BR112020014564A2

BR112020014564A2 - Terapia de combinação para tratamento ou prevenção de câncer

Info

Publication number: BR112020014564A2
Application number: BR112020014564-5A
Authority: BR
Inventors: Alexander Stevenson
Original assignee: 4D Pharma Research Limited
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-12-08
Also published as: WO2019141999A1; KR20200110343A; JP2021516661A; CN111902153A; SG11202006874SA; US20210060094A1; CA3088343A1; AU2019210005A1; WO2019141999A8; EP3740221A1; IL276073A; TW201934138A; MX2020007665A; MA51621A

Abstract

a presente invenção refere-se a uma terapia de combinação que compreende uma cepa bacteriana para tratar ou prevenir câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERA-

PIA DE COMBINAÇÃO PARA TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE CÂNCER", CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção está no campo de uma terapia de combina- ção para tratar ou prevenir câncer: uma combinação de uma composição que compreende uma cepa bacteriana e um inibidor de PD-L1 para tratar ou prevenir câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Se acredita que o intestino humano seja estéril no útero, porém, está exposto a uma grande variedade de micróbios ambientais e maternais imediatamente após o nascimento. Portanto, um período dinâmico de colonização microbiana e sucessão ocorre, que é influen- ciado por fatores, tais como modo de distribuição, ambiente, dieta e genótipo do hospedeiro, em que todos esses impactam mediante a composição da microbiota intestinal, particularmente durante a vida pregressa. Subsequentemente, a microbiota se estabiliza e se torna adulta [1]. A microbiota intestinal humana contém mais de 500 a 1000 diferentes filotipos que pertencem essencialmente a duas principais divisões bacterianas, os Bacteroidetes e os Firmicutes [2]. As relações simbióticas bem-sucedidas que surgem da colonização bacteriana do intestino humano renderam uma ampla variedade de funções metabó- lica, estrutural, protetora e outra funções benéficas. As atividades me- tabólicas aprimoradas do intestino colonizado asseguram que, de ou- tra forma, componentes alimentares indigestos sejam degradados com a liberação de subprodutos que fornecem uma fonte de nutriente im- portante para o hospedeiro. De modo similar, a importância imunológi- ca da microbiota intestinal é bem reconhecida e é exemplificada em animais livres de germes que têm um sistema imunológico prejudicado que é funcionalmente reconstituído depois da introdução de bactérias comensais [3 a 5].

[0003] Alterações drásticas em composição de microbiota foram documentadas em distúrbios gastrointestinais, tais como doença intes- tinal inflamatória (IBD). Por exemplo, os níveis de bactérias de conjun- to XIVa de Clostridium são reduzidos em pacientes com IBD, enquanto os números de E. coli são aumentados, o que sugere uma mudança no saldo de simbióticos e patobiontes dentro do intestino [6 a 9]. De maneira interessante, esta disbiose microbiana também está associa- da aos desequilíbrios em populações de célula efetora T.

[0004] Em reconhecimento ao potencial efeito positivo que deter- minadas cepas bacterianas podem ter sobre o intestino animal, várias cepas foram propostas para uso no tratamento de várias doenças (consultar, por exemplo, [10 a 13]). Além disto, determinadas cepas que incluem principalmente cepas de Lactobacillus e Bifidobacterium, foram propostas para uso no tratamento de várias doenças inflamató- rias e autoimunes que não são diretamente ligadas aos intestinos (consultar [14] e [15] para revisões). No entanto, a relação entre dife- rentes doenças e diferentes cepas bacterianas, e os efeitos precisos de cepas bacterianas particulares sobre o intestino e em um nível sis- temático e em quaisquer tipos particulares de doenças, são pouco ca- racterizados. Por exemplo, determinadas espécies de Enterococcus estão envolvidas no desencadeamento de câncer [16]. Em contraste, as cepas bacterianas da espécie Enterococcus gallinarum também fo- ram divulgadas para uso no tratamento e na prevenção de câncer [54].

[0005] Devido à natureza diversa de câncer, várias modalidades de tratamento estão em desenvolvimento de modo a tratar diferentes grupos de paciente. Uma modalidade de tratamento que se provou efi- caz é o uso de inibidores de checkpoint imunológico (ICIs). ICIs são compostos que inibem a habilidade de uma célula de câncer em evitar que as células imunológicas do hospedeiro ataquem as células de câncer. ICIs podem ser, por exemplo, anticorpos terapêuticos que fo-

ram desenvolvidos contra a interação entre a proteína de morte celular programada de receptor transmembranar 1 (denominada PDCDI, PD- 1, PD1 ou CD279) e seu ligante, ligante 1 de PD-1 (denominado PD- L1, PDL1 ou CD274).

[0006] Embora o tratamento de pacientes com câncer com um ICI, quando eficaz, possa resultar em efeitos clínicos duradouros e signifi- cativos, ainda há uma porcentagem significativa de pacientes que não são responsivos ou apenas parcialmente responsivos ao tratamento com ICI. Portanto, há uma necessidade na técnica por modalidades de tratamento novas e melhoradas para evitar e tratar câncer e, em parti- cular, modalidades de tratamento que possam melhorar o efeito de tratamento com inibidor de PD-L1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A presente invenção refere-se às terapias de combinação inovadoras para tratar e prevenir câncer. Em particular, a presente in- venção se refere às terapias melhoradas nas quais a administração sequencial e/ou parcialmente paralela de uma cepa bacteriana da es- pécie Enterococcus gallinarum e um inibidor de PD-L1 resulta em um tratamento mais eficaz de câncer do que o tratamento com a cepa bacteriana ou o inibidor de PD-L1 sozinho.

[0008] Composições que compreendem uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum são eficazes em terapia em geral, e no tratamento ou prevenção de câncer, em particular, conforme apre- sentado no presente documento abaixo e em [54]. A presente inven- ção é, adicionalmente, com base, em parte, no efeito inesperado al- cançado mediante administração tanto de um inibidor de PD-L1 quanto de uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum. Conforme usado no presente documento, os termos “a combinação da invenção”, “a combinação terapêutica da in- venção” e “a combinação terapêutica” podem ser usados intercambia-

velmente e se referem a uma combinação terapêutica de: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Entero- coccus gallinarum; e (b) um inibidor de PD-L1. Deve-se entender que o termo “combinação” no contexto da combinação terapêutica não se refere aos componentes (a) e (b) da combinação que estão necessari- amente na mesma composição e/ou são administrados ao mesmo tempo. De acordo com modalidades preferenciais, (a) e (b) da combi- nação terapêutica estão em composições separadas. De acordo com algumas modalidades, é fornecida no presente documento a combina- ção da invenção para uso em um método para tratar ou prevenir cân- cer em um indivíduo. De acordo com algumas modalidades, é forneci- do no presente documento um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo, que compreende administrar a combinação terapêu- tica da invenção ao indivíduo.

[0009] De acordo com algumas modalidades, a administração da composição bacteriana no contexto da combinação terapêutica possi- bilita tratamento de pacientes com câncer que não eram responsivos ou que demonstraram resposta insuficiente ao tratamento com um ini- bidor de checkpoint imunológico que foi administrado sem a composi- ção bacteriana. De acordo com algumas modalidades, os pacientes que não são responsivos ou responsivos parciais à terapia com ICI podem ser ICI virgem (isto é, não receberam anteriormente terapia com ICI) ou podem ter se tornado não responsivos ou responsivos parciais depois da administração anteriormente bem-sucedida de ICIs.

[0010] Sem desejar estar vinculado à teoria ou mecanismo, este efeito poderia ser através de modulação de mediadores que melhoram a eficiência de inibidores de PD-L1, tal como através de um aumento em células T CD8* de infiltração em tumor ou um aumento na razão entre células T CD8* de infiltração em tumor e células FoxP3+.

[0011] De acordo com um aspecto, é fornecida no presente docu-

mento uma combinação terapêutica para uso em um método para tra- tar ou prevenir câncer em um indivíduo, em que a referida combinação terapêutica compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor de PD-L1.

[0012] De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre- sente documento uma composição que compreende uma cepa bacte- riana da espécie Enterococcus gallinarum para uso em um método pa- ra tratar ou prevenir câncer em um indivíduo, em que a referida com- posição é usada em combinação com um inibidor de PD-L1.

[0013] De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre- sente documento uma primeira composição que compreende uma ce- pa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum para uso em com- binação com uma segunda composição que compreende um inibidor de PD-L1, para uso em um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo, opcionalmente, em que a referida primeira composição é administrada antes da primeira administração da referida segunda composição e/ou em paralelo com a administração da segunda com- posição, opcionalmente, em que o indivíduo não foi responsivo a um tratamento anterior que usa um inibidor de checkpoint imunológico so- zinho.

[0014] De acordo com outro aspecto, é fornecido no presente do- cumento um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo que necessita do mesmo (também denominado no presente documen- to “o método da invenção”), em que o método compreende: a) admi- nistrar ao indivíduo uma composição que compreende uma cepa bac- teriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) administrar ao indi- víduo um inibidor de PD-L1.

[0015] De acordo com outro aspecto, é fornecido no presente do-

cumento um kit que compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) uma composição que compreende um inibidor de PD-L1.

[0016] De acordo com algumas modalidades, câncer é seleciona- do dentre o grupo que consiste em: câncer de mama, câncer de pul- mão, câncer de cólon, câncer de rim, câncer de fígado, linfoma (tal como linfoma de não Hodgkin), hepatoma e câncer neuroendócrino. De acordo com algumas modalidades, a combinação terapêutica é pa- ra uso em um método para tratar ou prevenir câncer de pulmão, cân- cer de mama, câncer de rim, câncer de fígado, linfoma, hepatoma, câncer neuroendócrino ou câncer de cólon. De acordo com algumas modalidades, o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em: melanoma, carcinoma pulmonar de célula não pequena, câncer de be- xiga e câncer de cabeça e pescoço. Em determinadas modalidades, a combinação terapêutica ou o método da invenção é para uso na redu- ção de tamanho de tumor ou prevenção de crescimento de tumor no tratamento de câncer. De acordo com algumas modalidades, a combi- nação terapêutica ou o método da invenção é para uso em pelo menos um dentre a redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor, prevenção de metástase ou prevenção de angiogênese.

[0017] De acordo com algumas modalidades, os termos “a compo- sição”, “a composição bacteriana” e “a composição da invenção” po- dem ser usados intercambiavelmente e se referem à composição in- cluída na combinação terapêutica da invenção, que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum. De acordo com algumas modalidades, a composição que compreende uma cepa bac- teriana da espécie Enterococcus gallinarum não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de mini- mis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie. De acordo com algumas modalidades, cepas intimamente ligadas de En-

terococcus gallinarum também podem ser usadas como parte da com- binação terapêutica, tal como cepas bacterianas que têm uma se- quência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bac- teriana de Enterococcus gallinarum. De preferência, a cepa bacteriana tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2. De prefe- rência, a identidade de sequência é com a SEQ ID NO: 2. De prefe- rência, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da in- venção tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO:

2.

[0018] Consequentemente, a combinação terapêutica da invenção pode compreender uma composição que compreende uma cepa bac- teriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bacteriana de Entero- coccus gallinarum, opcionalmente à SEQ ID NO: 2, para uso em um método para tratar ou prevenir câncer. Enterococcus gallinarumEm algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição não é de En- terococcus gallinarum, porém, é uma cepa intimamente ligada.

[0019] Em determinadas modalidades, a composição da invenção é para administração oral. Administração oral das cepas da invenção pode ser eficaz para tratar câncer, em particular quando administradas como parte da combinação terapêutica da invenção. Além disto, a ad- ministração oral é conveniente para pacientes e médicos, e permite a distribuição no e/ou colonização parcial ou total do intestino. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 usado como parte da combinação terapêutica da invenção é administrado por via intraveno- sa. De acordo com algumas modalidades, cada um dentre a composi- ção bacteriana e o inibidor de PD-L1 da combinação terapêutica está presente em uma composição separada, em que cada um compreen-

de, possivelmente, um carreador e/ou um excipiente adequado para seu modo de administração. Em determinadas modalidades, a compo- sição da invenção compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em determinadas modalidades, o inibi- dor de PD-L1 está em uma composição que compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0020] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana da invenção compreende uma cepa bacteriana que foi liofiizada. À liofilização é uma técnica eficaz e conveniente para preparar composi- ções estáveis que permitem a distribuição de bactérias. De acordo com algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[0021] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana está compreendida em um produto alimentício. Em determinadas mo- dalidades, a composição bacteriana está compreendida em uma vaci- na.

[0022] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana compreende uma única cepa de Enterococcus gallinarum. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana compre- ende a cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum como parte de um consórcio microbiano. De preferência, a composição bacteriana com- preende a cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488.

[0023] De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é selecionado dentre o grupo que consiste em: Atezolizumabe, Avelu- mabe, Durvalumabe e uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é selecionado dentre o gru- po que consiste em: Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe, BMS- 936559, LY3300054, CK-301, 3D-2-02-0015, SHR-1316, FAZO53 e uma combinação dos mesmos.

[0024] De acordo com algumas modalidades do método da inven- ção, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo antes de uma primeira administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo. De acordo com algumas modalidades do método da invenção, a composi- ção bacteriana é administrada ao indivíduo por pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas antes da primeira administração do inibidor de PD-L1. Deve-se entender que, no contexto do método da invenção, a primeira administração do inibidor de PD-L1 se refere a uma primeira administração como parte da combinação terapêutica da invenção. Antes da administração da combinação terapêutica da invenção o indi- víduo pode ter recebido um inibidor de PD-L1 sem a composição bac- teriana da invenção que é administrada durante/antes da administra- ção do inibidor de PD-L1. De acordo com algumas modalidades, pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas se passaram entre a admi- nistração da combinação terapêutica da invenção e antes da adminis- tração de um inibidor de PD-L1 sozinho ou da composição bacteriana sozinha.

[0025] De acordo com algumas modalidades do método da inven- ção, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo. No contexto de vezes de administração da composição bac- teriana e do inibidor de PD-L1, a administração se refere, pelo menos parcialmente em paralelo, às administrações que podem se sobrepor completamente (por exemplo, administração de ambos componentes durante um período de tempo de 12 meses) ou parcialmente (por exemplo, administração de um componente durante um período de tempo de 12 meses e administração do segundo componente durante um período de tempo de 8 meses, que pode se sobrepor completa ou parcialmente ao período de 12 meses). Deve-se entender que a admi- nistração paralela de ambos os componentes não significa que ambos componentes são necessariamente administrados usando o mesmo regime de dosagem. De acordo com algumas modalidades do método da invenção, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo an- tes da primeira administração do inibidor de PD-L1 e/ou pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor de PD-L1 ao referido indivíduo. De acordo com determinadas modalidades, a com- posição bacteriana é administrada ao indivíduo por pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas antes da primeira administração do ini- bidor de PD-L1, seguido da administração da composição bacteriana e inibidor de PD-L1 pelo menos parcialmente em paralelo por pelo me- nos duas, quatro ou seis semanas.

[0026] De acordo com algumas modalidades, a cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum e o inibidor de PD-L1 estão em com- posições separadas, em que, preferencialmente, a composição bacteria- na é formulada para administração oral enquanto o inibidor de PD-L1 es- tá em uma formulação formulada para administração intravenosa.

[0027] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo que não foi responsivo a um tratamento anterior usando e um inibidor de checkpoint imunológico sozinho. Conforme usado no presente do- cumento, um indivíduo que não é responsivo ao tratamento com um inibidor de checkpoint imunológico se refere a um indivíduo que não é responsivo de acordo com os critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos) ou de acordo com os critérios ir- RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados).

[0028] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo, em que um inibidor de PD-L1 ou a composição bacteriana sozinhos não podem fornecer tratamento ou prevenção eficaz de câncer no in-

divíduo. De acordo com algumas modalidades, um tratamento eficaz contra câncer em um indivíduo compreende pelo menos uma dentre a redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor e/ou prevenção de metástase a um grau que resultará na remissão comple- ta ou parcial do câncer no indivíduo.

[0029] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é capaz de reduzir tamanho de tumor e/ou reduzir crescimento de tumor e/ou prevenir metástase e/ou prevenir angiogê- nese a um grau maior que um inibidor de PD-L1 ou a composição bac- teriana sozinhos.

[0030] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é para tratar câncer em um indivíduo, de modo que haja remissão completa do câncer no indivíduo, preferencialmente em um período de tempo mais curto do que aquele alcançado usando o tratamento com o inibidor de PD-L1 ou a composição bacteriana so- zinhos.

[0031] A invenção também fornece uma composição que compre- ende um inibidor de PD-L1, para uso em um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo que recebeu anteriormente adminis- tração de uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, preferencialmente a cepa deposita- da sob o número de acesso NCIMB 42488.

[0032] A invenção também fornece uma composição que compre- ende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, prefe- rencialmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, para uso em um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo diagnosticado com necessidade de tratamento com um inibi- dor de PD-L1.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0033] Figura 1A: Modelo de camundongo de câncer de mama —

volume tumoral.

[0034] Figura 1B: Painel superior: Área de necrose em tumores EMTSG (Não tratados n = 6, Veículo n = 6, MRx0518 n = 8). Painel infe- rior: Porcentagem de células divisoras em tumores EMT6. P = 0,019 (Não tratados n = 4, número total de células contadas = 37201, Veícu- lo n = 6, número total de células contadas = 64297, MRx0518 n=6, número total de células contadas = 33539).

[0035] Figura 1C: Modelo de camundongo de câncer de mama — células imunológicas infiltradas. Gráficos de dispersão representam contagens de célula de diferentes marcadores imunológicos de ani- mais individuais de cada grupo de tratamento.

[0036] Figura 1D: Modelo de camundongo de câncer de mama — Produção de citocina em lisados tumorais. Colunas representam a média de pg/ml de proteína total de cada grupo de tratamento. *p < 0,05 entre grupos que usam ANOVA de uma via seguido do teste de múltiplas comparações de Dunnett.

[0037] Figura 1E: Modelo de camundongo de câncer de mama — Produção de citocina em plasma sanguíneo. Colunas representam a média de pg/ml de cada grupo de tratamento (+/- SEM).

[0038] Figura 1F: Imagens representativas de criosseções de fleo do veículo, camundongos tratados com MRx0518 e CTLA-4 imuno- marcados com anticorpos contra CD8a (painéis inferiores) e contra- manchados com DAP! (painéis superiores).

[0039] Figura 1G: Plotagem que quantifica subconjuntos de estu- do animal com mais de 3 células CD8a+ por campo obtidas a partir da região de cripta de leo de camundongos tratados com veículo, MRx0518 ou CTLA-4.

[0040] Figura 2: Modelo de camundongo de câncer de pulmão — volume tumoral.

[0041] Figura 3A: Modelo de camundongo de câncer de fígado —

peso do fígado.

[0042] Figura 3B: Modelo de camundongo de câncer de rim — vo- lume tumoral.

[0043] Figura 4A: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríticas imaturas (Sem bactéria).

[0044] Figura 4B: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríticas imaturas após a adição de LPS.

[0045] Figura 4C: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríticas imaturas após a adição de MRX518.

[0046] Figura 4D: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríticas imaturas após a adição de MRX518 e LPS.

[0047] Figura 5A: Níveis de citocina em células THP-1 (Sem bac- téria).

[0048] Figura 5B: Níveis de citocina em células THP-1 após a adi- ção de sedimento bacteriano.

[0049] Figura 5C: Níveis de citocina em células THP-1 após a adi- ção de MRX518 sozinho ou em combinação com LPS.

[0050] Figura 6: Gráfico de barras que representa a porcentagem de células CD8+ de proliferação depois de vários tratamentos (NCD — Sem divisão celular, IRCD — Uma divisão celular, 2RCD — Duas divi- sões celulares, 3RCD — Três divisões celulares, 4RCD — Quatro divi- sões celulares).

[0051] Figura 7A: Uma representação esquemática do cronogra- ma de tratamento dos diferentes grupos usados no Exemplo 6 descrito no presente documento abaixo.

[0052] Figura 7B: Volume tumoral médio em camundongos que carregam um tumor formado por células EMT-6. Os camundongos eram não tratados ou tratados com um veículo YCFA (Veículo), bacté- rias MRx518 em meio YCFA (MRx518), um anticorpo anti-PD1 e meio YCFA (Anti-PD1), um anticorpo anti-CTLA-4 e meio YCFA (Anti-CTLA-

4), uma combinação de MRx518 e o anticorpo anti-PD1 ou uma com- binação de MRx518 e o anticorpo anti-CTLA-4.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO CEPAS BACTERIANAS

[0053] As composições da invenção compreendem uma cepa bac- teriana da espécie Enterococcus gallinarum. Os exemplos demons- tram que uma combinação terapêutica que compreende bactérias des- ta espécie é útil para tratar ou prevenir câncer.

[0054] De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre- sente documento uma combinação terapêutica para uso em um méto- do para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo, em que a referida combinação terapêutica compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor de PD-L1.

[0055] De acordo com algumas modalidades, uma composição que compreende uma cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum pode ser usada na combinação terapêutica e no método da presente invenção. De acordo com determinadas modalidades, a invenção também fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana que tem uma se- quência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2 para uso no tratamento ou prevenção de câncer em combinação com o um inibidor de PD-L1. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição não é de Enterococcus gallinarum, porém, é uma cepa intimamente ligada.

[0056] Em determinadas modalidades, a composição da invenção compreende uma cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo,

que é um Enterococcus gallinarum, e não contém nenhum outro gêne- ro bacteriano. Em determinadas modalidades, a composição da inven- ção compreende uma única cepa de uma cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é um Enterococcus gallinarum, e não contém nenhuma outra cepa ou espécie bacteriana.

[0057] Enterococcus gallinarum forma células cocoides, principal- mente em pares ou cadeias curtas. A mesma é não móvel e colônias em ágar sanguíneo ou ágar de nutriente são circulares e suaves. Ente- rococcus gallinarum reage com o antissoro de grupo D Lancefield. À cepa de tipo de Enterococcus gallinarum é F87/276 = PB21 = ATCC 49573 = CCUG 18658 = CIP 103013 = JCM 8728 = LMG 13129 = NBRC 100675 = NCIMB 702313 (anteriormente NCDO 2313) = NOCTC 12359 [17]. O número de acesso GenBank para uma sequência de gene de 168 rRNA de Enterococcus gallinarum é AFO39900 (descrito no presente documento como SEQ ID NO:1). Uma cepa de Entero- coccus gallinarum exemplificativa é descrita em [17].

[0058] A bactéria Enterococcus gallinarum depositada sob o nú- mero de acesso NCIMB 42488 foi testada nos Exemplos e também é denominada no presente documento cepa MRX518. Referências a MRX518 e MRx0518 são usadas intercambiavelmente. Uma sequên- cia de 16S rRNA para a cepa MRX518 que foi testada é fornecida na SEQ ID NO: 2. A cepa MRX518 foi depositada com a autoridade de depósito internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia) pela 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences In- novation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) em 16 de novembro de 2015 como “Enterococcus sp” e recebeu o número de acesso NCIMB 42488.

[0059] O genoma da cepa MRX518 compreende um cromossomo e plasmídeo. Uma sequência de cromossomo para a cepa MRX518 é fornecida na SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520. Uma sequência de plasmídeo para a cepa MRX518 é fornecida na SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520. Estas sequências foram ge- radas usando a plataforma PacBio RS |l.

[0060] Também se espera que as cepas bacterianas intimamente ligadas à cepa testada nos exemplos sejam eficazes para tratar ou prevenir câncer na combinação terapêutica da invenção. Em determi- nadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação tera- pêutica da invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo me- nos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum. De preferência, a cepa bacteriana, para uso na combinação terapêutica da invenção, tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2. De preferência, a identidade de sequência é com a SEQ ID NO: 2. De preferência, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2.

[0061] Também se espera que as cepas bacterianas que são bio- tipos da bactéria depositada sob o número de acesso 42488 sejam eficazes para tratar ou prevenir câncer no contexto da combinação te- rapêutica da invenção. Um biotipo é uma cepa intimamente ligada que tem características fisiológicas e bioquímicas iguais ou muito similares.

[0062] Cepas que são biotipos da bactéria depositada sob o núme- ro de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na combi- nação terapêutica da invenção podem ser identificadas sequenciando- se outras sequências de nucleotídeos para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. Por exemplo, substancialmente o genoma inteiro pode ser sequenciado e uma cepa de biotipo para uso na combinação terapêutica da invenção pode ter pelo menos 95%,

96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência através de pelo menos 80% de seu genoma inteiro (por exemplo, atra- vés de pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99%, ou através de seu geno- ma inteiro). Por exemplo, em algumas modalidades, uma cepa de bio- tipo tem pelo menos 98% de identidade de sequência através de pelo menos 98% de seu genoma ou pelo menos 99% de identidade de se- quência através de 99% de seu genoma. Outras sequências adequa- das para uso na identificação de cepas de biotipo podem incluir se- quências de hsp60 ou repetitivas, tais como BOX, ERIC, (GTG)s, ou REP ou [18]. Cepas de biotipo podem ter sequências com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de se- quência com a sequência correspondente da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. Em algumas modalidades, uma cepa de biotipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a se- quência correspondente da cepa MRX518 depositada como NCIMB 42488 e compreende uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 99% idêntica (por exemplo, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% idêntica) à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, uma cepa de bio- tipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência corres- pondente da cepa MRX518 depositada como NCIMB 42488 e tem a sequência de 16S rRNA da SEQ |D NO: 2.

[0063] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520. Em modalidades preferenciais, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção pode ter um cromos- somo com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do do- cumento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 95% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do do- cumento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do do- cumento nº WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 95% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/ 085520 através de 98% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/ 085520, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520.

[0064] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um plasmídeo com identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO?2017/085520. Em modalidades preferenciais, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um plasmídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção pode ter um plasmí-

deo com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/ 085520 através de 80% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/ 085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO?2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do do- cumento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 4 do do- cumento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520.

[0065] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 e um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520.

[0066] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520, por exemplo, conforme descrito acima, e uma se- quência de 16S rRNA com identidade de sequência com qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 1 ou 2, por exemplo, conforme descrito acima, preferencialmente com uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 2, mais preferencialmente que compreen- de a sequência de 16S rRNA da SEQ ID NO: 2 e compreende, opcio- nalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima.

[0067] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/ 085520, por exemplo, conforme descrito acima e compreende, opcio- nalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0068] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/ 085520, por exemplo, conforme descrito acima, e uma sequência de 168 rRNA com identidade de sequência com qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1 ou 2, por exemplo, conforme descrito acima e compre-

ende, opcionalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0069] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 168 rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cro- mossomo com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de pelo me- nos 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 e com- preende, opcionalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0070] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 168 rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cro- mossomo com pelo menos 98% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de se- quência) com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 atra- vés de pelo menos 98% (por exemplo, através de pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%) da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/ 085520 e compreende, opcionalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0071] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção é um Enterococcus gallinarum e tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou

99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 168 rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cromossomo com pelo menos 98% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 através de pelo menos 98% (por exemplo, através de pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%) da SEQ ID NO: 3 do docu- mento nº WO2017/085520 e compreende, opcionalmente, um plasmí- deo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para tra- tar ou prevenir câncer.

[0072] Alternativamente, cepas que são biotipos da bactéria depo- sitada sob o número de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na combinação terapêutica da invenção podem ser identifi- cadas usando a análise de fragmento de depósito e restrição e/ou aná- lise de PCR de número de acesso NCIMB 42488, por exemplo, usan- do polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado fluorescen- te (FAFLP) e identificação genética por (rep)-PCR de elemento de DNA repetitivo, ou perfilagem de proteína, ou sequenciamento de 16S ou 23s rDNA parcial. Em modalidades preferenciais, tais técnicas po- dem ser usadas para identificar outras cepas de Enterococcus galli- narum.

[0073] Em determinadas modalidades, cepas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na combinação terapêutica da invenção são ce- pas que fornecem o mesmo padrão que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 quando analisada por análise de res- trição de DNA ribossômico amplificada (ARDRA), por exemplo, medi- ante o uso de enzima de restrição Sau3Al (para métodos exemplifica- tivos e orientação, consultar, por exemplo,[19]). Alternativamente, as cepas de biotipo são identificadas como cepas que têm os mesmos padrões de fermentação de carboidrato que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. Em algumas modalidades, o pa- drão de fermentação de carboidrato é determinado usando o painel API 50 CHL (bioMérieux). Em algumas modalidades, a cepa bacteria- na usada na combinação terapêutica da invenção é:

[0074] positiva para fermentação de pelo menos um dentre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou todos dentre): L-arabinose, D-ribose, D-xilose, D-galactose, D- glicose, D-frutose, D-manose, N-acetilglicosamina, amidalina, arbutina, salicina, D-celobiose, D-maltose, sacarose, D-trealose, gentiobiose, D- tagatose e gliconato de potássio; e/ou

[0075] intermediária para fermentação de pelo menos um dentre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos dentre): D-manitol, Metil- aD-glicopiranosídeo, D-lactose, amido e L-fucose;

[0076] preferencialmente, conforme determinado por análise API 50 CHL (preferencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMéri- eux).

[0077] Outras cepas de Enterococcus gallinarum que são úteis nas composições e métodos da invenção, tais como biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, podem ser identi- ficadas usando qualquer método ou estratégia apropriada, que inclui os ensaios descritos nos exemplos. Por exemplo, cepas para uso na combinação terapêutica da invenção podem ser identificadas cultivan- do-as em YCFA anaeróbico e/ou administrando-se as bactérias para o modelo de camundongo com artrite induzida por colágeno tipo || e, en- tão, avaliando-se os níveis de citocina. Em particular, cepas bacteria- nas que têm padrões de crescimento, tipo metabólico e/ou antígenos de superfície similares com a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 podem ser úteis na combinação terapêutica da invenção. Uma cepa útil terá atividade imunomoduladora comparável com a cepa NCIMB 42488. Em particular, uma cepa de biotipo elicitará efeitos comparáveis nos modelos de câncer para os efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultivo e administração descritos nos Exemplos. De acordo com algu- mas modalidades, uma cepa de biotipo que pode ser usada na combi- nação terapêutica da invenção é uma cepa que é capaz de elicitar efeitos comparáveis nos modelos de câncer mostrados nos Exemplos quando administrada na combinação terapêutica ou método da inven- ção.

[0078] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na combinação terapêutica da invenção é:

[0079] (i) Positiva para pelo menos uma dentre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos dentre): fermentação de manose, des- carboxilase de ácido glutâmico, arilamidase de arginina, arilamidase de fenilalanina, arilamidase de ácido piroglutâmico, arilamidase de ti- rosina, arilamidase de histidina e arilamidase de serina; e/ou

[0080] (ii) Intermediária para pelo menos um dentre (por exemplo, pelo menos 2 ou todos dentre): B-galactosidase-6-fosfato, B-glicosi- dase e N-acetil-B-glicosaminidase; e/ou

[0081] (iii) Negativa para pelo menos uma dentre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou todos dentre): fermentação de rafinose, ari- lamidase de prolina, arilamidase de leucil-glicina, arilamidase de leuci- na, arilamidase de alanina, arilamidase de glicina e arilamidase de áci- do glutamil-glutâmico,

[0082] preferencialmente, conforme determinado por um ensaio de metabolismo de carboidrato, aminoácido e nitrato e, opcionalmente, um ensaio de atividade de fosfatase alcalina, mais preferencialmente, conforme determinado por análise Rapid ID 32A (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux).

[0083] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na combinação terapêutica da invenção é:

[0084] (i) Negativa para pelo menos uma dentre (por exemplo, pe- lo menos 2, 3, ou todos os 4 dentre) arilamidase de glicina, fermenta- ção de rafinose, arilamidase de prolina e arilamidase de leucina, por exemplo, conforme determinado por um ensaio de metabolismo de carboidrato, aminoácido e nitrato, preferencialmente conforme deter- minado por análise Rapid ID 32A (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux); e/ou

[0085] (ii) Intermediária positiva para fermentação de L-fucose, preferencialmente, conforme determinado por análise API 50 CHL (preferencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMérieux).

[0086] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na combinação terapêutica da invenção é um produtor de ATP extracelu- lar, por exemplo, um que produz 6 a 6,7 ng/ul (por exemplo, 6,1 a 6,6 ng/ul ou 6,2 a 6,5 ng/ul ou 6,33 + 0,10 ng/ul) de ATP conforme medido usando o Kit de Ensaio de ATP (Sigma-Aldrich, MAK190). ATP extra- celular bacteriano pode ter efeitos pleiotrópicos que incluem ativação de sinalização mediada por receptor de célula T (Schenk et al., 2011), promoção de diferenciação célula Th17 intestinal (Atarashi et al., 2008) e indução de secreção do mediador pró-inflamatório IL-1B ativando-se o inflamossoma NLRP3 (Karmarkar et al., 2016). Consequentemente, uma cepa bacteriana que é um produtor de ATP extracelular é útil para tratar ou prevenir câncer no contexto da combinação terapêutica e mé- todo da invenção.

[0087] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção compreende um ou mais dentre os seguintes três genes: Proteína de elemento móvel; Transportador ABC de xilose, componente de permease; e FIGO0632333: proteína hipotética. Por exemplo, em determinadas modalidades, a cepa bacte-

riana para uso na combinação terapêutica da invenção compreende genes que codificam proteína de elemento móvel e transportador ABC de xilose, componente de permease; proteína de elemento móvel e FIGO0632333: proteína hipotética; transportador ABC de xilose, com- ponente de permease e FIGO0632333: proteína hipotética; ou proteína de elemento móvel, transportador ABC de xilose, componente de per- mease e FIGO0632333: proteína hipotética.

[0088] Uma cepa particularmente preferencial da combinação te- rapêutica da invenção é a cepa de Enterococcus gallinarum deposita- da sob o número de acesso NCIMB 42488. Esta é a cepa MRX518 exemplificativa testada nos exemplos e que se mostrou eficaz para tratar uma doença. A invenção fornece, de acordo com algumas moda- lidades, uma composição bacteriana como parte da combinação tera- pêutica da invenção, que compreende uma célula da cepa de Entero- coccus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, ou um derivado da mesma. Um derivado da cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 pode ser uma cepa filha (progênie) ou uma cepa cultivada (subclonada) a partir da original.

[0089] Um derivado de uma cepa da composição compreendida na combinação terapêutica da invenção pode ser modificado, por exemplo, no nível genético, sem ablacionar a atividade biológica. Em particular, uma cepa derivada da combinação terapêutica da invenção é terapeuticamente ativa. Uma cepa derivada terá atividade imunomo- duladora comparável com a cepa NCIMB 42488 original. Em particular, uma cepa derivada elicitará efeitos comparáveis nos modelos de do- ença câncer quando combinadas com um inibidor de PD-L1 para os efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultivo e administração descritos nos Exemplos. Um derivado da cepa NCIMB 42488 será, de modo geral, um biotipo da cepa NCIMB 42488.

[0090] Referências às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 englobam quais- quer células que têm as mesmas características de eficácia de segu- rança e terapêutica que as cepas depositadas sob o número de aces- so NCIMB 42488, e tais células são englobadas pela combinação te- rapêutica da invenção. Assim, em algumas modalidades, referência às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 se refere apenas à cepa MRX518 depositada sob NCIMB 42488 e não se refere a uma cepa bacteriana que não foi depositada sob NCIMB 42488. Em algumas modalidades, referência às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o nú- mero de acesso NCIMB 42488 se refere às células que têm as mes- mas características de eficácia de segurança e terapêutica que as ce- pas depositadas sob o número de acesso NCIMB 42488, porém, que não são a cepa depositada sob NCIMB 42488.

[0091] Em modalidades preferenciais, as cepas bacterianas nas composições da invenção são viáveis e capazes de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

TRATAMENTO DE CÂNCER

[0092] Em modalidades preferenciais, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer. Os exemplos demonstram que a administração das combinações tera- pêuticas da invenção pode resultar em uma redução no crescimento de tumor.

[0093] Em determinadas modalidades, o tratamento com as com- binações terapêuticas da invenção resulta em uma redução no tama- nho de tumor ou em uma redução em crescimento de tumor. Em de- terminadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor ou redução de cresci- mento de tumor. As combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para reduzir tamanho ou crescimento de tumor. Em determi- nadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso em pacientes com tumores sólidos. Em determinadas moda- lidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução ou prevenção de angiogênese no tratamento de câncer. As combinações terapêuticas da invenção podem ter um efeito sobre os sistemas imunológicos ou inflamatórios, que têm papeis central em angiogênese. Em determinadas modalidades, as combinações tera- pêuticas da invenção são para uso na prevenção de metástase.

[0094] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de mama. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar câncer de mama. Em de- terminadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimen- to de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer de mama. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de ma- ma. Em modalidades preferenciais, o câncer é câncer de mama em estágio |V.

[0095] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de pulmão. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuti- cas da invenção podem ser eficazes para tratar câncer de pulmão. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimen- to de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer de pulmão. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de pul- mão.

[0096] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de fígado. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar câncer de fígado. Em de- terminadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimen- to de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer de fígado. Em modalidades preferenciais, o câncer é hepatoma (carcino- ma hepatocelular).

[0097] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de cólon. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção têm um efeito sobre células de câncer de cólon e podem ser eficazes para tratar câncer de cólon. Em determinadas modalida- des, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redu- ção de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor ou redu- ção de angiogênese no tratamento de câncer de cólon. Em modalida- des preferenciais, o câncer é adenocarcinoma colorretal.

[0098] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de rim (também denominado no presente documento câncer renal). Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção têm um efeito sobre células de câncer renal e podem ser eficazes para tratar câncer renal. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tu- mor, redução de crescimento de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer renal. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de célula renal ou carcinoma de célula transicional.

[0099] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de mela- noma. De acordo com algumas modalidades, as combinações tera- pêuticas da invenção têm um efeito sobre melanócitos e podem ser eficazes para tratar melanoma. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de melanoma.

[00100] Em algumas modalidades, o câncer é do intestino. Em al- gumas modalidades, o câncer é de uma parte do corpo que não é o intestino. Em algumas modalidades, o câncer não é câncer do intesti- no. Em algumas modalidades, o câncer não é câncer colorretal. Em algumas modalidades, o câncer não é câncer do intestino delgado. Em algumas modalidades, o tratamento ou prevenção ocorre em um sítio diferente do intestino. Em algumas modalidades, o tratamento ou pre- venção ocorre no intestino e também em um sítio diferente do intesti- no.

[00101] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de carci- noma. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar diversos tipos de carcinoma. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da in- venção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer não imu- nogênico. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar cânceres não imunogêni- cos.

[00102] Os efeitos terapêuticos das composições bacterianas da invenção sobre câncer, no contexto das combinações terapêuticas da invenção, podem ser mediados por um mecanismo pró-inflamatório. Exemplos 2, 4 e 5 demonstram que a expressão de diversas citocinas pró-inflamatórias pode ser aumentada depois da administração de MRX518. A inflamação pode ter um efeito supressor de câncer [20] e citocinas pró-inflamatórias, tais como TNFa são investigadas como te- rapias contra câncer [21]. A regulação crescente de genes, tal como

TNF mostrada nos exemplos, pode indicar que as composições bacte- rianas da invenção podem ser úteis para tratar câncer via um meca- nismo similar.

A regulação crescente de ligantes CXCR3 (CXCL9, CXCL10) e genes de IFNy induzível (IL-32) pode indicar que as com- posições bacterianas da invenção elicitam uma resposta do tipo IFNy.

IFNy é um fator de ativação de macrófago potente que pode estimular atividade tumirocida [22], e CXCL9 e CXCL10, por exemplo, também têm efeitos anticâncer [23 a 25]. Portanto, em determinadas modalida- des, as composições bacterianas da invenção, quando usadas no con- texto da combinação terapêutica da invenção, são para uso na promo- ção de inflamação no tratamento de câncer.

Em modalidades prefe- renciais, as composições da invenção, quando usadas no contexto da combinação terapêutica da invenção, são para uso na promoção de inflamação de Th1 no tratamento de câncer.

Células Th1 produzem IFNy e têm efeitos anticâncer potentes [20]. Em determinadas modali- dades, as composições da invenção, quando usadas no contexto da combinação terapêutica da invenção, são para uso no tratamento de um câncer em estágio inicial, tal como um câncer que não sofreu me- tástase, ou um câncer em estágio O ou estágio 1. Promover inflamação pode ser mais eficaz contra cânceres em estágio inicial [20]. Em de- terminadas modalidades, as composições da invenção, quando usa- das no contexto da combinação terapêutica da invenção, são para uso na promoção de inflamação para aprimorar o efeito de um inibidor de PD-L1. Em determinadas modalidades, o tratamento ou prevenção de câncer compreende aumentar o nível de expressão de uma ou mais citocinas.

Por exemplo, em determinadas modalidades, o tratamento ou prevenção de câncer compreende aumentar o nível de expressão de um ou mais dentre IL-18, IL-6 e TNF-a, por exemplo, IL-18 e IL-6, IL-18Be TNF-a, IL-6 e TNF-a ou todos os três dentre IL-1B, IL-6 e TNF- a.

Sabe-se que aumentos nos níveis de expressão de qualquer um dentre IL-1 B, IL-6 e TNF-a são indicativos de eficácia no tratamento de câncer.

[00103] Exemplos 4 e 5 demonstram que, quando uma cepa bacte- riana, conforme descrito no presente documento, é usada em combi- nação com lipopolissacarídeo (LPS), há um aumento sinérgico em IL-

18. Sabe-se que LPS elicita um efeito pró-inflamatório. Assim, em de- terminadas modalidades, o tratamento ou prevenção de câncer com- preende usar uma cepa bacteriana, conforme descrito no presente do- cumento, em combinação com um agente que regula de modo cres- cente IL-18. Em determinadas modalidades, o tratamento ou preven- ção de câncer compreende usar uma cepa bacteriana, conforme des- crito no presente documento, em combinação com LPS. Consequen- temente, a combinação terapêutica da invenção pode compreender, adicionalmente, um agente que regula de modo crescente IL-18. Con- sequentemente, a composição bacteriana da invenção pode compre- ender ainda LPS.

[00104] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de um paciente que rece- beu, anteriormente, quimioterapia. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de um paciente que não tolerou um tratamento de quimioterapia. As com- binações terapêuticas da invenção podem ser particularmente ade- quadas para tais pacientes. Em outras modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de um paciente com câncer que não foi responsivo a um tratamento anterior com um inibidor de checkpoint imunológico. Em outras modalidades, as combi- nações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de um paciente com câncer que não foi responsivo a um tratamento anterior com um inibidor de PD-1. Sem desejar estar vinculado à teoria ou me- canismo, se acredita que a composição bacteriana da invenção é ca-

paz de estimular o sistema imunológico do indivíduo através de um mecanismo diferente daquele de inibidores de PD-L1, fornecendo, as- sim, um mecanismo complementar para tratar pacientes que não são responsivos aos inibidores de checkpoint imunológico.

[00105] De acordo com algumas modalidades, o tratamento de câncer que usa a combinação terapêutica dos resultados da invenção é mais eficaz do que usar um inibidor de PD-L1 sozinho, conforme medido pelos critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos) ou os critérios irRECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados). De acordo com algumas modalidades, o tratamento de câncer que usa a combinação terapêutica dos resultados da invenção é mais eficaz do que usar a composição bacteriana sozinha, conforme medido pelos critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Só- lidos) ou os critérios ir»rRECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados). De acordo com al- gumas modalidades, o tratamento de câncer que usa a combinação terapêutica da invenção resulta em efeitos clínicos sinérgicos em com- paração com o tratamento com um inibidor de PD-L1 sozinho ou a composição bacteriana sozinha, conforme medido pelos critérios RE- CIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos) ou os critérios irRECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados).

[00106] De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 da combinação terapêutica é um anticorpo. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 da combinação terapêutica é um an- ticorpo que alveja PD-L1. Em determinadas modalidades, as combina- ções terapêuticas da invenção são para prevenir recaída. As composi- ções bacterianas, no contexto das combinações terapêuticas da in- venção, podem ser adequadas para administração a longo prazo. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na prevenção da progressão de câncer.

[00107] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC). Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de carcinoma pulmonar de célula pequena. Em determinadas modalida- des, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no trata- mento de carcinoma de célula escamosa. Em determinadas modalida- des, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no trata- mento de adenocarcinoma. Em determinadas modalidades, as combi- nações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de tumo- res glandulares, tumores carcinoides ou carcinomas não diferenciados.

[00108] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de hepatoblastoma, co- langiocarcinoma, cistadenocarcinoma colangiocelular ou câncer de fígado que resulta de uma infecção viral.

[00109] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de carcinoma ductal inva- sivo, carcinoma ductal in situ ou carcinoma lobular invasivo.

[00110] Em modalidades adicionais, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adre- nocortical, carcinoma de célula basal, câncer de duto biliar, câncer de bexiga, tumor ósseo, osteossarcomal/histiocitoma fibroso maligno, gli- oma do tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebelar, as- trocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tu- mores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, câncer de mama, adenomas bronquiais/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, linfo- ma de célula T cutâneo, câncer endometrial, ependimoma, câncer do esôfago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrointes- tinal, tumor do estroma gastrointestinal (GIST), tumor de célula germi- nal, glioma de via visual infantil e hipotalâmico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcinoma de célula de ilhota, sarcoma Kaposi, câncer de célula renal, câncer laríngeo, leucemias, linfomas, mesotelioma, neu- roblastoma, linfoma de não Hodgkin, câncer orofaríngeo, osteossar- coma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de paratireoide, câncer faríngeo, adenoma de hipófise, neoplasia de célula plasmática, câncer de próstata, carcinoma de célula renal, retinoblastoma, sarco- ma, câncer testicular, câncer de tireoide ou câncer uterino.

[00111] De acordo com algumas modalidades, as combinações te- rapêuticas são para uso no tratamento ou prevenção de câncer seleci- onado dentre o grupo que consiste em: melanoma, NSCLC, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço.

[00112] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção compreendem um agente anticâncer adicional. De acordo com algumas modalidades, o agente anticâncer adicional é se- lecionado dentre: uma imunoterapia de anticorpo alvejado, uma terapia de célula T CAR, um vírus oncolítico ou um fármaco citostático.

MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[00113] De preferência, as composições bacterianas da invenção devem ser administradas no trato gastrointestinal de modo a permitir a distribuição no e/ou colonização parcial ou total do intestino com a ce- pa bacteriana da invenção. De modo geral, as composições bacteria- nas da invenção são administradas por via oral, porém, podem ser administradas por via retal, intranasal ou através de rotas bucal ou sublingual.

[00114] Em determinadas modalidades, as composições bacteria- nas da invenção podem ser administradas como uma espuma, como uma aspersão ou um gel.

[00115] Em determinadas modalidades, as composições bacteria- nas da invenção podem ser administradas como um supositório, tal como um supositório retal, por exemplo, na forma de um óleo teobro- ma (manteiga de cacau), gordura dura sintética (por exemplo, suppo- cire, witepsol), glicero-gelatina, polietilenoglicol, ou composição de gli- cerina de sabão.

[00116] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana da invenção é administrada no trato gastrointestinal via um tubo, tal como um tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de jejunostomia (tubo J), gastrostomia endoscópica percutânea (PEG), ou uma porta, tal como uma porta da parede torácica que dá acesso ao estômago, jejuno e outras portas de acesso adequadas.

[00117] As composições bacterianas da invenção podem ser admi- nistradas uma vez, ou podem ser administradas em sequência como parte de um regime de tratamento. Em determinadas modalidades, as composições bacterianas da invenção devem ser administradas diari- amente.

[00118] Em determinadas modalidades da invenção, o tratamento, de acordo com a invenção, é acompanhado pela avaliação da microbi- ota intestinal do paciente. O tratamento pode ser repetido caso a dis- tribuição de e/ou colonização parcial ou total com a cepa da composi- ção bacteriana da invenção não seja alcançada de modo que a eficá- cia não seja observada, ou o tratamento pode ser interrompido caso a distribuição e/ou colonização parcial ou total seja bem-sucedida e efi- cácia seja observada. De acordo com algumas modalidades, a com- posição bacteriana da invenção é administrada ao indivíduo antes da primeira administração com o inibidor de PD-L1 da combinação tera-

pêutica da invenção. De acordo com algumas modalidades, a microbi- ota intestinal do indivíduo é avaliada após administração da composi- ção bacteriana e antes da primeira administração do inibidor de PD-L1, de modo que o inibidor de PD-L1 seja administrado apenas após dis- tribuição e/ou colonização parcial ou total com a cepa da cepa bacteri- ana na composição ser alcançada. Em determinadas modalidades, a combinação terapêutica da invenção pode ser administrada a um ani- mal grávido, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano, de modo a reduzir a probabilidade do câncer se desenvolver em seu filho no útero e/ou após o mesmo nascer.

[00119] A combinação terapêutica da invenção pode ser adminis- trada a um paciente que foi diagnosticado com câncer, ou que foi iden- tificado como em risco de um câncer. A combinação terapêutica tam- bém pode ser administrada como uma medida profilática para prevenir o desenvolvimento de câncer em um paciente saudável.

[00120] A combinação terapêutica da invenção pode ser adminis- trada a um paciente que foi identificado com uma microbiota intestinal anormal. Por exemplo, o paciente pode ter colonização reduzida ou ausente por Enterococcus gallinarum.

[00121] As composições bacterianas da invenção podem ser admi- nistradas como um produto alimentício, tal como um complemento nu- tricional.

[00122] De modo geral, as combinações terapêuticas da invenção são para o tratamento de seres humanos, embora possam ser usadas para tratar animais que incluem mamíferos monogástricos, tais como aves, porcos, gatos, cães, cavalos ou coelhos. As combinações tera- pêuticas da invenção podem ser úteis para aprimorar o crescimento e desempenho de animais. Se a composição bacteriana for administrada aos animais, gavagem oral pode ser usada.

[00123] De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é administrado por via intravenosa. De acordo com algumas modalida- des, o inibidor de PD-L1 que é administrado por via intravenosa está em uma composição que, opcionalmente, compreende ainda pelo me- nos um carreador ou excipiente farmaceuticamente compatível. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é administrado por via intravenosa aproximadamente a cada uma, duas, três ou qua- tro semanas, preferencialmente a cada três semanas.

[00124] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana e o inibidor de PD-L1 da combinação terapêutica da invenção são administrados usando rotas de administração diferentes. De acor- do com algumas modalidades, a composição bacteriana é administra- da por via oral, enquanto o inibidor de PD-L1 da combinação terapêu- tica da invenção é administrado usando uma rota diferente. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 da combinação tera- pêutica é administrado por via intravenosa, enquanto a composição bacteriana é administrada por via oral.

[00125] “De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana é administrada ao indivíduo antes de uma primeira administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo. De acordo com algumas modalida- des, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo antes de uma primeira administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo; em que a composição bacteriana é administrada até que a distribuição e/ou colonização parcial ou total com a cepa da cepa bacteriana na compo- sição seja alcançada. De acordo com algumas modalidades, a compo- sição bacteriana é administrada ao indivíduo antes de uma primeira administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo; em que a composi- ção bacteriana é administrada até que a modulação suficiente de bio- marcadores ocorra, de modo que o inibidor de PD-L1 seja capaz de tratar um paciente com câncer que anteriormente foi não responsivo ao tratamento com ICI. De acordo com algumas modalidades, a com-

posição bacteriana é administrada ao indivíduo por pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas antes da primeira administração do ini- bidor de PD-L1. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por cerca de duas semanas antes da primeira administração do inibidor de PD-L1. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao in- divíduo por pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas antes da primeira administração do inibidor de PD-L1 e não é administrada ao indivíduo em paralelo com a administração do inibidor de PD-L1.

[00126] De acordo com algumas modalidades, a primeira adminis- tração da composição bacteriana na combinação terapêutica da inven- ção é antes da primeira administração do inibidor de PD-L1. De acordo com algumas modalidades, a primeira administração do inibidor de PD-L1 ocorre não mais que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias depois da administração da composição bacteriana.

[00127] De acordo com algumas modalidades do método e da combinação terapêutica da invenção, a composição bacteriana é ad- ministrada ao indivíduo pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo. De acordo com al- gumas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indi- víduo por um primeiro período de tempo, seguido da administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo por um segundo período de tempo; em que a composição bacteriana é opcionalmente administrada adicio- nalmente ao indivíduo por pelo menos parte do referido segundo perí- odo de tempo, opcionalmente tudo através do segundo período de tempo. De acordo com determinadas modalidades, a composição bac- teriana é administrada ao indivíduo por um primeiro período de tempo, tal como, porém, sem limitação, por cerca de duas semanas, seguido da administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo por um segundo período de tempo, tal como, porém, sem limitação, por cerca de três semanas. De acordo com determinadas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por um primeiro período de tempo, tal como, porém, sem limitação, por cerca de duas semanas, seguido da administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo por um segundo período de tempo, tal como, porém, sem limitação, por cerca de três semanas; em que a composição bacteriana é administrada adicionalmente ao indivíduo por pelo menos parte do referido segundo período de tempo, preferencialmente tudo através do segundo período de tempo.

[00128] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana e o inibidor de PD-L1 não são administrados na mesma frequên- cia. Em um exemplo sem limitação, o inibidor de PD-L1 é administrado por via intravenosa a cada três semanas, enquanto a composição bac- teriana é administrada por via oral todos os dias ou em dias alterna- dos. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por um primeiro período de tempo, seguido da administração do inibidor de PD-L1 ao indivíduo por um segundo período de tempo; em que a composição bacteriana é opcionalmente administrada adicionalmente ao indivíduo por pelo menos parte do re- ferido segundo período de tempo; em que a frequência de administra- ção da composição bacteriana é diferente no primeiro período de tem- po e segundo período de tempo.

COMPOSIÇÕES BACTERIANAS DA COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA DA INVENÇÃO

[00129] De modo geral, a composição compreendida na combina- ção terapêutica da invenção compreende bactérias. Em modalidades preferenciais da invenção, a composição bacteriana é formulada na forma liofilizada. Por exemplo, a composição bacteriana da invenção pode compreender grânulos ou cápsulas de gelatina, por exemplo, cápsulas de gelatina dura que compreendem uma cepa bacteriana da invenção.

[00130] De preferência, a composição bacteriana da invenção com- preende bactérias liofilizadas. Liofilização de bactérias é um procedi- mento bem estabelecido e uma orientação relevante está disponível, por exemplo, nas referências [26 a 28].

[00131] —Alternativamente, a composição bacteriana da invenção pode compreender uma cultura bacteriana ativa e viva.

[00132] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composi- ção bacteriana da invenção não foi inativada, por exemplo, não foi termicamente inativada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção não foi eliminada, por exemplo, não foi termicamente eliminada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção não foi atenuada, por exemplo, não foi termicamente atenuada. Por exemplo, em algu- mas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da in- venção não foi eliminada, inativada e/ou atenuada. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção está viva. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção é viável. Por exem- plo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bac- teriana da invenção é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intes- tino. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção é viável e capaz de colonizar par- cial ou totalmente o intestino.

[00133] Em algumas modalidades, a composição bacteriana com- preende uma mistura de cepas bacterianas vivas e cepas bacterianas que foram eliminadas.

[00134] Em modalidades preferenciais, a composição bacteriana da combinação terapêutica da invenção é encapsulada para permitir a distribuição da cepa bacteriana no intestino. A encapsulação protege a composição bacteriana da degradação até a distribuição no local-alvo através, por exemplo, da ruptura com estímulos químicos ou físicos, tais como pressão, atividade enzimática ou desintegração física, que pode ser disparada através de alterações em pH. Qualquer método de encapsulação apropriado pode ser usado. Técnicas de encapsulação exembplificativas incluem prisão dentro de uma matriz porosa, ligação ou adsorção em superfícies de carreador sólido, auto agregação por floculação ou com agentes de reticulação, e contenção mecânica atrás de uma membrana microporosa ou uma microcápsula. Orientação em encapsulação que pode ser útil para preparar composições da inven- ção está disponível, por exemplo, nas referências [29] e [30].

[00135] A composição bacteriana pode ser administrada por via oral e pode estar na forma de um tablete, cápsula ou pó. Produtos encap- sulados são preferenciais, uma vez que Enterococcus gallinarum é anaeróbio. Outros ingredientes (tais como vitamina C, por exemplo), podem ser incluídos como depuradores de oxigênio e substratos pre- bióticos para melhorar a distribuição e/ou colonização parcial ou total e sobrevivência in vivo. Alternativamente, a composição probiótica da invenção pode ser administrada por via oral como um alimento ou pro- duto nutricional, tal como produto lácteo fermentado à base de soro ou leite, ou como um produto farmacêutico.

[00136] A composição bacteriana pode ser formulada como um probiótico.

[00137] Uma composição bacteriana da invenção inclui uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana da invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana é suficiente para exercer um efeito benéfico em um paciente. Uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana pode ser sufi- ciente para resultar na distribuição no e/ou colonização parcial ou total do intestino de um paciente.

[00138] “Uma dose diária adequada das bactérias, por exemplo, pa- ra um ser humano adulto, pode ser de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10" unidades formadoras de colônia (UFC); por exemplo, de cerca de 1x107 a cerca de 1 x 10ºº UFC; em outro exemplo de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10º UFC.

[00139] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana contém a cepa bacteriana em uma quantidade de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10** UFC/g, com relação ao peso da composição; por exemplo, de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10ºº UFC/g. A dose pode ser, por exemplo, de 19g,3g,5ge109g.

[00140] Um probiótico, tal como a composição bacteriana da inven- ção, pode ser, opcionalmente, combinado com pelo menos um com- posto prebiótico adequado. Um composto prebiótico é normalmente um carboidrato não digerível, tal como um oligo ou polissacarídeo, ou um álcool de açúcar, que não é degradado ou absorvido no trato di- gestivo superior. Prebióticos conhecidos incluem produtos comerciais, tais como inulina e transgalacto-oligossacarídeos.

[00141] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana probiótica da presente invenção inclui um composto prebiótico em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 30% em peso, com relação à composição de peso total (por exemplo, de 5 a 20% em peso). Carboi- dratos podem ser selecionados dentre o grupo que consiste em: fruto- oligossacarídeos (ou FOS), fruto-oligossacarídeos de cadeia curta, inulina, isomalte-oligossacarídeos, pectinas, xilo-oligossacarídeos (ou XOS), quitosana-oligossacarídeos (ou COS), beta-glucanos, goma arável modificada e amidos resistentes, polidextrose, D-tagatose, fi- bras acácia, alfarroba, aveia e fibras cítricas. Em um aspecto, os pre- bióticos são os fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (para fins de simplicidade mostrados abaixo no presente documento como FOSs- c.c); os ditos FOSs-c.c. são carboidratos não digeríveis obtidos, de modo geral, através da conversão do açúcar de beterraba e que inclu- em uma molécula de sacarose à qual três moléculas de glicose estão ligadas.

[00142] As composições bacterianas da invenção podem compre- ender excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exem- plos de tais excipientes adequados podem ser encontrados na refe- rência [31]. Veículos ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, na referência [32]. Exemplos de veículos adequados incluem lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e semelhantes. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, gli- cerol e água. A escolha de carreador, excipiente ou diluente farmacêu- tico pode ser selecionada com relação à rota de administração deseja- da e prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas po- dem compreender como, ou além do, carreador, excipiente ou diluente qualquer aglutinante (ou aglutinantes), lubrificante (ou lubrificantes), agente (ou agentes) de suspensão, agente (ou agentes) de revesti- mento, agente (ou agentes) de solubilização adequado. Exemplos de aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, edulcorantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tal como acácia, agradante ou alginato de sódio, carboximetilcelulose e polietilenoglicol. Exemplos de lubrificantes adequados incluem oleato de sódio, estea- rato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Conservantes, estabilizadores, corantes e até mesmo agentes saborizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoa- to de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Antio- xidantes e agentes de suspensão também podem ser usados.

[00143] As composições bacterianas da invenção podem ser formu-

ladas como um produto alimentício. Por exemplo, um produto alimentí- cio pode fornecer benefício nutricional adicionalmente ao efeito tera- pêutico da invenção, tal como em um complemento nutricional. De modo similar, um produto alimentício pode ser formulado para aprimo- rar o gosto da composição da invenção ou para tornar a composição mais atrativa ao consumo ao ser mais similar a um item alimentício comum, em vez de uma composição farmacêutica. Em determinadas modalidades, a composição da invenção é formulada como um produ- to à base de leite. O termo "produto à base de leite" significa qualquer produto à base de leite ou soro líquido ou semissólido que tem um teor de gordura variado. O produto à base de leite pode ser, por exemplo, leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite desnatado, leite inte- gral, leite recombinado a partir de leite em pó e soro sem nenhum pro- cessamento, ou um produto processado, tal como iogurte, leite coagu- lado, coalhada, leite coalhado, leite integral coalhado, leite de mantei- ga e outros produtos de leite coalhado. Outro grupo importante inclui bebidas lácteas, tais como bebidas à base de soro, leites fermentados, leites condensados, leites para bebês ou crianças; leites com sabor, sorvete; alimento que contém leite, tal como doces.

[00144] Em determinadas modalidades, as composições bacteria- nas da invenção contêm uma única cepa bacteriana ou espécie e não contêm qualquer uma das outras cepas bacterianas ou espécies. Tais composições bacterianas podem compreender apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de outras cepas bacterianas ou espécies. Tais composições bacterianas podem ser uma cultura que está substancialmente livre de outra espécie de organismo. Assim, em algumas modalidades, a composição bacteriana da combinação tera- pêutica compreende uma ou mais cepas da espécie Enterococcus gal- linarum, e não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou com- preende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevan-

tes de bactérias de outra espécie.

[00145] Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem mais de uma cepa bacteriana ou espécie. Por exemplo, em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem mais de uma cepa da mesma espécie (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 cepas) e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem menos de 50 cepas da mesma espécie (por exemplo, menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8,7, 6,5, 4 ou 3 cepas) e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem 1 a 40, 1 a 30,1 a 20,1a19,1a18,1a15,1 a 10,/1a9,/1a8,/1a7,1a6,1a5,1a4,1a3,1a2,2a50,2a40, 2a30,2a20,2a15,2a10,2a5,6a30,6a15,16 a 25, ou 31 a 50 cepas da mesma espécie e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem mais de uma espécie do mesmo gênero (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 ou 40 espécies) e, opcionalmente, não con- têm bactérias de nenhum outro gênero. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem menos de 50 es- pécies do mesmo gênero (por exemplo, menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 espécies) e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhum outro gênero. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem 1 a 50, 1 a 40, 1a30,1a20,1a15,1a10,/1a9,/1a8,/1a7,1a6,/1a5,1a4, 1a3,1a2,2a50,2a40,2a30,2a20,2a15,2a10,2a5,6a30, 6 a 15, 16 a 25, ou 31 a 50 espécies do mesmo gênero e, opcional- mente, não contêm bactérias de nenhum outro gênero. A composição bacteriana para uso na combinação da invenção pode compreender qualquer combinação do supracitado.

[00146] Em algumas modalidades, a composição bacteriana com- preende um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas modali- dades, a composição bacteriana compreende a cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é uma Enterococcus gallinarum, co- mo parte de um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, a cepa bacteriana está presente na composição bacteriana em combinação com uma ou mais (por exemplo, pelo menos 2, 3,4,5, 10, 15 ou 20) outras cepas bacterianas de outros gêneros com os quais pode viver simbioticamente in vivo no intestino. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende uma ce- pa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é uma Enterococcus gallinarum, em combinação com uma cepa bacteriana de um gênero diferente. Em algumas modalidades, o consórcio microbiano compre- ende duas ou mais cepas bacterianas obtidas a partir de uma amostra de fezes de um único organismo, por exemplo, um ser humano. Em algumas modalidades, o consórcio microbiano não se encontra junto na natureza. Por exemplo, em algumas modalidades, o consórcio mi- crobiano compreende cepas bacterianas obtidas a partir de amostras de fezes de pelo menos dois organismos diferentes. Em algumas mo- dalidades, os dois organismos diferentes são da mesma espécie, por exemplo, dois seres humanos diferentes, por exemplo, duas crianças diferentes. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são uma criança e um adulto. Em algumas modalidades, os dois orga- nismos diferentes são um ser humano e um mamífero não humano.

[00147] Em algumas modalidades, a composição bacteriana da in- venção compreende ainda uma cepa bacteriana que tem as mesmas características de eficácia de segurança e terapêutica que a cepa MRX518, porém, que não é MRX518 depositada como NCIMB 42488, ou que não é uma Enterococcus gallinarum.

[00148] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na composição bacteriana é obtida a partir de fezes de crianças. Em al- gumas modalidades nas quais a composição bacteriana compreende mais de uma cepa bacteriana, todas as cepas bacterianas são obtidas a partir de fezes de criança ou se outras cepas bacterianas estiverem presentes as mesmas estão presentes apenas em quantidades de mi- nimis. As bactérias podem ter sido cultivadas subsequente a serem obtidas das fezes de criança e serem usadas na composição bacteria- na.

[00149] Conforme mencionado acima, em algumas modalidades, a uma ou mais cepas bacterianas que têm uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é uma Enterococcus gallinarum, é o único agente (ou agentes) terapeu- ticamente ativo na composição bacteriana da invenção. Em algumas modalidades, a cepa (ou cepas) bacteriana na composição bacteriana é o único agente (ou agentes) terapeuticamente ativo na composição.

[00150] As composições bacterianas para uso, de acordo com a invenção, podem ou não exigir aprovação para comercialização.

[00151] Em determinadas modalidades, a invenção fornece a com- posição bacteriana acima, em que a referida cepa bacteriana é liofili- zada. Em determinadas modalidades, a invenção fornece a composi- ção bacteriana acima, em que a referida cepa bacteriana é seca por pulverização. Em determinadas modalidades, a invenção fornece a composição bacteriana acima, em que a cepa bacteriana é liofilizada ou seca por pulverização, e em que a mesma está viva. Em determi- nadas modalidades, a invenção fornece a composição bacteriana aci- ma, em que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulverização, e em que a mesma é viável. Em determinadas modalidades, a invenção fornece a composição bacteriana acima, em que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulverização, e em que a mesma é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Em determinadas modali- dades, a invenção fornece a composição bacteriana acima, em que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulverização, e em que a mesma é viável e capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[00152] Em alguns casos, a cepa bacteriana liofilizada ou seca por pulverização é reconstituída antes da administração. Em alguns casos, a reconstituição é através do uso de um diluente descrito no presente documento.

[00153] As composições bacterianas da invenção podem compre- ender excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00154] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana, conforme usada na invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é câncer de mama. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de mama. Em modalidades preferenciais, o câncer é câncer de mama em estágio |V.

[00155] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana, conforme usada na invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é câncer de pulmão. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de pulmão.

[00156] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana, conforme usada na invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é câncer de fígado. Em modalidades preferenciais, o câncer é hepatoma (carcinoma hepatocelular).

[00157] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamen- te aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade sufici- ente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é câncer de cólon. Em modalidades preferenciais, o câncer é adenocarcinoma colorretal.

[00158] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamen- te aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade sufici- ente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é carci- noma.

[00159] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamen- te aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade sufici- ente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é um câncer não imunogênico.

[00160] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamen- te aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade sufici- ente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é seleci- onado dentre o grupo que consiste em carcinoma pulmonar de célula não pequena, carcinoma pulmonar de célula pequena, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, tumores glandulares, carcinomas não diferenciados de tumores carcinoides.

[00161] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamen- te aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade sufici- ente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é seleci- onado dentre o grupo que consiste em hepatoblastoma, colangiocarci- noma, cistadenocarcinoma colangiocelular ou câncer de fígado que resulta de uma infecção viral.

[00162] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamen- te aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade sufici- ente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é seleci- onado dentre o grupo que consiste em carcinoma ductal invasivo, car- cinoma ductal in situ ou carcinoma lobular invasivo.

[00163] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamen-

te aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade sufici- ente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de PD-L1; e em que o distúrbio é seleci- onado dentre o grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, carcinoma de célula basal, câncer de duto biliar, câncer de bexiga, tumor ósseo, osteossarcomal/histiocitoma fibroso maligno, glioma do tronco encefáli- co, tumor cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, câncer de mama, adenomas bronqui- ais/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, linfoma de célula T cutà- neo, câncer endometrial, ependimoma, câncer do esôfago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor do es- troma gastrointestinal (GIST), tumor de célula germinal, glioma de via visual infantil e hipotalâmico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcino- ma de célula de ilhota, sarcoma Kaposi, câncer de célula renal, câncer laríngeo, leucemias, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma de não Hodgkin, câncer orofaríngeo, osteossarcoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de paratireoide, câncer faríngeo, adenoma de hipófise, neoplasia de célula plasmática, câncer de próstata, carci- noma de célula renal, retinoblastoma, sarcoma, câncer testicular, cân- cer de tireoide ou câncer uterino.

[00164] Em determinadas modalidades, a quantidade da cepa bac- teriana na composição bacteriana é de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10" unidades formadoras de colônia por grama com relação a um pe- so da composição.

[00165] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é administrada a uma dose de 1 g, 3g, 5gou10g.

[00166] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é administrada através de um método selecionado dentre o grupo que consiste em oral, retal, subcutâneo, nasal, bucal e sublingual.

[00167] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende um carreador selecionado dentre o grupo que consiste em lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, ma- nitol e sorbitol.

[00168] Em determinadas modalidades, a invenção fornece a com- posição bacteriana que compreende um diluente selecionado dentre o grupo que consiste em etanol, glicerol e água.

[00169] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende um excipiente selecionado dentre o grupo que consiste em amido, gelatina, glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta- lactose, edulcorante de milho, acácia, adragante, alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio e cloreto de sódio.

[00170] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende ainda pelo menos um dentre um conservante, um antioxi- dante e um estabilizador.

[00171] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende um conservante selecionado dentre o grupo que consiste em benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p- hidroxibenzoico.

[00172] Em determinadas modalidades, quando a composição bac- teriana é armazenada em um recipiente vedado a cerca de 4ºC ou cerca de 25ºC e o recipiente é colocado em uma atmosfera com 50% de umidade relativa, pelo menos 80% da cepa bacteriana, conforme medido em unidades formadoras de colônia, permanece após um pe-

ríodo de pelo menos cerca de: 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos.

[00173] Em algumas modalidades, a composição bacteriana da in- venção é fornecida em um recipiente vedado. Em algumas modalida- des, o recipiente vedado é um sachê ou garrafa. Em algumas modali- dades, a composição bacteriana da invenção é fornecida em uma se- ringa.

[00174] As bactérias; a composição pode, em algumas modalida- des, ser fornecida como uma formulação farmacêutica. Por exemplo, a composição bacteriana pode ser fornecida como um tablete ou cápsu- la. Em algumas modalidades, a cápsula é uma cápsula de gelatina (“gel-cap”).

[00175] Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção são administradas por via oral. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção são formuladas em uma formu- lação farmacêutica adequada para administração oral. Administração oral pode envolver deglutição, de modo que o composto entre no trato gastrointestinal, e/ou administração bucal, lingual ou sublingual através da qual o composto entra na corrente sanguínea diretamente a partir da boca.

[00176] Formulações farmacêuticas adequadas para administração oral incluem tampões sólidos, microparticulados sólidos, semissólido e líquido (que incluem múltiplas fases ou sistemas dispersos) tais como tabletes; cápsulas moles ou duras que contêm multi- ou nano- particulados, líquidos (por exemplo, soluções aquosas), emulsões ou pós; drágeas (que incluem carregadas com líquido); mastigáveis; géis; formas de dosagem de dispersão rápida; filmes; óvulos; pulverizações; e adesivos bucais/mucoadesivos.

[00177] Em algumas modalidades a formulação farmacêutica é uma formulação entérica, isto é, uma formulação gastrorresistente (por exemplo, resistente ao pH gástrico) que é adequada para distribuição da composição da invenção no intestino através de administração oral. Formulações entéricas podem ser particularmente úteis quando as bactérias ou outro componente da composição é sensível ao ácido, por exemplo, propensa à degradação sob condições gástricas.

[00178] Em algumas modalidades, a formulação entérica compre- ende um revestimento entérico. Em algumas modalidades, a formula- ção é uma forma de dosagem revestida entérica. Por exemplo, a for- mulação pode ser um tablete revestido entérico ou uma cápsula reves- tida entérica, ou semelhantes. O revestimento entérico pode ser um revestimento entérico convencional, por exemplo, um revestimento convencional para um tablete, cápsula ou semelhantes para distribui- ção oral. A formulação pode compreender um revestimento de filme, por exemplo, uma camada de filme fino de um polímero entérico, por exemplo, um polímero insolúvel em ácido.

[00179] Em algumas modalidades, a formulação entérica é intrinse- camente entérica, por exemplo, gastrorresistente sem a necessidade de um revestimento entérico. Assim, em algumas modalidades, a for- mulação é uma formulação entérica que não compreende um revesti- mento entérico. Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsu- la produzida a partir de um material termogelificante. Em algumas mo- dalidades, o material termogelificante é um material celulósico, tal co- mo metilcelulose, hidroximetilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em algumas modalidades, a cápsula compreende um invólu- cro que não contém nenhum polímero formador de filme. Em algumas modalidades, a cápsula compreende um invólucro e o invólucro com- preende hidroxipropilmetilcelulose e não compreende nenhum políme- ro formador de filme (por exemplo, consultar [33]). Em algumas moda- lidades, a formulação é uma cápsula intrinsecamente entérica (por exemplo, VcapsO da Capsugel).

[00180] Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsula mo- le. Cápsulas moles são cápsulas que podem, devido às adições de amaciantes, tais como, por exemplo, glicerol, sorbitol, maltitol e polieti- lenoglicóis, presentes no invólucro de cápsula, ter uma determinada elasticidade e maciez. Cápsulas moles podem ser produzidas, por exemplo, com base em gelatina ou amido. Cápsulas moles à base de gelatina estão comercialmente disponíveis a partir de vários fornece- dores. Dependendo do método de administração, tal como, por exem- plo, por via oral ou retal, cápsulas moles podem ter vários formatos, podem ser, por exemplo, redondas, ovais, oblongas ou em formato de torpedo. Cápsulas moles podem ser produzidas através de processos convencionais, tais como, por exemplo, através do processo Scherer, do processo Accogel ou do processo atomização ou insuflagem.

MÉTODOS DE CULTIVO

[00181] As cepas bacterianas para uso na presente invenção po- dem ser cultivadas usando técnicas de microbiologia padrão conforme detalhado, por exemplo, nas referências [34 a 36].

[00182] O meio sólido ou líquido usado para cultura pode ser ágar de YCFA ou meio de YCFA. Meio de YCFA pode incluir (por 100 ml, valores aproximados): Casitona (1,0 g), extrato de levedura (0,25 9), NaHCO; (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO. (0,045 g), KH2PO+ (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SOas (0,09 g), MgSOs + 7H2O (0,009 g), CaCl2 (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 ug), cobala- mina (1 ug), ácido p-aminobenzoico (3 ug), ácido fólico (5 ug) e pirido- xamina (15 ug).

CEPAS BACTERIANAS PARA USO EM COMPOSIÇÕES DE VACINA

[00183] Os inventores identificaram que as cepas bacterianas da composição bacteriana da invenção são úteis para tratar ou prevenir câncer quando administradas em combinação com um inibidor de PD- L1. Isto é provavelmente um resultado do efeito que as cepas bacteri-

anas da invenção têm sobre o sistema imunológico de hospedeiro. Em determinadas modalidades, as cepas bacterianas são viáveis. Em de- terminadas modalidades, as cepas bacterianas são capazes de coloni- zar parcial ou totalmente o intestino. Em determinadas modalidades, as cepas bacterianas são viáveis e capazes de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Em outras determinadas modalidades, as cepas bacterianas podem ser eliminadas, inativadas ou atenuadas. Em de- terminadas modalidades, as composições bacterianas são para admi- nistração via injeção, tal como via injeção subcutânea. INIBIDORES DE PD-L1

[00184] A combinação terapêutica da invenção compreende pelo menos um inibidor de PD-L1. Conforme descrito acima, inibidores de PD-L1 são compostos que inibem checkpoints imunológicos, assim, se permite que o sistema imunológico do corpo ataque as células que são reconhecidas como as próprias células do corpo que incluem células cancerígenas.

[00185] Inibidores de PD-L1 conhecidos incluem, por exemplo, compostos que inibem a interação entre a proteína de morte celular programada de receptor transmembranar 1 (denominada PDCD1, PD-1, PD1 ou CD279) e seu ligante, ligante 1 de PD-1 (denominado PD-L1, PDL1 ou CD274) ligando-se ao e bloqueando-se o PD-L1. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um antagonista que é capaz de reduzir ou inibir transdução de sinal mediada por PD-L1.

[00186] De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo ou fragmento de anticorpo útil como um inibidor de PD-L1 na presente invenção pode ser um anticorpo humano, um anticorpo hu- manizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo não humano ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. De acordo com modali-

dades preferenciais, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma especificidade de ligação alta para PD-L1.

[00187] De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a PD-L1. De acordo com algumas modalidades, o anticorpo que se liga especificamente ao PD-L1 é selecionado dentre o grupo que consiste em: Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe e uma combinação dos mesmos. Atezolizumabe é comercializado pela Genentech sob o nome comercial TECENTRIQS, Avelumabe é comer- cializado pela Pfizer sob o nome comercial BAVENCIOº? e Durvaluma- be é desenvolvido pela Medlmmune e AstraZeneca para tratamento de pacientes com câncer de bexiga urotelial positivo PD-L1.

[00188] O termo “anticorpo” se refere a qualquer forma de anticorpo que exibe a atividade biológica desejada, tal como inibição de ligação de um ligante a seu receptor, ou inibição de sinalização induzida por ligante de um receptor. Assim, “anticorpo” é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente, porém, sem limitação, anticorpos mo- noclonais (que incluem anticorpos monoclonais de comprimento com- pleto), anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exem- plo, anticorpos biespecíficos). De acordo com algumas modalidades, um anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) usado na presente invenção é um anticorpo isolado.

[00189] Os termos “fragmento de anticorpo”, “fragmento de ligação ao antígeno” e “fragmento de ligação anticorpo” usados intercambia- velmente ao longo do pedido significam fragmentos de ligação ao antí- geno que incluem, tipicamente, pelo menos uma porção das regiões variáveis ou de ligação ao antígeno (por exemplo, uma ou mais CDRs) do anticorpo parental. Um fragmento de anticorpo retém pelo menos alguma especificidade de ligação do anticorpo parental. Tipicamente, um fragmento de anticorpo retém pelo menos 10% da atividade de |li-

gação parental quando essa atividade é expressa em uma base molar. De preferência, um fragmento de anticorpo retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais da afinidade de ligação ao anticorpo parental para o alvo. Exemplos de fragmentos de anticor- po incluem, porém, sem limitação, fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; moléculas de anticorpo de cadeia única, por exemplo, sc-Fv.

[00190] O “fragmento de Fab” é compreendido por uma cadeia leve e as regiões variáveis e CH1 de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula de Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.

[00191] Um “fragmento de Fab” contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio Vn e o domínio CH1 e também a região entre os domínios CH1 e CH2, de modo que uma ligação de dissulfeto entre cadeias possa ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos de Fab' para formar uma molécula de F(ab')2.

[00192] Um “fragmento de F(ab')” contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que contêm uma poção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, de modo que uma ligação de dissulfito entre cadeias seja formada entre as duas cadeias pesadas. Um frag- mento de F(ab'), é composto, assim, por dois fragmentos de Fab' que são mantidos juntos por uma ligação de dissulfeto entre as duas ca- deias pesadas.

[00193] A “região de Fvy' compreende as regiões variáveis de am- bas as cadeias pesadas e leves, porém, carece das regiões constan- tes.

[00194] Um “anticorpo Fv de cadeia única” (ou “anticorpo scFvy”) se refere aos fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia polipeptídica única. De modo geral, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios Vx e V. que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação a antígeno.

[00195] Um anticorpo “isolado” é um anticorpo que foi separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Em al- gumas modalidades, o anticorpo será purificado em mais que 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry, e com máxima preferência mais de 99% em peso.

[00196] Um “anticorpo humano” é um anticorpo que tem uma se- quência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo pro- duzido por um ser humano. Esta definição exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação ao antíge- no não humano.

[00197] Um anticorpo “quimérico” se refere aos anticorpos em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo par- ticular, enquanto o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico a ou ho- mólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados uma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de an- ticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[00198] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo de receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma es- pécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e a capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região de su- porte humana Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Ademais, anticorpos humani- zados podem compreender resíduos que não são encontrados no an- ticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar o desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo huma- nizado irá compreender substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancial- mente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as re- giões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

[00199] O termo "região hipervariável", conforme usado no presente documento, se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido a partir de uma “região determi- nante de complementaridade” ou “CDR”.

[00200] O termo “anticorpo monoclonal", como usado neste docu- mento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos indivi- duais que compreendem a população são idênticos exceto pelas mu- tações de ocorrência natural possíveis podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclionais são altamente es- pecíficos, sendo diretamente contra a um sítio antigênico único. Adici- onalmente, em contraste com as preparações de anticorpo (policlonal) convencionais que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclional é dirigido contra um único determinante no antígeno. O termo “mono-

clonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma popu- lação substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser in- terpretado como exigindo a produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelo método hibridoma, ou podem ser produzidos pelos métodos de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados das bibliotecas de anticorpo de fago.

[00201] Os termos "ligação específica" ou "especificamente ligado", conforme usado no presente documento, se referem a uma associa- ção não aleatória entre duas moléculas, isto é, anticorpo e antígeno. De acordo com algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, via seu domínio de ligação ao antíge- no, se liga especificamente ao antígeno com uma afinidade de ligação (Kd) de < 10'ºM. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, via seu domínio de ligação ao antígeno, pode se ligar ao antígeno com uma Kd <10'ºM ou <10' M. Kd, conforme usado no presente documento, se refere à razão da taxa de dissocia- ção para a taxa de associação (Kdesativado/Kativado), € pode ser determi- nada usando quaisquer métodos adequados conhecidos na técnica.

[00202] De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 da combinação terapêutica é administrado sistematicamente. De acor- do com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é formulado para administração sistemática.

[00203] De acordo com outra modalidade, administração sistemati- camente é através de uma rota parenteral. De acordo com algumas modalidades, preparações do inibidor de PD-L1 da invenção para ad- ministração parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas es- téreis, suspensões ou emulsões, em que cada uma representa uma modalidade separada da presente invenção.

[00204] “De acordo com algumas modalidades, a administração pa-

renteral é administração por via intravenosa, intra-arterial, administra- ção em uma parede de vaso sanguíneo, por via intramuscular, intrape- ritoneal, intradérmica, intravítrea, transdérmica ou subcutânea. Cada uma das rotas de administração mencionadas acima representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 da combinação terapêutica é admi- nistrado por via intravenosa.

[00205] “De acordo com algumas modalidades, a administração sis- temática do inibidor de PD-L1 é através de injeção. Para administração através de injeção, o inibidor de PD-L1 pode ser formulado em uma solução aquosa, por exemplo, em um tampão fisiologicamente compa- tível, que inclui, porém, sem limitação, solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de sal fisiológico. Formulações para injeção podem ser apresentadas em formas de dosagem unitárias, por exemplo, em ampolas, ou em recipientes de múltiplas doses com, opcionalmente, um conservante adicionado. Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrana. Opcional- mente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos ingredientes ativos, para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00206] De acordo com algumas modalidades, a administração pa- renteral é realizada através de injeção de bolo. De acordo com outras modalidades, a administração parenteral é realizada através de infu- são contínua. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD- L1 é distribuído em um sistema de liberação controlada e é formulado para infusão intravenosa, bomba osmótica implantável, adesivo trans- dérmico, lipossomas ou outros modos de administração. Em uma mo- dalidade, uma bomba é usada. Ainda em outra modalidade, um siste- ma de liberação controlada pode ser colocado próximo ao alvo tera-

pêutico, assim, se exige apenas uma fração da dose sistemática.

A COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA

[00207] De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre- sente documento a combinação terapêutica da invenção para uso em um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo. De acordo com algumas modalidades, é fornecida no presente documento a combinação terapêutica da invenção para uso em um método para tra- tar câncer em um indivíduo.

[00208] “De acordo com algumas modalidades, o câncer a ser trata- do ou prevenido usando a combinação terapêutica da invenção é sele- cionado dentre o grupo que consiste em: melanoma, carcinoma pul- monar de célula não pequena, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço. De acordo com algumas modalidades, o câncer a ser tratado ou prevenido usando a combinação terapêutica da invenção é selecio- nado dentre o grupo que consiste em: câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de fígado.

[00209] “De acordo com algumas modalidades, tratamento de cân- cer se refere a pelo menos uma dentre a redução de tamanho de tu- mor ou prevenção de crescimento de tumor em um indivíduo. De acordo com algumas modalidades, a combinação terapêutica ou o método da invenção é para uso em pelo menos um dentre a redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor, prevenção de metástase ou prevenção de angiogênese em um indivíduo afetado com câncer.

[00210] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor de PD-L1.

[00211] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana da combinação terapêutica não contém bactérias de nenhuma outra espécie diferente de Enterococcus gallinarum, ou compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bac- térias de outra espécie. De acordo com algumas modalidades, a com- posição bacteriana da combinação terapêutica contém apenas uma única cepa da espécie Enterococcus gallinarum, e não contém bacté- rias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espé- cie. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana da combinação terapêutica compreende a cepa de Enterococcus galli- narum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana da combinação terapêutica compreende uma única cepa da espécie Enterococcus gal- linarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, e não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie.

[00212] De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 está em uma composição que compreende, possivelmente, pelo me- nos um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo. De acordo com algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anti- corpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00213] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, em que a composição compreende uma única cepa da espécie Enterococcus gallinarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, em que, opcionalmente, a composição não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de minimis ou bio- logicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie; e (b) um inibi- dor de PD-L1.

[00214] De preferência, a combinação terapêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreende a cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42488; e (b) um inibidor de PD-L1. De acordo com al- gumas modalidades, é fornecida no presente documento uma combi- nação terapêutica para uso em um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo, em que a combinação terapêutica compreen- de: (a) uma composição que compreende a cepa bacteriana da espé- cie Enterococcus gallinarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42488; e (b) um inibidor de PD-L1.

[00215] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor de PD-L1, em que, opcionalmente, o inibidor é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00216] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, opcio- nalmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, em que, opcionalmente, a composição não contém bactérias de ne- nhuma outra espécie e/ou cepas ou compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espé- cie e/ou cepa; e (b) um inibidor de PD-L1.

[00217] De acordo com algumas modalidades, é fornecido no pre- sente documento um método para tratar e/ou prevenir câncer em um indivíduo usando e qualquer uma das combinações terapêuticas divul- gadas no presente documento. De acordo com algumas modalidades, a presente invenção fornece qualquer uma das combinações terapêu- ticas divulgadas no presente documento para uso no tratamento e/ou prevenção de câncer em um indivíduo.

GERAL

[00218] A prática da presente invenção empregará, a menos que seja indicado de outra forma, métodos convencionais de química, bio- química, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da ha- bilidade da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Consultar, por exemplo, referências [37] e [38 a 44], etc.

[00219] O termo “que compreende” engloba “que inclui” assim como “que consiste” por exemplo, uma composição “que compreende” X po- de consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[00220] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x é op- cional e significa, por exemplo, x+10%.

[00221] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente” por exemplo, uma composição que é “substancialmente livre" de Y po- de ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra “subs- tancialmente” pode ser omitida da definição da invenção.

[00222] Referências a uma porcentagem de identidade de sequên- cia entre duas sequências de nucleotídeos significa que, quando ali- nhadas, esta porcentagem de nucleotídeos é igual em comparação com as duas sequências. Este alinhamento e o percentual de homolo- gia ou identidade de sequência podem ser determinados usando pro- gramas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles des- critos na seção 7.7.18 da referência [45]. Um alinhamento preferencial é determinado pelo algoritmo de busca de homologia de Smith- Waterman que usa busca de intervalo afim com uma penalidade de abertura de intervalo de 12 e uma penalidade de extensão de intervalo de 2, matriz de BLOSUM de 62. O algoritmo de busca de homologia de Smith-Waterman é descrito na referência [46].

[00223] Amenos que seja especificamente afirmado, um processo ou método que compreende diversas etapas pode compreender etapas adi-

cionais no começo ou fim do método, ou pode compreender etapas de intervenção adicionais. Além disto, etapas podem ser combinadas, omi- tidas ou realizadas em uma ordem alternativa, caso apropriado.

[00224] Várias modalidades da invenção são descritas no presente documento. Será reconhecido que os recursos especificados em cada modalidade podem ser combinados com outros recursos especifica- dos, para fornecer modalidades adicionais. Em particular, modalidades destacadas no presente documento como adequadas, típicas ou prefe- renciais podem ser combinadas entre si (exceto quando são mutua- mente exclusivas).

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO EXEMPLO 1 — EFICÁCIA DE INÓCULOS BACTERIANOS EM MO-

DELOS DE CÂNCER EM CAMUNDONGO SUMÁRIO

[00225] Este estudo testou a eficácia de composições que compre- endem cepas bacterianas, de acordo com a invenção, em quatro mo- delos de tumor.

MATERIAIS

[00226] Substância de teste - Cepa bacteriana nº MRX518.

[00227] Substância de Referência - Anticorpo Anti-CTLA-4 (clone: 9H10, catálogo: BE0131, isotipo: Hamster Sírio IgG1, Bioxcell).

[00228] Veículos de substâncias de teste e referência - Meio de cultura bacteriano (Meio de Extrato de Levedura, Casitona, Ácido Gra- xo (YCFA)). Cada dia de injeção em camundongos, o anticorpo foi di- luído com PBS (referência: BE14-516F, Lonza, França).

[00229] Doses de tratamento - Bactérias: 2x10º em 200 ul. O a- CTLA foi injetado a 10 mg/kg/inj. Anti-CTLA-4 foi administrado a um volume de dose de 10 mli/kg/adm (isto é, para um camundongo que pesa 20 g, 200 ul de substância de teste serão administrados) de acordo com o peso de corpo mais recente dos camundongos.

[00230] Rotas de administração - Inóculo bacteriano foi adminis- trado através de gavagem oral (por os, PO) via uma cânula. Cânulas foram descontaminadas todos os dias. Anti-CTLA-4 foi injetado na ca- vidade peritoneal de camundongos (Por via intraperitoneal, IP).

[00231] Condições de cultura de cepa bacteriana - As condições de cultura para a cepa bacteriana foram as seguintes: * Pipeta de 10 ml de YCFA (das garrafas de laboratório E8&O de 10 ml preparadas) em tubos Hungate * Vedar os tubos e nivelar com CO>2 usando um sistema de entrada e escape de seringa * Autoclave dos tubos Hungate * Quando resfriados, inocular os tubos Hungate com 1 ml das reservas de glicerol * Colocar os tubos em uma incubadora estática a 37ºC por cerca de 16 horas.

* No dia seguinte, pegar 1 ml desta subcultura e inocular 10 ml de YCFA (tubos Hungate nivelados pré-aquecidos novamente, tudo duas vezes) * Colocar os mesmos em uma incubadora estática a 37ºC por 5a6h LINHAGEM CELULAR CANCERÍGENA E CONDIÇÕES DE CULTURA -

[00232] As linhagens celulares que foram usadas são detalhadas na Tabela abaixo: ie ee Etna

[00233] A linhagem celular EMT-6 foi estabelecida a partir de um carcinoma mamário de murino transplantável que surgiu em um ca-

mundongo BALB/cCRGL após implante de um nódulo alveolar mamá- rio hiperplástico [47].

[00234] A linhagem celular LL/2 (LLC1) foi estabelecida a partir do pulmão de um camundongo C57BL que carrega um tumor que resulta de um implante de carcinoma pulmonar de Lewis primário [48].

[00235] A linhagem celular Hepa 1-6 é um derivado do hepatoma de camundongo BW7756 que surgiu em um camundongo C57/L [49].

[00236] Condições de cultura celular - Todas as linhagens celula- res foram cultivadas como monocamada a 37ºC em uma atmosfera umidificada (5% de CO», 95% de ar). O meio de cultura e complemen- to são indicados na Tabela abaixo: Linhagem Meio de cultura Complemento celular ENT RPMI 1640 que contém 2 mM dej/10% de soro bovino fetal (refe- L-glutamina (referência: BE 12-702F, Lonza) |rência: nº 3302, Lonza) LU2 RPMI 1640 que contém 2 mM dej/10% de soro bovino fetal (refe- (LLC1) L-glutamina (referência: BE 12-702F, Lonza) |rência: nº 3302, Lonza) 10% de soro bovino fetal (refe- rência: nº 3302, Lonza) Hepa1-6 DMEVM (referência: 11960-044, Gibco) 2 mM de L-glutamina penicilina-estreptomicina (Sig- ma G-6784) 10% de soro bovino fetal, 2 RENCA DMEM mM de L-glutamina, 1 ug/ml de puromicina

[00237] Para uso experimental, células de tumor aderentes foram removidas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (referência: BE17-161E, Lonza), em meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (referência: BE10-543F, Lonza) e neutralizado pela adição de meio de cultura completo. As células foram contadas em um hemocitômetro e sua viabilidade será avaliada por ensaio de exclusão de 0,25% de azul de tripano.

USO DE ANIMAIS -

[00238] “Camundongos Balb/C fêmeas saudáveis (BALB/cByJ), de peso e idade correspondentes, foram obtidos junto à CHARLES RI- VER (L'Arbresles) para os experimentos de modelo EMT6 e RENCA.

[00239] “Camundongos C57BL/6 fêmeas saudáveis (C57BLI6J), de peso e idade correspondentes, foram obtidos junto à CHARLES RI- VER (L'Arbresles) para os experimentos de modelo LL/2(LLC1) e He- pa1-6.

[00240] Animais foram mantidos em situação de saúde SPF de acordo com as orientações da FELASA, e procedimentos experimen- tais e de alojamento de animal de acordo com as Regras Europeias e Francesas e o Guia da NRC para o Uso e Cuidado com Animais de Laboratório foram seguidos [50, 51]. Animais foram mantidos em alo- jamentos sob condições ambientais controladas: Temperatura: 22 + 2ºC, Umidade 55 + 10%, Fotoperíodo (12 h de luz/12 h de escuro), ar filtrado com HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Recin- tos fechados para animal foram dotados de espaço estéril e adequado com roupa de cama, comida e água, enriquecimento ambiental e soci- al (alojamento em grupo) conforme descrito: gaiolas de 900 cm? (refe- rência: green, Tecniplast) em suportes ventilados, roupas de cama Epicea (SAFE), dieta irradiada de 10 kGy (AO4-10, SAFE), Ração completa para roedores imunocompetentes - Extrudado de R/M-H, água de garrafas de água.

PROJETO EXPERIMENTAL E TRATAMENTOS ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO EMT6

[00241] Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 9/8 usando o software Vivo manager (Biosistemaes, Couternon, França). Em DO, os camundongos receberam veículo (meio de cultura)

ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais EMT-6 conforme descrito abaixo. Em D24, camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpo anti-CTLAH.

[00242] O cronograma de tratamento é resumido na Tabela abaixo: e na mem e e ATI, mais de Tratamento Efe esses ES" Fofo fes E fe (MRX518) E ee en e e

[00243] O monitoramento de animais foi realizado conforme des- crito abaixo.

[00244] A indução de tumores EMT6 em animais - Em D14, tumo- res foram induzidos por injeção subcutânea de 1x10º células EMT-6 em 200 ul de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.

[00245] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito abai- xo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da dosagem. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO LL/2 (LLC1)

[00246] Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9/8 usando o software Vivo managerO (Biosistemaes, Couternon, França). Em DO, os camundongos receberão veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais LL/2, conforme descrito abaixo. Em D27, camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpo anti-CTLAH.

[00247] O cronograma de tratamento é resumido na Tabela abaixo: ie frenas praca ur E Tratamento a. ) nº 1 (MRX518) Pd een mes e me

[00248] O monitoramento de animais foi realizado conforme des- crito abaixo.

[00249] A indução de tumores LL/2 (LLC1) em animais - Em D14, tumores foram induzidos por injeção subcutânea de 1x10º células LL/2 (LLC1) em 200 ul de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.

[00250] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito abai- xo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da dosagem. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO HEPA1-6

[00251] Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9 usando o software Vivo managerO (Biosistemaes, Couternon, França). Em DO, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais Hepa 1-6, conforme descrito abaixo. Em D16, camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamen- tos com anticorpo anti-CTLA-4.

[00252] O cronograma de tratamento é resumido na Tabela abaixo:

pe eme fu «oe pe EE de Tratamento Pop ess o E nº 4 (MRX518) Por eee fes fe me

[00253] O monitoramento de animais foi realizado conforme des- crito abaixo.

[00254] A indução ortotópica de células tumorais Hepa 1-6 em ani- mais através de injeção intrasplênica - Em D14, um milhão de (1x10º) células tumorais Hepa 1-6 em 50 ul de meio RPM! 1640 foram trans- plantadas via injeção intrasplênica em camundongos. Brevemente, uma pequena incisão no flanco subcostal esquerdo foi feita e o baço foi exteriorizado. O baço foi exposto em um coxim de gaze estéril, e injetado sob controle visual com a suspensão de célula com uma agu- lha de calibre 27. Após a inoculação de célula, o baço foi excisado.

[00255] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito na se- ção abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da do- sagem.

[00256] Avaliação de fardo tumoral na eutanásia - No momento de morte, os fígados foram coletados e pesados. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO RENCA

[00257] Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 9 camundongos usando o software Vivo managerO (Biosistemaes, Couternon, França) Em DO, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana (2x10º em 200 ul, PO). Em D14,

todos os camundongos foram enxertados com SC injetado com células tumorais RENCA na superfície ventral do flanco inferior conforme des- crito abaixo. Tratamento com anti-CTLA-4 (10 mg/kg, IP) e anti-PDL1 (clone 10F.9G2, 10 mg/kg) foi iniciado quando tumores alcançaram um volume de 50 a 70 mm3.

[00258] O cronograma de tratamento é resumido na Tabela abaixo: pm ué Me me atos, mais de Tratamento e vet e eee lo area o fe e e (MRX518) ope e o Es quatro dias) pro e e e PDL1 10 mg/kg

[00259] O monitoramento de animais foi realizado conforme des- crito abaixo.

[00260] A indução ortotópica de células tumorais RENCA em ani- mais através de injeção SC - Em D14, um milhão (1x10º) de células tumorais RENCA em 50 ul de meio RPMI 1640 foram transplantadas via injeção SC na superfície ventral do flanco inferior de camundongos.

[00261] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito na se- ção abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da do- sagem.

[00262] Avaliação de fardo tumoral na eutanásia - No momento de morte, tumores foram coletados e seu volume avaliado.

MONITORAMENTO DE ANIMAL

[00263] Monitoramento clínico - O comprimento e largura do tumor foram medidos duas vezes por semana com paquímetros e o volume do tumor foi estimado por esta Fórmula [52]: Volume tumoral = largura? x comprimento * comprimento

[00264] Pontos finais humanitários [53]: Sinais de dor, sofrimento ou angústia: postura de dor, careta de dor, comportamento; Tumor que excede 10% do peso corporal normal, porém, não excede 2000 mm?; Tumores que interferem com a ambulação ou nutrição; Tumor ulcera- do ou erosão de tecido; 20% de perda de peso corporal que permane- ce por 3 dias consecutivos; Condição corporal fraca, emaciação, ca- quexia, desidratação; Ausência prolongada de respostas voluntárias aos estímulos externos; Respiração rápida ofegante, anemia, hemor- ragia significativa; Sinais neurológicos: tontura, convulsão, paralisia; Diminuição constante na temperatura corporal; Distensão abdominal.

[00265] Anestesia - Anestesias com gás isoflurano foram usadas para todos os procedimentos: cirurgia ou inoculação tumoral, injeções i.v., coleta de sangue. Anestesias com Ketamina e Xilazina foram usa- das para procedimento cirúrgico estereotaxia.

[00266] —Analgesia - Protocolos de analgesia com carprofeno ou carprofeno/buprenorfina multimodal foram adaptados para a gravidade do procedimento cirúrgico. Cuidado não farmacológico foi fornecido para todos os procedimentos dolorosos. Adicionalmente, o cuidado farmacológico que não interfere nos estudos (tratamento tópico) foi fornecido na recomendação do veterinário presente.

[00267] Eutanásia - Eutanásia de animais foi realizada através de superdosagem de gás para anestesia (Isoflurano) seguido de deslo- camento cervical ou exsanguinação.

RESULTADOS ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO EMT6

[00268] Os resultados são mostrados na Figura 1A. Tratamento com a cepa bacteriana da invenção resultou em uma redução clara em volume tumoral com relação a ambos os controles negativos. O con-

trole positivo também resultou em uma redução em volume tumoral, como seria esperado.

[00269] Para elucidar adicionalmente mecanismos através dos quais MRx0518 transporta seus efeitos terapêuticos em modelos de tumor singênicos, a análise ex vivo foi realizada nos estudos de mode- lo tumoral EMT6 singênico. Embora o volume tumoral seja a principal medição em estudos de oncologia pré-clínicos, tumores consistem, frequentemente, em dividir ativamente células tumorais juntamente com um núcleo necrótico. Para investigar se o tratamento com MRx0518 teve influência sobre o grau de necrose encontrado dentro de tumores EMTG6, seções de parafina da região média do ventre dos tumores foram machadas com Hematoxilina e Eosina. Tratamento com MRx0518 de um modelo de carcinoma de mama EMT6 murino de- monstrou uma tendência em relação ao aumento da área em corte transversal de necrose dentro do tumor (Figura 1B, painel superior). Para investigar se o tratamento com MRx0518 teve influência sobre células divisoras dentro do tumor, as seções de parafina da região média do ventre dos tumores foram manchadas com a proteína de proliferação Ki67, juntamente com a contramancha DAPI, para estimar a porcentagem de células que se dividem dentro do tumor EMT6. Tra- tamento com MRx0518 de um modelo de carcinoma de mama EMT6 murino diminuiu significativamente a porcentagem de células divisoras vistas dentro do tumor (Figura 1B, painel inferior, P = 0,019).

POPULAÇÕES DE CÉLULA IMUNOLÓGICA

[00270] Investigação adicional do microambiente tumoral foi reali- zada através de citometria de fluxo do tumor, para investigar a hipóte- se de que a cepa bacteriana MRx518 tem a habilidade para regular o sistema imunológico na indução de um efeito antitumoral. Tumores excisados dos diferentes grupos de tratamento foram cortados em pe- daços. Um pedaço foi submetido à análise de citometria de fluxo. Para avaliar a porcentagem relativa de linfócitos T, presentes dentro dos tumores, os seguintes marcadores foram usados: CD45, CD3, CDA, CD8, CD25 e FoxP3.

[00271] Os dados de citometria de fluxo mostram que a porcenta- gem relativa de linfócitos em tumores foi levemente diminuída em am- bos os grupos tratados com MRx0518 e anti-CTLA-4, em comparação, respectivamente, com animais de veículo ou controle (Figura 1C). De modo semelhante, a porcentagem relativa de células CD4+ pareceu diminuir nos animais tratados com MRx0518 e anti-CTLAH, enquanto a porcentagem relativa de células CD8+ seguido da tendência oposta em ambos grupos, embora com diferente magnitude. A porcentagem relativa de células CD4+FoxP3+ foi menor no grupo tratado com anti- CTLAH4 em comparação com a leve diminuição nos animais tratados com MRx0518; no entanto, a redução na porcentagem relativa de célu- las CD4+CD25+ foi notável apenas no grupo tratado com anti-CTLA-4. A razão de CD8+/FoxP3+ demonstrou um aumento maior no grupo tratado com anti-CTLA-4 do que nos animais com MRx0518. Estes dados apresentados aqui sustentam a hipótese de que anticorpo anti- CTLA+ alveja células T reguladoras (Tregs) reduzindo-se seus núme- ros celulares ou atenuando-se sua atividade supressiva em tecido tu- moral, enquanto sugere um modo de ação diferente para MRx0518.

PRODUÇÃO DE CITOCINA

[00272] Um pedaço de tumor adicional foi usado para extração de proteína total e subsequente análise de citocina, juntamente com amostras de plasma. Níveis de proteína de IL-10, CXCL1, CXCL2, CXCL10, I1L-18, IL-17A, GM-CSF, TNF-a, IL-12p70 e IFN-y no micro- ambiente tumoral foram analisados por tecnologia MagPix. Embora IL- 17A e GM-CSF estivessem abaixo dos níveis de detecção, todos os outros marcadores foram expressos em níveis razoáveis (Figura 1D). Uma diferença significativa foi observada entre o grupo de veículo e anti-CTLA-4 para IFN-y. A produção dos marcadores imunológicos IL- e I1L-12p70 pareceu reduzida depois de tratamento com MRx518 em comparação com os tratamentos com controle.

[00273] Níveis de citocina também foram avaliados em plasma san- guíneo dos mesmos animais. Níveis de proteína de 11-23, IL-6, I1L-10, VEGF, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-2, IL-18, IL-17A, GM-CSF, TNF-a, IL-12p70 e IFN-y foram analisados por tecnologia MagPix. No geral, pouca produção de citocina foi detectada no plasma sanguíneo de animais seja antes da indução de tumor ou no fim do estudo (Figura 1E). VEGF e CXCL10 foram detectados em níveis substanciais, en- quanto 11-23, IL-6, IL-10, CXCL1 e CXCL?2 foram detectados em níveis baixos. IL-2, IL-1b, IL-17A, GM-CSF, TNF-a, IL-12p70 e IFN-y não fo- ram detectados nas amostras. MRx0518 aumentou significativamente produção de IL-6 no Dia 0. MRx0518 também pareceu aumentar pro- dução de 11-23. VEGF e CXCL10 foram significativamente regulados de modo decrescente no grupo anti-CLTA-4 no Dia 22. De modo simi- lar aos resultados mostrados para as populações de células imunoló- gicas, as diferenças na produção de citocina no tumor e plasma, entre MRx518 e CTLA-4 sugere que cada um deles atue sobre um meca- nismo distinto e potencialmente complementar. LOCALIZAÇÃO DE Células Positivas CD8a NO ÍLEO

[00274] Crio-seções de 10 um de íleo foram cortadas em cryostat (CM 1950 Leica), capturadas em lâminas de lisina de poli-L. As seções foram, então, secadas com ar por 1 hora, fixadas por 10 minutos em metanol gelado, lavadas em PBS, bloqueadas em 10% de BSA em PBS, pH 7,2, antes de serem incubadas de um dia para o outro com o anticorpo primário (anticorpo rato-anticcamundongo-CD8a, Sigma- Aldrich, Millipore).

[00275] Na manhã seguinte as lâminas foram lavadas em PBS e manchadas com um anticorpo secundário: cabra-anti-rato-anticorpo-

Alexa488 (Molecular Probe, Invitrogen) por 1 hora em temperatura ambiente. Após outra etapa de lavagem, as lâminas foram contra manchadas com di-hidrocloreto de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich, Millipore) e montadas em Vectashield (Vector Laboratori- es). As lâminas foram visualizadas e transformadas em imagem usando um microscópio Zeiss Axioscope equipado com uma lâmpada de vapor de mercúrio, filtros apropriados e uma lente objetiva apocromática x20. Exemplos de imagens obtidas a partir das lâminas dos animais de veícu- lo, MRx0518 e anti-CTL4 são mostrados (Figura 1F — painéis superiores: tingimento com DAPI, painéis inferiores: tingimento com CD8a).

[00276] Campos de visão foram examinados a partir de 20 animais e transformados em imagem usando tempo de exposição manual. O número de animais e campos analisados são mostrados na seguinte Tabela: pena fa

[00277] As imagens foram classificadas como a seguir: campos com < 3 células positivas foram pontuados como 0, enquanto campos com =3 células foram pontuados como 1. Os resultados desta análise são mostrados (Figura 1G).

[00278] —Crio-seções de íleo manchadas com anti-CD8a mostraram um número maior de células positivas CD8a localizadas nos tecidos de região de cripta dos animais tratados com MRx0518 e anti-CTLA-4 em comparação com o grupo de veículo.

[00279] Esta observação está alinhada com células T CD8+ que estão presentes no intestino no caso de infecção ou microambiente inflamatório, como parte da resposta imune.

ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO LL/2 (LLC1)

[00280] Os resultados são mostrados na Figura 2. Tratamento com a cepa bacteriana da invenção resultou em uma redução clara em vo- lume tumoral com relação a ambos os controles negativos. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO HEPA1-6

[00281] Os resultados são mostrados na Figura 3A. O controle ne- gativo não tratado não parece conforme seria esperado, uma vez que o peso do fígado estava mais baixo neste grupo do que em outros grupos. No entanto, os grupos de controle negativo e controle positivo de veículo aparecem, ambos, conforme seria esperado, uma vez que camundongos tratados com veículo apenas tiveram fígados maiores do que camundongos tratados com anticorpos anti-CTLAA, o que refle- te um fardo tumoral maior no grupo de controle negativo de veículo. Tratamento com a cepa bacteriana da invenção resultou em uma re- dução clara no peso de fígado (e, portanto, fardo tumoral) em relação aos camundongos no grupo de controle negativo de veículo. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO RENCA

[00282] Os resultados são mostrados na Figura 3B. Tratamento com monoterapia de MRx0518 reduziu volume tumoral com Tes- te/Controle de 51% (dia 18) em comparação com os grupos tratados com veículo. Paclitaxel e anti-CTLA-4 + anti-PDL-1 mostraram uma redução (quase) completa em tamanho de tumor em D18 e D22 em comparação com ambos grupos não tratados e de veículo.

[00283] Estes dados indicam que a cepa MRX518 pode ser útil para tratar ou prevenir câncer e, em particular, para reduzir volume tumoral em cânceres de mama, pulmão, rim e fígado. EXEMPLO 2 — ANÁLISE DE GENE DE PCR

[00284] Uma cultura pura de bactérias MRX518 foi estudada em uma análise de gene de PCR. Haviam dois braços para o experimento: 1) MRX518 foi cocultivado com células do cólon humano (CaCo2) para investigar os efeitos das bactérias sobre o hospedeiro, e 2) MRX518 foi cocultivado em células CaCo2 que foram estimuladas com IL1 para imitar o efeito das bactérias em um ambiente inflamatório. Os efeitos em ambos os cenários foram avaliados através de análise de expres- são de gene. Os resultados são mostrados abaixo: Aumento na pressão CXCL3 28412,73 Ligante de CXCR?2, CXCL2 135,42 Ligante de CXCR2, 90% de homologia com CXCL1. Ligante de CXCR3, primeiramente considerado quimioa- EXCL 34,7 traente de célula Th1 (induzível por IFN-g) 18 31,81 Citocina, quimioatraente (especialmente neutrófilo), diver- ' sos receptores que incluem CXCR1 e CXCR2/ CxeL1 16,48 Ligante de CXCR2, estimula proliferação celular, assim como migração, superexpressão é neuroprotetora em EAE. CD40 14,33 Molécula coestimuladora, rota de ativação DC dependente de célula T. 13,50 Citocina pró-inflamatória principal Wi7e 12,18 Promove resposta antibacteriana a partir do epitélio, sinér- gica com IL-22, CXCL10 10,66 Homologia próxima com CXCLS9, ligante de CXCR3 tam- bém? HSPA1B 10,19 Proteína de choque térmico NFKBIA Sinalização de NFKB; PISK Resposta antibacteriana; sinalização de GPCR. TNFAIP3 Sinalização de TNF DUSP1 Fosfatase anti-inflamatória inativa MAPKs JUNB Fator de transcrição, sinalização de JAK-STAT BIRC3 Junções aderentes, junções de oclusão DUSP2 Anti-inflamatório, inativa MAPK.

1.32 Citocina pró-inflamatória, induzida por IFN-g, 1L-18 DUSP5 Anti-inflamatório, inativa MAPK Fos 3,03 Fatores de transcrição, sinalização de TLR, foz parte de AP-1 GADD45B Crescimento e proliferação celular CLDN4 Junções de oclusão KLF10 Paragem de ciclo celular, sinalização de TGF-b. Peptídeo antimicrobiano IGFBP1 Via de sinalização IFN-lambda, defesa imunológica antiviral,

Aumento na = em agem —

[00285] Estes dados parecem mostrar duas assinaturas de expressão gênica - ligantes de CXCR1/2 (CXCL3, CXCL2, CXCL1, I1L-8), que são associados à migração de célula pró-inflamatória, e ligantes de CXCR3 (CXCL9,CXCL10), que são mais especificamente indicativos de respos- tas tipo IFN-y, também suportados por IL-32, que é induzível por IFN-y. EXEMPLO 3 — TESTE DE ESTABILIDADE

[00286] Uma composição descrita no presente documento que con- tém pelo menos uma cepa bacteriana descrita no presente documento é armazenada em um recipiente vedado a 25ºC ou 4ºC e o recipiente é colocado em uma atmosfera com 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% de umidade relativa. Após 1 mês, 2 meses, 3 me- ses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos, pelo me- nos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da cepa bacteriana deve permane- cer, conforme medido em unidades formadoras de colônia determina- das pelos protocolos padrão. EXEMPLO 4 — PRODUÇÃO DE CITOCINA EM CÉLULAS DENDRÍ- TICAS IMATURAS INDUZIDAS POR MRX518 EM COMPARAÇÃO COM MRX518 + LPS

SUMÁRIO

[00287] Este estudo testou o efeito da cepa bacteriana MRX518 so- zinha e em combinação com lipopolissacarídeo (LPS) sobre a produ- ção de citocina em células dendríticas imaturas.

[00288] “Uma população de monócitos foi isolada das células mono- nucleares de sangue periférico (PBMCs). As células de monócito fo- ram subsequentemente diferenciadas em células dendríticas imaturas.

As células dendríticas imaturas foram colocadas em placa em 200000 células/poço e incubadas com MRX518 em uma concentração final de 107/ml, com a adição opcional de LPS em uma concentração final de 100 ng/ml. O controle negativo envolveu incubar as células com meios de RPMI sozinhos e controles positivos incubaram as células com LPS em uma concentração final de 100 ng/ml. O teor de citocina das célu- las foi, então, analisado.

RESULTADOS

[00289] Os resultados destes experimentos podem ser vistos nas Figuras 4a a d. A adição de MRX518 sozinha resulta em um aumento substancial no nível de citocinas IL-6 e TNF-a em comparação com o controle negativo (Figura 4a e c). A adição de LPS (controle positivo) resulta em um aumento no nível de IL-6 e TNF-a em comparação com o controle negativo, porém, não com IL-18 (Figura 4b). Uma combina- ção de MRX518 e LPS resultou em um aumento sinérgico no nível de IL-1B produzido (Figura 4d).

CONCLUSÃO

[00290] MRX518 tem a habilidade de induzir produção de citocina IL-6 e TNF-a maior em células dendríticas imaturas. A combinação LPS e MRX518 pode aumentar os níveis de citocinas IL-18 em células dendríticas imaturas. Estes dados indicam que MRX518 sozinho ou em combinação com LPS pode aumentar as citocinas inflamatórias IL- 18, IL-6 e TNF-a, que promove inflamação que pode suprimir o câncer. Tratamento com MRX518 sozinho ou em combinação pode induzir ci- tocinas que podem limitar o crescimento de tumor. EXEMPLO 5 - PRODUÇÃO DE CITOCINA EM CÉLULAS THP-1 IN- DUZIDA POR MRX518 EM COMPARAÇÃO COM MRX518 + LPS

SUMÁRIO

[00291] Este estudo testou o efeito de cepa bacteriana MRX518 so- zinha e em combinação com LPS na produção de citocina em células

THP-1, uma linhagem celular modelo para monócitos e macrófagos.

[00292] Células THF-1 foram diferenciadas em meio MO por 48 h com 5 ng/ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA). Estas células foram subsequentemente incubadas com MRX518 em uma concentra- ção final de 10º/ml, com ou sem a adição de LPS em uma concentra- ção final de 100 ng/ml. As bactérias foram, então, lavadas e permitiu- se que as células incubassem sob condições de crescimento normal por 24 h. As células foram, então, centrifugadas e o sobrenadante re- sultante foi analisado para teor de citocina.

RESULTADOS

[00293] Os resultados destes experimentos podem ser vistos nas Figuras 5a a c. A adição de MRX518 sem LPS resulta em um aumento nos níveis de citocina de IL-16, IL-6 e TNF-a em comparação com os controles de sedimento não bacterianos e bacterianos. A adição de LPS e MRX518 resulta em um aumento sinérgico na produção de cito- cinas.

CONCLUSÃO

[00294] “MRX518 tem a habilidade de induzir a produção de citocina em células THP-1, que pode ser sinergicamente aumentada com a adição de LPS. Estes dados indicam que MRX518 sozinho ou em combinação com LPS pode aumentar as citocinas inflamatórias IL-16, IL-6 e TNF-a, que promove inflamação que pode suprimir o câncer. Tratamento com MRX518 sozinho ou em combinação pode induzir ci- tocinas que podem limitar o crescimento de tumor. EXEMPLO 6 — ATIVIDADE ANTITUMORAL DE UMA COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA DE MRX518 E O INIBIDOR DE PD-1 RMP1-14 OU UM INIBIDOR DE CTLA4

SUMÁRIO

[00295] Este estudo comparou a atividade antitumoral de MRX518, um inibidor de PD-1 (RMP1-14), um inibidor de CTLA-4 e combinações terapêuticas de MRX518 com o inibidor de PD-1 ou o inibidor de CTLAH4 em camundongos que carregam células tumorais EMT-6.

MATERIAIS

[00296] Substâncias de teste e referência - Cepa bacteriana nº MRX518; Anticorpo anti-PD-1 (clone: RMP1-14, catálogo: BEO146, iso- tipo: Rato IgG2a, Bioxcell); Anticorpo anti-CTLA4 (referência: BEO0131, Bioxcell; clone: 9H10; reatividade: camundongo; isotipo: Hamster IgG1; condições de armazenamento: +4ºC).

[00297] Veículos de substâncias de teste e referência — As bac- térias MRX518 foram cultivadas em um meio de cultura bacteriano (Extrato de levedura, Casitona, Meio de Ácido Graxo (YCFA)) e manti- das como uma reserva de glicerol a -80ºC. Os animais foram dosados com as bactérias de acordo com o protocolo de estudo. Os anticorpos anti-PD1 e anti-CTLA foram diluídos com PBS (referência: BE14- 516F, Lonza, França) em cada dia de injeção em camundongos.

[00298] Doses de tratamento - Bactérias: 2x10º em 200 ul. Os an- ticorpos anti-PD1-1 e anti-CTLA4 foram administrados em 10 mg/kg de peso corporal de acordo com o peso corporal mais recente dos ca- mundongos.

[00299] Rotas de administração — A composição bacteriana foi administrada através de gavagem oral (por os, PO) via um tubo de ga- vagem em um volume de 200 ul/inj. Os anticorpos anti-PD-1 e anti- CTLA+A foram injetados na cavidade peritoneal de camundongos (por via intraperitoneal, IP) em um volume de 10 ml/kg ajustada ao peso corporal individual mais recente de camundongos.

[00300] Linhagem celular cancerígena e condições de cultura - A linhagem celular que foi usada neste estudo é a linhagem celular EMT-6 que foi obtida a partir da ATCC (American Type Culture Collec- tion, Manassas, Virginia, E.U.A.). A linhagem celular EMT-6 foi estabe- lecida a partir de um carcinoma mamário de murino transplantável que surgiu em um camundongo BALB/cCRGL após implante de um nódulo alveolar mamário hiperplástico.

[00301] Células tumorais foram cultivadas como monocamada a 37ºC em uma atmosfera umidificada (5% de CO2, 95% de ar). O meio de cultura foi RPMI 1640 que contém 2 mM de L-glutamina (referência: BE12-702F, Lonza, Verviers, Bélgica) complementado com 10% de soro bovino fetal (referência: 3302, Lonza). Células tumorais EMT-6 são aderentes em frascos plásticos. Para uso experimental, células de tumor foram removidas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (referência: BEO02-007E, Lonza), em meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (referência: BE10-543F, Lon- za) e neutralizadas pela adição de meio de cultura completo. As célu- las foram contadas e sua viabilidade foi avaliada por ensaio de exclu- são de 0,25% de azul de tripano.

[00302] Uso de animais - Centro e trinta (130) camundongos Balb/C fêmeas saudáveis (BALB/cByJ), de 5 a 7 semanas de idade, foram obtidos junto à CHARLES RIVER (L'Arbresles) e mantidos em situação de saúde SPF de acordo com as orientações da FELASA. Alojamento de animal e procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as regras europeias e francesas e o guia NRC para o cuidado e uso de animais de laboratório. Animais foram mantidos de 3 a 4 por gaiola em alojamentos sob condições ambientais controladas: Temperatura: 22 + 2ºC, Umidade 55 + 10%, Fotoperíodo (12 h de luz/12 h de escuro), ar filtrado com HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Recintos fechados para animal foram dotados de espaço estéril e adequado com roupa de cama, comida e água, enri- quecimento ambiental e social (alojamento em grupo) conforme des- crito: Gaiolas do tipo Ill ou IV Eurostandard de policarbonato de filtro superior, roupa de cama de espiga de milho (referência: LAB COB 12, SERLAB, França), dieta irradiada de 25 kGy (Ssniffê Soest, Alema-

nha), Comida completa para roedores imunocompetentes - R/M-H Ex- trudada, Estéril, filtrada em 0,2 um de água e enriquecimento ambien- tal (SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, França). Animais são individu- almente identificados com transponder RFID e cada gaiola foi identifi- cada com um código específico. Tratamento dos animais começou após uma semana de aclimação para os lotes 2 e 3, ou após três se- manas de aclimação para o lote 1.

PROJETO EXPERIMENTAL E TRATAMENTOS

[00303] No dia-14(D-14), 130 camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em 3 grupos de 30 animais e 4 grupos de 10 animais usando o software Vivo Ma- nager€ (Biosistemaes, Couternon, França). Os camundongos foram separados em 3 lotes de 10 animais por grupo de tratamento (lote 1: animais de grupos 1, 2 e 3; lote 2: 10 animais de grupos 1,2e3e lote 3: 10 animais de grupos 1 a 7) com pontos de terminação diferen- tes desde o começo do estudo: D-14 ou DO.

[00304] Na terminação, o lote 3 foi dividido em 2 coortes, devido à terminação e cronogramas de análises de FACS; estas foram escalo- nadas durante 1 dia: D24/D25 Portanto, todo coorte de animais teve 5 animais por grupo de tratamento (4 animais da gaiola um e um animal da gaiola 2). Com base nos critérios éticos, se o volume tumoral for maior que 1500 mm?, a seleção dos animais a serem sacrificados em D24 e D25 é com base em volume tumoral em vez da gaiola. O projeto experimental é representado na Figura 7A e resumido abaixo:

[00305] 1)Lote1 (grupos 1,2e3) começou tratamento em DO e foi abatido em D14 (10 animais formam os grupos 1 a 3). Estes não rece- beram células tumorais e constituíram o grupo de linha de base.

[00306] 2)Lote2 (grupo 1,2 e3) começou tratamento em D-14 e foi abatido em D7 (10 animais formam os grupos 1 a 3).

[00307] 3)Lote3 (grupos 1 a7) começou tratamento em D-14 e foi abatido em D24/25 (10 animais formam os grupos 1 a 7). O tratamento de anti-PD-1 e Anti-CTLA-4 começou em D10.

[00308] No dia O (DO) todos os camundongos de lotes 2 e 3 (termi- nação no dia 7 e 24/25, respectivamente) foram enxertados com célu- las tumorais EMT-6 através de uma injeção subcutânea de 1x106 célu- las EMT-6 em 200 ul de RPMI 1640 no flanco direito (os 30 camun- dongos do lote 1, que foram sacrificados em D14, não receberam a injeção de tumor). Os camundongos foram tratados de acordo com os seguintes grupos de cronograma de tratamento (TWx2 = duas vezes por semana): n E de Tratamento Cronograma de Tra- Animais tamento 30 = 1 10lote 1 Não tratado (+ Tu- 10/ote2 mor) 10 lote 3 30 = Diariamente -14 a DO 10 lote 1 , 1a 2 Veículo (YCFA) Diariamente -14 a D7 10 lote 2 io 10 lote 3 Diariamente -14 a oie D24/25 30 = ; 1 10 lote 1 MRX518 (cultivado a Diariamente -14 a DO 3 10 lote 2 partir de reserva de |2x10º Diariamente -14 a D7 1010te 3 glicerol) em YCFA Diariamente -14 a oie D24/25 . TWx2 de D10 4 10loteg | ANEPDA 10mglkg |IP+PO |YCFA Diariamente - + YCFA 14 a D24/25 10 mg/kg + TWx2 de D10 10/ote 3 Anti-PD-1 + MRX518 [2x10º bac-|IP+PO |Bactérias Diariamen- térias te -14 a D24/25 Anti-CTLA-4 TWx2 de D1O 6 10 lote 3 10mg/kg |IP+PO |YCFA Diariamente - +YCFA 14 a D24/25 + 7 1010te 3 [ANtECTIAA ? 200 Aa IP+PO Baco is or i MRX518 x! ac- actérias lariamen- térias te -14 a D24/25

[00309] As seguintes amostras são coletadas ao longo do experi- mento:

[00310] 1.Fezes (apenas para o lote 3) — Em três pontos no tempo durante o estudo (D-15, D-1 e D22) amostras fecais foram coletadas de oito camundongos idênticos por grupo (o equivalente a 80 a 100 mg ou 6 a 7 pelotas por camundongo, porém, pelo menos 3 pelotas fe- cais), congeladas rapidamente e armazenadas a -80ºC.

[00311] 2. Sangue - No momento da terminação dos camundongos (D14 para o lote 1, D7 para o lote 2 e D25 para o lote 3), aproximada- mente 1 ml de sangue intracardíaco foi coletado de cada animal em um tubo de EDTA em procedimentos terminais sob gás profundo de anestesia. O sangue foi centrifugado para obter plasma, e o plasma armazenado a -80ºC.

[00312] 3. Tumor e baço - O tumor (em D e D24/D25) e os baços (em D7, D14 e D24/D25) de todos os camundongos foram coletados. As células de infiltrado imunológico tumoral nas amostras de tumor foram quantificadas por análise de FACS conforme descrito abaixo.

[00313] 4. Gânglios linfáticos mesentéricos — Em D7, D14 e D24/D25 gânglios linfáticos mesentéricos de todos os animais por grupos e por ponto no tempo foram coletados e congelados rapidamente a -80ºC.

[00314] 5. Intestho - No momento de eutanásia (D7, DI4 e D24/D25), diversas seções dos intestinos de todos os camundongos por grupo e por temporização foram coletadas e dissecadas. O teor cecal foi colhido também.

ANÁLISE DE FACS

[00315] Para análise de células tumorais, tumores de todos os ca- mundongos por grupos e por temporização foram coletados no mo- mento de terminação (em D7 e D24/25). Todos os tumores foram cole- tados em meio de cultura HBSS. As células de infiltrado imunológico tumoral foram quantificadas por análise de FACS de cada amostra co-

letada.

Brevemente, as amostras coletadas foram processadas por dissociação mecânica e preparadas em 100 ul de tampão de tingimen-

to (PBS, 0,2% de BSA, 0,02% de NaN;3). Então, os anticorpos direcio-

nados contra os marcadores escolhidos foram adicionados, de acordo com o procedimento descrito pelo fornecedor para cada anticorpo.

To-

dos os anticorpos exceto FoxP3 foram para marcação de superfície e

FoxP3 para marcação intracelular.

Os anticorpos usados para análise de FACS são listados nas Tabelas abaixo:

PAINEL 1: PAINEL DE VIABILIDADE DE CÉLULAS T, CD45, CD3,

CDA4, CD8, CD25, FOXP3, PD1, B220

Especificidade e fluorocromo |Isótipo e especificidade

562600 BV421 1961

130-110-665 | CD45 REA737 |Miltenyi Biotec

130-104-624 | REA CTL qmeesen =| REA293 |Miltenyi Biotec universal

130-104-615 e Control ee 1 REAMISS Miltenyi Biotec Fixable Via-

564997 bility — Stain eg AF700 BD biosciences 700

130-109-250 APC-Vio770 Miltenyi Biotec

130-104-634 APC-Vio770 - Ra | Miltenyi Biotec

130-111-800 Con REA802 |Miltenyi Biotec

130-104-828 sa e [| A universal

130-110-845 CDASR FITC camundongo |[REA755 Miltenyi Biotec (B220)

130-104-626 | REA CT Fo E REA293 |Miltenyi Biotec universal

PAINEL 2 MACRÓFAGOS ASSOCIADOS AO TUMOR (TAM): VIA- BILIDADE, CD45, CD3, CD11b, Ly6C, F4/80, CD68, CD80, CD206,

[00316] A mistura foi incubada por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente no escuro, lavada e ressuspensa em 200 ul de tampão de tingimento. Todas as amostras foram armazenadas em gelo e protegi- das da luz até análise de FACS. Amostras de tumor também foram processadas com anticorpos de isótipo de controle. As células man-

chadas foram analisadas com um citômetro de fluxo de espaço CyFlowº (LSR Il, BD Biosciences) equipado com 3 lasers de excitação em comprimentos de onda de 405, 488 e 633 nm.

[00317] Para análise de amostras de intestino, o intestino delgado e o cólon de todos os camundongos por grupos e por temporização fo- ram coletados no momento de terminação (em D7, D14 e D24/25). Todos os tecidos frescos foram coletados em meio de cultura HBSS. As células imunológicas na lâmina própria foram quantificadas por análise de FACS de cada amostra coletada. As amostras foram pro- cessadas como as amostras tumorais. Os anticorpos usados para aná- lise de FACS são aqueles do painel 1 listados acima e aqueles listados na Tabela abaixo (incubação subsequente de amostras e análise ocor- reram conforme descrito acima): PAINEL 3: DCS intestinais: VIABILIDADE, CD45, CD3, CD11b, CD11c, MHC Il, CD103 Referên- iii 4h fin Especificidade e fluorocromo Isótipo e especificidade 130-109- PerCP- camundongo- Miltenyi 130-104- PerCP Miltenyi REA Contar O Vioroo poe e | 130-116- , REA/hlg |Miltenyi

PEVOTTO 130-104- : ; REA/hlg |Miltenyi 632 REA CTL universal PE-Vio770 po G1 Biotec AlexaFluor BD biosci som em. sá AlexaFluor BD biosci- seo so te o > 130-102- , Miltenyi som 130-102- ; Miltenyi som Meses | som Fixable Viability Stain BD biosci seo STS ca pve po Es

Referên- PO 4h io, cia Especificidade e fluorocromo Isótipo e especificidade Fornecedor 130-108- Miltenyi 130-104- : REA/hlg |Miltenyi [5679 [nenemamena fare LO melo | 130-112- , REA/hlg |Miltenyi 130-104- , , REA/hlg | Miltenyi GEO freneramena laememol Te ne | 130-102- Miltenyi 130-104- , Miltenyi Ga O irenenamena dero ness IR

[00318] Para análise de amostras do baço, o baço de todos os ca- mundongos por grupos e por temporização foram coletados no mo- mento de terminação (em D7, D14 e D24/25). Todos os baços foram coletados em meio de cultura de RPMI completo (10% de dFBS, 1% de Penicilina/estreptomicina, 2 MM de L-glutamina e 55 uM de 2- mer- captoetanol). As células de infiltrado imunológico tumoral foram quanti- ficadas por análise de FACS de cada amostra coletada após estímulo por 72 h com CD3 e CD28. Procedimento: Esplenócitos foram cultiva- dos com um dentre dois estímulos (CD3/CD28, MRx0518 eliminado por calor) e um controle negativo. Havia uma razão de 1:1 entre o MRx0518 eliminado por calor e os esplenócitos por poço. Havia 1x106 células bacterianas fornecidas em 20 ul da amostra de MRx0518 eli- minado por calor. Os anticorpos direcionados contra os marcadores de painel 1 acima foram adicionados às pelotas de célula de cada trata- mento, de acordo com o procedimento descrito pelo fornecedor para cada anticorpo. Incubação subsequente de amostras e análise foram realizadas conforme descrito acima.

MONITORAMENTO DE ANIMAL

[00319] A viabilidade e o comportamento dos animais foram grava-

dos todos os dias. Pesos corporais foram medidos duas vezes por semana. O comprimento e a largura do tumor foram medidos duas ve- zes por semana com paquímetros e o volume do tumor foi estimado pela seguinte Fórmula: Volume tumoral = Largura? x emprimento

[00320] A eficácia de tratamento foi avaliada em termos dos efeitos da substância de teste sobre os volumes tumorais de animais tratados em relação aos animais de controle. Os seguintes critérios de avalia- ção de eficácia antitumoral foram determinados usando o software Vi- vo ManagerO (Biosistemaes, Couternon, França):

[00321] 1. Volumes tumorais individuais e/ou médios (ou media- nos). Volumes tumorais médios de grupos 1 a 7 são representados na Figura 7B.

[00322] 2. Tempo de dobra de tumor (DT).

[00323] 3. Inibição de crescimento tumoral (T/C%) definida como a razão dos volumes tumorais medianos de grupo tratado em relação ao controle, calculada como a seguir (Dx = Dia de medição): T/CX% 2 Volume tumara! mediono de grupo tretado em D, x100 Yolume tumoral mediano de grupo tratado com veículo em D,

[00324] O valor ideal é a razão de T/C% mínima que reflete a inibi- ção de crescimento de tumor máxima alcançada. Os critérios eficazes para a razão de T/C%, de acordo com os padrões NCI, é < 42%.

[00325] 4. Curvas de volume tumoral relativo (RTV) de grupos de teste e controle, em que o RTV é calculado como a seguir (Dx = Dia de medição; Dr= Dia de aleatorização): RTV = TV em Dx TV em Dz

[00326] 5. Volume V e tempo para alcançar V são calculados. Vo- lume V é definido como um volume-alvo deduzido dos dados experi-

mentais e escolhido em fase exponencial de crescimento de tumor. Para cada tumor, o volume tumoral mais próximo ao volume-alvo V é selecionado nas medições de volume tumoral. O valor deste volume V e o tempo para o tumor alcançar este volume são gravados. Para cada grupo, a média dos volumes tumorais V e a média dos tempos para alcançar este volume são calculadas. EXEMPLO 7 — AVALIAÇÃO DE PROLIFERAÇÃO DE CD8

[00327] Para investigar os efeitos imunoestimuladores de MRX518 e inibidores de PD-L1, uma avaliação in vitro do impacto sobre prolife- ração de célula CD8+ de MRX518 e um inibidor de checkpoint anti-PD- 1 Miltenyi Biotech CD279, em combinação, foi conduzida.

[00328] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs, crio- preservadas da Stemcell Technologies, número de catálogo: 70025) foram removidas do nitrogênio líquido e deixadas para descansar de um dia para o outro em um frasco. Uma placa de 96 poços foi revesti- da com anticorpo CD3 (ThermoFisher Anticorpo Monoclonal CD3 (OKT3), 0,3 ug/ml) como uma metade de uma combinação mitogênica. Depois do período de descanso, as PBMCs foram contadas e man- chadas com marcador de célula fluorescente (Kit de Proliferação de Glóbulos Vermelhos Remoto CellTraceT“Y).

[00329] “Dez conjuntos de células foram preparados desta maneira. Para nove destes conjuntos, o anticorpo anti-PD-1 foi adicionado (da Miltenyi Biotech CD279 (PD1) grau funcional puro, 10 pg/ml). Nenhum anticorpo anti-PD-1 foi adicionado ao conjunto adicional, que serviu como um conjunto de controle (denominado Conjunto de Célula 1 na Tabela abaixo). Todos os conjuntos de célula foram, então, incubados por 1,5 horas.

[00330] Depois do período de incubação, componentes de teste bacteriano foram adicionados aos Conjuntos de Célula 3 a 10, confor- me mostrado nas Tabela a seguir:

Conjunto Acrônimo conforme Componente Bacteriano de Célula apresentado na Figura 6 Nenhum, controle livre de anti-PD-1 CD3/CD28 Nenhum, controle anti-PD-1 anti-PD1 10 pg/ml (MY) 3 MRXS518 Eliminado por Calor em uma razão de 1:1* |[HKMRx0518 WT 1:1 MRX518 Eliminado por Calor em uma razão de 4 HK MRx0518 WT 10:1 10:1* MRX518 Eliminado por Calor com knockout de fla- HK MRx0518 KO 1:1 gelina** em uma razão de 1:1* MRX518 Eliminado por Calor com knockout de fla- HK MRx0518 KO 10:1 gelina** em uma razão de 10:1* 7 Sobrenadante de MRX518 em uma razão de 1:1*** | HK MRx0518 WT SN 1:1 EN Sobrenadante de MRX518 em uma razão de 10:1*** [HK MRx0518 WT SN 10:1 sobrenadante de knockout de flagelina MRX518** 9 HK MRx0518 KO SN 1:1 em uma razão de 1:1** sobrenadante de knockout de flagelina MRX518** HK MRx0518 KO SN 10:1 em uma razão de 10:1** * Razão de células MRX518: células PBMC ** Um mutante de MRX518 modificado para ter uma montagem flage- lar rompida foi testado. Os inventores entenderam que a flagelina con- tribui para o efeito imunoestimulador de MRX518. *** Para a Multiplicidade de Infecção (MOI) de 1:1, o sobrenadante foi obtido a partir do mesmo número de bactérias que o número de PBMOCs tratadas com o sobrenadante. Para a MOI de 10:1, o sobrena- dante foi obtido a partir de uma cultura bacteriana altamente concen- trada, porém, o número preciso de bactérias com relação às PBMCs não foi medido.

[00331] Depois da adição dos componentes de teste bacteriano, um anticorpo CD28 (Thermofisher Anticorpo Monoclonal CD28 (CD28,2), 1 pg/ml) foi adicionado em cada um dos conjuntos de célula como a outra metade da combinação mitogênica, para disparar proliferação.

PDL-1 (Sistemas R&D, Quimera de Fc PD-L1/B7-H1 Humana Recom- binante, 10 ug/ml) foi, então, adicionada em cada conjunto de célula.

[00332] Os conjuntos de célula foram, então, incubados por 5 dias (37ºC, 5% de CO>2). Depois da incubação, as células foram colhidas e analisadas por FACS de acordo com a fluorescência celular transmiti- da pelo marcador de célula, que fornece uma indicação do número de divisões celulares que ocorreram no período de incubação. Os resul- tados que mostram as porcentagens de células agrupadas no número de divisões (desde nenhuma divisão celular (NCD) até 4 divisões celu- lares (4RCD)) são mostrados na Figura 6.

SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1 (Enterococcus gallinarum gene de 165 rRNA - AFO39900) 1 taatacatgc aagtegaacg ctttttettt caccggaget tgctecaceg aaagaaaaag 61 agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taacacttgg 121 aaacaggtgc taatacegta taacactatt ttcegcatgg aagaaagttg aaaggegett 181 ttgegtcact gatggatgga ccegeggtge attagctagt tggtgaggta acggctcace 241 aaggccacga tgcatagceg acctgagagg gtgateggee acactgggac tgagacacgg 301 cccagactec tacgggagge agcagtaggg aatcttegge aatggacgaa agtctgaceg 361 agcaacgcecg cgtgagtgaa gaaggtttte ggategtaaa actetgttgt tagagaagaa 421 caaggatgag agtagaacgt tcatcecttg acggtateta accagaaage cacggctaac 481 tacgtgccag cagcegeggt aatacgtagg tggcaagegt tgtcoggatt tattgggegt 541 aaagegageg caggeggttt cttaagtetg atgtgaaage ceceggetea aceggggagg 601 gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattecca tgtgtagegg 661 tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtaggcgaagg cggcteteta gretgtaact 721 gacgctgagg ctcgaaageg tggggagega acaggattag ataccectggt agtecacgec 7181 gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt tteegecett cagtgctgca gcaaacgcat 841 taagcactce gcetggggag tacgacegca aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggge 901 ccgeacaage ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gegaagaace ttaccaggte 961 ttgacatcct ttgaccacte tagagataga gettecectt cgggggeaaa gtgacaggto 1021 gtgcatggtt gtegteaget cgtgtegtga gatgttgggt taagtccege aacgagegea 1081 accettattg ttagttgcca teatttagtt gggcacteta gegagactge cggtgacaaa 1141 cceggaggaag gtggggatga cgtcaaatea tcatgeceet tatgacctag getacacacg 1201 tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgegagg ctaagctaat ctettaaage 1261 tteteteagt teggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagceggaat cgctagtaat 1321 cgeggatcag cacgecegegg tgaatacgtt ccegggectt gracacaceg cecgteacac 1381 cacgagagtt tgtaacaccc gaagteggtg aggtaacctt tttggagcca gcegectaag 1441 gtgggataga tgattggggt gaagtegtaa caaggtagece gtateggaag gtgcggetag 1501 atcace SEQ ID NO: 2 (sequência de 16S rRNA de consenso para a cepa de Enterococcus gallinarum MRX518)

TGCTATACATGCAGTCGAACGCTTTTTCTTTCACCGGAGCTTGCTCCACCGAAAGAAAAAGAGTGGCGAACGGGTGE AGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACACTATTT TCCGCATGGAAGAAAGTTGAAAGGCGCTTTTGCGTCACTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGÇG GTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGA AGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAGAACGTTCATCCCTTGACGGT ATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTT ATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTG GAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGG AACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGETCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCAARA CGCATTAAGCACTCCGCCTGGEGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGAT AGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACÇAA ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAG TACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTC GCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGEGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTG REFERÊNCIAS

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Combinação terapêutica para uso em um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que a referida combinação terapêutica compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor de PD-L1.

2. Combinação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição não contém bactérias de qualquer outra espécie, ou compreende apenas quanti- dades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie.

3. Combinação terapêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a combinação terapêutica é pa- ra uso em um método para tratar ou prevenir câncer de pulmão, cân- cer de mama, câncer de rim, câncer de fígado, linfoma, hepatoma, câncer neuroendócrino ou câncer de cólon.

4. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a combinação terapêutica é para uso em um método para reduzir tamanho de tumor, reduzir crescimento de tumor, prevenir metástase ou prevenir angio- gênese.

5. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a cepa bacte- riana tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2.

6. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a composição é para administração oral e/ou em que o inibidor de PD-L1 é para ad- ministração intravenosa.

7. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

8. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a cepa bacte- riana é liofilizada.

9. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a cepa bacte- riana é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

10. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma única cepa de Enterococcus gallinarum.

11. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição compreende a cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum como par- te de um consórcio microbiano.

12. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a composi- ção compreende a cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488.

13. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a composi- ção está compreendida em um produto alimentício ou em uma compo- sição de vacina.

14. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é selecionado dentre o grupo que consiste em: Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe, BMS-936559, LY3300054, CK-301, 3D-2- 02-0015, SHR-1316, FAZO53 e uma combinação dos mesmos.

15. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é administrada ao indivíduo antes da primeira administração de inibidor de PD-L1 ao indivíduo.

16. Combinação terapêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a composição é administrada ao indivíduo durante pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas an- tes da primeira administração do inibidor de PD-L1.

17. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é administrada ao indivíduo antes da primeira administração do inibidor de PD-L1 e/ou pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor de PD-L1 ao referido indivíduo.

18. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana da espécie Enterococcus gallinarum e o inibidor de PD-L1 es- tão em composições separadas.

19. Combinação terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o indivíduo foi não responsivo a um tratamento anterior que usa um inibidor de PD-L1 sozinho.

20. Primeira composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum para uso em combinação com uma segunda composição que compre- ende um inibidor de PD-L1 para uso em um método para tratar ou pre- venir câncer, em que, opcionalmente, a referida primeira composição é administrada antes da primeira administração da referida segunda composição e/ou em paralelo com a administração da segunda com- posição.

21. Primeira composição, caracterizada pelo fato de que compreende um inibidor de PD-L1 para uso em combinação com uma segunda composição que compreende uma cepa bacteriana da espé- cie Enterococcus gallinarum para uso em um método para tratar ou prevenir câncer, em que, opcionalmente, a referida primeira composi- ção é administrada em paralelo com a administração da segunda composição.

22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de um inibidor de PD-L1, para uso em um método para tratar ou pre- venir câncer em um indivíduo que recebeu anteriormente administra- ção de uma composição que compreende uma cepa bacteriana da es- pécie Enterococcus gallinarum, preferencialmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488.

23. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, prefe- rencialmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, para uso em um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo diagnosticado com necessidade de tratamento com um inibi- dor de PD-L1.

24. Método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo que necessita do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar ao indivíduo uma composição que compre- ende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) administrar ao indivíduo um inibidor de PD-L1.

25. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) uma composição que compreende um inibidor de PD- L1.