KR20170005499A - 예방 또는 치료 용도를 위한 리포솜성 구형 핵산에 의한 면역 조절인자의 다가 전달 - Google Patents

예방 또는 치료 용도를 위한 리포솜성 구형 핵산에 의한 면역 조절인자의 다가 전달 Download PDF

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Abstract

다가의 면역 조절인자로서 기능하는 리포솜성 구형 핵산이 본 발명에 따라 제공된다. 본 발명의 리포솜성 구형 핵산은 예방 및 치료 용도 및 연구 및 진단용으로 유용하다.

Description

예방 또는 치료 용도를 위한 리포솜성 구형 핵산에 의한 면역 조절인자의 다가 전달{MULTIVALENT DELIVERY OF IMMUNE MODULATORS BY LIPOSOMAL SPHERICAL NUCLEIC ACIDS FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC APPLICATIONS}
관련 출원
본원은 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 2014년 6월 4일 출원된 미국 특허 가출원 62/007,528 (명칭: "MULTIVALENT DELIVERY OF IMMUNE MODULATORS BY LIPOSOMAL SPHERICAL NUCLEIC ACIDS FOR PROPHYLACTIC 또는 THERAPEUTIC APPLICATIONS")을 기초로 한, 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장한다.
면역계는 신체의 외부 및 잠재적으로 위험한 물질을 인식하고 이를 고도로 표적화되고 제어된 방식으로 제거하도록 협력하여 작용하는 세포 및 체액 성분의 복잡한 네트워크이다. 이것은 일반적으로 선천성 및 적응 면역계로 나눌 수 있다. 선천성 면역계는 생식계열 (germline)에서 코딩되고, 병원체에 존재하는 보존된 모티프 (motif)에 응답하도록 설계된다. 적응 면역계는 제어된 체세포 재조합 과정을 통해 그의 항원 특이성 레퍼토리 (repertoire)를 개발하고, 매우 다양한 항원 종류에 대해 정교한 특이성으로 반응할 수 있다. 선천성 및 적응 면역 반응의 자극은 동물, 동물 질환 모델 및 인간의 매우 다양한 질환의 치료 또는 예방을 위한 효과적인 전략인 것으로 밝혀졌다.
다양한 감염성 질환의 치료 또는 예방에서 면역조절 방법의 성공은 놀라운 것이었다. 그럼에도 불구하고, 면역요법 방법을 사용하여 해결될 수 있는 잠재적으로 더 많은 질병이 존재한다. 다음과 같은 두 가지의 중요한 제한이 남아있다: (1) 적응 면역 반응을 유도하기에 적합한 환경을 또한 제공하면서 그 기능을 안전하게 강화하기 위해 최적의 시간에 최적의 비율로 전달되는 올바른 신호에 의한 선천성 면역 세포의 적절한 프라이밍 (priming), (2) 적응 반응에 의해 표적화되어야 하는 올바른 항원 또는 항원의 조합의 확인.
면역 반응을 자극하기 위한 현재의 접근 방식은 주로 별개로 면역조절성인 것으로 알려진 화합물들의 혼합물에 의존한다. 현재, 임상에서 사용되는 화합물은 각각 선천성 및 적응 면역 반응을 유도하는 경험적으로 결정된, 임의로 항원과 조합된 면역 자극제의 벌크 혼합물이다. 거의 1세기에 걸친 개발에도 불구하고, 종래의 방법은 단지 2개의 FDA 승인 면역 자극제만을 제시하였다: (1) 알루미늄 염의 조합물인 명반(alum), (2) 모노포스포릴 지질 A. 특히 명반은 감염성 질환에서 안전성 및 효능에 대한 인상적인 실적을 갖지만, 이것은 무엇보다도 세포 내 병원체, 암, 알레르기 및 알레르기성 질환과 같은 보다 복잡한 질환을 퇴치하기 위해 효과적인 면역 반응을 유도하기에 충분한 것으로 보이지 않는다는 것이 점차 명백해지고 있다. 새로운 면역 자극제를 개발하기 위한 노력은 주로 효능의 결여 때문에 또는 안전성 문제 때문에 크게 실패하였다.
면역계는 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충과 같은 병원체에 응답하도록 수천 년에 걸쳐 진화하였다. 따라서, 대부분의 면역 세포는 미생물에 존재하는 모티프를 인식하고, 포식, 처리한 후, 반응하도록 최적화되고, 유기체에 일반적으로 존재하는 비율로 "조정"되는 수용체를 갖는다.
발명의 개요
다가의 면역 조절인자로서 기능하는 리포솜성 구형 핵산이 본 발명의 측면에 따라 제공된다. 본 발명은 일부 측면에서, 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 나노구조체를 기초로 한다.
일부 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피 (shell)를 형성한다.
다른 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피를 형성하고, 올리고뉴클레오티드 외피는 적어도 하나의 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피를 형성하고, 올리고뉴클레오티드 외피는 적어도 하나의 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드는 TLR 효능제이다.
다른 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피를 형성하고, 올리고뉴클레오티드 외피는 적어도 하나의 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드는 TLR 길항제이다.
다른 실시양태에서 TLR은 TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, 및 TLR13으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피를 형성하고, 올리고뉴클레오티드 외피는 적어도 하나의 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드는 RIG-I 효능제이다.
다른 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피를 형성하고, 올리고뉴클레오티드 외피는 적어도 하나의 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드는 RIG-I 길항제이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 외피는 올리고뉴클레오티드 및 담체 분자로 구성된다.
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 외피는 전적으로 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 키메라 RNA-DNA 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 키메라 RNA-DNA 올리고뉴클레오티드의 조합물로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드는 구조적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 구조적으로 상이한 올리고뉴클레오티드들을 갖는다.
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드는 2-10개의 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 갖지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 A-클래스, B-클래스 및 C-클래스 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 그의 5'-말단이 나노구조체의 외면에 노출된다.
다른 실시양태에서, 모든 올리고뉴클레오티드는 그의 5'-말단이 나노구조체의 외면에 노출된다.
또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 리포솜성 코어에 직접 연결된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 리포솜성 코어에 간접적으로 연결된다.
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 초과의 링커를 통해 리포솜성 코어에 간접적으로 연결된다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 다음 링커이다: 토코페롤, 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 포화 C8-C22 지방산, 글리세롤의 포화 C8-C22 에테르 유도체, C8-C22 지방산의 포화 및 불포화 아미드 유도체 및 모노- 및 1,2- 또는 1,3-디-아미노 글리세롤 및 그의 유도체.
또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2-1,000개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포솜성 코어는 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함한다: 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 포화 C8-C22 지방산, 글리세롤의 포화 C8-C22 에테르 유도체, 및 C8-C22 지방산의 포화 및 불포화 아미드 유도체 및 모노- 및 1,2- 또는 1,3-디-아미노 글리세롤 및 그의 유도체.
또 다른 실시양태에서, 리포솜성 코어는 한 종류의 지질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포솜성 코어는 2-10개의 상이한 지질을 포함한다.
다른 실시양태에서, 면역 자극제는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 모노포스포릴 지질 A, 박테리아 기원의 지질 A, 22:0 트레할로스, 디메틸디옥타데실-암모늄, Kdo2 지질 A, 이노시톨 포스페이트, 예를 들어 IP3(1,3,4), IP3(1,3,5), IP3(1,4,5), IPR(1,3,4,5), LPA/S1P 수용체 선택적 효능제, PAF 및 PAF 유사체, 리포뉴클레오티드, 시클릭 LPA, 생물활성 세라미드, 엔도칸나비노이드, 아난다미드, 지질 산화 생성물, 디아실글리세롤 포스페이트, 박테리아 막 지질, N-아실글리신 지질, 아실 카르니틴 지질, 미콜산, 식물 지질 추출물, FSL-1, PAM3CSK4, HKLM, LPS, FLA-ST, 이미퀴모드, 레시퀴모드, C12-IE-DAP, L18-MDP toll 유사 수용체 효능제, NOD 수용체 효능제, 및 염증유발성 면역 수용체 효능제.
또 다른 실시양태에서, 나노구조체는 추가로 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원은 나노구조체와 함께 혼합된다.
다른 실시양태에서, 항원은 올리고뉴클레오티드 외피에 직접 연결된다.
일부 실시양태에서, 항원은 올리고뉴클레오티드 외피에 링커를 통해 간접적으로 연결된다.
다른 실시양태에서, 항원은 리포솜성 코어에 직접 연결된다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 항원은 리포솜성 코어에 링커를 통해 간접적으로 연결된다.
또 다른 실시양태에서, 항원-올리고뉴클레오티드 접합체는 리포솜성 코어에 올리고뉴클레오티드 혼성화를 통해 연결된다.
일부 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 면역 자극제는 리포솜성 코어 내에 포매됨으로써 리포솜성 코어와 회합된다.
다른 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 면역 자극제는 리포솜성 코어에 간접적으로 연결됨으로써 리포솜성 코어와 회합된다.
일부 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 면역 자극제는 리포솜성 코어에 직접 연결됨으로써 리포솜성 코어와 회합된다.
일부 실시양태에서, 나노구조체는 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어 (여기서 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 지질 이중층과 회합됨), 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피를 형성하고, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드는 방사상으로 바깥쪽으로 향한다.
다른 실시양태에서, 링커는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 토코페롤, 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 포화 C8-C22 지방산, 글리세롤의 포화 C8-C22 에테르 유도체, 및 C8-C22 지방산의 포화 및 불포화 아미드 유도체 및 모노- 및 1,2- 또는 1,3-디-아미노 글리세롤 및 그의 유도체.
일부 실시양태에서, 항원은 내부 수성 층에서 리포솜성 코어 내에 캡슐화된다.
다른 실시양태에서, 항원은 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드에 비공유 부착된다.
다른 실시양태에서, 항원은 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원, 기생충 항원, 합텐, 및 알레르겐으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 나노구조체는 자기조립형 (self-assembling) 나노구조체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 핵산 나노구조체를 면역 반응의 촉진을 위해 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 치료 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 대상체는 장애를 갖고, 방법은 장애의 치료 방법이다.
또 다른 실시양태에서, 장애는 암이다.
일부 실시양태에서, 장애는 감염성 질환이다.
다른 실시양태에서, 감염성 질환은 바이러스 감염이다.
일부 실시양태에서, 감염성 질환은 박테리아 감염이다.
또 다른 실시양태에서, 장애는 알레르기이다.
일부 실시양태에서, 장애는 천식이다.
또 다른 실시양태에서, 장애는 자가면역 질환이다.
일부 실시양태에서, 치료 프로토콜을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 치료 프로토콜은 수술이다.
일부 실시양태에서, 치료 프로토콜은 방사선 요법이다.
다른 실시양태에서, 치료 프로토콜은 약물 치료이다.
한 실시양태에서, 방법은 아주반트 (adjuvant)의 투여를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 대상체는 장애를 갖고, 방법은 장애의 치료 방법이고, 여기서 나노구조체는 표적화 분자와 회합된다.
한 실시양태에서, 대상체는 장애를 갖고, 방법은 장애의 치료 방법이고, 여기서 나노구조체는 경구, 비내, 설하, 정맥내, 피하, 점막, 호흡기, 직접 주사, 관장, 및 피내로 이루지는 군으로부터 선택되는 경로에 의해 전달된다.
또 다른 측면에서, 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물은 핵산 나노구조체 및 그의 실시양태를 포함한다.
본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 하나의 요소 또는 요소들의 조합을 수반하는 본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 각각의 측면에 포함될 수 있을 것으로 예상된다. 본 발명은 다음 설명에 제시되거나 또는 도면에 도시된 구성 또는 성분의 배열의 세부 사항에 대한 그의 적용으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태를 실행할 수 있고, 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 첨부되는 상세한 설명, 실시예, 청구범위 및 도면에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명으로부터 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
첨부된 도면은 축척으로 도시되는 것으로 의도되지 않는다. 도면에서, 다양한 도면에 도시된 각각의 동일한 또는 거의 동일한 성분은 유사한 수치로 표시된다. 명확성을 위해, 모든 성분이 모든 도면에 표시될 수 있는 것은 아니다.
도 1은 올리고뉴클레오티드 및 친유성 면역 자극제의 동시-전달을 위한 본 발명의 예시적인 리포솜성 나노구조체의 일반적인 구조를 보여준다. 나노구조체는 다음을 포함한다: (1) 지질 이중층에 부착되고 가능하게는 포매된 친유성 면역 자극제 (특히, TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6)를 함유하는 리포솜성 코어, 및 (2) 전체 구축물을 면역 세포에 표적화하는 데 도움을 주고 또한 핵산을 인식할 수 있는 면역 수용체 (특히, TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, TLR13, RIG-I)를 자극하는 작용을 한다는 점에서 이중 기능을 갖는 올리고뉴클레오티드 외피.
도 2는 올리고뉴클레오티드 및 친유성 면역 자극제 및 항원의 동시-전달을 위한 또 다른 예시적인 항원-접합된 리포솜성 나노구조체의 일반적인 구조를 보여준다. 구축물은 도 1에 도시된 것과 유사하지만, 항원-접합된 올리고뉴클레오티드가 모 구조에 비-공유 부착되는 추가의 변형을 포함한다. 항원은 올리고뉴클레오티드 외피와의 상호작용을 통해 리포솜성 SNA에 접합된다.
도 3은 올리고뉴클레오티드 및 친유성 면역 자극제 및 항원의 동시-전달을 위한 항원-접합된 리포솜성 나노구조체의 또 다른 일반적인 구조를 보여준다. 항원은 또한 리포솜성 코어 내에 캡슐화될 수 있다.
도 4는 리포솜성 나노구조체를 통해 TLR4 및 TLR9 둘 모두를 자극하는 것이 각각 별개의 경우보다 더 큰 활성화를 유도함을 보여주는 그래프이다. TLR4 및 TLR9 둘 모두의 효능제를 갖는 리포솜성 나노구조체는 각각 별개의 단독인 경우보다 RAW 블루 (Blue) 세포의 더 큰 활성화를 유도한다.
도 5a-5b는 MPLA에 의한 NF-kB의 활성화가 기능적 TLR4에 의존성임을 보여주는 막대 그래프의 세트이다. MPLA 함유 리포솜성 SNA에 의한 NF-kB의 활성화는 라모스 블루 (Ramos Blue) 세포주 (도 5b)가 아니라 RAW 블루 세포주 (도 5a)가 자극에 반응하여 NF-kB 활성화를 보였기 때문에 기능적 TLR4에 의존성이다. 일원 ANOVA ****p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01.
도 6a-6b는 CpG 및 MPLA의 나노구조체 동시-전달이 MyD88-의존성 및 -비의존성 경로 둘 모두를 최적으로 활성화함을 보여주는 막대 그래프의 세트이다. 단일 구축물 내에서의 CpG 1826 및 MPLA 둘 모두를 전달하는 리포솜성 나노구조체는 증가된 TNF (도 6a) 및 IFN-알파 (도 6b) 수준을 나타내었고 이는 각각 별개로 전달함으로써, 또는 두 성분을 동일한 웰에서 그러나 동일한 구축물 상에 존재하는 것은 아니게 전달함으로써 반복될 수 없다. ANOVA, **p<0.01, ****p<0.0001.
도 7a-7b는 MPLA의 리포솜성 나노구조체 전달이 CpG 모티프가 없는 경우에도 NF-kB의 활성화를 개선함을 보여주는 막대 그래프의 세트이다. 도 7a는 NF-kB 활성화를 보여주고, 도 7b는 TNF (OD)를 보여준다. 일원 ANOVA ****p<0.0001.
도 8은 나노구조체 제제 내로의 MPLA 공급량을 3.8% 초과 내지 7.7% 이하로 증가시키면 활성이 개선됨을 보여주는 그래프이다. RAW 블루 세포주에서, MPLA 공급량을 7.7% MPLA까지 증가시키면 리포솜성 SNA의 활성화의 효능이 증가하지만, 11.5%까지 증가시키는 것은 그렇지 않는다는 것이 관찰되었다.
도 9는 포스포로티오에이트 (PS) 연결이 11.5% MPLA (상단 패널) 또는 7.7%의 MPLA (하단 패널)에서 뮤린 면역 세포에서 효능은 증가시키지만 최대 자극은 증가시키지 않음을 보여주는 그래프의 세트이다. RAW 블루 세포에서, 리포솜성 나노구조체의 효능의 변화가 관찰되었고 최대 자극에서는 변화가 관찰되지 않았지만, 이것은 종 의존성일 것으로 예상된다.
도 10은 항원-접합된 리포솜성 나노구조체가 면역 세포의 활성화를 나타냄을 보여주는 그래프이다.
도 11은 나노구조체가 자유 PS 올리고 및 명반보다 더 효과적으로 세포 반응을 유도함을 보여주는 그래프이다. C57BL/6 마우스 (N=4/군)를 모델 항원으로서 난알부민을 이용하여 0일 및 21일에 지시된 제제로 면역화하였다. 28일째에 비장을 수집하고, 1 μM OVA (257-264)와 IFN-γ ELISPOT 플레이트 상에서 밤새 인큐베이팅하였다. IFN-γ 스팟의 수는 자동화 ELISPOT 계수기를 사용하여 정량하였다. *p<0.05, NS=비-유의성.
도 12는 항원을 갖는 빈 나노구조체(hollow nanostructure)가 종양 성장 속도를 감소시킴을 나타내는 그래프이다. C57BL/6 마우스 (N=10/군)에게 0일에 1x106 E.G7-OVA 세포를 접종한 후, 3, 7, 10일에 나타낸 화합물로 처리하였다.
발명의 특정 실시양태의 상세한 설명
Toll-유사 수용체 (TLR)는 선천성 면역 세포의 활성화를 촉발하고 그의 이펙터 기능을 촉진하고 선천성 및 적응 면역을 연결시키는 패턴 인식 수용체 (PRR)의 패밀리이다. TLR을 자극하는 작용제는, 상기 수용체가 면역 반응 조정에서 수행하는 중추적인 역할 때문에 잠재적인 치료 및 예방 화합물로서 광범위하게 연구되고 있다. 다수의 TLR 및 면역 수용체가 면역 세포가 병원체를 처리할 때 자극되는 방식과 유사하게, 다수의 화합물에 의한 다수의 TLR의 자극이 더 큰 효능을 생성할 수 있음이 밝혀졌다. 그러나, 다수의 TLR 효능제를 조합하여 효율적으로 제공하는 것은 다음과 같은 많은 이유로 매우 어려울 수 있다: (1) 시너지는 일반적으로 다른 IC50 또는 EC50 값 때문에 두 화합물 사이의 고정된 농도 비의 좁은 창에서만 종종 관찰되고, (2) 다른 크기, 전하, 소수성 등 다양한 물리화학적 특성은 이들을 서로 부착시키기 어렵게 만들거나 이들이 크게 다른 PK/PD/ADME 특성을 갖도록 만들 수 있고, (3) 화합물의 독성 수준이 상이한 경향을 보이고, (4) 하나 이상의 상이한 화합물의 표적 수용체는 접근불가능할 수 있거나 (예컨대 시토졸), 또는 엔도솜 또는 리포솜과 같은 분해 구획에 위치할 수 있다.
예기치 않게 높은 면역 조정 활성을 갖는 나노구조체의 신규 클래스가 본 발명에 따라 개발되었다. 이러한 나노구조체는 면역 조정 리포솜성 구형 핵산 (때때로 SNA로 언급됨)인 초분자 (supra-molecular) 어셈블리이다. 이러한 나노구조체는 세포에게 시공간적으로 고도로 제어되는 방식으로 면역 조정 물질의 조합을 전달할 수 있다 (예는 도 1-3에 도시됨). 이러한 나노구조체의 독특한 특징은 면역 반응의 규모 및 질의 측면에서 예상치 못한 면역 조정 효과를 달성하기 위해 협력하는, 외부 외피 내뿐만 아니라 코어 내로의 면역 조정 물질의 도입이다. 이러한 면역조정 효과는 물질을 개별적으로 또는 물리적으로 동일한 구축물로 함께 회합되지 않은 상태로 조합하여 전달함으로써는 달성될 수 없다. 단일 구조로 모든 구성 성분을 조립하는 것이 최적 효과를 달성하는 데 중요하다는 것이 본 발명에 따라 증명되었다 (데이터는 도 6-7에 도시된다).
상기에 더하여, 다가 면역-조정 구조를 갖는 항원의 동시-전달을 달성하기 위한 방법이 또한 개발되었다 (그 예는 도 2-3에 도시된다). 이에 의해, 상기 구축물은 다양한 질환에 대한 강력한 면역 반응을 유도하기 위해 선천성 및 적응 면역을 중개하기 위해 (자극 적용) 또는 자극 신호의 결여에 의해 또는 이펙터 세포 아네르기 (anergy) 또는 조절 T 세포의 유도로 이어지는 길항제 분자를 사용하여 면역 신호 전달을 차단함으로써 달성되는 동시-자극의 부재 하에서 항원을 전달하여 항원-특이적 내성을 유도하기 위해 (조절 적용) 항원 및 동시-자극 신호를 전달할 수 있다.
현재, 면역학적 효과를 유도하기 위해 병원에서 사용되는 방법은 일반적으로 다음 두 가지 범주로 구분된다: 1) 면역 반응을 활성화하거나 강화하는 화합물, 예컨대 백신 및 아주반트, toll-유사 수용체의 소분자 효능제, 예컨대 이미퀴모드 및 레시퀴모드, 또는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 ISS 1018 (디나박스 테크놀로지스 코퍼레이션 (Dynavax Technologies Corporation)), 및 2) 원치 않는 면역 반응을 감소시키는 작용을 하는 화합물, 예컨대 코르티코스테로이드, 시클로스포린, 타크롤리무스. 이들 화합물은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 상당한 제한을 갖는다.
일반적으로, 선행 기술의 면역 자극 시도는 각종 감염성 질환, 예컨대 HIV, 결핵, 말라리아, 뎅기열, 클라미디아 등에 대한 효과적이고 비용 효율적인 백신을 개발하는 데 실패를 초래하는, 항원을 표적화하기 위한 강력한 세포성 면역 반응을 활성화하는 능력의 결여에 의해 제한되고 있다. 유사하게, 암에 대한 다양한 실험 백신 화합물은 후기 임상 시험에서 그의 일차 종점에 도달하지 못했다. 아직 만족스럽게 충족된 것으로 보이지 않는 핵심 과제는 우수한 결과를 얻을 수 있는 항원 및 면역 자극제의 제제이다. 본 발명의 나노구조체는 이러한 목표를 달성하고, 종양 부하의 상당한 (95%) 감소 (도 12)의 증거와 함께 생체 내에서 항원에 강한 세포 반응의 활성화를 생성하였다.
본 발명의 나노구조체는 다음을 포함한다: (1) 지질 이중층 내에 포매되거나 이에 부착된 면역 자극제를 포함하는, 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어, 및 (2) 올리고뉴클레오티드 외피일 수 있고, 나노구조체를 면역 세포로 표적화하는데 도움을 주고 또한 핵산을 인식하는 면역 수용체를 자극하는 작용을 수행한다는 점에서 이중 기능을 갖는 올리고뉴클레오티드의 층 (도 1). 항원은 또한 동시-자극 신호와 함께 전달되도록 상기 구축물에 결합될 수 있다 (도 2). 도 1에 도시된 것과 유사한 구조는 항원-접합된 올리고뉴클레오티드가 나노구조체에 부착되는 추가의 변형을 겪는다. 별법으로 또는 추가로, 수용성 면역 자극제 또는 항원은 코어 내에 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 나노구조체는 리포솜성 코어를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 리포솜성 코어는 지질 이중층을 형성하는 지질 또는 인지질의 성분에 의해 형성된, 중앙에 위치한 코어 구획 (compartment)을 의미한다. "리포솜"은 하나 또는 여러 개의 막이 수성 코어를 캡슐화하는 다양한 크기와 구조의 자가 폐쇄된 인공 소포 구조이다. 가장 일반적으로, 리포솜 막은 친수성 헤드기가 수성 환경을 향해 배향되고, 지질 사슬은 친유성 코어에 포매된 지질 이중층 막으로부터 형성된다. 리포솜은 다른 양친매성 단량체 및 중합체 분자, 예컨대 블록 공중합체 또는 폴리펩티드와 같은 중합체로부터도 형성될 수 있다. 단일층 소포는 수성 공간을 둘러싸는 하나의 막에 의해 규정되는 리포솜이다. 이와 대조적으로, 올리고- 또는 다중층 소포는 여러 막으로 이루어진다. 일반적으로, 막은 약 4 nm 두께이며, 천연 또는 합성 기원의 인지질과 같은 양친매성 지질로 이루어진다. 임의로, 상기 막 특성은 스테롤 또는 콜산 유도체 등과 같은 다른 지질의 혼입에 의해 변형될 수 있다.
지질 이중층은 지질 분자의 두 층으로 구성된다. 도 1-3의 다이어그램에 도시된 바와 같이, 층의 각각의 지질 분자는 인접하는 지질 이중층과 실질적으로 평행하게 배향되고, 이중층을 형성하는 두 개의 층은 수성 상에 노출된 분자의 극성 말단 및 서로 인접한 비-극성 말단을 갖는다. 리포솜성 코어의 중앙 수성 영역은 비어 있거나, 물, 수성 에멀젼, 항원, 면역 자극제, 면역 억제인자 또는 다른 치료 또는 진단제로 완전히 또는 부분적으로 충전될 수 있다.
"지질"은 물에 불용성인 지방, 지질, 원형질의 알코올-에테르-가용성 구성 성분을 포괄하는 일반 용어로서 그의 종래의 의미를 지칭한다. 지질은 대체로 친수성 및 소수성 모이어티 (moiety)로 이루어진다. 물에서, 지질은 친수성 모이어티 (헤드 기)가 수성 상을 향해 배향되고 친유성 모이어티 (아실 사슬)는 이중층 코어 내에 포매되어 이중층 막을 형성하도록 자가 조직화될 수 있다. 지질은 또한 두 친수성 모이어티 (볼라 양친매성 물질 (bola amphiphile))를 포함할 수 있다. 이 경우, 막은 이중층이 아니라 단일 지질 층으로부터 형성될 수 있다. 본 문맥에서 지질에 대한 전형적인 예는 지방, 지방산 오일, 필수 오일, 왁스, 스테로이드, 스테롤, 인지질, 당지질, 황지질, 아미노지질, 색소지질 및 지방산이다. 이 용어는 천연 및 합성 지질 둘 모두를 포함한다. 본 발명과 관련하여 바람직한 지질은 다음과 같다: 포스파티딜, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민 및 스핑고미엘린을 포함하는 스테로이드 및 스테롤, 특히 콜레스테롤, 인지질. 지방산이 존재하는 경우, 이들은 6개 이하의 이중 결합을 함유하는, 약 12-24개의 탄소 사슬 길이일 수 있다. 지방산은 글리세롤로부터 유도될 수 있는 백본에 연결된다. 하나의 지질 내의 지방산은 상이할 수 있거나 (비대칭), 또는 단지 1개의 지방산 사슬, 예를 들어 리소레시틴이 존재할 수 있다. 혼합 제제는 특히 비-양이온성 지질이 계란 노른자, 소 심장, 뇌, 간 또는 대두로부터 정제된 레시틴 (포스파티딜콜린)과 같은 천연 공급원으로부터 유래될 때 가능하다.
리포솜성 코어는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 하나 이상의 지질로부터 제조될 수 있다: 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 및 이들의 유도체.
면역 자극제는 리포솜성 코어의 지질 이중층과 회합된다. 면역 자극제는 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 면역 인자, 즉, 시토카인, 면역 세포, 항체, 케모카인을 유도하거나 활성화되도록 면역계의 자극을 유도하는 물질이다. 면역 반응은 세포성 및/또는 체액성 반응을 포함할 수 있다. 면역 자극제는 예를 들어 소분자, 핵산, 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 면역 자극제는 국부적 미세환경의 세포에서 면역 자극 분자의 발현을 활성화시킬 수 있다.
이중층 내로 도입되는 면역 자극제는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 매우 다양한 분자일 수 있다: 모노포스포릴 지질 A, 박테리아 기원의 지질 A, 22:0 트레할로스, 디메틸디옥타데실-암모늄, Kdo2 지질 A, 이노시톨 포스페이트, 예를 들어 IP3(1,3,4), IP3(1,3,5), IP3(1,4,5), IPR(1,3,4,5), LPA/S1P 수용체 선택적 효능제, PAF 및 PAF 유사체, 리포뉴클레오티드, 시클릭 LPA, 생물활성 세라미드, 엔도칸나비노이드, 아난다미드, 지질 산화 생성물, 디아실글리세롤 포스페이트, 박테리아 막 지질, N-아실글리신 지질, 아실 카르니틴 지질, 미콜산, 식물 지질 추출물, FSL-1, PAM3CSK4, HKLM, LPS, FLA-ST, 이미퀴모드, 레시퀴모드, C12-IE-DAP, L18-MDP 및 toll 유사 수용체, NOD 수용체, 및 면역 반응을 유도하는 방향으로 생산될 다른 염증유발성 면역 수용체를 자극할 수 있는, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 다른 화합물.
면역 자극제는 리포솜성 코어와 회합된다. 이것은 코어 내에 포매됨으로써 회합되거나 또는 간접적으로 (즉, 비-공유적으로 또는 다른 분자, 예컨대 링커를 통해 공유적으로) 또는 직접 (즉 공유적으로) 부착되거나 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 나노구조체는 바람직하게는 치료 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 임의의 핵산 함유 분자를 의미한다. 핵산은 DNA, RNA, PNA, LNA, ENA 또는 이들의 조합 또는 변형일 수 있다. 또한, 이것은 단일, 이중 또는 삼중 가닥일 수 있다. 치료 올리고뉴클레오티드는 치료 및 또는 진단제로서 기능할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다.
올리고뉴클레오티드는 리포솜성 코어의 외부에 위치한다. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 외부에 존재한다. 일부 실시양태에서, 적어도 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 범위의 조합이 리포솜성 코어의 외부에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1-1000, 10-500, 50-250, 50-300개의 올리고뉴클레오티드가 표면에 존재한다. 일부 예에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 외피를 형성한다. 리포솜의 외부 표면의 사용가능한 표면 영역의 적어도 50%가 올리고뉴클레오티드를 포함할 때, 올리고뉴클레오티드 외피가 형성된다. 일부 실시양태에서, 리포솜의 외부 표면의 사용가능한 표면 영역의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드는 다양한 방향으로 배향될 수 있다. 일부 실시 예에서, 올리고뉴클레오티드는 방사상으로 외측으로 배향된다.
올리고뉴클레오티드는 코어에 또는 서로에 대해 및/또는 다른 분자, 예컨대 항원에 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단 또는 3' 말단을 통해 링커에 접합될 수 있다 - 예를 들어, [서열, 5'-3']-링커 또는 링커-[서열, 5'-3']. 나노구조체의 올리고뉴클레오티드의 일부 또는 전부는 서로 직접 또는 공유 또는 비공유 연결을 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 한 올리고뉴클레오티드의 또 다른 올리고뉴클레오티드에 대한 연결은 리포솜성 코어에 해당 올리고뉴클레오티드의 연결에 추가적이거나 또는 선택적인 것일 수 있다. 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 또한 다른 분자, 예컨대 항원에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 공유 또는 비공유 연결을 통해 직접 또는 간접적으로 코어의 항원에 연결될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 외피는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 매우 다양한 분자일 수 있다: 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 하나 또는 다수의 변형을 포함하는 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및 다른 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 하나 또는 다수의 변형을 포함하는 이중 가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및 다른 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 하나 또는 다수의 변형을 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 삼중체. 또 다른 실시양태에서, 하나 또는 다수의 상이한 올리고뉴클레오티드는 단일 리포솜성 나노구조체의 동일한 표면 상에 존재한다.
올리고뉴클레오티드 외피는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는, 하나 또는 다수의 링커 분자에 대한 접합을 통해 리포솜성 코어의 표면에 고정될 수 있다: 토코페롤, 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 및 이들의 유도체. 올리고뉴클레오티드는 자극될 때 상호작용에 반응하여 면역 반응을 생성하는 분자 또는 분자의 복합체와 상호작용하는 핵산일 수 있다. 분자 또는 분자의 복잡체는 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 패턴 인식 수용체 (PRR) 조정 올리고뉴클레오티드일 수 있다. PRR은 미생물 병원체 또는 세포 스트레스와 관련된 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP)뿐만 아니라, 세포 손상 동안 방출되는 세포 성분과 연관된 손상-관련 분자 패턴 (DAMP)을 확인하기 위해 선천성 면역계의 세포에 의해 발현된 단백질로 이루어진 면역계의 원시적인 부분이다. PRR는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다: 막 결합 PRR, 예컨대 수용체 키나제, toll-유사 수용체 (TLR) 및 C-형 렉틴 수용체 (CLR) (만노스 수용체 및 아시알로 당단백질 수용체); 세포질 PRR, 예컨대 RIG-I-유사 수용체 (RLR), RNA 헬리카제, 식물 PRR, 및 NonRD 키나제; 및 분비된 PRR. PRR 조정 올리고뉴클레오티드는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: TLR 효능제, RIG-I의 효능제 또는 길항제, 전사 인자, 세포 번역 기구, 세포 전사 기구, 핵산 작용 효소, 및 핵산 회합 자가항원. 상기 실시양태의 한 예는 비메틸화된 5'-시토신-포스페이트-구아노신-3' (CpG) 모티프의 사용이다. 또 다른 예는 5'-UUG-3' 또는 5'-UUA-3' 모티프의 사용이다. 추가의 또 다른 예는 긴 이중 가닥 RNA의 사용이다.
본원에서 사용되는 TLR 효능제는 TLR과 상호작용하고 그 활성을 자극하는 핵산 분자이다. Toll-유사 수용체 (TLR)는 포유 동물의 선천 면역에서 매우 중요한 역할을 수행하는 고도로 보존된 폴리펩티드의 패밀리이다. TLR1 - TLR10으로 지정된 적어도 10개의 패밀리 멤버가 확인되었다. 다양한 TLR의 세포질 도메인은 Toll-인터루킨 1 (IL-1) 수용체 (TIR) 도메인을 특징으로 한다 (Medzhitov R et al. (1998) Mol Cell 2:253-8). TLR에 의한 미생물 침입의 인식은 초파리 및 포유류에서 진화상 보존되는 신호전달 캐스케이드의 활성화를 촉발한다. TIR 도메인 함유 어댑터 단백질 MyD88은 TLR과 회합하고 IL-1 수용체-연관 키나제 (IRAK) 및 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체-연관 인자 6 (TRAF6)을 TLR에 동원하는 것으로 보고되었다. MyD88-의존성 신호전달 경로는 NF-κΒ의 전사 인자 및 c-Jun NH2 말단 키나제 (JnK) 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK), 면역 활성화 및 염증성 시토카인의 생산에서 매우 중요한 단계의 활성화를 유도할 것으로 생각된다. 검토를 위해, 문헌 [Aderem A et al. (2000) Nature (406):782-87]을 참고한다.
TLR은 다양한 조직에서 및 다양한 종류의 면역 세포에서 차별적으로 발현되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 인간 TLR7은 태반, 폐, 비장, 림프절, 편도선 및 형질세포양 전구체 수지상 세포 (pDC)에서 발현되는 것으로 보고되었다 ([Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8]; [Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9]). 인간 TLR8은 폐, 말초혈 백혈구 (PBL), 태반, 비장, 림프절, 및 단핵구에서 발현되는 것으로 보고되었다 ([Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9]; [Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8]). 인간 TLR9는 비장, 림프절, 골수, PBL, 및 pDC, 및 B 세포에서 발현되는 것으로 보고되었다 ([Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9]; [Bauer S et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:9237-42]; [Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8]).
인간 및 뮤린 TLR7의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 알려져 있다. 예를 들어, 그 모든 내용이 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록 번호 AF240467, AF245702, NM_016562, AF334942, NM_133211; 및 AAF60188, AAF78035, NP_057646, AAL73191, 및 AAL73192을 참고한다. 인간 TLR7은 길이가 1049개 아미노산인 것으로 보고되었다. 뮤린 TLR7의는 길이가 1050개 아미노산인 것으로 보고되었다. TLR7 폴리펩티드는 류신-풍부 반복 영역을 갖는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 TIR 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
인간 및 뮤린 TLR8의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 알려져 있다. 예를 들어, 그 모든 내용이 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록 번호 AF246971, AF245703, NM_016610, XM_045706, AY035890, NM_133212; 및 AAF64061, AAF78036, NP_057694, XP_045706, AAK62677, 및 NP_573475를 참고한다. 인간 TLR8은 적어도 2개의 이소형, 즉 1041개 아미노산 길이의 하나 및 1059개 아미노산 길이의 다른 하나가 존재하는 것으로 보고되었다. 뮤린 TLR8은 1032개 아미노산 길이이다. TLR8 폴리펩티드는 류신-풍부 반복 영역을 갖는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 TIR 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
인간 및 뮤린 TLR9의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 알려져 있다. 예를 들어, 그 모든 내용이 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록 번호 NM_017442, AF259262, AB045180, AF245704, AB045181, AF348140, AF314224, NM_031178; 및 NP_059138, AAF72189, BAB19259, AAF78037, BAB19260, AAK29625, AAK28488, 및 NP_112455를 참고한다. 인간 TLR9는 적어도 2개의 이소형, 즉 1032개 아미노산 길이의 하나 및 1055개 아미노산 길이의 다른 하나가 존재하는 것으로 보고되었다. 뮤린 TLR9는 1032개 아미노산 길이이다. TLR9 폴리펩티드는 류신-풍부 반복 영역을 갖는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 TIR 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TLR 신호전달"은 TLR을 통한 신호전달과 연관된 세포내 신호전달의 임의의 측면을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TLR-매개 면역 반응"은 TLR 신호전달과 연관된 면역 반응을 말한다. TLR 신호전달의 수준은 신호전달의 기존 수준을 초과하는 수준으로 향상될 수 있거나 신호전달의 배경 수준을 초과하는 수준으로 유도될 수 있다.
TLR3-매개 면역 반응은 TLR3 신호전달과 연관된 반응이다. TLR3 효능제는 dsRNA, 예컨대 다수의 AU 모티프를 갖는 dsRNA를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
TLR7-매개 면역 반응은 TLR7 신호전달과 연관된 반응이다. TLR7-매개 면역 반응은 일반적으로 IFN-α 및 IFN-유도가능 시토카인, 예컨대 IP-10 및 I-TAC의 유도를 특징으로 한다. TLR7-매개 면역 반응에서 유도된 시토카인 IL-1α/β, IL-6, IL-8, MIP-1α/β 및 MIP-3α/β의 수준은 TLR8-매개 면역 반응에서 유도된 것보다 작다. TLR7 리간드는 비제한적으로, 구아노신 유사체, 예컨대 C8-치환된 구아노신, 필수적으로 G 및 U로 이루어지는 리보뉴클레오시드, 구아노신 리보뉴클레오티드 및 RNA 또는 RNA-유사 분자의 혼합물 (PCT/US03/10406), 및 아데노신계 화합물 (예를 들어, 6-아미노-9-벤질-2-(3-히드록시-프로폭시)-9H-퓨린-8-올, 및 스미또모 (Sumitomo)에 의해 제조된 유사한 화합물 (예를 들어, CL-029))을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "구아노신 유사체"는 구아닌 염기, 구아노 신 뉴클레오시드 당, 또는 구아닌 염기와 구아노신 뉴클레오시드 당 둘 모두를 포함하는 화학적 변형을 갖는 구아노신-유사 뉴클레오티드 (구아노신 제외)를 의미한다. 구아노신 유사체는 구체적으로, 비제한적으로 7-데아자-구아노신을 포함한다.
구아노신 유사체는 추가로 C8-치환된 구아노신, 예컨대 7-티아-8-옥소구아노신 (이뮤노신), 8-머캅토구아노신, 8-브로모구아노신, 8-메틸구아노신, 8-옥소-7,8-디히드로구아노신, C8-아릴아미노-2'-데옥시구아노신, C8-프로피닐-구아노신, C8- 및 N7-치환된 구아닌 리보뉴클레오시드, 예컨대 7-알릴-8-옥소구아노신 (록소리빈) 및 7-메틸-8-옥소구아노신, 8-아미노구아노신, 8-히드록시-2'-데옥시구아노신, 8-히드록시구아노신, 및 7-데아자 8-치환된 구아노신을 포함한다.
TLR8-매개 면역 반응은 TLR8 신호전달과 연관된 반응이다. 이 반응은 추가로 염증유발성 시토카인, 예컨대 IFN-γ, IL-12p40/70, TNF-α, IL-1α/β, IL-6, IL-8, MIP-1α/β 및 MIP-3α/β의 유도를 특징으로 한다. TLR8 리간드는 필수적으로 G 및 U, 구아노신 리보뉴클레오티드 및 RNA 또는 RNA-유사 분자 (PCT/US03/10406)로 이루어진 리보뉴클레오시드의 혼합물을 포함한다. 추가의 TLR8 리간드는 또한 문헌 [Gorden et al. J. Immunol. 2005, 174:1259-1268]에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "TLR7/8 효능제"는 집합적으로 TLR7 및/또는 TLR8 신호전달을 증가시킬 수 있는 임의의 핵산 (즉, TLR7 및/또는 TLR8의 효능제)을 의미한다. 일부의 TLR7/8 리간드는 TLR7 신호전달만을 유도하고 (예를 들어, TLR7 특이적 효능제), 일부는 TLR8 신호전달만을 유도하고 (예를 들어, TLR8 특이적 효능제), 다른 것은 TLR7 및 TLR8 신호전달 둘 모두를 유도한다.
TLR9-매개 면역 반응은 TLR9 신호전달과 연관된 반응이다. 이 반응은 추가로 TLR8-매개 면역 반응을 통해 달성되는 것보다 낮은 수준이기는 하지만, 적어도 IFN-γ 및 IL-12의 생산/분비를 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TLR9 효능제"는 TLR9 신호전달을 증가시킬 수 있는 임의의 작용제 (즉, TLR9의 효능제)로 지칭한다. TLR9 효능제는 특히 비제한적으로, 면역자극성 핵산, 특히 CpG 면역자극성 핵산을 포함한다.
"면역자극성 CpG 핵산" 또는 "면역자극성 CpG 올리고뉴클레오티드"는 면역 세포를 활성화할 수 있는 임의의 CpG 함유 핵산을 의미한다. 적어도 CpG 디뉴클레오티드의 C가 반드시는 아니지만 일반적으로 비메틸화된다. 면역자극성 CpG 핵산은 미국 특허 6,194,388; 6,207,646; 6,218,371; 6,239,116; 6,339,068; 6,406,705 및 6,429,199를 비롯한 많은 등록 특허 및 공개된 특허 출원에 기재되어 있다.
TLR13-매개 면역 반응은 TLR13 신호전달과 연관된 반응이다. TLR13 효능제는 박테리아 23S rRNA이다.
올리고뉴클레오티드는 또한 레티노산 유도가능 유전자-I (RIG-I) 효능제 또는 길항제일 수 있다. RIG-I는 GenBank 등록 번호 AF038963에 대응한다. RIG-I 효능제는 dsRNA, 예컨대 폴리 (I:C)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. RIG-I 길항제는 짧은 5' 트리포스페이트 DNA 또는 RNA를 포함한다.
"면역자극성 올리고뉴클레오티드"는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역자극성 모티프 또는 백본을 포함하는 임의의 핵산 (DNA 또는 RNA)이다. 면역 반응의 유도는 면역 세포의 임의의 수 또는 활성의 증가, 또는 시토카인과 같은 면역 인자의 발현 또는 절대 수준의 증가를 의미한다. 면역 세포는 NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 기타 항원 제시 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 시토카인은 인터루킨, TNF-α, IFN-α, β 및 γ, FLT-리간드 및 동시-자극 분자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 면역자극성 모티프는 CpG 모티브 및 T-풍부 모티프를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 세트는 다음을 포함한다:
dsRNA:
폴리(A:C) 및 폴리(I:C)
ssRNA:
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용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 다수의 뉴클레오티드 (즉, 포스페이트 기에 및 치환된 피리미딘 (예를 들어, 시토신 (C), 티미딘 (T) 또는 우라실 (U)) 또는 치환된 퓨린 (예를 들어, 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)인 교환가능한 유기 염기에 연결된 당 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스)을 포함하는 분자)를 의미하기 위해 교환가능하게 사용된다. 따라서, 이 용어는 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 둘 모두를 포괄한다. 이 용어는 또한 올리고뉴클레오시드 (즉, 포스페이트가 없는 올리고뉴클레오티드) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체를 포함할 것이다. 올리고뉴클레오티드는 존재하는 핵산 공급원 (예를 들면, 게놈 또는 cDNA)로부터 얻을 수 있지만, 바람직하게는 합성 (예를 들면, 핵산 합성에 의해 제조)될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 이중체로도 언급된다. 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 2개의 별개의 상보성 핵산 가닥을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이중체"는 상보성 서열 또는 부분적으로 상보성인 서열이 서로 수소 결합된 이중 가닥 핵산 분자(들)을 포함한다. 상보성 서열은 센스 가닥 및 안티센스 (antisense) 가닥을 포함할 수 있다. 안티센스 뉴클레오티드 서열은 효과적인 표적 유전자 억제를 매개하기 위해 표적 유전자와 동일하거나 충분히 동일할 수 있다 (예를 들어, 표적 유전자 서열에 적어도 약 98% 동일한, 96% 동일한, 94%, 90% 동일한, 85% 동일한 또는 80% 동일).
이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 그의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥일 수 있고, 이것은 올리고뉴클레오티드가 오버행 (overhang) 단일 가닥 서열을 갖지 않고, 따라서 평활 말단을 갖는다는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 두 가닥은 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 생산하는 상이한 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 미스매치 및/또는 루프 또는 돌출부 (bulge)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에 걸쳐 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 또는 그 이하의 미스매치를 함유한다.
본 발명과 관련된 올리고뉴클레오티드는 예컨대 당 모이어티, 포스포디에스테르 연결 및/또는 염기에서 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "당 모이어티"는 펜토스, 리보스 및 데옥시리보스, 비변형 당 및 당 유사체를 포함하는 천연, 변형 당을 포함한다. 당 모이어티의 변형은 할로겐, 헤테로원자 또는 지방족 기에 의한 히드록실기의 교체를 포함할 수 있고, 예를 들어 에테르, 아민 또는 티올로서 히드록실기의 관능화를 포함할 수 있다.
당 모이어티의 변형은 "메틸화"로 언급되는 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부의 경우에, 본 발명과 관련되는 올리고뉴클레오티드는 변형된 또는 비변형된 당 모이어티만을 포함할 수 있지만, 다른 경우에는, 올리고뉴클레오티드는 변형된 일부의 당 모이어티 및 변형되지 않은 일부의 당 모이어티를 포함한다.
일부의 경우에, 변형된 뉴클레오단량체 (nucleomonomer)는 당- 또는 백본-변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오티드는 비-천연 생성 염기, 예컨대 5'-위치에서 변형된 우리딘 또는 시티딘, 예를 들어, 5'-(2-아미노)프로필 우리딘 및 5'-브로모 우리딘; 8-위치에서 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어, 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; 및 N-알킬화된 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신을 포함할 수 있다. 또한, 당-변형된 리보뉴클레오티드의 2'-OH 기는 H, 알콕시 (또는 OR), R 또는 알킬, 할로겐, SH, SR, 아미노 (예컨대 NH2, NHR, NR2), 또는 CN 기로 교체될 수 있고, 여기서 R은 저급 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이다. 일부 실시양태에서, 변형된 리보뉴클레오티드는 인접 리보뉴클레오티드에 연결하는 포스포디에스테르 기가 변형된 기, 예컨대 포스포로티오에이트 기에 의해 교체될 수 있다.
일부 측면에서, 2'-O-메틸 변형은 바람직하지 않은 세포 스트레스 반응, 예컨대 이중 가닥 핵산에 대한 인터페론 반응을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 변형된 당은 D-리보스, 2'-O-알킬 (2'-O-메틸 및 2'-O-에틸 포함), 즉, 2'-알콕시, 2'-아미노, 2'-S-알킬, 2'-할로 (2'-플루오로 포함), 2'-메톡시에톡시, 2'-알릴옥시 (-OCH2CH=CH2), 2'-프로파르길, 2'-프로필, 에티닐, 에테닐, 프로페닐, 및 시아노 등을 포함할 수 있다. 당 모이어티는 또한 헥소스일 수 있다.
용어 "알킬"은 포화 지방족 기, 예를 들어 직쇄 알킬기 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등), 분지쇄 알킬기 (이소프로필, tert-부틸, 이소부틸 등), 시클로알킬 (알리시클릭) 기 (시클로프로필, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸), 알킬 치환된 시클로알킬기, 및 시클로알킬 치환된 알킬기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그의 백본에 6개 이하의 탄소 원자 (예를 들어, 직쇄의 경우 C1-C6, 분지쇄의 경우 C3-C6), 보다 바람직하게는 4개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 유사하게, 바람직한 시클로알킬은 그의 고리 구조에 3-8개의 탄소 원자를 갖고, 보다 바람직하게는 고리 구조에 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다. 용어 C1-C6은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 알킬은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬" 둘 모두를 포함하고, 후자는 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 교체하는, 독립적으로 선택되는 치환기를 갖는 알킬 모이어티를 의미한다. 용어 "알케닐"은 상기 기재된 알킬과 길이 및 가능한 치환이 유사지만, 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 불포화 지방족 기를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 알케닐은 "비치환된 알케닐" 및 "치환된 알케닐" 둘 모두를 포함하고, 후자는 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 교체하는, 독립적으로 선택되는 치환기를 갖는 알케닐 모이어티를 의미한다.
용어 "염기"는 공지의 퓨린 및 피리미딘 헤테로시클릭 염기, 데아자퓨린, 및 유사체 (헤테로시클릭 치환된 유사체, 예를 들어, 아미노에티옥시 페녹사진 포함), 유도체 (예를 들어, 1-알킬-, 1-알케닐-, 헤테로방향족- 및 1-알키닐 유도체) 및 그의 호변이성질체 (tautomer)를 포함한다. 퓨린의 예는 아데닌, 구아닌, 이노신, 디아미노퓨린, 및 잔틴 및 유사체 (예를 들어, 8-옥소-N6-메틸아데닌 또는 7-디아자잔틴) 및 그의 유도체를 포함한다. 피리미딘은 예를 들어, 티민, 우라실 및 시토신과 그의 유사체 (예를 들어, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 5-(1-프로피닐)우라실, 5-(1-프로피닐)시토신 및 4,4-에타노시토신)을 포함한다. 적합한 염기의 다른 예는 비-퓨린 및 비-피리미딘 염기, 예컨대 2-아미노피리딘 및 트리아진을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오단량체는 변형된 RNA 뉴클레오티드를 비롯한 RNA 뉴클레오티드이다.
용어 "뉴클레오시드"는 당 모이어티, 바람직하게는 리보스 또는 데옥시리보스에 공유 부착된 염기를 포함한다. 바람직한 뉴클레오시드의 예는 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드는 또한 유리 카르복실기, 유리 아미노기, 또는 보호기를 포함할 수 있는 아미노산 또는 아미노산 유사체에 연결된 염기를 포함한다. 적합한 보호기는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 ([P.G.M. Wuts and T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1999] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 뉴클레오티드간 연결의 문맥에서 사용되는 용어 "연결기"는 인접 뉴클레오단량체들을 공유 연결하는 천연 생성의 비변형된 포스포디에스테르 모이어티 (-O-(PO2-)-O-)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환 연결기" 또는 "변형된 연결기" 또는 "변형된 뉴클레오티드간 연결기"는 인접 뉴클레오단량체들을 공유 연결하는 천연 포스포디에스테르기의 임의의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 치환 연결기는 포스포디에스테르 유사체, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및 P-에티옥시포스포디에스테르, P-에톡시포스포디에스테르, P- 알킬옥시포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 및 비-인 함유 연결기, 예를 들어, 아세탈 및 아미드를 포함한다. 그러한 치환 연결기는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, [Bjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843]; [Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47]). 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 연결기, 예컨대 포스포로티오에이트 연결기가 바람직하다.
일부 측면에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 3' 및 5' 말단을 포함한다 (환상 올리고뉴클레오티드 제외). 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단은 예를 들어, 3' 또는 5' 연결기를 변형시킴으로써 뉴클레아제로부터 실질적으로 보호될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,849,902 및 WO 98/13526). 올리고뉴클레오티드는 "차단기"를 포함함으로써 저항성으로 만들어질 수 있다. 본원에서 사용될 때 용어 "차단기"는 합성을 위해 보호기 또는 결합기로서 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오단량체에 부착될 수 있는 치환기 (예를 들어, OH기 이외의)를 나타낸다 (예를 들어, FITC, 프로필 (CH2-CH2-CH3), 글리콜 (-O-CH2-CH2-O-) 포스페이트 (PO3 2-), 수소 포스포네이트, 또는 포스포르아미다이트). "차단기"는 또한 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 엑소뉴클레아제 저항성 구조를 비롯하여, 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단을 보호하는 "단부 차단기" 또는 "엑소뉴클레아제 차단기"를 포함한다.
예시적인 단부-차단기는 캡 (cap) 구조 (예를 들어, 7-메틸구아노신 캡), 예를 들어, 3'-3' 또는 5'-5' 단부 역전을 갖는 역전된 뉴클레오단량체 (예를 들어, [Ortiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2: 129] 참조), 메틸포스포네이트, 포스포르아미다이트, 비-뉴클레오티드기 (예를 들어, 비-뉴클레오티드 링커, 아미노 링커, 접합체) 등을 포함한다. 3' 말단 뉴클레오단량체는 변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 3' 말단 뉴클레오단량체는 올리고뉴클레오티드의 3'-엑소뉴클레아제 분해를 방지하는 차단기에 의해 임의로 치환될 수 있는 3'-O를 포함한다. 예를 들어, 3'-히드록실은 3'→3' 뉴클레오티드간 연결기를 통해 뉴클레오티드로 에스테르화될 수 있다. 예를 들어, 알킬옥시 라디칼은 메톡시, 에톡시 또는 이소프로폭시일 수 있고, 바람직하게는 에톡시일 수 있다. 임의로, 3' 말단에서 3'→3' 연결된 뉴클레오티드는 치환 연결기에 의해 연결될 수 있다. 뉴클레아제 분해를 감소시키기 위해, 최말단 5'의 3'→5' 연결기는 변형된 연결기, 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 P-알킬옥시포스포트리에스테르 연결기일 수 있다. 바람직하게는, 2개의 최말단 5'의 3'→5' 연결기는 변형된 연결기이다. 임의로, 5' 말단 히드록시 모이어티는 인 함유 모이어티, 예를 들어, 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 P-에톡시포스페이트를 사용하여 에스테르화될 수 있다.
일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 둘 모두 포함하는 키메라 RNA-DNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 6 내지 100개 염기 길이이다. 그러나, 4개 초과의 뉴클레오티드 (심지어 많은 kb 길이)의 임의의 크기의 핵산이 충분한 자극 모티프가 존재하면 본 발명에 따라 생물학적 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게는 핵산의 크기는 8 내지 100개, 일부 실시양태에서, 8 내지 50개 또는 8 내지 30개 뉴클레오티드 범위이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 백본, 예컨대 포스포로티오에이트 (PS) 백본을 갖는다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 (PO) 백본을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 혼합 또는 키메라 PO 및 PS 백본을 갖는다.
나노구조체는 또한 항원을 포함할 수 있다. 항원은 본원에서 사용될 때, 신체에서 면역 반응, 특히 항체의 생산을 일으킬 수 있는 분자이다. 항원은 세포, 세포 추출물, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 다당류 접합체, 다당류의 펩티드 및 비-펩티드 모방체, 및 다른 분자, 소분자, 지질, 당지질, 탄수화물, 바이러스 및 바이러스 추출물 및 다세포 유기체, 예컨대 기생충 및 알레르겐을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 용어 항원은 광범위하게, 숙주 면역계가 외래물질로 인지하는 임의의 종류의 분자를 포함한다. 항원은 암 항원, 미생물 항원 및 알레르겐을 포함하고 이로 제한하지 않는다.
항원은 공유 또는 비-공유, 예를 들어 왓슨/크릭 (Watson/Crick) 혼성화를 통해 외부에 대면하는 올리고뉴클레오티드에 의해 구조체에 부착될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항원은 소수성 모이어티에의 접합을 통해 리포솜성 이중층 내로 포함될 수 있다 (도 2-3). 본원에 제시된 데이타는 상기 형태의 항원 전달이 예상치 않게 시험관 내에서 면역 자극 효과의 보다 강력한 유도를 일으키고 (도 10), 효과적인 항원 처리 및 제시를 유도하여, 매우 예상치 않은 수준에서 생체 내에서 항-종양 면역 반응의 효과적인 유도를 일으키는 (도 11-12) 것을 입증한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 항원은 리포솜의 내부 수성 층 내부에 포함될 수 있다 (도 3).
한 실시양태에서, 항원은 올리고뉴클레오티드 외피와의 상호작용을 통해 리포솜성 나노구조체에 접합된다 (도 2). 일부 경우에, 항원-올리고뉴클레오티드 접합체는 올리고뉴클레오티드 혼성화를 통해 리포솜성 코어에 연결된다. 즉, 올리고뉴클레오티드는 상보성 또는 부분적 상보성 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 이중체 또는 부분적 이중체를 형성한다. 이중체의 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두는 리포솜성 코어에 직접 연결되고, (지질 이중층의 바깥쪽에서) 외부에 대면하거나 또는 (내부 수성 층 내에) 내부에 있고 리포솜성 코어에 직접 연결되지 않은 항원은 이중체에서 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 리포솜성 코어와의 직접 상호작용을 통해 리포솜성 나노구조체에 접합된다 (도 3). 항원은 다음의 것들을 포함하고 이로 제한되지 않는, 하나 또는 다수의 링커 분자에 대한 접합을 통해 리포솜성 코어의 표면에 고정될 수 있다: 토코페롤, 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 및 이들의 유도체.
암 항원은 본원에서 사용될 때, 종양 또는 암 세포 표면과 연관되고, MHC 분자의 맥락에서 항원 제시 세포의 표면 상에서 발현될 때 면역 반응을 일으킬 수 있는 화합물, 예컨대 펩티드 또는 단백질이다. 암 항원은 예를 들어, 문헌[Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54: 1055]에 기재된 바와 같이 암 세포의 조질 추출물을 제조하거나, 항원을 부분적으로 정제하거나, 재조합 기술에 의해, 또는 공지의 항원의 디 노보 (de novo) 합성에 의해 암 세포로부터 제조될 수 있다. 암 항원은 재조합 발현되는 항원, 전체 종양 또는 암, 또는 그의 면역원성 부분을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그러한 항원은 단리되거나 재조합에 의해 또는 관련 기술 분야에 알려진 임의의 다른 수단에 의해 제조될 수 있다.
미생물 항원은 본원에서 사용될 때, 미생물의 항원이고, 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 항원은 무손상 미생물뿐만 아니라 천연 단리물 및 그의 단편 또는 유도체를 포함하고, 또한 천연 미생물 항원에 동일하거나 유사한 합성 화합물은 그 미생물에 대해 특이적인 면역 반응을 유도한다. 화합물은 천연 미생물 항원에 대해 (체액성 및/또는 세포성) 면역 반응을 유도하면 천연 미생물 항원에 유사하다. 상기 항원은 관련 기술분야에서 일상적으로 사용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
인간에서 발견되는 바이러스의 예는 레트로바이러스과(Retroviridae) (예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, 예컨대 HIV-1 (또한 HDTV-III, LAVE 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로 칭함); 및 다른 단리물, 예컨대 HIV-LP; 피코르나바이러스과(Picornaviridae) (예를 들어 소아마비 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키(Coxsackie) 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시바이러스과(Calciviridae) (예를 들어, 위장염을 일으키는 바이러스주); 토가바이러스과(Togaviridae) (예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라바이러스과(Flaviridae) (예를 들어 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로노바이러스과(Coronoviridae) (예를 들어 코로나바이러스); 랍도바이러스과(Rhabdoviradae) (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로바이러스과(Filoviridae) (예를 들어, 에볼라바이러스); 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) (예를 들어 인플루엔자 바이러스); 붕가바이러스과(Bungaviridae) (예를 들어 한탄(Hantaan) 바이러스, 붕가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로(Nairo) 바이러스); 아레나바이러스과(Arena viridae) (출혈열 바이러스); 레오바이러스과(Reoviridae) (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나바이러스과(Birnaviridae); 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보바이러스과(Parvovirida) (파르보바이러스); 파포바바이러스과(Papovaviridae) (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노바이러스과(Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스바이러스과(Herpesviridae) (단순 포진 바이러스 (HSV) 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 포진 바이러스; 폭스바이러스과(Poxviridae) (천연두 바이러스, 우두 바이러스, 수두 바이러스); 및 이리도바이러스과(Iridoviridae) (예를 들어 아프리카 돼지열 바이러스); 및 다른 바이러스 (예를 들어, 델타 간염의 원인체 (B형 간염 바이러스의 결함 위성체(satellite)인 것으로 생각됨), C형 간염; 노르워크(Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 둘 모두 척추 동물에서 항원으로서 역할을 한다. 그러한 그람 양성 박테리아는 파스테렐라(Pasteurella) 종, 스태필로코커스(Staphylococci) 종, 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 종을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그람 음성 박테리아는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 및 살모넬라(Salmonella) 종을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 감염성 박테리아의 구체적인 예는 헬리코박터 파일로리스(Helicobacter pyloris), 보렐레아 부르그도르페리(Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 마이코박테리아(Mycobacteria) 종 (예를 들어 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis), 엠. 아븀(M. avium), 엠. 인트라셀룰라레 (M. intracellulare), 엠. 칸사이이(M. kansaii), 엠. 고르도내(M. gordonae)), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 나이세리아 고노레아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes) (A군 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae) (B군 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 (비리단스(viridans) 군), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 (혐기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄파이로박터(Campylobacter) 종, 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 바실루스 안트락시스(Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아에(corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종, 에리시페로트릭스 루시오패티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 페르프린게르스(Clostridium perfringers), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 애로제네스(Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 멀토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실루스 모니리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 리케치아(Rickettsia), 및 액티노마이세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
진균의 예는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함한다.
다른 감염성 유기체 (즉, 원생생물)는 플라스모듐(Plasmodium) 종, 예컨대 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 및 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax) 및 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii)를 포함한다. 혈액 매개 및/또는 조직 기생충은 플라스모듐 종, 바베시아 미크로티(Babesia microti), 바베시아 디베르겐스(Babesia divergens), 레이슈마니아 트로피카(Leishmania tropica), 레이슈마니아 종, 레이슈마니아 브라질리엔시스(Leishmania braziliensis), 레이슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 트리파노소마 감비엔세(Trypanosoma gambiense) 및 트리파노소마 로데시엔세(Trypanosoma rhodesiense) (아프리카 수면병), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) (샤가스 (Chagas) 질환), 및 톡소플라스마 곤디이를 포함한다.
다른 의료 관련 미생물은 문헌에 광범하게 설명되어 있고, 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983]를 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암 항원" 및 "종양 항원"은 암세포에 의해 차별적으로 발현되고 암세포를 표적화하기 위해 이용될 수 있는 항원을 나타내기 위해 교환가능하게 사용된다. 암 항원은 잠재적으로 명백하게 종양-특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 항원이다. 이러한 항원 중 일부는, 반드시 발현되는 것은 아니지만, 정상 세포에 의해 코딩된다. 이 항원은 정상 세포에서 일반적으로 침묵하는 (즉, 발현되지 않는) 것, 특정 분화 단계에서만 발현되는 것 및 배아 및 태아 항원과 같이 일시적으로 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다. 다른 암 항원은 돌연변이 세포 유전자, 예컨대 종양 유전자 (예를 들어, 활성화된 ras 종양 유전자), 억제인자 유전자 (예를 들어, 돌연변이 p53), 내부 결실 또는 염색체 전좌에 의한 융합 단백질에 의해 코딩된다. 또 다른 암 항원은 RNA 및 DNA 종양 바이러스에 보유되는 것과 같은 바이러스 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 나노구조체는 치료 및/또는 진단 용도를 위해 생체 내에서 또는 생체 외에서 대상체에게 전달될 수 있거나, 연구 목적을 위해 시험관 내에서, 생체 외에서 또는 생체 내에서 사용될 수 있다. 별법으로, 나노구조체는 수거될 수 있는 시약, 예컨대 항체 또는 시토카인을 생성하기 위한 면역 반응을 촉발하기 위해 사용될 수 있다.
나노구조체는 생체 내 투여를 위해 단독으로 또는 임의의 적절한 제약학적 담체, 예컨대 액체, 예를 들어 염수, 또는 분말 내에서 투여될 수 있다. 나노구조체는 또한 더 큰 담체 입자와 함께 또는 투여 장치 내에서 동시에 전달될 수 있다. 나노구조체는 제제화되거나 제제화되지 않을 수 있다. 본 발명의 제제는 통상적으로 제약상 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 적합한 담체, 아주반트, 및 임의로 다른 치료 성분을 함유할 수 있는 제약상 허용되는 용액으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노구조체는 로션 (예를 들어, 아쿠아포어용)과 같은 물질과 혼합되고, 대상체의 피부에 투여되어, 나노구조체가 대상체의 피부를 통해 전달된다. 관련 기술 분야에 알려진 나노구조체의 임의의 전달 방법은 본 발명의 측면과 상용성일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 나노구조체는 멸균될 수 있다.
치료에 사용하기 위한 나노구조체의 유효량은 요구되는 세포에 나노구조체를 전달하는 임의의 방식에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 제약 조성물의 투여는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 투여 경로는 경구, 비경구, 근내, 정맥내, 피하, 점막, 비내, 설하, 기관내, 흡입, 안구, 질내, 경피, 직장, 직접 주사를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 나노구조체가 면역 자극 효과를 매개하는데 매우 효과적이라는 발견을 포함한다. 상기 나노구조체 (자극 및 조절)는 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 자가면역 질환 및 기타 장애의 치료를 위해 및 암 화학요법 후의 기회 감염 방지를 돕기 위해 면역계를 조정하도록 치료 및 예방상 유용하다.
따라서, 본 발명의 나노구조체는 알레르기 또는 천식, 감염성 유기체의 감염 또는 특정 암 항원이 확인된 암이 발생할 위험이 있는 대상체 또는 이들이 존재하는 대상체를 치료하기 위한 백신으로서 유용하다. 나노구조체는 또한 감염, 알레르기 또는 암에 대한 보호를 위해 항원 또는 알레르겐 없이 제제화될 수 있고, 이 경우에 반복 투여가 장기간 보호를 가능하게 할 수 있다. 본원에서 사용되는 위험이 있는 대상체는 감염을 일으키는 병원체 또는 암 또는 알레르겐에 노출될 임의의 위험 또는 암 발생 위험이 있는 대상이다. 예를 들어, 위험이 있는 대상체는 특정 유형의 감염 물질이 발견되는 지역으로 여행을 계획하는 대상체일 수 있거나, 생활 양식 또는 의료 절차를 통해 감염성 유기체를 포함할 수 있는 체액에 또는 직접 유기체에 노출되는 대상체 또는 심지어 감염성 유기체 또는 알레르기 항원이 확인된 지역에서 생활하는 임의의 대상체일 수 있다. 감염에 걸릴 위험이 있는 대상체는 또한 의료 기관이 특정 감염성 유기체 항원을 사용한 예방 접종을 권장하는 일반 집단을 포함한다. 항원이 알레르겐이고 대상체에서 특정 항원에 대한 알레르기 반응이 발생하고 대상체가 항원에, 즉 꽃가루가 날리는 계절에 노출될 수 있는 경우, 대상체는 항원에 노출될 위험이 있는 것이다.
감염이 존재하는 대상체는 감염성 병원체에 노출된 대상체이고, 몸에 급성 또는 만성 검출가능한 수준의 병원체를 갖는다. 나노구조체는 감염성 병원체의 수준을 감소시키거나 박멸할 수 있는 항원 특이적 전신 또는 점막 면역 반응을 유도하기 위해 항원과 함께 또는 항원 없이 사용될 수 있다. 감염성 질환은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 신체 내의 외래 미생물의 존재로부터 발생하는 질환이다. 1차적인 병원체 도입 부위인 신체의 점막 표면을 보호하기 위한 효과적인 백신 전략 및 치료법을 개발하는 것이 특히 중요하다.
암이 존재하는 대상체는 검출가능한 암세포를 갖는 대상체이다. 암은 악성 또는 비-악성 암일 수 있다. 암 또는 종양은 담도암; 뇌암; 유방암; 자궁경부암; 융모상피암; 결장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 상피내 신생물; 림프종; 간암; 폐암 (예를 들어 소세포 및 비-소세포); 흑색종; 신경모세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 육종; 피부암; 고환암; 갑상선암; 및 신장암, 및 다른 암종 및 육종을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 암은 털세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 피부 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 악성 흑색종, 편평 세포 암종, 신장 세포 암종, 전립선 암종, 방광 세포 암종, 또는 결장 암종이다.
대상체는 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 칠면조, 닭, 영장류, 예를 들어, 원숭이, 및 어류 (양식 어종), 예를 들어 연어를 포함하고 이로 제한되지 않는 인간 또는 척추동물을 의미할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 비-인간 대상체에서 암 및 종양, 감염, 자가면역 질환 및 알레르기/천식을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 감염성 질환, 자가면역 질환, 암, 알레르기, 천식 등의 질환에 대해 사용할 때 용어 치료하다, 치료된, 또는 치료하기는 질환의 발생에 대한 (예를 들어, 병원체 감염에 대한) 대상체의 저항성을 증가시키는, 또는 달리 말해서 대상체에서 질환이 발생할 (예를 들어, 병원체로 감염될) 가능성을 감소시키는 예방적 처치뿐만 아니라, 질환과 싸우거나 (예를 들어, 감염을 감소시키거나 제거하거나) 또는 질환이 악화되는 것을 방지하기 위해 대상체에서 질환이 발생한 후 시행하는 처치를 의미한다.
본 발명의 나노구조체는 항-미생물제로 코팅되거나 이와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 항-미생물제는 감염성 미생물을 죽이거나 억제할 수 있는 천연 생성 또는 합성 화합물을 의미한다. 본 발명에 따라 유용한 항-미생물제의 종류는 대상체가 감염되거나 감염될 위험이 있는 미생물의 종류에 따라 달라질 것이다. 항-미생물제는 항-박테리아제, 항-바이러스제, 항-진균제, 항-기생충제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. "항-감염제", "항-박테리아제", "항-바이러스제", "항-진균제", "항-기생충제" 및 "구충제"와 같은 문구는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 확립된 의미를 갖고, 표준 의학 교재에 정의되어 있다. 간단히 설명하면, 항-박테리아는 박테리아를 죽이거나 억제하고, 항생제 및 유사한 기능을 갖는 다른 합성 또는 천연 화합물을 포함한다. 항생제는 미생물과 같은 세포에 의한 2차 대사산물로서 생산되는 저분자량 분자이다. 일반적으로, 항생제는 하나 이상의 박테리아 기능 또는 미생물에 특이하고 숙주 세포에 존재하지 않는 구조를 저해한다. 항-바이러스제는 천연 공급원으로부터 단리되거나 합성되고, 바이러스를 죽이거나 억제하는 데 유용하다. 항-진균제는 표재성 진균 감염 및 기회 및 일차 전신 진균 감염을 치료하는 데 사용된다. 항-기생충제는 기생충을 죽이거나 억제한다.
또한, 본 발명의 나노구조체는 일부의 면역 인자의 수준이 감소되도록 면역 반응을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 선행 기술은 일반적으로 면역 반응을 광범위하게 하향조절함으로써 작용하기 때문에, 특이적인 면역 하향조절 또는 "관용성"을 달성하는 것은 상당한 도전이다. 이러한 비특이적 방법은 특히 부작용의 높은 빈도, 독성, 전염병 발생 위험 증가를 초래할 수 있다. 병원에서 효능있고 특이적인 항-염증 효과를 유도할 수 있는 능력을 보인 상업적으로 이용가능한 화합물 또는 구조체는 존재하지 않는다. 직면하게 되는 문제점은 추가의 동시-자극 신호의 부재 하에서 항원과 같은 적절한 신호를 면역 세포에 전달하는 것이다.
본 발명의 나노구조체는 선행 기술에 의해 발생하는 일부의 상기 문제를 해결한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용성을 달성하거나 촉진하는 방식으로 본 발명의 나노구조체에 대한 접합을 통해 세포 내로 효율적으로 전달될 수 있다. 방법은 항원-특이적 관용성을 유도하는 능력을 향상시키기 위하여 항원 전달 과정 동안 toll-유사 수용체를 길항하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에 사용되는 나노구조체는 면역 억제인자, 예컨대 TLR4 면역 억제인자에 부착된 리포솜성 코어 및 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
이러한 조절성 나노구조체는 면역 반응을 하향조절하는 데 유용하거나 또는 언제나 관용성을 유도하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 자가면역 질환, 알레르기, 천식, 또는 병적 측면의 요소가 간 섬유증 또는 특발성 폐 섬유증과 같은 과도한 면역 반응을 수반하는 다른 병태를 치료 및 예방하는데 유용하다.
알레르기를 갖는 대상체는 알레르겐에 반응한 알레르기 반응이 존재하거나 발생할 위험이 있는 대상체이다. 알레르기는 물질 (알레르겐)에 대한 후천적 과민증을 의미한다. 알레르기 병태는 습진, 알레르기 비염 또는 코감기, 건초열, 결막염, 기관지 천식, 두드러기 및 식품 알레르기, 및 다른 아토피 병태를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
알레르겐은 감수성 대상체에서 알레르기 또는 천식 반응을 유도할 수 있는 물질 (항원)을 의미한다. 알레르겐의 리스트는 매우 많고, 꽃가루, 곤충 독, 동물의 비듬, 곰팡이 포자 및 약물 (예를 들어, 페니실린)을 포함할 수 있다. 천연 동물 및 식물 알레르기의 예는 다음 속에 특이적인 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 카닌(Canine) (카니스 파밀리아리스(Canis familiaris)); 데르마토파고이데스(Dermatophagoides) (예를 들어 데르마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae)); 펠리스(Felis) (펠리스 도메스티쿠스(Felis domesticus)); 암브로시아(Ambrosia) (암브로시아 아르테미이스폴리아(Ambrosia artemiisfolia)); 롤륨(Lolium) (예를 들어, 롤륨 페레네(Lolium perenne) 또는 롤륨 멀티플로룸(Lolium multiflorum)); 크립토메리아(Cryptomeria) (크립토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica)); 알테르나리아(Alternaria) (알테르나리아 알테르나타(Alternaria alternata)); 알데르(Alder); 알누스(Alnus) (알누스 굴티노아사(Alnus gultinoasa)); 베툴라(Betula) (베툴라 베루코사(Betula verrucosa)); 퀘르쿠스(Quercus) (퀘르쿠스 알바(Quercus alba)); 올레아(Olea) (올레아 유로파(Olea europa)); 아르테미시아(Artemisia) (아르테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris)); 플란타고(Plantago) (예를 들어, 플란타고 란세올라타(Plantago lanceolata)); 파리에타리아(Parietaria) (예를 들어 파리에타리아 오피시날리스(Parietaria officinalis) 또는 파리에타리아 주다이카(Parietaria judaica)); 블라텔라(Blattella) (예를 들어 블라텔라 게르마니카(Blattella germanica)); 아피스(Apis) (예를 들어 아피스 멀티플로룸(Apis multiflorum)); 쿠프레수스(Cupressus) (예를 들어 쿠프레수스 셈페르비렌스(Cupressus sempervirens), 쿠프레수스 아리조니카(Cupressus arizonica) 및 쿠프레수스 마크로카르파(Cupressus macrocarpa)); 주니페루스(Juniperus) (예를 들어 주니페루스 사비노이데스(Juniperus sabinoides), 주니페루스 비르기니아나(Juniperus virginiana), 주니페루스 코무닌스(Juniperus communis) 및 주니페루스 아쉐이(Juniperus ashei)); 투야(Thuya) (예를 들어 투야 오리엔탈리스(Thuya orientalis)); 카마에시파리스(Chamaecyparis) (예를 들어 카마에시파리스 옵투사(Chamaecyparis obtusa)); 페리플라네타(Periplaneta) (예를 들어 페리플라네타 아메리카나(Periplaneta americana)); 아그로피론(Agropyron) (예를 들어 아그로피론 레펜스(Agropyron repens)); 세칼레(Secale) (예를 들어 세칼레 세레알레(Secale cereale); 트리티쿰(Triticum) (예를 들어 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)); 닥틸리스(Dactylis) (예를 들어 닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)); 페스투카(Festuca) (예를 들어 페스투카 엘라티오르(Festuca elatior)); 포아(Poa) (예를 들어 포아 프라텐시스(Poa pratensis) 또는 포아 콤프레사(Poa compressa)); 아베나(Avena) (예를 들어 아베나 사티바(Avena sativa)); 홀쿠스(Holcus) (예를 들어 홀쿠스 라나투스 (Holcus lanatus)); 안톡산툼(Anthoxanthum) (예를 들어 안톡산툼 오도라툼(Anthoxanthum odoratum)); 아레나테룸(Arrhenatherum) (예를 들어 아레나테룸 엘라티우스(Arrhenatherum elatius)); 아그로스티스(Agrostis) (예를 들어 아그로스티스 알바(Agrostis alba)); 플레움(Phleum) (예를 들어 플레움 프라텐세(Phleum pratense)); 팔라리스(Phalaris) (예를 들어 팔라리스 아룬디나세아(Phalaris arundinacea)); 파스팔룸(Paspalum) (예를 들어 파스팔룸 노타툼(Paspalum notatum)); 소르굼(Sorghum) (예를 들어 소르굼 할레펜시스(Sorghum halepensis)); 및 브로무스(Bromus) (예를 들어 브로무스 이네르미스(Bromus inermis)).
자가면역 질환은 대상체 자신의 항체가 숙주 조직과 반응하거나 면역 이펙터 T 세포가 내인성 자가 펩티드에 자기 반응성이고, 조직 파괴를 유도하는 질환의 종류이다. 따라서 면역 반응은 자가 항원으로 언급되는 대상체 자신의 항원에 대해 유도된다. 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 크론 (Crohn) 병, 다발성 경화증, 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증 (MG) 근무력증, 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 굿패스쳐 (Goodpasture) 증후군, 천포창 (예를 들어, 심상성 천포창), 그레이브 (Grave) 병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 항-콜라겐 항체 존재 경화증, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 근염, 악성 빈혈, 특발성 애디슨 (Addison) 병, 자가면역 관련 불임, 사구체신염 (예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 수포성 유천포창, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 인슐린 저항성, 및 자가면역 당뇨병을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"자가-항원"은 본원에서 사용될 때 정상 숙주 조직의 항원을 나타낸다. 정상 숙주 조직은 암세포를 포함하지 않는다. 따라서, 자가면역 장애의 측면에서 자가-항원에 대해 유도된 면역 반응은 바람직하지 않은 면역 반응이고, 정상 조직의 파괴 및 손상에 기여하는 반면, 암 항원에 대해 유도된 면역 반응은 바람직한 면역 반응이고, 종양 또는 암의 파괴에 기여한다. 따라서, 자가면역 장애의 치료를 목적으로 하는 본 발명의 일부 측면에서, 나노구조체는 자가 항원, 특히 자가면역 장애의 표적인 항원과 함께 제제화하는 것은 권장되지 않는다.
다른 예에서, 나노구조체는 자가-항원을 소량 포함할 수 있다. 많은 동물 연구는 낮은 용량의 항원의 점막 투여가 면역 과다반응성 또는 "관용"의 상태를 유발할 수 있음을 증명하고 있다. 활성 메커니즘은 Th1로부터 우세한 Th2 및 Th3 (즉, TGF-β 우세) 반응을 향한 시토카인 매개 면역 편위 (immune deviation)인 것으로 보인다. 또한, 저용량 항원 전달을 사용한 활성 억제는 자가면역 질환, 예를 들어, 류마티스성 관절염 및 SLE의 치료시에 상당한 관심을 끄는 비관련된 면역 반응을 억제할 수 있다 (방관자 억제 (bystander suppression)). 방관자 억제는 염증유발성 및 Th1의 시토카인이 항원-특이적 또는 항원-비특이적 방식으로 방출되는 국소 환경에서 Th1-역조절성 억제 시토카인의 분비를 수반한다. 본원에서 사용되는 "관용성"은 상기 현상을 나타내기 위해 사용된다. 실제로, 경구 관용성은 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 실험적 자가면역 중증 근무력증, 콜라겐-유도 관절염 (CIA), 인슐린 의존형 당뇨병을 포함하는 동물의 많은 자가면역 질환의 치료에서 효과적이었다. 상기 모델에서, 자가면역 질환의 예방 및 억제는 항원-특이적 체액성 및 세포성 반응의 Th1로부터 Th2/Th3 반응으로의 변화와 연관된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 앞서 논의된 하나 이상의 조성물을 포함하는 키트 (kit)에 관한 것이다. "키트"는 본원에서 사용될 때, 일반적으로 하나 이상의 본 발명의 조성물, 및/또는 예를 들어, 앞서 설명된 바와 같은 본 발명과 연관된 다른 조성물을 포함하는 패키지 (package) 또는 조립체 (assembly)를 규정한다. 키트의 각각의 조성물은 존재하는 경우에, 액체 형태 (예를 들어, 용액)로, 또는 고체 형태 (예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에, 일부 조성물은 예를 들어, 키트에 제공될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종류의 첨가에 의해 구성가능하거나 달리 (예를 들어, 활성 형태로) 처리될 수 있다. 본 발명과 연관될 수 있는 다른 조성물의 예는 예를 들어 샘플 및/또는 대상체에 대한 특정 용도를 위한 조성물 성분의 사용, 투여, 변형, 조립, 저장, 포장, 제조, 혼합, 희석, 및/또는 보존을 위한 용매, 계면활성제, 희석제, 염, 완충제, 유화제, 킬레이팅제, 충전제, 항산화제, 결합제, 증량제, 보존제, 건조제, 항미생물제, 바늘, 시린지, 포장재, 튜브, 병, 플라스크, 비이커, 접시, 프릿 (frit), 필터, 고리, 클램프, 랩, 패치, 용기, 테이프, 접착제 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 키트는 나노구조체의 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 키트는 리포솜 코어를 형성하기 위한 리포솜, 면역 자극제 또는 TLR4 면역 억제인자 및/또는 나노구조체의 외부를 위한 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 키트는 또한 하나 이상의 항원 및/또는 다른 치료제를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 일부 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 설명서가 본 발명의 조성물과 연관됨을 인식하는 방식으로 본 발명의 조성물과 함께 제공되는 임의의 형태의 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 설명서는 키트와 연관된 조성물 및/또는 다른 조성물의 사용, 변형, 혼합, 희석, 보존, 투여, 조립, 저장, 포장, 및/또는 제조를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 설명서는 또한 예를 들어 샘플에 대한 특정 용도를 위한 조성물의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 상기 설명서를 보유하기 적합한 매체로서 인지가능한 임의의 형태, 예를 들어, 임의의 방식으로 제공되는 서면 또는 출판, 구두, 청각 (예를 들어, 전화), 디지탈, 광학, 시각 (예를 들어, 비디오테이프, DVD 등) 또는 전자 통신 수단 (인터넷 또는 웹-기반 통신 수단 포함)으로 제공될 수 있다.
실시예
본원에서 설명되는 본 발명을 보다 충분히 이해될 수 있도록, 다음 실시예가 제시된다. 본원에서 설명되는 실시예는 본원에서 제시되는 화합물, 제약 조성물, 및 방법을 예시하기 위해 제공되고, 그 범위를 제한하는 것으로 어떠한 방식으로도 해석되지 않아야 한다.
실시예 1.
실시를 위해 변형된 한 실시양태에서, 서열 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (서열식별번호 (SEQ ID NO): 1; "CpG 1826"으로 지정됨)의 올리고뉴클레오티드를 알파-토코페롤로 3'-변형시키고, (8% w/w) 모노포스포릴 지질 A와 혼합된 (92% w/w) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (DOPC)으로 이루어진 작은 단일층 소포 내에 도입하였다 (도 1). 하위-실시양태에서, 이들 구조는 난알부민-올리고 구축물의 왓슨-크릭형 혼성화를 통해 모델 단백질 항원인 난알부민과 접합되고, 여기서 올리고 부분은 CpG 1826 (5'-AACGTCAGGAACGTCATGGA-3', 서열식별번호: 2)에 상보성이었다 (도 2). 여기서 올리고뉴클레오티드는 TLR9를 자극하는 그의 능력을 기초로 하여 선택하고, MPLA는 TLR4를 자극하는 그의 능력을 기초로 하여 선택하였다.
리포솜성 SNA (나노구조체) 합성
4 mL 디클로로메탄 (DCM)에 용해된 25 mg의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (DOPC)을 유리 용기 내의 1 mL의 클로로포름에 용해된 1 mg 모노포스포릴 지질 A (MPLA)와 혼합하였다. 이어서, 지질을 모든 용매가 증발할 때까지 아르곤 하에서 서서히 건조하여, 얇은 필름 내의 유리 용기의 벽 상에 건조하였다. 임의의 잔류 용매는 밤새 동결건조에 의해 제거하였다. 다음 날, 지질을 볼텍싱 및 초음파 처리에 의해 10 mL의 리포솜 완충제 (150 mM NaCl, 20 mM HEPES)에 재구성한 후, 2-5회의 동결 해동 사이클을 통과시키고, 100 nm, 50 nm, 이어서 30 nm 압출 막을 통한 연속적인 압출을 수행하였다. 압출 후에, 3'-알파-토코페롤기가 공유 부착된 1 μmol의 올리고뉴클레오티드 (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3', 서열식별번호: 1)를 26 mg의 지질과 혼합하고, 4℃에서 인큐베이팅하여 리포솜성 SNA를 형성시켰다. 다음 날, 리포솜성 SNA는 1x PBS의 >5 부피 교환을 사용하여 300 kDa 막 컷오프 (cutoff) 필터에 의한 접선 유동 여과에 의해 정제하였다.
일부 리포솜성 SNA는, 난알부민을 먼저 CpG 1826에 상보성인 올리고뉴클레오티드 (5'-AACGTCAGGAACGTCATGGA-3', 서열식별번호: 2)에 접합시킴으로써 난알부민을 함유하도록 추가로 변형시켰다. 이어서, 상기 난알부민-올리고뉴클레오티드 접합체는, 리포솜성 SNA 상의 올리고뉴클레오티드에 비해 2배 과량의 난알부민-올리고뉴클레오티드 접합체를 3시간 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이팅함으로써 리포솜성 SNA에 혼성화시켰다. 과량의 난알부민-올리고뉴클레오티드 접합체는 접선 유동 여과에 의해 제거하였다.
시험관내 시험
화합물을 1:4로 연속 희석하였다. 20 ㎕의 상기 혼합물을 96 웰 플레이트 내에 이중으로 접종하였다. NF-kB 유도가능한 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP)를 함유하는 RAW 264.7 세포로부터 유래된 수용체 뮤린 대식세포 세포주인 RAW 블루 세포 (인비보젠(InVivoGen))를 웰당 180 ㎕ 내에 100k 세포/웰로 접종하고, 96 웰 플레이트 상에서 시험 화합물에 첨가하였다. NF-kB 유도가능 SEAP를 함유하는 라모스 세포로부터 유래된 수용체 인간 B 세포주로부터 유래된 라모스 블루 세포 (인비보젠)를 웰당 180 ㎕ 내에 306k 세포/웰로 접종하고, 96 웰 플레이트 상에서 시험 화합물에 첨가하였다. 중요하게는, 라모스 블루 세포는 TLR4를 통한 기능적 신호전달을 갖지 않는다. 세포는 가습 챔버에서 37℃, 5% CO2에서 시험 화합물과 함께 밤새 인큐베이팅하였다. 다음 날, 상청액을 제조사의 권장 프로토콜에 따라 콴티블루 (QuantiBlue) 시약 (인비보젠)을 사용하여 SEAP 활성에 대해 프로빙하였다. 결과는 TLR4 및 TLR9 둘 모두의 효능제를 보유하는 리포솜성 SNA가 그 단독의 경우보다 RAW 블루 세포의 더 큰 활성화를 유도함을 보여준다 (도 4). 중요하게는, 결과는 MPLA를 함유하는 리포솜성 SNA에 의한 NF-kB의 활성화가 기능적 TLR4에 의존함을 보여주고, 이것은 라모스 블루 세포주가 아니라 RAW 블루 세포주가 자극에 반응하여 NF-kB 활성화를 보이기 때문이다 (도 5).
TLR9 및 TLR4 효능제 둘 모두를 함유하는 리포솜성 SNA에 의해 촉발되는 반응을 추가로 프로파일링하기 위해, 리포솜성 SNA가 MyD88-의존성 및 MyD88-비의존성 경로의 활성화를 유도하는 능력을 각각 TNF 및 IFN-알파의 활성화 수준에 의해 측정하여 시험하였다. 이를 위해, 6백만 개의 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 내에 1백만/mL로 재현탁하고, 20 ㎕의 시험 화합물로 180k/웰로 접종하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 상청액을 ELISA에 의해 TNF 및 IFN-알파 수준에 대해 프로빙하였다. 결과는 CpG 1826 및 MPLA 둘 모두를 단일 구축물로 전달한 리포솜성 SNA가, 각각 별개로 전달함으로써, 또는 두 성분을 동일한 구축물 상에 존재하는 것이 아니라 동일한 웰에서 전달함으로써 복제될 수 없는 증가된 TNF 및 IFN-알파 수준을 나타냄을 보여준다 (도 6). TLR9를 활성화하지 않은 서열 ("CTL-ps"로 지정됨: 5'-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT-3', 서열식별번호: 3)을 사용하여 리포솜성 SNA를 구축한 경우에도, MPLA의 향상된 활성이 관찰되었고 (도 7), 이것은 리포솜성 SNA가 MPLA를 리포솜성 제제보다 더 효율적으로 전달함을 제시한다.
다음으로, 리포솜성 SNA의 효능을 조정할 수 있는 파라미터를 확인하였다. 리포솜성 제제 단계 내로의 MPLA 공급물의 양 및 뉴클레오티드간 연결 화학 (PO vs PS)이 일정 기능을 수행할 수 있다. 따라서, MPLA 공급을 3.8% (w/w)로부터 11.5% (w/w)로 증가시키고 PO 및 PS 연결 둘 모두를 함유하는 구축물을 사용하여 리포솜성 SNA를 개발하고, 이를 RAW 블루 세포에서 활성에 대해 시험하였다. 상기 세포주에서, MPLA 공급을 7.7%까지 증가시키면 리포솜성 SNA의 활성화의 효능이 증가하지만, MPLA 공급을 11.5%까지 증가시키면 그렇지 않음이 관찰되었다 (도 8). RAW 블루 세포에서, 리포솜성 SNA의 효능의 변화가 관찰되었고 최대 자극에서는 변화가 관찰되지 않았지만 (도 9), 이것은 종에 의존성일 것으로 예상된다.
마지막으로, 항원-접합된 리포솜성 SNA가 면역 세포를 활성화하는 능력을 시험하였다. 난알부민 로딩된 리포솜성 SNA를 콴티블루 검정에 의해 프로빙된 SEAP의 수준에서 밤새 RAW 블루 세포를 사용하여 설명한 바와 같이 인큐베이팅하였다. 리포솜성 SNA에 대한 항원의 접합은 그 활성을 증가시키는 것으로 보였다 (도 10). 이것은 난알부민에 부착된, CpG 1826과 이중체를 형성한 상보성 올리고뉴클레오티드에 의해 도입된 추가의 CpG 모티프의 존재 때문에 발생할 가능성이 있다.
생체내 시험
상기 형태의 항원 전달은 시험관 내에서 면역 자극 효과의 보다 강력한 유도를 일으키고 (도 10), 효과적인 항원 처리 및 제시를 유도하여, 생체 내에서 항-종양 면역 반응의 효과적인 유도를 일으키는 (도 11-12) 것으로 나타났다.
C57BL/6 마우스 (N=4/군)를 모델 항원으로 난알부민을 사용하여 0일 및 21일에 표시된 제제로 면역화하였다 (200 ㎕ s.c., 100 ㎍의 난알부민 동등 용량) (도 11). 28일에, 비장을 회수하고, 1 μM의 OVA (257-264)와 함께 IFN-γ ELISPOT 플레이트상에서 밤새 인큐베이팅하였다. IFN-y 스팟의 수는 자동 ELISPOT 계수기를 사용하여 정량하였다. 이 연구는 SNA가 자유 PS 올리고 및 명반보다 더 효과적으로 세포 반응을 유도함을 보여준다. *p<0.05, NS=비-유의성.
또 다른 실험에서, C57BL/6 마우스 (N=11/군)에게 0일에 1x106 E.G7-OVA 세포 (ATCC #CRL-2113)를 접종한 후, 3, 7, 10일에 나타낸 화합물로 처리하였다 (200 ㎕ s.c., 100 ㎍의 난알부민 동등 용량). 종양 부피는 피하 종양의 길이 및 폭을 측정하고 다음 식을 적용함으로써 계산하였다: 종양 부피 = (길이) x (폭) x (폭)/2. 결과는종양 부하의 유의한 (95%) 감소의 증거와 함께 생체 내에서 항원에 대한 강한 세포 반응의 활성화를 입증한다 (도 12).
청구항에서, 관사, 예컨대 "a", "an" 및 "the"는 반대로 표시되거나 문맥상 달리 명확하지 않는 한 하나 이상을 의미할 수 있다. 그룹의 하나 이상의 멤버 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 반대로 표시되거나 문맥상 달리 명확하지 않는 한, 하나의, 하나 초과의 또는 모든 그룹의 멤버가 제시된 제품이나 공정에 존재하거나, 사용되거나 달리 관련된다면 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹의 단 하나의 멤버가 제시된 제품이나 공정에 존재하거나, 사용되거나 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 하나 초과의 또는 모든 그룹의 멤버가 제시된 제품이나 공정에 존재하거나, 사용되거나 달리 관련되는 실시양태를 포함한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 나열된 청구항으로부터 하나 이상의 제한, 요소, 절 및 서술 용어가 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 및 치환을 포함한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 의존하는 임의의 청구항은 동일한 독립항에 의존하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로, 예를 들어 마커쉬 (Markush) 그룹 형식으로 제시되는 경우, 요소의 각질 표면 하위 그룹이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)이 그룹으로부터 제거될 수 있다. 본 발명 또는 본 발명의 측면은 일반적으로 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정 요소 및/또는 특징을 포함하는 것으로 언급될 경우, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 측면은 본 발명의 상기 요소 및/또는 특징으로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이로 이루어지는 것을 이해되어야 한다. 단순화를 위해, 실시양태는 본원에서 구체적으로 이들 용어로 제시되어 있지 않다. 또한, 용어 "포함하는", "함유하는"은 개방적인 용어로서, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용하는 것이 의도된다. 범위가 제시될 경우, 종점이 포함된다. 또한, 달리 표시되거나 또는 문맥 및 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 이해로부터 달리 분명하지 않으면, 범위로 표현되는 값은 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 그 범위의 하한의 단위의 1/10까지 본 발명의 다른 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 가정할 수 있다.
본원은 그 모두가 본원에 참고로 포함되는 다양한 등록된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 논문, 및 기타 간행물을 말한다. 임의의 포함된 참고 문헌과 본원 명세서 사이에 상충 관계가 존재하는 경우, 명세서가 우선한다. 또한, 선행 기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 제외될 수 있다. 이러한 실시양태는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 그 배제가 명시적으로 본원에 제시되지 않은 경우에도 제외될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 선행 기술의 존재와 관련있는지의 여부와 무관하게 어떠한 이유로든 임의의 청구항으로부터의 제외될 수 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에서 설명되는 특정 실시양태의 많은 균등물을 통상의 실험을 벗어난 실험을 사용하지 않고 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본원에 개시된 본 실시양태의 범위는 상기 설명으로 제한되지 않고, 첨부되는 청구 범위에 제시된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 대한 다양한 변경 및 수정이 다음 청구범위에 정의된 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AuraSense, LLC <120> MULTIVALENT DELIVERY OF IMMUNE MODULATORS BY LIPOSOMAL SPHERICAL NUCLEIC ACIDS FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC APPLICATIONS <130> A1107.70003WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/007,528 <151> 2014-06-04 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 aacgtcagga acgtcatgga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 tccatgagct tcctgagctt 20 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 ccgucuguug ugugacuc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 gccaccgagc cgaaggcacc 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 uauauauaua uauauauaua 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 uuauuauuau uauuauuauu 20 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 9 uuuuauuuua uuuuauuuua 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 10 ugugugugug ugugugugug 20 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 11 uuguuguugu uguuguuguu 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 12 uuuguuuguu uguuuguuug 20 <210> 13 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 13 uuauuuauuu auuuauuuau uuau 24 <210> 14 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 14 uuguuuguuu guuuguuugu uugu 24 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 15 gcccgucugu ugugugacuc 20 <210> 16 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 16 guccuucaag uccuucaa 18 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 17 tccatggacg ttcctgagcg tt 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 18 tcgtcgttcg aacgacgttg at 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 19 tcgtcgacga tccgcgcgcg cg 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 20 ggggtcaacg ttgagggggg 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 21 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 22 tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 23 gggggacgat cgtcgggggg 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 24 ggggacgacg tcgtgggggg g 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 25 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 26 tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

Claims (66)

  1. 면역 자극제 또는 면역 억제인자가 회합된 지질 이중층을 갖는 리포솜성 코어, 및 리포솜성 코어의 외부에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 나노구조체.
  2. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 외피를 형성하는 것인 나노구조체.
  3. 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 외피가 적어도 하나의 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것인 나노구조체.
  4. 제3항에 있어서, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드가 TLR 효능제인 나노구조체.
  5. 제3항에 있어서, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드가 TLR 길항제인 나노구조체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, TLR이 TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, 및 TLR13으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 나노구조체.
  7. 제3항에 있어서, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드가 RIG-I 효능제인 나노구조체.
  8. 제3항에 있어서, 패턴 인식 수용체 조정 올리고뉴클레오티드가 RIG-I 길항제인 나노구조체.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 외피가 올리고뉴클레오티드 및 담체 분자로 구성되는 것인 나노구조체.
  10. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 외피가 전적으로 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것인 나노구조체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것인 나노구조체.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것인 나노구조체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 키메라 RNA-DNA 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것인 나노구조체.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 키메라 RNA-DNA 올리고뉴클레오티드의 조합물로 구성되는 것인 나노구조체.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드가 구조적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 갖는 것인 나노구조체.
  16. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드가 적어도 2개의 구조적으로 상이한 올리고뉴클레오티드를 갖는 것인 나노구조체.
  17. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드가 2-10개의 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 나노구조체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 갖는 것인 나노구조체.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결을 갖지 않는 것인 나노구조체.
  20. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 나노구조체.
  21. 제20항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드가 A-클래스, B-클래스 및 C-클래스 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 나노구조체.
  22. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 면역자극성 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA를 포함하는 것인 나노구조체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 나노구조체의 외면에 노출되는 것인 나노구조체.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 나노구조체의 외면에 노출되는 것인 나노구조체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 리포솜성 코어에 직접 연결되는 것인 나노구조체.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 링커를 통해 리포솜성 코어에 간접적으로 연결되는 것인 나노구조체.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 하나 초과의 링커를 통해 리포솜성 코어에 간접적으로 연결되는 것인 나노구조체.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 링커가 토코페롤, 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 포화 C8-C22 지방산, 글리세롤의 포화 C8-C22 에테르 유도체, C8-C22 지방산의 포화 및 불포화 아미드 유도체 및 모노- 및 1,2- 또는 1,3-디-아미노 글리세롤 및 그의 유도체 중 하나 이상의 링커인 나노구조체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 2-1,000개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 나노구조체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜성 코어가 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 포화 C8-C22 지방산, 글리세롤의 포화 C8-C22 에테르 유도체, 및 C8-C22 지방산의 포화 및 불포화 아미드 유도체 및 모노- 및 1,2- 또는 1,3-디-아미노 글리세롤 및 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 것인 나노구조체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜성 코어가 한 종류의 지질을 포함하는 것인 나노구조체.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜성 코어가 2-10개의 상이한 지질을 포함하는 것인 나노구조체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 자극제가 모노포스포릴 지질 A, 박테리아 기원의 지질 A, 22:0 트레할로스, 디메틸디옥타데실-암모늄, Kdo2 지질 A, IP3(1,3,4), IP3(1,3,5), IP3(1,4,5), IPR(1,3,4,5)를 포함하는 이노시톨 포스페이트, LPA/S1P 수용체 선택적 효능제, PAF 및 PAF 유사체, 리포뉴클레오티드, 시클릭 LPA, 생물활성 세라미드, 엔도칸나비노이드, 아난다미드, 지질 산화 생성물, 디아실글리세롤 포스페이트, 박테리아 막 지질, N-아실글리신 지질, 아실 카르니틴 지질, 미콜산, 식물 지질 추출물, FSL-1, PAM3CSK4, HKLM, LPS, FLA-ST, 이미퀴모드, 레시퀴모드, C12-IE-DAP, L18-MDP toll 유사 수용체 효능제, NOD 수용체 효능제, 및 염증유발성 면역 수용체 효능제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 나노구조체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 추가로 포함하는 나노구조체.
  35. 제34항에 있어서, 항원이 나노구조체와 함께 혼합되는 것인 나노구조체.
  36. 제34항에 있어서, 항원이 올리고뉴클레오티드 외피에 직접 연결되는 것인 나노구조체.
  37. 제34항에 있어서, 항원이 올리고뉴클레오티드 외피에 링커를 통해 간접적으로 연결되는 것인 나노구조체.
  38. 제34항에 있어서, 항원이 리포솜성 코어에 직접 연결되는 것인 나노구조체.
  39. 제34항에 있어서, 항원이 링커를 통해 리포솜성 코어에 간접적으로 연결되는 것인 나노구조체.
  40. 제34항에 있어서, 항원-올리고뉴클레오티드 접합체가 올리고뉴클레오티드 혼성화를 통해 리포솜성 코어에 연결되는 것인 나노구조체.
  41. 제1항에 있어서, 면역 자극제가 리포솜성 코어 내에 포매됨으로써 리포솜성 코어와 회합되는 것인 나노구조체.
  42. 제1항에 있어서, 면역 자극제가 리포솜성 코어에 간접적으로 연결됨으로써 리포솜성 코어와 회합되는 것인 나노구조체.
  43. 제1항에 있어서, 면역 자극제가 리포솜성 코어에 직접 연결됨으로써 리포솜성 코어와 회합되는 것인 나노구조체.
  44. 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드가 방사상으로 바깥쪽으로 향하는 것인 나노구조체.
  45. 제37항 또는 제39항에 있어서, 링커가 토코페롤, 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 스핑고신 포스페이트, 메틸화 스핑고신 및 스핑가닌, 세라미드, 세라미드 포스페이트, 1-0 아실 세라미드, 디히드로세라미드, 2-히드록시 세라미드, 스핑고미엘린, 글리코실화 스핑고지질, 술파티드, 강글리오시드, 포스포스핑고지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 피토스핑고신 및 이들의 유도체, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티드산, 리소포스파티드산, 시클릭 LPA, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 이노시톨 포스페이트, LPI, 카르디오리핀, 리소카르디오리핀, 비스(모노아실글리세로) 포스페이트, (디아실글리세로) 포스페이트, 에테르 지질, 디피타닐 에테르 지질, 및 다양한 길이 및 포화 상태의 플라스말로겐, 및 이들의 유도체, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 14-데메틸-라노스테롤, 콜레스테롤 술페이트, DHEA, DHEA 술페이트, 14-데메틸-14-데히드로라노스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 에테르 음이온성 지질, 에테르 양이온성 지질, 란타나이드 킬레이팅 지질, A-고리 치환된 옥시스테롤, B-고리 치환된 옥시스테롤, D-고리 치환된 옥시스테롤, 측쇄 치환된 옥시스테롤, 이중 치환된 옥시스테롤, 콜레스탄산 유도체, 플루오르화 스테롤, 형광 스테롤, 술폰화 스테롤, 인산화된 스테롤, 및 상이한 길이 및 포화 상태의 다가불포화 스테롤, 포화 C8-C22 지방산, 글리세롤의 포화 C8-C22 에테르 유도체, 및 C8-C22 지방산의 포화 및 불포화 아미드 유도체 및 모노- 및 1,2- 또는 1,3-디-아미노 글리세롤 및 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 나노구조체.
  46. 제34항에 있어서, 항원이 내부 수성 층에서 리포솜성 코어 내에 캡슐화되는 것인 나노구조체.
  47. 제34항에 있어서, 항원이 올리고뉴클레오티드 외피의 올리고뉴클레오티드에 비공유 부착되는 것인 나노구조체.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원, 기생충 항원, 합텐, 및 알레르겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 나노구조체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 나노구조체가 자기조립형 나노구조체인 나노구조체.
  50. 대상체에게 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 핵산 나노구조체를 면역 반응 촉진에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 치료 방법.
  51. 제50항에 있어서, 대상체에 장애가 존재하고, 방법이 장애의 치료 방법인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 장애가 암인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 장애가 감염성 질환인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 감염성 질환이 바이러스 감염인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 감염성 질환이 박테리아 감염인 방법.
  56. 제51항에 있어서, 장애가 알레르기인 방법.
  57. 제51항에 있어서, 장애가 천식인 방법.
  58. 제51항에 있어서, 장애가 자가면역 질환인 방법.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 프로토콜을 대상체에게 시행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 치료 프로토콜이 수술인 방법.
  61. 제59항에 있어서, 치료 프로토콜이 방사선 요법인 방법.
  62. 제59항에 있어서, 치료 프로토콜이 약물인 방법.
  63. 제51항에 있어서, 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제51항에 있어서, 나노구조체가 표적화 분자와 회합되는 것인 방법.
  65. 제51항에 있어서, 나노구조체가 경구, 비내, 설하, 정맥내, 피하, 점막, 호흡기, 직접 주사, 관장, 및 피내로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로에 의해 전달되는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 산 나노구조체를 포함하는, 질환 치료에 사용하기 위한 조성물.
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