JP2019521652A - 球状核酸のｔｌｒ９アゴニスト - Google Patents

Abstract

本発明の側面は、リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるＣｐＧオリゴヌクレオチドをもつオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体から構成される球状核酸（ＳＮＡ）の組成物に関する。本発明はまた、対象を処置する方法にも、および本明細書に記載の組成物を使用して対象におけるサイトカインの発現を誘発する方法にも関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１６年５月６日に出願された米国仮出願シリアル番号62/333,074の35 U.S.C.§119（e）下での優先権を主張するものであり、本明細書中にその全内容は、参照によって組み込まれる。

発明の背景
トール様受容体（ＴＬＲ）９は、エンドソームの受容体であって、ＤＮＡ中の非メチル化ＣＧモチーフ（ＣｐＧ）を認識し、Ｔｈ１型免疫応答を刺激する。先に同定された合成オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９アゴニストは、直鎖または分枝オリゴヌクレオチドである。直鎖オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９アゴニストは、配列特性および生物的効果の組み合わせに基づいて、大きく３つのクラスに分けられる。ＡクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（ＰＯ）骨格とともに中心に自己相補的な領域、およびホスホロチオアート（ＰＳ）連結とともに５’および３’末端の反復≧３個のＧを有し、高レベルのＩＦＮα生成を刺激するが、ＮＦ−κＢの低活性化を刺激する。ＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＰＳ骨格、最小限の自己相補性を有し、低レベルのＩＦＮαを刺激するが、ＮＦ−κＢの高活性化を刺激する。ＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＰＳ骨格および高い自己相補性を有し、中程度のレベルのＩＦＮαおよびＮＦ−κＢを誘発する。直鎖オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９アゴニストは、ＴＬＲ９の活性化のために、配列のモチーフおよび長さの厳密な要件を有し、典型的には、ＢおよびＣクラスのオリゴヌクレオチドのために２４ヌクレオチド長を、およびヒトＴＬＲ９の最適な活性化のために５’ＴＣＧを要求する。

いくつかの側面において、本発明は、リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体を包含する球状核酸（spherical nucleic acid)（ＳＮＡ）であり、ここでＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、４〜１６ヌクレオチド長であるか、および／または５’ＴＣＧモチーフを有さない。

一態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、８〜１４ヌクレオチド長である。別の態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＧモチーフを有さない。

いくつかの態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、リポソームまたはリポプレックスへアンカー基を通して付着している。一態様において、アンカー基は、脂質アンカー基である。別の態様において、アンカー基は、コレステロールである。別の態様において、アンカー基は、トコフェロールであるが、これは、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロールまたはデルタ−トコフェロールであってもよい。別の態様において、アンカー基は、ステロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジオキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン色素（例として、Ｃｙ３またはＣｙ５）、Hoechst33258色素、ソラレン、およびイブプロフェンまたは他の親油性部分から選択されることがある。

他の態様において、オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは、外側へ放射状に配向されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドシェルは、１ＳＮＡにつき５〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する。さらなる態様において、オリゴヌクレオチドシェルは、１ＳＮＡにつき５００〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する。

いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有さない。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有する。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシド間に立体性に富んだホスホロチオアート連結を有する。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオシド間に立体性に富んだホスホロチオアート連結を有する。立体性に富んだホスホロチオアート連結は、ＲｐジアステレオマーまたはＳｐジアステレオマーであってもよい。

いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、１０〜１２ヌクレオチドの長さを有する。

別の態様において、オリゴヌクレオチドの少なくとも２５パーセントは、ＳＮＡの外側表面にさらされる５’末端を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドシェルのすべてのオリゴヌクレオチドは、ＳＮＡの外側表面にさらされる５’末端を有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドのうち少なくとも２５％は、ＳＮＡの外側表面にさらされる３’末端を有する。

他の側面において、本発明は、リポソームまたはリポプレックスの外側に位置したＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有するリポソームまたはリポプレックス複合体から構成される球状核酸（ＳＮＡ）を包含する組成物であって、ある同等の物質量において同じ配列の直鎖ＣｐＧオリゴヌクレオチドよりも著しく多量のサイトカインの生成を刺激する前述の組成物である。

他の側面において、本発明は、リポソームまたはリポプレクスの外側に位置した非伝統的なＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有するリポソームまたはリポプレックス複合体から構成される球状核酸を含有する組成物である。

いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−６である。別の一態様において、サイトカインはＩＬ−１２である。別の一態様において、サイトカインは、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、ＩＬ１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および一部のＴｈ１型またはＴｈ２型免疫反応として発現されることが知られている他のサイトカインの１種以上であってもよい。

一態様において、サイトカイン生成はin vitroである。別の態様において、サイトカイン生成はin vivoである。

いくつかの態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドである。該ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、別の態様において、ＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドである。他の態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドである。さらなる態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドと、ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドと、ＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドとの混合物である。

一態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、４〜１６ヌクレオチドの長さがある。いくつかの態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＧモチーフを有さない。

別の態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、外側へ放射状に配向されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドシェルは、１ＳＮＡにつき５〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドシェルは、１ＳＮＡにつき１００〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する。別の態様において、オリゴヌクレオチドシェルは、１ＳＮＡにつき５００〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度が有する。

いくつかの態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオシド間のホスホロチオアート連結を有する。別の態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはヌクレオシド間のホスホロチオアート連結を有さない。他の態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオシド間においてホスホロチオアート連結を有する。

他の一態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは１０から１６ヌクレオチドの長さを有する。

さらなる態様において、少なくとも２５パーセントのＣｐＧオリゴヌクレオチドがＳＮＡの外側にさらした５’末端を有する。いくつかの態様において、少なくとも２５パーセントのＣｐＧオリゴヌクレオチドがＳＮＡの外側の表面にさらした３’末端を有する。

本開示の別の側面は、リポソームまたはリポプレックスの外側に位置するＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有するリポソームまたはリポプレックス複合体から構成される球状核酸（ＳＮＡ）を含む組成物を包含する。

他の側面において、本発明は、対象においてサイトカインの発現を誘導するための方法を包含し、すなわち、対象にＩＬ−６またはＩＬ−１２の発現を誘導するために有効量のリポソームまたはリポプレックスの外側に位置するＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有するリポソームまたはリポプレックス複合体の球状核酸（ＳＮＡ）を含む組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、該ＳＮＡとはあるＳＮＡまたは上に記載された組成物である。

本発明は、別の側面において、以下を含む対象を処置するための方法：リポソームまたはリポプレックスの外部に位置付けられるＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有するリポソームまたはリポプレックス複合体の球状核酸（ＳＮＡ）を含む組成物の、対象を処置するために有効量を、対象へ投与すること、を包含する。いくつかの態様において、前記ＳＮＡは、上記のＳＮＡまたは組成物である。一態様において、対象はがんを有する。別の態様において、対象は感染症を有する。他の態様において、対象はアレルギー疾患または免疫疾患を有する。

本発明の限定の各々は、本発明の様々な態様を網羅できる。したがって、いずれか１つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の限定の各々は、本発明の各側面に包含され得ると予想される。本発明は、その適用を以下の記述または図解された図面により発表される、構造の詳細および成分の配合に限定されない。本発明は、他の態様であることおよび実践されること、または様々なやり方で実施されるということが可能である。

図面の簡単な記載
添付の図面は比率に合わせて描かれることを意図されていない。図面において、様々な図において図解されるそれぞれ同一またはほぼ同一の構成物は数などで表される。明確さのために、必ずしもすべての構成物がすべての図面においてラベル付けされていないことがある。図面において：

図１は、ヒト末梢血単核球（ＰＭＢＣ）におけるオリゴヌクレオチドの摂取を描写する２つのグラフを包含する。上部のグラフは、オリゴヌクレオチドを吸収しているｈＰＭＢＣのパーセンテージを示し、下部のグラフはｈＰＢＭＣにおける１細胞当たりのオリゴヌクレオチドの吸収を示す。

図２は、in vivoで、マウスがＣｐＧオリゴヌクレオチドを皮下に注射された後のサイトカインの反応を示す２つのグラフを包含する。ＩＬ−１２ｐ７０の濃度は上部のグラフに示され、ＩＬ−６の濃度は下部のグラフに示される。

詳細な記載
ＣｐＧオリゴヌクレオチドが免疫賦活性であることが見出されたものの、in vivoでの治療学的な利点を有する特異的なオリゴヌクレオチドは、好適な長さ、および特異的な構造を有する、比較的に狭い範囲のオリゴヌクレオチドに限定された。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、より低いin vitroでの活性を有し典型的に治療学的に意味のあるin viｖoでの免疫反応を産生するために、十分な活性を有さない。それらの至適以下のＣｐＧオリゴヌクレオチドは典型的に２４ヌクレオチドの長さより短く、５’ＴＣＧなどの決定的なモチーフを包含しない。本発明に従って、至適以下のＣｐＧオリゴヌクレオチドが球状核酸（ＳＮＡ）として組み立てられた場合、in vivoでの治療学的な免疫を生成することができることが発見された。

球状核酸は、高密度に充填された、放射状に配向している核酸からなる。この構築はそれらに独自の性質を与え、スカベンジャー受容体に媒体されるＳＮＡの細胞的な吸収を可能にする。細胞的なＳＮＡの吸収は速く、効果的で、エンドソームへの集積を導く。ＳＮＡにおいて組み立てられたＣｐＧオリゴヌクレオチドが、より良い細胞的吸収を有し、より多量のＳＮＡ−オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド単独に比べて細胞の中に取り込まれるということが、発見された。

本発明のＳＮＡはＣｐＧオリゴヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、それらのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、至適以下または非伝統的ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。「非伝統的」ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、in vitroでの免疫賦活性がin vivoで治療学的な利点を持つほどの十分な免疫反応を生成しない、メチル化されていないＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、非伝統的ＣｐＧオリゴヌクレオチドが２４ヌクレオチドより短い長さを有する。他の態様において、非伝統的ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、伝統的なＡクラス、Ｂクラス、ＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドから、構造上の特徴の欠損を１つ以上有する。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、いくつかの態様において、２４ヌクレオチドの長さの知られている治療学的なオリゴヌクレオチドより短い。オリゴヌクレオチドは、好ましくは４から２０ヌクレオチドの範囲の長さである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、６から１６の間の範囲内であり、およびいくつかの態様において、８から１２の間、８から１０、１０から１２、６から１２、４から１４、または６から１０ヌクレオチドのサイズである。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、例えばＡクラス、Ｂクラス、およびＣクラス免疫賦活性のＣｐＧオリゴヌクレオチドを包含する。本明細書で使用されるように、「免疫賦活性のＣｐＧ核酸」、または「免疫賦活性のＣｐＧオリゴヌクレオチド」という用語は、ＣｐＧを含有するいかなるオリゴヌクレオチドで免疫細胞を活性化する能力のあるものを指す。少なくとも、ＣｐＧジヌクレオチドのＣは、典型的に非メチル化である。免疫賦活性のＣｐＧオリゴヌクレオチドは数々の、発行された特許および出版された特許出願において記述され、本明細書に参照として組み込まれた米国特許番号6,194,388；6,207,646；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；および6,429,19を含有する。

ある態様において、免疫賦活性のオリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えばホスホロチオアート（ＰＳ）骨格を有する。他の態様において、免疫賦活性のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（ＰＯ）骨格を有する。しかし、他の態様において、免疫賦活性のオリゴヌクレオチドは、混合のＰＯおよびＰＳ骨格を有する。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ａクラスオリゴヌクレオチド、Ｂクラスオリゴヌクレオチド、またはＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであることがある。「Ａクラス」ＣｐＧ免疫賦活性の核酸は、出版されたＰＣＴ出願、WO01/22990に記述されている。それらの核酸は、Ｂ細胞の活性化に最小の効果を有すものの、高度のインターフェロンαを誘発する能力によって特徴づけられる。ＡクラスＣｐＧ免疫賦活性の核酸はYamamotoおよび同僚により記述された六量体の回文構造、ＧＡＣＧＴＣ、ＡＧＣＧＣＴ、またはＡＡＣＧＴＴを含有することがある。Yamamoto S et al. J Immunol 148:4072-6 (1992)。伝統的なＡクラスオリゴヌクレオチドはポリＧリッチ５’および３’末端を有し、および回文構造の中心領域を有する。典型的に、５’および３’末端におけるヌクレオチドは、安定化されたヌクレオチド間連結、および中心の回文構造の領域のホスホジエステル連結（キメラ型の）を有する。非伝統的なＡクラスオリゴヌクレオチドは１つ以上のポリＧ末端および回文構造の中心を欠落する。代わりに、非伝統的なＡクラスオリゴヌクレオチドはすべてホスホロチオアートまたはすべてホスホジエステルのヌクレオチド間連結を有することがある。

ＢクラスＣｐＧ免疫賦活性核酸は、人間のＢ細胞を強く活性化するが、しかしさらなる修飾なしでは、インターフェロンを誘発することには最小の効果を有する。伝統的に、Ｂクラスオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＮ_１ＴＸ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４３’（配列番号７７）の配列を包含し、Ｘ_１はＧまたはＡ；Ｘ_２はＴ、ＧまたはＡ；Ｘ_３はＴまたはＣ、およびＸ_４は、ＴまたはＣ；およびＮはいかなるヌクレオチド、およびＮ_１とＮ_２は約０〜２５Ｎの核酸配列である。典型的に完全ホスホロチアート化され、および、特定の好ましい塩基の状況の中で非メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有するＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞および形質細胞様の樹状細胞を活性化することに強力であるが、しかしＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化を誘発することは比較的弱い。例としては、米国特許番号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；および6,339,068を参照。

一態様において、非伝統的ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも、式によって表され、
５’ Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４ ３’
式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４はヌクレオチドである。一態様において、Ｘ₂はアデニン、グアニン、またはチアミンである。別の態様において、Ｘ_３はサイトシン、アデニン、またはチアミンである。いくつかの態様において、非伝統的ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＧを欠落する。

別の態様において、本発明は少なくとも公式により表された単離されたＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供し、
５’ Ｎ_１Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４Ｎ_２ ３’（配列番号７８）
式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３およびＸ_４はヌクレオチド、Ｎはいかなるヌクレオチドであり、およびＮ_１とＮ_２は、各々約０〜２５Ｎから構成される核酸配列である。一態様において、Ｘ_１Ｘ_２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり；およびＸ_３Ｘ_４は、ＴｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、および ＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドである。好ましくは、Ｘ_１Ｘ_２はＧｐＡまたはＧｐＴおよびＸ_３Ｘ_４はＴｐＴである。他の態様において、Ｘ_１またはＸ_２が、または両方がプリンでありおよびＸ_３またはＸ_４が、または両方がピリミジンまたは、Ｘ_１Ｘ_２がＧｐＡ、およびＸ_３またはＸ_４または情報がピリミジンである。別の好ましい態様において、Ｘ_１Ｘ_２は、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＣ、ＡｐＧ、およびＧｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドである。しかし別の態様において、Ｘ_３Ｘ_４は、ＴｐＴ、ＴｐＡ、ＴｐＧ、ＡｐＡ、ＡｐＧ、ＧｐＡおよびＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドである。Ｘ_１Ｘ_２は、別の態様において、ＴｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＴ、ＧｐＣ、ＣｐＣ、ＣｐＴ、ＴｐＣ、ＧｐＴおよびＣｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり、Ｘ_３はＡおよびＴからなる群から選択されるヌクレオチドであり、Ｘ_４はヌクレオチドである。しかしＸ_１Ｘ_２は、ＴｐＣ、ＧｐＴ、またはＣｐＧであり、Ｘ_３Ｘ_４は、ＴｐＣ、ＡｐＴまたはＡｐＣではない。いくつかの態様において、非伝統的なＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは５’ＴＣＧを欠落する。

別の好ましい態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＮ_１ＴＸ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４３’（ＳＥＱＩＤ番号：７７）という配列を有し、長さは２４ヌクレオチドの長さ未満である。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、いくつかの態様において、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から選択されるＸ_１Ｘ_２、およびＴｐＴ、ＣｐＴおよびＴｐＣからなる群から選択されるＸ_３Ｘ_４を包含する。

いくつかの態様において、１つ以上のＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、２〜２０、５〜２０、１０〜２０、１５〜２０、２〜２０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、２〜４０、５〜４０、１０〜４０、１５〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、３５〜４０、２〜５０、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、２〜１００、５〜１００、１０〜１００、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００ヌクレオチドの長さがある。いくつかの態様において、１つ以上のＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドはは４〜１６ヌクレオチドの長さがある。

Ｃクラス免疫賦活性の核酸は、少なくとも２つの明白なモチーフを含有し、および独特のおよび望ましい免疫システムの細胞への刺激効果を有する。それらＯＤＮのうちいくつかは、伝統的な「刺激」、ＣｐＧ配列および「ＧＣリッチ」、または「Ｂ細胞中和化」モチーフを有する。それらの組み合わせモチーフの核酸は、免疫刺激効果を有する。ここにおける免疫刺激効果は、伝統的な「クラスＢ」ＣｐＧＯＤＮに関連されるＢ細胞の活性化と樹状細胞（ＤＣ）の活性化の強い誘導者としての効果と、ＡクラスＣｐＧＯＤＮに関連されるＩＦＮ−αおよびナチュラルキラー細胞の活性化の強い誘導者であるもののＢ細胞およびＤＣの活性化の比較的乏しい誘導者としての効果の間のどこかに当たる。Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9；Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5；Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6を参照。好ましいクラスＢ ＣｐＧ ＯＤＮは頻繁にホスホロチオアート骨格を有し、好ましいクラスＡ ＣｐＧ ＯＤＮは、混合またはキメラ型骨格を有し、組み合わせモチーフの免疫刺激核酸のＣクラスは安定化された、例えばホスホロチオアート、キメラ型、またはホスホジエステル骨格を有し、いくつかの好ましい態様において、それらはセミソフトな骨格、例としては、ＣとＧヌクレオチドとの間にホスホジエステルのヌクレオチド間連結、およびホスホロチオアート連結を有する、他のヌクレオチド間連結を有することがある。

刺激ドメインまたはモチーフは式：５’Ｘ_１ＤＣＧＨＸ_２３’によって定義される。ＤはＣ以外のヌクレオチドである。Ｃはサイトシンである。Ｇはグアニンである。ＨはＧ以外のヌクレオチドである。

Ｘ_１およびＸ_２はいかなる核酸配列で０から１０ヌクレオチドの長さである。Ｘ_１はＣＧを包含し、その場合好ましくは、ＴがＣＧのすぐ直前にある。いくつかの態様において、ＤＣＧはＴＣＧである。Ｘ_１は好ましくは０から６ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、Ｘ_２はいかなるポリＧまたはポリＡモチーフをも含有しない。他の態様において、免疫賦活性の核酸は５’末端または３’末端にポリＴ配列を有する。本明細書で使われるとき「ポリＡ」または「ポリＴ」は、３つ以上の連続するそれぞれのＡ’ｓまたはＴ’ｓの一続きを指すことになっており、例としては５’ＡＡＡＡ３’または５’ＴＴＴＴ３’である。

本明細書で使われるとき、「ポリＧ末端」とは一続きの３つ以上の連続するＧ’ｓ例としては、核酸の５’末端または３’末端で生じる５’ＧＧＧ３’を指すことになっている。本明細書で使われるとき、「ポリＧ核酸」とは、公式５’Ｘ_１Ｘ_２ＧＧＧＸ_３Ｘ_４３’を有する核酸を指すことになっており、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３およびＸ_４はヌクレオチドであり、および好ましくは少なくとも１つのＸ_３およびＸ_４はＧである。

この式に準ずるもので、Ｂ細胞刺激ドメインのためのいくつかの好ましいデザインは、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、ＴＣＧＴＣＧＴを含む。

核酸の２番目のモチーフは、ＰまたはＮのいずれかで指され、およびすぐＸ_１の５’側、すぐＸ_２の３’側に位置される。

ＮはＢ細胞を中和する配列で、ＣＧＧトリヌクレオチドで始まりおよび少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。Ｂ細胞を中和するモチーフは少なくとも１つのＣｐＧ配列を包含し、そのなかでＣＧはＣに先行され、またはＧによって後続され、（Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:12631-12636）または、ＣＧを含有するＤＮＡ配列であり、その中でＣＧのＣはメチル化されている。本明細書で使われるとき、「ＣｐＧ」は、５’サイトシン（Ｃ）と指されることになっており、３’グアニン（Ｇ）によって後続され、およびリン酸結合によって連結される。少なくとも５’ＣＧ３’のＣは非メチル化されてなければならない。中和するモチーフは、ある程度の免疫賦活性能力を有し、それ以外において存在するときは、非刺激モチーフであるが、しかし、他の免疫賦活性のモチーフという文脈で存在するとき、他のモチーフの免疫賦活性の潜在性を減少させるように作用する。

Ｐは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さを含有するＧＣリッチの回文構造である。本明細書で使われるとき、「回文構造」および同等に「回文構造の配列」は、逆にされたリピート、言い換えれば例えばＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’の配列で、ＡとＡ’、ＢとＢ’等が、通常のワトソン・クリック塩基対を形成する能力のある塩基である。Ｐもまた断続性の回文構造であることがあり、言い換えれば、ＡＢＣＤＥＮＮＮＮＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’のような配列で、ＡとＡ’、ＢとＢ’等が、通常のワトソン・クリック塩基対を形成する能力がある塩基であり、およびＮはいかなる塩基でもある。

本明細書に使用されるとき、「ＧＣリッチな回文構造」は、少なくとも３分の２がＧ’ｓとＣ’ｓである塩基組成物を有する回文構造のことを指すことになっている。いくつかの態様において、ＧＣリッチなドメインは好ましくは「Ｂ細胞刺激ドメイン」の３’側にある。１０塩基の長さのＧＣリッチな回文構造の場合において、回文構造、それゆえ少なくとも８つＧ’ｓおよびＣ’ｓを含有する。１２塩基の長さのＧＣリッチな回文構造、回文構造もまた少なくとも８つＧ’ｓおよびＣ’ｓを含有する。１４塩基の長さのＧＣリッチな回文構造における場合において、少なくとも回文構造の１０塩基はＧ’ｓおよびＣ’ｓである。いくつかの態様において、ＣＧリッチな回文構造は専らＧ’ｓおよびＣ’ｓから作り上げられる。

ある態様において、ＣＧリッチな回文構造は、少なくとも、８１％がＧ’ｓおよびＣ’ｓの塩基組成物を有する。そのような１０塩基の長さのＣＧリッチな回文構造場合において、回文構造はそれ故、専らＧ’ｓおよびＣ’ｓによって作られる。そのような１２塩基の長さのＣＧリッチな回文構造の場合において、回文構造の少なくとも１０の塩基が（８３％）がＧ’ｓおよびＣ’ｓであることが好まれる。いくつかの好ましい態様において、１２の塩基の長さがあるＧＣリッチの回文構造は、専らＧ’ｓおよびＣ’ｓによって作られる。１４塩基の長さのＧＣリッチな回文構造における場合は、回文構造の少なくとも１２塩基（８６％）は、Ｇ’ｓおよびＣ’ｓである。いくつかの好ましい態様において、１４塩基の長さのＧＣリッチな回文構造は、専らＧ’ｓとＣ’ｓにより作られる。ＧＣリッチな回文構造のＣ’ｓは非メチル化されるか、またはメチル化されることが可能である。

一般に、このドメインは少なくとも３つのＣおよびＧを、さらに好ましくは各々を４ずつ、および最も好ましくは各々を５つ以上有する。このドメインにおけるＣとＧの数は、同一であることは必要ない。ＣおよびＧが自己相補二重鎖、または例えばＣＣＧＣＧＣＧＧのような回文構造を形成することができるように配置されていることが好まれる。これはＡまたはＴによる断続性であり、しかし自己相補は例えばモチーフＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＣＧ（配列番号７９）またはＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号８０）の中に少なくとも部分的に保存されることが好まれる。自己相補が保存されないときは、非相補の塩基対はＴＧであることが好ましい。好ましい態様において、回文構造の部分ではない塩基であり、３つより多く連続するものはなく、好ましくは２つ以下および最も好ましくはたった１つである。いくつかの態様において、ＧＣリッチな回文構造は、少なくとも１つのＣＧＧトリマー、少なくとも1つのＣＣＧトリマー、または少なくとも1つのＣＧＣＧテトラマーを包含する。

いくつかの態様において、非伝統的なＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列や好まれた長さまたは骨格の修飾を包含する、伝統的Ｃクラスオリゴヌクレオチドの、上の特徴のいかなる１つ以上をも欠落している。

球状核酸（ＳＮＡ）は、はっきり定義された高分子のクラスであり、核酸を放射状にナノ粒子コア、言い換えれば無機金属コア、の周りに組織化することにより形成される(Mirkin CA,et.al.(1996) A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature 382(6592):607-609.)。それらの構造は、補助の運搬媒体、またはクラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）および脂質ラフトを関与することによるトランスフェクション試薬を必要としない状態で、細胞へ入る能力を見せる(Rosi NL, et. al. (2006) Oligonucleotide-modified gold nanoparticles for intracellular gene regulation. Science 312: 1027-1031; Patel PC, et al. (2010))。スカベンジャー受容体は、機能化された金ナノ粒子の多価のオリゴヌクレオチドの細胞的な吸収を媒体する。Bioconjugate chemistry 21(12):2250-2256.）。細胞内に入ると直ちに、伝統的なＳＮＡの核酸成分がヌクレアーゼ解重合に抵抗し、より長い細胞内的生存期間に至る。さらにまた、ＳＮＡはそれらの多機能の化学構造により、それらの標的を多価的な傾向で接着する能力を有する(Choi CH, et. al. (2013) Mechanism for the endocytosis of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110(19):7625-7630; Wu XA, et. al. (2014) Intracellular fate of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society 136(21):7726-7733）。

本明細書では、ＳＮＡ脂質を基にした運搬システムとして組み立てられるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、高められた治療学的な性質を有することが発見された。ＣｐＧオリゴヌクレオチドＳＮＡは、脂質ナノ粒子を高密度に充填されたＣｐＧオリゴヌクレオチドシェルに合体させる本発明に従って進行された。それらの独特の分子は、いかなる型の治療学的または診断学的試薬を、細胞におよびとりわけ細胞に効率の良い仕方で、効率よく運搬するために使用されることができ、治療学的な反応を高めるという結果となる。選択の治療薬剤がそれらの中に取り入れられたリポソームまたはリポプレックス脂質抱合型の核酸を外側の表面の中に挿入することにより、ＳＮＡの中へ機能化されることができる。結果として生じるＳＮＡは脂質および外側へ放射状に配向した核酸分子を含有する。上述のＳＮＡが充填された分子は、スカベンジャー受容体が媒体するエンドサイトーシスを介して細胞の中へ取り込まれるだろうし、それは他のＳＮＡの特徴である効率の良くおよび速いエンドソームへの集積という結果になる。リポソーム／リポプレックスをＳＮＡとして機能化することは吸収のルートを変化する。リポソーム／リポプレックスをＳＮＡとして機能化することは効率、力学、またはエンドソームでのリポソーム／リポプレックスの集積を増加させる。リポソーム／リポプレックスの表面をＳＮＡの中に機能化することにより、細胞的な運搬のルートはスカベンジャー受容体によって方向づけられ、in vitroおよびin vivoでのエンドソームでの吸収を高める。

本発明のナノ構造は典型的には、ＣｐＧオリゴヌクレオチドをコアから放射状に外側へ向くように並べることによって形成されたオリゴヌクレオチドのシェルを有する相互転換可能なナノ粒子コアから構成される。いくつかの側面において、ナノ粒子コアは、脂質ナノ粒子であることがある。代わりにナノ粒子コアはニオソームから成り立っていることがある。オリゴヌクレオチドの、５’または３’末端のいずれかに結着された疎水性（例としては脂質）アンカー基は、オリゴヌクレオチドが５’または３’末端をコアから外側に面するように配置されるかどうかに依存し、好ましくは脂質ナノ粒子の中のオリゴヌクレオチドを包理するために使われる。アンカーは脂質ナノ粒子中への挿入を駆動し、およびオリゴヌクレオチドを脂質へ結着するように作用する。

ニオソームは、二重層内に向けられる非イオン化界面活性物質から形成された媒体である。ニオソームは一般的に賦形剤として足されているコレステロールを有するが、他の脂質ベースのおよび非脂質ベースの組成物もまた包含することができる。ニオソームの調整のための方法は当該技術分野において知られている。いくつかの態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ニオソームの調整の間または後に含有されるニオソーム媒体は構造的におよび機能的にリポソームと相似するが、脂質というよりは、非イオン化界面活性物質を主要な組成物として基づく。一般的な非イオン化界面活性物質で使用されるものはソルビタン（spans）またはポリソルベート（tween）を含有する。しかし、広く多様な非イオン化界面活性物質がニオソームの調整に使用されることができる。

脂質ナノ粒子は、当該技術分野における者にリポソームまたはリポプレックスを生成すると知られる、広く多様な脂質から作成されることができる。リポソームは少なくとも1つの内部区画を取り囲む脂質二重膜構造から成り立つ。リポソームは膜のタイプ、および大きさに従って特徴づけられることがある。小ユニラメラー媒体（ＳＵＶｓ）は単一の膜で、および典型的に直径０．０２と０．０５ｐｍの間にわたるものを有し、大ユニラメラー媒体（ＬＵＶＳ）は典型的に０．０５ｐｍより大きい。オリゴラメラー大媒体および、複数ラメラー媒体は数枚の通常的に同心性の膜層を有し、および典型的に０．１ｐｍより大きい。数枚の非同心性膜を持つリポソームは、言いかえれば、大きな媒体に含有される数個のより小さな媒体は、多胞体の媒体と定義付けられる。

本発明のナノ構造は、コアを含有することがある。コアは、凹窩コアであることがあり、少なくともシェルの材料の中心領域にいくらかの空間を有することがある。凹窩コアはリポソームのコアも含有する。

本明細書で使われるとき、脂質二重層を形成する脂質またはリン酸脂質の構成物により形成されるリポソームのコアは中央に位置されるコア区画を指す。脂質二重層は２つの層の脂質分子から成り立っている。各々の層における脂質分子は、実質的に隣接する脂質二重層に平行に向けられ、および、それらの分子の水性の領域にさらされる極性末端、およびお互いに隣接する無極性末端を有する２つの層を形成する二重層を有する。リポソームのコアの中央の水性の領域は空であることもあれば、完全にまたは部分的に水、水性の乳化液、オリゴヌクレオチド、または他の治療学的または診断的な薬剤によって満たされることもある。

リポプレックスは、特異的に核酸を脂質核酸複合体に取り入れる、脂質ナノ粒子の１つのタイプである。リポプレックスは、核酸脂質粒子とも言及されるが、典型的に陽イオン性の脂質または非陽イオン性の脂質および選択的なステロールおよび／または、粒子の凝縮を阻止する脂質（例としては、ＰＥＧ脂質抱合体）を含有する。いくつかの例において、リポプレックスは陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、ステロールおよび脂質を含有する。

他の脂質が、多様な目的のために脂質ナノ粒子に包含されることがあり、例えば脂質の酸化を阻止するため、または脂質ナノ粒子表面のリガンドと結着するためである。両親性、中性、陽イオン性、および陰イオン性脂質を含有するいかなるメンバーの脂質もが存在することがある。そのような脂質は、単独でまたは組み合わせで使用されることができる。脂質ナノ粒子において、存在することのある追加の成分は、ポリアミドオリゴマー、ペプチド、タンパク質、洗浄剤、脂質由来成分、二重層を安定化する成分で例えばホスファチジルエタノールアミンと共役するＰＥＧ、およびセラミドに抱合されるＰＥＧである。 脂質ナノ粒子は、１つ以上の第２アミノ脂質または陽イオン性脂質、陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、および形成の間の脂質粒子の凝集を減少させるために選ばれた脂質をも包含することがあり、それは粒子の形成の間に電荷により誘発される凝集を阻止する、粒子の立体的安定化の結果によることがある。本明細書で使われるとき、用語「アミノ脂質」は、生理的ｐＨにおいて陽イオン性の脂質を形成するようにプロトン化されることがある１つまたは２つの脂肪酸または脂肪アリキル鎖、およびアミノ頭部（アルキルアミノまたはジアリキルアミノ群を包含する）を有するような脂質を包含することが意味される。

脂質ナノ粒子またはニオソームは、平均直径で約１０ｎｍから約１５０ｎｍ、さらに典型的には約６０ｎｍから約１３０ｎｍ、さらに典型的には約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍから約９０ｎｍを有することがある。ある態様において、脂肪ナノ粒子またはニオソームの直径は、平均直径で１ｎｍから約２５０ｎｍであり、平均直径で約１ｎｍから約２４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約２３０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約２２０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約２１０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約２００ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１９０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１８０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１７０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１６０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１３０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１２０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１１０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約１００ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約９０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約８０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約７０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約６０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍから約３０ｎｍ、または平均直径で約１ｎｍから約２０ｎｍ、または平均直径で約１ｎｍから約１０ｎｍである。

オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子またはニオソームの外側、コアの壁の中、および／またはコアの中心に位置されることがある。コアの上に位置されるオリゴヌクレオチドは、典型的にコアと共役すると言及される。共役されたものは直接的または間接的であることがある。いくつかの態様において、少なくとも５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、５０００、または１０，０００オリゴヌクレオチドまたはいかなる範囲のそれらの組み合わせがコアの外側の上にある。いくつかの態様において、１-１０００、１０-５００、５０-２５０、または５０-３００オリゴヌクレオチドが表面に存在する。

脂質ナノ粒子は中性の脂質を含有することがある。中性の脂質は、例としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ-グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセリン）（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセリン）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、および１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノラミン（ＤＰＰＥ）、いかなる関連のホスホタイデルコリンまたは商業的な売り手から入手できる中性脂質であることがある。

脂質ナノ粒子は陽イオン性脂質を含有することがある。陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３ Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２,３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレオオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレオイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１,２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１,２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−トキリノレオキシ―３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃ１）、１,２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ.Ｃ１）、１,２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１,２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１,２−プロパネジオ（ＤＯＡＰ）、３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２,２−ジリノレニル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ、５Ｓ、６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２,２−ジ（（９Ｚ、１２Ｚ）−オクタデカ−９,１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ、３１Ｚ）−ヘプタトリアセトン−６,９,２８,３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、またはそれらの混合物であることがある。

他の陽イオン性の脂質で、およその生理的ｐＨにおいて正味プラス電位を運び、それらの特異的に上に記載されたものに加えて、脂質ナノ粒子もまた含有することができることがある。かかる陽イオン性の脂質は、これらに限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウム塩化物（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物(「ＤＤＡＢ」)；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ)プロピル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）、３．ベータ−（Ｎ−−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−スペルミンカルボキサミド)エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリフルオル酢酸アンモニウム(「ＤＯＳＰＡ」)、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１,２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン(「ＤＯＰＥ」)、１,２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ジオレイルオキシ)プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）およびＮ−（１,２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル)−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ハイドロキシエチルアンモニウム臭化物（「ＤＭＲＩＥ」）である。

「両親性脂質」はいかなる適切な材料をも指し、脂質材料の疎水性の部分は、疎水性の領域を向き一方で親水性の部分は水性の領域を向く。そのような組成物にはリン酸脂質、アミノ酸脂質およびスフィンゴ脂質を包含するが、それらに限定されない。代表的なリン酸脂質は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジノニルホスファチジルコリンを包含する。

本発明において記載される脂質ナノ粒子は、変化する割合の陽イオン脂質、中性脂質、ステロールおよびＰＥＧ修飾脂質を包含することがある。

治療的な薬剤がＳＮＡの中へ取り入れられることもある。それらは小分子、タンパク質、核酸、機体（例えばＮＯ）、染色物、ビタミン、栄養素、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤、化学療法剤、ステロイド、ホルモン、磁性および常磁性粒子、カプセル包治療薬、プロドラックまたは分子、水溶性、または非水溶性分子、および、エンドソームの中でも機能するタンパク質で特にエンドソームでの蓄積の病気に関連するものを包含するタンパク質を包含するが、それらに限定されない。

リポソーム／リポプレックスは、アプタマー、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質由来物、小分子、および磁性／常磁性粒子を包含し、またそれらに限定されない他の表面の要素を含有するように構築されている。それらは様々な目的のために使われることがある。

オリゴヌクレオチドシェルは、本明細書に記載されるように、広く多様なＣｐＧオリゴヌクレオチドから作成されることができる。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは一本鎖デオキシリボヌクレオチドである。しかしながらオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドであることもあり、および他の一本鎖オリゴヌクレオチドで当該技術分野において知られる１つ、または複数の修飾を取り入れるでいるもの、二重鎖デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および他の二重鎖オリゴヌクレオチドで、当該技術分野において知られる１つまたは複数の修飾を取り入れるもの、三重のオリゴヌクレオチドで、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドで、当該技術分野において知られる１つまたは複数の修飾を取り込んでいるものである。それらのオリゴヌクレオチドは、タンパク質、ポリマー体またはプロタミンを包含するキャリアーと前に複合されていることもありされてないこともある。

いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドシェルは２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００オリゴヌクレオチドの、またはそれらの中での組み合わせの密度を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドシェルは、１〜１０，０００、１〜９，０００、１〜８，０００、１〜７，０００、１〜６，０００、１〜５，０００、１〜４，０００、１〜３，０００、１〜２，０００、１〜１，０００、５〜１０,０００、５〜９，０００、５〜８，０００、５〜７，０００、５〜６，０００、５〜５，０００、５〜４，０００、５〜３，０００、５〜２，０００、５〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜９，０００、１００〜８，０００、１００〜７，０００、１００〜６，０００、１００〜５，０００、１００〜４，０００、１００〜３，０００、１００〜２，０００、１００〜１，０００、５００〜１０，０００、５００〜９，０００、５００〜８，０００、５００〜７，０００、５００〜６，０００、５００〜５，０００、５００〜４，０００、５００〜３，０００、５００〜２，０００、５００〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜５００、５０〜１０，０００、５０〜３００、または５０〜２５０オリゴヌクレオチドの密度を有する。

いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは、構造的にオリゴヌクレオチドと同一である。他の態様において、オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは少なくとも２つの構造に異なるオリゴヌクレオチドを有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０または２〜１０の異なるヌクレオチド配列を有する。

いくつかの態様において、少なくとも、オリゴヌクレオチドの６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がナノ構造の表面に位置されている。

いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドシェルを形成する。少なくとも、リポソームコアの外側表面の１０％の空き表面面積がオリゴヌクレオチドを包含しているときにオリゴヌクレオチドシェルが形成される。いくつかの態様において、リポソームコアの外側表面の空き表面面積の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がオリゴヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは、多様な方向に向けられることがある。いくつかの態様においてオリゴヌクレオチドは放射状に外側に向けられる。

いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドシェルの少なくとも１０％のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を介してナノ粒子に結着されている。脂質アンカーは、オリゴヌクレオチドまたは核酸を、脂質膜へ挿入することまたは据え付けることを可能にする疎水基から構成される。いくつかの態様において、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のオリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドが、脂質アンカー基を通して、脂質ナノ粒子に結着される。いくつかの態様において、脂質アンカー基はコレステロールである。他の態様において、脂質アンカー基は、ステロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコラート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸エステルまたは当該技術分野において知られている他の脂質である。

「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、複数のヌクレオチド（すなわち、ホスファート基へ、および交換可能な有機塩基へ連結された糖類（例として、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子であるが、前記有機塩基は、置換ピリミジン（例として、シトシン（C）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例として、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）のいずれかである）を意味するために、相互転換可能に使用される。よって、この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの両方を含む。この用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、ホスファートを差し引いたポリヌクレオチド）および他の有機塩を含有するポリマー体をも包含することになっている。オリゴヌクレオチドは既存の核酸源（例として、ゲノムのまたはｃＤＮＡ）から得ることができ、しかし好ましくは合成性である（例えば、核酸合成により生成される）。「ヌクレオシド」という用語は、糖類部分、好ましくはリボースまたはデオキシリボースへ共有結合的に付着されている塩基を包含する。ヌクレオチドという用語は、ホスファート基またはホスファート類似体をさらに含むヌクレオシドを包含する。

本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、例えば糖類部分、ホスホジエステル連結、および／または塩基において修飾されることができる。本明細書で使われるとき「糖類部分」は自然の非修飾のペントース、リボースおよびデオキシリボースを包含する糖類、修飾された糖類および糖類似化合物を包含する。糖部分の修飾は、ヒドロキシル基をハロゲン、ヘテロ原子、両親性基と交換することを包含することができ、およびヒドロキシル基を機能化すること、例としては、エステル、アミンまたはチオールを包含することができる。

糖類の修飾は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを包含することができ、それはメチル化されたと言及される。いくつかの例において、本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、修飾されたまたは非修飾された糖類部分のみを含有し、一方で他の例において、オリゴヌクレオチドは、修飾されたいくつかの糖部分およびそうではないいくつかを含有する。

いくつかの例において、修飾されたヌクレオチドは、糖または背骨格修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを包含する。修飾されたリボまたはデオキシリボヌクレオチドは、自然には生じない塩基、例えば、５’の位置で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば５’−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５’−ブロモウリジン；アデノシンおよび８−の位置で修飾されたグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザヌクレオチドおよびＮ−アルキルアテドヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンを包含する。また、糖類修飾されたリボヌクレオチドはＨ、アルコシル（またはＯＲ）、Ｒまたはアリキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミン（例えばＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２）またはＣＮ基と交換された２’−ＯＨ基を有することができ、Ｒは低アルキル、アルケニルまたはアルキニル基である。いくつかの態様において、修飾されたリボヌクレオチドは、ホスホロチオアート基などの修飾基により交換された隣接するリボヌクレオチドとつながるホスホジエステル基を有することができる。

修飾された糖類はＤ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを包含する）、言い換えれば、２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを包含する）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、２’アミン、エチニル、エテニル、プロペニルおよびシアノ等を包含することができる。糖類部分はヘキソースでもまたあり得る。

「疎水修飾」という用語は、全体の疎水性が増加しおよび塩基がいまだに規則的なワトソン−クリック相互作用を形成することが可能であるような修飾を指す。塩基修飾の非限定例は、フェニル、４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、およびイソブチル、フェニル（Ｃ_６Ｈ_５ＯＨ）トリプトファニル（Ｃ_８Ｈ_６Ｎ）ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；およびナフチルなどの５位ウリジンおよびシチジン修飾物が包含される。

いくつかの側面において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’および５’末端を含む。オリオゴヌクレオチドの３’および５’末端は、例えば３’または５’連結を修飾することによって、ヌクレアーゼから実質的に保護されることができる。（例として、米国特許番号5,849,902およびWO98/13526）オリゴヌクレオチドは、「ブロック基」の包括によって耐性にされることができる。「ブロック基」という用語は、本明細書に使用されるとき、保護基または合成のための共役基のいずれかとして、オレオゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに結着することができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す。（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）ホスフェート（ＰＯ_３ ^２−）、ホスホン酸水素ホスホネートまたはホスホラミダイト）「ブロック基」には、修飾ヌクレオオチドおよび非ヌレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を包含するオリゴヌクレオチドの５’および３’末端を保護する「エンドブロック基」または「エキソヌクレアーゼブロック基」もまた包含する。

例示的な末端ブロッキング基には、キャップ構造（例えば、７−メチルグアノシンキャップ）、例えば３’−３’または５’−５’末端反転を有する逆に変化するヌクレオモノマー、例えば３’−３’または５’−５’末端倒置を持つ（Ortiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129）、メチルホスホン酸、亜ホスホルアミド酸、２’→５’ヌクレオチド間連結非ヌクレオチド基（例として、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、抱合体）等が包含される。３’末端ヌクレオチドは、修飾された糖類部分を含むことができる。３’末端ヌクレオチドはオリオゴヌクレオチドの３’−エキソヌクレアーゼ解重合を阻止するブロッキング基で選択的に置換することができる３’−Ｏを含む。例としては、３’ヒドロキシルは３’→３’ヌクレオチド間連結を介してエステル化されることができる。例としては、アルキルオキシ基は、メトキシ、エトキシまたはイソプロポキシおよび好ましくはエトキシであり得る。選択的に、３’末端において３’→３’連結されるヌクレオチドは置換連結により連結されることができる。ヌクレアーゼ解重合を減少するために、最も５′側の３’→５’連結は、修飾連結であることができ、例えばホスホロチオアートまたはＰ−アルキル酸化リン酸トリエステル連結である。好ましくは、２つの最も５’側の３’→５’連結は修飾連結である。選択的に５’末端ヒドロキシル部分はリンを含有する部分、例えばリン酸、ホスホチオアートまたはＰ−エソキシリン酸、でエステル化されることができる。

いくつかの側面において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含むことができる。

いくつかの側面において、少なくともオリゴヌクレオチドの一部分は置換連結、例えばホスホロチオアート連結により連結される。置換連結の存在は、血清タンパク質へのより高い結合性のため、薬物動態を改善することができる。

オリゴヌクレオチドの表面密度は、コアの大きさおよび型、およびオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存することがある。ナノ粒子を安定した状態にするのに十分な表面密度、およびそれを望ましい組み合わせのナノ粒子およびオリゴヌクレオチドのために得るために必要な状態は、経験的に決定されることができる。一般的に、少なくとも１粒子当たり１００オリゴヌクレオチドの表面密度は安定したコア−オリゴヌクレオチド抱合体を提供するのに十分であるだろう。好ましくは、表面密度は少なくとも１ナノ粒子当たり５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２００、１，４００、１，６００、１，８００、２，０００、５，０００、または１０，０００オリゴヌクレオチドである。

本発明の他の１つの側面に従って、免疫反応を刺激する方法が提供される。方法は、対象において免疫反応を誘発するための有効量の、ＣｐＧ免疫賦活性のオリゴヌクレオチドを含むＳＮＡを対象に投与することを関与する。好ましくは、ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは経口で、局所的に、持続性放出装置において、粘膜で、全身性に、非経口で、鼻腔内で、眼球内に、または筋肉内に投与される。ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡが、粘膜の表面に投与されるとき、粘膜の免疫反応または全身性の免疫反応を誘発するための有効量が運搬される。

本明細書に記載の化合物の対象への用量は、典型的には約０．１μｇから１０，０００ｍｇまで、より典型的には約１μｇ／日から８０００ｍｇまで、最も典型的には約１０μｇから１００μｇまでに及ぶ。対象の体重の観点から述べると、典型的な投薬量は、１投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重またはこれより多くまで、およびこれらから誘導可能ないずれの範囲に及ぶ。

本明細書において、列挙した数からの推論可能範囲の非限定的な例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重まで、約５μｇ／ｋｇ／体重から約５００ｍｇ／ｋｇ／体重までなどが、前記述の数値に基づいて投与されることができる。絶対量は、同時進行の処置、投与の回数、および年齢、体の状態、大きさ、重さを包含する個々の患者のパラメーターを包含する多様な要素に依存するだろう。それらの要素は当該技術分野において、普通の技術を持つ人々に熟知されている要素であり、および単なるルーチンな実験法のみで対処され得る。最大容量が使われるとき、健全な医療判断に従った最も高い安全用量であることが一般的に好まれる。

本開示は、他の側面において、がんを有する対象への静脈内、腫瘍内または皮下注射による投与を包含する、がんを処置するための方法を提供する。本明細書に記載された本発明。

いくつかの態様において、方法は免疫反応が抗原特異的な免疫反応である場合、対象を抗原にさらすことを関与する。いくつかの態様において、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、バクテリア抗原、寄生虫抗原およびペプチド抗原からなる群から選択される。他の態様において、抗原はＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むＳＮＡの中に取り入れられる。

ＣｐＧ免疫賦活のオリゴヌクレオチドを含むＳＮＡは、広範囲の免疫反応を扇動する能力がある。例としては、これらのＳＮＡを含むＣｐＧ免疫活性活性化オリゴヌクレオチドは、Ｔｈ２をＴｈ１免疫反応に向けなおすために使用することができる。ＣｐＧ免疫賦活のオリゴヌクレオチドはまた免疫細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、樹状細胞、およびＮＫ細胞を活性化するために使用されることがある。活性化はin vivo、in vitroまたはex vivoにおいて実施されることができ、言い換えれば、免疫細胞を対象から単離させること、免疫細胞を活性化するための有効量のＣｐＧ免疫賦活性のオリゴヌクレオチドを免疫細胞に接触させること、および対象に活性化された免疫細胞を再投与することによる。いくつかの態様において、樹状細胞ががん抗原を提示する。樹状細胞は、ex vivoでがん抗原へさらされ得る。

ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡによって生成される免疫反応はまた、サイトカインの生成、例として、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８，ＴＮＦ，ＩＦＮ−α、ケモカイン、およびＩＦＮ−γの生成の誘発をももたらすことがある。

さらに別の態様において、ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡは、がんを処置するのに有用である。ＣｐＧ免疫賦活性のオリゴヌクレオチドはまた、本発明の他の側面に従って、がんが発生するリスクのある対象におけるがんを予防する（例として、がんが発生するリスクを低減させる）のにも有用である。がんは、胆道がん、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、大腸がん、子宮内膜がん、胃がん、上皮内新生物、Ｂ細胞およびＴ細胞リンパ腫、肝臓がん、肺がん（例として、小細胞および非小細胞）、メラノーマ、神経芽細胞腫、口腔がん(oral cancer)、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、肉腫、甲状腺がん、および尿道がん、卵巣がん、ならびに他の癌および肉腫からなる群から選択されてもよい。いくつかの重要な態様において、がんは、骨がん、脳およびＣＮＳがん、結合組織がん、食道がん、眼のがん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、喉頭がん、口腔がん(oral cavity cancer)、メラノーマおよび他の皮膚がん、および精巣がんからなる群から選択される。

ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡはまた、任意にＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドが抗がん治療と併せて施されるとき、がん治療（例として、抗がん治療）に対するがん細胞の応答性を増大させるためにも使用されてもよい。抗がん治療は、化学治療、ワクチン（例として、in vitroでプライムされた樹状細胞ワクチンまたはがん抗原ワクチン）または抗体ベースの治療であってもよい。この後者の治療はまた、細胞表面抗原（例えば、がん細胞の）に特異的な抗体を投与することも伴ってもよく、ここで免疫応答は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）をもたらす。一態様において、抗体は、リブタキシン(Ributaxin)、ハーセプチン、クアドラメット、キイトルーダ、オプジーボ、ベキサール、ベクチビックス、アーゼラ、ヤーボイ、ゼヴァリンダラザレックス、アービタックス、アドセトリス、アバスチン、キャンパス、パノレックス(Panorex)、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、オンコリム(Oncolym)、SMART M195、アトラゲン(ATRAGEN)、オバレックス(Ovarex)、ベキサール、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗VEGF、ゼナパックス、MDX-220、MDX-447、メルイミューン２(MELIMMUNE-2)、メルイミューン１(MELIMMUNE-1)、シーサイド(CEACIDE)、プレターゲット(Pretarget)、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、リンホシド(LymphoCide)、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 Ab、ImmuRAIT-CEA、チェックポイント阻害剤または免疫系を刺激する抗体を包含する他の抗がん抗体からなる群から選択されてもよい。がん治療は、いくつかの態様において、ＳＮＡへ組み込まれてもよい。

よって、本発明のいくつかの側面に従うと、がんを有するかまたはがんを有するリスクのある対象は、ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよび抗がん治療を施される。いくつかの態様において、抗がん治療は、化学治療剤、免疫治療剤、チェックポイント阻害剤、免疫系のアゴニスト、抗体断片、二重特異性抗体、およびがんワクチンからなる群から選択される。

チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7ファミリーリガンドまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質を阻害する。チェックポイント阻害剤は、いくつかの態様において、抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの態様において、抗ＰＤ−１抗体は、BMS-936558（ニボルマブ）である。別の態様において、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。他の態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブである。

免疫系のアゴニストは、CD27、CD28、B7.1、CD137、CD137L、OX40、OX40L、HVEN、およびGITRをアゴナイズする(agonize)化合物から選択されてもよい。

本発明は、他の側面において、対象における疾患を予防するための方法に関する。方法は、免疫系の応答性を促進することで対象における疾患が予防されるように、ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡを対象へ定期的に投与することを伴う。本発明の予防的方法を使用して予防されるようにする疾患または状態の例は、微生物感染（例として、性感染病）および食物アレルギーからのアナフィラキシーショックを包含する。

他の側面において、本発明は、ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡを、自然免疫応答を活性化するのに有効な量で対象へ投与することによって、自然免疫応答を誘発するための方法である。

本発明の別の側面に従うと、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を処置または予防するための方法が提供される。方法は、本発明の組成物のいずれかの、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を処置または予防するのに有効な量を、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を有するかまたは有するリスクのある対象へ投与することを伴う。いくつかの態様において、ウイルスは、肝炎ウイルス、例として、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスによって引き起こされる。

細菌感染を処置または予防するための方法は、本発明の別の側面に従い提供される。方法は、本発明の組成物のいずれかの、細菌感染を処置または予防するのに有効な量を、細菌感染を有するかまたは有するリスクのある対象へ投与することを伴う。一態様において、細菌感染は、細胞内細菌に起因する。

別の側面において、本発明は、本発明の組成物のいずれかの、寄生体感染を処置または予防するのに有効な量を、寄生体感染を有するかまたは有するリスクのある対象へ投与することによって、寄生体感染を処置または予防するための方法である。一態様において、寄生体感染は、細胞内寄生体に起因する。別の態様において、寄生体感染は、非蠕虫寄生体に起因する。

いくつかの態様において、対象はヒトであり、他の態様において、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、シチメンチョウ、ヤギ、魚類、サル、ニワトリ、ラット、マウス、およびヒツジからなる群から選択される非ヒト脊椎動物である。

別の側面において、本発明は、本発明の組成物のいずれかを、Ｔｈ１免疫応答を生成するのに有効な量で対象へ投与することによって、Ｔｈ１免疫応答を誘発するための方法に関する。

本発明は、その適用において、構築物の詳細および以下の記載に明記されるかまたは図面中に説明される成分の配合には限定されない。本発明は、他の態様が、および様々なやり方で実践または実行されることが可能である。また、本明細書に使用される言い回しおよび専門用語は、記載を目的としており、限定するものとして見なすべきではない。「包含すること」、「含むこと」、または「有すること」、「含有すること」、「伴うこと」、および本明細書中これらの変形は、この後に列挙される事項およびこれらの均等物ならびに付加的事項を網羅することが意味される。

当業者は、単なるルーチンな実験法のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の態様との多くの均等物を認識するか、または解明することができるであろう。かかる均等物は、以下のクレームによって網羅されることが意図される。

本明細書に開示される、特許書類を包含するすべての参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。

例
核酸ベースの新規ＴＬＲ９アゴニストの特徴付け
背景
球状核酸（ＳＮＡ）は、球状の脂質二重層上に放射状に配向され、密に充填されたオリゴヌクレオチドを含有する。この構造によって、ＳＮＡは、直鎖オリゴヌクレオチドと比較して、増強された細胞取り込みおよびエンドソームの受容体活性化の動態を包含する独特の特性が与えられる。

ＳＮＡ形式の核酸ベースのＴＬＲ９アゴニストの特徴付けを記載する。ＣｐＧモチーフの長さおよび数が変動するオリゴヌクレオチドを、レポーター細胞、ヒトＰＢＭＣを使用して、およびマウスにおいてin vivoにて特徴付けした。直鎖ＣｐＧオリゴヌクレオチドとは違い、１２マーと同程度に短いＣｐＧオリゴヌクレオチドをＳＮＡ形式で試験し、ＴＬＲ９を活性化することを見出した。これは、５’−ＴＣＧモチーフを要求しない。ＴＬＲ９アゴニストのＳＮＡは、ＴＬＲ９に対して高特異性を保持し、ヒトＰＢＭＣ中への取り込みを増大し、直鎖ＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して増大したＴｈ１型サイトカインを誘発する。強力なサイトカイン誘発が、マウスにおいて全身投与の後に観察された。ＳＮＡ構造は、ＴＬＲ９特異性を損なうことなくＴＬＲ９アゴニスト合成オリゴヌクレオチドのための長さおよびモチーフの要求を低減させ、細胞取り込みを増大する。ＳＮＡのこれらの際立った特性は、治療への適用のための免疫賦活性ＳＮＡの有用性を強調する。

結果
レポーター細胞におけるＮＦ−κＢの活性化
核酸のＴＬＲ９賦活活性を、ヒトＲａｍｏｓ Ｂリンパ球およびマウスＲＡＷマクロファージに由来するＮＦ−κＢレポーター細胞株において査定した。ＳＮＡ構築物は、直鎖形式の同じ配列より強力であった。より短い長さ（例えば、配列６を参照）または５’ＴＣＧの欠如（例えば、配列２および配列４を参照）に起因する直鎖オリゴヌクレオチドとしての、ＴＬＲ９を十分には刺激しない配列は、ＳＮＡとしては高度に活性があった。ＢクラスとＣクラスとの両ＣｐＧは、ＳＮＡ形式で活性があった。ＮＦ−κＢの活性化がＴＬＲ９依存性であるか確認するため、同様の実験を、外生的なＴＬＲ発現がないＨＥＫ細胞株（ヌル(null)）、またはヒトＴＬＲ９、マウスＴＬＲ９、ヒトＴＬＲ３、ヒトＴＬＲ７、またはヒトＴＬＲ８を発現するよう安定的に形質転換されたＨＥＫ細胞株において実施した。ＴＬＲ９しか発現しない細胞株は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドでの処置に応答した。

活性化は、ヌル、ｈＴＬＲ３、ｈＴＬＲ７、またはｈＴＬＲ８のレポーター細胞株において見られなかった。

ヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン応答
核酸に対するヒトサイトカイン応答を、培養下のヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を使用してモデル化した。核酸ベースのＴＬＲ９アゴニストでの処置の後、ｈＰＭＢＣ培養上清のサイトカインレベルを定量化した（表２）。ＳＮＡ構築物は、直鎖形式の同じ配列より強力であった。より長さが短い配列（例えば、配列６、配列９、および配列１４を参照）または５’ＴＣＧを欠如する配列（例えば、配列４および配列５を参照）は、直鎖オリゴヌクレオチドとしてよりＳＮＡとしての方がより活性であった。１２ｎｔと同程度に短い配列（配列９を参照）は、ＳＮＡとしては高度に活性であった。Ａクラス、Ｂクラス、およびＣクラスのＣｐＧは、ＳＮＡ形式で活性であった。

ヒトＰＢＭＣにおけるオリゴヌクレオチド取り込み
ヒトＰＢＭＣによる蛍光標識核酸の取り込みを、フローサイトメトリーによって査定した（図１）。直鎖オリゴヌクレオチドと比較すると、より高いパーセンテージの細胞がＳＮＡを取り込んだ。オリゴヌクレオチドを取り込む細胞のうち、１細胞当たりより多くのＳＮＡが取り込まれた。

in vivoでのサイトカイン応答
マウスにおけるＣｐＧオリゴヌクレオチドの皮下注射の後、より高い血清サイトカインレベルが、直鎖オリゴヌクレオチドよりＳＮＡで観察された（図２）。

材料および方法
ＳＮＡ調製。
ヌクレオチド間連結にホスホロチオアート（ＰＳ）をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。ＳＮＡ形式のＤＮＡオリゴヌクレオチドのために、コレステロール部分（３’−Ｃｈｏｌ）を、２つのヘキサエチレングリコール（ｓｐ１８）部分を介して３’末端へ付着させた。ＳＮＡ化合物を、５０ｎｍ ＤＯＰＣリポソーム（ＬＳＮＡ）上へ、１００オリゴヌクレオチド分子／リポソームの比率にて、機能化した。

レポーター細胞におけるＮＦ−κＢ活性化。
ＮＦ−κＢレポーター細胞（ヒトＲａｍｏｓ Ｂリンパ球、マウスＲＡＷ マクロファージ、ヒトＴＬＲ９−ＨＥＫ、マウスＴＬＲ９−ＨＥＫ、ヌル１−ＨＥＫ、ヒトＴＬＲ３−ＨＥＫ、ヒトＴＬＲ７−ＨＥＫ、およびヒトＴＬＲ８−ＨＥＫ；Invivogen）を、ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬ Normocin、１００μｇ／ｍＬゼオシン、１０μｇ／ｍＬブラストサイジン、２ｍＭ Ｌ−グルタミンから構成される成長培地中で培養した。細胞培養物を、CorningからのＴ７５フラスコ（非パイロジェン性のポリスチレン）中３７℃および５％ＣＯ_２にて保管した。

核酸の添加から２４時間後にて、ＮＦ−κＢの活性化を、QuantiBlue試薬（Invivogen）を使用して査定した。１６０μＬのQuantiBlueを滅菌９６ウェルプレートの各ウェルへ加え、４０μＬの細胞上清をそれらの対応するウェルへ加えることで、総体積が２００μＬになった。すべての試験化合物を撒いたら、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２にて３０分間インキュベーター中に置いた。色の進行を、３０分間のインキュベーション時間の後、１５分毎にチェックした。参照としての標準曲線を使用する色の進展後、プレートを、蛍光プレートリーダー（Synergy 4）を使用して６５０ｎｍの吸光度にて読み取った。

ヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン応答。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養のため、バフィーコートをZen Bio and AllCellsから購入した。バフィーコートをさらに、塩化アンモニウムを使用して処理することで、赤血球を溶解し除去した。細胞を、収集から２４時間以内に新鮮な状態で(fresh)使用した。ＰＢＭＣを、補充されたＲＰＭＩ成長培地（フェノールレッド（Corning）、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンをもつＲＰＭＩ）中で３７℃および５％ＣＯ_２にて培養した。核酸の添加から２４時間後にて、ＰＢＭＣ培養上清中のサイトカインレベルを、マルチプレックスサイトカインＥＬＩＳＡキット（Quansys）を使用して査定した。標準曲線を、キット中に提供されていた試料の希釈剤を使用して調製した。

トランスフェクトされた細胞から収集された上清を、試料の希釈剤を使用して１：２に希釈した。５０μＬの標準および試料を、Q-Plex９６ウェルプレートへ加えた。プレートを密封して１時間シェイカー上（に置いた５００ｒｐｍおよび２０℃）。次いでプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。５０μＬの検出ミックス(Detection mix)を各ウェルへ加えた。再びプレートを密封して１時間シェイカー上に置いた（５００ｒｐｍおよび２０℃）。次いでプレートを３回洗浄した。５０μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（１×）を各ウェルへ加え、プレートを密封し、１５分間シェイカーに戻した（５００ｒｐｍおよび２０℃）。このとき混合された基質が調製される間、ＵＶ光からそれを保護することに気を付ける。次いでプレートを６回洗浄した。５０μＬの基質ミックスを各ウェルへ加え、プレートを、Q-View LSイメージャー(imager)を使用して１５分以内に読み取った。

ヒトＰＢＭＣにおけるオリゴヌクレオチド取り込み。
ヒトＰＢＭＣを上記のとおりに培養した。ＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドで処置し、２４時間後にフローサイトメトリーを使用してオリゴヌクレオチドの取り込みを査定した。

in vivoでのサイトカイン応答。
参照ＢクラスＣｐＧ（ヒト）直鎖オリゴヌクレオチドまたはＳＮＡを、１０週齢オスC57BL/6マウス中へ皮下注射した。注射から４時間後、全血を収集し処理して血清を得た。サイトカインを、上記のとおりのマルチプレックスサイトカインＥＬＩＳＡキットを使用して査定した。

オリゴヌクレオチド配列
表３．

均等物
当業者は、単なるルーチンな実験法のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の態様との多くの均等物を認識するか、または解明することができるであろう。かかる均等物は、以下のクレームによって網羅されることが意図される。
本明細書に開示される、特許書類を包含するすべての参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。

Claims (64)

1. リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体を含む球状核酸（ＳＮＡ）であって、ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドが、４〜１６ヌクレオチド長であるか、および／または５’ＴＣＧモチーフを有さない、前記ＳＮＡ。
2. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、８〜１４ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＳＮＡ。
3. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’ＴＣＧモチーフを有さない、請求項１または２に記載のＳＮＡ。
4. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、リポソームまたはリポプレックスへ、脂質アンカー基を通して付着させられている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
5. アンカー基が、コレステロールまたはトコフェロールである、請求項４に記載のＳＮＡ。
6. オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドが、外側へ放射状に配向されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
7. リポソームコアが、２〜２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
8. オリゴヌクレオチドシェルが、１ＳＮＡにつき５〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
9. オリゴヌクレオチドシェルが、１ＳＮＡにつき１００〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
10. オリゴヌクレオチドシェルが、１ＳＮＡにつき５００〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
11. オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
12. オリゴヌクレオチドが、ヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有さない、請求項１〜１０いずれか一項に記載のＳＮＡ。
13. オリゴヌクレオチドが、すべてのヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
14. オリゴヌクレオチドが、１０〜１２ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
15. 少なくとも２５パーセントのオリゴヌクレオチドが、ＳＮＡの外部表面へさらされる５’末端を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
16. オリゴヌクレオチドシェルのすべてのオリゴヌクレオチドが、ＳＮＡの外部表面へさらされる５’末端を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
17. オリゴヌクレオチドシェルのうち少なくとも２５パーセントのオリゴヌクレオチドが、ＳＮＡの外部表面へさらされる３’末端を有する、請求項１〜１４項のいずれか一項に記載のＳＮＡ。
18. リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体から構成される球状核酸（ＳＮＡ）を含む組成物であって、組成物が、等モル濃度の同じ配列の直鎖ＣｐＧオリゴヌクレオチドより高いレベルの１種以上のサイトカインの生成を刺激する、前記組成物。
19. リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるこれまでにないＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体から構成される球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物。
20. サイトカインが、ＩＬ−６である、請求項１８または１９に記載の組成物。
21. サイトカインが、ＩＬ−１２である、請求項１８または１９に記載の組成物。
22. サイトカインが、ＩＦＮ−αである、請求項１８または１９に記載の組成物。
23. サイトカインが、ＩＦＮ−γである、請求項１８または１９に記載の組成物。
24. サイトカインの生成が、in vitroである、請求項１８または１９の組成物。
25. サイトカインの生成が、in vivoである、請求項１８または１９の組成物。
26. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１８〜２５いずれか一項に記載の組成物。
27. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、二次構造のないＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
28. ＣｐＧオリゴヌクレオチドがＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１８〜２５いずれか一項に記載の組成物。
29. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、二次構造のあるＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１８〜２５いずれか一項に記載の組成物。
30. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドである請求項１８〜２５いずれか一項に記載の組成物。
31. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、Ｇリッチな配列からなるＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
32. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドの混合物である、請求項１８〜２５いずれか一項に記載の組成物。
33. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、４〜１６ヌクレオチド長である、請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
34. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’ＴＣＧモチーフを有さない、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
35. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、外側へ放射状に配向している、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
36. リポソームコアが、２〜２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１８〜３４いずれかに記載のＳＮＡ。
37. オリゴヌクレオチドシェルが、１ＳＮＡにつき５〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する、請求項１８〜３４いずれか一項に記載の組成物。
38. オリゴヌクレオチドシェルが、１ＳＮＡにつき１００〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する、請求項１８〜３４いずれか一項に記載の組成物。
39. オリゴヌクレオチドシェルが、１ＳＮＡにつき５００〜１，０００オリゴヌクレオチドの密度を有する、請求項１８〜３４いずれか一項に記載の組成物。
40. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有する、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
41. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有さない、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
42. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、すべてのヌクレオシド間にホスホロチオアート連結を有する、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
43. ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、１０〜１６ヌクレオチドの長さを有する、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
44. 少なくとも２５％のＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＳＮＡの外部表面へさらされる５’末端を有する、請求項１８〜３４いずれか一項に記載の組成物。
45. 少なくとも２５％のＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＳＮＡの外部表面へさらされる３’末端を有する、請求項１８〜３４いずれか一項に記載の組成物。
46. リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体から構成される球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物。
47. ＩＬ−６またはＩＬ−１２の発現を誘発するのに有効な量の、リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体の球状核酸（ＳＮＡ）を含む組成物を対象へ投与することを含む、対象におけるサイトカインの発現を誘発するための方法。
48. ＳＮＡが、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＳＮＡであるか、または請求項１７〜４２のいずれか一項に記載の組成物である、請求項４７の方法。
49. 対象を処置するのに有効な量の、リポソームまたはリポプレックス複合体の外部に位置付けられるＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドシェルを有する前記リポソームまたはリポプレックス複合体の球状核酸（ＳＮＡ）を含む組成物を、対象へ投与することを含む、対象を処置するための方法。
50. ＳＮＡが、請求項１〜１６いずれか一項に記載のＳＮＡであるか、または請求項１８〜４５のいずれか一項に記載の組成物である、請求項４９に記載の方法。
51. 対象が、がんを有する、請求項４９に記載の方法。
52. 対象が、感染症を有する、請求項４９に記載の方法。
53. 対象が、アレルギー疾患を有する、請求項４９に記載の方法。
54. チェックポイント阻害剤を対象へ投与することをさらに含む、請求項４９または５１に記載の方法。
55. チェックポイント阻害剤が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗体断片、二重特異性抗体、抗体薬物複合体、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせ、および小分子からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
56. チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ １、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質を阻害する、請求項５５に記載の方法。
57. チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体である、請求項５６に記載の方法。
58. 抗ＰＤ−１抗体が、BMS-936558（ニボルマブ）である、請求項５７の方法。
59. 抗ＰＤ−１抗体が、ペンブロリズマブである、請求項５７に記載の方法。
60. チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項５６に記載の方法。
61. 抗ＣＴＬＡ−４抗体が、イピリムマブである、請求項６０に記載の方法。
62. チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項５６に記載の方法。
63. 抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、MPDL3280A（アテゾリズマブ）である、請求項６２に記載の方法。
64. がんが、胆道がん；脳がん；乳がん；子宮頸がん；絨毛癌；大腸がん；子宮内膜がん；食道がん；胃がん；上皮内新生物；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；肝臓がん；肺がん（例として、小細胞および非小細胞）；メラノーマ；神経芽細胞腫；口腔がん(oral cancer)；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；直腸がん；肉腫；皮膚がん；精巣がん；甲状腺がん；および尿道がんからなる群から選択される、請求項４９〜５１および５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。