约1x10⁷至约1x10¹⁰CFU；在另一实例中，约1x10⁶至约1x10¹⁰CFU。

在某些实施方案中，相对于组合物的重量，细菌组合物含有约1x10⁶至约1x10¹¹CFU/g之量的细菌菌株；例如，约1x10⁸至约1x10¹⁰CFU/g。剂量可为例如1g、3g、5g及10g。

益生菌(诸如本发明的细菌组合物)可任选地与至少一种合适的益生元化合物组合。益生元化合物通常为不可消化的碳水化合物，诸如寡糖或多糖或糖醇，其不会在上消化道中降解或吸收。已知的益生元包括商业产品，诸如菊糖和反式低聚半乳糖。

在某些实施方案中，相对于总重量组合物，本发明的益生菌细菌组合物包括约1重量％至约30重量％(例如，5重量％至20重量％)之量的益生元化合物。碳水化合物可选自由以下各物组成的组：低聚果糖(或FOS)、短链低聚果糖、菊糖、低聚异麦芽糖、果胶、低聚木糖(或XOS)、低聚壳聚糖(或COS)、β-葡聚糖、阿拉伯胶、改性的和抗性淀粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯胶纤维、角豆树、燕麦及柑橘纤维。在一方面中，益生元为短链低聚果糖(为简单起见，在下文中示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c.为不可消化的碳水化合物，一般通过甜菜糖的转化获得，且包括三个葡萄糖分子所键结的蔗糖分子。

本发明的细菌组合物可包含药学上可接受的赋形剂或载剂。这些合适赋形剂的实例可见于参考文献[31]中。用于治疗用途的可接受的载剂或稀释剂为医药领域中公知的，且描述于例如参考文献[32]中。合适的载剂的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油及水。药物载剂、赋形剂或稀释剂的选择可关于预期施用途径和标准医药实践来选择。药物组合物可包含任何合适的一种(或多种)粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂布剂、增溶剂作为载剂、赋形剂或稀释剂，或除了任何合适的一种(或多种)粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂布剂、增溶剂以外还包含其他载剂、赋形剂或稀释剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(诸如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成胶(诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、及聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料及甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸及对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。

本发明的细菌组合物可被调配为食物产品。例如，除了本发明的治疗作用外，食物产品还可诸如在营养补充剂中提供营养益处。类似地，可配制食物产品以增强本发明组合物的味道，或通过更加类似于普通食物而非药物组合物来使组合物更具消费吸引力。在某些实施方案中，本发明的组合物被调配成乳基产品。术语“乳基产品”意指具有不同脂肪含量的基于任何液体或半固体乳或乳清的产品。乳基产品可为例如牛乳、山羊乳、绵羊乳、脱脂乳、全乳、不经过任何加工而由乳粉和乳清重组的乳、或加工产品诸如酸奶、凝结乳(curdled milk)、凝乳、酸乳、酸全乳、黄油乳及其他酸乳产品。另一重要群包括乳饮料，诸如乳清饮料、发酵乳、浓缩乳、婴儿或幼儿乳；调味乳、冰淇淋；含乳食物，诸如糖果。

在某些实施方案中，本发明的细菌组合物含有单个细菌菌株或种，且不含有任何其他细菌菌株或种。此类细菌组合物可仅包含微量或生物学不相关量的其他细菌菌株或种。此类细菌组合物可为大体上不含其他种类有机体的培养物。因此，在一些实施方案中，治疗组合的细菌组合物包含物种鹑鸡肠球菌的一个或多个菌株，且不含有来自任何其他物种的细菌，或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种的细菌。

在一些实施方案中，本发明的细菌组合物包含一个以上细菌菌株或种。例如，在一些实施方案中，本发明的细菌组合物包含来自同一物种内的一个以上菌株(例如，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或45个菌株)，且任选地不含来自任何其他物种的细菌。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物包含来自同一物种内的少于50个菌株(例如，少于45、40、35、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或3个菌株)，且任选地不含来自任何其他物种的细菌。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物包含来自同一物种内的1-40、1-30、1-20、1-19、1-18、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-50、2-40、2-30、2-20、2-15、2-10、2-5、6-30、6-15、16-25或31-50个菌株，且任选地不含来自任何其他物种的细菌。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物包含来自同一属内的一个以上物种(例如，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、23、25、30、35或40个物种)，且任选地不含来自任何其他属的细菌。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物包含来自同一属内的少于50个物种(例如，少于50、45、40、35、30、25、20、15、12、10、8、7、6、5、4或3个物种)，且任选地不含来自任何其他属的细菌。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物包含来自同一属内的1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-50、2-40、2-30、2-20、2-15、2-10、2-5、6-30、6-15、16-25或31-50个物种，且任选地不含来自任何其他属的细菌。用于本发明的组合中的细菌组合物可包含上述的任何组合。

在一些实施方案中，细菌组合物包含微生物聚生体。例如，在一些实施方案中，细菌组合物包含具有与SEQ ID NO:2至少95％相同的16s rRNA序列的细菌菌株，例如，其为鹑鸡肠球菌，作为微生物聚生体的一部分。例如，在一些实施方案中，所述细菌菌株与来自其他属的一个或多个(例如，至少2、3、4、5、10、15或20个)其他细菌菌株组合存在于细菌组合物中，所述细菌菌株可与其他细菌菌株在活体内共生生活于肠道中。例如，在一些实施方案中，细菌组合物包含具有与SEQ ID NO:2至少95％相同的16s rRNA序列的细菌菌株，例如，其为鹑鸡肠球菌，与来自不同属的细菌菌株组合。在一些实施方案中，微生物聚生体包含两个或两个以上由单一生物(例如人)的粪便样品获得的细菌菌株。在一些实施方案中，微生物聚生体在自然界中未发现在一起。例如，在一些实施方案中，微生物聚生体包含由至少两种不同生物的粪便样品获得的细菌菌株。在一些实施方案中，两种不同生物来自于同一物种，例如两种不同人，例如两种不同人类婴儿。在一些实施方案中，两种不同生物为人类婴儿和成年人。在一些实施方案中，两种不同生物为人和非人哺乳动物。

在一些实施方案中，本发明的细菌组合物另外包含与菌株MRX518具有相同的安全性和治疗功效特征的细菌菌株，但其不为寄存为NCIMB 42488的MRX518或其不为鹑鸡肠球菌。

在一些实施方案中，用于细菌组合物中的细菌菌株获自人类婴儿粪便。在细菌组合物包含多于一个细菌菌株的一些实施方案中，所有细菌菌株皆获自人类婴儿粪便，或如果存在其他细菌菌株，那么这些其他细菌菌株仅以微量存在。细菌可在自人类婴儿粪便中获得之后培养，且在细菌组合物中使用。

如上所提及，在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO:2(例如其为鹑鸡肠球菌)至少95％相同的16s rRNA序列的一种或多种细菌菌株为本发明的细菌组合物中唯一的一种(或多种)治疗活性剂。在一些实施方案中，细菌组合物中的一个(或多个)细菌菌株为组合物中唯一的一种(或多种)治疗活性剂。

根据本发明使用的细菌组合物可需要或不需要上市许可证。

在某些实施方案中，本发明提供以上细菌组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。在某些实施方案中，本发明提供以上细菌组合物，其中所述细菌菌株为喷雾干燥的。在某些实施方案中，本发明提供以上细菌组合物，其中所述细菌菌株为冻干或喷雾干燥的，且其中其为活的。在某些实施方案中，本发明提供以上细菌组合物，其中所述细菌菌株为冻干或喷雾干燥的，且其中其为有活力的。在某些实施方案中，本发明提供以上细菌组合物，其中所述细菌菌株为冻干或喷雾干燥的，且其中其能够部分或完全定植于肠。在某些实施方案中，本发明提供以上细菌组合物，其中所述细菌菌株为冻干或喷雾干燥的，且其中其为有活力的且能够部分或完全定植于肠。

在一些情况下，冻干或喷雾干燥的细菌菌株在施用前复原。在一些情况下，复原是通过使用本文所述的稀释剂来进行。

本发明的细菌组合物可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明中使用的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症为乳腺癌。在优选实施方案中，癌症为乳腺癌。在优选实施方案中，癌症为IV期乳腺癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明中使用的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症为肺癌。在优选实施方案中，癌症为肺癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明中使用的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症为肝癌。在优选实施方案中，癌症为肝癌(肝细胞癌)。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症为结肠癌。在优选实施方案中，癌症为结肠直肠腺癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症为癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症为非免疫原性癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症选自由下列各病组成的组：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、腺癌、腺肿瘤、类癌瘤、未分化癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症选自由下列各病组成的组：肝胚细胞瘤、胆管癌、胆管细胞囊腺癌或由病毒感染引起的肝癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症选自由下列各病组成的组：浸润性导管癌、导管原位癌或浸润性小叶癌。

在某些实施方案中，细菌组合物为一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；及药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中所述细菌菌株之量足以当与PD-L1抑制剂组合向受试者施用时治疗病症；且其中所述病症选自由下列各病组成的组：急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤、类癌瘤、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性脊髓增生病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、神经胶质瘤、儿童期视觉通路和下丘脑、霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤、肾细胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、咽癌、垂体腺瘤、浆细胞瘤形成、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。

在某些实施方案中，相对于组合物的重量，细菌组合物中的细菌菌株之量为每克约1×10³至约1×10¹¹个菌落形成单位。

在某些实施方案中，细菌组合物是以1g、3g、5g或10g的剂量施用。

在某些实施方案中，细菌组合物通过选自由以下途径组成的组的方法来施用：经口、直肠、皮下、鼻、经颊及舌下。

在某些实施方案中，细菌组合物包含选自由以下各物组成的组的载剂：乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇及山梨醇。

在某些实施方案中，本发明提供细菌组合物，其包含选自由以下各物组成的组的稀释剂：乙醇、甘油及水。

在某些实施方案中，细菌组合物包含选自由以下各物组成的组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠及氯化钠。

在某些实施方案中，细菌组合物还包含防腐剂、抗氧化剂及稳定剂中的至少一种。

在某些实施方案中，细菌组合物包含选自由以下各物组成的组的防腐剂：苯甲酸钠、山梨酸及对羟基苯甲酸酯。

在某些实施方案中，当细菌组合物在约4℃或约25℃下储存在密封容器中且将容器置于具有50％相对湿度的气氛中时，如以菌落形成单位所测量，至少80％细菌菌株在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年的时期后剩余。

在一些实施方案中，本发明的细菌组合物在密封容器中提供。在一些实施方案中，密封容器为小袋或瓶子。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物在注射器中提供。

在一些实施方案中，细菌组合物可作为药物制剂提供。例如，细菌组合物可作为片剂或胶囊提供。在一些实施方案中，胶囊为明胶胶囊(“凝胶帽”)。

在一些实施方案中，本发明的细菌组合物是经口施用。在一些实施方案中，本发明的细菌组合物是在适用于经口施用的药物制剂中配制。经口施用可涉及吞咽以使化合物进入胃肠道和/或经颊、经舌或舌下施用以使化合物直接从口腔进入血流。

适用于经口施用的药物制剂包括固体栓、固体微粒、半固体及液体(包括多相或分散系统)，诸如片剂；含有多微粒或纳米微粒的软胶囊或硬胶囊、液体(例如水溶液)、乳剂或粉剂；锭剂(包括液体填充的)；咀嚼剂；凝胶；快速分散剂型；膜剂；卵形体；喷雾剂；及颊/粘膜粘附贴剂。

在一些实施方案中，药物制剂为肠溶制剂，即适用于通过经口施用将本发明组合物递送至肠的胃耐受性制剂(例如，耐受胃pH)。当组合物的细菌或另一组分为酸敏感性的(在胃条件下易于降解)时，肠溶制剂可尤其有用。

在一些实施方案中，肠溶制剂包含肠溶包衣。在一些实施方案中，制剂为肠溶包衣的剂型。例如，制剂可为肠溶包衣的片剂或肠溶包衣的胶囊等。肠溶包衣可为常规肠溶包衣，例如用于片剂、胶囊等以进行经口传递的常规包衣。制剂可包含膜包衣，例如肠溶聚合物(例如酸不溶性聚合物)的薄膜层。

在一些实施方案中，肠溶制剂为固有肠溶的，例如胃耐受性的，而无需肠溶包衣。因此，在一些实施方案中，制剂为不包含肠溶包衣的肠溶制剂。在一些实施方案中，制剂为由热胶凝材料制成的胶囊。在一些实施方案中，热胶凝材料为纤维质材料，诸如甲基纤维素、羟甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在一些实施方案中，胶囊包含不含任何成膜聚合物的壳。在一些实施方案中，胶囊包含壳，且所述壳包含羟丙基甲基纤维素且不包含任何成膜聚合物(例如，参见[33])。在一些实施方案中，制剂为固有肠溶胶囊(例如，来自Capsugel的

)。

在一些实施方案中，制剂为软胶囊。软胶囊为可由于添加软化剂(诸如，例如胶囊壳中存在的甘油、山梨醇、麦芽糖醇及聚乙二醇)而具有一定弹性和柔软度的胶囊。软胶囊可例如在明胶或淀粉的基础上生产。基于明胶的软胶囊可由不同供应商购得。取决于施用方法(诸如，例如经口或直肠)，软胶囊可具有各种形状，可为例如圆形、椭圆形、长方形或鱼雷形。软胶囊可通过常规方法，诸如例如通过Scherer方法、Accogel方法或微滴或吹制方法来生产。

培养方法

用于本发明中的细菌菌株可使用如在例如参考文献[34-36]中所详述的标准微生物学技术来培养。

用于培养的固体或液体培养基可为YCFA琼脂或YCFA培养基。YCFA培养基可包括(每100ml，近似值)：酪胨(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO₃(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、K₂HPO₄(0.045g)、KH₂PO₄(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH₄)₂SO₄(0.09g)、MgSO₄·7H₂O(0.009g)、CaCl₂(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯高铁血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)及吡哆胺(15μg)。

用于疫苗组合物的细菌菌株

本发明人已鉴别当本发明的细菌组合物的细菌菌株与PD-L1抑制剂组合施用时适用于治疗或预防癌症。此可能是由于本发明的细菌菌株对宿主免疫系统具有作用。在某些实施方案中，细菌菌株为有活力的。在某些实施方案中，细菌菌株能够部分或完全定植于肠。在某些实施方案中，细菌菌株为有活力的，且能够部分或完全定植于肠。在其他某些实施方案中，细菌菌株可为被杀灭、灭活或减毒的。在某些实施方案中，细菌组合物是经由注射，诸如经由皮下注射施用。

PD-L1抑制剂

本发明的治疗组合包含至少一种PD-L1抑制剂。如上所述，PD-L1抑制剂是化合物，其抑制免疫检查点，由此能够使机体免疫系统攻击被识别为机体自身细胞(包括癌细胞)的细胞。

已知的PD-L1抑制剂包括例如通过结合至并阻断PD-L1来抑制跨膜受体程序性细胞死亡1蛋白(称为PDCD1、PD-1、PD1或CD279)与其配体、即PD-1配体1(称为PD-L1、PDL1或CD274)之间的相互作用的化合物。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂为能够减少或抑制由PD-L1介导的信号传递的抗体、其抗原结合片段或拮抗剂。

根据一些实施方案，PD-L1抑制剂为抗体或其抗原结合片段。适用作本发明中的PD-L1抑制剂的抗体或抗体片段可为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、非人抗体、或其抗原结合片段。根据优选实施方案，抗体或其抗原结合片段对PD-L1具有高结合特异性。

根据一些实施方案，PD-L1抑制剂为特异性地结合至PD-L1的抗体或其抗原结合片段。根据一些实施方案，特异性地结合至PD-L1的抗体选自由下列各物组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗及其组合。阿特珠单抗是以商品名称

由Genentech出售，阿维鲁单抗是以商品名称

由Pfizer出售且度伐单抗是由MedImmune和AstraZeneca开发用于治疗患有PD-L1阳性泌尿道上皮膀胱癌的患者。

术语“抗体”是指展现以下所需生物活性的任何形式的抗体：诸如抑制配体与其受体的结合或抑制受体的配体诱导的信号传导。因此，“抗体”以最广泛含义使用且特定地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、及多特异性抗体(例如双特异性抗体)。根据一些实施方案，用于本发明中的抗体(或其抗原结合片段)为分离的抗体。

在本申请通篇可互换使用的术语“抗体片段”、“抗原结合片段”及“抗体结合片段”意指抗原结合片段，通常包括亲本抗体的抗原结合或可变区(例如，一个或多个CDR)的至少一部分。抗体片段保留亲本抗体的至少一些结合特异性。通常，当活性在摩尔基础上表现时，抗体片段保留至少10％的亲本结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高的亲本抗体对标靶的结合亲和力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；单链抗体分子，例如sc-Fv。

“Fab片段”包含一条轻链，及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fab’片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，所述部分含有V_H结构域和CH1结构域且还含有在CH1与CH2结构域之间的区，使得可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)₂分子。

“F(ab’)₂片段”含有两条轻链及两条含有恒定区中在CH1与CH2域之间的部分的重链，以致在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)₂片段因此由两个Fab’片段构成，所述Fab’片段通过两条重链之间的二硫键保持在一起。

“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。

“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中此等结构域存在于单一多肽链中。一般来说，Fv多肽还包含在V_H与V_L结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。

“分离的”抗体为已由其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。在一些实施方案中，如通过洛瑞方法所测定，抗体将纯化至大于95重量％的抗体，且最优选大于99重量％。

“人抗体”为具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。此定义特定地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“嵌合”抗体是指以下抗体，其中一部分重链及/或轻链与来源于具体物种或属具体抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而其余链与来源于另一物种或属另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要其表现出所需的生物活性即可。

非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式为含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基由来自非人物种(施体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔、或具有所要特异性、亲和力及能力的非人灵长动物)的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含未见于接受者抗体或施体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改良抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含大体上全部至少一个且通常两个可变结构域，其中全部或大体上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环且全部或大体上全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。

如本文所用，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指自大体上均质抗体的群体获得的抗体，即，构成所述群体的个别抗体除可以微量存在的可能天然存在的突变之外为相同的。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(抗原决定基)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂形成对比，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。术语“单克隆”指示抗体的特性为获自大体上均质的抗体群体，且不应理解为需要通过任何具体方法来产生抗体。例如，单克隆抗体可通过杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA方法制得。单克隆抗体也可自噬菌体抗体文库中分离。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两种分子(即抗体与抗原)之间的非随机缔合。根据一些实施方案，抗体或其抗原结合片段经由其抗原结合域以<10^”5M的结合亲和力(Kd)特异性地结合至抗原。或者，抗体或其抗原结合片段可经由其抗原结合域以<10^”6M或<10”M的Kd结合至抗原。如本文所用，Kd是指解离速率与结合速率的比率(k_解离/k_结合)，并且可使用本领域中已知的任何合适的方法来测定。

根据一些实施方案，治疗组合的PD-L1抑制剂是全身施用的。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂被调配用于全身施用。

根据另一实施方案，全身施用是经由肠胃外途径。根据一些实施方案，用于肠胃外施用的本发明的PD-L1抑制剂的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液或乳液，各自代表本发明的单独的实施方案。

根据一些实施方案，肠胃外施用为静脉内、动脉内、施用至血管壁中、肌内、腹膜内、真皮内、玻璃体内、经皮或皮下施用。上述施用途径各自代表本发明的单独的实施方案。根据一些实施方案，治疗组合的PD-L1抑制剂是静脉内施用。

根据一些实施方案，PD-L1抑制剂的全身施用是经由注射。对于经由注射的施用，PD-L1抑制剂可在水溶液中配制，例如在生理相容的缓冲液中，包括但不限于汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。用于注射的制剂可在添加防腐剂的情况下以单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器中呈现。水性注射混悬液可含有增加混悬液的黏度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡萄糖。任选地，混悬液还可含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。

根据一些实施方案，通过弹丸式注射进行肠胃外施用。根据其他实施方案，通过连续输注进行肠胃外施用。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂是在控制释放系统中递送并且被调配用于静脉内输注、可植入渗透泵、经皮贴剂、脂质体或其他施用模式。在一实施方案中，使用泵。在又一实施方案中，可将控制释放系统置于治疗目标的邻近处，由此仅需要全身剂量的一小部分。

治疗组合

根据一些实施方案，本文提供本发明的治疗组合，其是用于治疗或预防受试者的癌症的方法中。根据一些实施方案，本文提供本发明的治疗组合，其是用于治疗受试者的癌症的方法中。

根据一些实施方案，有待使用本发明的治疗组合治疗或预防的癌症是选自由下列各病组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌及头颈癌。根据一些实施方案，有待使用本发明的治疗组合治疗或预防的癌症是选自由下列各病组成的组：乳腺癌、肺癌、结肠癌及肝癌。

根据一些实施方案，治疗癌症涉及以下至少一者：在受试者中减小肿瘤尺寸或预防肿瘤生长。根据一些实施方案，本发明的治疗组合或方法是用于以下至少一者：在患有癌症的受试者中减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长、预防转移或预防血管生成。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合包含：(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与(b)PD-L1抑制剂。

根据一些实施方案，治疗组合的细菌组合物不含来自除鹑鸡肠球菌以外的任何其他物种的细菌或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种的细菌。根据一些实施方案，治疗组合的细菌组合物仅含有物种鹑鸡肠球菌的单一菌株，且不含来自任何其他物种的细菌或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种的细菌。根据一些实施方案，治疗组合的细菌组合物包含在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌菌株。根据一些实施方案，治疗组合的细菌组合物包含在登录号NCIMB 42488下寄存的鹑鸡肠球菌物种的单一菌株，且不含来自任何其他物种的细菌或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种的细菌。

根据一些实施方案，PD-L1抑制剂是在组合物中，所述组合物可能包含至少一种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂为抗体。根据一些实施方案，PD-L1抑制剂为抗体或其抗原结合片段。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合包含：(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物，其中所述组合物包含在登录号NCIMB42488下寄存的鹑鸡肠球菌物种的单一菌株，任选地其中所述组合物不含来自任何其他物种的细菌或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种的细菌；与(b)PD-L1抑制剂。

优选地，本发明的治疗组合包含：(a)包含在登录号NCIMB 42488下寄存的物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与(b)PD-L1抑制剂。根据一些实施方案，本文提供一种治疗组合，其是用于治疗或预防受试者的癌症的方法中，其中所述治疗组合包含：(a)包含在登录号NCIMB 42488下寄存的物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与(b)PD-L1抑制剂。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合包含：(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与(b)PD-L1抑制剂，任选地其中所述抑制剂为抗体或其抗原结合片段。

根据一些实施方案，本发明的治疗组合包含：(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株(任选地在登录号NCIMB 42488下寄存的菌株)的组合物，任选地其中所述组合物不含来自任何其他物种和/或菌株的细菌或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种和/或菌株的细菌；与(b)PD-L1抑制剂。

根据一些实施方案，本文提供一种使用本文所公开的治疗组合中的任一种治疗和/或预防受试者的癌症的方法。根据一些实施方案，本发明提供本文所公开的治疗组合中的任一种，其是用于治疗和/或预防受试者的癌症。

总则

除非另外指示，本发明的实践将采用本领域的技能范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学及药理学的常规方法。此类技术在文献中得到充分说明。参见，例如参考文献[37]和[38-44]等

术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成，或可包括另外者，例如X+Y。

关于数值x的术语“约”为任选的，且意指例如x±10％。

词语“大体上”不排除“完全地”，举例来说，“大体上不含”Y的组合物可为完全不含Y。必要时，词语“大体上”可从本发明的定义中删除。

对两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比的提及意指当比对时，核苷酸百分比在比较两个序列方面为相同的。此比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域中已知的软件程序，例如参考文献[45]的章节7.7.18中所述的那些软件程序来确定。优选比对是通过Smith-Waterman同源性搜索算法，使用空隙开放罚分为12且空隙延伸罚分为2、BLOSUM矩阵为62的仿射空隙搜索来确定。Smith-Waterman同源性搜索算法公开于参考文献[46]中。

除非特别说明，包含许多步骤的过程或方法可在方法开始或结束时包含另外的步骤，或可包含另外的介入步骤。而且，适当时，可将这些步骤组合、省略或以替代性顺序执行。

本发明的各个实施方案描述于本文中。应当理解，各实施方案中指定的特征可与其他指定特征组合，以提供进一步的实施方案。具体来说，本文中强调为合适、典型或优选的实施方案可彼此组合(除非这些实施方案互相排斥)。

进行本发明的方式

实施例1–细菌接种物在小鼠癌症模型中的功效

概述

此项研究测试包含根据本发明的细菌菌株的组合物在四个肿瘤模型中的功效。

材料

测试物质-细菌菌株#MRX518。

参比物质-抗CTLA-4抗体(克隆：9H10，目录：BE0131，同型：叙利亚仓鼠(SyrianHamster)IgG1，Bioxcell)。

测试和参比物质媒介物-细菌培养基(酵母提取物、酪胨、脂肪酸培养基(YCFA))。当每天注射到小鼠中时，用PBS(参见：BE14-516F,Lonza,France)稀释抗体。

治疗剂量-细菌：于200μL中2x10⁸个。a-CTLA-4是以10mg/kg/inj注射。根据小鼠最近的体重，以10mL/kg/adm的剂量体积(即，对于一只称重20g的小鼠，将施用200μL测试物质)施用抗CTLA-4。

施用途径-经由插管，通过口服灌胃(经口，PO)施用细菌接种物。每天净化插管。将抗CTLA-4注射到小鼠的腹腔(腹膜内，IP)中。

细菌菌株的培养条件-细菌菌株的培养条件如下：

·将10mL YCFA(由10mL E&O lab瓶制备)吸移至Hungate管中

·密封这些管并使用注射器输入和排气系统，用CO₂冲洗

·对Hungate管进行高压釜处理

·冷却时，用1mL甘油储备液接种Hungate管

·将这些管置于静态37℃培养箱中约16小时

·次日，采集1mL此继代培养物并接种10mL YCFA(再次预热冲洗的Hungate管，所有皆一式两份)

·将其置于静态37℃培养箱中5至6h

癌细胞系和培养条件-

所用细胞系在下表中详述：

细胞系	类型	小鼠品系	来源
				EMT-6	乳腺癌	BALB/c	ATCC
LL/2(LLC1)	肺癌	C57BL/6	ATCC CRL1642
				Hepa1-6	肝细胞癌	C57BL/6	IPSEN INNOVATION
RENCA	肾腺癌	BALB/c	ATCC

由在植入增生性乳腺泡结节之后的BALB/cCRGL小鼠中出现的可移植鼠类乳腺癌建立EMT-6细胞系[47]。

由带有经由植入原发性路易斯(Lewis)肺癌产生的肿瘤的C57BL小鼠的肺建立LL/2(LLC1)细胞系[48]。

Hepa 1-6细胞系为在C57/L小鼠中出现的BW7756小鼠肝细胞瘤的衍生物[49]。

细胞培养条件-所有细胞系在37℃下在湿润气氛(5％CO₂，95％空气)中作为单层生长。培养基和补充剂在下表中示出：

关于实验使用，通过用胰蛋白酶-维耳新(参见：BE17-161E,Lonza)在无钙或镁的汉克氏培养基(参见：BE10-543F,Lonza)中处理5分钟将粘附的肿瘤细胞自培养瓶处分开并且通过添加完全培养基来中和。将细胞在血球计中计数并且通过0.25％锥虫蓝排除测定评估其活力。

动物的使用-

体重和年龄匹配的健康雌性Balb/C(BALB/cByJ)小鼠是由CHARLES RIVER(L’Arbresles)获得以用于EMT6和RENCA模型实验。

体重和年龄匹配的健康雌性C57BL/6(C57BLl6J)小鼠是由CHARLES RIVER(L’Arbresles)获得以用于LL/2(LLC1)和Hepa1-6模型实验。

根据FELASA指导方针将动物在SPF健康状态下饲养，并且遵循根据关于实验室动物的护理和使用的法国和欧洲条例及NRC指导(the French and European Regulationsand NRC Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)的动物圈养和实验程序[50,51]。将动物在圈养室中在受控环境条件下饲养：温度：22±2℃、湿度55±10％、光周期(12h光/12h暗)、HEPA过滤空气、15次换气/小时而无再循环。动物围栏提供有无菌和足够的空间，如所述其中有垫褥材料、食物和水、环境和社会丰富(组圈养)：在通风架中的900cm²笼(参见：green,Tecniplast)、Epicea垫褥(SAFE)、10kGy照射膳食(A04-10,SAFE)、用于有免疫活性的啮齿动物的完全食品-R/M-H挤出物、来自水瓶的水。

实验设计和治疗

抗肿瘤活性，EMT6模型

治疗方案-将首次给药的开始视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)将非移植小鼠根据其个别体重随机分组，每组9/8只。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株。在D14，如下所述用EMT-6肿瘤细胞移植所有小鼠。在D24，来自阳性对照组的小鼠接受抗CTLA-4抗体治疗。

治疗方案概述于下表中：

如下所述进行动物的监测。

在动物中EMT6肿瘤的诱导-在D14，通过将200μL RPMI 1640中的1x10⁶个EMT-6细胞皮下注射到小鼠的右胁腹中诱导肿瘤。

安乐死-当各小鼠达到如下所述的人道终点时或在给药开始后最多6周之后对其施以安乐死。

抗肿瘤活性，LL/2(LLC1)模型

治疗方案-将首次给药的开始视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)将非移植小鼠根据其个别体重随机分成7组，每组9/8只。在D0，小鼠将接受媒介物(培养基)或细菌菌株。在D14，如下所述用LL/2肿瘤细胞移植所有小鼠。在D27，来自阳性对照组的小鼠接受抗CTLA-4抗体治疗。

治疗方案概述于下表中：

如下所述进行动物的监测。

在动物中LL/2(LLC1)肿瘤的诱导-在D14，通过将200μL RPMI 1640中的1x10⁶个LL/2(LLC1)细胞皮下注射到小鼠的右胁腹中诱导肿瘤。

安乐死-当各小鼠达到如下所述的人道终点时或在给药开始后最多6周之后对其施以安乐死。

抗肿瘤活性，Hepa1-6模型

治疗方案-将首次给药的开始视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)将非移植小鼠根据其个别体重随机分成7组，每组9只。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株。在D14，如下所述用Hepa 1-6肿瘤细胞移植所有小鼠。在D16，来自阳性对照组的小鼠接受抗CTLA-4抗体治疗。

治疗方案概述于下表中：

如下所述进行动物的监测。

通过脾内注射在动物中的Hepa 1-6肿瘤细胞的正位诱导-在D14，经由脾内注射到小鼠中移植50μL RPMI 1640培养基中的一百万(1x10⁶)个Hepa 1-6肿瘤细胞。简言之，在左肋下胁腹做一小切口并将脾脏自腹内取出。将脾脏暴露在消毒纱布垫上，并且经由27号针在目测检查下用细胞悬液注射。在细胞接种之后，切除脾脏。

安乐死-当各小鼠达到如下文部分中所述的人道终点时或在给药开始后最多6周之后对其施以安乐死。

在安乐死时对肿瘤负荷的评估-在结束之时，采集肝脏并称重。

抗肿瘤活性，RENCA模型

治疗方案-将首次给药的开始视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)将非移植小鼠根据其个别体重随机分到各组中，每组9只小鼠。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株(在200μL中2x10⁸个，PO)。在D14，如下所述用SC注射到下胁腹的腹面中的RENCA肿瘤细胞移植所有小鼠。当肿瘤达到50-70mm3的体积时，开始抗CTLA-4(10mg/kg，IP)和抗PDL1(克隆10F.9G2，10mg/kg)的治疗。

治疗方案概述于下表中：

如下所述进行动物的监测。

通过SC注射在动物中的RENCA肿瘤细胞的正位诱导-在D14，经由SC注射到小鼠的下胁腹的腹面中移植50μL RPMI 1640培养基中的一百万(1x10⁶)个RENCA肿瘤细胞。

安乐死-当各小鼠达到如下文部分中所述的人道终点时或在给药开始后最多6周之后对其施以安乐死。

在安乐死时对肿瘤负荷的评估-在结束之时，收集肿瘤并评估其体积。

动物监测

临床监测-每周两次用卡尺测量肿瘤的长度和宽度并且通过此式估算肿瘤的体积[52]：

人道终点[53]：疼痛、痛苦或窘迫体征：疼痛姿势、疼痛面具、行为；肿瘤超过10％的正常体重但不超过2000mm³；肿瘤干扰步行或营养；肿瘤溃疡或组织侵蚀；20％体重下降保持连续3日；不良身体条件、憔悴、恶病质、脱水；对外界刺激的自发反应的不存在延长；快速劳动呼吸、贫血、显著出血；神经体征：转圈、惊厥、麻痹；体温的持续降低；腹胀。

麻醉-将异氟烷气体麻醉用于所有程序：手术或肿瘤接种、静脉内注射、血液采集。将氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉用于立体定向手术程序。

镇痛-卡洛芬或多模式卡洛芬/丁丙诺啡镇痛方案适应手术程序的严重性。为所有疼痛程序提供非药理学护理。另外，在主治兽医的建议下提供不干扰研究(主题治疗)的药理学护理。

安乐死-通过过量气体麻醉(异氟烷)，继之以颈椎脱位术或放血对动物施以安乐死。

结果

抗肿瘤活性，EMT6模型

结果示于图1A中。本发明的细菌菌株的治疗造成肿瘤体积相对于两个阴性对照的明显减小。阳性对照还造成肿瘤体积的减小，如所预期。

为了进一步阐明MRx0518在同基因肿瘤模型中传递其治疗作用的机制，在同基因EMT6肿瘤模型研究中进行离体分析。虽然肿瘤体积为临床前肿瘤学研究中的主要测量指标，但肿瘤常常由活跃分裂的肿瘤细胞和坏死核心组成。为了研究MRx0518治疗是否对在EMT6肿瘤内发现的坏死程度有影响，将来自肿瘤的腹中区域的石蜡切片用苏木精和伊红染色。鼠类EMT6乳腺癌模型的MRx0518治疗显示朝向肿瘤内的坏死截面积增加的倾向(图1B，上图)。为了研究MRx0518治疗是否对肿瘤内的分裂细胞有影响，将来自肿瘤的腹中区域的石蜡切片用增殖蛋白Ki67染色，并且进行DAPI对比染色，以估算EMT6肿瘤内分裂的细胞的百分比。鼠类EMT6乳腺癌模型的MRx0518治疗显著地减小肿瘤内所见的分裂细胞的百分比(图1B，下图，P＝0.019)。

免疫细胞群

经由肿瘤的流动式细胞测量术进行肿瘤微环境的进一步研究，以便探究以下假设：MRx518细菌菌株具有调控免疫系统以诱导抗肿瘤效应的能力。将自不同治疗组切除的肿瘤切成块。对一块进行流动式细胞测量术分析。为了评估肿瘤内存在的T淋巴细胞的相对百分比，使用以下标志物：CD45、CD3、CD4、CD8、CD25及FoxP3。

流动式细胞测量术数据显示在MRx0518和抗CTLA-4治疗组中当分别与媒介物或对照动物相比时肿瘤中的淋巴细胞的相对百分比的稍微减少(图1C)。同样，CD4+细胞的相对百分比在MRx0518和抗CTLA-4治疗动物中似乎减少，而CD8+细胞的相对百分比在两个组中遵循相反的趋势，但以不同量级。CD4+FoxP3+细胞的相对百分比在抗CTLA 4治疗组中下降，相比之下，在MRx0518治疗动物中有轻微减少；然而，CD4+CD25+细胞的相对百分比的降低仅在抗CTLA-4治疗组中是显著的。CD8+/FoxP3+比率显示在抗CTLA-4治疗组中比在MRx0518动物中的更大提高。提供的这些资料在此支持以下假设：抗CTLA-4抗体通过在肿瘤组织中减少其细胞数目或削弱其抑制活性靶向调节性T细胞(Tregs)，同时提示MRx0518的不同作用模式。

细胞因子产生

另外的肿瘤块以及血浆样品是用于总蛋白提取及后续的细胞因子分析。通过MagPix技术分析肿瘤微环境中的IL-10、CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL-1β、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70及IFN-γ的蛋白质水平。虽然IL-17A和GM-CSF低于检测水平，但所有其他标志物在合理的水平下表达(图1D)。在媒介物与抗CTLA-4组之间关于IFN-γ观察到显著性差异。IL-10和IL-12p70免疫标志物的产生在MRx518治疗之后与对照治疗相比似乎减少。

还评估了同一动物的血浆中的细胞因子水平。通过MagPix技术分析IL-23、IL-6、IL-10、VEGF、CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL-2、IL-1β、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70及IFN-γ的蛋白质水平。总体上，在肿瘤诱导之前或在研究结束时在动物血浆中几乎检测不到细胞因子产生(图1E)。检测到在实质性水平下的VEGF和CXCL10，而检测到在低水平下的IL-23、IL-6、IL-10、CXCL1及CXCL2。未在样品中检测到IL-2、IL-1b、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70及IFN-γ。在第0天，MRx0518显著增加IL-6的产生。MRx0518也似乎增加IL-23产生。在第22天，VEGF和CXCL10在抗CLTA-4组中显著下调。类似于针对免疫细胞群所示的结果，在MRx518与CTLA-4之间在肿瘤和血浆中的细胞因子产生的差异表明其各自作用于独特和潜在的补充机制。

CD8α阳性细胞在回肠中的定位

将10μm回肠的低温切片在低温恒温器(CM 1950Leica)中切割，挑取于聚-L赖氨酸载玻片上。然后将切片风干1小时，在冰冷的甲醇中固定10分钟，在PBS中洗涤，在PBS pH7.2中的10％BSA中阻断，之后与一抗(大鼠-抗小鼠-CD8α抗体，Sigma-Aldrich,Millipore)培育过夜。

次日早晨，将载玻片在PBS中洗涤并在室温下用二抗染色1小时：山羊-抗大鼠-抗体-Alexa488(Molecular Probe,Invitrogen)。在另一个洗涤步骤之后，将载玻片用4’,6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)(Sigma-Aldrich,Millipore)对比染色并安装于Vectashield(Vector Laboratories)中。察看载玻片并使用配备有水银灯、适当的滤光片及x20复消色差物镜的Zeiss Axioscope显微镜成像。显示由来自媒介物、MRx0518及抗CTL4动物的载玻片获得的图像的实例(图1F-上图：DAPI染色，下图：CD8α染色)。

检查来自20只动物的视野并使用手动曝光时间成像。所分析的动物和视野的数量示于下表中：

对图像的评分如下：≤3个阳性细胞的视野被评为0，而≥3个细胞的视野被评为1。显示此分析的结果(图1G)。

用抗CD8α染色的回肠低温切片显示与媒介物组相比在来自用MRx0518及抗CTLA-4治疗的动物的隐窝区组织中定位的CD8α阳性细胞的数量更多。

此观察结果与在感染或炎性微环境的情况下肠中存在的CD8+T细胞一致，作为免疫反应的一部分。

抗肿瘤活性，LL/2(LLC1)模型

结果示于图2中。本发明的细菌菌株的治疗造成肿瘤体积相对于两个阴性对照的明显减小。

抗肿瘤活性，Hepa1-6模型

结果示于图3A中。未治疗的阴性对照不如预期所表现，因为肝脏重量在此组中比其他组减轻。然而，媒介物阴性对照和阳性对照组皆如预期所表现，因为用媒介物单独治疗的小鼠具有比用抗CTLA4抗体治疗的小鼠更大的肝脏，反映了在媒介物阴性对照组中更大的肿瘤负荷。用本发明的细菌菌株的治疗造成相对于媒介物阴性对照组中的小鼠在肝脏重量(及由此肿瘤负荷)上的明显减轻。

抗肿瘤活性，RENCA模型

结果示于图3B中。用MRx0518单一疗法的治疗与媒介物治疗组相比在测试/对照下减小51％的肿瘤体积(第18天)。紫杉醇和抗CTLA-4+抗PDL-1显示与未治疗和媒介物组两者相比在D18和D22于肿瘤尺寸上的(几乎)完全减小。

这些资料表明菌株MRX518可适用于治疗或预防癌症，且尤其适用于减小乳腺癌、肺癌、肾癌及肝癌中的肿瘤体积。

实施例2–PCR基因分析

在PCR基因分析中研究细菌MRX518的纯培养物。存在两个实验小组：1)将MRX518与人结肠细胞(CaCo2)共培养以研究细菌对宿主的作用，及2)将MRX518与用IL1刺激的CaCo2细胞共培养以模拟细菌在炎性环境中的作用。经由基因表达分析评估在两种情况下的作用。结果显示如下：

这些资料似乎显示两个基因表达特征-CXCR1/2配体(CXCL3、CXCL2、CXCL1、IL-8)，其与促炎细胞迁移有关；及CXCR3配体(CXCL9、CXCL10)，其更具体地指示IFN-γ型反应，还由IL-32支持，IL-32为IFN-γ诱导型。

实施例3-稳定性测试

将本文所述的含有至少一种本文所述的细菌菌株的组合物于密封容器中在25℃或4℃下储存，且将容器置于具有30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相对湿度的气氛中。1个月、2个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年之后，应剩余至少50％、60％、70％、80％或90％细菌菌株，如以通过标准方案所确定的菌落形成单位所测量。

实施例4-与MRX518+LPS相比由MRX518诱导的未成熟的树突细胞中的细胞因子产生

概述

此研究测试细菌菌株MRX518单独及与脂多糖(LPS)组合对未成熟的树突细胞中的细胞因子产生的作用。

单核细胞群是自末梢血液单核细胞(PBMC)中分离。随后将单核细胞分化成未成熟的树突细胞。将未成熟的树突细胞以200,000个细胞/孔铺板并与MRX518在10⁷/ml的最终浓度下培育，任选添加最终浓度为100ng/ml的LPS。阴性对照涉及将细胞与RPMI培养基单独培育且阳性对照涉及将细胞与LPS在100ng/ml的最终浓度下培育。接着分析细胞的细胞因子含量。

结果

这些实验结果可见于图4a-d中。单独添加MRX518造成与阴性对照相比细胞因子IL-6及TNF-α的水平的实质提高(图4a及c)。LPS的添加(阳性对照)造成与阴性对照相比IL-6和TNF-α而非IL-1β的水平的提高(图4b)。MRX518与LPS的组合造成所产生的IL-1β水平的协同提高(图4d)。

结论

MRX518具有在未成熟的树突细胞中诱导更高IL-6和TNF-α细胞因子产生的能力。LPS与MRX518的组合可提高细胞因子IL-1β在未成熟的树突细胞中的水平。这些资料表明MRX518单独或与LPS组合可增加炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，其促进可抑制癌症的炎症。用MRX518单独或以组合形式的治疗可诱导会限制肿瘤生长的细胞因子。

实施例5–与MRX518+LPS相比由MRX518诱导的THP-1细胞中的细胞因子产生

概述

此研究测试细菌菌株MRX518单独及与LPS组合对THP-1细胞(即单核细胞和巨噬细胞的模型细胞系)中的细胞因子产生的作用。

用5ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸盐-13-乙酸盐(PMA)将THF-1细胞在M0培养基中分化48h。随后将这些细胞与MRX518在10⁸/ml的最终浓度下培育，添加或不添加最终浓度为100ng/ml的LPS。接着洗掉细菌并且容许细胞在正常生长条件下培育24h。随后将细胞旋转沉降并关于细胞因子含量分析所得的上清液。

结果

这些实验的结果可见于图5a-c中。在无LPS下MRX518的添加造成与无细菌和细菌沉积物对照相比细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平的提高。LPS和MRX518的添加造成细胞因子产生的协同增加。

结论

MRX518具有诱导细胞因子在THP-1细胞中产生的能力，其可随LPS的添加而协同增加。这些资料表明MRX518单独或与LPS组合可增加炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，其促进可抑制癌症的炎症。用MRX518单独或以组合形式的治疗可诱导会限制肿瘤生长的细胞因子。

实施例6–MRX518与PD-1抑制剂RMP1-14或CTLA-4抑制剂的治疗组合的抗肿瘤活性

概述

此研究比较MRX518、PD-1抑制剂(RMP1-14)、CTLA-4抑制剂及MRX518与PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂在带有EMT-6肿瘤细胞的小鼠中的抗肿瘤活性。

材料

测试及参比物质-细菌菌株#MRX518；抗PD-1抗体(克隆：RMP1-14，目录：BE0146，同型：大鼠IgG2a，Bioxcell)；抗CTLA4抗体(参见：BE0131,Bioxcell；克隆：9H10；反应性：小鼠；同型：仓鼠IgG1；储存条件：+4℃)。

测试及参比物质媒介物-使MRX518细菌生长于细菌培养基(酵母提取物、酪胨、脂肪酸培养基(YCFA))中并在-80℃下作为甘油储备液保存。根据研究方案向动物给予细菌。在每天注射到小鼠时，用PBS(参见：BE14-516F,Lonza,France)稀释抗PD1及抗CTLA-4抗体。

治疗剂量-细菌：200μL中的2x10⁸个。根据小鼠最近的体重，以10mg/kg体重施用抗PD1-1和抗CTLA4抗体。

施用途径-经由灌胃管，通过口服灌胃(经口，PO)以200μL/inj的体积施用细菌组合物。将抗PD-1和抗CTLA-4抗体以10ml/kg(调整至小鼠最近的个体体重)的体积注射到小鼠的腹膜腔(腹膜内，IP)中。

癌细胞系和培养条件-用于此研究中的细胞系为由ATCC(美国菌种保存中心，Manassas,Virginia,USA)获得的EMT-6细胞系。由在植入增生性乳腺泡结节之后的BALB/cCRGL小鼠中出现的可移植鼠类乳腺癌建立EMT-6细胞系

将肿瘤细胞在37℃下在湿润气氛(5％CO2，95％空气)中作为单层生长。培养基为补充有10％胎牛血清(参见：3302,Lonza)的含有2mM L-谷氨酰胺(参见：BE12-702F,Lonza,Verviers,Belgium)的RPMI 1640。EMT-6肿瘤细胞粘附至塑料烧瓶。关于实验使用，通过用胰蛋白酶-维耳新(参见：BE02-007E,Lonza)在无钙或镁的汉克氏培养基(参见：BE10-543F,Lonza)中处理5分钟将肿瘤细胞自培养瓶处分开并且通过添加完全培养基来中和。将细胞计数并且通过0.25％锥虫蓝排除测定评估其活力。

动物的使用-一百三十(130)只5-7周龄的健康雌性Balb/C(BALB/cByJ)小鼠是由CHARLES RIVER(L’Arbresles)获得并且根据FELASA指导方针在SPF健康状态下饲养。根据关于实验室动物的护理和使用的法国和欧洲条例及NRC指导实现动物圈养和实验程序。将动物在圈养室中在受控环境条件下饲养(3-4只/笼)：温度：22±2℃、湿度55±10％、光周期(12h光/12h暗)、HEPA过滤空气、15次换气/小时而无再循环。动物围栏提供有无菌和足够的空间，如所述其中有垫褥材料、食物和水、环境和社会丰富(组圈养)：顶级过滤器聚碳酸酯欧标(Eurostandard)III或IV型笼、玉米芯垫褥(参见：LAB COB 12,SERLAB,France)、25kGy照射膳食(

Soest,Germany)、用于免疫活性啮齿动物的完全食品-R/M-H挤出物、在0.2μm水和环境丰富(SIZZLE-dri kraft-D20004 SERLAB,France)下无菌过滤。用RFID应答器单个鉴别动物并且各笼带有特定码。对于批次2和批次3在适应一周后或对于批次1在适应三周后开始动物的治疗。

实验设计和治疗

在第-14(D-14)天，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)将130只非移植小鼠根据其个别体重随机分成3组，每组30只动物，及4组，每组10只动物。将小鼠分成三批，每治疗组10只动物(批次1：组1、2及3的10只动物；批次2：组1、2及3的10只动物；以及批次3：组1至7的10只动物)，从研究开始起具有不同终点：D-14或D0。

在终止时，将批次3分成2个群组，归因于终止和FACS分析方案；将其错开1天：D24/D25。因此，每个动物群组具有5只动物/治疗组(4只动物来自笼1且一只动物来自笼2)。基于伦理准则，如果肿瘤体积大于1500mm³，那么有待在D24和D25处死的动物的选择是基于肿瘤体积，而非笼。实验设计描绘于图7A中且在下文中概述：

1)批次1(组1、2及3)在D0开始治疗且在D14淘汰(10只动物形成组1至3)。它们不接受肿瘤细胞并构成基线组。

2)批次2(组1、2及3)在D-14开始治疗且在D7淘汰(10只动物形成组1至3)。

3)批次3(组1至7)在D-14开始治疗且在D24/25淘汰(10只动物形成组1至7)。抗PD-1和抗CTLA-4的治疗在D10开始。

在第0天(D0)，将批次2和批次3的所有小鼠(分别在第7及24/25天终止)通过皮下注射200μL RPMI 1640中的1x10⁶ EMT-6个细胞至右胁腹中用EMT-6肿瘤细胞移植(将来自批次1的30只小鼠在D14处死，它们不接受肿瘤注射)。根据以下治疗方案组治疗小鼠(TWx2＝每周两次)：

在整个实验中收集以下样品：

1.粪便(仅对于批次3)–在研究期间的三个时点(D-15、D-1及D22)，从每组8只相同小鼠处收集粪便样品(每只小鼠80-100mg或6-7个球粒的等效物，但至少3个粪球粒)，将其快速冷冻并在-80℃下储存。

2.血液–在小鼠的终止之时(对于批次1为D14，对于批次2为D7且对于批次3为D25)，在深度气体麻醉下在终止程序中自各动物处收集大约1mL的心内血至EDTA管中。离心血液以获得血浆，并将血浆在-80℃下储存。

3.肿瘤及脾脏–从所有小鼠处收集肿瘤(在D和D24/D25)及脾脏(在D7、D14及D24/D25)。通过如下所述的FACS分析定量肿瘤样品中的肿瘤免疫浸润细胞。

4.肠系膜淋巴结–在D7、D14及D24/D25，从每组和每次的所有动物处收集肠系膜淋巴结并在-80℃下快速冷冻。

5.肠-在安乐死之时(D7、D14及D24/D25)，从每组和每次的所有小鼠处收集肠的若干节段并解剖。还收获盲肠内容物。

FACS分析

关于肿瘤细胞的分析，在终止之时(在D7及D24/25)从每组和每次的所有小鼠处收集肿瘤。将所有肿瘤皆收集在HBSS培养基中。通过来自每次收集的样品的FACS分析定量肿瘤免疫浸润细胞。简言之，将所收集的样品通过机械解离处理并于100μL染色缓冲液(PBS、0.2％BSA、0.02％NaN₃)中制备。随后根据供应商对于每种抗体所述的程序，添加针对所选标志物的抗体。将除FoxP3之外的所有抗体用于表面标记，而FoxP3则用于胞内标记。用于FACS分析的抗体列于下表中：

组1：组T细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、FOXP3、PD1、B220

组2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)：活力、CD45、CD3、CD11b、Ly6C、F4/80、CD68、CD80、CD206、MHCII

将混合物在黑暗中在室温下培育20至30分钟，洗涤并且再悬浮于200μL染色缓冲液中。将所有样品储存在冰上并且避光保存直至FACS分析。还用对照同型抗体处理肿瘤样品。用配备有波长405、488及633nm的3个激发激光的

空间流式细胞仪(LSR II,BDBiosciences)分析所染色的细胞。

关于肠样品的分析，在终止之时(在D7、D14及D24/25)从每组和每次的所有小鼠处收集小肠及结肠。所有新鲜的组织皆收集于HBSS培养基中。通过来自每次收集的样品的FACS分析定量固有层中的免疫细胞。将样品作为肿瘤样品处理。用于FACS分析的抗体为以上列举的组1的那些以及下表列举的那些(样品的后续培育和分析如上所述)：

组3：肠DC：活力、CD45、CD3、CD11b、CD11c、MHC II、CD103

关于脾脏样品的分析，在终止之时(在D7、D14及D24/25)从每组和每次的所有小鼠处收集脾脏。将所有脾脏皆收集于完全RPMI培养基(10％dFBS、青霉素/链霉素1％、2mM L-谷氨酰胺及55μM 2-巯基乙醇)中。在用CD3及CD28刺激72h之后，通过来自每次收集的样品的FACS分析定量肿瘤免疫浸润细胞。程序：将脾细胞与两种刺激(CD3/CD28，热杀灭的MRx0518)中的任一种和一个阴性对照一起培养。在每孔热杀灭的MRx0518与脾细胞之间存在1:1的比率。在20μl经热杀灭的MRx0518样品中提供有1x106个细菌细胞。根据供应商对于每种抗体描述的程序，将针对以上组1的标志物的抗体添加至来自各治疗的细胞沉淀中。如上所述进行样品的后续培育和分析。

动物监测

每天记录动物的活力和行为。每周两次测量体重。每周两次用卡尺测量肿瘤的长度和宽度并且通过下式估算肿瘤的体积：

按照测试物质对所治疗动物的肿瘤体积与对照动物相比的作用来评估治疗功效。使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)确定抗肿瘤功效的以下评价准则：

1.个体和/或平均(或中值)肿瘤体积。组1至7的平均肿瘤体积描绘于图7B中。

2.肿瘤倍增时间(DT)。

3.肿瘤生长抑制(T/C％)，是定义为治疗组对比对照组的中值肿瘤体积的比率，计算如下(Dx＝测量的天数)：

最佳值为最小T/C％比率，反映了所实现的最大肿瘤生长抑制。根据NCI标准，T/C％比率的有效准则为≤42％。

4.测试组与对照组的相对肿瘤体积(RTV)曲线，其中RTV计算如下(D_X＝测量的天数；D_R＝随机化的天数)：

5.计算体积V和达到V的时间。体积V是定义为由实验数据推断且在肿瘤生长的指数期选择的靶体积。对于每个肿瘤，在肿瘤体积测量中选择最接近靶体积V的肿瘤体积。记录此体积V及肿瘤达到此体积的时间的值。对于每个组，计算肿瘤体积V的平均值和达到此体积的时间的平均值。

实施例7-CD8增殖评估

为了研究MRX518和PD-L1抑制剂的免疫刺激作用，进行MRX518与抗PD-1检查点抑制剂Miltenyi Biotech CD279以组合形式对CD8+细胞增殖的影响的活体外评估。

将末梢血液单核细胞(PBMC，由Stemcell Technologies低温保存，目录编号：70025)自液氮中移除并且容许在烧瓶中静置过夜。将96孔板用CD3抗体(ThermoFisher CD3单克隆抗体(OKT3)，0.3μg/ml)包被作为细胞分裂组合的一半。在休眠期之后，对PBMC计数并用荧光细胞示踪剂(CellTrace^TM远红外细胞增殖试剂盒)染色。

以此方式制备细胞的十个集合。向那些集合的9个中添加抗PD-1抗体(来自Miltenyi Biotech CD279(PD1)纯功能等级，10μg/ml)。不向另外的集合中添加抗PD-1抗体，其充当对照集合(在下表中称为细胞集合1)。接着将所有细胞集合培育1.5小时。

在培育期之后，将细菌测试组分添加至如下表所示的细胞集合3至10中：

*MRX518细胞:PBMC细胞的比率

**测试工程改造以具有破坏的鞭毛组装的MRX518的突变体。本发明人理解到鞭毛蛋白促进MRX518的免疫刺激作用。

***对于1:1感染多重性(MOI)，上清液是取自与用上清液处理的PBMC的数量相同数量的细菌。对于10:1的MOI，上清液是取自高度浓缩的细菌培养物，但不测量相对于PBMC的精确数量的细菌。

在添加细菌测试组分之后，将CD28抗体(Thermofisher CD28单克隆抗体(CD28.2)，1μg/ml)作为细胞分裂组合的另一半添加至每个细胞集合中以触发增殖。随后将PDL-1(R&D Systems，重组人PD-L1/B7-H1 Fc嵌合体，10μg/ml)添加至每个细胞集合中。

接着培育细胞集合5天(37℃，5％CO₂)。培育之后，收获细胞并根据由细胞示踪剂赋予的细胞荧光通过FACS进行分析，提供了已在培育期中发生的细胞分裂的次数的指示。结果显示根据分裂次数(自无细胞分裂(NCD)至4次细胞分裂(4RCD))分组的细胞的百分比示于图6中。

序列

SEQ ID NO:1(鹑鸡肠球菌16S rRNA基因-AF039900)

SEQ ID NO:2(鹑鸡肠球菌菌株MRX518的一致16S rRNA序列)

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[48]Bertram and Janik(1980)Cancer Lett.11：63-73.

[49]Darlington(1987)Meth Enzymol.151：19-38.

[50]Principe d’éthique de l’expérimentation animale，Directive n°2010/63 CEE 22nd September 2010，

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[51]Guide for the Care and Use of Laboratory Animals：EighthEdition.The National Academies Press；2011

[52]Simpson-Herren and Lloyd(1970)Cancer Chemother Rep.54：143-74.

[53]Workman et al.(2010)Br.J.Cancer.102：1555-77.

[54]WO 2017/085520

序列表

<110> 4D制药研究有限公司(4D PHARMA RESEARCH LIMITED)

<120> 用于治疗或预防癌症的组合疗法

<130> P073196WO

<160> 2

<170> SeqWin2010, version 1.0

<210> 1

<211> 1506

<212> DNA

<213> 鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)

<400> 1

taatacatgc aagtcgaacg ctttttcttt caccggagct tgctccaccg aaagaaaaag 60

agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taacacttgg 120

aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaaggcgctt 180

ttgcgtcact gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg 360

agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa 420

caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg acggtatcta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540

aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca tgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gcaaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960

ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt cgggggcaaa gtgacaggtg 1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccttattg ttagttgcca tcatttagtt gggcactcta gcgagactgc cggtgacaaa 1140

ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctcttaaagc 1260

ttctctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagccggaat cgctagtaat 1320

cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gccgcctaag 1440

gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg 1500

atcacc 1506

<210> 2

<211> 1444

<212> DNA

<213> 鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)

<400> 2

tgctatacat gcagtcgaac gctttttctt tcaccggagc ttgctccacc gaaagaaaaa 60

gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca tcagaagggg ataacacttg 120

gaaacaggtg ctaataccgt ataacactat tttccgcatg gaagaaagtt gaaaggcgct 180

tttgcgtcac tgatggatgg acccgcggtg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240

caaggccacg atgcatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacga aagtctgacc 360

gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttagagaaga 420

acaaggatga gagtagaacg ttcatccctt gacggtatct aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540

taaagcgagc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600

ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agcaaacgca 840

ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960

cttgacatcc tttgaccact ctagagatag agcttcccct tcgggggcaa agtgacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttatt gttagttgcc atcatttagt tgggcactct agcgagactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200

gtgctacaat gggaagtaca acgagttgcg aagtcgcgag gctaagctaa tctcttaaag 1260

cttctctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagccggaa tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc agccgcctaa 1440

ggtg 1444

Claims (25)

1.一种治疗组合，用于治疗或预防受试者的癌症的方法中，其中所述治疗组合包含：

(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；与

(b)PD-L1抑制剂。

2.如权利要求1所述的治疗组合，其中所述组合物不含来自任何其他物种的细菌或仅包含微量或生物学不相关量的来自另一物种的细菌。

3.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述治疗组合用于治疗或预防肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、肝细胞瘤、神经内分泌癌或结肠癌的方法中。

4.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述治疗组合用于减小肿瘤尺寸、减慢肿瘤生长、预防转移或预防血管生成的方法中。

5.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列。

6.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述组合物用于经口施用和/或其中所述PD-L1抑制剂用于静脉内施用。

7.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

8.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述细菌菌株是冻干的。

9.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述细菌菌株能够部分或完全定植于肠。

10.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述组合物包含鹑鸡肠球菌的单一菌株。

11.如权利要求1至9中任一项所述的治疗组合，其中所述组合物包含鹑鸡肠球菌的细菌菌株作为微生物聚生体的一部分。

12.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述组合物包含在登录号NCIMB42488下保藏的鹑鸡肠球菌菌株。

13.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述组合物包含在食物产品或疫苗组合物内。

14.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述PD-L1抑制剂选自由下列各物组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐单抗(Durvalumab)、BMS-936559、LY3300054、CK-301、3D-2-02-0015、SHR-1316、FAZ053及其组合。

15.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中在向所述受试者首次施用所述PD-L1抑制剂之前向所述受试者施用所述组合物。

16.如权利要求15所述的治疗组合，其中在首次施用所述PD-L1抑制剂之前至少一周、两周、三周或四周向所述受试者施用所述组合物。

17.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中在向所述受试者首次施用所述PD-L1抑制剂之前和/或与施用所述PD-L1抑制剂至少部分同时向所述受试者施用所述组合物。

18.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株与所述PD-L1抑制剂是在单独的组合物中。

19.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合，其中所述受试者对单独使用PD-L1抑制剂的先前治疗无反应。

20.一种包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的第一组合物，与包含PD-L1抑制剂的第二组合物组合使用，用于治疗或预防癌症的方法中，任选地其中所述第一组合物在首次施用所述第二组合物之前和/或与施用所述第二组合物同时施用。

21.一种包含PD-L1抑制剂的第一组合物，与包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的第二组合物组合使用，用于治疗或预防癌症的方法中，任选地其中所述第一组合物与施用所述第二组合物同时施用。

22.一种包含PD-L1抑制剂的组合物，用于治疗或预防受试者的癌症的方法中，所述受试者先前接受施用包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株、优选在登录号NCIMB 42488下保藏的菌株的组合物。

23.一种组合物，其包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株、优选在登录号NCIMB 42488下保藏的菌株，所述组合物用于治疗或预防被诊断为需要用PD-L1抑制剂治疗的受试者的癌症的方法中。

24.一种治疗或预防有此需要的受试者的癌症的方法，其包括：

(a)向所述受试者施用包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；和

(b)向所述受试者施用PD-L1抑制剂。

25.一种试剂盒，其包括：

(a)包含物种鹑鸡肠球菌的细菌菌株的组合物；和

(b)包含PD-L1抑制剂的组合物。

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